ES2288609T5 - Virus vaccinia ankara modificado para la vacunación de neonatos - Google Patents

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Description

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DESCRIPCION
Virus vaccinia ankara modificado para la vacunacion de neonatos
La invencion se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por lo tanto esta se refiere al uso del Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), segun el cual MVA es la cepa MVA-BN depositada en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury (Reino Unido) con el numero V00083008 o sus derivados, donde dicha cepa Ankara MVA-BN y sus derivados se caracterizan por (i) ser capaces de efectuar una replicacion reproductiva en los fibroblastos de embriones de pollo (CEF) y en la lmea celular de rinon de hamster bebe BHK pero son incapaces de efectuar una replicacion reproductiva en las lmeas celulares humanas HaCat, HeLa y 143B y
(ii) por la ineptitud para replicarse en una cepa de ratones que es incapaz de producir linfocitos B y T maduros y como tales estan gravemente inmunodeprimidos y sumamente vulnerables a un virus que se replica, para la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento de un animal neonato, incluido un ser humano, segun el cual MVA es un virus que infecta abortivamente al animal neonato, incluido un ser humano, y en el que el tratamiento induce o mejora la maduracion del sistema inmunitario, segun el cual dicha maduracion se correlaciona con un aumento del numero de celulas dendnticas y de sus celulas precursoras.
Antecedentes de la invencion
El ambiente natural de los animales y los seres humanos contiene una variedad grande de agentes infecciosos como virus, bacterias u hongos. Muchos de estos agentes infecciosos pueden causar enfermedades en los huespedes infectados. En circunstancias normales, el huesped infectado se recupera de la enfermedad inducida por el agente infeccioso despues de un cierto penodo. Esta recuperacion se debe al sistema inmunitario de un animal o un ser humano.
El sistema inmunitario es la parte del organismo humano o del animal que es responsable de eliminar el agente infeccioso. La respuesta inmunitaria se divide en una reaccion espedfica y una inespedfica (innata) aunque ambas cooperan estrechamente. La respuesta inmunitaria inespedfica es la defensa inmediata contra una amplia diversidad de sustancias extranas y agentes infecciosos. En la respuesta inmunitaria innata contra los virus, el interferon (IFN)-a y el IFN-p son absolutamente esenciales para controlar la replicacion vmca inicial y para activar los linfocitos citolfticos naturales (NK) para la eliminacion inmediata de las celulas infectadas. Los patogenos bacterianos o parasitarios intracelulares inducen la IL-12 que expresa al IFN-y en los linfocitos NK y/o algunos subconjuntos de linfocitos T. Los linfocitos NK activados por el IFN-y pueden entonces eliminar los patogenos intracelulares. Por otra parte, el IFN-y tambien activa los macrofagos y les permite eliminar los patogenos internalizados.
Con mucho, la fuente mas rica de IFN-a/p por tipo de celula son las celulas dendnticas (CD), una poblacion especializada de celulas distribuida estrategicamente en todo el organismo. Las celulas dendnticas plasmacitoides CD11c+ CD8+ DC estan entre las mejores productoras de IFN-a/p. Las CD8+ DC que son infectadas por agentes patogenos intracelulares no vmcos son las celulas cruciales capaces de secretar IL-12 esencial para los primeros pasos de la defensa inmunitaria.
Se puede inducir una respuesta inmunitaria espedfica contra una sustancia extrana particular (antfgeno) despues de una fase lag, cuando el organismo es provocado con esta sustancia por primera vez. La iniciacion de la respuesta inmunitaria espedfica tambien es coordinada por las CD. Hay un transito constante de estas celulas desde la periferia a los organos linfoides secundarios, los ganglios linfaticos o el bazo donde recirculan los linfocitos T y B vfrgenes. El antfgeno que es transportado por las CD a estos organos permite la activacion de los linfocitos B y T vfrgenes para convertirse en linfocitos T y B efectores. Con este fin, las CD no solo transportan el antfgeno, sino que la plasticidad del reconocimiento del patogeno permite la activacion de diferentes genes en las CD y de esta forma una sensibilizacion ajustada de los linfocitos T por el patogeno.
La respuesta inmunitaria espedfica es sumamente eficaz y es responsable de que un individuo que se recupera de una infeccion espedfica este protegido contra esa infeccion espedfica. Por lo tanto, una segunda infeccion con el mismo agente infeccioso o uno muy similar causa smtomas mucho mas leves o no causa ningun smtoma en absoluto, porque ya hay una "inmunidad espedfica preexistente" contra este agente. Dicha inmunidad y la memoria inmunologica, respectivamente, persisten durante mucho tiempo, en algunos casos incluso durante toda la vida. En consecuencia, se puede usar la induccion de una memoria inmunologica para la vacunacion, es decir para proteger a un individuo contra la infeccion con un patogeno espedfico.
A los efectos de la vacunacion, se provoca al sistema inmunitario con una vacuna que en sf misma es menos perjudicial que el agente patogeno contra el cual se va a inducir una respuesta inmunitaria. La vacuna comprende o expresa epftopos que se encuentran en el agente o son expresados por el agente contra el cual se hace la vacunacion. El organismo, por lo tanto, es inmunizado contra el agente que contiene el epftopo que forma parte de la vacuna.
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Las vacunas tipicas son virus atenuados o inactivados (por ejemplo, las vacunas antipoliomielttica o antivariolica), protemas recombinantes (por ejemplo, la protema S del virus de la hepatitis B recombinante), toxinas bacterianas inactivadas por calor (la toxina del Clostridium tetani) o polisacaridos de la pared de la capsula bacteriana (Streptococcus pneumoniae).
Puesto que las enfermedades infecciosas pueden provocar afecciones muy cnticas en los recien nacidos y lactantes, existe el interes de vacunar a los ninos o los animales recien nacidos lo antes posible. Los ejemplos de las afecciones contra las cuales es aconsejable la vacunacion son las infecciones causadas por poxvirus, incluida la viruela. Sin embargo, los intentos por vacunar con exito a recien nacidos son obstaculizados por el hecho de que el sistema inmunitario de los mairnferos recien nacidos todavfa no esta maduro. Se piensa que el sistema inmunitario de los lactantes y otros marnfferos neonatos madura gradualmente durante un cierto penodo. Para los seres humanos la maduracion ocurre durante el primer ano de vida. Esta es la razon por la que el grupo de edad neonatal queda expuesto a diversas infecciones durante este primer ano (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527532). Mas particularmente, los lactantes neonatos tienen disfuncion de los linfocitos B, deficiencias en la presentacion primaria de antigenos por las celulas dendnticas y proliferacion limitada de linfocitos T (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527-532). Poco despues del nacimiento los niveles de linfocitos T en el bazo son 1.000 veces menores que en los adultos. Para lograr al menos una inmunizacion debil se sugirio el uso de cualquier virus que se replique o de formulaciones que comprendan un adyuvante para la inmunizacion. Sin embargo, con virus de replicacion siempre se corre el riesgo de que el sistema inmunitario inmaduro pueda ser sobrepasado por la infeccion vmca o las vacunas de virus vivo dado que los linfocitos T son necesarios para la depuracion de los virus (Hassett et al., J. Virol. (1997) 71, 7.881-7.888). Puesto que en los neonatos hay una produccion reducida de citocinas por los linfocitos T cooperadores Th-1, la respuesta de los lactantes es predominantemente por Th-2. En consecuencia, no se reclutan los linfocitos T citotoxicos y no se logra depuracion de los virus.
La situacion en los animales mamfferos es muy similar a la situacion en los seres humanos, es decir el sistema inmunitario despues del nacimiento todavfa no esta maduro. En los ratones recien nacidos, el numero de linfocitos T CD4+ esplenicos es 80.000 veces menor y el de los linfocitos T CD8+ 1.000 veces menor que en los bazos de los adultos. Ademas, el sistema de produccion de interferon (IFN) en estos ratones esta inmaduro. Por consiguiente, los ratones neonatos no pueden controlar eficazmente la reproduccion de los patogenos intracelulares mediante el IFN en el sitio de la infeccion. Ademas, el numero bajo de celulas inmunitarias y posiblemente un estadio de activacion inadecuado de dichas celulas son demasiado limitados para hacer frente a los patogenos en rapido aumento o los virus que se replican utilizados para la vacunacion.
Kovarik et al. (Virology (2001) 285, 12-20) divulgan la induccion de respuestas de Th1 y linfocitos T citotoxicos semejantes a la del anticuerpo del adulto en un modelo de inmunizacion murina en edad temprana utilizando la cepa NYVAC(K1L) basada en el virus vaccinia (de la variolovacuna) derivada de la cepa Copenhagen. Sin embargo, dicha cepa se replica en las celulas humanas.
Debido al riesgo asociado a las vacunas de virus vivo no se recomienda vacunar a los animales neonatos, incluidos los seres humanos, con virus que se replican. Por ejemplo, se recomienda no vacunar a los recien nacidos contra la viruela con las cepas de variolavirus utilizadas hasta la erradicacion de la viruela, como las cepas Elstee, Copenhague y NYCBH. Segun las recomendaciones recientes en los EE.UU., los bebes menores de 12 meses de edad no deben recibir las vacunas antivariolicas comercializadas hasta el presente.
La vacunacion de los neonatos con formulaciones que comprenden un adyuvante tiene la desventaja de que se introducen en el organismo varias sustancias nocivas. Por lo tanto, una vacunacion en neonatos humanos solo se hace en casos de emergencia, por ejemplo, en el caso de infeccion por el virus de la hepatitis B.
En resumen, se debe advertir que el sistema inmunitario no esta maduro al nacer. Puesto que la vacunacion con virus competentes para la replicacion o formulaciones que comprenden un adyuvante tiene desventajas importantes, los lactantes no se vacunan antes de los 2 meses de edad en Alemania (Empfehlung der Standigen Impfkommission STICO, 2001) o 6 semanas en los EE.UU (ACIP "Recommended Childhood Immunization Schedule, United States").
