ES2288306T3

ES2288306T3 - Deteccion de microorganismos.

Info

Publication number: ES2288306T3
Application number: ES97941302T
Authority: ES
Inventors: Maxine Helen Simmons; Rosemary Katherine Cameron Sharpin
Original assignee: SBM Ltd
Current assignee: SBM Ltd
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 2008-01-01
Anticipated expiration: 2017-09-12
Also published as: EP0927353B1; DE69737718D1; CA2264772A1; WO1998011250A2; AU4324397A; WO1998011250A3; EP0927353A2; EP0927353A4; US6051394A; CA2264772C; DE69737718T2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO Y UN KIT QUE PERMITE DETECTAR MICROORGANISMOS EN UNA MASA,UN LIQUIDO O UNA SUPERFICIE. ESTE PROCEDIMIENTO CONSISTE EN TOMAR UNA MUESTRA Y A COLOCARLA EN UNA CAMARA ESTERIL QUE TIENE UNA CAPACIDAD VOLUMETRICA LIMITADA. LA MUESTRA SE PONE A CONTINUACION EN CONTACTO CON UNA COMPOSICION QUE PERMITE DETECTAR LOS MICROORGANISMOS. LA CAMARA ESTERIL PUEDE CONTENER UN FILTRO QUE PERMITE AISLAR CUALQUIER MICROORGANISMO PRESENTE EN LA MUESTRA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A INSTRUMENTOS DE MUESTREO, A UN INSTRUMENTO DE DELIMITACION,ASI COMO A UN SISTEMA DE TIPAJE DE LOS MICROORGANISMOS.

Description

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Detección de microorganismos.

Esta invención involucra un método de detección de microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1 y las reivindicaciones dependientes de ésta, un kit para la detección de microorganismos de acuerdo con la reivindicación 16, y el uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 17.

Esta invención se relaciona con la detección de microorganismos y es especialmente, pero no exclusivamente, aplicable a la detección de microorganismos patogénicos durante la preparación de alimentos para el consumo humano.

La contaminación de productos alimenticios, cosméticos, farmacéuticos y similares por microorganismos indeseables representa una amenaza significativa a la salud pública. En el pasado se han desarrollado varios métodos para monitorear la presencia de tales microorganismos en por ejemplo productos alimenticios, abastecimientos de agua y en superficies de preparación de alimentos. Generalmente, estos métodos dependen de técnicas microbiológicas convencionales, que incluyen típicamente el crecimiento de microorganismos en medios de nutrientes selectivos con soporte sólido, o alternativamente en medios de nutrientes selectivos. Se llevan a cabo análisis morfológicos subsiguientes. Tales técnicas de testeo están obstaculizadas por el hecho de que un resultado puede demorar 24 a 48 horas o más, y el proceso es complejo y laborioso.

La demanda de pruebas sencillas en las cuales los resultados en cuanto al número de microorganismos patógenos particulares presentes en una muestra se pueda obtener en menos tiempo que las pruebas descritas más arriba ha desembocado en el desarrollo de técnicas alternativas. Este tipo de técnicas se basa en el cultivo de microorganismos en un medio de nutrientes en presencia de un indicador específico a un microorganismo a detectar, o alternativamente en un medio de cultivo selectivo. Todavía es necesario un período de aproximadamente 12 a 24 horas para obtener un resultado en este tipo de ensayo de prueba. Generalmente, durante todos los aspectos de la preparación de alimentos para consumo humano y similar esta restricción temporal es indeseable.

Otros problemas posibles asociados con los sistemas de ensayo actuales disponibles para detectar microorganismos patogénicos pueden incluir la falta de contención del microorganismo durante el proceso de detección, y en el caso del testeo de superficies de preparación de alimentos por ejemplo la estandarización del área de la muestra.

US-A-5, 420, 017 describe un método para la detección selectiva de bacterias Gram negativas en una muestra líquida, que abarca los siguientes pasos:

(a): agregar un detergente no iónico alquil glucósido y un compuesto caotrópico a la muestra;

(b): filtrar la muestra líquida a través de un filtro que tiene un tamaño de poros lo suficientemente pequeño como para evitar el pasaje de microorganismos a través del filtro pero lo suficientemente grande para permitir el pasaje de cualquier compuesto reductor libre presente en la muestra, mientras que los microorganismos presentes en la muestra son retenidos en el filtro;

(c): pasar una solución de prueba que abarca un reactivo cromóforo, en una cantidad efectiva para detectar las bacterias Gram negativas en la muestra líquida, a través del filtro con los microorganismos retenidos en él, dicho reactivo cromóforo contando con un potencial de oxidación tal que el reactivo se puede reducir por deshidrogenasa microbiana, y dicho reactivo cromóforo es seleccionado de forma tal que la reducción del reactivo cromóforo produce un producto coloreado; y

(d): monitorear el filtro en busca de la formación de un producto coloreado, en donde la formación de un producto coloreado es indicativa de la presencia de bacterias Gram negativas en la muestra.

DE-A-43 14 981 se ocupa de la determinación rápida de la demanda de oxígeno bioquímico en una probeta con un sello, según el cual el sello, el interior de este espacio de probeta o la pared interior están recubiertos con biocatalizadores que están inmovilizados con polímeros solubles en agua, y abarca: (a) el agregado de la muestra a ser testeada (muestra de prueba), hasta que rebose, opcionalmente luego del pretratamiento; (b) colocar el sello; (c) llevar a cabo la reacción durante un lapso temporal definido; (d) agregar un indicador de color a los contenidos de la probeta luego del fin de la reacción; y (e) medir la reacción química y/o física por medio de medición de extinción.

Se reivindica también el aparato utilizado para el proceso de más arriba, que es estable al almacenamiento, viene listo para ser utilizado y es adecuado para permitir la medición de cambios bioquímicos.

