ES2288759T3 - Nuevo anticuerpo monoclonal y procedimiento de analisis inmunologico de un dimero e-d y un complejo e-dd/e. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE REACCIONA ESPECIFICAMENTE CON MONOMERO-D PRODUCIDO AL DIGERIR FIBRINOGENO HUMANO CON ELASTASA DE GRANULOCITOS Y PRODUCTOS DE DIGESTION CONTENIENDO DOMINIO-D PRODUCIDOS AL DIGERIR FIBRINA HUMANA ESTABILIZADA CON ELASTASA DE GRANULOCITOS, PERO QUE NO REACCIONA CON FIBRINOGENO, O FRAGMENTOS X, Y O E PRODUCIDOS AL DIGERIR FIBRINOGENO CON ELASTASA DE GRANULOCITOS. EL DIMERO-D O EL COMPLEJO DD/E PRODUCIDO POR LA DIGESTION CON ELASTASA DE GRANULOCITOS EN UNA MUESTRA DE UN CUERPO VIVO PUEDE ANALIZARSE UTILIZANDO EL ANTICUERPO MONOCLONAL SIN QUE HAYA INTERFERENCIA CON EL FIBRINOGENO, PRODUCTOS DE DIGESTION DEL FIBRINOGENO CON PLASMINA, O PRODUCTOS DE DIGESTION DE FIBRINA ESTABILIZADA POR PLASMINA.
Description
Nuevo anticuerpo monoclonal y procedimiento de
análisis inmunológico de un dímero e-D y un complejo
e-DD/E.
La presente invención se refiere a un nuevo
anticuerpo monoclonal, y un ensayo inmunológico de un dímero D
producido digiriendo fibrina humana estabilizada con elastasa de
granulocitos (a partir de ahora mencionada a veces como "dímero
e-D") y un complejo DD/E producido digiriendo
fibrina humana estabilizada con elastasa de granulocitos (a partir
de ahora mencionado a veces como complejo
e-DD/E).
El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
presente invención es útil como reactivo para el ensayo inmunológico
del dímero e-D y el complejo e-DD/E
que se producen en plasma o suero cuando se digiere fibrina humana
estabilizada con elastasa de granulocitos. El dímero
e-D y el complejo e-DD/E son útiles
como marcador para predecir un trastorno postoperatorio de
múltiples órganos y enfisema pulmonar.
Los productos de digestión de fibrina humana
estabilizada con diversas proteasas son útiles como marcadores de
diagnóstico en diagnóstico clínico. Por ejemplo, un dímero D
producido digiriendo fibrina humana estabilizada con plasmina (a
partir de ahora mencionado a veces como "dímero
p-D") y un complejo DD/E producido digiriendo
fibrina humana estabilizada con plasmina (a partir de ahora
mencionado a veces como "complejo p-DD/E") se
usan ampliamente como marcador de diagnóstico de coagulación
intravascular diseminada (DIC). En la determinación del dímero
p-D y el complejo p-DD/E en una
muestra de un cuerpo vivo, generalmente se usa la aglutinación de
látex sensibilizado con un anticuerpo monoclonal específico para el
dímero p-D.
Además, el dímero e-D y el
complejo e-DD/E de fibrina humana estabilizada son
útiles como marcador para predecir un trastorno postoperatorio de
múltiples órganos y enfisema pulmonar. La reacción de aglutinación
del látex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal anterior
específico para el dímero p-D hace posible
determinar el dímero p-D y complejo
p-DD/E producidos por la acción de plasmina, pero no
hace posible determinar el dímero e-D y el complejo
e-DD/E producidos por la acción de la elastasa de
granulocitos. Por lo tanto, ha habido varios intentos de determinar
el dímero e-D y el complejo e-DD/E
de fibrina humana estabilizada.
Se informó de un anticuerpo monoclonal que
reacciona con un sitio N-terminal
(A\alpha22-36) recién formado en la cadena
A\alpha del fibrinógeno cuando se digiere con elastasa de
granulocitos (Blood Coagulation and Fibrinolysis, vol. 6, pág. 259,
1995). El anticuerpo monoclonal tiene un sitio de unión a antígeno
en un dominio E, y por lo tanto, diferente del anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la presente invención. Además, el primer
anticuerpo monoclonal reacciona ligeramente con fibrinógeno, y por
tanto, los productos de digestión de fibrinógeno o fibrina con
elastasa de granulocitos en plasma no pueden determinarse por EIA
cuando se usa el primer anticuerpo monoclonal.
Además, los anticuerpos policlonales preparados
adsorbiendo y retirando anticuerpos que pueden reaccionar con
monómero D digerido con plasmina, dímero D digerido con plasmina,
complejo DD/E digerido con plasmina y fibrinógeno de anticuerpos
policlonales obtenidos por inmunización con elastasa de
granulocitos-fragmento D de fibrinógeno (J. Lab.
Clin. Med. vol. 102, pág. 858, 1983) a veces se usan, pero el
procedimiento es incómodo.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de ensayo de una cantidad de dímero
e-D y complejo e-DD/E en una muestra
de un cuerpo vivo, tal como plasma, sin la influencia de cantidades
de fibrinógeno, productos de fibrinógeno digerido con plasmina, o
productos de fibrina humana estabilizada digerida con plasmina
(particularmente, dímero p-D o complejo
p-DD/E) que se espera que co-existan
con ellos en la muestra.
Otros objetivos y ventajas serán evidentes a
partir de la siguiente descripción.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente
con un monómero D producido digiriendo fibrinógeno humano con
elastasa de granulocitos, productos de digestión que contienen el
dominio D producidos digiriendo fibrina humana estabilizada con
elastasa de granulocitos y un fragmento parcial de cadena Ax de un
monómero D producido digiriendo fibrinógeno humano con elastasa de
granulocitos, produciéndose dicho fragmento parcial retirando un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos desde el primer
aminoácido al 111 de la cadena Ax, pero no reacciona con
fibrinógeno, o un fragmento X, Y o E producido digiriendo
fibrinógeno con elastasa de granulocitos, productos de digestión de
fibrinógeno humano con plasmina, o productos de digestión de
fibrina estabilizada con plasmina.
