ES2288979T3 - Diagnostico y tratamiento del cancer de prostata. - Google Patents

Abstract

Un método de ayuda para la determinación de la susceptibilidad de un paciente humano al cáncer de próstata que comprende el paso de determinar si la muestra que contiene ácido nucleico y/o proteína, obtenidos del paciente contiene un nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na+ regulado por voltaje asociado con el cáncer de próstata, en el que tal nivel se define como el nivel aumentado presente en células conocidas de próstata cancerosas o metastáticas con respecto a células conocidas de próstata no cancerosas o no metastáticas.

Description

Diagnóstico y tratamiento del cáncer de próstata.

La presente invención se refiere a métodos para determinar si un paciente tiene cáncer y si el cáncer es semejante a metástasis: y a los métodos de tratamiento de cáncer, en particular al cáncer de próstata.

Al cáncer se le considera una enfermedad severa y un destructor de grandes proporciones. Aunque en años recientes se ha avanzado en el diagnóstico y tratamiento de ciertos cánceres, existe todavía la necesidad de mejoras en el diagnóstico y tratamiento.

El cáncer es una enfermedad genética y en la mayoría de los casos involucra las mutaciones en uno o más genes. Se cree que existen alrededor de 60 000 genes en el genoma humano pero de éstos se ha demostrado que solo un puñado están involucrados en el cáncer. Aunque se supone que muchos más genes de los ya identificados se verán involucrados en el cáncer, el progreso en esta área ha sido lento a pesar de la disponibilidad de técnicas de análisis molecular. Esto puede atribuirse a la estructura diversa y a la función de los genes que se han identificado hasta la fecha, lo que sugiere que los genes del cáncer pueden adoptar muchas formas y pueden tener muchas funciones diferentes.

El carcinoma de próstata se ha convertido en una enfermedad muy significativa en muchos países y constituye la malignidad más comúnmente diagnosticada en hombres en el mundo occidental y su ocurrencia aumenta significativa con la edad. En los últimos 20 años las tasas de mortalidad se han duplicado y constituye en la actualidad la segunda causa más común de muertes de hombres de cáncer en el mundo occidental (Wingo et al (1995) Cáncer J. Clin. 45, 8-30; Mortality Statistics: Cause England and Wales. OPCS DH2 19, 1993, Her Majesty's Stationery Office). La prevalencia de cáncer de próstata se ha incrementado en un 28% en la última década y esta enfermedad abarca ahora el 12% del total de cánceres en hombres en Inglaterra y Gales (Cáncer Statistics: Registrations England and Wales.OPCSMBI No 22, 1994, Her Majesty's Stationery Office; Foster et al (1999) Br. J. Urol. 83, 171-194). Para el año 2018 se espera que constituya el mayor depredador de la población masculina y que el 50% de la misma lo sufra (80% a la edad de 80 años). La evidencia reciente sugiere que el cáncer de próstata también aumenta entre hombres más jóvenes (Br J Cáncer (1999) 79, 13-17). Estos incrementos y las muertes recientes de muchas figuras públicas por causa del cáncer de próstata han servido para subrayar la necesidad de hacer algo alrededor de este tipo de cáncer. Se ha sugerido
que una disponibilidad más amplia de su identificación pueda limitar la mortalidad causada por el cáncer de próstata.

La identificación del cáncer de próstata consiste actualmente en un examen rectal y medida de los niveles específicos de antígenos en la próstata (PSA). Estos métodos carecen de especificidad ya que el examen rectal digital tiene una considerable variabilidad entre los examinadores (Smith & Catalona (1995) Urology 45, 70-74). La medición del antígeno específico del suero de la próstata. (PSA), sintetizado por las células epiteliales de los gránulos y conductos prostáticos y segregado como un constituyente normal del fluido seminal, es el marcador de diagnóstico de mayor aplicación común del cáncer (e.g. Gao et al (1997) The Prostate 31, 264-281). Sin embargo, las mediciones PSA pueden arrojar una información inconsistente de manera que algunos con cáncer de próstata pueden tener niveles bajos de PSA, mientras que los niveles de PSA pueden ser elevados en presencia de enfermedades prostáticas no malignas, por ejemplo en la hiperplasia prostática benigna (BPH), en la inflamación prostática y en otras condiciones (e.g. Mandelson et al (1995) Annu. Rev. Public Health 16, 283-306; Flood et al (1996) J. Gen. Int. Med. 11, 342-349; Morgan et al (1996) The Prostate 57, 58-63; Chan & Sulmasy (1998) Am. J. Med. 108, 226-274. El fallo comparativo del PSA como prueba diagnóstico se mostró en 366 hombres que desarrollaron cáncer de próstata mientras se incluían en el Physicians Health Study (Estudio Médico de Salud), un estudio prospectivo de más de 22 000 hombres. Los niveles de PSA se midieron en el suero, que fue almacenado al comienzo del estudio y se encontraron niveles elevados únicamente en el 47% de los hombres que desarrollaron cáncer de próstata en los cuatro años subsiguientes (Gann et al (1995) JAMA 273, 289-294).

Los métodos actuales de identificación son por tanto, insatisfactorios, no existe un método confiable para el diagnóstico del cáncer, o la predicción o la prevención de su posible diseminación metastático, lo que constituye la causa principal de muerte para la mayoría de los pacientes.

Grimes et al (1995) FEBS Lett. 369, 290-294 describe la expresión diferencial de las corrientes de Na^{+} activadas mediante voltaje en dos líneas de células de cáncer prostático y presenta la contribución de éstas a la capacidad de invasión in Vitro. Las líneas de células estudiadas son líneas de células de ratas y no hay indicación de cuales son los canales de Na^{+} en particular que puedan estar involucrados.

Laniado et al (1997) Am J. Pathol. 150, 1213-1221 describe la expresión y el análisis funcional de los canales de Na^{+} activados mediante voltaje en las líneas de células en el cáncer humano de próstata y presenta la contribución de éstas a la invasión in Vitro. No hay indicación de cuales son los canales de Na^{+} en particular que puedan participar.

Smith et al (1998) FEBS Lett. 423, 19-24 sugiere que la expresión de canal de proteína del Na^{+} enriquece la capacidad invasiva de las líneas de células de cáncer de próstata humanas y de ratas.

Grimes & Djamgoz (1998) J. Cell. Physiol. 175, 50-58, describe la caracterización electrofisiológica y farmacológica de la corriente de Na^{+} regulada mediante voltaje y expresada en la línea de células Mat-LyLu altamente metastático del cáncer de próstata en ratas

Dawes et al (1995) Visual Neuroscience 12, 1001-1005 describe la identificación de los subtipos de canales Na^{+} inducidos en células epiteliales cultivadas del pigmento de la retina.

Las revisiones de la literatura sobre los canales de Na^{+} pueden encontrarse por ejemplo, en Black & Waxman (1996) Develop. Neurosci. 18, 139-152; Fozzard & Hanck (1996) Physiol. Rev. 76, 887-926; Bullman (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 1679-1685; Cannon (1999); and Marban et al (1998) J. Physiol. 508, 647-657. Algunos canales iónicos de Na^{+} y de otros se conoce que subyacen a ciertos defectos genéticos tal como se describe en Bullman (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 1679-1685; Burgess et al (1995) Nature Genet. 10, 461-465; y Cannon (1998) Mol Neurology (JB Martin, Ed) Scientific American Inc., NY. Sin embargo, actualmente no se utiliza ninguna secuencia de canales de Na^{+} con objetos de diagnóstico.

Por tanto, los trabajos previos pueden haber sugerido algún rol general de los canales de Na^{+} regulados mediante voltaje (VGSC) en el cáncer de próstata y sus metástasis basados en el trabajo con líneas celulares; hasta ahora no ha sido posible hacer uso de esta información de manera efectiva ya que la participación de los VGSC's en el cáncer de próstata in vivo no ha sido demostrado, y no se han podido identificar los VGSC's participantes en el cáncer humano de próstata.

Ahora sorprendentemente, hemos encontrado que la expresión de los VGSC se correlaciona con la progresión patológica y que el VGSC que se asocia con el cáncer humano, particularmente el cáncer de próstata y sus metástasis, es el hNe (también nombrado Na v1.7.) Como se acotó anteriormente, este es un VGSC conocido (aunque no se conociera previamente que estuviera asociado con el cáncer humano o el cáncer de líneas celulares, en particular con el cáncer humano de próstata) y una secuencia aminoácida de la proteína, y se ha reportado el ADNc del ARNm que lo codifica para éste (Klugbauer et al (1995) EMBO J. 14, 1084-1090). El hNe-Na (humano) y PN1 (rata) se corresponden con el gen SCN9A, tal como se presentó en el Ejemplo 1. Recientemente se adoptó una nueva nomenclatura de VGSC (Goldin et al (2000) Neuron 28(2), 365-368). En este sistema hNa y PN1 son los ortólogos humanos y de ratas respectivamente del Na_{v}1.7.

La ubicación cromosómica del hNe-Na no se ha determinado todavía. Sin embargo el equivalente del ratón se ha ubicado en el cromosoma 2 del ratón en el cluster de canal de Na^{+} regulado mediante voltaje (Beckers et al (1997) Genomics 36, 202-205). Este cluster también está presente en el cromosoma humano 2, en el que el hNe-Na puede estar presente de manera similar (Malo et al (1994) Cytogen.Cell. Genet. 67, 178-186; Malo et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2975-2979; George et al (1994) Genomics 19, 395-397). No se ha determinado todavía la organización intrones/axones del gen hNe-Na (SCN9A humano) pero pudiera inferirse de otras posiciones de intrones VGSC conservadas, conocidas, (Loughey et al (1989) Cell 58, 1143-1154; George et al (1993) Genomics 15, 598-606; Wang et al (1996) Genomics 34, 9-16; and Sonslova et al (1997) Genomics 41, 201-209).

