ES2288480T3 - Identificacion de material procedente de un conducto mamario. - Google Patents

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Abstract

Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método: examinar una muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador que comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas.

Description

Identificación de material procedente de un conducto mamario.
Antecedentes 1. Campo de la invención
El campo de esta invención está relacionado con métodos y sistemas para detectar cáncer de mama y precáncer de mama en seres humanos.
2. Descripción de la técnica antecedente
Durante varias décadas, miembros significativos de la comunidad médica dedicados al estudio del cáncer de mama han creído y demostrado que el análisis citológico de las células recuperadas de la secreción del pezón procedentes de los galactóforos puede proporcionar una información valiosa que lleve a la identificación de pacientes con riesgo de cáncer de mama. De hecho, el propio Papanicolaou contribuyó a la génesis de la posibilidad de un frotis "Pap" para el cáncer de mama por medio del análisis de las células contenidas en la secreción del pezón. Véase Papanicolaou et al, "Exfoliative Cytology of the Human Mammary Gland and Its Value in the Diagnosis of Cancer and Other Diseases of the Breast" Cancer (1958) March/April 377-409. Véase también Petrakis, "Physiological, biochemical, and cytological aspects of nipple aspirate fluid", Breast Cancer Research and Treatment 1986; 8:7-19; Petrakis, "Studies on the epidemiology and natural history of benign breast disease and breast cancer using nipple aspirate fluid" Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention (Jan/Feb 1993) 2:3-10; Petrakis, "Nipple Aspirate Fluid in epidemiological studies of breast disease", Epidemiologic Reviews (1993) 15:188-195. Más recientemente, también se han detectado marcadores en el fluido del pezón. Sauter et al, "Nipple aspirate fluid: a promising non invasive method to identify cellular markers of breast cancer risk", British Journal of Cancer 76(4):494-501 (1997). La detección de CEA en fluidos obtenidos poniendo un material absorbente en el pezón se describe en Imayama et al. (1996) Cáncer 78: 1229-1234.
Se cree que el cáncer de mama se origina en el revestimiento de un solo galactóforo de la mama; y además se cree que las mamas humanas contienen de 6 a 9 de estos conductos. Véase Sartorius, JAMA 224 (6): 823-827 (1973). Sartorius describe el uso de catéteres de un solo lumen del tipo piloso que se insertan en los conductos mamarios usando un microscopio de operación y en los conductos se descargó solución salina como se describe en Cassels, D, March 20th, 1973, The Medical Post, articulo titulado "New tests may speed breast cancer detection". Sartorius et al, Contrast ductography for recognition and localization of benign and malignant breast lesions: an improved technique, páginas 281-300. En: Logan WW, ed. Breast Carcinoma New York, Wiley, 1977. Después de infundir el fluido, el catéter se retiró porque era demasiado pequeño para recoger el fluido, la mama se apretó y el fluido que salía sobre la superficie del pezón se retiró de la superficie por medio de un tubo capilar. De forma similar, Love y Barsky, "Breast-duct endoscopy to study stages of cancerous breast disease", Lancet 348 (9033):997-999, 1996 describen la canulación de conductos mamarios con un catéter de un solo lumen y la infusión de una pequeña cantidad de solución salina, la retirada del catéter y la presión para recoger el fluido que vuelve a la superficie del pezón. El uso de un ductoscopio rígido de 1,2 mm para identificar papilomas intraductales en mujeres con secreción en el pezón se describe en Makita et al (1991) Breast Cancer Res Treat 18: 179-188. Seria ventajoso desarrollar métodos y dispositivos para recoger el fluido ductal desde dentro del conducto.
La galactografía, o la ductografía de contraste, ha localizado durante años conductos mamarios basándose en la secreción espontánea del pezón, infundiendo soluciones de colorante de contraste en los conductos (usando cánulas para este fin) y tomando imágenes de rayos-x para determinar la fuente de la secreción dentro del conducto. Véase, en general, The Breast: Comprehensive Management of Benign and Malignant Breast Diseases, Bland and Copeland eds. W.B. Saunders Co. Philadelphia PA 1991 páginas 61-67.
Las proteínas de la matriz nuclear están implicadas en los cánceres de vejiga, colon, próstata, mama y otros cánceres, y se han propuesto por Matritech, Inc (Newton, MA 02460) como parte de un kit para ensayar el cáncer de vejiga usando un fluido corporal. Para ensayar el cáncer de mama, se ha creado un ensayo sanguíneo usando anticuerpos contra proteínas de la matriz nuclear (véase la página web de Matritech, Inc. hffp://www.matritech.com). Los ensayos de sangre y de fluidos corporales se promueven al considerarse ensayos capaces de detectar de forma precoz los cánceres que se pretenden identificar. Además, se han detectado perfiles y patrones diferenciales de expresión de proteínas de la matriz nuclear para varios cánceres diferentes (Fey y Penman 1986, Stuurman 1990, y Getzenberg 1990).
Matritech, Inc. ha patentado diversos aspectos de proteínas y ácidos nucleicos de proteínas de la matriz nuclear, así como kits para ensayar su presencia para identificar cánceres en las Patentes de Estados Unidos 5.965.376, 5.914.238, 5.882.876, 5.858.683, 5.840.503, 5.830.677, 5.783.403, 5.780.596, 5.698.439, 5.686.562 y 5.547.928. Específicamente, Matritech ha patentado en las reivindicaciones de la Patente de Estados Unidos 5.914.238, un método para diagnosticar cáncer de mama en un paciente, que comprende detectar la presencia de una proteína asociada con el cáncer de mama en un tejido o fluido corporal obtenido a partir del paciente. La proteína asociada con el cáncer de mama tiene un peso molecular de aproximadamente 32.500 ó 33.000 Daltons y un punto isoeléctrico de aproximadamente 6,82, y tiene una secuencia de aminoácidos continua procedente de varias secuencias de aminoácidos descritas en la solicitud. La proteína de la matriz nuclear se detecta por anticuerpos policlonales o monoclonales o por amplificación por PCR de un producto de expresión del gen diana. La muestra del paciente en los ejemplos es una muestra de tejido de mama, aunque en la memoria descriptiva se reivindica y menciona la posibilidad de ensayar sangre o un fluido corporal. No se describe el ensayo del fluido del conducto mamario.
Sumario de la invención
Un objeto de la invención es identificar a un paciente que tiene un cáncer de mama o un precáncer de mama. De acuerdo con este objeto, se proporciona un método que comprende proporcionar una muestra de fluido ductal de un conducto de una mama de un paciente, sin que el fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, y examinar la muestra de fluido ductal para determinar la presencia de un marcador que comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas. De acuerdo con este objeto, también se proporcionan métodos para determinar marcadores que puedan identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama examinando la muestra de fluido ductal para determinar la presencia de un marcador que comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido o una forma peptídica del marcador. La invención también incluye un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método examinar una muestra de fluido ductal de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, examinar la muestra de fluido ductal para determinar la presencia de un marcador que comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas; donde el marcador puede diferenciar entre dos categorías citológicas cualesquiera consistentes en normal, anormal, hiperplasia, atipia, carcinoma ductal, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma ductal in situ - bajo grado (DCIS-LG), carcinoma ductal in situ - alto grado (DCIS-HG), carcinoma invasivo, cambios atípicos leves, cambios atípicos marcados, hiperplasia ductal atípica (ADH), insuficiente material celular para el diagnóstico y suficiente material celular para el diagnóstico.
La invención proporciona además un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, examinando una muestra de fluido ductal de al menos un conducto de una mama del paciente; y examinando la muestra de fluido ductal para determinar la presencia de un marcador que comprende un producto de expresión de un gen que codifica una proteína de la matriz nuclear. El producto de expresión puede comprender un ácido nucleico o un polipéptido. El producto de expresión puede comprender ARN o una proteína o parte de una proteína. La proteína de la matriz nuclear puede ser lamina A, lamina B, lamina C, una proteína de la matriz periférica, una proteína del aparato del huso mitótico nuclear (NuMA), topoisomerasa II, o una proteína de la matriz nuclear interna. El producto de expresión puede ser un polipéptido y el examen puede comprender poner en contacto el marcador polipeptídico con un anticuerpo que se une específicamente a una parte del polipéptido. El producto de expresión puede ser un ácido nucleico y el examen puede comprender la detección de la presencia del ácido nucleico. La detección de la presencia del ácido nucleico puede comprender amplificar el ácido nucleico. El fluido puede obtenerse por aspiración de los galactóforos en el pezón. La muestra de fluido puede obtenerse lavando el lumen ductal y recuperando fluido y células del lumen. El fluido recogido puede proceder de un solo conducto.
Descripción detallada de realizaciones preferidas de la invención
El método de la invención proporciona un método de selección para detectar cáncer de mama o precáncer de mama en mujeres que comprende examinar una muestra de fluido ductal de un conducto de una mama del paciente; y detectar un nivel aumentado de un marcador, donde un nivel aumentado de uno o mas marcadores indica un mayor riesgo de cáncer o precáncer de mama.