EP-A-O 128 527 se refiere a un método para la determinación acelerada de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias oxifílicas, que abarca:

(a): obtener un cultivo puro de la bacteria oxifílica a testear;

(b): preparar una serie de muestras estériles de un medio de cultivo acuoso formulado para fomentar el crecimiento rápido de dicha bacteria, incluyendo por lo menos una muestra positiva de control, dichas muestras son de volumen y composición correspondiente y tienen una concentración conocida de oxígeno disuelto;

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(c): incorporar en dichas muestras, excluyendo las muestras de control, concentraciones predeterminadas de un antimicrobiano soluble en agua seleccionado para forma una serie de muestras de dilución antimicrobiana progresiva;

(d): inocular a dichas muestras, excluyendo las muestras de control negativas, con una cantidad predeterminada de dicho cultivo para obtener en eso una concentración seleccionada de células;

(e): cultivar dichas muestras bajo condiciones favorables al crecimiento rápido de la bacteria inoculada en dicha muestra positiva de control, dicho cultivo continuado hasta un momento en la parte tardía de la fase latente o la parte temprana de la fase de crecimiento logarítmico de la bacteria con referencia a dicha muestra de control positiva; y

(f): determinar el alcance del cambio en la concentración de oxígeno disuelto en la fase líquida de las muestras como medida de la susceptibilidad de la bacteria inoculada al antimicrobiano de la prueba, la reducción de oxígeno en el medio se correlaciona con la resistencia antimicrobiana y/o la concentración antimicrobiana debajo de un nivel inhibitorio de crecimiento.

EP-A-O 592 728 revela un método para detectar crecimiento microbiológico en un recipiente de muestra sellado que abarca los pasos:

(a): controlar la presión dentro del espacio de cabeza del recipiente,

(b): detectar la tasa de cambio de dicha presión del espacio de cabeza, y

(c): la indicación de la presencia de crecimiento microbiológico dentro del recipiente como función de dicha tasa de cambio de dicha presión del espacio de cabeza.

EP-A-O 264 221 describe un dispositivo adaptado para contener un volumen de medios de crecimiento, dicho dispositivo se emplea para la detección de gas producido por un microorganismo contenido putativamente dentro de una muestra de prueba agregada al medio de crecimiento, que abarca:

-: una cámara primaria que tiene una superficie superior;

-: un domo definido por dicha superficie superior de dicha cámara primaria y con la que se comunica, dicho domo establece un nivel de fluido y es adaptado para recoger dicho gas producido por dicho microorganismo dentro de dicho medio de crecimiento; y

-: una sección de llenado adyacente a y comunicándose con un extremo de dicha cámara primaria, dicha sección de llenado separada de dicho domo y extendiéndose por encima de dicho nivel de fluido, y definiendo aún más una apertura para el agregado de dicha muestra de prueba.

Es objeto de la presente invención brindar un medio y un método mejorado de detectar microorganismos, o uno que brinde por lo menos al público una elección útil. El método para detectar microorganismos se define en la reivindicación 1, el kit para la detección de microorganismos se define en la reivindicación 16, y el uso del kit se define en la reivindicación 17.

De acuerdo con un aspecto general de la presente invención se provee un método de detectar microorganismos que abarca los pasos de tomar una muestra de una masa, una superficie o un fluido a testear, proveer una cámara estéril obturable de capacidad volumétrica limitada en la cual se lleva a cabo el proceso de detección, colocar la muestra en contacto con una composición capaz de detectar microorganismos dentro de dicha cámara estéril obturable, y registrar un cambio en la composición.

Preferentemente la capacidad volumétrica de dicha cámara estéril obturable es inferior a 10 centímetros cúbicos.

La capacidad volumétrica más preferible de dicha cámara estéril obturable es inferior o igual a 2 centímetros cúbicos.

Preferentemente la muestra se toma y se coloca en contacto con dicha composición en dicha cámara estéril obturable utilizando un instrumento estéril para la toma de muestras.

Alternativamente, la muestra se toma lavando la superficie con una solución apropiada y recolectando subsecuentemente la solución de lavado.

Alternativamente, la muestra se toma de la superficie utilizando un instrumento estéril de toma de muestras, el instrumento estéril de toma de muestras se lava con una solución apropiada y se recolecta subsecuentemente la solución de lavado.

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Alternativamente la muestra se toma extrayendo una masa de un objeto a ser testeado, lavando la masa con una solución apropiada y recolectando subsecuentemente la solución de lavado.

Preferentemente dicho cambio en la composición capaz de detectar microorganismos es tal que se puede visualizar por el ojo o en un espectrofotómetro.

Preferentemente el método descrito en cualquiera de los 8 párrafos anteriores abarca también el paso de delinear un área de una superficie a ser testeada y ubicar el instrumento estéril de toma de muestras en contacto con substancialmente toda el área delineada.

Preferentemente el método descrito en cualquiera de los 9 párrafos anteriores abarca también el paso inicial de extraer cualquier materia extraña de dicha muestra.

Más preferentemente, el método descrito en cualquiera de los 10 párrafos anteriores abarca también un paso final de clasificar cualquier microorganismo detectado.

En un aspecto relacionado de la presente invención se brinda un método para detectar microorganismos de acuerdo al párrafo 1 de más arriba, incluyendo los pasos de tomar una muestra de una masa, una superficie o un fluido a testear, proveer una cámara estéril obturable, colocar la muestra en la cámara estéril obturable, aislar substancialmente cualquier microorganismo presente en la muestra por filtración dentro de la cámara estéril obturable, colocar los microorganismos aislados en contacto con una composición capaz de detectar microorganismos dentro de una cámara estéril obturable, y registrar un cambio en la composición.