El retraso en el desarrollo del sistema inmunitario es compensado en parte por la transferencia de los anticuerpos maternos desde la madre al lactante durante el embarazo o a traves de la lactancia materna. Sin embargo, no todos los lactantes son amamantados por diversas razones. De este modo, hay un penodo muy cntico de aproximadamente 6 a 8 semanas en los seres humanos durante el cual el lactante que tiene un sistema inmunitario inmaduro y por lo tanto no plenamente funcional no recibe anticuerpos maternos y durante el cual una vacunacion generalmente no es exitosa o es demasiado peligrosa.
La situacion es muy similar en los animales mamfferos, en particular para los animales economicamente importantes como las vacas o los animales de comparua como los gatos y los perros. Para reducir los costos, la cantidad de leche que el ternero recibe de la madre es a menudo reducida drasticamente. En su lugar, el ternero recibe una mezcla de leche en polvo, alimento iniciador y concentrado espedfico, a veces ya en la primera semana despues del nacimiento. En consecuencia, el ternero no recibe la cantidad y diversidad necesarias de anticuerpos maternos de modo que el sistema inmunitario inmaduro es muy vulnerable a las infecciones. Ademas, los agricultores que cnan
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terneros y los que los engordan para la produccion de carne a menudo no son los mismos. A las 4 a 6 semanas de edad se reunen y despachan terneros de diferentes explotaciones agropecuarias a otras explotaciones agropecuarias para la produccion de carne. En ese momento los anticuerpos maternos son bajos y el sistema inmunitario no esta plenamente desarrollado pero los animales estan expuestos a nuevos agentes infecciosos en condiciones de estres. Esto aumenta el riesgo de infecciones que podnan evitarse mediante la vacunacion. Se puede encontrar una situacion similar en los pensionados de gatos y establecimientos de cna de perros donde la presion infecciosa es alta.
Objetivo de la invencion
El objetivo de la presente invencion es proporcionar medios que permitan la maduracion acelerada del sistema inmunitario de los animales y los seres humanos recien nacidos.
Descripcion detallada de la invencion
De acuerdo con la presente invencion se encontro inesperadamente que es posible vacunar y/o tratar con seguridad y eficazmente a los animales neonatos, incluidos los seres humanos, con los virus caracterizados en las reivindicaciones que son capaces de infectar las celulas del animal neonato, incluido un ser humano, pero que son incapaces de replicarse en dichas celulas para generar una descendencia vmca infecciosa. Se ha demostrado que se puede administrar MVA, es decir MVA-BN y sus derivados (ver mas adelante) a los recien nacidos, sin que se observe ningun efecto perjudicial. La vacunacion del animal con el virus produce una respuesta inmunitaria espedfica contra el virus usado para la vacunacion y/o una vacunacion general contra antfgenos extranos y antfgenos tumorales segun se explica mas adelante en mas detalle a modo de ejemplo. Por otra parte, el MVA usado de acuerdo con la presente invencion produce una induccion y/o una mejora de la maduracion del sistema inmunitario, que se asocia a un aumento de la cantidad de celulas dendnticas y de factores como los interferones. La vacunacion con MVA utilizada de acuerdo con la presente invencion es posible aunque la formulacion que se administre al animal no comprenda un adyuvante.
En resumen, los virus que se usan de acuerdo con la presente invencion (i) provocan una respuesta inmunitaria eficaz en los neonatos, (ii) se pueden administrar sin necesidad de un adyuvante y (iii) no comportan el riesgo de sobrepasar al organismo.
De acuerdo con la presente invencion el efecto protector se ejerce durante al menos 5 dfas, preferentemente durante al menos 7, 14 o 28 dfas despues de la primera vacunacion.
Los virus que son "capaces de infectar las celulas" son virus que albergan en la superficie vmca estructuras capaces de interactuar con las celulas del huesped en una medida tal que el virus o al menos el genoma del virus se incorpora en la celula del huesped. Aunque el MVA utilizado de acuerdo con la presente invencion es capaz de infectar las celulas del huesped, es incapaz de replicarse para generar una descendencia vmca infecciosa en las celulas infectadas. En el contexto de la presente invencion la expresion "virus incapaz de replicarse para generar una descendencia vmca infecciosa en dichas celulas" hace referencia a los virus cuyo genoma esta al menos parcialmente transcrito y traducido a protemas vmcas o incluso replicado, sin embargo, no esta empacado en partmulas vmcas infecciosas. Por lo tanto, el MVA utilizado de acuerdo con la presente invencion es un virus que produce infecciones abortivas en el huesped. Las infecciones abortivas se pueden producir por dos razones: de acuerdo con la primera opcion una celula puede ser vulnerable a la infeccion pero no permitir la multiplicacion del virus, por ejemplo, debido a que no todos los genes vmcos necesarios para la multiplicacion del virus en dicha celula se expresan y/o estan presentes en el genoma del virus. El virus utilizado de acuerdo con la presente invencion en las celulas humanas es el Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), segun se caracteriza en las reivindicaciones y que se explica en mas detalle mas adelante. Una infeccion abortiva puede tambien ser el resultado de la infeccion de celulas con virus defectuosos, que carecen del complemento total de genes vmcos. Un ejemplo de dichos virus para las celulas humanas es DISC-HSV1 (virus del herpes simple restringido a ciclo unico), es decir un virus del herpes simple, que esta restringido a un unico ciclo de infeccion (Dilloo et al., Blood 1997, 89: 119-127). Este virus carece del gen para la glucoprotema esencial H (gH), pero puede reproducirse hasta un tttulo alto en una lmea celular complementaria que exprese gH. En las lmeas celulares no complementarias que son permisivas para la proliferacion del virus herpetico, esta restringido a un ciclo unico de replicacion, dando lugar a la liberacion de virus no infecciosos. La expresion "incapaz de replicarse" se refiere preferentemente a los virus que no se replican en absoluto en las celulas del animal vacunado. Sin embargo, incluso esos virus MVA que tienen una actividad de replicacion residual menor que es controlada por el sistema inmunitario inmaduro del recien nacido estan dentro del alcance de la presente solicitud.
El MVA de acuerdo con la presente invencion es el que se caracteriza en las reivindicaciones. Este es capaz de infectar las celulas del animal pero que sea incapaz de replicarse para generar una descendencia vmca infecciosa en dichas celulas. Se comprendera, que un virus que es capaz de infectar las celulas de una primera especie animal pero que es incapaz de replicarse para generar una descendencia vmca infecciosa en dichas celulas puede comportarse de un modo diferente en una segunda especie animal. Los MVA-BN y sus derivados (ver a mas adelante) son virus capaces de infectar las celulas del ser humano pero son incapaces de replicarse para generar
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una descendencia vmca infecciosa en las celulas humanas. Los mismos virus se pueden replicar en los polios, es dedr, en los pollos, MVA-BN puede no ser un virus incapaz de replicarse en una descendencia vmca infecciosa en las celulas del pollo. Los expertos en la materia saben cuales virus se deben elegir para una especie animal espedfica. Una prueba que permite determinar si un virus es capaz o no de replicarse en un animal neonato o prenato se divulga en WO 02/42480 y usa la cepa de ratones AGR129. Los resultados obtenidos en este modelo de ratones son indicativos para los seres humanos. Por lo tanto, el termino "incapaz de replicarse en una descendencia vmca infecciosa" segun se usa en esta solicitud se corresponde con la expresion "ineptitud para replicarse in vivo" segun se usa para ratones en WO 02/42480. A continuacion se proporcionan mas detalles de esta prueba. Los virus de acuerdo con la presente invencion son preferentemente capaces de replicarse en al menos un tipo de celulas de al menos una especie animal. Por lo tanto, es posible amplificar el virus antes de la administracion al animal que se va a vacunar y/o tratar. Se hace referencia a MVA-BN que se puede amplificar en las celulas CEF (fibroblasto de embrion de pollo) pero que es un virus incapaz de replicarse en una descendencia vmca infecciosa en el neonato humano. En este contexto se debe advertir que los virus inactivados qmmica o ffsicamente no tienen todas las propiedades de esta realizacion preferida ya que los virus inactivados son capaces de infectar las celulas del animal neonato, incluido un ser humano, y son incapaces de replicarse para generar una descendencia infecciosa en el animal neonato, incluido un ser humano, pero estos virus son incapaces de replicarse en al menos un tipo de celulas de al menos una especie animal.
Para las celulas de mairnferos, en particular las celulas humanas, el virus de ADN es el Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) segun se caracteriza en las reivindicaciones.
El Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) esta relacionado con el virus Vaccinia, un integrante del genero Orthopoxvirus de la familia Poxviridae. MVA se genero mediante 516 pasajes seriados en fibroblastos de embriones de pollo de la cepa Ankara del Virus Vaccinia (CVA) (por una resena consulte Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 [1975]). Como consecuencia de estos pasajes de largo plazo el virus MVA resultante suprimio aproximadamente 31 kilobases de su secuencia genomica y, por consiguiente, fue descrito como altamente restringido a las celulas de aves como celulas huesped (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72. 1.031-1.038 [1991]). Se demostro, en una diversidad de modelos de animales que el MVA resultante era significativamente avirulento (Mayr, A. y Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand, 41: 225-34). Ademas, esta cepa de MVA se probo en ensayos clmicos como vacuna para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr et al., zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr, 99, 2.386-2.392 [1974]). En estos estudios participaron mas de 120.000 seres humanos, incluidos pacientes de alto riesgo, y se demostro que, en comparacion con las vacunas basadas en Vaccinia, MVA habfa disminuido la virulencia o la infecciosidad manteniendo al mimo tiempo una buena inmunogenicidad.
Una cepa de acuerdo con la presente divulgacion es MVA 575, depositada en la Coleccion Europea de Cultivos de Celulas Animales (ECACC) con el numero de deposito V00120707. El MVA-BN, depositado en la misma institucion con el numero de deposito V000083008 y sus derivados son los utilizados en la invencion reivindicada.