De acuerdo con la presente invención, también se
proporciona un anticuerpo monoclonal que reacciona con un péptido
que tiene una secuencia de aminoácidos, SEC ID Nº 1:
Ser Glu Asp Leu Arg
Ser.
Además, de acuerdo con la presente invención, se
proporciona un ensayo inmunológico para un dímero D y un complejo
DD/E que se producen digiriendo fibrina humana estabilizada con
elastasa de granulocitos, en una muestra de un cuerpo vivo,
caracterizado porque se pone la muestra en contacto con un vehículo
revestido con los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos
de los mismos, y se detecta el agregado formado por el dímero D o
complejo DD/E con el vehículo revestido.
La Figura 1 es un gráfico que ilustra la
correlación entre concentraciones de antígenos e índices de
aglutinación, en una reacción de aglutinación causada por poner en
contacto diversos antígenos con látex sensibilizados con anticuerpo
monoclonal IF-101 de la presente invención.
La expresión "elastasa de granulocitos"
usada en este documento significa elastasa que está contenida en un
gránulo azurófilo de granulocitos; se libera de granulocitos
activados por inflamación local; e hidroliza sustratos
fisiológicos, por ejemplo, elastina, colágeno, fibronectina o
proteoglicano contenido en la matriz celular, o proteínas
sanguíneas, tales como fibrinógeno, fibrina, plasminógeno o
antitrombina III, en el extremo ácido carboxílico de aminoácidos
hidrófobos, tales como valina o alanina.
En la presente memoria descriptiva, un producto
digerido formado por digestión con elastasa de granulocitos a veces
se indica colocando el símbolo "e-" delante del producto. Por
ejemplo, el monómero D producido digiriendo fibrinógeno humano con
elastasa de granulocitos, un fragmento X producido digiriendo
fibrinógeno humano con elastasa de granulocitos, un fragmento Y
producido digiriendo fibrinógeno humano con elastasa de
granulocitos, o un fragmento E producido digiriendo fibrinógeno
humano con elastasa de granulocitos se indica por un monómero
e-D de fibrinógeno humano, un fragmento
e-X de fibrinógeno humano, un fragmento
e-Y de fibrinógeno humano, o un fragmento
e-E de fibrinógeno humano, respectivamente.
Además, en la presente memoria descriptiva, un
producto digerido formado por digestión con plasmina a veces se
indica colocando el símbolo "p-" delante del producto.
El anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede obtenerse por un procedimiento para producir un
anticuerpo monoclonal a partir de un hibridoma preparado por un
procedimiento de fusión celular recientemente usado en diversos
campos.
El anticuerpo monoclonal de la presente
invención reacciona específicamente con el monómero D producido
digiriendo fibrinógeno humano con elastasa de granulocitos
(monómero e-D) y los productos de digestión que
contienen el dominio D producidos digiriendo fibrina humana
estabilizada con elastasa de granulocitos, pero no reacciona con
fibrinógeno, o el fragmento X, Y o E producido digiriendo
fibrinógeno con elastasa de granulocitos. La expresión "productos
de digestión que contienen el dominio D producidos digiriendo
fibrina humana estabilizada con elastasa de granulocitos"
significa productos de digestión que se producen tratando fibrina
humana estabilizada con elastasa de granulocitos, y que contienen
un dominio e-D de fibrina humana estabilizada. Por
ejemplo, pueden mencionarse sustancias tipo polímero
e-DD/E que contienen unidades básicas
e-DD/E, el dímero e-D, o el
complejo e-DD/E, particularmente el dímero
e-D, o el complejo e-DD/E.
El anticuerpo monoclonal preferible de la
presente invención no reacciona con productos de digestión de
fibrinógeno humano con plasmina, o productos de digestión de
fibrina humana estabilizada con plasmina.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal que reacciona con un péptido que tiene una secuencia de
aminoácidos, SEC ID Nº 1:
Ser Glu Asp Leu Arg
Ser.
La secuencia de aminoácidos anterior de la SEC
ID Nº 1 corresponde a la secuencia de aminoácidos del aminoácido
112 al 117 en la cadena A\alpha, contando desde el extremo N de la
cadena A\alpha. La cadena A\alpha es uno de los tres
polipéptidos (es decir, cadena A\alpha A\alpha, cadena B\beta
y cadena \gamma) de los que está compuesto el fibrinógeno humano.
Además, la secuencia de aminoácidos anterior de la SEC ID Nº 1
corresponde a la secuencia de aminoácidos del primer aminoácido al
sexto aminoácido de un fragmento parcial de la cadena A\alpha,
contando desde el grupo amino terminal del fragmento de la cadena
A\alpha que es uno de los polipéptidos que componen los monómeros
D digeridos con elastasa de granulocitos del fibrinógeno humano;
concretamente, un péptido producido retirando un polipéptido que
tiene una secuencia
de aminoácidos desde el primer aminoácido al 111 de la cadena A\alpha; a partir de ahora mencionado como /cadena \alpha.
de aminoácidos desde el primer aminoácido al 111 de la cadena A\alpha; a partir de ahora mencionado como /cadena \alpha.
El anticuerpo monoclonal preferible de la
presente invención reacciona con el péptido que tiene la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, y reacciona específicamente con el
monómero e-D de fibrinógeno humano y los productos
de digestión que contienen el dominio D de fibrina humana
estabilizada con elastasa de granulocitos, pero no reacciona con
fibrinógeno, o el fragmento X, Y o E producidos digiriendo
fibrinógeno con elastasa de granulocitos. El anticuerpo monoclonal
más preferible de la presente invención no reacciona con los
productos de digestión de fibrinógeno humano con plasmina, o los
productos de digestión de fibrina humana estabilizada con
plasmina.
El anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede producirse cultivando un hibridoma (tal como un
hibridoma de ratón) capaz de producir dicho anticuerpo monoclonal,
por ejemplo, en un medio adecuado o cavidad abdominal en un
mamífero, tal como un ratón. El hibridoma puede producirse por
fusión celular de una célula esplénica de un mamífero (tal como un
ratón) o un ave inmunizada con el dímero e-D como un
inmunógeno y una célula de mieloma de un mamífero (tal como un
ratón) de acuerdo con el procedimiento convencional de la fusión
celular de Köhler y Milstein (véase Nature, vol. 256, pág. 495,
1975). Más particularmente, el hibridoma puede producirse por el
procedimiento de los Ejemplos que se menciona a continuación.
Como medio para cultivar los hibridomas, puede
usarse cualquier medio adecuado para el cultivo de un hibridoma.
Preferiblemente, se usa un medio que comprende el medio esencial
mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (a partir de ahora
mencionado como DME), y suero de ternera fetal,
L-glutamina, ácido L-pirúvico y
antibióticos (penicilina G y estreptomicina).
El cultivo del hibridoma se realiza
preferiblemente, por ejemplo, en CO_{2} al 5% y a 37ºC durante
aproximadamente 3 días en un medio, o durante aproximadamente 14
días en las cavidades abdominales de ratones.
Es posible aislar o purificar el anticuerpo
monoclonal de la presente invención a partir del líquido de cultivo
resultante o fluido ascítico de ratón, usando, por ejemplo, un
procedimiento generalmente aplicado para el aislamiento y
purificación de proteínas. Como ejemplos del mismo, puede
mencionarse el desalado con sulfato amónico, cromatografía en
columna de intercambio iónico usando celulosa de intercambio iónico,
cromatografía en columna de tamiz molecular usando gel de tamiz
molecular, cromatografía en columna de afinidad usando polisacáridos
de unión a proteína A, diálisis o liofilización.
Como el fragmento de anticuerpo de la presente
invención, concretamente el fragmento de anticuerpo del anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la presente invención que contiene un
sitio de unión a antígeno que reacciona específicamente con el
monómero D producido digiriendo fibrinógeno humano con elastasa de
granulocitos y los productos de digestión que contienen el dominio
D producidos digiriendo fibrina humana estabilizada con elastasa de
granulocitos, pueden mencionarse, por ejemplo, Fab, Fab',
F(ab')_{2}, Fv. El fragmento puede obtenerse, por ejemplo,
digiriendo el anticuerpo monoclonal de la presente invención con
una proteasa en un procedimiento convencional, y después realizando
un procedimiento de aislamiento y purificación convencional de
proteínas.
El ensayo de la presente invención puede
aplicarse a un procedimiento de aglutinación convencional, tal como
un procedimiento de aglutinación de látex, excepto en que se usa el
anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo de acuerdo con la
presente invención. El ensayo de la presente invención puede
aplicarse no solamente a una detección visual de aglutinación en un
portaobjetos de vidrio, sino también a un ensayo óptico automatizado
por un analizador automático. Además, de acuerdo con el ensayo de
la presente invención, es posible detectar la presencia del dímero
D digerido con elastasa de granulocitos y el complejo DD/E digerido
con elastasa de granulocitos de fibrina humana estabilizada, o
determinar de forma semi-cuantitativa o cuantitativa
el dímero D digerido con elastasa de granulocitos y el complejo
DD/E digerido con elastasa de granulocitos de fibrina humana
estabilizada.
Un vehículo sobre el que se revisten los
anticuerpos monoclonales y/o los fragmentos de los mismos y que
puede usarse en el ensayo de la presente invención puede prepararse
por un procedimiento convencionalmente conocido. Por ejemplo, un
vehículo (tal como vehículo insoluble en agua, particularmente látex
de poliestireno) se mezcla con un tampón que contiene los
anticuerpos con agitación, se centrifuga la mezcla, y el precipitado
resultante se suspende en un tampón adecuado.
El vehículo revestido puede reaccionar con el
dímero e-D y el complejo e-DD/E, y
el monómero e-D, respectivamente, pero no puede
reaccionar con otras sustancias. Cuando el vehículo revestido se
pone en contacto con el dímero e-D o el complejo
e-DD/E, se provoca la reacción de aglutinación de
los vehículos revestidos, porque el dímero e-D y el
complejo e-DD/E tienen múltiples determinantes
antigénicos. Por el contrario, el monómero e-D tiene
solamente un determinante antigénico. Por lo tanto, si el vehículo
revestido se pone en contacto con el monómero e-D,
no se provoca la reacción de aglutinación de los vehículos
revestidos. Por lo tanto, cuando una muestra que contiene el dímero
e-D, el complejo e-DD/E y el
monómero e-D se pone en contacto con los vehículos
revestidos, se provoca la reacción de aglutinación por la reacción
con el dímero e-D y el complejo
e-DD/E. La cantidad del dímero e-D
y/o el complejo e-DD/E en la muestra de un cuerpo
vivo puede medirse sin la influencia del monómero
e-D, en base a las diferencias de dicha reacción de
aglutinación.
Por ejemplo, una cantidad de una fracción que
retiene una estereoestructura del dímero e-D y/o el
complejo e-DD/E en la muestra de un cuerpo vivo
puede determinarse mezclando una cierta cantidad de los látex
revestidos y una cierta cantidad de la muestra de un cuerpo vivo en
un placa de portaobjetos o una placa de microtitulación durante un
cierto periodo de tiempo, y observando la presencia o ausencia de
los agregados, o la fuerza de los agregados. Como alternativa,
puede determinarse una cantidad de una fracción que retiene una
estereoestructura del dímero e-D y/o el complejo
e-DD/E en la muestra de un cuerpo vivo mezclando una
cierta cantidad de los látex revestidos y una cierta cantidad de la
muestra de un cuerpo vivo, y midiendo de forma espectroscópica un
aumento de la absorción a una longitud de onda apropiada después de
un cierto periodo de tiempo.
Además, en el ensayo de la presente invención,
el vehículo revestido no reacciona con fibrinógeno humano,
productos de fibrinógeno humano digeridos con plasmina, o productos
de fibrina humana estabilizada digeridos con plasmina, incluso si
la muestra de un cuerpo vivo contiene dichos compuestos. Por lo
tanto, la cantidad del dímero e-D y/o el complejo
e-DD/E en la muestra puede medirse sin la influencia
de dichos compuestos.