Los canales de Na^{+} de tipo cerebral (rat brain I-III (Noda et al (1986) Nature 322, 826-828; Kayano et al (1988) FEBS Lett. 228, 187-194) que son los más similares al hNe-Na son un 20% diferentes a lo largo de la secuencia total (esquelético humano, 30%; corazón 34% diferente). Sin embargo (i) si la comparación de la secuencia se hace dentro de dominios específicos estructurales/funcionales esta homología se reduce en gran medida (por ejemplo, el primer tercio de la región del enlazador citoplásmico DII-D-III tiene solamente un 45% de homología con el canal más similar (RBII/HVII); (ii) el hNe-Na tiene regiones suficientemente diferentes (por ejemplo los residuos 446-460: EYTSIRRSRIMGLSE) para hacer anticuerpos específicos (ver, por ejemplo, Toledo-Aral et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1527-1532).

Es objeto de esta invención brindar métodos útiles para aportar diagnósticos y prognosis del cáncer, especialmente del cáncer de próstata y para auxiliar al clínico en el manejo del cáncer, particularmente del cáncer de próstata. En particular, es un objeto de la invención el proveer un método de evaluación del potencial metastático del cáncer, en particular del cáncer de próstata.

Los objetos adicionales de la invención incluyen el aporte de métodos de tratamiento del cáncer, en particular del cáncer de próstata y los métodos de identificación de los compuestos que inhiben selectivamente los VGSC asociados con el cáncer humano, particularmente el cáncer de próstata, ya que éstos pueden resultar útiles en el tratamiento del cáncer.

Como un primer aspecto de la invención se brinda un método para la determinación de la susceptibilidad de un paciente humano al cáncer de próstata que comprende el paso de determinar si una muestra que contiene ácido nucleico y/o proteína obtenida de un paciente, contiene un nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje asociado con el cáncer de próstata, en el que tal nivel se define como el nivel incrementado presente en células prostáticas cancerosas o metastáticas conocidas con respecto a células prostáticas no cancerosas o no metastáticas conocidas.

Como un segundo aspecto de la invención se brinda un método para el diagnóstico del cáncer de próstata en un paciente humano que comprende el paso de la determinación de si una muestra que contiene ácido nucleico y/o proteína obtenidos a partir del paciente, contienen un nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje asociado con el cáncer de próstata, en el que dicho nivel se define como el nivel incrementado presente en células prostáticas cancerosas o metastáticas conocidas con respecto a células prostáticas o no metastáticas conocidas.

Se aprecia que la determinación de si la muestra contiene un nivel de ácido nucleico o proteína del hNe-Na del VGSC asociado con el cáncer, puede en si misma, ser el diagnóstico del cáncer o puede utilizarse por parte del clínico como un auxiliar en la obtención de un diagnóstico.

Por ejemplo, en relación con el cáncer de próstata, es útil si el clínico realiza un examen histopatológico del tejido para biopsia o mide el nivel de plasma PSA o lleva a cabo un examen digital externo o mediante imágenes. Recientemente también se ha sugerido la posibilidad de utilizar el nivel de sangre IGF-1 (Chan et al (1998) Science 279, 563-566). Se apreciaría que el clínico tomara en consideración éstos u otros factores, así como que considerara el nivel de dicho VGSC antes de hacer un diagnóstico.

Como un tercer aspecto la invención brinda un método de predicción de los prospectos relativos de una evolución en particular de un cáncer de próstata en un paciente humano que incluye el paso de determinación de si una muestra que contiene ácido nucleico y/o proteína obtenida a partir de un paciente contiene un nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje asociado con el cáncer de próstata, en el que tal nivel se define como el nivel incrementado presente en células prostáticas cancerosas o metastáticas conocidas con respecto a células prostáticas o no metastáticas conocidas.

Por lo tanto, el método del tercer aspecto de la invención puede ser útil en prognosis o en apoyo a prognosis. El método puede utilizarse como un coadyuvante a métodos conocidos de prognosis tales como el examen histopatológico de tejido de biopsia o la medición de niveles PSA de plasma, el examen digital externo o las imágenes.

Se aprecia que la determinación del nivel de dicho VGSC en la muestra será útil al clínico en la determinación de cómo manejar el cáncer en el paciente. Por ejemplo, debido a que los niveles elevados de dicho VGSC se asocian con un potencial metastático, particularmente en caso de cáncer de próstata y pueden ser asociados con insensibilidad andrógena, el clínico puede utilizar la información respecto a los niveles de dicho VGSC para facilitar la toma de decisión con respecto al tratamiento del paciente. Por tanto, si el nivel de dicho VGSC es indicativo de un potencial metastático bajo de dicho cáncer de próstata, puede evitarse una cirugía radical innecesaria. De manera similar, si el nivel dicho VGSC es indicativo de un potencial metastático alto de dicho cáncer de próstata, la cirugía radical (esto es la prostatactomía) puede constituir el tratamiento preferido.

Se aprecia a partir de lo anterior y de los ejemplos a continuación que la determinación de los niveles de dichos VGSC puede explotarse en materia de diagnóstico para predecir si un cáncer dado, en particular un cáncer de próstata, puede hacer metástasis ya que la expresión de dicho VGSC se cree que se corresponde con una posible diseminación de un tumor.

También se prefiere en particular si el método de la invención se emplea en la predicción de si un cáncer de próstata dado puede hacer metástasis.

El nivel de dicho VGSC que es indicativo de cáncer o de un potencial metastático puede definirse como el nivel incrementado presente en células de cáncer de próstata o metastáticas conocidas con respecto a con respecto a células prostáticas o no metastáticas conocidas. El nivel de dicha proteína VGSC puede ser por ejemplo, al menos 11/2 veces mayor en células cancerosas o metastáticas o puede ser al menos de dos a tres veces mayor. El análisis cuantitativo mediante microdensitometría de secciones de tejidos procesadas de forma inmunohistoquímica ha demostrado que la expresión de los VGSC en regiones cancerosas de conductos prostáticos es tres veces mayor que la correspondiente a regiones benignas (ver Ejemplo 3). El anticuerpo utilizado se cree que reacciona con todos los VGSC, pero nuestros resultados en el Ejemplo 1, indican que el canal hNeNa Na^{+} es proclive a ser la forma predominante en células de cáncer de próstata humano y que es por tanto muy probable que sea el principal canal hNe-Na Na^{+} que sea reconocido. El nivel de codificación de ARNm de dicho VGSC puede ser por ejemplo, al menos 11/2 veces mayor en células cancerosas o metastáticas, o puede ser al menos de dos a tres veces mayor, o al menos 10, 50, 100, 500 o unas 1 000 veces mayor. Las mediciones mediante PCR semicuantitativo indican que el nivel del ARNm es alrededor de 1 000 veces mayor en las líneas de células altamente metastáticas que en las líneas de células de baja metastaticidad, tal como se describe en los Ejemplos.

En una realización preferida de la invención se determina si el nivel VGSC de dicho ácido nucleico, en particular ARNm, es un nivel asociado al cáncer. Preferiblemente, la muestra contiene ácido nucleico, tal como el ARNm y el nivel de dichos VGSC se mide al contactar dicho ácido nucleico que se "hibridiza" selectivamente a dicho VGSC de ácido nucleico.

Por "hibridización selectiva" se entiende que el ácido nucleico tiene suficiente similitud de la secuencia nucleótida con el ácido nucleico humano como para hibridizar bajo condiciones moderadas o altamente fibrosas. Como es bien conocido en la técnica, la dureza de la hibridización del ácido nucleico depende de factores tales como la extensión del ácido nucleico en el que ocurre la hibridización, el grado de identidad de las secuencias de hibridización y de factores tales como la temperatura, la fortaleza iónica y el contenido CG o At de la secuencia. Por tanto, cualquier ácido nucleico capaz de hibridización selectiva como se ha dicho es útil en la práctica de la invención.

Los ácidos nucleicos que pueden hibridizar selectivamente a dicho ácido nucleico humano incluyen ácidos nucleicos que tienen > 95% de identidad de secuencia, preferiblemente aquellos con más del 98%, de mayor preferencia más del 98%, de mayor preferencia los de más del 99% de la identidad de secuencia, al menos durante una porción del ácido nucleico con el mismo ácido nucleico humano. Como es bien conocido, los genes humanos contienen usualmente intrones de manera tal que por ejemplo, un ARNm o un ADNc derivado de un gen no acoplaría perfectamente a lo largo de toda su extensión con el mismo ADN genómico humano pero sin embargo sería un ácido nucleico capaz de hibridizar selectivamente a dicho ADN humano. Por tanto, la invención incluye específicamente ácidos nucleicos que hibriden selectivamente a dichos ARNm o ADNc de VGSC pero no hibridizar a un gen de VGSC dado. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que expanden los límites intrón-axón de dicho gen de VGSC pueden no ser capaces de hibridizar selectivamente a dicho ARNm o ADNc de VGSC.

Las condiciones de hibridización típicas moderadas o altamente resistentes que llevan a la hibridización selectiva son conocidas por la técnica, por ejemplo las descritas en (Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) incorporadas aquí como referencia.

Un ejemplo de una solución de hibridización típica en la que un ácido nucleico se inmoviliza en una membrana de nailon y el ácido nucleico de prueba es \geq500 bases o pares de bases es:

6 x SSC (citrato salino Na^{+})

0,5% Na^{+} dodecil sulfato (SDS)

100 \mug/ml desnaturalizados, de ADN de esperma fragmentada de salmón.

La hibridización se realiza a 68ºC. La membrana de nailon, con el ácido nucleico inmovilizado, puede ser lavada a 68ºC en 1 x SSC o 0,1 x SSC para alta resistencia.

Pueden prepararse 20 x SSC de la siguiente manera. Se disuelven 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de Na^{+} en 800 ml de H_{2}O. Se ajusta el pH a 7,0 con unas cuantas gotas de una solución 10 N de NaOH. Se ajusta el volumen con H_{2}O a 1 litro. Se dispensa en partes alícuotas. Se esteriliza en autoclave.