Las propiedades de MVA-BN y sus derivados, se pueden resumir del siguiente modo:
(i) capacidad de efectuar una replicacion reproductiva en los fibroblastos de embriones de pollo (CEF) y en la lmea celular BHK, pero incapacidad de efectuar una replicacion reproductiva en la lmea celular humana HaCat, HeLa y 143B,
(ii) ineptitud para replicarse in vivo,
(iii) induccion de una inmunogenicidad mayor en comparacion con la cepa conocida MVA 575 (ECACC V00120707) en un modelo de provocacion letal y/o
(iv) induccion de al menos practicamente el mismo nivel de inmunidad en regfmenes de sensibilizacion con virus vaccinia/refuerzo con virus vaccinia en comparacion con regfmenes de sensibilizacion con ADN/refuerzo con virus vaccinia.
Para obtener informacion detallada con respecto a los ensayos usados para determinar si una cepa de MVA tiene una o mas de las caractensticas anteriores (i) a (iv) consultar WO 02/42480. Esta publicacion tambien divulga como se pueden obtener los virus que tienen las propiedades deseadas. En particular, WO 02/42480 proporciona una definicion detallada de las caractensticas de MvA-BN y de un derivado de MVA-BN y divulga en detalle los ensayos biologicos que se usan para determinar si una cepa de MVA es MVA-BN o un derivado. En otras palabras, las caractensticas de MVA-BN, la descripcion de los ensayos biologicos que permiten evaluar si una cepa de MVA es MVA-BN o un derivado y los metodos que permiten obtener a MVA-BN o un derivado se divulgan en WO 02/42480. A continuacion se resume brevemente como un experto en la materia llega a cepas de MVA que tienen una o mas de las caractensticas anteriores y como se puede probar si una cepa de MVA dada tiene una o mas de dichas caractensticas y es por lo tanto un virus muy preferido de acuerdo con la presente invencion. No se debe entender que el resumen siguiente limita a la informacion siguiente la pertinencia de WO 02/42480 para la presente solicitud. En cambio, WO 02/42480 se incorpora aqrn en su totalidad por referencia.
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El termino "incapaz de efectuar una replicacion reproductiva" en la lmea celular HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106 (3): 761-71) se usa en la presente solicitud segun se define en WO 02/42480. Por lo tanto, un virus "incapaz de efectuar una replicacion reproductiva" en la lmea celular HaCat es un virus que tiene una tasa de amplificacion menor de 1 en la lmea celular humana HaCat. Preferentemente, la tasa de amplificacion del virus utilizado como vector de acuerdo con la invencion es 0,8 o menor en la lmea celular humana HaCat. La "tasa de amplificacion" de un virus es el cociente entre el virus producido a partir de una celula infectada (Produccion) y la cantidad usada originalmente para infectar las celulas en primer lugar (Insumo) ("tasa de amplificacion"). Un cociente de "1" entre la produccion y el insumo define un estado de amplificacion en el que la cantidad de virus producido a partir de las celulas infectadas es la misma que la cantidad inicialmente usada para infectar las celulas. El termino "derivados" de los virus como el depositado como ECACC V00083008 hace referencia preferentemente a los virus que tienen esencialmente las mismas caractensticas de replicacion que la cepa depositada pero tienen diferencias en una o mas partes de su genoma. Los virus que tienen las mismas "caractensticas de replicacion" que el virus depositado son los virus que se replican con tasas de amplificacion similares a la de la cepa depositada en las celulas CEF y las lmeas celulares BHK, HeLa, HaCat y 143B y que tienen una replicacion similar in vivo segun se determina en el modelo de ratones transgenicos AGR129 (ver mas adelante).
El termino "ineptitud para replicarse in vivo" se usa en la presente solicitud segun se define en WO 02/42480. Por lo tanto, dicha expresion hace referencia a los virus que no se replican en los seres humanos ni en el modelo de ratones segun se explica en WO 02/42480. Los ratones usados en WO 02/42480 son incapaces de producir linfocitos B y T maduros (ratones AGR129). El MVA-BN y sus derivados no matan a los ratones AGR129 en un penodo de al menos 45 dfas, mas preferentemente de al menos 60 dfas, muy preferentemente de 90 dfas despues de la infeccion de los ratones con 107 ufp de virus administradas intraperitonealmente. Preferentemente, los virus que presentan "ineptitud para replicarse in vivo" se caracterizan ademas porque no se recupera ningun virus de los organos o tejidos de los ratones AGR129 45 dfas, preferentemente 60 dfas y muy preferentemente 90 dfas despues de la infeccion de los ratones con 107 ufp de virus administradas intraperitonealmente.
En vez de los ratones AGR129 se puede usar otra raza de ratones que sea incapaz de producir linfocitos B y T maduros y como tal esten severamente inmunodeprimidos y sumamente vulnerables a un virus que se replica.
Los detalles del experimento de provocacion letal utilizado para determinar si una cepa de MVA tiene "una inmunogenicidad mayor en comparacion con la cepa 575 de MVA conocida" se explican en WO 02/42480. En dicho modelo de provocacion letal los ratones sin vacunar mueren despues de la infeccion con cepas de vaccinia competentes para la replicacion como la cepa Western Reserve L929 TK+ o IHD-J. La infeccion con virus vaccinia competentes para la replicacion se denomina "provocacion" en el contexto de la descripcion del modelo de provocacion letal. En general se mata a los ratones cuatro dfas despues de la provocacion y se determina el tttulo vmco en los ovarios mediante ensayos en placa estandar utilizando celulas VERO. El tftulo vmco se determina para los ratones sin vacunar y los ratones vacunados con MVA-BN y sus derivados. Mas espedficamente MVA-BN y sus derivados se caracterizan porque en esta prueba despues de la vacunacion con 102 DICT50 de virus/ml los tftulos vmcos en los ovarios se reducen en al menos un 70 %, preferentemente en al menos 80 %, mas preferentemente en al menos 90 % en comparacion con los ratones sin vacunar.
El MVA-BN y sus derivados, son utiles para la administracion de sensibilizacion/refuerzo. Las cepas de MVA que se usan en la presente invencion, MVA-BN y sus derivados asf como los virus recombinantes correspondientes que albergan secuencias heterologas, se pueden usar para sensibilizar primero y luego reforzar las respuestas inmunitarias eficazmente en los animales nativos asf como en los animales con una inmunidad preexistente a los poxvirus. Por lo tanto el virus de acuerdo con la presente invencion induce al menos practicamente el mismo nivel de inmunidad en los regfmenes de sensibilizacion con virus vaccinia/refuerzo con virus vaccinia en comparacion con los regfmenes de sensibilizacion con ADN/refuerzo con virus vaccinia.
Se considera que una cepa de MVA induce al menos practicamente el mismo nivel de inmunidad en los regfmenes de sensibilizacion con virus vaccinia/refuerzo con virus vaccinia cuando se comparan con los regfmenes de sensibilizacion con ADN/refuerzo con virus vaccinia si la respuesta CTL medida segun el "ensayo 1" o el "ensayo 2" segun se divulgan en WO 02/42480, preferentemente en ambos ensayos, es al menos practicamente la misma en los regfmenes de sensibilizacion con virus vaccinia/refuerzo con virus vaccinia cuando se comparan con los regfmenes de sensibilizacion con ADN/refuerzo con virus vaccinia. Mas preferentemente la respuesta CTL despues de la administracion de sensibilizacion con virus vaccinia/refuerzo con virus vaccinia es mayor en al menos uno de los ensayos, cuando se compara con los regfmenes de sensibilizacion con ADN/refuerzo con virus vaccinia. Muy preferentemente la respuesta CTL es mayor en ambos ensayos.
El virus usado de acuerdo con la presente invencion puede ser un virus no recombinante que no contenga secuencias nucleotfdicas heterologas. El MVA-BN y sus derivados son virus vaccinia no recombinantes. Alternativamente el virus puede ser un MVA-BN recombinante o un derivado de este que contenga secuencias nucleotfdicas adicionales, que sean heterologas para el virus.
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El termino "heterologas" segun se usa en la presente solicitud hace referencia a cualquier combinacion de las secuencias de acidos nucleicos que no se encuentra normalmente mtimamente asociada al virus en la naturaleza, tal virus tambien se denomina "virus recombinante".
La secuencia de acido nucleico heterologa se selecciona preferentemente entre una secuencia que codifica al menos un antigeno; un epftopo antigenico, protemas beneficiosas y/o un compuesto terapeutico.
La expresion "protemas beneficiosas" segun se usa en la presente solicitud hace referencia a cualquier protema que sea util para proteger a un animal contra un antigeno seleccionado entre un antfgeno tumoral y un antfgeno extrano, donde el antfgeno tumoral y el antfgeno extrano son diferentes de los antigenos asociados al virus. Alternativamente y mas en particular las "protemas beneficiosas" son activas para aumentar el nivel de los factores que activan las celulas dendnticas y/o son activas para aumentar el numero de celulas dendnticas y/o son activas para aumentar la produccion y/o el contenido celular de un interferon (IFN) o IL-12. Por lo tanto, los ejemplos de tales protemas beneficiosas son los interferones como IFN-alfa o IFN-beta, IL-12, Flt3-L y/o GM-CSF.
Los epftopos antigenicos pueden ser cualquier epftopo para el que tenga sentido inducir una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de epftopos antigenicos son los epftopos del Plasmodium falciparum, Mycobacteria, del virus de la gripe, de los virus seleccionados de la familia de los Flavivirus, los Paramyxovirus, los virus de la hepatitis, los virus de la inmunodeficiencia humana o de los virus que causan la fiebre hemorragica como los Hantavirus o Filovirus, es decir, el virus del Ebola o el virus de Marburgo. Por lo tanto, si por ejemplo, un MVA recombinante que expresa los epftopos heterologos se usa para vacunar neonatos de acuerdo con la presente invencion, el resultado de este tratamiento no es solo una vacunacion general debida a la maduracion acelerada del sistema inmunitario sino tambien una vacunacion espedfica contra el epftopo heterologo expresado del MVA heterologo.