La muestra de un cuerpo vivo que puede ensayarse
en la presente invención es, por ejemplo, plasma, suero u orina.
La presente invención se ilustrará ahora
adicionalmente mediante, aunque sin limitación, los siguientes
ejemplos.
El dímero e-D se preparó de
acuerdo con, principalmente, el procedimiento de Stephanie A. Olexa
y Andrei Z. Budzynski (1978), el procedimiento de Olexa y col.,
Circulation, Supl. 58, 119, (1979), y el procedimiento de Biochim.
Biophys. Acta 576, 39 a 50. A 20 mg (10 mg/ml) de fibrinógeno (Kabi
Diagnostica; Suecia), se añadieron trombina humana (a la
concentración final de 10 unidades/ml) y cloruro cálcico (en la
concentración final de
10 mM), y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 2 horas para convertir el fibrinógeno en fibrina. La fibrina se separó de las sustancias no coaguladas por centrifugación (18000 X g) durante 30 minutos. La fibrina se suspendió en
20 ml de tampón tris-HCI 0,15 M (pH 7,8)/cloruro cálcico 5 mM/NaN_{3} al 0,02%. A la suspensión resultante, 0,5 ml
de elastasa humana de granulocitos (25 unidades/ml; Elastin Product; USA). La reacción se realizó a 37ºC. Después de 8 horas, se añadió fluorofosfato de diisopropilo (DFP) (Mobay Chemical Corp.) en la concentración final de
2 mM para que cesara la digestión. Los productos de digestión obtenidos por el tratamiento durante 1 hora después de la adición de DFP se denominaron el complejo DD/E/productos digeridos por elastasa de granulocitos de fibrina estabilizada. El fragmento era la mezcla de DD/E y sustancias tipo polímero DD/E que contienen unidades básicas
DD/E.
10 mM), y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 2 horas para convertir el fibrinógeno en fibrina. La fibrina se separó de las sustancias no coaguladas por centrifugación (18000 X g) durante 30 minutos. La fibrina se suspendió en
20 ml de tampón tris-HCI 0,15 M (pH 7,8)/cloruro cálcico 5 mM/NaN_{3} al 0,02%. A la suspensión resultante, 0,5 ml
de elastasa humana de granulocitos (25 unidades/ml; Elastin Product; USA). La reacción se realizó a 37ºC. Después de 8 horas, se añadió fluorofosfato de diisopropilo (DFP) (Mobay Chemical Corp.) en la concentración final de
2 mM para que cesara la digestión. Los productos de digestión obtenidos por el tratamiento durante 1 hora después de la adición de DFP se denominaron el complejo DD/E/productos digeridos por elastasa de granulocitos de fibrina estabilizada. El fragmento era la mezcla de DD/E y sustancias tipo polímero DD/E que contienen unidades básicas
DD/E.
El complejo DD/E/productos digeridos con
elastasa de granulocitos de fibrina estabilizada resultante se cargó
en una columna de Sepharose CL6B (Pharmacia; Suecia; diámetro = 2,6
cm; longitud = 90 cm) que se había equilibrado con tampón
tris-HCI 50 mM (pH 7,5)/cloruro sódico 0,15
M/cloruro cálcico 5 mM (a partir de ahora mencionado como solución
A), y se trató por cromatografía en tamiz molecular desarrollada con
la solución A. La fracción de complejo e-DD/E se
identificó y aisló por marcadores de peso molecular, y el
procedimiento de Ouchterlony, usando antisuero
anti-D, y antisuero anti-E (Hoechst,
Alemania). El complejo e-DD/E resultante se incubó a
37ºC durante 4 horas en solución de urea 3 M/citrato 50 mM (pH
5,5). El complejo e-DD/E tratado con urea resultante
se cargó en una columna de Sepharose CL6B (diámetro = 2,6 cm;
longitud = 90 cm) que se había equilibrado con tampón
tris-HCI 50 mM (pH 7,4)/citrato sódico 28 mM/cloruro
sódico 0,1 M (a partir de ahora mencionado como solución B), y se
desarrolló con la solución B. La fracción de dímero
e-D (DD) y la fracción de e-E (E) se
identificaron y aislaron por marcadores de peso molecular, y el
procedimiento de Ouchterlony, usando antisuero
anti-D, y antisuero anti-E. Como
resultado, se obtuvieron 10 ml del dímero e-D que
tiene la absorbancia particular (A280 nm = 2,0). El dímero
e-D resultante se usó como un inmunógeno para
producir hibridomas que pueden secretar anticuerpos monoclonales
que reaccionan específicamente con el dímero e-D, y
como un antígeno para seleccionar los hibridomas en inmunoensayo
enzimático (ELISA).
La solución de inmunógeno dímero
e-D (A280 nm = 2,0) obtenida en el Ejemplo 1 se
mezcló con un volumen igual de adyuvante completo de Freund hasta
que emulsionó, y después, se administraron 100 \mul de la mezcla
por vía intraperitoneal en ratones para inmunizarlos (primera
inmunización). Después de 30 días, la mezcla mencionada
anteriormente se administró por vía intraperitoneal a los ratones
del mismo modo (segunda inmunización). Después de 21 días desde la
segunda inmunización, se administraron 100 \mul de la solución
diluida preparada diluyendo la solución de inmunógeno dímero
e-D (A280 nm = 2,0) con un volumen igual de una
solución salina fisiológica por vía intravenosa a los ratones
(inmunización final). Después de 3 días desde la inmunización final,
se retiraron los bazos de forma aséptica de los ratones y se usaron
en la siguiente fusión celular.