El método se pone en práctica examinando una muestra de fluido ductal de un conducto de una mama del paciente. La disposición de la muestra de fluido ductal puede comprender la obtención de la muestra a partir de la mama. La disposición de la muestra de fluido ductal también puede comprender la recepción de una muestra que se había obtenido previamente. Por ejemplo, un laboratorio puede recibir una muestra de fluido ductal de un paciente o un médico, y se le puede pedir al laboratorio que realice un análisis de la muestra. Cuando el fluido se obtiene a partir de la mama, la muestra de fluido puede obtenerse, por ejemplo, por aspiración en el pezón de los galactóforos o por lavado ductal de un galactóforo. Cuando se recoge el fluido por aspiración en el pezón, o por lavado ductal, puede recogerse el fluido de un solo conducto. Por ejemplo, el conducto y el tubo de recogida pueden marcarse de forma que el análisis del fluido se dirija a un conducto.
Por el procedimiento de lavado ductal, por medio de lavado se retiran del conducto células del epitelio ductal que revisten las paredes del lumen ductal. El fluido de lavado se introduce en el conducto por infusión, y se recoge el fluido de lavado mezclado con el fluido ductal. El lavado se describe en solicitudes en trámite y del mismo propietario que la presente, incluyendo los documentos 09/067.661, 09/301.058, PCT US99/09141, 60/122.076, 09/313.463, 60/143.359, y la Solicitud de Estados Unidos nº 09/473.510. En algunos casos, puede aplicarse succión a la herramienta que accede al lumen ductal para recuperar una cantidad máxima de células y/o fluido. El fluido de lavado puede introducirse en el conducto por infusión y después recogerse. Puede aplicarse succión a la herramienta que accede al lumen ductal para recuperar una cantidad máxima de células y/o fluido.
El acceso a un conducto mamario puede facilitarse como se describe, por ejemplo, en Love & Barsky, (1996) Lancet 348: 997-999, Makita et al (1991) Breast Cancer Res Treat 18: 179-188, u Okazaki et al (1991) Jpn J. Clin. Oncol. 21:188-193. Como alternativa, el fluido ductal puede recuperarse por una herramienta médica, por ejemplo, un catéter o una cánula introducida en el conducto para infundir fluido de lavado y para recuperar una mezcla de fluido de lavado y ductal. El fluido del conducto mamario puede contener células del epitelio ductal, incluyendo células de una fase que se considera precancerosa o cancerosa.
La aspiración en el pezón del fluido ductal de la mama se consigue usando presión de vacío. También se describen y reivindican técnicas de aspiración en el pezón en la solicitud de patente en tramite y del mismo propietario que la presente: Solicitud de Patente de Estados Unidos nº: 09/438.219, incorporada en este documento como referencia en su totalidad. El fluido aspirado del pezón puede recuperarse como se describe, por ejemplo, en Goodson WH & King EB, Capítulo 4: Discharges and Secretions of the Nipple, The Breast: Comprehensive Management of Benign and Malignant Diseases (1998) 2ª Ed. vol 2, Bland & Kirby eds. W.B. Saunders Co, Philadelphia, PA páginas 51-74; Wrensch et al., (1992) American Journal of Epidemiology. 135(2): 130-41; y Sauter et al (1997) British Journal of Cancer. 76(4):494-501. El lavado ductal se describe en la solicitud de patente en trámite junto con la presente USSN 09/067.661 presentada el 28 de Abril de 1998. Las células de la lesión pueden recuperarse recogiendo el fluido ductal que contiene algunas de estas células, por ejemplo, aspirando el pezón para obtener un fluido aspirado del pezón, por ejemplo, como se describe en Petrakis (1993) Cancer Epidem. Biomarker Prev. 2:3-10, Petrakis (1986) Breast Cancer Res. Treat 8: 7-19, Wrensch et al (1992) Am. J. Epidem. 135:130-141, Wrensch et al (1990) Breast Cancer Res Treat 15: 39-21, y Wrensch et al (1989) Cancer Res. 49: 2168-2174. También pueden recogerse secreciones de fluido del pezón según aparecen espontáneamente en la superficie del pezón. Para recoger el fluido no mezclado con el fluido ductal de otros conductos, el médico observa cuidadosamente los signos del fluido y recupera el fluido de la superficie del pezón cerca del orificio antes de que pueda mezclarse con el fluido de cualquier otro orificio.
El fluido ductal puede analizarse in situ, es decir, dentro de la mama y dentro del conducto mamario, por ejemplo, cuando puede introducirse un marcador particular en el conducto y puede identificarse dentro de la mama. El ensayo in situ dentro del conducto también se considera un medio no invasivo para examinar las células del epitelio ductal. Las células del epitelio ductal que se examinan por el método de la invención pueden examinarse in situ (es decir, en el conducto; por ejemplo, cuando un marcador puede unirse a las células o a un componente de las células en el conducto y puede identificarse dentro de la mama por una señal unida al marcador), o después de haber extraído las células del epitelio ductal de la mama del paciente por medios no invasivos, por ejemplo, como se acaba de describir. Los métodos de análisis in situ pueden incluir el uso de herramientas de biología molecular, métodos y materiales tales como los descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos nº 5.169.774, 5.720.937, 5.677.171, 5.720.954, 5.725.856, 5.770.195 y 5.772.997. También pueden usarse marcadores para el cáncer de mama y el precáncer de mama descritos en otras partes y en este documento para un análisis in situ del conducto mamario.
El fluido ductal se examina para detectar la presencia de células del epitelio ductal precancerosas o cancerosas. La muestra de fluido (que comprende células del epitelio ductal) puede analizarse por cualquier medio eficaz para identificar un precáncer o cáncer de mama, incluyendo, por ejemplo, el análisis citológico de las células recuperadas o identificadas. El examen de las células del epitelio ductal puede realizarse examinando indicadores útiles tales como, por ejemplo, la morfología de las células o el contenido celular. El contenido celular puede incluir, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, partículas, complejos u otros marcadores bioquímicos o moleculares de las células. La morfología celular puede servir para establecer si las células del epitelio ductal son normales (es decir, no son precancerosas o cancerosas o tienen otra anomalía no cancerosa), precancerosas (es decir, comprenden hiperplasia, hiperplasia ductal atípica (ADH) o carcinoma ductal de bajo grado in situ ((LG-DCIS)) o cancerosas (es decir, comprenden un carcinoma ductal de alto grado in situ (HG-DCIS), o un carcinoma invasivo).
El análisis del contenido celular puede servir para establecer el estadio de una forma similar a como se establece por la morfología, capturando generalmente una progresión de un estado precanceroso o canceroso en las células. De esta manera, las células del epitelio ductal pueden analizarse con respecto a otros marcadores, por ejemplo, marcadores proteicos, marcadores de ácido nucleico, partículas, complejos o marcadores bioquímicos o moleculares en las células o en las superficies celulares o secretados por la célula, o con respecto a cualquier marcador que proporcione indicios de neoplasia. La célula del epitelio ductal puede proceder de cualquier parte del galactóforo, incluyendo, por ejemplo, el lumen ductal y/o la unidad lobular ductal terminal (TDLU). Las células derivadas de la TDLU también pueden tener estadios similares a los encontrados en otras células del epitelio ductal luminal que no proceden de la TDLU incluyendo, por ejemplo, hiperplasia, atipia, carcinoma in situ y carcinoma invasivo.
Una vez que se ha introducido por infusión el fluido de lavado en el conducto y una vez que se ha recogido el fluido de lavado y el fluido ductal de un conducto mamario, el material celular puede separarse y puede examinarse. El material celular puede incluir, por ejemplo, sustancias seleccionas entre el grupo consistente en células enteras, desechos celulares, proteínas, ácidos nucleicos, polipéptidos, glicoproteínas, lípidos, grasas, glicoproteínas, moléculas orgánicas pequeñas, metabolitos y macromoléculas. Por medio de citología o cualquier otro método adecuado para analizar el estado de las células, se pueden examinar las células enteras. Otros marcadores presentes en el material celular, el fluido ductal en general u otro material obtenido a partir del conducto mamario puede analizarse como sea apropiado para el marcador que se esta buscando, incluyendo, por ejemplo ensayos de unión, inmunohistoquímica o usando otra tecnología analítica para distinguir e identificar moléculas biológicas obtenidas a partir del material biológico.
La identificación de un paciente con cáncer de mama o precáncer de mama puede realizarse retirando el fluido del conducto mamario del paciente y analizando el fluido que comprende el contenido ductal con respecto a marcadores que pueden indicar un estado canceroso o precanceroso en la mama. La disposición de una muestra de fluido ductal procedente de un conducto de una mama de un paciente incluye que el fluido no se mezcle con el fluido ductal de ningún otro conducto de la mama. El método se pone en práctica examinando una muestra de fluido ductal de un conducto de una mama del paciente.
La disposición de la muestra de fluido ductal también puede comprender la recepción de una muestra que se había obtenido previamente. Por ejemplo, un laboratorio puede recibir una muestra de fluido ductal de un paciente o un medico, y puede pedirse al laboratorio que realice una análisis de la muestra. Cuando el fluido se obtiene a partir de la mama, la muestra de fluido puede obtenerse, por ejemplo, por aspiración en el pezón de los galactóforos o por lavado ductal de un galactóforo. Cuando se recoge fluido por aspiración en el pezón o por lavado ductal, puede recogerse el fluido de un solo conducto. Por ejemplo, el conducto y el tubo de recogida pueden marcarse de forma que el análisis del fluido se dirija a un conducto.