Un "compuesto terapeutico" codificado por el acido nucleico heterologo en el virus recombinante puede ser, por ejemplo, un acido nucleico terapeutico como un acido nucleico antisentido o un peptido o protema con la actividad biologica deseada.
La insercion de la secuencia de acido nucleico heterologa se hace preferentemente en una region no esencial del genoma del virus. Alternativamente, la secuencia de acido nucleico heterologa se inserta en un sitio del genoma del virus donde se produce naturalmente delecion (para el MVA divulgado en PCT/EP96/02926). Los metodos acerca de como insertar las secuencias heterologas en el genoma del virus como un genoma poxvftico son conocidos por los expertos en la materia.
La presente invencion tambien describe una preparacion farmaceutica y una vacuna que comprende dicho MVA, por ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria en un organismo animal vivo, incluido un ser humano.
La preparacion farmaceutica en general puede incluir uno o mas excipientes, aditivos, antibioticos, conservantes, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizantes farmaceuticamente aceptables y/o aprobados. Dichas sustancias auxiliares pueden ser agua, solucion salina, glicerol, etanol, humectantes o emulsionantes, amortiguadores del pH, o similares. Los excipientes adecuados son habitualmente moleculas grandes, de metabolizacion lenta como protemas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polimericos, aminoacidos copolimericos, agregados lipfdicos, o similares.
Para la elaboracion de las vacunas, el virus o sus recombinantes se convierten en una forma fisiologicamente aceptable. Dichos metodos son conocidos por los expertos en la materia. La vacuna de MVA se puede preparar basandose en la experiencia en la elaboracion de vacunas de poxvirus utilizadas para vacunar contra la viruela segun describen Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr, 99, 2.386-2.392). Por ejemplo, el virus purificado se almacena a -80°C con un tftulo de 5 x 108 DICTso/ml formulado en aproximadamente Tris 10 mM, NaCl 140 mM a pH 7,4. Para la elaboracion de las dosis de vacuna, se liofilizan, por ejemplo, 101, 108 partmulas del virus en 100 ml de solucion salina amortiguada con fosfato (PBS) en presencia de peptona al 2% y albumina humana al 1% en una ampolla, preferentemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna se pueden producir mediante liofilizacion en etapas del virus en una formulacion. Esta formulacion puede contener otros aditivos como manitol, dextrano, azucar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos como antioxidantes o gas inerte, estabilizantes o protemas recombinantes (por ejemplo, albumina serica humana) adecuados para la administracion in vivo. Despues se sella la ampolla de vidrio y se puede almacenar entre 4°C y temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, mientras no sea necesaria la ampolla se almacena preferentemente a temperaturas por debajo de -20°C.
Para la vacunacion o el tratamiento, el liofilizado se puede disolver en 0,1 a 0,5 ml de una solucion acuosa, preferentemente solucion salina o solucion amortiguadora Tris y administrarse ya sea sistemicamente o localmente, es decir por via parenteral, intramuscular u otra via de administracion conocida por los profesionales del area. Los tecnicos con experiencia en el tema pueden optimizar la modalidad de administracion, la dosis y el numero de administraciones de una manera conocida.
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El MVA utilizado de acuerdo con la presente invencion, se puede administrar mediante aplicacion oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradermica y/o subcutanea. En los animales pequenos la inoculacion para la inmunizacion se realiza preferentemente parenteral o nasalmente, mientras que en los animales mas grandes o los seres humanos se prefiere la inoculacion subcutanea, intramuscular u oral.
MVA se administra preferentemente en una dosis de 101 DICT50 (dosis infecciosa de cultivo tisular) a 109 DICT50.
Segun se senala precedentemente MVA-BN y sus derivados se pueden administrar en una cantidad terapeuticamente eficaz en una primera inoculacion ("inoculacion de sensibilizacion") y en una segunda inoculacion ("inoculacion de refuerzo").
En el contexto de la presente invencion el termino "animal" abarca tambien a los seres humanos. De manera mas general, el animal es un animal vertebrado, preferentemente un mairnfero incluido un ser humano. Ejemplos espedficos de los animales son las mascotas como los perros, los gatos, los animales economicamente importantes como los terneros, el ganado bovino, los ovinos, los caprinos, los caballos, los cerdos y otros animales como los ratones y las ratas. La invencion tambien se puede usar para las aves economicamente importantes como pavos, patos, gansos y gallinas si se usan virus que son capaces de infectar las celulas de las aves pero incapaces de replicarse para generar una descendencia vmca infecciosa en dichas celulas.
La expresion "animales domesticos" segun se usa en esta descripcion hace referencia preferentemente a animales domesticos mamfferos, mas preferentemente a los perros, los gatos, los terneros, el ganado bovino, los ovinos, los caprinos, los cerdos, los caballos y los ciervos.
MVA-BN y sus derivados se pueden usar como vacunas espedficas, es decir, para provocar una respuesta inmunitaria que proteja al recien nacido vacunado contra las enfermedades causadas por un virus virulento que pertenezca al mismo grupo, familia o genero de virus que el virus que se uso para la vacunacion. MVA-BN o sus derivados se pueden usar para vacunar a los seres humanos recien nacidos contra las infecciones por poxvirus, en particular contra la viruela. MVA-BN y sus derivados tambien se pueden usar para vacunar animales vertebrados contra las infecciones por poxvirus de importancia veterinaria. El virus usado para la vacunacion puede ser un MVA- BN no recombinante o un derivado, o un virus recombinante que albergue genes en el genoma del virus que no se encuentran naturalmente en dicho genoma. El virus recombinante alberga otros genes que son utiles para estimular la respuesta inmunitaria. Los ejemplos de esta clase de genes son los genes de citocina y los genes de interferon.
Ademas, a modo de ejemplo, se puede vacunar a los neonatos con un virus recombinante que albergue una secuencia de acido nucleico heterologa segun se define precedentemente para inducir una respuesta inmunitaria contra la secuencia aminoaddica expresada a partir de la secuencia de acido nucleico heterologa. A modo de ejemplo la secuencia de acido nucleico puede codificar un antfgeno o un epttopo antigenico segun se define precedentemente. El virus recombinante es un MVA-BN recombinante o un derivado de este, que comprendan un acido nucleico heterologo que codifique los antfgenos de (i) otros virus que no sean MVA, como VIH-1, VIH-2, el virus del dengue, el virus del Nilo Occidental, el virus de la encefalitis japonesa, el virus del sarampion, (ii) antfgenos tumorales, (iii) bacterias, (iv) hongos. Si el antfgeno expresado del virus recombinante es por ejemplo, un antfgeno del VIH es posible usar el virus recombinante para inducir una respuesta inmunitaria en el neonato vacunado contra el VIH y prevenir el SIDA. En un sentido mas amplio el virus recombinante que expresa el antfgeno o epftopo antigenico se usa para inducir una respuesta inmunitaria contra el agente del cual deriva la secuencia heterologa y/o contra el agente que comprende el antfgeno o el epftopo antigenico.
De acuerdo con la invencion se ha encontrado, inesperadamente, que los virus que son capaces de infectar las celulas del animal neonato, incluido un ser humano, pero que son incapaces de replicarse para generar una descendencia vmca infecciosa en el animal neonato, incluido un ser humano, se pueden usar para la preparacion de un medicamento para proteger un animal recien nacido, incluido un ser humano, contra un antfgeno seleccionado entre el antfgeno tumoral y el antfgeno extrano, donde el antfgeno tumoral y/o el antfgeno extrano son diferentes de los antfgenos asociados al virus.
De acuerdo con la invencion los recien nacidos vacunados con MVA-BN o sus derivados estan protegidos contra una provocacion con antfgenos extranos como los agentes infecciosos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, MVA-BN o sus derivados son una vacuna general para los recien nacidos, es decir mediante la vacunacion de los recien nacidos con MVA-BN o sus derivados el sistema inmunitario de los recien nacidos se torna mas competente para lidiar con los antfgenos extranos como los virus. En la seccion de los ejemplos esto se ejemplifica para la vacunacion con MVA y una provocacion posterior con virus del herpes simple tipo 1. Por lo tanto, si se usa MVA-BN o sus derivados para la vacunacion de los recien nacidos, los animales vacunados estan mas protegidos contra los antfgenos extranos que los animales sin vacunar en el lapso cntico hasta que se establece un sistema inmunitario funcional y maduro.
De acuerdo con la presente invencion "el antfgeno tumoral y/o el antfgeno extrano son diferentes de los antfgenos asociados al virus". Esta expresion se interpretara en el sentido de que de acuerdo con la invencion la intencion principal no es usar MVA para inducir una respuesta inmunitaria contra el virus mismo. En cambio el virus se usa
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para inducir una respuesta inmunitaria o al menos una estimulacion inmunitaria general que proteja al huesped contra los antigenos extranos y los antigenos tumorales, respectivamente, que no estan asociados al virus. La expresion "antfgenos asociados al virus" hace referencia a los epftopos y los antigenos de la partfcula vftica y a los antfgenos y los epftopos en la superficie de una celula infectada con el virus que son el resultado de la expresion del genoma del virus.
En el contexto de esta realizacion la expresion "antigenos extranos" hace referencia a cualquier antigeno y epftopo que no sea naturalmente una parte o un componente del organismo del animal. Antigenos extranos son especialmente los antigenos y epftopos de los agentes infecciosos y las toxinas. Los agentes infecciosos tfpicos son virus como los herpesvirus, los retrovirus, los virus de la rabia, los rabdovirus, los adenovirus; las bacterias como Salmonella, Mycoplasma, Meningococcus, Haemophilus; los priones o los hongos.
