ES2288076B1 - Procedimiento para la obtencion de enzimas termofilicas con actividad lipolitica de microorganismos del genero thermus. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de enzimas termofílicas con actividad lipolítica de microorganismos del género thermus. El procedimiento consiste en cultivar microorganismos del género Thermus en un medio de crecimiento preparado con un agua termal minero-medicinal y someter los postincubados a etapas secuenciales de congelación, descongelación y centrifugación. El resultado de tal proceder es la obtención de enzimas termofílicas con actividad lipolítica en el líquido, extracelular. El procedimiento y el producto de su aplicación son de interés en industrias de fabricación de enzimas, farmacéutica, química fina o actividades de investigación y desarrollo.
Description
Procedimiento para la obtención de enzimas
termofílicas con actividad lipolítica de microorganismos del género
Thermus.
El procedimiento que se describe es de
aplicación inmediata en la industria de fabricación de enzimas,
destinándose el producto obtenido (enzimas lipolíticas
termofílicas) a la industria farmacéutica, química fina o
actividades de investigación y desarrollo.
Las enzimas lipolíticas (lipasas, esterasas)
presentan una gran variedad de aplicaciones industriales en
sectores muy diversos, tales como la fabricación de detergentes,
aromas y principios farmacéuticos homoquirales, industria
alimentaria, del papel y pasta de papel, cuero, e incluso en la
depuración de aguas residuales.
Uno de los mayores problemas encontrados en la
utilización de enzimas como biocatalizadores industriales es su
desactivación a altas temperaturas, lo que supone un incremento en
los costes de operación asociados. Se han desarrollado estrategias
para obtener enzimas termoestables, tales como la variación de su
estructura molecular por mutagénesis dirigida o por modificación
química de superficie, o la aplicación de técnicas de
inmovilización que permiten además recuperar y reutilizar el
biocatalizador.
Los microorganismos termófilos crecen a
temperaturas por encima de los 45°C, y en algunos casos
(hipertermófilos) incluso por encima de 90°C. Las enzimas
producidas por estos microorganismos presentan una elevada
estabilidad térmica y resistencia a desnaturalizantes químicos
(sales caotrópicas, disolventes orgánicos, detergentes). Estas
propiedades hacen posible su utilización en procesos a temperatura
elevada con pérdidas mínimas de actividad, con el consiguiente
incremento en la velocidad de reacción y en la solubilidad de
reactivos. Se han descrito diversas enzimas termofílicas de
potencial aplicación en procesos biotecnológicos, destacando las
enzimas amilolíticas, celulasas, xilanasas, quitinasa, proteasas,
DNA polimerasas, transcriptasas inversas, ligasas, glucosa
isomerasas y alcohol-deshidrogenasas.
Recientemente se ha indicado la capacidad de
diversas cepas de género Thermus para producir enzimas con
actividad lipolítica, que pueden ser liberadas al medio de cultivo.
Se han identificado dos enzimas, de pesos moleculares 32 y 64 kDa,
que presentan elevada actividad a pH alcalino y alta temperatura,
así como una excepcional termoestabilidad y estabilidad en
presencia de concentraciones elevadas de disolventes orgánicos. Si
bien se han descrito aspectos relacionados con las condiciones de
cultivo a pequeña escala, purificación y caracterización, no
existen procedimientos registrados para su obtención con vistas a su
aplicación industrial.
A continuación se concretan algunos artículos
relacionados:
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Se propone un procedimiento para la obtención de
enzimas con actividad lipolítica por cultivo de microorganismos del
género Thermus, consistente en el diseño de un medio de
cultivo y las condiciones de operación adecuadas para la producción
de un nivel elevado de actividad lipolítica extracelular, así como
en la definición de un sistema para la recuperación en el líquido
extracelular de las enzimas producidas.
La obtención de enzimas termofílicas con
actividad lipolítica se basa en cultivar un microorganismo del
género Thermus en un medio y condiciones adecuados, y
posteriormente recuperar las enzimas en el líquido extracelular
mediante etapas de congelación/descongelación y centrifugación.