El fluido ductal puede recuperarse poniendo una herramienta de acceso ductal en el conducto, infundiendo fluido dentro del conducto a través de la herramienta y recuperando del conducto al que se tiene acceso a través de la herramienta una parte del fluido infundido mezclado con el fluido ductal. El proceso puede repetirse para más de un conducto de una mama, y/o el proceso puede repetirse para una pluralidad de conductos de una mama. Puede usarse el acceso secuencial o simultáneo del conducto en una mama.
La siguiente etapa en el método después de recoger el fluido es examinar la muestra de fluido ductal para determinar la presencia de un marcador que comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas.
El examen de la muestra de fluido ductal puede comprender determinar la presencia de un marcador que comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido o una forma peptídica de un marcador seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor, un ligando, un factor proteico, un antígeno, un anticuerpo, una enzima, una proteína soluble, una proteína citosólica, una proteína citoplásmica, un supresor tumoral, un antígeno de la superficie celular, un fosfolípido, una lipoproteína, una proteína que responde a hormonas, un antígeno asociado con la diferenciación, una antígeno asociado con la proliferación, un antígeno asociado con la metástasis, una proteína integral de la membrana, una proteína que participa en la ruta apoptótica, una proteína que participa en la ruta de activación de la trascripción, una molécula de adhesión celular, una proteína de la matriz extracelular, un proteolípido, una citoquina, una proteína de la membrana basal, una glicoproteína de tipo mucina, una histona, una ribonucleoproteína, un ácido siálico, una proteína de la matriz ósea, un antígeno carbohidrato, una proteína nuclear, una fosfoproteína nuclear, un protooncogen, un oncogen, una apolipoproteína, una proteasa de serina, un antígeno de rechazo tumoral, una proteína surfactante, una proteína de muerte celular, una endoproteasa de cinc y un gen trefoil.
El examen de la muestra de fluido ductal puede comprender la determinación de la presencia de un marcador que comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido, o una forma peptídica de un marcador seleccionado entre el grupo compuesto por una quimioquina, una lectina, una integrina, una selectina, una queratina, una interleuquina, una taxina, una ferritina, una lipocalina, una laminina, una ciclina, una relaxina, una nucleína, una caspasa, un antígeno asociado a melanoma, una proteína inflamatoria de macrófagos, una proteína de unión tipo gap, una proteína de unión a calcio, una proteína de unión a actina, una proteína de unión a fosfolípidos, una proteína de choque térmico, una proteína del ciclo celular, un activador de tirosina y triptófano hidroxilasa, un miembro de la familia de proteínas del factor de necrosis tumoral, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación alfa, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación beta, un miembro de la familia de proteínas Bcl2, una proteína de interacción con Bcl2, una proteína asociada a Bcl2, un miembro de la familia de proteínas de vasopresina/oxitocina y un miembro de la familia de proteínas de la proteína de unión a secuencias CCAAT/potenciadoras.
El examen de la muestra de fluido ductal puede comprender la determinación de la presencia de un marcador, donde el marcador es una enzima y la enzima comprende un RNA, DNA, proteína, polipéptido o forma peptídica de una enzima seleccionada entre el grupo compuesto por una fosforilasa, una fosfatasa, una descarboxilasa, una isoenzima, una quinasa, una proteasa, una nucleasa, una peptidasa, una proteasa, una DNasa, una RNasa, una aminopeptidasa, una topoisomerasa, una fosfodiesterasa, una aromatasa, una ciclooxigenasa, una hidroxilasa, una deshidrogenasa, una metaloproteinasa, una telomerasa, una reductasa, una sintasa, una elastasa, una tirosinasa, una transferasa y una ciclasa.
El examen de la muestra de fluido ductal puede comprender la determinación de la presencia de un marcador, donde el marcador es un receptor y el receptor comprende un ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un receptor seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor de hormonas esteroideas, un receptor de factores del crecimiento, un receptor de quinasa, un receptor asociado a proteínas G, un receptor de la familia del TNF, un receptor de tirosina quinasa, un receptor de vasopresina, un receptor de oxitocina y un receptor de serina proteasa.
El examen de la muestra de fluido ductal puede comprender la determinación de la presencia de un marcador, donde el marcador es un factor proteico y el factor comprende un ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor del crecimiento, un factor proteolítico, un factor de células estromáticas, un factor de células epiteliales, un factor de angiogénesis, un factor de células epiteliales, un factor angiogénico y un factor estimulador de colonias.
El examen de la muestra de fluido ductal puede comprender la determinación de la presencia de un marcador, donde el marcador es un inhibidor y el inhibidor comprende un ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un inhibidor seleccionado entre el grupo compuesto por un inhibidor de una ciclina, un inhibidor de un complejo de ciclina, una serpina, un inhibidor de la degradación proteolítica, un inhibidor tisular de una metaloproteasa y un inhibidor de la angiogénesis.
El examen de fluido ductal puede comprender la identificación de un nivel o cualidad de al menos un marcador que comprende un producto de expresión de un gen que codifica una proteína de la matriz nuclear.
Un nivel del marcador puede ser una presencia con respecto a un control normal o una ausencia con respecto a un control normal de un marcador dado. El control normal puede determinarse con respecto al paciente particular, o con respecto a una población de pacientes.
Además, puede evaluarse la cualidad del marcador. Una cualidad de un marcador puede ser cambios tales como una mutación de ADN, o una cantidad de mutaciones, un deterioro de la calidad o cantidad de cromosomas, la degradación de una proteína o un cambio en la cantidad de un ácido nucleico o cromosoma. Una cualidad puede ser una erosión de una molécula, partícula, molécula u orgánulo con respecto a una cualidad normal.
Una vez que se ha introducido el fluido de lavado por infusión en el conducto y que se ha recogido el fluido de lavado y el fluido ductal de un conducto mamario, el material celular puede separarse y puede examinarse. El material celular puede incluir, por ejemplo, sustancias seleccionadas entre el grupo compuesto por células enteras, desechos celulares, proteínas, ácidos nucleicos, polipéptidos, glicoproteínas, lípidos, grasas, glicoproteínas, moléculas orgánicas pequeñas, metabolitos y macromoléculas. El examen de la muestra de fluido ductal para determinar la presencia de un marcador que comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas. La detección y análisis de estas clasificaciones de marcadores puede realizarse como se describe mas adelante, usando ensayos convencionales para determinar la presencia de marcadores o clasificaciones de marcadores indicadas, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989).
Por medio de la citología o cualquier otro método adecuado para analizar el estado de las células se pueden examinar las células enteras. Otros marcadores presentes en el material celular, fluido ductal en general u otro material obtenido a partir del conducto mamario puede analizarse como sea apropiado para el marcador que se está buscando, incluyendo, por ejemplo, ensayos de unión, inmunohistoquímica o el uso de otra tecnología analítica para distinguir e identificar moléculas biológicas obtenidas a partir de un material biológico.
También pueden ensayarse componentes intracelulares, secretados o no secretados y que se encuentran en el fluido ductal. Por ejemplo, pueden identificarse partículas con forma de anillo que comprenden proteínas, ADN y ARN usando un ensayo y/o inmunógeno de unión como se describe en las Patentes de Estados Unidos nº 5.635.605 y 5.459.035, y en el documento EP 465.715, incluyendo (como se describe) un medio de cromatografía de afinidad específico para proteínas con características particulares (en el caso de la partícula con forma de anillo un pliegue dinucleotídico) y un inmunoensayo convencional que procede como se describe. Además, pueden identificarse complejos de proteínas u otras moléculas. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que se unen a complejos, por ejemplo complejos de la matriz extracelular, para identificar un complejo que se considera un marcador del cáncer de mama. El proceso de identificación de estos complejos se describe en el documento WO 96/12192.
Se describen marcadores ilustrativos en Masood S., (Prediction of recurrence for advanced breast cancer. Traditional and contemporary pathologic and molecular markers) Surgical Oncology Clinics of North America. 4(4):601-32, 1995; Lopez-Guerrero et al (1999) J Hematother 8(1):53-61; Marjumdar and Diamandis (1999) Br J Cancer 79(9-10):1594-602; Balleine et al (1999) Br J Cancer 79 (9-10):1564-71; Houston et al (1999) Br J Cancer 79(7-8):1220-6; Nikolic-Vukosavljevic et al (1998) Tumori 84(6):691-4; Maguire et al (1998) Int J Biol Markers 13(3):139-44; Stearns et al (1998) Breast Cancer Res Treat 52(1-3):239-59; Eiriksdottir et al (1998) Eur J Cancer 34(13):2076-81, y Patente de Estados Unidos nº 5.169.774. Muchos marcadores de cáncer de mama conocidos se describen en libros de texto médicos fácilmente adquiribles sobre el cáncer de mama. Además, en la misma muestra pueden identificarse y analizarse varios marcadores, por ejemplo, Fabian et al 1993 J. Cellular Biochemistry 17G:153-16 y Fabian et al 1994 Breast Cancer Res Treat 30(3):263-74 estudiando el receptor de estrógenos (ER), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), p53 mutante, HER-2 neu por inmunohistoquímica y estudiando aneuploidías por análisis de imágenes en aspirados con agujas finas. Los métodos descritos en este documento pueden ponerse en práctica por analogía al análisis del contenido del fluido ductal, particularmente células del epitelio ductal recuperadas por aspiración en el pezón y/o por técnicas de lavado ductal.