La invencion no solo es de interes para vacunar animales contra los antfgenos extranos sino que, en una realizacion alternativa, tambien es adecuada para vacunar contra antigenos tumorales. "Antfgenos tumorales" son los antigenos asociados a ciertas enfermedades tumorales. Los antigenos tumorales son con mayor frecuencia los antigenos codificados por el genoma del huesped que presenta el tumor. Por lo tanto, en un sentido estricto los antigenos tumorales no son antfgenos extranos. Sin embargo, los antfgenos tumorales se encuentran en cantidades significativas en los tumores, mientras que la cantidad de antfgenos tumorales en los tejidos normales es significativamente inferior y con mayor frecuencia no se encuentra ningun antfgeno tumoral en el tejido normal. Los ejemplos de antfgenos tumorales son conocidos por los expertos en la materia e incluyen por ejemplo, los antfgenos MAGE. MVA-BN o sus derivados son eficaces contra estos antfgenos tumorales puesto que la vacunacion de los animales produce una activacion y/o una maduracion acelerada del sistema inmunitario que luego puede dar lugar a la destruccion de las celulas tumorales.
La expresion "que protege contra un antigeno" hace referencia al desarrollo de una respuesta inmunitaria, que se dirige contra el antfgeno extrano o tumoral. Si el antfgeno extrano es un agente infeccioso el huesped esta protegido contra dicho agente, es decir el huesped desarrolla una respuesta inmunitaria contra dicho antfgeno. En consecuencia, la infeccion con el agente infeccioso deriva en una enfermedad menos grave o en ninguna enfermedad. La expresion "que protege" no se debe entender en el sentido de que hay siempre una proteccion del 100% contra el antigeno extrano o tumoral. En cambio, el termino "proteccion" como se usa en esta solicitud se refiere a cualquier efecto beneficioso que ayude al animal a lidiar con el antfgeno extrano y el antfgeno tumoral, respectivamente.
De acuerdo con la presente invencion dicho efecto protector se ejerce durante al menos 5 dfas, preferentemente durante al menos 7, 14 o 28 dfas despues de la primera vacunacion. En otras palabras, el animal vacunado y o tratado esta protegido por ejemplo, contra un antfgeno extrano si el animal entre en contacto con dicho antfgeno despues de 5, 7, 14 y 28 dfas, respectivamente.
En el contexto de la presente invencion el efecto de la vacunacion de los recien nacidos con MVA-BN o sus derivados se puede explicar mediante la induccion o la mejora de la maduracion del sistema inmunitario y/o la activacion del sistema inmunitario. En el contexto de la presente invencion la expresion "induccion o mejora de la maduracion del sistema inmunitario" hace referencia entre otras cosas al aumento acelerado de celulas dendrfticas o de sus precursoras en los vacunados en relacion con los testigos. Las expresiones "aceleracion de la maduracion" del sistema inmunitario y "mejora de la maduracion" del sistema inmunitario se usan indistintamente en esta descripcion.
La "activacion del sistema inmunitario" se caracteriza por la expresion en la superficie de las celulas de moleculas y hormonas que facilitan la interaccion o el trafico celula/celula y/o por la secrecion de dichas moleculas y hormonas por las celulas. Los receptores espedficos captan estas senales y responden. Los marcadores de la activacion son entre otros Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II y CD8, en particular CD8alfa (ver mas adelante).
El desarrollo o la maduracion acelerados del sistema inmunitario se correlacionan con un aumento del nivel de los factores que activan y/o movilizan las celulas dendrfticas (CD) o sus celulas precursoras y/o con un aumento del numero de celulas dendrfticas y de sus celulas precursoras y/o con un aumento de la produccion y/o el contenido celular de un interferon o IL-12. Un ejemplo de celulas precursoras de CD que son inducidas por MVA, son los precursoras de CD plasmacitoides que son muy importantes para la defensa contra las infecciones vfticas y que parecen producir IFN a/p.
Mas espedficamente, la mejora de la maduracion del sistema inmunitario se define preferentemente mediante un aumento de al menos 2 veces en los marcadores superficiales encontrados en las CD, como MHC-II, CD40 y/o CD80/86. Preferentemente dicho aumento se puede medir en la sangre. Otros marcadores para caracterizar una mejora de la maduracion del sistema inmunitario son Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II y CD8a (ver mas adelante). Ademas, la maduracion acelerada del sistema inmunitario se correlaciona preferentemente con al menos un aumento de 1,5 veces, preferentemente con al menos un aumento de 2,0 veces en el numero de celulas CD11c positivas en la sangre y/o el bazo 7 dfas despues de la administracion de MVA-BN a los animales recien nacidos en comparacion con los animales testigo que no recibieron MVA-BN. Por otra parte, la mejora de la maduracion del
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sistema inmunitario se puede correlacionar preferentemente con un aumento de al menos 1,5 veces, mas preferentemente un aumento de al menos 2,0 veces en la concentracion de Flt3-L dos d^as despues de la vacunacion de los neonatos con los virus de acuerdo con la presente invencion, cuando se comparan con testigos coincidentes en edad.
En este contexto se debe advertir que hay una asociacion entre el fenotipo y la funcion de las poblaciones de CD murinas y humanas que se pueden caracterizar por su fenotipo superficial (Hochrein et al. 2002. Hum. Immunol. 63:1.103). Las CD se pueden detectar en la sangre mediante citometna de flujo usando una variedad de marcadores superficiales (MacDonald et al. 2002. Blood. 100:4.512) eso tambien permite identificar poblaciones espedficas de CD, como las CD plasmacitoides (Dzionek et al. 2002. Hum Immunol. 63: 1.133; Dzionek et al 2000. J. Immunol. 165: 6.037). Usando tecnicas similares tambien se pueden detectar las CD en otros tejidos humanos (Summers et al. 2001. Am. J. Pathol. 159: 285).
De acuerdo con la presente invencion los virus como los definidos antes tambien se podnan usar para tratar animales neonatos para aumentar el nivel de los factores que activan y o movilizan las celulas dendnticas (CD) o sus celulas precursoras y/o para aumentar el numero de celulas dendnticas y de sus celulas precursoras y/o para aumentar la produccion y/o el contenido celular de un interferon o IL-12. Se demostro que despues de la vacunacion con MVA-BN las celulas dendnticas plasmacitoides fabrican significativamente mas IL-12 y tienen una mayor produccion de IFN-alfa y expresion de MHC-II y CD8a. El aumento de IL-12 despues de la administracion de los virus usados de acuerdo con la presente invencion es preferentemente de 2 veces, mas preferentemente de 100 veces, 500 veces, 1.000 veces, 2.500 veces o 5.000 veces. El aumento de la concentracion de Flt3-L dos dfas despues de la vacunacion de los neonatos con MVA-BN o sus derivados es preferentemente de 1,5 veces, mas preferentemente de 2,0 veces en comparacion con los testigos coincidentes en edad.
El termino "activacion de las celulas dendnticas o de sus precursoras" hace referencia a la maduracion de las CD a celulas que presentan antigeno a traves de los estadios celulares definidos por la enfermedad dirigidas por hormonas y estfmulos. Los intermediarios de las CD se denominan precursoras. Las CD inmaduras alcanzan la periferia. Diferentes estfmulos (antigenicos) activan las CD. Los marcadores de la activacion, que se expresan en las celulas dendnticas activadas son entre otros Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II y CD8a (ver mas adelante).
Se observo que las hormonas tales como GM-CSF dan lugar a mas CD inmaduras en la periferia. Debido a que el GM-SCF da lugar a mas precursoras de las CD en la medula osea, la sangre y los organos perifericos (y las celulas se tienen que trasladar allf), este fenomeno se ha denominado "movilizacion de las celulas dendnticas o de sus precursoras". Esta definicion tambien se usa en esta descripcion.
En consecuencia, la vacunacion de animales incluido un ser humano es especialmente util, si esta destinada a aumentar el nivel de los factores que activan las celulas dendnticas (CD) o sus celulas precursoras y/o a aumentar el numero de celulas dendnticas o de sus celulas precursoras y/o a aumentar la produccion y/o el contenido celular de un interferon o de IL-12.
Los factores que activan las celulas dendnticas comprenden entre otros a Flt3-L (Lyman et al., Cell 1993, 75:1.1571.167) y GM-CSF. Los interferones tfpicos de acuerdo con la presente invencion son IFN-alfa e IFN-beta. Los virus usados de acuerdo con la presente invencion inducen a Flt3-L y se supone que algunos de los efectos beneficiosos observados son debidos a dicha induccion.
En el contexto de la presente solicitud un animal o ser humano recien nacido se define como un animal o ser humano que todavfa no tiene un sistema inmunitario maduro. En toda esta especificacion las expresiones "animal recien nacido" y "animal neonato" se usan sinonimamente. Un sistema inmunitario maduro se caracteriza por la capacidad de activar plenamente el sistema inmunitario innato y por el hecho de que todas las funciones y productos conocidos de los linfocitos T y B estan en su sitio, en particular los isotipos de la inmunoglobulina como la IgA y la IgE. Por lo tanto un sistema inmunitario inmaduro se caracteriza por un numero bajo de linfocitos T, linfocitos B y celulas dendnticas en relacion con el de los adultos, por una produccion de IFN, que es baja en comparacion con la de los adultos y por el hecho de que los organos linfoides secundarios no estan totalmente maduros. Mas espedficamente un "neonato" o "recien nacido" en el contexto de la presente invencion se puede definir como un animal de poca edad que tiene un numero de celulas CD4+ esplenicas que son preferentemente al menos 2 veces, mas preferentemente al menos 20 veces, mas preferentemente al menos 200 veces, mas preferentemente al menos 2.000 veces, muy preferentemente al menos 20.000 veces menor que el numero promedio de celulas CD4+ esplenicas en los adultos.