En otro aspecto relacionado de la presente invención se provee un método para detectar microorganismos de acuerdo al párrafo 1 de más arriba que incluye los pasos de proveer un instrumento de delineación, delinear un área de una superficie a ser testeada, proveer un instrumento estéril de toma de muestras, colocar el instrumento estéril de toma de muestras en contacto con substancialmente el total del área delineada a ser testeada, lavar dicho instrumento estéril en una solución apropiada, proveer una cámara estéril obturable, colocar la solución de lavado en dicha cámara estéril obturable, aislar substancialmente cualquier microorganismo presente en la solución de lavado por medio de filtración dentro de la cámara estéril obturable, colocar los microorganismos aislados en contacto con una composición capaz de detectar microorganismos dentro de la cámara estéril obturable, y registrar un cambio en la composición.

En otro aspecto relacionado de la presente invención se provee un método para detectar microorganismos de acuerdo a cómo se describe en el párrafo 1 de más arriba, incluyendo los pasos para proporcionar un instrumento estéril de toma demuestras, tomar una muestra de una masa, un líquido o una superficie a ser testeada, proveer una cámara estéril obturable que contiene una cantidad definida de una composición capaz de detectar microorganismos, colocar por lo menos una parte del instrumento estéril de toma de muestras y por lo tanto la muestra en contacto con la composición, y registrar un cambio en la composición.

En otro aspecto relacionado de la presente invención se provee un método para detectar microorganismos como se describe en el párrafo 1 de más arriba, incluyendo los pasos de proveer un instrumento de delineación, delinear un área de una superficie a ser testeada, proveer un instrumento estéril de toma de muestras, colocar el instrumento de toma de muestras en contacto con substancialmente el total del área delineada de la superficie a ser testeada, proveer una cámara estéril obturable que contiene una cantidad definida de una composición capaz de detectar microorganismos, colocar por lo menos una parte del instrumento estéril de toma de muestras y por lo tanto la muestra en contacto con la composición, y registrar un cambio en la composición.

De acuerdo a otro aspecto de la presente invención, se provee un kit para la detección de microorganismos de acuerdo al método descrito en los 15 párrafos anteriores, que abarca una cámara estéril obturable, una cantidad definida de una composición adaptada para detectar microorganismos, y un medio para recoger y colocar una muestra en contacto con dicha composición adaptada para detectar microorganismos.

Preferentemente la composición se provee en dicha cámara estéril obturable.

Preferentemente por lo menos una parte de la cámara estéril obturable es translúcida.

Más peferentemente la cámara estéril obturable contiene un medio para aislar substancialmente cualquier microorganismo en la muestra.

Preferentemente la cámara estéril obturable es una unidad de filtrado.

Preferentemente la unidad de filtrado contiene un filtro de membrana con un tamaño de poro de alrededor de 0,2 micrones o inferior.

Alternativamente la cámara estéril obturable es una probeta.

En un aspecto relacionado de la presente invención se provee un kit de acuerdo con los 7 párrafos anteriores que abarca además cualquiera o varios de: un instrumento estéril de toma de muestras, un patrón estéril para delinear un área de una superficie a testear, un medio para extraer materia extraña de la muestra antes de poner la muestra en contacto con dicha composición adaptada para detectar microorganismos, y un medio de determinar substancialmente la cantidad de microorganismos en la muestra.

Preferentemente el instrumento estéril de toma de muestras es un dispositivo de hisopado que contiene una manija y una cabeza removible que sostiene al hisopo.

Preferentemente la cabeza del instrumento estéril de toma de muestras está adaptada para cooperar con la boca de la cámara estéril obturable, para formar un sellado entre dicha cabeza y dicha boca para que en el uso dicho hisopo esté contenido dentro de dicha cámara estéril obturable.

Preferentemente el instrumento de delineación es un patrón definidor de área.

Alternativamente el instrumento estéril de toma de muestras puede delinear el área de la superficie a ser testeada.

Preferentemente los medios para extraer materia extraña de una muestra antes de colocar la muestra en contacto con la composición capaz de detectar microorganismos es un sistema de filtrado que abarca una o más unidades de filtrado.

Preferentemente el medio de determinar substancialmente la cantidad de microorganismos en la muestra es una tabla de colores o algo similar.

Preferentemente la composición adaptada para detectar microorganismos es como se describe aquí.

En otro aspecto relacionado de la presente invención se provee una composición selectiva para la detección de microorganismos que contiene un indicador, un inhibidor de microorganismos no específicos, una fuente de proteína, y una fuente de energía.

Se describen varias realizaciones de la presente invención, sólo a modo de ejemplo, en referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales:

Las figuras 1A a 1C son representaciones diagramáticas del aparato y del método de la primera realización preferida de la invención;

Las figuras 2A y 2B son representaciones diagramáticas del aparato y del método de la segunda realización preferida de la invención.

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Realización preferida Composiciones de ensayo preferidas

La siguiente descripción de las realizaciones preferidas de la presente invención hace referencia a composiciones de ensayo. En las tablas a continuación se muestran ejemplos de las composiciones preferidas. Debe tenerse en cuenta, que estas composiciones de ensayo pueden ser alteradas para permitir el crecimiento y la detección específica de varios microorganismos: los presentes ejemplos se relacionan con la detección de bacteria coliforme (Tabla 1 y Tabla 2) y bacteria estafilocócica (Tabla 3).

Ejemplo 1 Bacteria coliforme

Una composición de ensayo preferida de la presente invención contiene un indicador (ej. Resazurin), un inhibidor (ej. sales biliares) de microorganismos no específicos (es decir aquellos microorganismos que no se está testeando), una fuente de proteína (ej. Casitone), una fuente de energía (ej. lactosa), y por lo menos una sal (ej. NaCl). Se describe un ejemplo de esta composición en la Tabla 1. Además, se ha dado un rango del porcentaje de cada componente de la composición dentro del cual la detección de coliformes se puede todavía realizar bajo la presente invención. En la Tabla 2 se brinda otro ejemplo específico de una composición de ensayo.