Los detalles del procedimiento son los
siguientes:
El medio de cultivo utilizado consiste en una
disolución en agua minero-medicinal termal de alta
mineralización y con un elevado contenido en residuo seco de una
fuente de carbono como glucosa u otro azúcar simple, una fuente de
nitrógeno como extracto de levadura u otro hidrolizado proteico y
una mezcla de sales, todos ellos a las concentraciones adecuadas
para promover el crecimiento del microorganismo y la producción de
enzimas con actividad lipolítica, cuyo pH se ajusta inicialmente a
un valor cercano a la neutralidad. Cuando se utilizan fuentes de
nitrógeno complejas puede obviarse la adición de la fuente de
carbono al medio de cultivo.
El inóculo para el proceso de producción se
obtiene por cultivo axénico de un microorganismo del género
Thermus en el medio descrito anteriormente mediante la
adición de células del microorganismo conservadas congeladas a
matraces de tipo Erlenmeyer con una relación de carga inferior al
50% y sin necesidad de aireación forzada. Tras homogeneizar la
mezcla, se incuba con agitación constante y temperatura controlada
comprendida entre 50 y 90°C durante un tiempo que permita alcanzar
un nivel suficiente de crecimiento celular.
A continuación, se recupera la biomasa por
centrifugación, eliminando la humedad en exceso, y se conserva
congelada hasta su posterior uso como inóculo.
Esta etapa del proceso se lleva a cabo en
condiciones estériles, y todo el material y disoluciones empleadas
deben ser esterilizadas previamente en autoclave.
Cuando se trata de obtener volúmenes pequeños de
enzima el cultivo del microorganismo puede realizarse siguiendo el
mismo procedimiento descrito en la preparación del inóculo. Por el
contrario, para volúmenes de medio de cultivo superiores a un
litro, éste se introduce en un fermentador equipado con sistema de
aireación. En todos los casos, es necesario dejar un volumen libre
suficiente en los recipientes para facilitar la transferencia de
oxígeno. El medio se inocula con una cantidad determinada de
biomasa activa de Thermus, obtenida como se indica en el
apartado anterior. Tras homogeneizar la mezcla, se incuba con
agitación constante y temperatura controlada comprendida entre 50 y
90°C durante un tiempo que permita alcanzar un nivel suficiente de
crecimiento celular.
La suspensión celular obtenida en el cultivo de
producción enzimática se congela con el fin de desintegrar
estructuras celulares en donde pudiera quedar retenida la enzima y
facilitar así su recuperación. Una vez descongelada a temperatura
ambiente se separa la biomasa por centrifugación, y se conserva el
sobrenadante, en el cual se encuentra la actividad enzimática.
Figura
1
Evolución de la producción de biomasa y de
actividad lipolítica extracelular en cultivos de Thermus
thermophilus HB27 sobre medio preparado con agua ultrapura de
calidad Milli-Q (símbolos negros) y agua
minero-medicinal termal (símbolos blancos). Los
cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 2 L de capacidad,
con 400 mL de medio de cultivo, incubados a 70°C en las condiciones
descritas en el Ejemplo 1.
\newpage
Figura
2
Evolución de la producción de biomasa (símbolos
negros) y de actividad lipolítica extracelular (símbolos blancos)
en cultivos de Thermus thermophilus HB27 llevados a cabo en
un reactor de tanque agitado de 5 L de capacidad, con 3 L de medio
de cultivo preparado con agua minero-medicinal
termal, incubados a 70°C en las condiciones descritas en el Ejemplo
2. Las dos líneas de trazos indican el inicio de operación en modo
continuo con un caudal de 1 L/día (tiempo de residencia \tau = 72
h), y el cambio a medio de cultivo de alimentación preparado con
agua ultrapura de calidad Milli-Q.
Figura
3
Comparación entre la actividad lipolítica
extracelular detectada en diversos cultivos de Thermus
thermophilus HB27 cuando los postincubados se someten sólo a una
etapa de centrifugación para separar la biomasa (barras negras) o a
sucesivas etapas de congelación, descongelación y centrifugación
(barras grises), según lo indicado en el
Ejemplo 3.
Ejemplo 3.
En este primer ejemplo se compara la influencia
del tipo de agua utilizada en la preparación del medio de cultivo
sobre la evolución de la producción de biomasa y de actividad
lipolítica extracelular en cultivos de Thermus thermophilus
HB27, realizados según el procedimiento descrito.