Los bazos mencionados anteriormente tomados de
forma aséptica se colocaron en una placa de laboratorio que
contenía 5 ml de un medio DME que contenía suero de ternera fetal
del 10 al 15%. Después, los bazos se perfundieron con
aproximadamente 15 ml de un medio DME que contenía suero de ternera
fetal del 10 al 15% para extraer por lavado abundante las células
esplénicas. La suspensión resultante de las células esplénicas se
pasó a través de una malla de nylon. Las células esplénicas se
recogieron en un tubo de centrifugación de 50 ml y se centrifugaron
a 500 x g durante 10 minutos. A los sedimentos resultantes, se
añadieron de 3 a 5 ml de una solución hemolisante (NH_{4}CI
155 mM, KHCO_{3} 10 mM, Na_{2}EDTA 1 mM; pH 7,0) para suspender los sedimentos. La suspensión se dejó reposar a 0ºC durante 5 a 10 minutos para lisar los glóbulos rojos de la misma. Se añadió un medio DME (10 a 20 ml) que contenía suero de ternera fetal del 10 al 15%, y se centrifugó la mezcla. Los sedimentos celulares resultantes se lavaron con un medio DME por el procedimiento de centrifugación y se contó la cantidad de células esplénicas vivas.
155 mM, KHCO_{3} 10 mM, Na_{2}EDTA 1 mM; pH 7,0) para suspender los sedimentos. La suspensión se dejó reposar a 0ºC durante 5 a 10 minutos para lisar los glóbulos rojos de la misma. Se añadió un medio DME (10 a 20 ml) que contenía suero de ternera fetal del 10 al 15%, y se centrifugó la mezcla. Los sedimentos celulares resultantes se lavaron con un medio DME por el procedimiento de centrifugación y se contó la cantidad de células esplénicas vivas.
Las células esplénicas anteriores (1 x 10^{8})
se añadieron a aproximadamente 2 x 10^{7} células de mieloma de
ratón pre-cultivadas SP2/0-Ag14 y el
conjunto se mezcló minuciosamente en un medio DME, y se centrifugó
(500 x g, 10 minutos). El sobrenadante se succionó, y los sedimentos
se soltaron minuciosamente. Se añadieron gota a gota 0,5 ml de
solución de polietilenglicol 4000 al 40% (calentada a 37ºC), y
después, el tubo de centrifugación se rotó suavemente a mano
durante 1 minuto para mezclar de este modo la solución de
polietilenglicol con los sedimentos celulares. Después, se añadió
un medio DME calentado a 37ºC en cantidades de 1 ml cada 30 segundos
y el tubo se rotó suavemente. Después de que este procedimiento se
repitiera 10 veces, se añadieron de 20 a 30 ml de un medio DME que
contenía suero de ternera fetal del 10 al 15% y el conjunto se
centrifugó (500 x g, 10 minutos). Después de que se retirara el
sobrenadante, los sedimentos celulares se lavaron dos veces por el
procedimiento de centrifugación con un medio HAT (preparado
añadiendo, a un medo DME, aminopterina, timidina e hipoxantina de
modo que las concentraciones del mismo llegaran a ser 4 x 10^{-7}
M, 1,6 x 10^{-5} M, y 1 x 10^{-4} M, respectivamente) que
contenía suero de ternera fetal del 10 al 15%, y después se
suspendieron en 40 ml del medio HAT. La suspensión celular se
vertió en cada pocillo de placas de cultivo de 96 pocillos en una
cantidad de 200 \mul/pocillo, y se cultivaron en un incubador de
dióxido de carbono gaseoso que contenía dióxido de carbono al 5% a
37ºC. Durante el cultivo, se retiraron aproximadamente 100 \mul
del medio de cada uno de los pocillos a intervalos de 2 a 3 días y
se añadieron 100 \mul de medio HAT reciente para seleccionar los
hibridomas que crecían en el medio HAT. Después de aproximadamente 8
días, el medio se sustituyó por un medio HT (preparado añadiendo, a
un medio CME, timidina e hipoxantina de modo que las concentraciones
del mismo llegaran a ser 1,6 x 10^{-5} M y 1 x 10^{-4} M,
respectivamente) que contenía suero de ternera fetal del 10 al 15%
y se observó el crecimiento de los hibridomas. Aproximadamente en el
día diez, se exploraron los hibridomas que producían los
anticuerpos que reaccionan con monómero e-D y dímero
e-D (a partir de ahora mencionados como anticuerpos
anti-monómero e-D/dímero
e-D) por el procedimiento ELISA como se menciona a
continuación.
La presencia de anticuerpos producidos en el
sobrenadante del cultivo de hibridoma se determinó por el
procedimiento ELISA. En cada pocillo de placas ELISA de 96 pocillos
(Immulon II; Nippon Dynatech K.K.), la solución purificada de
dímero e-D obtenida en el Ejemplo 1 (A280 nm = 0,05,
diluida con solución salina fisiológica) se vertió en una cantidad
de 50 \mul, respectivamente, y se dejó reposar a 25ºC durante 2
horas. Después de ello, los pocillos se lavaron tres veces con
Tween 20 al 0,05%/solución salina fisiológica. Después, se añadieron
50 \mul del sobrenadante del cultivo de hibridoma a cada pocillo y
se realizó una reacción a 25ºC durante 1 hora.
Después, se añadieron 50 \mul de un anticuerpo
anti-ratón conjugado con peroxidasa (Dako Co.,
Dinamarca) diluido 200 veces con Tween 20 al 0,05%/solución salina
fisiológica a cada pocillo. Después de que se completara la
reacción, se lavaron los pocillos tres veces con Tween 20 al
0,05%/solución salina fisiológica. Después de ello, se
añadieron
250 \mul de una solución que contenía aminoantipirina 0,5 mM, fenol 10 mM, y peróxido de hidrógeno al 0,005% a cada pocillo, y se realizó una reacción a 25ºC durante 30 minutos. Después, se midió la absorción de cada pocillo a
490 nm. Como resultado, se observó la producción de anticuerpos en 12 pocillos de los 192 pocillos.
250 \mul de una solución que contenía aminoantipirina 0,5 mM, fenol 10 mM, y peróxido de hidrógeno al 0,005% a cada pocillo, y se realizó una reacción a 25ºC durante 30 minutos. Después, se midió la absorción de cada pocillo a
490 nm. Como resultado, se observó la producción de anticuerpos en 12 pocillos de los 192 pocillos.