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La anomalías cromosómicas en las células del epitelio ductal también pueden proporcionar información y actuar como marcadores para identificar cáncer o precáncer como se describe en Mark et al (1999) Cancer Genet Cytogenet 108:26-31; Lundlin and Mertens (1998) Breast Cancer Res Treat 51:1-15; Newsham (1998) Am J Pathol 153:5-9; Larson et al (1998) Am J Pathol 152:1591-8; Adelaide et al (1998) Genes Chromosomes Cancer 22:186-99; Fejzo et al (1998) Gene Chromosome Cancer 22:105-113; Dietrich et al (1998) Hum Pathol 12: 1379-82; Cavalli et al (1997) Hereditas 126:261-8; Adeyinka et al (1997) Cancer Genet Cytogenet 97:119-21; Afify and Mark (1997) Cancer Genet Cytogenet 97:101-5; Brenner and Aldaz (1997) Prog Clin Biol Res 396:63-82; Mark et al (1997) Ann Clin Lab Sci 27:47-56; y Fabian et al 1993 J. Cellular Biochemistry 17G:153-16.
Otros marcadores del cáncer de mama pueden detectarse como se describe en Springer, G.F. et al, Dao et al, Eds, Tumor Markers and Their Significance in the Management of Breast Cancer, páginas 47-70, New York; A.R. Liss, 1986. Además de algunos marcadores descritos y/o artículos o libros citados sobre marcadores de cáncer de mama y precáncer de mama, incluyendo los marcadores indicados en Porter-Jordan y Lippman, "Overview of the biological markers of breast cancer", Hematology/Oncology Clinics of North America vol. 8 (1):73-100,1994), en este documento se indican los siguientes marcadores de cáncer como ejemplos y pueden usarse, al igual que otros marcadores, para analizar el estado de un conducto mamario, incluyendo el análisis del contenido ductal (incluyendo fluido y células). Pueden usarse procedimientos de ensayo convencionales para identificar los marcadores, incluyendo anticuerpos u otras moléculas de unión, moléculas marcadoras, tintes, análisis de patrones (para células y componentes celulares) y, en general, cualquier otra técnica de identificación química o visual.
Los marcadores ilustrativos que se están estudiando actualmente por los investigadores que dirigen su investigación al cáncer de mama incluyen, por ejemplo, antígeno embrionario de carcinoma (CEA), antígeno especifico de próstata (PSA), antígeno Erb B2, proteína del fluido de la enfermedad quística generalizada-15 (GCDFP-15), y lactosa deshidrogenasa (LDH). En relación con CEA, véase Imayama et al, Cancer 1996, 78(6):1229-34; lnaji et al, Cancer 1987, 60(12):3008-13; Mori Int Conger Seer 1989, 807:211-8; Inaji, et al, An To Kagaku Ryoho 1991, 18(2):313-7; Yayoi, et al Gan To Kagaku Ryoho 1994, 21 Suppl 2:133-9; Mori, et al Jpn J Clin Oncol 1989,19(4):373-9; Foretova, et al Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol 1995,14:A101; y Nishiguchi, et al Rinsho Byori 1992, 40(1):67-72. En relación con PSA, véase Foretova and Garber Lancet 1996, 347(9015):1631; Sauter et al, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 5(12):967-70, 1996; Sauter and Daly (1996) Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 37:A1458; y Foretova and Garber (1996) Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 37:A1446. En relación con Erb 2, véase Motomura (1995) Breast Cancer Res and Treat 33:89-92; y Inaji et al (1993) Tumour Biol 14:271-8. En relación con GCDFP-15, véase Petrakis et al (1994) Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 35:A1698. En relación con LDH, véase Mannello et al (1995) Cancer 76:152-4; y Kawamoto (1994) Cancer 73:1836-41.
Generalmente, los marcadores pueden ser, por ejemplo, una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas. Estos marcadores pueden detectarse por detección de un ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un marcador seleccionado entre el grupo compuesto por, por ejemplo, una quimioquina, una lectina, una integrina, una selectina, una queratina, una interleuquina, una taxina, una ferritina, una lipocalina, una laminina, una ciclina, una relaxina, una nucleína, una caspasa, un antígeno asociado a melanoma, una proteína inflamatoria de macrófagos, una proteína de unión de tipo gap, una proteína de unión a calcio, una proteína de unión a actina, una proteína de unión a fosfolípidos, una proteína de choque térmico, una proteína del ciclo celular, un activador de tirosina y triptófano hidroxilasa, un miembro de la familia de proteínas del factor de necrosis tumoral, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación alfa, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación beta, un miembro de la familia de proteínas Bcl2, una proteína de interacción con Bcl2, una proteína asociada a Bcl2, un miembro de la familia de proteínas de vasopresina/oxitocina, y un miembro de la familia de proteínas de la proteína de unión a secuencias CCAAT/potenciadoras; o seleccionado entre el grupo compuesto por una quimioquina, una lectina, una integrina, una selectina, una queratina, una interleuquina, una taxina, una ferritina, una lipocalina, una laminina, una ciclina, una relaxina, una nucleína, una caspasa, un antígeno asociado a melanoma, una proteína inflamatoria de macrófagos, una proteína de unión de tipo gap, una proteína de unión a calcio, una proteína de unión a actina, una proteína de unión a fosfolípidos, una proteína de choque térmico, una proteína del ciclo celular, un activador de tirosina y triptófano hidroxilasa, un miembro de la familia de proteínas del factor de necrosis tumoral, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación alfa, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación beta, un miembro de la familia de proteínas Bcl2, una proteína de interacción con Bcl2, una proteína asociada a Bcl2, una miembro de la familia de proteínas de vasopresina/oxitocina y un miembro de la familia de proteínas de la proteína de unión a secuencias CCAAT/potenciadoras. Un ejemplo de un marcador peptídico es el péptido de degradación de fibrinógeno, que puede ensayarse como se describe en el documento WO 98/55872.
El marcador puede ser, también o como alternativa, una enzima, y la enzima puede comprender ARN, ADN, proteína, polipéptido o una forma peptídica de una enzima tal como, por ejemplo, una fosforilasa, una fosfatasa, una descarboxilasa, una isoenzima, una quinasa, una proteasa, una nucleasa, una peptidasa, una proteasa, una DNasa, una RNasa, una aminopeptidasa, una topoisomerasa, una fosfodiesterasa, una aromatasa, una ciclooxigenasa, una hidroxilasa, una deshidrogenasa, una metaloproteinasa, una telomerasa, una reductasa, una sintasa, una elastasa, una tirosinasa, una transferasa o una ciclasa.
El marcador, también o como alternativa, puede ser un receptor y el receptor puede comprender un ARN, ADN, proteína, polipéptido o una forma peptídica de un receptor tal como, por ejemplo, un receptor de hormonas esteroideas, un receptor de factores del crecimiento, un receptor de quinasa, un receptor asociado a proteínas G, un receptor de la familia del TNF, un receptor de tirosina quinasa, un receptor de vasopresina, un receptor de oxitocina y un receptor de serina proteasa.
El marcador, también o como alternativa, puede ser un factor proteico y el factor proteico y el factor proteico puede comprender ARN, ADN, polipéptido o una forma peptídica de un factor proteico tal como, por ejemplo, un factor de crecimiento, un factor proteolítico, un factor de células estromáticas, un factor de células epiteliales, un factor de angiogénesis, un factor de células epiteliales, un factor angiogénico o un factor estimulador de colonias.
El marcador, también o como alternativa, puede ser un inhibidor y el inhibidor puede comprender un ARN, un ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un inhibidor tal como, por ejemplo, un inhibidor de una ciclina, un inhibidor de un complejo de ciclina, una serpina, un inhibidor de la degradación proteolítica, un inhibidor tisular de una metaloproteasa y un inhibidor de la angiogénesis.
Las diferentes categorías de marcadores se ensayan de forma diferente dependiendo de la categoría y posiblemente también de la localización del marcador en la célula (por ejemplo, una proteína de la superficie celular podría detectarse de forma diferente que una proteína citoplásmica o nuclear). Típicamente, pueden usarse ensayo que comprenden uno o mas de los siguientes sucesos: unión, coloración, precipitación, selección en columnas de afinidad, unión in situ, unión en fase de solución, marcaje de sondas de ácido nucleico, marcaje con sondas de proteínas, marcaje con sondas de polipéptidos, marcaje con sondas de péptidos, y/o una combinación o variación de estos procesos. Se describen procedimientos convencionales para realizar estos ensayos (por ejemplo, ELISA, hibridación de sondas de ARN o ADN y otros ensayos de unión o detección) en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989).
Mas específicamente, en la Tabla I presentada mas adelante se describen ejemplos de detección de marcadores o clases particulares de marcadores, indicando ejemplos de marcadores y citando referencias en las que se detectan esos marcadores. En el caso de los marcadores no indicados específicamente, en categorías amplias tales como, por ejemplo, proteínas, lípidos, transcritos de ARN, glicoproteínas y otras categorías, pueden detectarse otros marcadores específicos de la misma forma que los marcadores específicos de la misma categoría o de una categoría similar. En la Tabla I se indican algunos de estos marcadores específicos que pertenecen a categorías más amplias.