Los medios de cultivo utilizados consistieron en
disoluciones de los siguientes compuestos, en las cantidades
indicadas: tripticasa (8 g/L), extracto de levadura (4 g/L) y NaCl
(3 g/L). El pH se ajustó inicialmente a un valor de 7,5 \pm 0,2
por adición de NaOH 1 M. Se utilizaron dos medios, el primero
preparado en agua ultrapura de calidad Milli-Q y el
segundo en un agua minero-medicinal termal de alta
mineralización y elevado contenido en residuo seco, cuyas
propiedades físico-químicas y composición se indican
en la Tabla 1.
El inóculo para el proceso de producción se
obtuvo por cultivo del microorganismo en matraces Erlenmeyer de 250
mL, en los que se introdujeron 50 mL del mismo medio de cultivo. Se
taparon con tapones de celulosa, para permitir la aireación pasiva
de los cultivos. A cada matraz se añadió 1,5 mg (peso seco) de
biomasa activa de Thermus thermophilus HB27, previamente
preparada, lo cual corresponde a una proporción de inóculo de 30 mg
de células (peso seco)/L. Tras homogeneizar la mezcla, se incubó
durante 24 horas o hasta un nivel adecuado de crecimiento del
microorganismo (concentración celular de aproximadamente 1 g/L) en
incubador orbital a una temperatura constante de 70°C y una
velocidad de agitación de 100 r.p.m. Para comprobar el nivel de
crecimiento celular se tomaron muestras periódicamente y se
centrifugaron durante 10 min a 5000 x g y 4°C para separar la
biomasa, que se determinó, una vez lavada para eliminar los restos
de medio de cultivo, gravimétricamente mediante
pesada.
pesada.
La masa celular producida se recuperó, siempre
en condiciones estériles, por centrifugación durante 10 minutos a
5000 x g y 4°C. A continuación, se distribuyó en viales estériles,
eliminando la humedad con ayuda de una bomba de vacío, y se
conservó a -20°C hasta su posterior uso como inóculo.
Los cultivos de producción enzimática se
llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 2 L de capacidad, en los
que se introdujeron 400 mL de los medios de cultivo descritos. Los
matraces se taparon con tapones de celulosa, que permiten la
aireación pasiva de los cultivos. A cada matraz se añadió una
proporción de inóculo de Thermus thermophilus HB27,
previamente preparada como se indica, de 30 mg de células (peso
seco)/L. Tras mezclar adecuadamente, se incubó durante 32 horas en
incubador orbital a una temperatura constante de 70°C y una
velocidad de agitación de 100 r.p.m. Periódicamente, se tomaron
muestras que se utilizaron para determinar el crecimiento celular y
la actividad enzimática en el líquido extracelular. Se separó la
biomasa de las muestras y se determinó su concentración de modo
idéntico al utilizado en los cultivos de preparación de inóculo. El
sobrenadante obtenido en la centrifugación se utilizó para
determinar la actividad enzimática, por medida de la hidrólisis de
laurato de p-nitrofenilo a 65°C y pH 8,0 (Fuciños et
al., 2005).
Los resultados de tal proceder se muestran en la
Figura 1, expresados en función de la evolución a lo largo del
tiempo de la concentración de biomasa y la actividad lipolítica
extracelular, en los dos medios de cultivo ensayados. De ellos se
deduce la aptitud del procedimiento para la producción de enzimas
con actividad lipolítica en el medio descrito, preparando el mismo
en un agua minero-medicinal termal con elevado
contenido en residuo seco. En este caso, se alcanzan a las 24 h de
incubación los niveles máximos de actividad enzimática, con valores
cercanos a 130 U/L. Ello supone un nivel interesante de producción,
habida cuenta de los bajos niveles de expresión en la producción de
enzimas extracelulares encontrados habitualmente en microorganismos
termófilos.