En los ratones el sistema inmunitario esta maduro a la edad de 4 semanas. En los humanos probablemente entre los 6 meses y 1 ano de edad. En los gatos y perros el sistema inmunitario esta maduro generalmente a la edad de 6 meses, en los terneros, los ovinos y los cerdos a las 4 a 12 semanas de edad. La vacunacion con MVA-BN o sus derivados se lleva a cabo preferentemente antes de que el sistema inmunitario este maduro. Sin embargo, dado que la madurez se desarrolla casi exponencialmente despues del nacimiento lo que mas se prefiere es vacunar con MVA-BN o sus derivados tan pronto como sea posible despues del nacimiento. Puesto que en todos los animales domesticos importantes y en los seres humanos el sistema inmunitario no esta maduro hasta 4 semanas despues
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del nacimiento, en general es preferible que la vacunacion con MVA-BN o sus derivados, se haga preferentemente en las 4 semanas siguientes al nacimiento, mas preferentemente en las 2 semanas siguientes al nacimiento, aun mas preferentemente en la semana siguiente al nacimiento, muy preferentemente en los 3 dfas siguientes al nacimiento. Estos terminos generales son aplicables a todos los animales domesticos importantes, en particular a todos los animales domesticos mairnferos importantes, incluidos los seres humanos. El experto en la materia sera consciente del hecho de que incluso los animales de mas edad se pueden considerar como recien nacidos/neonatos en el contexto de la presente invencion y que, por lo tanto, la vacunacion tambien se puede llevar a cabo con exito en animales de mas edad, cuando el sistema inmunitario todavfa no esta maduro 4 semanas despues del nacimiento. Por lo tanto, en los seres humanos la vacunacion se puede llevar a cabo en los 6 meses siguientes al nacimiento, mas preferentemente en los 3 meses siguientes al nacimiento, mas preferentemente en los 2 meses siguientes al nacimiento, mas preferentemente en las 4 semanas siguientes al nacimiento, mas preferentemente en las 2 semanas siguientes al nacimiento, aun mas preferentemente en la semana siguiente al nacimiento, muy preferentemente en los 3 dfas siguientes al nacimiento.
A modo de ejemplo, puesto que los mejores efectos de MVA-BN o sus derivados como una vacuna general se observan si el virus se administra a un sistema inmunitario inmaduro, se pueden vacunar los animales incluidos los seres humanos antes de nacer. La vacunacion prenatal puede ser aconsejable en los animales economicamente importantes como el ganado bovino o los cerdos. Si la placenta deja pasar al virus el prenato se puede vacunar sencillamente vacunando al animal madre. Por lo tanto, la vacunacion del animal madre para vacunar al prenato es particularmente promisoria en un animal que tenga una placenta endoteliocorial, como los perros, los gatos, las ratas y los ratones o que tenga una placenta hemocorial, como los primates incluidos los seres humanos. En los animales que tienen una placenta epiteliocorial, como el ganado bovino y ovino o que tienen una placenta sindesmocorial, como los cerdos y los caballos, la vacunacion de los prenatos se puede hacer por administracion intrauterina. Desde luego, esta modalidad de administracion tambien se puede usar en los animales que tienen placenta endoteliocorial o hemocorial.
Dado que MVA-BN o un derivado de este produce una maduracion acelerada del sistema inmunitario y que MVA-BN o un derivado de este es por lo tanto util como una vacuna general, los animales vacunados estan protegidos contra una diversidad de enfermedades. Mas espedficamente MVA-BN o un derivado de este se puede usar para vacunar a los gatos para el bienestar general y contra el herpes felino o la peritonitis infecciosa felina. MVA se puede usar en los perros para el bienestar general y contra las enfermedades (vmcas) asociadas a las vfas respiratorias. MVA-BN o un derivado de este se puede usar en los cerdos para el bienestar general y contra infecciones por Haemophilus o Mycoplasma, especialmente en cerdos para engorde.
Como se senalo a modo de ejemplo, MVA-BN o un derivado de este se puede usar en los animales recien nacidos o prenatos para protegerlos contra un antfgeno extrano y/o un antfgeno tumoral, donde el antfgeno tumoral es diferente de los antfgenos asociados al virus usado para la vacunacion. Sin embargo, esto no esta restringido a los animales recien nacidos y prenatos. En cambio, esto se puede llevar a cabo en animales de todas las edades, ya que se puede observar un efecto beneficioso tambien en los animales adultos. Por lo tanto, MVA-BN y sus derivados son utiles para proteger a un animal, incluido un ser humano, contra un antfgeno seleccionado entre un antfgeno tumoral y un antfgeno extrano, donde el antfgeno tumoral y/o el antfgeno extrano son diferentes de los antfgenos asociado al virus. Segun se senala antes, MVA-BN o un derivado de este es capaz de infectar celulas del animal pero es incapaz de replicarse para generar una descendencia vmca infecciosa en dichas celulas. Toda la informacion, las definiciones, incluida la definicion de la duracion del efecto protector y los ejemplos dados para los neonatos tambien se aplican a los adultos.
En contraposicion a los recien nacidos, el sistema inmunitario de los animales adultos ya maduro. No obstante, podna ser que el sistema inmunitario estuviera debilitado debido a ciertas enfermedades o sencillamente debido a la edad del animal. Especialmente en personas inmunodeprimidas y en las personas ancianas la administracion de MVA-BN o un derivado de este al animal puede tener un efecto beneficioso entre otras cosas por el aumento del nivel de los factores que activan y/o movilizan las celulas dendnticas (CD) o sus celulas precursoras y/o por el aumento del numero de celulas dendnticas o de sus celulas precursoras y/o por el aumento de la produccion y/o el contenido celular de un interferon o de IL-12. Por lo tanto, incluso en los animales adultos la administracion de MVA- BN o un derivado de este puede dar lugar a una mayor competencia del sistema inmunitario para lidiar con los antfgenos extranos y/o los antfgenos tumorales. En otras palabras, aunque no es parte de la invencion reivindicada, MVA-BN o un derivado de este es util para la activacion del sistema inmunitario en general.
La invencion se refiere ademas a MVA-BN o un derivado de este para la elaboracion de un medicamento que se va a administrar a un animal neonato, incluido un ser humano, donde dicho medicamento aumenta el nivel de los factores que activan las celulas dendnticas y/o aumenta el numero de celulas dendnticas y/o aumenta la produccion y/o el contenido celular de un interferon (IFN) o de IL-12. Todas las definiciones proporcionadas antes para las otras realizaciones tambien se aplican a la presente realizacion. Segun esta realizacion la invencion no apunta principalmente a inducir una proteccion contra los antfgenos extranos y/o los antfgenos tumorales. En cambio, esta realizacion tiene como finalidad tratar las afecciones y enfermedades caracterizadas por un bajo nivel de los factores que activan las celulas dendnticas y/o por un numero insuficiente o demasiado bajo de celulas dendnticas y/o por una produccion y/o contenido celular bajos de un interferon (IFN) o de IL-12. Por lo tanto, segun esta realizacion el
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tratamiento con MVA-BN o un derivado de este podna proteger contra las alergias o las enfermedades autoinmunitarias. Nuevamente, este tratamiento es particularmente prometedor si MVA-BN o el derivado de este se administra a los animales recien nacidos.
MVA-BN y sus derivados son particularmente utiles para inducir respuestas inmunitarias en los animales
inmunodeprimidos, por ejemplo, los monos (CD4 < 400/^J de sangre) infectados con el VIS, o los seres humanos inmunodeprimidos. El termino "inmunodeprimido" describe el estado del sistema inmunitario de un individuo, que muestra solo respuestas inmunitarias incompletas o tiene una eficacia reducida en la defensa contra agentes infecciosos.
A modo de ejemplo, MVA-BN o un derivado de este se puede usar en un metodo para proteger a un animal, incluido un ser humano, contra un antigeno seleccionado entre un antigeno tumoral y un antigeno extrano, mediante la administracion de un virus de acuerdo con la presente invencion, donde el antfgeno tumoral y/o el antigeno extrano son diferentes de los antfgenos asociados al virus.
Ademas, a modo de ejemplo, MVA-BN o un derivado de este se puede usar en un metodo para el tratamiento de un animal, incluido un ser humano, para aumentar el nivel de los factores que activan las celulas dendnticas y/o aumentar el numero de celulas dendnticas y/o aumentar la produccion y/o el contenido celular de un interferon (IFN) o de IL-12, que comprende la administracion de MVA-BN o un derivado de este.
Resumen de la invencion
La invencion se refiere al uso caracterizado en las reivindicaciones.
MVA-BN esta depositado en la Coleccion Europea de Cultivos de Celulas Animales (ECACC) con el numero de deposito V00083008.
El uso, como el precitado, segun el cual dicho MVA se administra mediante aplicacion oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradermica y/o subcutanea.
El uso, como el precitado, segun el cual dicho MVA se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz en una primera inoculacion ("inoculacion de sensibilizacion") y en una segunda inoculacion ("inoculacion de refuerzo").
El uso, como el precitado, segun el cual dicho MVA se administra al animal, incluido un ser humano, en una cantidad de al menos 101 DICT50 (dosis infecciosa de cultivo tisular).
El uso, como el precitado, segun el cual el dicho genoma de MVA comprende al menos una secuencia de acido nucleico heterologa.
El uso, como el precitado, segun el cual la secuencia de acido nucleico heterologa se selecciona entre una secuencia que codifica al menos un antfgeno, un epttopo antigenico y/o un compuesto terapeutico.
El uso, como el precitado, segun el cual el tratamiento se usa (i) para aumentar el nivel de los factores que activan y/o movilizan las celulas dendnticas o sus celulas precursoras, (ii) para aumentar el numero de celulas dendnticas o de sus celulas precursoras o (iii) para aumentar la produccion y/o el contenido celular de un interferon (IFN) o de IL- 12.
El uso, como el precitado, segun el cual el factor que activa las celulas dendnticas es Flt3-L y/o GM-CSF.
El uso, como el precitado, segun el cual el interferon es IFNa y/o IFNp.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1A: Se inyectaron, una vez, a ratones recien nacidos dentro de las 24-48 h del nacimiento, 106 u.f.p de MVA o DISC HSV-1 o se los trato con solucion salina fisiologica (NaCl) como testigos. A los 7 dfas de edad, se uso, CD11c, un marcador pan de CD para determinar estas celulas en la sangre periferica por citometna de flujo. Se muestran la desviacion media y estandar de 3 a 5 experimentos.
Figura 1B: El mismo experimento que en la Fig.lA. Sin embargo, las celulas CD11c se determinaron en el bazo por citometna de flujo.