Un ejemplo de una solución típica de hibridización cuando se inmoviliza un ácido nucleico en una membrana de nailon y la muestra de prueba es un oligonucleótido entre 15 y 20 bases, es:

3,0 M de cloruro trimetilamonio (TMACI)

0,01 M fosfato Na^{+} (pH 6,8)

1 mm EDTA (pH 7,6)

0.5% SDS

100 \mug/ml desnaturalizados, de ADN de esperma fragmentada de salmón.

0,1% de leche descremada en polvo.

La temperatura óptima de hibridización se elige usualmente de 5ºC por debajo del Ti para la extensión dada de la cadena. Ti es la temperatura de fusión irreversible del híbrido formado entre la muestra de prueba y su secuencia objetivo. Jacobs et al (1988) Nucl. Acids Res. 16, 4637 presenta la determinación de las Tis. La temperatura de hibridización recomendada para 17-ímeros en 3M TMAC1 es de 48-50ºC; para 19-ímeros es de 55-57ºC y para 20-ímeros es de 58-66ºC.

Como "ácido nucleico que hibrida selectivamente" también se incluyen ácidos nucleicos que amplificarán el ADN de dicho ARNm de VGSC mediante cualquiera de los sistemas de amplificación conocidos tales como los descritos en mayor detalle a continuación, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las condiciones apropiadas para la amplificación de la PCR incluyen la amplificación en un búfer de 1 x apropiado:

10 x búfer de amplificación es 500 mM KCl; 100 mM Tris.Cl (pH 8,3 a temperatura ambiente): 15 mM MgCl_{2}: 0,1% gelatina.

Se utiliza un agente denaturalizador o procedimiento apropiado (tal como el calentamiento a 95ºC) para separar las hebras de ADN de doble hebra.

De manera apropiada, la parte templada de la amplificación está entre los 37ºC y los 60ºC, preferiblemente 50ºC.

Aunque el ácido nucleico que es útil en los métodos de la invención puede ser ARN o ADN, el ADN es el preferido. Aunque el ácido nucleico que es útil en los métodos de la invención puede ser de hélice doble o de hélice simple, el ácido nucleico de hélice sencillo es el preferido bajo ciertas circunstancias tales como las reacciones de amplificación del ácido nucleico.

El ácido nucleico útil en los métodos de la invención puede ser de cualquier tamaño apropiado. Sin embargo, para ciertos objetos diagnósticos, de ensayo o de amplificación, se prefiere que el ácido nucleico tenga menos de 10 000, más preferentemente menos de 1 000, aún más preferente de 10 a 100 y de preferencia adicional de 15 a 30 pares bases (si el ácido nucleico es de hebra doble o bases (si el ácido nucleico es de hebra simple). Como se describe en detalle a continuación, se prefieren particularmente las plantillas de ADN de hebra simple, apropiadas para uso en una reacción en cadena de la polimerasa.

El ácido nucleico para uso en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridizar a dichos ARNm's VGSC. Los fragmentos de dichos genes VGSC, y los ADNc's derivados de ARNm codificado por dichos genes de VGSC también son ácidos nucleicos preferidos para uso en los métodos de la invención.

Se prefiere de manera particular si el ácido nucleico para el uso en los métodos de la invención es una plantilla de oligonucleótidos que puede utilizarse para amplificar una porción de dicho ácido nucleico de VGSC, particularmente ARNm de VGSC.

El ARN hNe-Na es similar, pero distinto de otros ARNm de VGSC. Los ácidos nucleicos para uso en la invención pueden hibridizar a más de uno, por ejemplo a todos, sustancialmente todos o a un subconjunto particular de ARNm de VGSC. Esto se discute adicionalmente en los Ejemplos 1 y 2. Así, el ácido nucleico para uso en la invención puede hibridizar a una parte del ARNm de VGSC que codifica para una región del polipéptido VGSC que se conserva entre VGSC's, por ejemplo que tiene la misma secuencia de aminoácidos en todos, sustancialmente todos o en un subconjunto en particular de VGSC's. Los ácidos nucleicos preferidos para uso en la invención son los que hibridizan selectivamente al ARNm de hNe-Na y no hibridizan a otros ARNm de VGSC. Tales ácidos nucleicos de hibridización selectiva pueden obtenerse fácilmente, por ejemplo, por referencia a si ellos hibridizan, o no, a dichos ARNm de VGSC, y no a otros ARNm de VGSC.

Los métodos y ácidos nucleicos descritos por ejemplo en el Ejemplo 1, pueden utilizarse. En particular, puede utilizarse una técnica PCR semicuantitativa, descrita en el Ejemplo 1.

Los métodos son apropiados con respecto a cualquier cáncer pero se prefieren si el cáncer es cáncer de próstata.

Se prefiere si el ácido nucleico se deriva de una muestra del tejido en el que se sospecha de cáncer o en el que se ha encontrado cáncer. Por ejemplo, si el tejido en el que se sospecha de cáncer o en el que se ha encontrado cáncer es de próstata, se prefiere si la muestra que contiene ácido nucleico se deriva de la próstata del paciente. Las muestras de próstata pueden obtenerse mediante escisión quirúrgica, laparoscopía y biopsia, endoscopia y biopsia y biopsia guiada mediante imagen. La imagen puede generarse mediante ultrasonido o anticuerpos de tecnecio-99 o fragmentos de anticuerpo que vinculan o se ubican selectivamente en la próstata.

Aunque cualquier muestra que contenga ácido nucleico derivado del paciente es útil en los métodos de la invención se prefiere que la muestra se elija entre el grupo compuesto por tejido de la próstata, sangre, orina o semen. El tejido de próstata puede obtenerse de un paciente utilizando técnicas quirúrgicas estándares. Las células derivadas de la próstata se encuentran en pequeños números en la orina y en la sangre. Aunque se prefiere que la muestra que contiene el ácido nucleico del paciente sea, o se derive directamente de una célula del paciente, tal como una célula de la próstata, también se incluye en la invención una muestra derivada indirectamente de un paciente, tal como una célula cultivada. Igualmente, aunque el ácido nucleico derivado del paciente pueda haber estado físicamente dentro del paciente, pudiera copiarse de manera alternativamente de un ácido nucleico que sí estuvo físicamente dentro del paciente. El tejido tumo-
ral puede tomarse del tumor primario o de las metástasis y particularmente puede tomarse de los márgenes del tumor.

Se apreciaría que los métodos antes descritos pudieran utilizarse en la identificación presintomática de un paciente que esté en un grupo de riesgo ante el cáncer. Por ejemplo, los hombres mayores de los 60 años pueden estar en un riesgo mayor de cáncer de próstata que los de menos de 35. De manera similar, los métodos pueden utilizarse para la clasificación patológica de los tumores tales como tumores de próstata.

Si la sangre, el semen, la circulación linfática o la orina son las fuentes de dicha muestra contentiva del ácido nucleico derivada del paciente, se prefiere que ésta sea enriquecida respecto al tejido o células derivadas de la próstata. Este enriquecimiento se logra utilizando por ejemplo, métodos de selección de células tales como la selección fluorescente (FACS), usando un anticuerpo selectivo de próstata tal como el que se dirige al antígeno específico de próstata (PSA). De forma alternativa, el enriquecimiento pudiera lograrse utilizando cuentas magnéticas u otro soporte sólido, por ejemplo una columna, revestida con tal anticuerpo específico de próstata, por ejemplo un anticuerpo anti-PSA. La fuente de dicha muestra también incluye material de biopsia y muestras de tumores, también incluye especímenes fijos montados de parafina así como tejido fresco o congelado.

De manera conveniente, el ácido nucleico capaz de hibridizar selectivamente a dicho ácido nucleico humano tal como un ARNm y que se utiliza en los métodos de la invención, comprende además una etiqueta detectable.

Como "etiqueta detectable" se incluye cualquier etiqueta radioactiva conveniente tal como 32P, 33P o 35S que pueda incorporarse fácilmente dentro de una molécula de ácido nucleico utilizando métodos bien conocidos; también se incluye cualquier etiqueta fluorescente o quimiluminiscente conveniente que pueda incorporarse dentro de un ácido nucleico. Adicionalmente el término "etiqueta detectable" también incluye una porción o resto que pueda detectarse en virtud del enlace a otra porción (tal como la biotina que puede detectarse mediante enlace a estreptavidina); y una porción, tal como una enzima, que pueda detectarse en virtud de su capacidad para convertir un compuesto incoloro a coloreado, o viceversa (por ejemplo, la fosfatasa alcalina puede convertir nitrofenil-fosfato-o a o -nitrofenol coloreado). De manera conveniente, la muestra de ácido nucleico puede ocupar una cierta posición en un conjunto establecido y si el ácido nucleico hibrida a dicho VGSC de ácido nucleico puede determinarse mediante referencia a la posición de la hibridización en el conjunto establecido.

Se prefieren las plantillas apropiadas para uso en una reacción en cadena de polimerasa (PCR; Saiki et al (1988) Science 239, 487-491). Las plantillas PCR apropiadas pueden tener las siguientes propiedades:

Es bien conocido que la secuencia en el extremo 5' del oligonucleótido no tiene que corresponder a la secuencia objetivo que debe ser amplificada.

Es usual que las plantillas PCR no contengan estructuras complementarias entre sí mayores de 2 bases, especialmente en sus extremos 3', ya que esta característica puede promover la formación de un producto artifactual llamado "dímero de plantilla". Cuando los extremos 3' de las dos plantillas hibridan, forman un complejo de "patrón de plantilla" y la extensión de la plantilla resulta en un producto doble corto denominado "dímero de plantilla"

La estructura secundaria interna debe evitarse en las plantillas. Para PCR simétrico, se recomienda un contenido del 40-60% G+C para ambas plantillas, sin tramos largos de cualquier base. Los cálculos de la temperatura clásica de fusión utilizados de conjunto con los estudios de prueba de hibridización de ADN a menudo predicen que una plantilla dada debe templarse a una temperatura específica o que la temperatura de extensión de 72C disociará el híbrido patrón/plantilla prematuramente. En la práctica, los híbridos son generalmente más efectivos en el proceso PCR que lo predicho mediante simples cálculos T_{m}.