Además de algunos marcadores descritos y/o artículos o libros citados sobre marcadores del cáncer de mama y precáncer de mama, en este documento se indican los siguientes marcadores de cáncer como ilustrativos y pueden usarse, así como otros marcadores, para analizar el estado de un conducto mamario. Pueden usarse procedimientos de ensayo convencionales para identificar los marcadores, incluyendo anticuerpos u otras moléculas de unión, moléculas marcadoras, tintes, análisis de patrones (para células y componentes celulares) y, en general, cualquier otra técnica de identificación química o visual.
A continuación se proporcionan posibles marcadores ilustrativos para esta identificación y análisis: catepsinas (incluyendo la catepsina D); maspina, fas, ligando fas, inhibidor tisular de metaloproteinasa de matriz-1 (TIMP-1); quimioquinas (tanto quimioquinas de tipo C-C como de tipo C-X-C); colagenasas, metaloproteinasas, TIMP, catepsinas, epítopos de la membrana basal fragmentados, estromelisina-3; citoqueratinas (por ejemplo, queratina 14, B1, KA1, KA4 y 312C8-1); receptores de estrógenos y progesterona (o cualquier receptor de andrógenos o receptor de otro esteroide); receptores de factores del crecimiento para miembros de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) incluyendo FGF1-18, factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor de crecimiento semejante a insulina-1 (IGF-I), IGF-II, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), y factor de crecimiento epitelial (EGF); factor de crecimiento placentario (PLGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de necrosis tumoral (TNF), factor de crecimiento de transformación (TGF) tanto en forma alfa como en forma beta, y angiopoyetina, por ejemplo; proteínas de choque térmico (HSP) (por ejemplo HSP27) 27 (HSP27); receptores de tirosina quinasa ErB de tipo 1 (por ejemplo, Her2 (un receptor de EGF) o cualquier ligando o receptor de la familia ErbB de ligandos y receptores); integrinas, selectinas, cadherinas, por ejemplo (es decir, integrina alfa y beta 3); queratina-14; antígenos de cáncer conocidos incluyendo, por ejemplo, Ki-67, Ki-S1, p53, nm23, bcl-2, p21 ras, ciclinas y pS2; péptido activador del receptor de trombina, uroquinasa, activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (UPA), plasmina antiplasmina; receptor de UPA (UPAR), fibrinógeno, inhibidor del activador de plasmina-1 y 2 (PAI-1 y 2); telomerasa; anticuerpos contra el antígeno-72 asociado a tumores (TAG-72) (por ejemplo, B72.3, B6.2, y TKH2); antígeno carcinoembrionario (CEA) (véase, por ejemplo, el documento EP 319.686); antígeno específico de próstata (PSA); proteína del fluido de la enfermedad quística generalizada-15 (GCDFP-15); lactosa deshidrogenasa (LDH); anomalías cromosómicas (por ejemplo, aneuploidía u otras anomalías); proteína S1; fosfatasa alcalina; miosina; sialil glicopéptido Tn (STn) (por ejemplo TAG-72); glicopéptido Tn; y proteínas de la matriz nuclear (como se describe en la solicitud de patente provisional presentada con fecha 17-11-99 con el nº de expediente PDH 99-029, incorporada en este documento como referencia en su totalidad).
Otros marcadores de cáncer de mama incluyen, por ejemplo, alanina aminopeptidasa, alfa 6 integrina, alfa-lactalbúmina, antígeno AN43 (BB1), anexina 1, anti-Her2, anti-p53, Bad, BAG-1, Bak, Bax, BCA225, Bcl-2, Bcl-x, oligosacáridos beta 1-6 ramificados, beta-2 microglobulina (BMG), Bfl-1, sialoproteína ósea (BSP), C/EBP beta-LIP, antígeno Ca 1, CA27.29, CA M26, CA M29, CA125, CA15.3, CA195, CA19-9, CA50, CA549, Cadherina-11, receptor de calcitonina (CTR), catepsina B, catepsina L, CD 105, CD24, CD34 (marcador pan-endotelial), CD44, CEA, c-met, c-myc, Cox-1, Cox-2, CPP32, nucleótido cíclico fosfodiesterasa, ciclina E, ADN topoisomerasa ll-alfa, ADN topoisomerasa ll-beta, EGF, EGFR, E-selectina, fosfatasa alcalina sensible a homoarginina rápida (FHAP), ácido graso sintasa, ferritina, GCDFP-15/BRST-2, Her-2 (extracelular), h-mts1 (S100A4), hsc73, hsp70, hsp90alpha, hsp90beta, ID1, ID3, interleuquina-1 beta, queratina 8, queratina 18, queratina 19, laminina, receptor de laminina (MluC5), leucina aminopeptidasa (LAP), ácido siálico unido a lípidos (LSA), MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, glicoproteínas Man6-P, MCA, Mcl-1, metalotioneína (MT), MKP-1, MMP-2, MMP-9, MSA, MUC-2, MUC-3, MUC-6, Nm23, ornitina descarboxilasa (ODC), osteopontina (OPN), P114 (proteína de unión a MAR), P120 (un antígeno de la proliferación nucleolar), p125FAK, p330d/CENP-F (un marcador para la proliferación celular), PAI-2, Pepsinógeno C, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), factor plaquetario 4 (marcador angiogénico), proteína quinasa C (PKC), PSA, pirimidina nucleósido fosforilasa, ras p21, glutatión reducido (GSH), receptor alfa del retinoide X, proteína S2 ribosómica, sialiltransferasa, Estromelisina-1 (MMP-3), proteínas surfactantes A, proteínas surfactantes B, TAG-12, TFF-1, TFF-3 (también denominado ITF, hP1.B y es otra proteína trefoil además de pS2), trombina, trombomodulina, timidina fosforilasa (TP), timosina beta 15, ferritinas citosólicas celulares, antígeno polipeptídico tisular (TPA), TPS (antígeno para el anticuerpo M3), uPAl, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-R1, VEGF-R2 y VEGF-R3.
En general, los marcadores pueden clasificarse de forma no exclusiva y a menudo en las siguientes categorías solapantes: 1. Marcadores que se detectan o que pueden detectarse gracias a la expresión o sobreexpresión de proteínas (la detección puede realizarse, por ejemplo, por inmunohistoquímica o hibridación in situ); 2. Marcadores que se detectan o que pueden detectarse gracias a la expresión o sobreexpresión de ARNm (la detección puede realizarse, por ejemplo, por técnicas de presentación diferencial); 3. Marcadores que se detectan o que pueden detectarse gracias a un cambio postraduccional en una proteína, por ejemplo, la fosforilación de la proteína, una ubiquitinación, una farnesilación, metilación, u otra modificación en la proteína que puede detectarse, por ejemplo, por anticuerpos específicos para la modificación postraduccional.
Los genes que se sobreexpresan en el cáncer de mama y que pueden encontrarse por presentación diferencial incluyen, por ejemplo, Claudina-7, cinc-alfa-2-glicoproteína, apolipoproteína B, B94, EST (R08988), trombospondina (THBS1), FGF-1, NGAL-Lipocalina 2, EST (N77731), BS247 (Laboratorios Abbott, documento WO 99/22027), AIB-1. Los genes que se pueden identificar por cambios en la fosforilación de tirosina incluyen, por ejemplo, Erb-B2 y EGFR. Los genes que se pueden identificar por metilación de genes incluyen, por ejemplo, 14-3-3, SPR1, ciclina D2, GST-pi y estrógenos. Los marcadores que están ausentes en tumores y, por lo tanto, se denominan marcadores supresores de tumores y cuando están ausentes indican un estado tumorigénico incluyen, por ejemplo, mamastatina y maspina.
Por consiguiente, en el fluido ductal pueden buscarse marcadores tales como los siguientes, por ejemplo, proteínas que se sobreexpresan, transcritos de ARNm que se sobreexpresan y proteínas que comprenden modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, pueden identificarse los siguientes marcadores para distinguir una célula cancerosa o precancerosa de una célula normal. Las proteínas que se sobreexpresan pueden incluir, por ejemplo, Estromelisina-3, Metaloproteinasa de matriz de membrana de Tipo 1 (MT1-MMP), Metaloproteinasa de Matriz-3 (MMP-3), Isoferritina Placentaria (p43), Proteína de la Matriz Nuclear (NMP22), antígeno específico NM-200.4, factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), Endoglina (CD105), Telomerasa, ErbB-2, ErbB-3, Antígeno Carcinoembrionario (CEA), proteína de choque térmico-27 (HSP-27), Gen específico de cáncer de mama (BCSG), Inhibidor activador del plasminógeno (PAI-1), Activador de Plasminógeno de tipo Uroquinasa (uPA), Receptor del Activador de Plasminógeno de tipo Uroquinasa (uPAR), Factor Estimulador de Colonias-1 (CSF-1), Receptor del Factor Estimulador de Colonias-1 (fms), Anexina I, Vasopresina, la quimioquina CC regulada por activación de células T normales, expresada y secretada (RANTES), antígeno específico 44-3A6, antígeno específico A-80, MUC-1, antígeno específico H23, antígeno específico 83 D4, antígeno específico SP-2, antígeno específico 323/A3, antígeno asociado a tumores-72 (TAG-72), y antígeno específico MBE6.