Figura 1C: El mismo experimento que en la Fig.lA. Sin embargo, las celulas CD11c se determinaron en el lfquido peritoneal por citometna de flujo.
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Figura 2: Se vacuno a los ratones con MVA-BN segun se indica en la columna de la izquierda. Despues de dos semanas se determinaron los porcentajes de celulas CD11c+ simple y CD11c+/CD8+ doble positivas en el bazo y en la sangre por citometna de flujo.
Figura 3: Se inyecto a los ratones recien nacidos MVA o NaCl a los testigos los dfas 1 y 5 de edad. El dfa 8, se determino Flt3-L murino en el suero de estos ratones mediante ELISA y los valores se informan en pg/ml.
Figura 4: Se inyectaron, una vez, a ratones recien nacidos, dentro de las 24 a 48 h del nacimiento, 106 u.f.p. de MVA o se los trato con NaCl como testigos. A los 7 dfas de edad, todos los ratones fueron expuestos a 100 x DL50 de la cepa F de HSV 1. El numero de animales sobrevivientes se controlo durante 21 dfas.
Figura 5: Se trato a los ratones como en la Fig. 4. Los datos representan 9 experimentos de provocacion diferentes con 100 DL50 de HSV-1. Ninguno de los animales testigo sobrevivio a la provocacion.
Figura 6: Supervivencia de ratones adultos vacunados con MVA-BN en el primer dfa de vida despues de una provocacion letal con vaccinia. Se vacunaron tres camadas de 6 cnas de 1 dfa (18 ratones) con MVA-BN (2,5 x 107 DICT50) y a las 4 semanas (ratones adultos) se los provoco con una dosis letal de vaccinia: la vacunacion con MVA- BN indujo claramente una inmunidad protectora en los ratones neonatos que duro hasta la edad adulta.
Ejemplos
Ejemplo 1
(i) MVA-BN y DISC-HSV inducen CD del fenotipo CD11c+ y CD8+ en los animales recien nacidos.
Primer conjunto de experimentos: Los ratones recien nacidos son naturalmente inmunodeficientes porque el sistema de IFN no esta maduro. El numero y el estado de activacion de las CD, las mejores productoras de IFN que se conocen actualmente, no fue analizado. Las CD se pueden inducir in vitro asf como in vivo mediante una diversidad de estfmulos. En estos estudios se probo si una replicacion controlada de MVA-BN podna inducir CD y se analizo su fenotipo. Se inyectaron a grupos de ratones 106 unidades formadoras de placas (u.f.p.) de MVA-BN o solucion salina sola dentro de 1 a 2 dfas despues del nacimiento y en algunos casos 5 dfas despues del nacimiento. Se analizaron la sangre y celulas esplenicas de ratones individuales de ambos grupos mediante FACS (separador de celulas activadas con fluorescencia) y se compararon los datos.
Los datos de 7 a 8 ratones individuales indicaron que el tratamiento con MVA-BN aumento las celulas CD11c+ en 2 a 3 veces acompanado de un aumento de la expresion de MHC II y una mayor presencia de linfocitos T del tipo CD4 o CD8. De manera interesante, CD19/54, un marcador de los linfocitos B maduros disminuyo indicando que estas celulas emigraron a organos diferentes del bazo o que las precursoras de los linfocitos B fueron reclutadas precozmente para otros linajes en particular CD del fenotipo plasmacitoide que acarrea marcadores de linfocitos B tempranos (b220).
Los datos de tres experimentos diferentes indicaron reproducibilidad y diferencias significativas. Los experimentos con DISC-HSV-1, una vacuna vmca de replicacion controlada diferente, induce cantidades semejantes de celulas CD11c+ despues de la sensibilizacion neonatal.
Los resultados se resumen en la Fig. 1A-C.
Para investigar mas a fondo las subpoblaciones de CD en la sangre y el bazo y analizar el efecto a largo plazo del tratamiento con MVA-BN, se analizaron las celulas de la sangre y el bazo a las 2 semanas de edad. En ese momento de toma de muestras, los animales tratados tuvieron aproximadamente dos veces el numero de celulas CD11c+ en el bazo que teman a la semana de vida pero un tratamiento unico con el virus al nacer elevo a 3 veces el numero de estas celulas en el bazo 2 semanas mas tarde (Fig. 2). Se observaron efectos similares en la sangre excepto que CD11c+/CD8a+ fueron aproximadamente 4 veces mayores. Un tratamiento unico con MVA-BN a los 7 dfas del nacimiento produjo un aumento de CD11c+/CD8a+ de 13 a 40 veces con un efecto menos notable sobre las celulas CD11c+. Como se esperaba, dos vacunaciones al nacer y a los 7 dfas tuvieron un efecto considerable sobre las celulas CD11c+. Los diversos efectos se muestran en la figura 2.
Segundo conjunto de experimentos: Ratones de una semana que habfan sido vacunados al nacer con 2,5 x 107 DICT50 de MVA-BN mostraron una composicion diferente en las poblaciones de celulas inmunologicamente importantes en el bazo y la sangre que los ratones testigo (Tabla 1). En la sangre hubo un aumento en la poblacion de linfocitos CD8 positivos asf como un aumento en el numero de linfocitos NK. El numero de celulas CD11c positivas fue aproximadamente 3 veces superior que en los testigos y el porcentaje de linfocitos B (B220 y celulas CD19 doble positivas) disminuyo significativamente. En el bazo el numero total de celulas no difirio entre los animales inmunizados y los testigos. En contraposicion a la sangre, el bazo de los animales vacunados tuvo mas linfocitos T CD4 positivos que los testigos y el numero de linfocitos NK no aumento. De manera similar que en la sangre el numero relativo de linfocitos CD8 positivos aumento y el numero de linfocitos B disminuyo. El porcentaje
de celulas CD11c positivas fue aproximadamente 3 veces mayor que en los testigos. Primero reconocimos una diferencia en el porcentaje de celulas dendnticas el dfa 5 despues de la vacunacion con MVA-BN, cuando el numero de celulas CD11c positivas en el bazo de 4 testigos sin tratar fue de 3,6 %, en comparacion con 4,8 % en 4 ratones vacunados con mVA-BN. La misma cantidad de MVA-BN inactivado con UV no causo ningun cambio significativo en 5 las poblaciones de celulas despues de la vacunacion de los ratones neonatos en comparacion con los testigos (no se muestran los datos). La dosis de vacunacion inicial se eligio arbitrariamente. Despues de la titulacion del inoculo seleccionamos una dosis estandar de 2,5 x 106 DICT50 para la vacunacion (10 veces menos que en el experimento inicial). A esta dosis se indujeron los numeros maximos de CD (Tabla 2).
10 Tabla 1. Cambios inducidos en las celulas sangumeas y esplenicas en ratones recien nacidos 1 semana despues de ___________________________la inmunizacion con 2,5 x 107 DICT50 de MVA-BN___________________________
Parametro %
Sangre MVA-BN P* NaCl Bazo MVA-BN P*
Celulas totales x 106
17,9±1,9 24,1 ±2,6 0,105
%CD11c
5,4±1,3 18,6±1,5 0,001 2,8±0,1 7,9±0,8 0,001
%CD11c/CD8a
0,5±0,1 2,7+0,3 0,001 1,1+0,1 4,6±0,7 0,002
%CD4/CD3
16,9±1,1 16,1+ 1,5 0,999 4,8+0,3 8,1 + 1,5 0,004
%CD8a/CD3
6,0±0,9 10,3±0,9 0,002 4,7±0,3 8,4±1,1 0,002
%NK1.1/DX5
16,4±1,2 24,4±3,3 0,032 2,5=0,3 2,4±0,2 0,862
%CD19/B220
22,3±0,5 8,4±0,8 0,001 16,2±1,3 8,6±0,9 0,004
* Prueba U de Mann Whitney
Tabla 2. Induccion de celulas CD11c positivas en el bazo de ratones wt de 1 dfa de edad y ratones con interrupciones genicas dentro de los 7 dfas posteriores al tratamiento con MVA.
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Cepa del raton
Dosis de MVA (DICT50) %CD11c en controles %CD11c en MVA-BN relacion
wta
2,5 x 10' 2,8 7,9 2,8
wt
2,5 x 106 2,1 11,9 5,6
wt
2,5 x 105 2,5 6,6 2,6
RAGb
2,5 x 10' 4,2 5,4 1,3
AG129c
2,5 x 103 2,6 2,7 1,0
a Wt = ratones C57BL/6 o 129 Sv/Ev. b Delecion en raton RAG en el gen que activa la recombinacion (es decir, ningun linfocito T y B funcional). c Interrupciones genicas en AG129 del receptor del IFN Tipo I (IFN-a y p) y Tipo II (IFN-y).
(ii) MVA-BN induce preferentemente celulas dendnticas plasmacitoides (CDp).
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De acuerdo con otros autores las celulas CD11c positivas que tambien expresaron CD45RA o CD45R se consideraron CDp (Asselin-Paturel, et al. 2001, Nat Immunol, 12:1.144). Se planteo la pregunta de si MVA-BN induda un aumento de CDp. Se llevo a cabo otro experimento en el cual tambien se analizaron CD45RA o CD45R en CD11c positiva. El porcentaje de celulas CD11c y CD45R doble positivas fue significativamente mayor en los ratones tratados con MVA-BN (5,6 ± 0,7 %) que en ambos grupos testigo (3,0 ± 0,3 % sin tratar, p = 0,01; MVA-BN inactivado con UV 3,0 ± 0,2 %, p = 0,006. prueba U de Mann Whithney).