Las temperaturas óptimas de templado pueden determinarse empíricamente y pueden ser superiores a lo previsto. La polimerasa ADN Taq tiene actividad en la región de 37-55ºC, así que la extensión de la plantilla ocurrirá durante el paso de templado y el híbrido se estabilizará. Las concentraciones de las plantillas son iguales en el PCR convencional (simétrico) y típicamente están dentro del rango de 0,1 a 1 \muM.

Puede utilizarse cualquiera de los protocolos de amplificación de ácidos nucleicos en el método de la invención incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa, de la replicaza QB y de la ligasa. También puede utilizarse la NASBA (amplificación basada en la frecuencia del ácido nucleico), denominada 3SR, tal como se describe en Compton (1991) Nature 350, 91-92 and AIDS (1993), Vol 7 (Suppl 2), y puede utilizarse S108 o SDA (amplificación del desplazamiento de la hebra) tal como se describe en Walker et al (1992) Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696. La reacción en cadena de la polimerasa se prefiere en particular debido a su simplicidad.

Cuando se utiliza un par de ácidos nucleicos apropiados de la invención en un PCR es conveniente detectar el producto mediante electroforesis de gel y contraste con bromuro de etidio. Como una alternativa en la detección del producto de la amplificación del ADN utilizando electroforesis de gel de agarosa y contraste del ADN con bromuro de etidio, es conveniente utilizar un oligonucleótido etiquetado capaz de hibridizar al ADN amplificado como un ensayo. Cuando la amplificación se realiza mediante un PCR el ensayo de oligonucleótido hibrida a la secuencia del entre el cebador (entre la plantilla) como se definió por las dos plantillas. La muestra de ensayo de oligonucleótido es preferiblemente de 10 a 50 nucleótidos de largo, de mayor preferencia entre 15 y 30 nucleótidos de largo. La muestra puede ser etiquetada con un radionuclido tal como 32P, 33P y 35S utilizando técnicas estándar o puede ser etiquetado con un tinte fluorescente. Cuando la muestra de oligonucleótido se etiqueta de manera fluorescente, el producto amplificado de ADN puede ser detectado en solución (ver por ejemplo Balaguer et al (1991) "Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent" Anal. Biochem. 195, 105-110 and Dilesare et al (1993) "A high-sensitivity electrochemiluminescence-based detection system for automated PCR product quantitation" BioTechniques 15, 152-157.

Los productos PCR pueden también ser detectados utilizando un ensayo que puede tener un par extintor de fluoroforo o puede ser fijada a un apoyo sólido o puede tener una lengüeta de biotina o puede ser detectado utilizando una combinación de un ensayo de captura y uno de detección.

Los pares extintores de fluoroforo están particularmente dotados para mediciones cuantitativas de reacciones PCR (ej. RTPCR). La polarización de fluorescencia utilizando una muestra de ensayo apropiada puede utilizarse también para detectar productos PCR.

En una realización preferida adicional, se mide el nivel de dicho proteína de VGSC. Preferiblemente, el nivel de dicha proteína se mide contactando la proteína con una molécula que enlace selectivamente al hNe-Na de VGSC.

La muestra que contiene la proteína derivada del paciente es una muestra de tejido.

La muestra que contiene la proteína derivada del paciente es convenientemente una muestra del tejido en el cual se sospecha existe o se ha encontrado cáncer. Estos métodos pueden utilizarse para cualquier cáncer, pero son particularmente efectivos con respecto al cáncer de próstata. Los métodos de obtención de muestras apropiadas se describen con respecto a métodos anteriores.

Los métodos de la invención que involucran la detección de dichas proteínas de VGSC son particularmente útiles en relación a muestras históricas tales como las que contienen secciones de muestras de tumores conservadas en parafina.

El nivel de dicha proteína de VGSC puede determinarse en una muestra en cualquier forma apropiada. El ejemplo 2 describe la detección de proteína de VGSC, incluyendo proteína hNe-Na de VGSC, en secciones de tejido de próstata humana.

Se prefiere en particular que la molécula que enlaza selectivamente al hNe-Na de VGSC sea un anticuerpo.

Los anticuerpos que enlazan selectivamente a VGSC's o a una forma o formas particulares de VGSC pueden ser hechos por ejemplo utilizando péptidos que se conservan respectivamente en todos o en un VGSC en particular o que abarcan las diferencias entre una forma de VGSC y las otras formas.

Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales apropiados pueden prepararse mediante técnicas conocidas, por ejemplo las presentadas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982), ambos incorporados aquí como referencia.

El nivel de dicho VGSC que es indicativo de cáncer o de potencial metastático puede definirse como el nivel incrementado presente en células cancerosas de próstata o metastáticas con respecto a células no cancerosas o no metastáticas de próstata. El nivel puede ser por ejemplo de al menos 1 1/2 veces mayor en células cancerosas o metastáticas o puede ser al menos de 2 a 3 veces mayor.

Como "la cantidad relativa de dicha proteína VGSC" se quiere decir la cantidad de proteína de VGSC por unidad de masa de tejido de muestra o por número de unidades de células de muestra comparadas a la cantidad de dicha proteína de VGSC por unidad de masa de tejido normal conocido o por número de unidades de células normales. La cantidad relativa puede determinarse utilizando cualquier método apropiado de cuantificación de proteína. En particular, se prefiere si se utilizan los anticuerpos y que la cantidad de dicha proteína de VGSC se determine utilizando métodos que incluyen mancha Blott occidental cuantitativo, ensayos inmunosorbentes vinculados a enzimas (ELISA) o inmunohistoquímica cuantitativa.

Se conocen por parte de la técnica otras técnicas para elevar y purificar los anticuerpos y cualquiera de ellas puede elegirse para lograr los preparados útiles en los métodos reivindicados en esta invención. En una realización preferida de la invención, los anticuerpos inmuno precipitarán dichas proteínas de VGSC de la solución así como reaccionaran con dichas proteínas de VGSC sobre inmuno manchas de gel de poliacrilamida. En otra realización preferida, los anticuerpos detectarán dichas proteínas de VGSC en secciones de tejido congelado conservado en parafina, utilizando técnicas inmuno citoquímicas.

Las realizaciones preferidas respecto a los métodos para la detección de dichas proteínas de VGSC incluyen ensayos inmunosorbentes vinculados a enzimas (ELISA), radioinmuno ensayos (RIA), ensayo inmunoradiométricos y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA), incluyendo ensayos sándwich utilizando anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Los ensayos sándwich a manera de ejemplo se describen por David et al en las Patentes de los EE.UU. Nos. 4 376 110 y 4 486 530 incorporadas aquí como referencia.

Se apreciaría que otras moléculas similares a los anticuerpos se utilicen en el método de la invención incluyendo, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos o derivados que retengan sus locaciones de enlace-antígeno, moléculas similares a anticuerpos sintéticos tales como los fragmentos Fv de cadena simple (ScFv) y anticuerpos de dominio (dAbs), y otras moléculas con motivos vinculantes de antígenos similares a los anticuerpos.

En una realización adicional el nivel del hNe-Na de VGSC se mide ensayando selectivamente su actividad en la muestra. La actividad del VGSC por ejemplo hNe-Na de VGSC en una muestra puede ensayarse disociando una biopsia en células independientes y en cultivo ensayando (i) el efecto de los bloqueadores de canal Na^{+} sobre su movilidad y (ii) detectando la actividad de canal Na^{+} mediante registro electrofisiológico.

Los métodos de diagnóstico preferidos de la invención incluyen lo que puede describirse a grandes rasgos como métodos "invasivos" y métodos "no invasivos". Los métodos invasivos incluyen por ejemplo, la toma de una biopsia para la detección de la expresión de canal Na^{+} mediante, por ejemplo, (a) aplicación inmunohistoquímica de un anticuerpo de secuencia específica, (b) PCR in situ en secciones de tejido, o (c) transcripción inversa (RT)-PCR de células epiteliales después de separarlas de la biopsia. Los métodos no invasivos incluyen la obtención de células derivadas de la próstata a partir de la orina, la eyaculación o la sangre, que puedan separarse por afinidad con el PSA ensayándolas respecto a la expresión de canal Na^{+} mediante PCR.

Otro aspecto adicional de la invención brinda el uso de un agente que es capaz de usarse en la determinación del nivel de la proteína hNe-Na de Na^{+} regulada mediante voltaje o el ácido nucleico en una muestra en la producción de un reactante para el diagnóstico del cáncer de próstata. En el que el agente es un ácido nucleico que hibridiza selectivamente al ácido nucleico del hNe-Na de VGSC o es una molécula que enlaza selectivamente a la proteína hNe-Na de VGSC, en la que la molécula ese un anticuerpo o fragmento o derivado de éste o una molécula tipo anticuerpo.

Los agentes tal como se definen son por tanto útiles en un método para el diagnóstico del cáncer.

Un aspecto adicional de la invención incluye un set de partes útil para el diagnóstico de cáncer de próstata, que comprende un agente que es capaz de usarse en la determinación del nivel de la proteína del hNe-Na de VGSC o ácido nucleico en una muestra. El agente puede ser un ácido nucleico que hibridiza selectivamente al ácido nucleico del hNe-Na de VGSC o el agente puede ser una molécula que enlace selectivamente a la proteína del hNe-Na del VGSC o el agente puede ser un agente útil en el ensayo selectivo de la actividad del hNe-Na del VGSC. El set también incluye medios para separar las células prostáticas epiteliales de una muestra, utilizando un anticuerpo especifico prostático.

Preferiblemente, el set incluye además una muestra de control que contiene ácido nucleico del hNe-Na de VGSC o proteína en el que la muestra de control puede ser un control negativo (que contiene un nivel de proteína de VGSC o ácido nucleico que no esté asociado con el cáncer o con un alto potencial metastático al cáncer). El set puede contener tanto controles positivos como negativos. El set puede contener de manera útil controles de la proteína del hNe-Na de VGSC o ácido nucleico que correspondan a diferentes cantidades de manera tal que pueda hacerse una curva de calibración.