TABLA 1

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1

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*Resazurin es un indicador de tinte de reacción de oxidación-reducción [reacción redox]. Se pueden utilizar otros indicadores similares, por ejemplo cloruro de trifeniltetrazolio y ácido rosólico (Tabla 3).

*Resazurin se conoce también como sal de sodio (7-hidroxi -3H-fenoxazin -3-uno 10-óxido) y se puede adquirir de Sigma como Resazurin R-2127.

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TABLA 2

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2

Ejemplo 2 Bacteria estafilocócica

En la Tabla 3 se brinda un ejemplo de la gama de componentes utilizados en una composición de ensayo que se pueda utilizar para sostener el crecimiento y detección de bacteria estafilocócica.

TABLA 3

3

Se debe tener en cuenta que los componentes de la composición de las Tablas 1, 2 o 3 se pueden variar dependiendo de si se usa o no una solución estéril para lavar la superficie de muestra a testear (vea la primera y segunda realización preferida de más abajo) y la naturaleza de este tipo de solución. Por ejemplo, si se utilizara el regulador de Butterfields para lavar la superficie a testear la composición de reacción no contendría cloruro de sodio suplementario como se presenta en las composiciones de la Tabla 1. Cuando se trata de testear muestras de carne la composición de la Tabla 1 preferentemente no contiene sal. Además, se pueden utilizar tintes de reacción de oxidación-reducción [reacción redox] alternativos u otros indicadores. Lo que es más, la proteína, la sal y las fuentes de energía de las composiciones descritas aquí se pueden alterar para sostener el crecimiento de varios microorganismos alternativos.

Primera realización preferida

La siguiente descripción es una realización preferida de la presente invención en relación a la detección de bacteria coliforme en superficies de preparación de alimentos. Esto debe tomarse sólo a modo de ejemplo, y debe entenderse que el método y aparato de la invención se puede adaptar para la detección de cualquiera de las varias clases o tipos de microorganismos sobre cualquiera de las varias clases de superficies o alternativamente para uso con muestras líquidas.

En primer lugar, se provee una cámara estéril de reacción 100, que contiene aproximadamente 100 \mul-2000 \mul de una composición de reacción 101 como se describe anteriormente. Este volumen se puede alterar para acomodar aplicaciones modificadas. La cámara estéril es translúcida o por lo menos una parte de ella es translúcida y es preferentemente de capacidad volumétrica pequeña; por ejemplo 10 cm cúbicos o menos y preferentemente 2 cm cúbicos o menos. Preferentemente la cámara de reacción es una probeta y más preferentemente se utiliza una micro-probeta. Tal cámara de reacción contiene una tapa 102. La tapa 102 se puede adjuntar a la probeta por medio de una rosca de tornillo u otro medio adecuado de conexión. La probeta puede ser construida en plástico u otros materiales adecuados; por ejemplo, si el cambio en la composición se medirá en un espectrofotómetro entonces el material del que estará construida la probeta puede ser alterado para que se corresponda con la longitud de onda a la cual se realizará la medición. En esta realización preferida la probeta está construida en Perspex. Además, la tapa de la probeta puede contener una abertura a través de la cual se pueden tomar muestras de la composición de ensayo antes o después de realizar la prueba de reacción para análisis subsecuentes.

En segundo lugar, se provee un instrumento de toma de muestras estéril 103 envasado asépticamente. En esta realización preferida el instrumento de toma de muestras es un dispositivo de hisopado que abarca una manija 104 y una cabeza 105. La cabeza sostiene un hisopo. La manija 104 está construida preferentemente de plástico u otro material adecuado y el hisopo sostenido sobre la cabeza es de espuma u otro material adecuado. En esta realización la cabeza 105 se puede desmontar de la manija 104. Alternativamente, en la base 107 de la cabeza desmontable 105, hay preferentemente una rosca de tornillo o un medio de conexión similar que coopera con la boca 106 de la probeta 100 para formar un sello (y actúa por lo tanto como tapa) y está adaptada para sostener el hisopo apoyado sobre la cabeza 10 en su lugar dentro de la probeta 100; vea la figura 1B.

Para realizar el método de detección de microorganismos de acuerdo a la presente realización de la invención el instrumento de toma de muestras estéril empacado asépticamente, o el dispositivo de hisopado 103, se extrae de su envoltorio con cuidado de no tocar la cabeza estéril 105. Un lado de la cabeza 105 del hisopo 103 se pone en contacto con la superficie a testear y se mueve por sobre la superficie. El dispositivo de hisopado 103 se puede dar vuelta y un segundo lado de la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 se pone en contacto con la superficie a testear. En este ejemplo el dispositivo de hisopado 103 se mueve por sobre la superficie en una forma que es perpendicular a la dirección movida cuando se puso el primer lado de la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 en contacto con la superficie a testear como se ilustra en la figura 1A. Se pueden utilizar alternativamente otros métodos de arrastrar el dispositivo de hisopado 103 sobre la superficie a testear. Por ejemplo, uno puede arrastrar la cabeza del dispositivo de hisopado 103 sobre un área a ser testeada y luego dar vuelta el dispositivo de hisopado del otro lado y arrastrar la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 sobre un área separada del mismo objeto que se está testeando.

Se extrae la tapa 102 de la probeta 100. La cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 se ubica en la boca 106 de la probeta 100 y la manija 104 del dispositivo de hisopado 103 se separa de la probeta 100 en sentido horizontal para que la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 caiga dentro de la composición 101 contenida dentro de la probeta 100. Se vuelve a colocar entonces la tapa 102 y la probeta 100 se agita para asegurar que la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 entre en contacto completo con la composición 101. En una forma alternativa preferida de esta realización (como se observa en la figura 1B) la base 107 de la cabeza desmontable incluye preferentemente una rosca de tornillo o un medio similar de conexión que coopera con la boca 106 de la probeta 100 para formar un sello (y actúa por lo tanto como una tapa) y se adapta para poder sostener el hisopo colocado sobre la cabeza 105 en su lugar dentro de la probeta 100. En este caso la probeta se puede incubar cabeza para abajo para que el hisopo en la cabeza 105 del dispositivo de hisopado esté sumergida en la composición de ensayo; figura 1B.