Los anticuerpos anti-dímero
e-D en los sobrenadantes de cultivo seleccionados
por el procedimiento ELISA anterior se examinaron para las
reactividades contra el monómero e-D, fragmento
e-X, fragmento e-Y, fragmento
e-E, y fibrinógeno, usando placas ELISA de 96
pocillos sensibilizadas con los antígenos del mismo modo. Los
resultados en reposo mostraron que, de los sobrenadantes de cultivo
de los 12 pocillos que reaccionaron con dímero e-D,
un pocillo de sobrenadante de cultivo reaccionó con monómero
e-D, pero no reaccionó con fragmento
e-X, fragmento e-Y, fragmento
e-E, o fibrinógeno, mientras que los once pocillos
restantes de sobrenadante de cultivo no reaccionaron con fragmento
e-E, pero reaccionaron con monómero
e-D, fragmento e-X, fragmento
e-Y, y fibrinógeno.
Los hibridomas del pocillo de sobrenadante
específicamente reactivo contra el dímero e-D y el
monómero e-D se transfirieron a una placa de 24
pocillos y se cultivaron durante 4 a 5 días en un medio HT que
contenía suero de ternera fetal del 10 al 15%. Después de ello, se
determinaron las reactividades cruzadas con productos de digestión
de fibrinógeno con plasmina (una mezcla de fragmento
p-X, fragmento p-Y, fragmento
p-D y fragmento p-E) y el producto
de digestión de la fibrina estabilizada con plasmina (complejo
p-DD/E) por el procedimiento ELISA, para no
encontrar reacción cruzada con productos digeridos con plasmina.
Además, la presencia de los anticuerpos
anti-monómero e-D/dímero
e-D producidos se confirmó por el procedimiento
ELISA, y después, se realizó clonación por el procedimiento de
dilución limitante. En el procedimiento de dilución limitante, se
vertieron 100 \mul de la suspensión celular diluida con un medio
HT de modo que la concentración del hibridoma llegara a ser 5
hibridomas/ml en cada uno de los pocillos de una placa de 96
pocillos en la que se vertieron 2 x 10^{4} células abdominales de
ratones BALB/C normales con anterioridad en cada pocillo. Después de
aproximadamente 10 días, se exploraron los clones de los hibridomas
que producían anticuerpos anti-dímero
e-D y anti-monómero
e-D por el procedimiento ELISA. Como resultado, se
obtuvieron 20 clones que producían anticuerpos. A parir de estos
clones, se seleccionaron los estables que mostraban fuerte
proliferación y una elevada capacidad para secretar anticuerpos, y
se volvieron a clonar por el mismo procedimiento que anteriormente,
y se obtuvo el hibridoma IF-101 que produce
anticuerpos anti-monómero e-D/dímero
e-D. El hibridoma anterior se depositó localmente
en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology Agency of Industrial Science and
Technology Agency of Industrial Science and Technology (Dirección:
1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305,
Japón) el 24 de abril de 1996, en el FERM
P-15599, y se transfirió al depósito internacional el 31 de marzo de 1997. El número de depósito internacional es FERM
BP-5890.
P-15599, y se transfirió al depósito internacional el 31 de marzo de 1997. El número de depósito internacional es FERM
BP-5890.
Se cultivó el hibridoma de ratón
IF-101 en un medio DME que contenía suero de ternera
fetal al 15% a 37ºC durante 72 a 96 horas en atmósfera de dióxido
de carbono al 5%. Después de que se centrifugara el cultivo (10.000
x g, 10 minutos), se añadió gradualmente sulfato amónico sólido al
sobrenadante de modo que la concentración final del mismo llegar a
ser del 50%. La mezcla se agitó durante 30 minutos enfriando con
hielo. Después de dejar que reposara durante 60 minutos, la mezcla
se centrifugó (10.000 x g, 10 minutos). El residuo se disolvió en
una pequeña cantidad de un tampón fosfato 10 mM (pH 8,0) y se
dializó frente a una cantidad 1000 veces de tampón fosfato 10 mM.
El dializado resultante se aplicó a una columna de
DEAE-celulosa que se había equilibrado con tampón
fosfato 10 mM. El anticuerpo monoclonal se eluyó por el
procedimiento de gradiente de densidad entre tampón fosfato 10 mM
(pH 8,0) a tampón fosfato 10 mM (pH 8,0) que contenía NaCI 0,2 M. El
anticuerpo monoclonal eluido se concentró por el procedimiento de
ultrafiltración y se dializó frente a tampón fosfato 0,1 M (pH
8,0). Para retirar la IgG sérica bovina, el producto dializado se
pasó a través de una columna de IgG sérica de cabra
anti-bovina-Sepharose 4B. Después,
al solución pasada se aplicó a una columna de proteína
A-Sepharose 4B equilibrada con tampón fosfato 0,1 M
(pH 8,0). La columna se eluyó con un tampón (pH 3,5) para obtener
el anticuerpo monoclonal IF-101 purificado
anti-monómero e-D/dímero
e-D de acuerdo con la presente invención.
Se administró bristano
(2,6,10,14-tetrametilpentadecano) (0,5 ml) por vía
intraperitoneal en ratones BALB/C de 10 a 12 semanas de edad.
Después de 14 a 20 días, se inocularon las cavidades abdominales de
los ratones con 2 x 10^{6} células/ratón de hibridoma
IF-101 proliferado in vitro.
Se obtuvieron de aproximadamente 10 a 15 ml de
fluido ascítico de un ratón. Las concentraciones del anticuerpo
fueron de 5 a 10 mg/ ml. La purificación del anticuerpo monoclonal a
partir de los fluidos ascíticos se realizó repitiendo los mismos
procedimientos que los de purificación in vitro, excepto en
que no se realizó la etapa de pasar a través de una columna de IgG
sérica de cabra
anti-bovina-Sepharose.
La clase de inmunoglobulina del anticuerpo
monoclonal IF-101 anti-monómero
e-D/dímero e-D de la presente
invención se examinó por el procedimiento de inmunodifusión de
Ouchterlony. La clase de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal
IF-101 era IgG1\kappa.