El set incluye además medios para separar las células epiteliales prostáticas de una muestra para llevar a cabo el ensayo del VGSC. Preferiblemente, los medios para separar las células epiteliales prostáticas incluyen micro cuentas revestidas-anticuerpo-anti-PSA o columnas.

También brindamos un método para el tratamiento del cáncer que comprende el paso de administración al paciente de un agente que evita selectivamente la función del hNe-Na del Na^{+} regulado mediante voltaje.

Como será aparente a los expertos en la técnica, el término "evita" abarca la evitación parcial de la función, i.e., la reducción de la función. Por tanto, el efecto del agente puede parecer como reducción, preferiblemente reducción marcada, de la función observada

Por "un agente que evite selectivamente la función del hNe-Na de VGSC" incluimos agentes que (a) inhiban la expresión de dichos VGSC o (b) inhiban la actividad de dichos VGSC.

Los agentes que evitan la función de los hNe-Na de VGSC pueden incluir antagonistas del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (cuyo antagonista puede ser un anticuerpo reactivo con EGF o su receptor (EGFR) y antagonista de otros factores de crecimiento (por ejemplo factor de crecimiento de nervios) y hormonas (incluyendo andrógenos) (cuyo antagonista puede ser un anticuerpo de manera similar). Por tanto, un inhibidor EGF receptor de quinaza o un anticuerpo receptor EGF pueden inhibir la función de VGSC (que es predominantemente hNe-Na) en una línea celular de cáncer de próstata, tal como se discute en el Ejemplo 4. Estos agentes pueden actuar como agentes que evitan la expresión del hNe-Na de VGSC's.

Los antagonistas de EGF pueden incluir anticuerpos monoclonales (por ejemplo cetuximab [IMC-C225] dirigido contra el dominio del enlace extra-celular del receptor EGF; el Trastuzumab (un anticuerpo monoclonal que enlaza al receptor HER2 (receptor 2 humano EGF); un inhibidor EGF receptor de quinaza, por ejemplo OSI-774, PD182905, PKl-166. Cl-1033 o ZD1839.

Los agentes que evitan la expresión de dichos VGSC's incluyen pero no se limitan a agentes "de reacción inversa" y ribozimas.

Los oligonucleótidos "de reacción inversa" son ácidos nucleicos de hebra simple, que pueden enlazarse específicamente a una secuencia complementaria de ácido nucleico. Al enlazarse a la secuencia objetivo apropiada, se forma una dupla ARN-ARN, ADN-ADN o ARN-ADN. Estos ácidos nucleicos se denominan con frecuencia como "de reacción inversa" porque son complementarios al sentido o hebra codificadora del gen. Recientemente, se ha probado la posibilidad de formación de una hebra triple en la que el oligonucleótido está enlazado a una dupla de ADN. Se encontró que los oligonucleótidos podían reconocer secuencias en el pliegue mayor de la doble hélice del ADN. Por tanto se formaba una triple hélice. Esto sugiere que es posible sintetizar secuencias-moléculas específicas que se unen específicamente a los ADN's de doble hebra a través del reconocimiento de los sitios hidrógeno de enlace de brecha alta.

Al enlazarse al ácido nucleico objetivo, los oligonucleótidos anteriores pueden inhibir la función del ácido nucleico objetivo. Esto pudiera por ejemplo, ser un resultado del bloqueo de la transcripción, procesamiento, adición poli(A), replicación, traducción, o promoción de mecanismos inhibitorios celulares, tales como la promoción de degradaciones del ARN.

Los oligonucleótidos "de reacción inversa" se preparan en el laboratorio y entonces se introducen en las células, por ejemplo mediante microinyección o ingestión en las células a partir del medio de cultivo celular, o se expresan en células luego de transfección con plásmidos o retrovirus u otros vectores que porten un gen "de reacción inversa". Los oligonucleótidos "de reacción inversa" fueron descubiertos primeramente con el objeto de inhibir la replicación viral o expresión en cultivos celulares para el virus de sarcoma Rous, el virus de estomatitis vesicular, el virus de herpes simple tipo 1, el virus simio y el virus de la influenza. Desde entonces, la inhibición de la traducción de ARNm mediante oligonucleótidos "de reacción inversa" se ha estudiado extensivamente en sistemas libres de células incluyendo lisatos reticulocitos de conejo y extractos de germen de trigo. La inhibición de la función viral mediante oligonucleótidos de reacción inversa se ha demostrado in Vitro utilizando oligonucleótidos que eran complementarios al ARN del retrovirus del HIV SIDA (Goodchild, J. 1988 "Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Replication by Antisense Oligodeoxynucleotides", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(15), 5507-11). El estudio Goodchild mostró que los oligonucleótidos más efectivos eran los complementarios a la señal poli(A); también eran efectivos los dirigidos al extremo 5' del ARN, particularmente la tapa (tapado) y la región no traducida 5', aledaña al sitio de enlace de la plantilla y en el sitio de enlace de la plantilla. El tapado, región no traducida 5' y la señal poli(A) están dentro de la secuencia repetida en los extremos del retrovirus ARN (región R) y los oligonucleótidos complementarios a estos pueden enlazarse dos veces al ARN.

Los oligonucleótidos están sujetos a degradación o desactivación por parte de nucleasas celulares endógenas. Para enfrentar este problema, es posible utilizar oligonucleótidos modificados, por ejemplo, que tengan vínculos internucleótidos alterados, en los cuales los vínculos fosfo-diésteros que ocurren naturalmente han sido reemplazados con otro vínculo. Por ejemplo, Agrawal et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 mostró una inhibición incrementada en el cultivo de tejido de HIV-1 utilizando fosforamidatos y fosforo-tioatos de oligonucleótidos. Sarin et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451demostró inhibición incrementada del HIV-1 utilizando metilfosfonatos de oligonucleótidos.

Agrawal et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794 mostró inhibición de la replicación del HIV-1 tanto en cultivos celulares de infección temprana como crónica, utilizando fosforo-tioatos de nucleótidos de secuencia específica. Leither et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 reporta inhibición en replicación en cultivo de tejido con virus de influenza mediante fosforo-tioatos de oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos que tienen enlaces artificiales se han mostrado resistentes a la degradación in vitro. Por ejemplo Shaw et al (1991) in Nucleic Acids Res. 19, 747-750, reporta que aquellos oligonucleótidos de no haber sido modificados, se hacen más resistentes a las nucleasas in vivo cuando están bloqueados en el extremo 3' mediante ciertas estructuras de tapado y que los fosforo-tioatos de nucleótidos no cerrados no se degradan in vivo.

Agrawal and Tang (1990) Tetrahedron Letters 31, 7541-7544, brindan una descripción del enfoque H-fosfonato a la síntesis de los fosforo-tioatos de oligonucleótidos, éstas enseñanzas se incorporan aquí como referencia. Las síntesis de metilfosfonatos, fosforoditioatos, fosforamidatos oligonucleósidos, ésteres de fosfato, fosforamidatos puenteados y fosforo-tioatos puente, son conocidos por parte de la técnica. Ver por ejemplo Agrawal and Goodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539; Nielsen et al (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager et al (1988) Biochemistry 27, 7237; Uznanski et al (1987) Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517; Crosstick and Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405, cuyas enseñanzas se incorporan aquí cómo referencia. También son posibles otros métodos para la síntesis o producción. En una realización preferida el oligonucleótido es un ácido desoxirribonucleico (ADN), aunque las secuencias del ácido ribonucleico (ARN) pueden también sintetizarse y aplicarse.

Los oligonucleótidos útiles en los métodos brindados se diseñan preferiblemente para resistir la degradación mediante enzimas nucleóticas endógenas. La degradación in vivo de oligonucleótidos produce ruptura de los productos oligonucleótidos de longitud reducida. Tales productos de ruptura son más susceptibles de involucrarse en hibridización no específica y son menos proclives a ser efectivos, en relación a sus contrapartes de longitud plena. Por tanto, se desea utilizar oligonucleótidos que sean resistentes a la degradación en el cuerpo y que sean capaces de llegar a las células objetivo. Los oligonucleótidos presentes pueden considerarse más resistentes a la degradación in vivo mediante sustitución de uno o más vínculos internucleótidos artificiales internos respecto a los vínculos de fosfo-diésteres nativos, por ejemplo, reemplazando el fosfato con azufre en el vínculo. Los ejemplos de vínculos que pueden utilizarse incluyen fosforo-tioatos, metilfosfonatos, sulfonas, sulfatos, cetilos, fosforoditioatos, diversos fosforamidatos, ésteres de fosfato, fosforo-tioatos puenteados y fosforoamidatos puenteados. Tales ejemplos son ilustrativos y no limitantes, ya que los vínculos internucleótidos son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Cohen, (1990) Trends in Biotechnology. Es bien conocida en la técnica la síntesis de oligonucleótidos que tienen uno o más de estos vínculos sustituidos para los internucleótidos de fosfo-diésteres, incluyendo los recorridos sintéticos para la producción de oligonucleótidos que tienen vínculos internucleótidos mezclados.

Los oligonucleótidos pueden hacerse resistentes a la extensión por parte de enzimas endógenas mediante "tapado" o incorporación de grupos similares en los nucleótidos terminales 5' o 3'. El AminoLink II^{TM} de Applied BioSystems Inc, Foster City, CA es un reactante comercialmente disponible para el tapado. Los métodos de tapado se describen por ejemplo por Shaw et al (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750 y por Agrawal et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(17), 7595-7599, cuyas enseñanzas se incorporan aquí como referencia.

Un método adicional de hacer a los oligonucleótidos resistentes ante ataque de la nucleasa consiste en que sean "autoestabilizados" tal como describe Tang et al (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735, incorporado aquí como referencia. Los oligonucleótidos autoestabilizados tienen estructuras de lazo en forma de presilla en sus extremos 3' y muestran una resistencia incrementada a la degradación mediante la fosfodiesterasa del veneno de serpiente, a la polimerasa I de ADN y al suero fetal de bovino. La región autoestabilizada del oligonucleótido no interfiere en la hibridización con ácidos nucleicos complementarios y los estudios farmacocinéticos de estabilidad en ratones han mostrado una persistencia incrementada in vivo de los oligonucleótidos autoestabilizados con respecto a sus contrapartes lineales.