La probeta 100 que contiene la composición 101 y la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 se incuba a una temperatura específica al microorganismo que la prueba quiere identificar. En esta realización la incubación se efectúa a 98ºF (37ºC). A esta temperatura se seleccionan todas las bacterias coliformes. Alternativamente uno puede elegir incubar a 113ºF (54ºC) para elegir el crecimiento de bacteria predominantemente E. coli. Se puede alterar la temperatura para acomodar el crecimiento de varios otros tipos de microorganismos; por ej. si se deseara la presencia de la bacteria estafilocócica la incubación se realizaría en el medio descrito en la tabla 3 a 37ºC.

Durante la incubación la composición 101 debe ser inspeccionada ocasionalmente y comparada con un control negativo (una probeta no utilizada que contenga la composición de ensayo). Con el transcurso del tiempo la composición cambiará su color (si en la muestra hay bacterias coliformes), en esta realización de azul a color rojo/rosado. Este cambio de color es el resultado de reacciones de oxidación/reducción que involucran un tinte (Resazurin: vea las Tablas 1 y 2) presente dentro de la composición. La tasa a la que ocurre este cambio depende de la cantidad de coliformes presentes en la muestra inicial tomada (vea la Tabla 4). Hay que tomar nota de la hora en que se observa un cambio de color en comparación con el control negativo. Durante los 30 a 60 minutos siguientes el color cambiará a un rojo/rosado definido. Es preferible que la aproximación de la cantidad de microorganismos presentes en la muestra original se determine por comparación del color de reacción con una tabla de colores.

Alternativamente se puede utilizar un espectrofotómetro para medir el cambio de color antes de que sea visible al ojo. En este caso, durante el período de incubación la probeta 100 que contiene la composición y la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 se puede colocar directamente en un espectrofotómetro y las medidas de absorción se pueden realizar a 600 nm y 560 nm. Un cambio en la tasa 600/500 nm comparada con aquella del control negativo indicará la presencia de coliformes en la muestra inicial tomada 30 a 90 minutos antes de que un cambio de color pueda ser visualizado por el ojo. Hay que tomar nota de la hora en que ocurre esto. A modo de ejemplo, un cambio en la tasa 600/500 nm de más de 15% comparado con el control negativo indicará la presencia de 200 coliformes en el área del que se tomó la muestra después de 7 horas (vea la Tabla 4 para más ejemplos).

TABLA 4

4

En esta realización preferida de la invención son aplicables la/s composición/es de ensayo descritas en la sección anterior (Composiciones de ensayo preferidas).

El método y aparato descrito más arriba pueden abarcar también el uso de un patrón estéril que delinea y por lo tanto estandariza el área de muestra a testear. En esta realización preferida el patrón define un área de 6,45 cm^{2} (1 pulgada cuadrada). Sin embargo, esta área se podría alterar para adaptarse a varios otros tipos de aplicaciones o para incrementar la sensibilidad o la velocidad del ensayo. El patrón 108 se puede construir en plástico u otro material adecuado. Es preferible que el patrón contenga un medio para manipularlo al mismo tiempo que lo mantiene substancialmente estéril, por ejemplo, la lengüeta 109 de la Figura 1C. En el uso, el patrón estéril 108 se coloca sobre una superficie a testear, por ejemplo una superficie de preparación de alimentos. El patrón 108 se sostiene preferiblemente mediante la lengüeta 109 para mantener al patrón substancialmente estéril. Se puede tomar una muestra del área a ser testeada utilizando el método y dispositivo de hisopado descrito más arriba; es preferible que el hisopo entre en contacto substancialmente con la totalidad del área definida por el patrón.

El método descrito arriba se puede modificar con el agregado de un paso en el cual luego de la toma de la muestra de la superficie con el dispositivo de hisopado 103 el hisopo apoyado sobre la cabeza 105 se lava con una solución estéril apropiada (vea la sección anterior de más arriba) y una muestra de esta solución posterior al lavado se usa subsecuentemente en el ensayo de detección. En este caso la muestra se mezclará con la composición de ensayo contenida dentro de la probeta 100 y la reacción se permitirá que continúe como se describe previamente. Preferentemente la composición de ensayo se proveerá en la probeta 100 en un estado de secado en frío en este caso. Este método es aplicable también cuando un hisopado no se usa sino que la superficie a ser testeada se lava en una solución apropiada o regulador (vea la sección previa de más arriba) y se testea la muestra líquida. Además, este método es aplicable a la detec-
ción de microorganismos en líquidos, por ejemplo abastecimientos de agua, preparaciones de laboratorio y bebidas.

Segunda realización preferida

La siguiente es una descripción de una segunda realización preferida de la presente invención en relación a la detección de bacteria coliforme en superficies de preparación de alimentos. Esto debe tomarse sólo a modo de ejemplo. Sin embargo, al igual que con la realización descrita anteriormente, debe entenderse que el método o el aparato de la invención se puede adaptar para la detección de cualquiera de una variedad de microorganismos sobre cualquiera de varias clases de superficies o alternativamente muestras líquidas.

En esta realización preferida de la invención la/s composición/es de ensayo descritas en la sección anterior de más arriba (Composiciones de ensayo preferidas) son aplicables.