Otros marcadores de cáncer de mama detectados por cualquier medio incluyendo, por ejemplo, expresión de proteínas, expresión de ARNm o modificación postraduccional pueden incluir, por ejemplo (en orden alfabético), alanina aminopeptidasa, alfa 6 integrina, alfa-lactalbúmina, AN43, p53, antagonisa Bcl2 de la muerte celular (Bad), atanogen asociado a Bcl2 (BAG-1), antagonista/destructor de Bcl2 1 (Bak), proteína X asociada a Bcl2 (Bax), antígeno 225 de cáncer de mama (BCA225), CLL/linfoma 2 de células B (Bcl-2), Bcl2 de tipo 1 (Bcl-x), oligosacáridos beta 1-6 ramificados, beta-2 microglobulina (BMG), proteína AI relacionada con Bcl2 (Bfl-1), sialoproteína ósea (BSP), proteína de unión a secuencias CCAAT/potenciadoras, proteína inhibidora enriquecida hepática (C/EBPbeta-LIP), Antígeno 1 de carcinoma (Ca 1), Antígeno 27.29 de carcinoma (CA 27.29), Antígeno M26 de carcinoma (CA M26), Antígeno M29 de carcinoma (CA M29), Antígeno 125 de carcinoma (CA125), Antígeno 15.3 de carcinoma (CA15.3), Antígeno 195 de carcinoma (CA195), Antígeno 19-9 de carcinoma (CA19-9), Antígeno 50 de carcinoma (CA50), Antígeno 549 de carcinoma (CA549), Cadherina-11, receptor de calcitonina (CTR), catepsina B, catepsina L, Endoglina (CD105), CD24, CD34 (marcador pan-endotelial), CD44, c-met/receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, c-myc, ciclooxigenasa-1 (Cox-1), ciclooxigenasa-2 (Cox-2), caspasa-3 (CPP32), nucleótido cíclico fosfodiesterasa, ciclina E, ADN topoisomerasa II-alfa, ADN topoisomerasa ll-beta, EGF, receptor de EGF, E-selectina, fosfatasa alcalina sensible a homoarginina rápida (FHAP), ácido graso sintasa, ferritina, proteína del fluido de la enfermedad quística generalizada (GCDFP-15/BRST-2), h-mts1 asociado a metástasis (S100A4), proteína afín de choque térmico-73 (hsc73), proteína de choque térmico-70 (hsp70), proteína de choque térmico-90 alfa (hsp90alpha), proteína de choque térmico-90 beta (hsp90beta), inhibidores de la diferenciación-1 (ID1), inhibidores de la diferenciación-3 (ID3), interleuquina-1 beta, Queratina 8, Queratina 18, Queratina 19, Laminina, Receptor de Laminina (MLuC5), Leucina Aminopeptidasa (LAP), ácido siálico unido a lípidos (LSA), antígeno de Melanoma-1 (MAGE-1), antígeno de Melanoma-2 (MAGE-2), antígeno de Melanoma-3 (MAGE-3), Man6-P glicoproteínas, antígeno asociado a carcinoma de tipo mucina (MCA), leucemia de células mieloides-1 (Mcl-1), metalotioneína (MT), proteína quinasa fosfatasa-1 activada por mitógenos (MKP-1), Metaloproteinasa de matriz-2 (MMP-2), Metaloproteinasa de matriz-9 (MMP-9), antígeno de suero mamario (MSA), mucina de cáncer de mama-2 (MUC-2), mucina de cáncer de mama-3 (MUC-3), mucina de cáncer de mama-6 (MUC-6), Nm23 nucleósido difosfato quinasa, ornitina descarboxilasa (ODC), osteopontina (OPN), P114 (proteína de unión a MAR), P120 (un antígeno de la proliferación nucleolar), quinasa de adhesión focal p125FAK, autoantígeno nuclear p330d/CENP-F, inhibidor del activador de plasminógeno-2 (PAI-2), Pepsinógeno C, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), factor plaquetario 4 (marcador angiogénico), proteína quinasa C (PKC), antígeno específico de próstata (PSA), pirimidina nucleósido fosforilasa, ras p21, glutatión reducido (GSH), receptor del retinoide X alfa, proteína ribosómica S2, sialiltransferasa, Estromelisina-1 (MMP-3), proteínas surfactantes A, proteínas surfactantes B, antígeno asociado a tumores-12 (TAG-12), gen trefoil TFF1, gen trefoil TFF3/ITF/hP1.B, Trombina, Trombomodulina, timidina fosforilasa (TP), timosina beta 15, ferritinas citosólicas tisulares, antígeno de polipéptido tisular (TPA), antígeno específico de polipéptido tisular (TPS), Factor de Crecimiento del Endotelio vascular-B (VEGF-B), Factor del Crecimiento del endotelio Vascular-C (VEGF-C), receptor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular-1 (VEGFR1), receptor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular-2 (VEGFR2), y receptor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular-3 (VEGFR3).
Haciendo referencia específicamente a las proteínas de la matriz nuclear, el proceso es similar al realizado con otros marcadores: el fluido ductal puede examinarse para determinar la presencia de un marcador que comprende un producto de expresión de un gen que codifica una proteína de la matriz nuclear. El producto de expresión puede comprender un ácido nucleico o un polipéptido. El producto de expresión puede comprender un ARN. El producto de expresión puede comprende una proteína o parte de una proteína. La proteína de la matriz nuclear puede seleccionarse entre el grupo compuesto por laminina A, laminina B, laminina C, una proteína de la matriz periférica, una proteína del aparato del huso mitótico nuclear (NuMA), topoisomerasa II, y una proteína de la matriz nuclear interna. El producto de expresión puede ser un polipéptido y el examen del polipéptido puede comprender poner en contacto el marcador polipeptídico con un anticuerpo que se une específicamente a una parte del polipéptido.
El producto de expresión puede ser un ácido nucleico y el examen puede comprender la detección de la presencia del ácido nucleico. La detección de la presencia del ácido nucleico puede comprender amplificar el ácido nucleico, por ejemplo, por PCR.
Una vez localizado o aislado el fluido ductal, el fluido puede ensayarse con respecto a la presencia de uno o más productos de expresión de genes que codifican proteínas de la matriz nuclear (por ejemplo, un ARN o un polipéptido) para evaluar la presencia de células cancerosas o precancerosas en el conducto. Estos ensayos típicamente pueden ser ensayos de amplificación de anticuerpos o de ácido nucleico que se realizan comúnmente en la técnica de la detección de marcadores. Los productos génicos identificados pueden ser cualquier producto génico de la proteína de la matriz nuclear, incluyendo productos génicos de la matriz nuclear específicos para malignidades de la mama, y posiblemente incluyendo, por ejemplo, laminina A, laminina B, laminina C, una proteína de la matriz periférica, una proteína del aparato del huso mitótico nuclear (NuMA), topoisomerasa II, o una proteína de la matriz nuclear interna. También pueden adaptarse ensayos, kits y métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.965.376, 5.914.238, 5.882.876, 5.858.683, 5.840.503, 5.830.677, 5.783.403, 5.780.596, 5.698.439, 5.686.562 o 5.547.928 y aplicarse al ensayo de muestras de fluido ductal.
Una vez que el fluido ductal se ha analizado con respecto a uno o más marcadores, el fluido también puede analizarse citológicamente para determinar el estado citológico de las células del epitelio ductal y otras células. Los ensayos citológicos que pueden realizarse en las células recuperadas de un conducto o de un aspirado de pezón pueden incluir, por ejemplo, los ensayos descritos en King et al, J. Nat'l Cancer Inst (1983) 71:1115-21, Wrensch et al. (1992) Am. J. Epidem. 135: 130-141, Papanicolaou et al, (1958) Cancer, 11: 377-409 y Goodson WH & King EB, Capítulo 4: Discharges and Secretions of the Nipple, THE BREAST: COMPREHENSIVE MANAGEMENT OF BENIGN AND MALIGNANT DISEASES (1998) 2nd Ed. vol 2, Bland & Kirby eds. W.B. Saunders Co, Philadelphia, PA páginas 51-74. Por ejemplo, como se describe en Goodson y King (página 60), la hiperplasia atípica se presenta como anomalías celulares, un mayor engrosamiento de la cromatina y tendencia a más células individuales así como a grupos de células. Con respecto al carcinoma in situ, Papanicolaou et al, describió anomalías celulares, por ejemplo anomalías nucleares diagnosticadas por citología de fluido de secreciones del pezón que contenían células ductales. La citología de las células anómalas también puede realizarse como se describe en Sartorius et al (1977) J. Natl Cancer Inst 59:1073-1080 y King et al, (1983) JNCI 71(6) 1115-1121. La atipia y el carcinoma in situ se caracterizan ampliamente de forma patológica, como se describe en Page et al, (1998) Mod Pathol 11(2): 120-8. El fluido ductal puede analizarse por técnicas citológicas poniendo parte del fluido en un portaobjetos con un colorante citológico convencional usando un microscopio óptico. Las células pueden estudiarse con respecto a patrones de crecimiento atípicos en células individuales y cúmulos de células usando métodos publicados, incluyendo Mouriquand J, (1993) S Karger Pub, "Diagnosis of Non-Palpable Breast Lesions: Ultrasonographically Controlled Fine-Needle Aspiration: Diagnostic and Prognostic Implications of Cytology" (ISBN 3805557477); Kline TS and IK, Pub Igaku-Shoin Medical "Breast: Guides to Clinical Aspiration Biopsy" (LSBN 0896401596; Masood, American Society of Clinical Pathology: Nov. 199S, "Cytopathology of the Breast" ISBN 0891893806; and Feldman PS, American Society of Clinical Pathology, Nov. 1984, "Fine Needle Aspiration Cytology and Its Clinical Applications: Breast and Lung"
ISBN 0891891846.