De acuerdo con el método brindado, la especificidad enlazadora inherente de los oligonucleótidos de reacción inversa característica del apareamiento base se enriquece limitando la disponibilidad del compuesto de reacción inversa respecto a la intención de su posición in vivo, permitiendo el uso de dosis menores, minimizando así los efectos sistémicos. Por tanto, los oligonucleótidos se aplican localmente para lograr el efecto deseado. La concentración de los oligonucleótidos en la posición deseada es mucho mayor en comparación con el caso en que los oligonucleótidos fueran administrados sistémicamente y el efecto terapéutico pueda alcanzarse utilizando una cantidad total significativamente menor. La alta concentración local de oligonucleótidos enriquece la penetración de las células objetivos y bloquea efectivamente la traducción de las secuencias del ácido nucleico objetivo.

Los oligonucleótidos pueden ser enviados a la posición a través de medios apropiados para la administración localizada de un medicamento. Por ejemplo, puede inyectarse directamente en el lugar una solución de oligonucleótidos o puede administrarse mediante infusión utilizando una bomba de infusión. Los oligonucleótidos también pueden incorporarse dentro de un dispositivo implantable que al ser colocado en el sitio deseado, permita que los oligonucleótidos se liberen hacia la posición circundante.

Los oligonucleótidos pueden administrarse vía un hidrogel. El hidrogel es no inflamatorio y biodegradable. Muchos materiales de esta naturaleza son ahora conocidos, incluyendo los hechos a partir de polímeros naturales y sintéticos. En una realización preferida, el método explota un hidrogel que es líquido por debajo de la temperatura corporal pero se gelatiniza para formar un hidrogel semisólido que mantiene la forma a o cerca de la temperatura corporal. Los hidrogeles preferidos son polímeros en unidades de repetición de óxido de etileno óxido de propileno. Las propiedades del polímero dependen del peso molecular del polímero y del porcentaje relativo de óxido de polietileno y óxido de polipropileno en el polímero. Los hidrogeles preferidos contienen de 10 a 80% por peso de óxido de etileno y de alrededor de 20 a 90% por peso de óxido de propileno. Un hidrogel de particular preferencia contiene alrededor del 70% de óxido de polietileno y 30% de óxido de polipropileno. Los hidrogeles que pueden utilizarse se suministran por ejemplo por BASF Corp, Parsippany, N.J. bajo el nombre comercial PluronicR.

En esta realización el hidrogel se enfría a un estado líquido y los oligonucleótidos se mezclan con el líquido a una concentración de alrededor de 1 mg de oligonucleótido por gramo de hidrogel. La mezcla resultante entonces se aplica a la superficie a tratar, por ejemplo rociando o pintando durante la cirugía o utilizando un catéter o procedimientos endoscópicos.

Los oligonucleótidos pueden administrarse mediante otros implantes comercialmente disponibles o descritos en la literatura científica, incluyendo liposomas, microcápsulas y dispositivos implantables. Por ejemplos, los implantes hechos de materiales biodegradables tales como polianhidridos, poliortoésteres, ácido poliláctico y ácido poliglicóligco y sus copolímeros, colágenos y polímeros de proteínas o materiales no biodegradables tales como el acetato de etilen-vinilo (EVAc), acetato de polivinilo, alcohol etilen-vinílico y derivados de éstos pueden utilizarse para administrar los oligonucleótidos localmente. Los oligonucleótidos pueden incorporarse al material a medida que se polimeriza o solidifica, utilizando técnicas de fusión o de evaporación de solvente, o mezcladas mecánicamente con el material. En una realización, los oligonucleótidos se mezclan con o se aplican en forma de recubrimiento en los dispositivos implantables tales como cuentas de sílice revestidas con dextrana, reductores o catéteres. Los portadores poliméricos de nanopartículas biodegradables pueden utilizarse también (Mader (1998) Radiol. Oncol. 32,
89-94).

La dosis de oligonucleótidos depende del tamaño de los oligonucleótidos y del propósito para el que se administra. En general, el rango se calcula en base al área superficial del tejido a tratar. La dosis efectiva de oligonucleótido depende en cierta medida de la longitud y composición química del oligonucleótido pero está generalmente en el rango de alrededor de 30 a 3 000 mg por centímetro cuadrado de área superficial de tejido.

Los oligonucleótidos pueden administrarse al paciente sistémicamente tanto con propósitos terapéuticos como profilácticos. Los oligonucleótidos pueden administrarse mediante cualquier método efectivo, por ejemplo, vía parenteral (ej. Intravenosa, subcutánea, intramuscular) o por medio oral, nasal u otro que permita que los oligonucleótidos accedan y circulen por el torrente sanguíneo del paciente. Los oligonucleótidos administrados sistémicamente se administran preferiblemente en adición a oligonucleótidos administrados localmente, pero también son de utilidad en ausencia de la administración local. La dosis en el rango de alrededor de 0,1 a 1,0 gramos por administración a un humano adulto será generalmente efectiva con este propósito.

Se aprecia que sería oportuno tener a la próstata como objeto de enfoque de los oligonucleótidos de reacción inversa. Esto puede lograrse administrando los oligonucleótidos de reacción inversa a la próstata, o puede lograrse utilizando oligonucleótidos de reacción inversa que estén asociados con una molécula que dirige selectivamente el oligonucleótido de reacción inversa a la próstata. Por ejemplo, el oligonucleótido de reacción inversa puede estar asociado con un anticuerpo o molécula tipo anticuerpo que enlace selectivamente un antígeno relacionado con la próstata tal como el PSA. Por "asociado con" queremos decir que el oligonucleótido de reacción inversa y la entidad direccional hacia la próstata están asociadas de manera tal que la entidad direccional hacia la próstata es capaz de dirigir el oligonucleótido de reacción inversa a las células prostáticas.

Se aprecia que los agentes de reacción inversa también incluyen moléculas mayores, por ejemplo de alrededor de cien a varios cientos de bases que enlazan a dicho ARNm de VGSC o genes y evita sustancialmente la expresión de dicho ARNm de VGSC o genes y evita sustancialmente la expresión de dicha proteína de VGSC. Por lo tanto la expresión de una molécula de reacción inversa que sea sustancialmente complementaria a dicho ARNm de VGSC se considera como parte del método provisto.

Por tanto, en este enfoque, los oligonucleótidos sintéticos con secuencia de reacción inversa a regiones específicas de (i) canales de hNe-Na (ii) de VGSC generalmente se administran para bloquear la actividad canalizadora. Los detalles de los oligonucleótidos sintéticos en particular se presentan en el ejemplo 2. Es meritorio que la tecnología de oligonucleótidos de reacción inversa ya ha sido utilizada para manipular canales de potasio in Vitro (Roy et al (1996) Glia 18, 174-188) y VGSC's in vitro (Biochem Biophys Res Comm (1997) 234, 235-241) y en el bloqueo de dolor neuropático (Lai et al (1999) "Blockade of neuropathic pain by antisense targeting of tetrodotoxin-resistant sodium channels in sensory neurons" Methods in Enzymol 314, 201-213).

Un método adicional para bloquear dicha actividad de VGSC incluye la supresión dominante negativa. En esta técnica, un producto mutado de gen de VGSC suprime o elimina la actividad del producto correspondiente del gen normal cuando los dos se coexpresan. En el caso de los canales de potasio activados mediante voltaje que comprenden 4 subunidades alfa, tal enfoque haciendo uso de un producto de gen altamente truncado, ha sido utilizado exitosamente para suprimir la expresión funcional de los VGPCs in Vitro (Tu et al (1995) Biophys. J. 68, 147-156) e in vivo (London et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2926-2931).. La subunidad truncada es capaz de enlazar a otras subunidades VGPC pero no contiene las identificaciones requeridas para el funcionamiento de canal. Por tanto, la actividad del VGPC "combinado" se bloquea. Se ha detectado un número de subunidades canalizadoras empalmadas alternativamente que ocurren de manera natural y que pueden funcionar para suprimir la actividad de VGPC mediante un mecanismo similar in vivo (Baumann et al (1987) EMBO J. 6, 3419-3429; Kamb et al (1988) Neuron 1, 421-430; y Pongs et al (1988) EMBO J. 7, 1087-1096). Creemos que los VGSC pueden ser suprimidos de manera similar interfiriendo con la formación funcional de canal. Aunque los VGSC se forman a partir de una sola subunidad alfa (que incluye cuatro dominios funcionales), los estudios recientes han demostrado la expresión específica (durante el desarrollo en humanos, ratones y peces) de proteínas VGSC truncadas que poseen solamente dos dominios que pueden funcionar de una manera dominante negativa para controlar la actividad de VGSC (Plummer et al (1997) J. Biol. Chem. 272, 24008-24015; y Oh & Waxman (1998) NeuroReport 9, 1267-1271).

Las moléculas mayores pueden expresarse a partir de cualquier composición genética apropiada tal como se describe más adelante, administrándola al paciente. Típicamente, la composición genética que expresa la molécula de reacción inversa comprende al menos una porción de dicho ADNc de VGSC o gen vinculado operativamente a un promotor que puede expresar la molécula de reacción inversa en la célula, preferiblemente célula de próstata, que sea o pueda hacerse cancerosa.

Aunque la composición genética puede ser ADN o ARN se prefiere si es ADN.

La composición genética se adapta preferiblemente para el suministro a la célula humana.