Como se indica en la Figura 2 el área de una superficie a ser testeada se lava inicialmente con una solución estéril adecuada como agua o un regulador apropiado (vea el ejemplo de más arriba bajo Composiciones de ensayo preferidas). Una tal superficie puede abarcar una amplia variedad de objetos; por ejemplo una mesada para la preparación de productos alimenticios, cosméticos, farmacéuticos y similar o los productos alimenticios mismos por ejemplo carcasas de animales. También, una masa medida de un producto alimenticio (por ejemplo) a ser testeada puede ser lavada con una solución estéril adecuada. Alternativamente, se puede tomar una muestra líquida desde una solución como por ejemplo un abastecimiento de agua. Lo que es más, se puede utilizar un dispositivo de hisopado como se describe en la primera realización preferida para obtener una muestra de una superficie a ser testeada, lavada en una solución estéril adecuada y una muestra de esa solución posterior al lavado del dispositivo de hisopado se puede utilizar en la presente realización. Una muestra de la solución posterior al lavado de la superficie (o dispositivo de hisopado), o la muestra de líquido misma, se filtra luego a través de un filtro estéril preferentemente con un tamaño de poro de 0,2 \mum o inferior. El filtro es preferentemente un filtro de membrana construido en materiales adecuados de filtrado como ester de celulosa, nitrocelulosa, polietileno, polisulfona, policarbonato o similar. El filtro está preferentemente alojado en un compartimento translúcido, o en un compartimento del cual por lo menos una parte es translúcida, construido de materiales plásticos o similares y del tipo que contiene una espita de entrada 111 y una espita de salida 112 o similar como se muestra en la Figura 2A. Este filtro y el compartimento forman la unidad de filtrado 110. La espita de entrada puede contener preferentemente una válvula de un solo sentido. Lo que es más, la unidad de filtrado 110 es preferentemente de capacidad volumétrica relativamente pequeña; por ejemplo menos de 2 cm cúbicos.

La muestra se puede desplazar a través del filtro por cualquier método convencional: por ejemplo inyección o bombeado. Los medios para pasar la muestra a través del filtro pueden depender del tamaño de la unidad de filtrado 110 y la naturaleza y el volumen de la muestra.

Luego de la filtración cualquier microorganismo presente en la solución de muestra será retenido sobre o en la membrana de filtrado y contenido dentro de la unidad de filtrado 110.

Luego, un volumen apropiado de una composición utilizada para detectar un tipo particular de microorganismo se inserta, preferiblemente por inyección, dentro de la unidad de filtrado 110 a través de la espita de entrada 111 o salida 112 y por lo tanto entra en contacto con cualquier microorganismo retenido sobre o dentro del filtro. Un ejemplo de tal volumen apropiado de la composición de esta realización preferida es 1 ml. La composición de ensayo se provee preferentemente en un contenedor estéril obturado como una jeringa o frasco ampolla de plástico de una capacidad volumétrica de 1,5 a 2,0 ml.

La unidad de filtrado 110 que contiene la composición de esta realización preferida y los microorganismos de muestra (si están presentes en la muestra) se incuba a una temperatura específica al microorganismo que la prueba quiere identificar. En esta realización la incubación se efectúa a 37ºC (98ºF).

Se pueden utilizar diferentes temperaturas dependiendo del tipo de bacteria que uno desea detectar. La incubación y el registro de un cambio de color en la composición de ensayo deben realizarse de acuerdo a aquellos de la primera realización preferida. Nuevamente, en esta realización preferida una tabla de colores se puede utilizar en algún momento durante o al terminar el ensayo para indicar la cantidad de microorganismos presentes en la solución de muestra inicial; es decir comparando el color de la reacción de prueba en un momento determinado con el de la tabla de colores.

En una alternativa de la segunda realización preferida el método para detectar microorganismos como se describe más arriba puede incluir también el paso de emplear un sistema de prefiltrado aguas arriba de la unidad de filtrado 110 para extraer cualquier materia extraña contenida en la solución de muestra. Un tal sistema de prefiltrado incluye preferentemente una unidad de filtrado que contiene un filtro con un tamaño de poro de 60 \mum y una unidad de filtrado que contiene un filtro con un tamaño de poro de 5 \mum para que la solución de muestra sea filtrada primero a través de la unidad de filtrado de 60 \mum, y luego la unidad de filtrado de 5 \mum antes de ser filtrada a través de la unidad de filtrado 110 como se describe más arriba.

Subsecuentemente a los pasos de prefiltrado descritos más arriba el método de detección de microorganismos puede realizarse como se describe anteriormente.

El método de detección de microorganismos como se describe anteriormente puede incluir también un primer paso de definir un área de la superficie a ser testeada utilizando un patrón estéril 108 como se muestra en la figura 2B y de acuerdo a la descripción de la primera realización preferida. Siguiendo la colocación del patrón 108 se puede utilizar un dispositivo de hisopado 103 como se describe en la primera realización preferida para tomar una muestra del área definida a ser testeada. Esto debe realizarse de acuerdo al método descrito en la primera realización preferida. Subsecuentemente el hisopo sobre la cabeza 105 del dispositivo de hisopado 103 se puede lavar en una solución estéril adecuada y la solución de muestra resultante se puede filtrar a través de la unidad de filtrado 110.

Luego de la filtración la prueba se realiza como se describe aquí.

Tercera realización preferida

Las realizaciones preferidas descritas anteriormente pueden incluir también un paso adicional al concluir el ensayo de cualquiera de las realizaciones preferidas, en el cual los microorganismos detectados son tipificados para identificar el tipo o clase de microorganismo presente. Un tal paso se realiza preferentemente utilizando anticuerpos ligados a la enzima específicos a un género particular y/o especies de microorganismos. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo marcado con fluorocromo.

Por ejemplo, en el caso de la detección de microorganismos que se realiza en la unidad de filtrado 110 la unidad de filtrado se inunda con un volumen de un regulador apropiado (solución salina tamponada con fosfato (PBS), por ejemplo) para extraer la composición de ensayo. Subsecuentemente una cantidad apropiada de una solución que contiene anticuerpos ligados a la enzima específicos a un microorganismo particular se puede insertar (utilizando preferentemente un medio de inyección o similar) dentro de la unidad de filtrado 110.