\newpage
Cabe señalar que cuando el medio de cultivo se
prepara en agua ultrapura de calidad Milli-Q, los
valores máximos de actividad enzimática se obtienen más tarde (a
las 28-32 h de cultivo), y son sensiblemente
inferiores a los alcanzados en el otro medio (85 U/L a las 32 h, un
33% inferiores a los detectados en agua
minero-medicinal a ese mismo tiempo de cultivo). En
lo que se refiere a la biomasa, los perfiles son similares en ambos
casos, con niveles finales alrededor de 1,4-1,6 g/L,
siendo ligeramente superiores en los cultivos realizados en agua
minero-medicinal. Se ilustra por lo tanto la
adecuación del medio de cultivo propuesto para la producción de
enzimas lipolíticas extracelulares por microorganismos del género
Thermus a pequeña escala, destacando la conveniencia de
utilizar un agua minero-medicinal termal de elevado
contenido en residuo seco para la preparación del medio.
En este ejemplo se muestra la evolución del
crecimiento celular y la producción de actividad lipolitica
extracelular en cultivos de Thermus thermophilus HB27,
llevados a cabo según el procedimiento descrito en un fermentador
de 5 L de capacidad, equipado con un agitador mecánico de palas y
de sistemas de control de temperatura y de entrada de aire estéril.
A lo largo del tiempo de cultivo se han utilizado secuencialmente
medios preparados de modo análogo a lo indicado en el Ejemplo 1,
con dos tipos de agua (minero-medicinal termal
descrita en la Tabla 1 y ultrapura de calidad
Milli-Q).
Inicialmente, se introdujeron en el reactor 3 L
de medio de cultivo preparado en agua
minero-medicinal termal, que se inoculó con 90 mg
(peso seco) de biomasa de Thermus thermophilus HB27
previamente preparada como en el ejemplo 1. El cultivo se incubó a
una temperatura constante de 70°C, con una velocidad de agitación
de 650 rpm, y un caudal de aire de 1 L/min.
Al cabo de 72 horas de cultivo, se inició el
proceso en modo continuo, con introducción de una corriente
continua de 1 L/día de medio de cultivo preparado en agua
minero-medicinal termal y extracción del mismo
caudal del contenido del reactor. Esto corresponde a un tiempo de
residencia en el reactor (\tau) de 72 horas.
El sistema se mantuvo en estas condiciones hasta
las 312 horas de cultivo, momento en el cual se sustituyó el medio
de alimentación por otro preparado en agua ultrapura de calidad
Milli-Q, conservando iguales el resto de condiciones
(caudal de entrada y salida, agitación, aireación, temperatura). El
proceso se monitorizó hasta las 504 horas de
cultivo.
cultivo.
Durante todo el proceso se tomaron muestras
periódicas del interior del reactor (periodo en modo discontinuo,
entre 0 y 72 horas) o de la corriente de salida del reactor
(periodo en modo continuo, a partir de 72 horas), para determinación
de la concentración de biomasa y de actividad lipolítica
extracelular.
En todos los casos, las muestras se
centrifugaron durante 10 minutos a 5000 x g y 4°C, para separar la
biomasa. El sobrenadante se utilizó para determinar la actividad
enzimática, por medida de la hidrólisis de laurato de
p-nitrofenilo a 65°C y pH 8,0 (Fuciños et al., 2005).
El residuo sólido, una vez lavado para eliminar los restos de medio
de cultivo, se usó para determinar la biomasa gravimétricamente
mediante pesada.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 2, expresados en función de la evolución a lo largo del
tiempo de la concentración de biomasa y la actividad lipolítica
extracelular. Se indica mediante líneas de trazos los momentos de
inicio de modo de operación en continuo, y de cambio de medio de
cultivo de alimentación (medio preparado en agua
minero-medicinal termal o ultrapura de calidad
Milli-Q). De ellos se deduce la aptitud del
procedimiento para el escalado de la producción de enzimas
lipolíticas termofílicas, alcanzándose en modo discontinuo al cabo
de 72 h de incubación niveles de actividad enzimática alrededor de
130 U/L y biomasa en torno a 1,2 g/L. Se obtienen, por tanto,
valores similares a los detectados en cultivos a pequeña escala
según lo descrito en el ejemplo 1, si bien se requieren tiempos más
largos de cultivo. Como se indicó anteriormente, esto supone un
nivel aceptable de producción, habida cuenta de los bajos niveles
de expresión en la producción de enzimas encontrados habitualmente
en microorganismos termófilos. Además, se demuestra la viabilidad
del modo de operación en continuo para la producción de enzimas
lipolíticas según el procedimiento descrito, manteniéndose niveles
medios de actividad enzimática y biomasa en la corriente de salida
del reactor en torno a 230 U/L y 1,4 g/L, respectivamente.