Los medios y métodos para la introducción de una composición genética en una célula en un cuerpo animal son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las composiciones aquí presentadas pueden introducirse en las células tumorales mediante cualquier método conveniente, por ejemplo métodos que involucran retrovirus, de manera que la composición se inserta dentro del genoma de la célula tumoral. Por ejemplo en Kuriyama et al (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510 se administran retrovirus purificados. Los retrovirus brindan un medio potencial para infectar selectivamente las células de cáncer porque ellos pueden integrarse solamente dentro del genoma de división de células; la mayoría de las células normales que rodean a los cánceres están en una etapa de quietud, no receptiva de crecimiento celular, o al menos, se dividen con mucho menos rapidez que las células tumorales. Las composiciones retrovirales de ADN que codifican a dichos agentes de reacción inversa pueden hacerse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Para producir retrovirus activos a partir de tal composición es usual el uso de una línea de células de empaque ecotrópica psi2 en medio de Dulbecco modificado de Tagle (DMEM) que contiene 10% de suero fetal de becerro (FCS). La transfección de la línea de célula es conveniente mediante coprecipitación de fosfato de calcio, y se eligen los transformadores estables por adición de G418 a una concentración final de 1 mg/m (asumiendo que la composición retroviral contiene un gen peor). Las colonias independientes se aíslan y expanden y se retira el cultivo flotante, filtrado a través de un filtro de poro 0,45 mm, almacenándolo a -70º. Para la introducción del retrovirus dentro de las células tumorales, es conveniente inyectar directamente el material retroviral flotante al cual se adicionan 10 mg/ml de Polybrene. Para tumores que exceden de 1,0 mm. en diámetro, es apropiado inyectar entre 0,1 ml y 1 ml del material flotante retroviral, preferiblemente 0,5 ml.

De manera alternativa tal como describe Culver et al (1992) Science 256, 1550-1552, las células que producen retrovirus se inyectan dentro del tumor. Las células que producen retrovirus así introducidas se transforman para producir activamente partículas retrovirales vectoriales de manera que ocurran producciones continuas del vector dentro de la masa tumoral in situ. Por tanto, las células tumorales que proliferan, pueden translucirse efectivamente in vivo al mezclarlas con células retrovirales que producen vectores.

Los retrovirus objetivo también están disponibles para su uso en la invención; por ejemplo, las secuencias que le confieren afinidades de enlace específicas pueden ser transformados en genes virales preexistentes, (ver Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 para una revisión de este y otros vectores objetivo para la terapia de genes.)

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Otros métodos se refieren a un suministro simple del compuesto a la célula para su expresión allí por un período de tiempo limitado o, siguiendo la integración al genoma durante un tiempo más prolongado. Un ejemplo de éste último enfoque incluye liposomas (preferiblemente teniendo como objetivo células tumorales) (Nässander et al (1992), Cancer Res. 52, 646-653).

Los inmunoliposomas (liposomas dirigidos a anticuerpos) son especialmente útiles en la identificación de tipos de células cancerosas objetivo que sobreexpresan una proteína de superficie celular para la cual hay anticuerpos disponibles. Por ejemplo, los inmunoliposomas pueden ser identificados como objetivo mediante anticuerpos que enlazan a dichos VGSC tal como se presenta más adelante. Para la preparación de inmunoliposomas se sintetiza (MPB-PE (N-[4[(p-maleimidofenil)butiril]-fosfatidil-etanolamina) de acuerdo al método de Martin & Papahadjpopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257. 286-288. El MPB-PE se incorpora a las bicapas liposomales para permitir un acople covalente del anticuerpo o un fragmento del mismo a la superficie liposomal. El liposoma se carga convenientemente con el ADN u otro compuesto genético de la invención para suministro a las células objetivo, por ejemplo, formando dichos liposomas en una solución del ADN u otro compuesto genético seguido de extrusión secuenciada a través de filtros de membrana de policarbonato con poros de 0,6 mm y 0,2 mm bajo presiones de nitrógeno de hasta 0,8 M\mua. Luego de la extrusión el compuesto del ADN recolectado se separa del compuesto de ADN libre mediante ultracentrifugación a 80 000x g durante 45 min. Los liposomas MPB-PE recién preparados en búfer desoxigenado se mezclan con los anticuerpos recién preparados (o sus fragmentos) y se llevan a cabo las reacciones de acople en una atmósfera de nitrógeno a 4ºC bajo una rotación constante de extremo sobre extremo durante la noche. Los inmunoliposomas se separan de los anticuerpos conjugados mediante ultracentrifugación a 80 000 x g durante 45 min. Los inmunoliposomas pueden inyectarse intraperitoneal o directamente en el tumor.

Los otros métodos de suministro incluyen los adenovirus que portan ADN externo vía un puente polilisina-anticuerpo (ver Curiel Prog. Med. Virol. 40, 1-18) y conjugados de policatión-transferina como portadores (Wagner et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414). En el primero de estos métodos se forma un complejo policatión-anticuerpo con el compuesto de ADN u otro compuesto genético aquí presentado, en el que el anticuerpo es específico para un adenovirus de tipo silvestre o una variante de adenovirus en la que se ha introducido un nuevo epítope que enlaza al anticuerpo. El resto del policatión enlaza al ADN vía interacciones electrostáticas con el espinazo del fosfato. El adenovirus, debido a que contiene fibra no alterada y proteínas de pentona se internaliza dentro de la célula e introduce en la célula consigo el compuesto de ADN de la invención. Se prefiere que el policatión sea polilisina.

El AND también puede suministrarse mediante adenovirus en los que está presente dentro de la partícula de adenovirus, por ejemplo tal como se describe más adelante.

En el segundo de estos métodos, se emplea un sistema de suministro de ácido nucleico de alta eficiencia que utiliza endocitosis mediante receptor para llevar las macromoléculas de ADN a las células. Esto se logra conjugando la transferina de proteína de transporte de hierro a los policationes para enlazar los ácidos nucleicos. La transferina humana o su homólogo avícola, el conalbúmina, o combinaciones de éste se vinculan covalentemente a la protamina de proteína de enlace simple de ADN o a las polilisinas de diversos tamaños a través de vínculo de bisulfuro. Estas moléculas modificadas de transferina mantienen su capacidad para enlazar su receptor semejante y para mediar el transporte eficiente de hierro a la célula. Las moléculas de policatión de transferina forman complejos electroforéticamente estables con constructores de ADN u otros constructores genéticos aquí presentados independientes del tamaño del ácido nucleico (de oligonucleótidos cortas a ADN de 21 pares kilobase). Cuando se suministran a las células tumorales los complejos de policatión de transferina y los constructores de ADN u otros constructores genéticos aquí presentados, se espera una expresión de alto nivel del compuesto en las células.

También pueden utilizarse los constructores de alta eficiencia en el suministro de ADN mediante receptor u otros constructores genéticos de los aquí presentados, que utilizan la actividad de disrupción del endosoma de las partículas de adenovirus defectuosas o desactivadas químicamente producidas por los métodos de Cotten et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098. Este enfoque parece descansar en el hecho de que los adenovirus se adaptan para permitir la liberación de su ADN de un endosoma sin el paso a través del lisosoma y, en presencia de por ejemplo, transferina vinculada al compuesto de ADN u otro compuesto genético aquí presentado, el compuesto es asimilado por la célula por la misma ruta que la partícula del adenovirus.

Este enfoque tiene las ventajas de que no hay necesidad de utilizar constructores retrovirales complejos, no hay modificación permanente del genoma como ocurre con la infección retroviral y el sistema de expresión objetivo se acopla con un sistema de suministro objetivo, reduciendo por tanto la toxicidad a otros tipos de células.

También puede resultar apropiado el rociado local de un tumor durante un periodo de tiempo, con un vehículo de suministro aceptable que incluya el compuesto genético; adicionalmente o de manera alternativa el vehículo de suministro o compuesto genético puede inyectarse directamente en tumores asequibles.

Se aprecia que el "ADN desnudo" y el ADN complejizado con lípidos neutrales y catiónicos puede ser útil en la introducción del ADN de la invención en las células de un paciente a tratar. Los enfoques no virales a la terapia de genes se describen en Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 1129-1144.

También son conocidos otros sistemas alternativos de suministro dirigido (objetivo) tales como el sistema de adenovirus modificado descrito en la WO 94/10 323 en la que, típicamente, el ADN se transporta dentro del adenovirus, o partículas similares al adenovirus. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668 describe la modificación de adenovirus para adicionar una porción selectiva de célula a una proteína de fibra. Los adenoviruses mutantes que replican selectivamente en células tumorales humanas p53-deficientes, tales como las descritas en Bischoff et al (1996) Science 274, 373-376, también son útiles para el suministro de los constructores genéticos a la célula, aquí presentados. Por tanto, se aprecia que aportamos una partícula de virus o similar que comprende un compuesto genético tal como se presenta. Otros virus apropiados o partículas similares a virus incluyen al HSV, AAV, vaccinia y al parvovirus.

El agente que evita selectivamente la función de los hNe-Na de VGSC puede ser una ribozima capaz de penetrar los ARN o ADN de VGSC objetivo. Un gen que expresa dicha ribozima puede ser administrado sustancialmente de la misma manera y utilizando sustancialmente los mismos vehículos que en el caso de las moléculas de reacción inversa.

Las ribozimas que pueden codificarse en los genomas de los virus o partículas similares a éstos aquí presentadas se describen en las patentes Cech and Herschlag "Penetración en localizaciones específicas de ADN de hebra simple" EE.UU. 5 180 818; Altman et al "Penetración de ARN objetivo por ARNasa P" EE.UU. 5168 053; Cantin et al "Penetración por ribozima de HIV-1 ARN" EE.UU. 5 149 796; Cech et al "Endoribolucleasas de ribozimas de restricción del ARN y métodos" EE.UU. 5 116 742; Been et al "Endonucleasas de restricción del ARN, polimerasas de ribozimas, defosforilazas y métodos", EE.UU. 5 093 246; y Been et al "Endoribonucleasas de restricción del ARN, polimerasas de ribozimas, defosforilazas y métodos; penetración de ARN de hebra simple en puntos específicos mediante transesterificación", EE.UU. 4 987 071), todas incorporadas aquí como referencia.