Una solución madre de un anticuerpo ligado a la enzima particular a ser utilizada en esta realización preferida contiene 1,3 g de anticuerpo ligado a la enzima por litro de solución. Dependiendo del anticuerpo particular a ser utilizado esta solución madre luego se diluye hasta una solución de trabajo de 1 en 500 a 1 en 5000. En esta realización preferida de la invención el volumen de anticuerpo ligado a la enzima es preferentemente desde 0,2 – 2,0 ml. Este volumen se puede alterar para acomodarse a unidades de filtrado de diferentes tamaños. Si hay microorganismos presentes en el filtro que reaccionan específicamente con el anticuerpo ligado a la enzima agregado a la unidad de filtrado 110 el anticuerpo ligado a la enzima será retenido en el filtro (es decir que se ligará a los microorganismos presentes). Si no hay microorganismos específicos presentes el anticuerpo ligado a la enzima pasará a través de la unidad de filtrado. Las enzimas preferidas para ligarse a los anticuerpos específicos son Peroxidasa de Rábano (HRP) y Fosfatasa Alcalina.

A continuación de la inserción del anticuerpo ligado a la enzima se insertará dentro de la unidad de filtrado 110 una solución de sustrato específica al anticuerpo ligado a la enzima. Tales sustratos son muy conocidos para aquellos capacitados. Por ejemplo, si se utiliza un anticuerpo ligado a HRP, o fenilediamina se utilizaría como un sustrato; en el caso de Fosfatasa Alcalina el sustrato puede ser p-nitrofenil fosfato. La unidad de filtrado puede ser incubada subsecuentemente y se registrará el cambio en la solución de sustrato de acuerdo a las técnicas convencionales (por ejemplo un cambio de color). Si se obtiene un resultado negativo (es decir que no hubo cambios en la muestra observada) se pueden añadir subsecuentes anticuerpos ligados a enzimas y sustratos apropiados a la unidad de filtrado 110 hasta que se obtenga un resultado positivo, que indique que el microorganismo está presente en la muestra original. La unidad de filtrado 110 debe inundarse (con PBS por ejemplo) entre cada inserción subsecuente dentro de la unidad de filtrado 110 de un anticuerpo ligado a la enzima.

En una alternativa a lo anterior, la solución de anticuerpo ligado a la enzima se pasa a través de la unidad de filtrado 110, recogiendo el filtrado en un contenedor y agregando subsecuentemente un volumen apropiado de un sustrato específico a ese contenedor. Si los microorganismos presentes en el filtro no reaccionaron con la solución de anticuerpo ligado a la enzima pasado a través de la unidad de filtrado 110 el anticuerpo ligado a la enzima pasaría a través de la unidad de filtrado hacia el contenedor de recolección. Al agregar la solución de sustrato al contenedor de recolección se obtendría un resultado positivo, indicando que ese microorganismo particular no estaba presente dentro de la unidad de filtrado 110.

Además, se pueden agregar más soluciones específicas de anticuerpos ligados a enzimas a la unidad de filtrado 110 o al filtrado luego de un resultado positivo para poder subclasificar el microorganismo identificado.

Es preferible que las soluciones de anticuerpos ligados a enzima y soluciones de sustrato se provean en contenedores estériles sellados, como un frasco ampolla de plástico al que se le pueda romper el sellado y luego apretarlo para insertar la solución dentro de la unidad de filtrado 110 o una jeringa.

En el caso de que la prueba de la presente invención se lleve a cabo en una probeta (como se describe en la primera realización preferida y se ilustra en las figuras 1A y 1B) una muestra de la solución de reacción se puede tomar al finalizar la reacción de detección. Una tal muestra se puede tomar de la probeta 100 a través de una abertura por ejemplo, lo que puede obviar la necesidad de abrir el frasco ampolla que puede contener una cantidad substancial de microorganismos patogénicos y por lo tanto puede evitar la contaminación del ambiente que lo rodea. Una tal abertura puede estar presente en la tapa 102 en el caso descrito en la primera realización preferida con referencia a la Figura 1A o en la base 107 de la cabeza 105 en el caso del ejemplo ilustrado en la Figura 1B. Una vez que se haya tomado la muestra se la puede combinar con los anticuerpos ligados a la enzima y el sustrato y se la puede clasificar por medios clásicos para determinar la especie de microorganismo en la muestra original. Finalmente, se puede agregar un agente antibacteriano como hipoclorito de sodio para descontaminar la unidad de prueba.

Cuando se usa un anticuerpo ligado a fluorocromo se sigue el mismo procedimiento básico. Sin embargo, no hay necesidad de agregar un sustrato al filtro o filtrado porque los fluorocromos se pueden detectar directamente en la muestra monitoreando su emisión característica. Los fluorocromos adecuados incluyen Fluoresceína y Rodamina (isocianato de tetrametilrodamina). En el caso de los Fluorocromos es preferible que el filtrado se use para determinar la presencia o ausencia de microorganismos específicos.

Ventajas

La presente invención utiliza sólo un volumen pequeño de una composición de ensayo para brindar un método relativamente rápido de detectar microorganismos sobre una variedad de superficies o en una variedad de substancias. Puede también contar con la ventaja de que los componentes de la invención son tales que contienen los microorganismos durante la prueba de detección y por lo tanto ayudan a evitar cualquier contaminación mayor.

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Además, se puede proveer un patrón que se adapta para estandarizar el área de superficie a ser testeada. Esto puede resultar ventajoso cuando es necesario realizar una comparación de resultados entre pruebas.