Por último, destaca el efecto derivado de la
sustitución de la alimentación de medio de cultivo preparado en
agua minero-medicinal termal por otro formulado en
agua ultrapura de calidad Milli-Q. A partir del
momento en que se lleva a cabo el cambio se observa una progresiva
disminución en la biomasa, y especialmente en la actividad
enzimática extracelular detectada en la corriente de salida del
reactor. Estos resultados confirman lo indicado en el Ejemplo 1,
relativo a la conveniencia de utilizar agua
minero-medicinal termal para la preparación del
medio de
cultivo.
cultivo.
En este ejemplo se muestra el efecto de
introducir etapas de congelación/descongelación previas a la
separación de la biomasa de los cultivos, con objeto de aumentar el
porcentaje de recuperación de las enzimas producidas.
Los microorganismos del género Thermus
forman con frecuencia agrupaciones conocidas con el nombre de
cuerpos multicelulares, consistentes en un número variable de
células rodeadas por una membrana formada por la fusión de las
membranas externas de cada célula (Becker y Starzyk, 1984). En el
interior de estas estructuras puede acumularse una cierta cantidad
de enzima, que no es posible recuperar en el líquido extracelular
si la separación de la biomasa se lleva a cabo por simple
centrifugación. La incorporación de etapas previas de
congelación/descongelación induce la ruptura de las membranas que
rodean a estos agregados, y por lo tanto la liberación de las
enzimas retenidas, manteniéndose prácticamente por completo la
integridad de las células individuales. Suspensiones celulares
procedentes de cultivos realizados de modo análogo a lo descrito en
el Ejemplo 1 se sometieron a dos tipos de tratamiento. Por un lado,
las suspensiones se centrifugaron durante 10 minutos a 5000 x g y
4°C directamente tras la finalización del cultivo para separar la
biomasa. El sobrenadante se utilizó para determinar la actividad
enzimática extracelular, por medida de la hidrólisis de laurato de
p-nitrofenilo a 65°C y pH 8,0 (Fuciños et al.,
2005).
2005).
Por otro lado, las suspensiones se congelaron a
-40°C durante 24 h, tras lo cual se descongelaron a temperatura
ambiente. Luego, se centrifugaron durante 10 minutos a 5000 x g y
4°C, para separar la biomasa. El sobrenadante se utilizó para
determinar la actividad enzimática, como en el caso anterior.
Los resultados obtenidos con muestras
procedentes de cultivos de 24 h realizados en medios preparados con
agua minero-medicinal termal y agua ultrapura de
calidad Milli-Q se muestran en la Figura 3. Se puede
observar cómo el proceso de congelación/descongelación conduce a un
significativo aumento en la tasa de recuperación de enzima en el
líquido extracelular, que se incrementa entre un 60 y un 150% en
muestras procedentes de cultivos realizados en agua
minero-medicinal termal y ultrapura de calidad
Milli-Q, respectivamente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (3)
1. Un procedimiento para la obtención de enzimas
termofílicas con actividad lipolítica procedentes de
microorganismos del género Thermus consistente en el cultivo
del microorganismo en un medio de crecimiento preparado con un agua
termal minero-medicinal y la recuperación de la
actividad mediante un procedimiento de congelación de los
cultivos.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado por el cultivo en agua
minero-medicinal de microorganismos del género
Thermus y la recuperación en el líquido extracelular de las
enzimas lipolíticas producidas.
3. Un procedimiento según la reivindicaciones 1
y 2 caracterizado por la recuperación de las enzimas
lipolíticas producidas en cultivo líquido mediante etapas
secuenciales de congelación, descongelación y centrifugación.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200501553A ES2288076B1 (es) | 2005-06-24 | 2005-06-24 | Procedimiento para la obtencion de enzimas termofilicas con actividad lipolitica de microorganismos del genero thermus. |
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|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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2005
- 2005-06-24 ES ES200501553A patent/ES2288076B1/es not_active Expired - Fee Related
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