El sitio de reconocimiento del anticuerpo
monoclonal IF-101 se identificó por un procedimiento
de transferencia de western. Los procedimientos fueron
principalmente de acuerdo con el Zeta-Probe Blotting
Mewbranes Instruction Manual (Bio-Rad, USA), del
siguiente modo:
Se trató el fibrinógeno con elastasa de
granulocitos durante 30 minutos, 60 minutos o 24 horas. Los
productos de fibrinógeno digeridos después de la reacción durante
30 minutos, 60 minutos y 24 horas se trataron por una
electroforesis en gel de SDS poliacrilamida en presencia o ausencia
de ditiotreitol (DTT). Se realizó la transferencia y el
inmunoensayo enzimático en el procedimiento anterior. Los resultados
de los mismos y los resultados de la tinción de proteínas de la
electroforesis anterior en gel de SDS poliacrilamida con Azul
Brillante de Coomassie G-250 se compararon para
identificar el sitio de reconocimiento del anticuerpo monoclonal
IF-101. Para fibrinógeno, dímero e-D
y complejo e-DD/E purificados (productos de
digestión de fibrina estabilizada con elastasa de granulocitos), se
repitieron los mismos procedimientos. Las reactividades de unión del
presente anticuerpo monoclonal IF-101 contra
diversos antígenos se muestran en la Tabla 1. En la Tabla 1,"+"
indica que el anticuerpo monoclonal mostraba reactividad de unión,
y "-" indica que el anticuerpo monoclonal no mostraba
reactividad de unión.
Además, para los fragmentos digeridos X, Y, D, y
E de fibrinógeno con plasmina, dímero p-D y complejo
p-DD/E (productos de digestión de fibrina
estabilizada con plasmina), se repitieron los mismos procedimientos.
Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Como anteriormente, los resultados de las Tablas
1 y 2 muestran que el anticuerpo monoclonal IF-101
de la presente invención reconoce la /cadena \alpha delmonómero
e-D.
Los resultados del Ejemplo 5 muestran que el
anticuerpo monoclonal IF-101 reconoce la /cadena
\alpha del monómero e-D. Por tanto, para analizar
el epítope del anticuerpo monoclonal IF-101 en
detalle, se determinó la secuencia de aminoácidos de la /cadena
\alpha del monómero e-D. Después, se prepararon
péptidos que tenían la misma secuencia de aminoácidos, y se
realizaron experimentos de inhibición de la unión entre el
anticuerpo monoclonal IF-101 y monómero
e-D, monómero e-D/cadena \alpha,
dímero e-D, y complejo e-DD/E,
usando los péptidos, para determinar la secuencia de aminoácidos
del epítope. El procedimiento concreto es el siguiente:
La secuencia de aminoácidos en el extremo N de
la cadena \alpha del monómero e-D se analizó por
un secuenciador de proteínas (Applied Systems Japan K.K.) para
encontrar
| Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile | (SEC ID Nº 2). |
Una comparición de la secuencia encontrada
anteriormente y la secuencia de la cadena A\alpha de fibrinógeno
humano reveló que la /cadena \alpha del monómero
e-D comienza con el aminoácido 112 de la cadena
A\alpha. En otras palabras, se descubrió que la secuencia de
aminoácidos N-terminal que incluye el aminoácido
N-terminal de la /cadena \alpha del monómero
e-D corresponde a
Ser_{112}-Glu_{113}-Asp_{114}-Leu_{115}-Arg_{116}-Ser_{117}-Arg_{118}-Ile_{119}-
de la cadena A\alpha del fibrinógeno humano.
Se prepararon tres péptidos que tienen la
secuencia de aminoácidos después del aminoácido 112 de la cadena
A\alpha del fibrinógeno humano. Los experimentos de inhibición de
la unión entre el anticuerpo monoclonal IF-101 y el
monómero e-D, monómero e-D/cadena
\alpha, dímero e-D, y complejo
e-DD/E (producto de digestión de fibrina
estabilizada con elastasa de granulocitos) se realizaron usando los
péptidos.
Los experimentos de inhibición de la unión se
realizaron por un procedimiento de transferencia de western. Más
particularmente, los productos (que contienen monómero
e-D) obtenidos digiriendo fibrinógeno con elastasa
de granulocitos durante 24 horas se trataron por una electroforesis
en gel de SDS poliacrilamida, junto con el dímero
e-D y complejo e-DD/E purificados
(productos de digestión de fibrina estabilizada con elastasa de
granulocitos), en presencia o ausencia de ditiotreitol (DTT).
Después, la transferencia se realizó de acuerdo con el
Zeta-Probe
Blotting Mewbranes Instruction Manual (Bio-Rad, USA). En la transferencia, el anticuerpo monoclonal IF-101 se hizo reaccionar en presencia de los péptidos (100 \muM) o ausencia de los mismos, para determinar si los péptidos inhiben o no la reacción del anticuerpo monoclonal IF-101.
Blotting Mewbranes Instruction Manual (Bio-Rad, USA). En la transferencia, el anticuerpo monoclonal IF-101 se hizo reaccionar en presencia de los péptidos (100 \muM) o ausencia de los mismos, para determinar si los péptidos inhiben o no la reacción del anticuerpo monoclonal IF-101.
Los resultados se muestran en la Tabla 3. El
péptido A tiene la secuencia de aminoácidos:
| Ser Glu Asp Leu Arg Ser | (SEC ID Nº 1), |
que corresponde a la secuencia de aminoácidos
desde el aminoácido 112 al 117 en la cadena A\alpha del
fibrinógeno humano. El péptido B tiene la secuencia de
aminoácidos:
| Ser Arg Ile Glu Val Leu | (SEC ID Nº 3), |
que corresponde a la secuencia de aminoácidos
desde el aminoácido 117 al 122 en la cadena A\alpha del
fibrinógeno humano. El péptido C tiene la secuencia de
aminoácidos:
| Leu Lys Arg Lys Val Ile | (SEC ID Nº 4), |
que corresponde a la secuencia de aminoácidos
desde el aminoácido 122 al 127 en la cadena A\alpha del
fibrinógeno humano. En la Tabla 3, "+" indica que la unión del
anticuerpo monoclonal IF-101 y los productos
digeridos con elastasa de granulocitos se inhibía por el péptido
añadido, y "-" indica que la unión no se inhibía por el péptido
añadido.