Además, la presente invención se aplica fácilmente a una variedad de ambientes e industrias en las cuales la higiene es importante y la contaminación un problema, por ejemplo la preparación y elaboración de cosméticos, la preparación de farmacéuticos, ambientes de laboratorio, consultorios veterinarios y quirúrgicos, etc.

Variaciones

La composición de la presente invención puede ser alterada para sostener el crecimiento y detección de microorganismos diferentes a aquellos de los ejemplos dados en esta especificación sin salirse del alcance de la presente invención.

Será también apreciado que el tamaño del poro de los filtros descritos en las realizaciones preferidas de esta especificación se pueda alterar para usos específicos sin alejarse del alcance de la invención.

La realización preferida describe el uso de un instrumento de toma de muestras estéril y un patrón que define el área de muestreo y prueba. Estaría dentro del alcance de la invención que el instrumento estéril delineara el área de muestreo.

La composición de la presente invención se puede alterar para sostener el crecimiento y detección de microorganismos diferentes a la bacteria coliforme sin alejarse del alcance de la presente invención.

Claims

1. Un método para detectar microorganismos que abarca los pasos de tomar una muestra de una masa, superficie o un líquido a ser testeado, y proveer una cámara estéril obturable (100, 110) de capacidad volumétrica substancialmente limitada en la cual se llevará a cabo el proceso de detección, y caracterizado porque los pasos abarcan además el colocar la muestra en la cámara estéril obturable (100, 110), aislando substancialmente cualquier microorganismo presente en la muestra por filtración (110) dentro de la cámara estéril obturable (100, 110), colocar los microorganismos aislados en contacto con una composición (101) capaz de detectar microorganismos dentro de dicha cámara estéril obturable (100, 110), y registrar un cambio en la composición.

2. Un método para detectar microorganismos según la reivindicación 1, caracterizado porque la capacidad volumétrica de dicha cámara estéril obturable se selecciona del grupo que abarca: una cámara que es inferior o igual a aproxidamamente 10 centímetros cúbicos, y una cámara que es inferior o igual a aproximadamente 2 centímetros cúbicos.

3. Un método para detectar microorganismos según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la muestra se toma y se coloca en contacto con dicha composición en dicha cámara estéril obturable (100, 110) utilizando un instrumento de toma de muestras estéril (103).

4. Un método para detectar microorganismos según la reivindicación 3, caracterizado porque el método abarca los pasos de proveer un instrumento de delineación (108), delinear un área de una superficie a ser testeada, y colocar el instrumento estéril de toma de muestras (103) en contacto con substancialmente la totalidad del área delineada de la superficie a testear.

5. Un método para detectar microorganismos según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque por lo menos parte de la cámara estéril obturable (100, 110) es transparente y el cambio en la composición capaz de detectar microorganismos es tal que se puede visualizar por el ojo o en un espectrómetro.

6. Un método para detectar microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el método abarca también uno o más de los siguientes pasos: delinear un área de una superficie a ser testeada y colocar el instrumento estéril de toma de muestras (103) en contacto con substancialmente la totalidad del área delineada, extraer cualquier materia extraña de dicha muestra antes de colocar la muestra en contacto con la composición adaptada para detectar microorganismos, y clasificar cualquier microorganismo detectado luego de registrar un cambio en la composición adaptada para detectar microorganismos.

7. Un método para detectar microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el método abarca además los pasos de colocar una solución en dicha cámara estéril obturable (100, 110), aislar substancialmente cualquier microorganismo presente en la solución por filtración (110) dentro de la cámara estéril obturable (100, 110), colocar los microorganismos aislados en contacto con una composición (101) capaz de detectar microorganismos dentro de la cámara estéril obturable (100, 110), y registrar un cambio en la composición.

8. Un método para detectar microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la filtración (110) se realiza por un filtro de membrana construido de materiales de filtrado adecuados seleccionados del grupo que abarca ester de celulosa, nitrocelulosa, polietileno, polisulfona y policarbonato.

9. Un método según la reivindicación 8, caracterizado porque el filtro (110) tiene un tamaño de poro de 0,2 \mum o inferior.

10. Un método según la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el filtro (110) está alojado en un compartimento translúcido (100, 110) formado de material de plásticos, que tiene una espita de entrada (111) y una espita de salida (112).

11. Un método según la reivindicación 10, caracterizado porque la espita de entrada (111) posee una válvula de un solo sentido.

12. Un método según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la muestra se pasa por el filtro (110) por inyección o bombeado.

13. Un método para detectar microorganismos según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el método abarca también el paso de emplear un sistema de prefiltrado aguas arriba de la cámara estéril obturable para extraer cualquier materia extraña contenida en la muestra.

14. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque el sistema de prefiltrado abarca una unidad de filtrado que contiene un filtro con un tamaño de poro de 60 \mum y una unidad de filtrado que contiene un filtro con un tamaño de poro de 5 \mum, ubicados de tal manera que la muestra se filtra primero por la unidad de filtrado de 60 \mum, y luego por la unidad de filtrado de 5 \mum, antes de ingresar en la cámara estéril obturable.

15. Un método según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque los microorganismos detectados son tipificados utilizando anticuerpos ligados a enzimas.

16. Kit para la detección de microorganismos (110, 111, 112, 101) de acuerdo al método según cualquier reivindicación precedente, que abarca una cámara estéril obturable (111, 110, 112) bajo la forma de una unidad de filtrado (110), una cantidad definida de una composición (101) adaptada para detectar microorganismos, y medios para recoger y colocar dicha composición (101) en contacto con una muestra, donde los medios (111, 112) abarcan una espita de entrada (111) que contiene una válvula de un solo sentido y una espita de salida (112) ambas en comunicación con la unidad de filtrado (110), y los medios (111, 112) se adaptan para desplazar una muestra o composición a través de la unidad de filtrado (110) por inyección.

17. Uso de un kit según la reivindicación 16.