Otras referencias que describen el análisis citológico y que proporcionan pautas para un análisis de células del epitelio ductal derivadas del fluido ductal incluyen Silverman et al, (Can FNA biopsy separate atypical hyperplasia, carcinoma in situ, and invasive carcinoma of the breast?: Cytomorphologic criteria and limitations in diagnosis, Diagnostic Cytopathology) 9(6):713-28, 1993; Masood et al, (Immunohistochemical differentiation of atypical hyperplasia vs. carcinoma in situ of the breast) Cancer Detection & Prevention. 16(4):225-35, 1992; Masood et al, (Cytologic differentiation between proliferative and nonproliferative breast disease in mammographically guided fine-needle aspirates) Diagnostic Cytopathology. 7(6):581-90, 1991; Masood S., (Occult breast lesions and aspiration biopsy: a new challenge) Diagnostic Cytopathology. 9(6):613-4, 1993; Masood S., (Prognostic factors in breast cancer: use of cytologic preparations) Diagnostic Cytopathology. 13(5):388-95, 1995; Novak and Masood, (Nuclear grooves in fine-needle aspiration biopsies of breast lesions: do they have any significance?) Diagnostic Cytopathology. 18(5):333-7, 1998; Sidawy et al, (Interobserver variability in the classification of proliferative breast lesions by fine-needle aspiration: results of the Papanicolaou Society of Cytopathology Study) Diagnostic Cytopathology. 18(2):150-65, 1998; Masood et al, (Automation in cytology: a survey conducted by the New Technology Task Force, Papanicolaou Society of Cytopathology) Diagnostic Cytopathology. 18 (1):47-55, 1998; y Frykberg y Masood Copeland EM 3d. Bland Kl., (Ductal carcinoma in situ of the breast) Surgery, Gynecology & Obstetrics 177(4):425-40, 1993.
Como se ha descrito, las células recogidas pueden comprender células del epitelio ductal y el fluido ductal recogido puede comprender material molecular y celular. Las células recogidas y el fluido y los componentes del fluido pueden analizarse, por ejemplo, como se describe o sugiere en este documento. El fluido recogido de los galactóforos puede incluir constituyentes de fluido biológicos, por ejemplo, los encontrados típicamente en fluido de conducto mamario, por ejemplo, agua, células, marcadores celulares, marcadores moleculares, ácidos nucleicos, proteínas, desechos celulares, sales, partículas o moléculas orgánicas. Estos constituyentes pueden analizarse por cualquier método apropiado dependiendo del marcador y del fin del diagnóstico. Además, cualquiera de las células del conducto puede analizarse con respecto a anomalías morfológicas en componentes celulares, incluyendo, por ejemplo, anomalías morfológicas del núcleo, citoplasma, aparato de Golgi u otras partes de una célula. La morfología celular puede servir para establecer si las células del epitelio ductal son normales (es decir, no son precancerosas o cancerosas o tienen otra anomalía no cancerosa), precancerosas (es decir, que comprenden hiperplasia, hiperplasia ductal atípica (ADH) o carcinoma ductal de bajo grado in situ (LG-DCIS)) o cancerosas (es decir, que comprenden carcinoma ductal de alto grado in situ (HG-DCIS), o carcinoma invasivo). El análisis del contenido celular puede servir para establecer el estadio de manera similar a como se establece por la morfología, capturando generalmente una progresión de un estado precanceroso o canceroso en las células.
Una vez recuperada la muestra de fluido ductal de la mama, se examina con respecto a la presencia de un marcador tal como, por ejemplo, una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido y una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas como se ha descrito anteriormente. Además, el marcador puede ser capaz de diferenciar entre dos categorías citológicas cualesquiera consistentes en normal, anormal, hiperplasia, atipia, carcinoma ductal, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma ductal in situ - bajo grado (DCIS-LG), carcinoma ductal in situ - alto grado (DCIS-HG), carcinoma invasivo, cambios atípicos leves, cambios atípicos marcados, hiperplasia ductal atípica (ADH), material celular insuficiente para el diagnóstico y material celular suficiente para el diagnóstico. Estas categorías clasifican las células epiteliales citológicamente y estas clasificaciones pueden indicar cáncer o sus precursores, o ausencia de indicios de cáncer. El marcador puede ser capaz de diferenciar entre dos categorías citológicas cualesquiera consistentes en normal, anormal, hiperplasia, atipia, carcinoma ductal, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma ductal in situ - bajo grado (DCIS-LG), carcinoma ductal in situ - alto grado (DCIS-HG), carcinoma invasivo, cambios atípicos leves, cambios atípicos marcados, hiperplasia ductal atípica (ADH), material celular insuficiente para el diagnóstico y material celular suficiente para el diagnóstico.
Por ejemplo, el número de células epiteliales en las muestras de lavado ductal puede variar de ninguna a varios miles. Al menos se requieren diez células epiteliales para considerar una muestra adecuada. Las células ductales benignas pueden estar presentes individualmente, en monocapas o en cúmulos apretados, usando un espesor de una a dos capas de células. Las células son pequeñas con núcleos pequeños (en un intervalo de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 micrómetros de diámetro). La relación entre núcleo y citoplasma puede parecer alta dependiendo de la orientación de las células en los cúmulos. Las células ductales benignas individuales a menudo son difíciles de identificar, teniendo con frecuencia un aspecto similar al de los linfocitos o histiocitos circundantes. Las células ductales pueden reconocerse por la forma columnar de su citoplasma o por la presencia de pequeñas vacuolas discretas en el citoplasma. El borde citoplásmico discreto liso también puede ayudar a distinguir las células ductales. Las células ductales benignas se reconocen más fácilmente cuando a parecen en agrupamientos. Los grupos cohesivos, en oposición a los cúmulos sueltos, son más sugerentes del origen epitelial. Los gropos benignos tienen un espesor de una a dos capas celulares, y se componen de células que tienen un tamaño uniforme. Los núcleos celulares también son de tamaño uniforme y tienen una forma regular de redonda a ovalada. Los marcadores que pueden identificarse además de las notaciones citológicas pueden ayudar al diagnóstico confirmando una lectura citológica y/o añadiendo información adicional a cualquier subcategoría digna de mención dentro de la categoría de benigno.
La categoría citológica incluyendo células epiteliales atípicas, con cambios leves, incluye células ductales de estados proliferativos incluyendo hiperplasia. Las células pueden aparecer individualmente, en grupos cohesivos de múltiples capas y complejos y en monocapas. Los grupos pueden mostrar un aumento en el número de capas celulares, que puede apreciarse enfocando a través de los grupos. Los agrupamientos de los conductos también pueden mostrar un mayor solapamiento, con múltiples núcleos. Las células pueden estar mínimamente agrandadas, y pueden mostrar aumentos moderados en el tamaño nuclear, en un intervalo de 12 a 16 \mum de diámetro. Puede estar presente una ligera anisonucleosis entre las células de los grupos. A menudo están presentes nucleolos. Los marcadores encontrados en el fluido ductal pueden ayudar a identificar las células atípicas o células atípicas con cambios leves, o puede confirmar esta identificación citológica.
Las células atípicas también pueden incluir células atípicas con cambios notables. Los cambios más marcados a menudo están asociados con hiperplasia atípica y carcinoma ductal de bajo grado in situ (DCIS). Pueden estar presentes células ductales agrandadas, que muestran un aumento nuclear más marcado y variación en tamaño y forma. Las células individuales están agrandadas, con el citoplasma en algunos casos abundantes, y las relaciones entre núcleo y citoplasma pueden aparecer reducidas. La cromatina puede parecer gruesa, con una anomalía leve en la distribución. Los nucleolos pueden ser más grandes, múltiples y más prominentes. Los núcleos en grupos pueden parecer solapantes. Pueden verse figuras mitóticas. Los marcadores encontrados en el fluido ductal pueden ayudar a identificar células atípicas con cambios notables, o pueden confirmar esta identificación citológica.
Las células epiteliales malignas incluyen células ductales de carcinoma de mama de alto grado y presentan características comunes de malignidad. Están presentes más células individuales, y se pierde la cohesividad celular. Están presentes cúmulos sueltos de células epiteliales, junto con más grupos apretados habituales de células. El aumento celular y nuclear puede ser notable. En algunos casos pueden estar presentes altas relaciones entre núcleo y citoplasma. Sin embargo, algunas muestras de alto grado a menudo han perdido su citoplasma en una parte de las células tumorales, dando como resultado relaciones entre núcleo y citoplasma bajas o variables. Las membranas nucleares a menudo son irregulares y la cromatina está formando grumos, hipercromática y está dispersa de una forma no uniforme. Los nucleolos a menudo son grandes y llamativos y pueden ser múltiples. Puede verse una notable variación entre las células en términos del tamaño celular y nuclear. Acompañando a estos cambios a menudo hay un fondo de desechos necróticos. Pueden verse microcalcificaciones en el material de fondo. Pueden aparecer como un material denso con bordes lisos y capas concéntricas o pueden ser de naturaleza distrófica y amorfa. Los marcadores encontrados en el fluido ductal pueden ayudar a identificar células malignas, aspectos de indicios malignos o pueden confirmar esta identificación citológica. Los marcadores también pueden ayudar a determinar el estadio de malignidad o proporcionar otra información valiosa que podría ayudar a dirigir un diagnóstico detallado y/u opciones de tratamiento viables.