Los resultados de la Tabla 3 muestran que el
epítope del anticuerpo monoclonal IF-101 existe en
el sitio que contiene la secuencia de aminoácidos
N-terminal:
Ser-Glu-Asp-Leu-Arg-Ser
que contiene el aminoácido
N-terminal de la cadena \alpha del monómero
e-D. La secuencia de aminoácidos corresponde
a:
Ser_{112}-Glu_{113}-Asp_{114}-Leu_{115}-Arg_{116}-Ser_{117}-Arg_{118}-lle_{119}-
de la cadena A\alpha del
fibrinógeno
humano.
Se mezcló látex de poliestireno [Seradyn; USA,
suspensión al 10% (p/v), diámetro de partícula = 0,489
\muM]
(0,2 ml) con 1,8 ml de tampón tris-HCI 50 mM (pH 8,0) (concentración de anticuerpo = 0,9 mg/ml) que contenía el anticuerpo monoclonal IF-101 anti-monómero e-D/complejo e-DD/E preparado en el Ejemplo 3 de acuerdo con la presente invención, y la mezcla se agitó con un agitador magnético.
(0,2 ml) con 1,8 ml de tampón tris-HCI 50 mM (pH 8,0) (concentración de anticuerpo = 0,9 mg/ml) que contenía el anticuerpo monoclonal IF-101 anti-monómero e-D/complejo e-DD/E preparado en el Ejemplo 3 de acuerdo con la presente invención, y la mezcla se agitó con un agitador magnético.
La mezcla se centrifugó (20.000 X g; 10
minutos), se lavó con agua destilada que contenía NaN_{3} al 0,05%
cuatro veces, se suspendió en tampón tris-HCI 0,1 M
(pH 8,0) que tenía BSA (1 mg/ml) y se almacenó. El látex revestido
se mezcló con diversas concentraciones de dímero
e-D, complejo e-DD/E, productos de
digestión de fibrinógeno con elastasa de granulocitos, productos de
digestión de fibrinógeno con plasmina, o productos de digestión de
fibrina estabilizada con plasmina. Se usó un sistema de ensayo de
suero inmunológico completamente automático
(LPIA-200; Mitsubishi Chemical Corp.) para medir los índices de reacción de la aglutinación para la determinación.
(LPIA-200; Mitsubishi Chemical Corp.) para medir los índices de reacción de la aglutinación para la determinación.
Los resultados se muestran en la Fig. 1. En la
Fig. 1, la línea a ilustra a los resultados del dímero
e-D usado como un antígeno, la línea b ilustra los
resultados del complejo e-DD/E, la línea c ilustra
los resultados de una mezcla de complejo e-DD/E y
complejo p-DD/E en cantidades equivalentes, la línea
d ilustra los resultados de los productos de digestión de
fibrinógeno con plasmina, la línea e ilustra los resultados de
complejo p-DD/E, y la línea f ilustra los
resultados de los productos de digestión de fibrinógeno con elastasa
de granulocitos. El valor V significa un índice de reacción de
aglutinación.
Los resultados de la Tabla 1 muestran que el
dímero e-D o el complejo e-DD/E
pueden medirse cuantitativamente por el látex revestido con
anticuerpo monoclonal IF-101.
Como anteriormente, se manifiesta que el
anticuerpo monoclonal de la presente invención puede proporcionar
un ensayo inmunológico capaz de determinar cuantitativa y
específicamente una cantidad de dímero e-D o
complejo e-DD/E en una muestra de un cuerpo vivo,
sin interferencia de las sustancias que se supone que están
presentes en la muestra, es decir, fibrinógeno, productos de
digestión de fibrinógeno con plasmina, o productos de digestión de
fibrina estabilizada con plasmina, particularmente dímero
p-D o complejo p-DD/E.
SEC ID Nº 1
| LONGITUD DE SECUENCIA: 6 |
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácido TOPOLOGÍA: lineal |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: |
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Asp Leu Arg Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 2
| LONGITUD DE SECUENCIA: 8 |
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácido TOPOLOGÍA: lineal |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: |
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 3
| LONGITUD DE SECUENCIA: 6 |
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácido TOPOLOGÍA: lineal |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: |
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Ile Glu Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 4
| LONGITUD DE SECUENCIA: 6 |
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácido TOPOLOGÍA: lineal |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: |
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Lys Arg Lys Val Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Iatron Laboratories, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11-4, Higashi-kanda 1-chome, Chiyoda-ku
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Tokio
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: ninguno
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Japón
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 101
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo anticuerpo monoclonal, y ensayo inmunológico de dímero e-D y complejo e-DD/E
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentln Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Asp Leu Arg Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Ile Glu Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Lys Arg Lys Val Ile}
Claims (5)
1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento del
mismo que reacciona específicamente con monómero D producido
digiriendo fibrinógeno humano con elastasa de granulocitos,
productos de digestión que contienen dominio D producidos
digiriendo fibrina estabilizada humana con elastasa de granulocitos,
y un fragmento parcial de cadena A\alpha de monómero D producido
digiriendo fibrinógeno humano con elastasa de granulocitos,
produciéndose dicho fragmento parcial retirando un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos del primer aminoácido al 111 de
la cadena A\alpha, pero no reacciona con fibrinógeno, fragmento
X, Y o E producido digiriendo fibrinógeno con elastasa de
granulocitos, productos de digestión de fibrinógeno humano con
plasmina, o productos de digestión de fibrina estabilizada con
plasmina.
2. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que existe un epítope en la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº 1.
3. Un hibridoma que produce dicho anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
4. Un ensayo inmunológico para el dímero D
producido digiriendo fibrina humana estabilizada con elastasa de
granulocitos y complejo DD/E producido digiriendo fibrina humana
estabilizada con elastasa de granulocitos, en un muestra obtenida
de un cuerpo vivo, caracterizado porque se pone dicha muestra
en contacto con un vehículo revestido con el anticuerpo monoclonal
o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 y se
detecta el agregado formado por dicho dímero D o complejo DD/E con
dicho vehículo revestido.
5. Una composición de diagnóstico que comprende
el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2.
Applications Claiming Priority (2)
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