(iii) Ratones neonatos tratados con MVA-BN elevaron sus niveles de Ftl3-L serico
Flt3-L es un factor hematopoyetico que produce mayores niveles de CD en los animales adultos. En los humanos y posiblemente en los ratones la fuente mas rica de este factor son los linfocitos T activados. Para determinar si los numeros elevados de CD podnan ser el resultado de los Ftl3-L inducidos, se comparo suero de raton tratado con MVA-BN con el de los animales simuladamente tratados con relacion a la presencia de este factor. Los animales tratados los dfas 2 y 5 tuvieron dos veces los niveles de Flt3-L en el suero en comparacion con el suero de animales simuladamente tratados. En consecuencia, Flt3-L es uno de los factores que podnan ser responsables de numeros elevados de CD (Fig. 3)
Se evaluo el curso del tiempo de la induccion de Flt3-L en los ratones recien nacidos despues de la administracion de MVA-BN. En los recien nacidos, la vacunacion con MVA-BN indujo un aumento de la concentracion de Flt3-L en un plazo de 24 horas. La induccion alcanzo un maximo despues de 48 horas y todavfa estuvo presente el dfa 7, el momento en el que generalmente se analizaron las celulas esplenicas y se probo la resistencia contra HSV-1 (ver mas adelante). En los ratones vacunados la concentracion de Flt3-L en el suero aumento al doble 24 horas y 48 horas despues de la vacunacion, en comparacion con los animales testigo coincidentes en edad.
Ejemplo 2
(i) Ratones neonatos tratados con MVA-BN sobrevivieron a la provocacion con 100 a 500 DL50 de HSV-1
Se trataron grupos de ratones con la dosis estandar de MVA-BN uno o 2 dfas despues del nacimiento y se provocaron a los 7 a 8 dfas de edad con 100 a 500 DL50 del virus herpes simple 1 (HSV-1) (Fig. 4). Los ratones tratados con MVA-BN sobrevivieron a la provocacion con HSV 1, mientras que todos los ratones testigo murieron dentro de los 5 a 6 dfas posteriores a la inoculacion del virus de provocacion.
Para respaldar aun mas estas observaciones, se realizaron 9 experimentos de provocacion con 40 ratones tratados con MVA-BN y 45 testigos. Mas del 80 % de los ratones tratados con virus sobrevivio a la provocacion, mientras que todos los ratones testigo murieron (Fig. 5).
En otro conjunto de experimentos los ratones fueron tratados al nacer con MVA-BN (2,5 x 106 DICT50/raton). El dfa 8 se realizo una provocacion o con 103 (1 DL50) o con 105 (100 DL50) UFP de HSV-1. Despues de la vacunacion con MVA-BN 65 % de los ratones sobrevivio a una dosis vmca que mato al 100 % de los ratones testigo (100 DL50) y un 90 % sobrevivio a una dosis que mato al 45,5 % de los testigos (1 DL50). En otros experimentos un grupo de 7 ratones vacunados con MVA-BN inactivado con UV fueron infectados con HSV-1. Cinco de ellos murieron en el transcurso de 7 dfas. Los restantes 2 animales dejaron de crecer y murieron el dfa 22 y 29. Por consiguiente, los ratones tratados con MVA-BN alcanzaron un estado de mayor resistencia contra HSV-1 que se asocio a MVA-BN vivo, pero no a MVA-BN inactivado.
En los experimentos testigo realizados con ratones que no tienen linfocitos T funcionales se determino que la proteccion contra HSV-1 despues de la vacunacion con MVA-BN no se debio a reaccion cruzada de los linfocitos T citotoxicos inducidos por MVA-BN.
Se probo si las celulas dendnticas eran responsables de la proteccion de los ratones contra HSV-1 despues de la vacunacion con MVA-BN. Con este fin se provoco a ratones vfrgenes de 8 dfas con 5 x 104 UFP de HSV-1 4 h despues de la transferencia de celulas de ratones tratados con MVA. En un primer experimento se separaron los esplenocitos de los ratones de 8 dfas tratados cuando teman 1 dfa de vida con MVA-BN en fracciones ricas en CD (de baja densidad) y fracciones pobres en CD (de alta densidad). Los ratones que recibieron 5 x 106 celulas de la fraccion rica en CD sobrevivieron a la provocacion en un 50 % mientras que todos los ratones que recibieron 10 veces menos suspension rica en CD o los ratones sin tratar murieron en el transcurso de 5 dfas. Un segundo enfoque se hizo transfiriendo celulas CD11c positivas positivamente aisladas de los ratones de 8 dfas tratados al dfa de vida con MVA-BN a ratones vfrgenes coincidentes en edad. Una suspension de 2 x 106 esplenocitos que contema mas del 80 % de celulas CD11c positivas de los ratones tratados con MVA-BN protegio a los ratones vfrgenes de la infeccion por HSV-1. En contraposicion, 4 cnas de la misma camada asf como otros 8 animales sin tratar murieron despues de la provocacion. Ademas, los ratones que recibieron la misma cantidad de celulas esplenicas o los ratones que recibieron un equivalente esplenico (50 x 106 celulas) de la fraccion negativa no mostraron mayor resistencia contra HSV-1. Por lo tanto las celulas CD11c positivas pueden proteger a los ratones contra HSV-1.
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En el estado anterior de la tecnica se describieron despues de la administracion de MVA efectos protectores a corto plazo en el rango de aproximadamente 24 horas (Vilsmeier, B., Berl. Munch. Tierarztl. Wschr. 1l2 (1999), 329-333). Aunque los virus usados en dicha publicacion no son virus incapaces de replicarse para generar una descendencia viral infecciosa en el animal neonato o prenato utilizado, se probo si el modo de accion segun se divulga en Vilsmeier es similar al modo de accion descrito en la presente solicitud. Mas en particular, Vilsmeier divulga que MVA, en particular MVA inactivado, induce una parainmunidad durante aproximadamente 24 horas. Para probar si el efecto de parainmunidad cuenta tambien para los efectos protectores segun se divulga en la presente solicitud se vacuno a ratones a las 24 horas del nacimiento con MVA-BN o con MVA-BN inactivado. A los 7 dfas de edad se provoco a los ratones con una dosis letal de HSV-1 (105 UFP de HSF-1f). Los ratones testigo sin vacunar murieron 6 dfas despues de la provocacion. Tampoco los ratones vacunados con MVA-BN inactivado estuvieron protegidos contra la provocacion con HSV-1. El numero de celulas dendnticas en estos ratones no fue elevado. En contraposicion, los ratones vacunados con MVA-BN sin inactivar estuvieron considerablemente protegidos contra una provocacion con HSV-1. Treinta dfas despues de la provocacion mas del 80 % de los ratones todavfa estaba vivo. Dos dfas despues de la vacunacion se encontro un elevado valor de Flt3-L serico en el suero. Se encontraron valores elevados de CD en el bazo. El aumento de Flt3-L se asocio al numero elevado de CD. Esto confirma que los efectos de parainmunidad no son responsables de la proteccion observada.
(ii) MVA-BN induce una inmunidad espedfica en los neonatos que dura hasta la edad adulta
Se vacuno (i.p.) a ratones C57BI/6 de 1 dfa de vida (tamano del grupo de 18) con MVA-BN (2,5 x 107 DICT50). Cuatro semanas despues de la vacunacion, cuando los ratones se consideraron adultos se los provoco con una dosis letal (1 x 104 DICT50) del virus Vaccinia Western Reserve (VV-WR). Con excepcion de un animal todos los otros animales vacunados con MVA-BN sobrevivieron. En contraposicion, todos los animales vacunados con placebo murieron en el transcurso de 7 dfas y mostraron smtomas clmicos graves como piel erizada, perdida de peso y actividad reducida. Evidentemente esto es una demostracion clara de que la vacunacion con MVA-BN no solo es segura en animales neonatos, sino que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora contra una infeccion por vaccinia letal (virus relacionado con MVA-BN).

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
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    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. El uso del Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), segun el cual MVA es la cepa MVA-BN depositada en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury (Reino Unido) con el numero V00083008 o sus derivados, donde dicha cepa Ankara MVA-BN y sus derivados se caracterizan por (i) ser capaces de efectuar una replicacion reproductiva en los fibroblastos de embriones de pollo (CEF) y en la lmea celular de rinon de hamster bebe BHK pero son incapaces de efectuar una replicacion reproductiva en las lmeas celulares humanas HaCat, HeLa y 143B y (ii) por la ineptitud para replicarse en una cepa de ratones que es incapaz de producir linfocitos B y T maduros y como tales estan gravemente inmunodeprimidos y sumamente vulnerables a un virus que se replica, para la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento de un animal neonato, incluido un ser humano, segun el cual MVA es un virus que infecta abortivamente al animal neonato, incluido un ser humano, y en el que el tratamiento induce o mejora la maduracion del sistema inmunitario, segun el cual dicha maduracion se correlaciona con un aumento del numero de celulas dendnticas y de sus celulas precursoras.
  2. 2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, segun el cual las celulas precursoras de las celulas dendnticas son precursoras de las celulas dendnticas plasmacitoides.
  3. 3. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, segun el cual la mejora de la maduracion del sistema inmunitario se correlaciona con un aumento de al menos 1,5 veces en la concentracion de Flt3-L dos dfas despues de la administracion de MVA.
  4. 4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, segun el cual el medicamento se administra mediante aplicacion oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradermica, intrauterina y/o subcutanea.
  5. 5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, segun el cual el medicamento se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz en una primera inoculacion ("inoculacion de sensibilizacion) y en una segunda inoculacion ("inoculacion de refuerzo").
  6. 6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, segun el cual el medicamento se administra al animal, incluido un ser humano, en una cantidad de al menos 101 DICT50 (dosis infecciosa de cultivo tisular) de MVA.
  7. 7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, segun el cual el genoma del virus comprende al menos una secuencia de acido nucleico heterologa.
  8. 8. El uso de acuerdo con la reivindicacion 7, segun el cual la secuencia de acido nucleico heterologa se selecciona entre una secuencia que codifica al menos un antfgeno, un epftopo antigenico y/o un compuesto terapeutico.
  9. 9. El uso de acuerdo con la reivindicacion 7, segun el cual la secuencia de acido nucleico heterologa codifica una protema seleccionada entre un interferon, IL-12, Flt3-L y GM-CSF.
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