En Barret et al, Acta Cytol 1976;20:174-180; Goodson et al, Discharges and Secretions of the Nipple, THE BREAST: COMPREHENSIVE MANAGEMENT OF BENIGN AND MALIGNANT DISEASES, Segunda Edición, Vol. 1, Capítulo 4, página 1; King et al, Cytometry 1984; 5:124-130; King et al, A. J.C.P. 1975; 64:739-748; King et al, A. J.C.P. 1975; 64:728-738; King et al, Cytopathology of Abnormal Mammary Duct Epithelium, Prevention and Detection of Cancer, Part II, Detection, vol 2 Cancer detection in specific sites, 1976; King et al, J Natl Cancer Inst, 1983; 71: 1115-1121; Kjellgren et al, Acta Cytol 1964; 8: 216-217; Masood et al, The Breast Journal 1999; 5:1-2; Papanicolaou et al, Cancer 1958; 377-409; Petrakis et al, Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 1993; 2:3-10; Ringrose et al, Acta Cytol 1966; 10:373-375; Sartorius et al, NCI 1977; 59:1073-1080; Sauter et al, British J. Cancer 1997; 76(4):494-501; Wrensch et al, Amer J. Epid. 1992; 135:130-141 se describen otros criterios y procesos citológicos relacionados con el análisis del fluido ductal.
La siguiente tabla proporciona algunos marcadores ilustrativos y categorías de marcadores y publicaciones que identifican los métodos de identificación particular para esa categoría de marcador y/o para el marcador específico.
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TABLA I
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Ejemplos 1. Recuperación de Fluido Ductal y Análisis de Marcadores en el Fluido
Un paciente se prepara para un lavado ductal por medio del uso de una herramienta de acceso ductal, se lava un conducto de cada mama y el fluido ductal se recoge por separado de cada conducto al que se ha accedido. El fluido de cada conducto al que se ha accedido se analiza con respecto a proteínas de la matriz nuclear, maspina, claudina 7, telomerasa, FGF básico, péptido de degradación de fibrinógeno y receptor de CSF-1 usando técnicas convencionales.
Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para facilitar la comprensión, será fácilmente evidente para los especialistas en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención, que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la reivindicaciones adjuntas.

Claims (22)

1. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar una muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador que comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas.
2. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar una muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador que comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un marcador seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor, un ligando, un factor proteico, un antígeno, un anticuerpo, una enzima, una proteína soluble, una proteína citosólica, una proteína citoplásmica, un supresor de tumores, un antígeno de la superficie celular, un fosfolípido, una lipoproteína, una proteína que responde a hormonas, un antígeno asociado a la diferenciación, un antígeno asociado a la proliferación, un antígeno asociado a la metástasis, una proteína integral de la membrana, una proteína que participa en una ruta apoptótica, una proteína que participa en una ruta de activación de la transcripción, una molécula de adhesión celular, una proteína de la matriz extracelular, un proteolípido, una citoquina, una proteína de la membrana basal, una glicoproteína de tipo mucina, una histona, una ribonucleoproteína, un ácido siálico, una proteína de la matriz ósea, un antígeno carbohidrato, una proteína nuclear, una fosfoproteína nuclear, un protooncogen, un oncogen, una apolipoproteína, una proteasa de serina, un antígeno de rechazo tumoral, una proteína surfactante, una proteína de muerte celular, una endoproteasa de cinc y un gen trefoil.
3. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar una muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador que comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un marcador seleccionado entre el grupo compuesto por una quimioquina, una lectina, una integrina, una selectina, una queratina, una interleuquina, una taxina, una ferritina, una lipocalina, una laminina, una ciclina, una relaxina, una nucleína, una caspasa, un antígeno asociado a melanoma, una proteína inflamatoria de macrófagos, una proteína de unión gap, una proteína de unión a calcio, una proteína de unión a actina, una proteína de unión de fosfolípidos, una proteína de choque térmico, una proteína del ciclo celular, un activador de tirosina y triptófano hidroxilasa, un miembro de la familia de proteínas del factor de necrosis tumoral, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación alfa, un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de transformación beta, un miembro de la familia de proteínas Bcl2, una proteína de interacción con Bcl2, una proteína asociada con Bcl2, un miembro de la familia de proteínas vasopresina/oxitocina y un miembro de la familia de proteínas de la proteína de unión a secuencias CCAAT/potenciadoras.
4. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar una muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador donde el marcador es una enzima y la enzima comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de una enzima seleccionada entre el grupo compuesto por una fosforilasa, una fosfatasa, una descarboxilasa, una isoenzima, una quinasa, una proteasa, una nucleasa, una peptidasa, una proteasa, una DNasa, una RNasa, una aminopeptidasa, una topoisomerasa, una fosfodiesterasa, una aromatasa, una ciclooxigenasa, una hidroxilasa, una deshidrogenasa, una metaloproteinasa, una telomerasa, una reductasa, una sintasa, una elastasa, una tirosinasa, una transferasa y una ciclasa.
5. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar la muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador donde el marcador es un receptor y el receptor comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un receptor seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor de hormonas esteroideas, un receptor de factores de crecimiento, un receptor de quinasa, un receptor asociado a proteínas G, un receptor de la familia del TNF, un re-
ceptor de tirosina quinasa, un receptor de vasopresina, un receptor de oxitocina y un receptor de serina proteasa.
6. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar la muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador donde el marcador es un factor proteico y el factor comprende ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor de crecimiento, un factor proteolítico, un factor de células estromáticas, un factor de células epiteliales, un factor de angiogénesis, un factor de células epiteliales, un factor angiogénico y un factor estimulador de colonias.
7. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar la muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador donde el marcador es un inhibidor y el inhibidor comprende un ARN, ADN, proteína, polipéptido o forma peptídica de un inhibidor seleccionado entre el grupo compuesto por un inhibidor de ciclina, un inhibidor de un complejo de ciclina, una serpina, un inhibidor de la degradación proteolítica, un inhibidor tisular de una metaloproteasa y un inhibidor de la angiogénesis.
8. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar la muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto de una mama de un paciente, sin que dicho fluido esté mezclado con el fluido ductal de cualquier otro conducto de la mama, para determinar la presencia de un marcador que comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un ARNm, una molécula orgánica pequeña, un lípido, una grasa, una glicoproteína, un glicopéptido, un carbohidrato, un oligosacárido, una anomalía cromosómica, una célula entera que tiene una molécula marcadora, una partícula, una molécula secretada, una molécula intracelular y un complejo de una pluralidad de moléculas;
donde el marcador es capaz de diferenciar entre dos categorías citológicas cualesquiera consistentes en normal, anormal, hiperplasia, atipia, carcinoma ductal, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma ductal in situ - bajo grado (DCIS-LG), carcinoma ductal in situ - alto grado (DCIS-HG), carcinoma invasivo, cambios atípicos leves, cambios atípicos marcados, hiperplasia ductal atípica (ADH), insuficiente material celular para el diagnóstico y suficiente material celular para el diagnóstico.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además analizar el fluido ductal para determinar una citología anómala.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el fluido ductal se recupera poniendo una herramienta de acceso ductal en el conducto e infundiendo fluido dentro del conducto a través de la herramienta y recuperando del conducto al que se ha accedido a través de la herramienta una parte del fluido de infusión mezclado con el fluido ductal.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el método se repite usando una muestra de fluido ductal obtenida a partir de un conducto diferente en una mama.
12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el método se repite usando muestras de fluido ductal obtenidas a partir de una pluralidad de conductos en una mama.
13. Un método para identificar a un paciente que tiene cáncer de mama o precáncer de mama, comprendiendo dicho método:
examinar una muestra de fluido ductal de un conducto de una mama del paciente para determinar la presencia de un marcador que comprende un producto de expresión de un gen que codifica una proteína de la matriz nuclear.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el producto de expresión comprende un ácido nucleico o un polipéptido.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el producto de expresión comprende ARN.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el producto de expresión comprende una proteína o parte de una proteína.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde la proteína de la matriz nuclear se selecciona entre el grupo compuesto por laminina A, laminina B, laminina C, una proteína de la matriz periférica, una proteína del aparato del huso mitótico nuclear (NuMA), topoisomerasa II y una proteína de la matriz nuclear interna.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el producto de expresión es un polipéptido y el examen comprende poner en contacto el marcador polipeptídico con un anticuerpo que se une específicamente a una parte o al polipéptido.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el producto de expresión es un ácido nucleico y el examen comprende detectar la presencia del ácido nucleico.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, donde la detección de la presencia del ácido nucleico comprende amplificar el ácido nucleico.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el fluido se obtuvo por aspiración del galactóforo en el pezón.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde la muestra de fluido se obtuvo lavando el lumen ductal y recuperando el fluido y las células del lumen.
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