Se aprecia que puede ser aconsejable que las moléculas de restricción inversa o ribozimas se expresen a partir de un elemento promotor celular prostático específico. El antígeno prostático específico (PSA) es uno de los mayores constituyentes de proteína de la secreción prostática humana. Se ha convertido en marcador útil para la detección y monitoreo del cáncer de próstata. El gen que codifica al PSA y a la región de su promotor que dirige la expresión específica de próstata del PSA se ha descrito por (Lundwall (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, 1151-1159; Riegman et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 159, 95-102; Brawer (1991) Acta Oncol.. 30, 161-168). Por tanto, apropiadamente el promotor es el promotor PSA.

Los constructores genéticos aquí expuestos pueden prepararse utilizando los métodos bien conocidos en la técnica.

Una variedad de métodos ha sido desarrollada para vincular operativamente los ADN a través de las terminaciones cohesivas complementarias. Por ejemplo, los tractos complementarios de homopolímeros pueden adicionarse al segmento de ADN a ser insertado al vector ADN. El vector y el segmento de ADN se unen entonces mediante enlace de hidrógeno entre los extremos homopoliméricos complementarios para formar moléculas recombinantes de ADN.

Los vinculantes sintéticos que contienen un sitio o más de restricción brindan un método alternativo de unión del segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado mediante digestión de endonucleasa de restricción tal como se describió anteriormente, se trata con polimerasa ADN T4 bactectoriófaga o E.coli ADN polimerasa I, enzimas que eliminan las terminales sobresalientes 3'-de hebra simple con sus actividades 3'-5'-exonucleóticas y llenan los extremos 3' con sus actividades polimerizantes.

La combinación de estas actividades por tanto genera segmentos de ADN de terminación brusca (áspera). Los extremos de terminación brusca se incuban entonces con un gran exceso molar de moléculas vinculantes en presencia de una enzima capaz de catalizar la ligazón de las moléculas de segmentos de terminación brusca, tal como la ligasa bacteriófaga ADN T4. Por tanto, los productos de la reacción son segmentos de ADN que portan secuencias poliméricas vinculantes en sus extremos. Estos segmentos de ADN entonces se penetran con la enzima de restricción apropiada y se ligan a un vector de expresión que se haya penetrado con una enzima que produce terminales compatibles con las del segmento de ADN.

Los vinculantes sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasas de restricción están disponibles en numerosas fuentes que incluyen a International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.

Como forma adecuada de modificar la codificación del ADN del polipéptido de la invención se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa tal como se presenta en Saiki et al (1988) Science 239, 487-491.

En este método el ADN a ser amplificado enzimáticamente se flanquea por dos plantillas específicas de oligonucleótidos que se incorporan por sí mismos al ADN amplificado. Dichas plantillas específicas pueden contener sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción que pueden utilizarse para la clonación en vectores de expresión utilizando métodos conocidos en la técnica. También aportamos una célula receptora transformada con un compuesto genético (preferiblemente compuesto de ADN) de la presente invención. La célula receptora puede ser o procariótica o eucariótica. Las células bacterianas constituyen células procarióticas receptoras preferidas y típicamente consisten en un filtrado de E. coli tal como por ejemplo, los filtrados DH5 de E. coli disponibles en Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, y RR1 disponibles en el American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, D,USA(NoATCC31343). Las células receptoras eucarióticas preferidas incluyen el fermento de levadura y las células de mamíferos, preferiblemente células de vertebrados tales como las ratones, ratas, monos de líneas celulares fibroblásticas humanas. Las células receptoras de fermentos incluyen YPH499, YPH500 y YPH501 generalmente disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Las células receptoras de mamífero preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles en ATCC como CCl61, células NIH de embrión de ratón suizo NIH/3T3 disponibles en ATCC como CRL 1658 y células de riñón de mono COS-1 disponibles en ATCC como CRL 1650.

La transformación de receptores celulares apropiados con un compuesto de ADN aquí expuesto se logra mediante método bien conocidos y depende típicamente del tipo de vector utilizado. Respecto a la transformación de células receptoras procarióticas, ver por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Las transformación de células de fermentos se describe en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. El método de Beggs (1978) Nature 275, 104-109 también es útil. Respecto a células de vertebrados, los reactantes útiles en la transfección de tales células, por ejemplo el fosfato de calcio y la dextrana-DAE o formulaciones de liposoma, están disponibles en Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA.

La electroporación también es útil para la transformación de células y es bien conocida en la técnica para la transformación de fermentos, células bacterianas y células de vertebrados.

Por ejemplo, muchas especies bacterianas pueden transformarse mediante métodos descritos en Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646 incorporado aquí como referencia. El mayor número de transformadores se recupera consistentemente siguiendo la electroporación de la mezcla celular de ADN suspendida en 2,5X PEB utilizando 6 250V por cm. a 25 mFD.

Los métodos para la transformación de fermentos mediante electroporación se presentan en Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182.

Las células satisfactoriamente transformadas, por ejemplo células que contienen un compuesto de ADN tal como se presenta aquí, pueden ser identificadas mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un compuesto de expresión de los aquí presentados pueden cultivarse para producir la molécula tal como aquí se define. Las células pueden ser cultivadas y lisadas y su contenido de ADN examinado buscando la presencia de ADN utilizando un método tal como los descritos por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent et al (1985) Biotech. 3, 208. De manera alternativa la presencia de la molécula, por ejemplo la proteína, en la material flotante puede detectarse utilizando los anticuerpos descritos a continuación.

Adicionalmente para ensayar directamente buscando la presencia del ADN recombinante, la transformación exitosa puede confirmarse mediante métodos inmunológicos bien conocidos en los que el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las células transformadas exitosamente con un vector de expresión producen proteínas que despliegan una antigenicidad adecuada. Las muestras de células que se sospecha han sido transformadas se cultivan y ensayan en busca de la proteína utilizando anticuerpos apropiados.

Por tanto, en adición a las propias células receptoras transformadas, también brindamos un cultivo de aquellas células, preferibles un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo) o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal en un medio nutriente.

Cuando el compuesto genético es un compuesto plásmido de ADN éste puede purificarse. El compuesto de ADN purificado aquí está purificado a partir de la célula receptora utilizando métodos bien conocidos.

Por ejemplo, el vector plásmido de ADN puede prepararse a gran escala a partir de lisatos divididos mediante agregación en un gradiente CsC1 de acuerdo a los métodos de Clewell&Helinski (1970) Biochemistry 9, 4428-4440 y Clewell (1972) J. Bacteriol. 110, 667-676. El ADN plásmido extraído de esta manera puede liberarse del CsCl mediante diálisis contra búfer estéril, libre de pirógeno a través de entubamiento Visking o mediante cromatografía de tamizado (exclusión por tamaño).

De manera alternativa el ADN plásmido puede purificarse a partir de lisatos aclarados utilizando cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo suministra por Qiagen. La cromatografía de columna de hidroxiapatita puede utilizarse también.

También brindamos el uso de un agente que evita selectivamente la función de canal de hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje en la producción de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

También brindamos un compuesto genético que comprende un ácido nucleico que codifica a una molécula capaz de evitar la función de canal de hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje expresada en una célula.

Como se apuntó anteriormente, el compuesto genético puede ser ARN o ADN. La molécula capaz de evitar la función del hNe-Na del VGSC es convenientemente una molécula de reacción inversa o una ribozima tal como se presentó anteriormente.

Los constructores genéticos se adaptan para su suministro a una célula humana, en particular a una célula cancerosa o en la que pueda ocurrir cáncer y más particularmente el compuesto genético se adapta para su suministro a una célula prostática. Los constructores genéticos de esta presentación incluyen los sistemas virales y no virales antes descritos.

Apropiadamente, la molécula es capaz de evitar la función del VGSC, por ejemplo de hNe-Na de VGSC, tal como una ribozima o una molécula de reacción inversa, que se expresa selectivamente en una célula cancerosa. Por ejemplo, la expresión de dicha molécula mediante el compuesto genético puede ser vía un promotor de la célula cancerosa o selector de tejido, que en el caso del cáncer de próstata puede ser un promotor PSA o cualquier otro promotor selectivo de próstata.

También brindamos los constructores genéticos para uso en medicina. Por tanto, los constructores genéticos se empacan y presentan para su uso médico.

También brindamos una composición farmacéutica que comprende un compuesto genético aquí brindado y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con el compuesto genético aquí aportado y no destructivos respecto a sus recipientes. Típicamente, los portadores serán agua o solución salina estéril y libre de pirógeno.

Para eliminar cualquier duda, los constructores genéticos aquí presentados específicamente incluyen partículas de virus o similares a éstos.

Otro aspecto de la invención brinda un método de identificación de un compuesto que puede ser útil en el tratamiento del cáncer de próstata y que inhibe selectivamente un canal hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje, comprendiendo el método (a) el contacto con un compuesto de prueba con dichos canales de Na^{+} regulado mediante voltaje y la determinación de si dicho compuesto es inhibitorio; (b) el contacto del compuesto de prueba con otros canales de Na^{+} de regulación voltaje y la determinación de si dicho compuesto es inhibitorio; y (c) la selección de un compuesto que es sustancialmente inhibitorio en (a) pero no es sustancialmente inhibitorio en (b).

Típicamente, se identificará un rango de compuestos, incluyendo agentes farmacológicos con efectos conocidos sobre los canales de Na^{+} (por ejemplo compuestos con efectos similares a la terodotoxina) o fisiológicos (por ejemplo factores de crecimiento hormonal, por ejemplo factores de crecimiento epidérmico o andrógenos), respecto a su efectividad en un número de ensayos. Los formatos apropiados del ensayo incluyen registro electrofisiológico a partir de células en cultivos a largo plazo como líneas de células y cultivos de células a corto plazo disociadas de biopsias (ver, por ejemplo Grimes & Djamgoz (1998) J. Cell Physiol. 175, 50-58); el registro electrofisiológico de oocitos que expresan funcionalmente el recombinante de dicho VGSC seguido de inyección de ARNcs (ver por ejemplo Fraser et al (1993) In Electrophysiology, A practical approach (D. Willis, ed) IRL Press); e in Vitro (Boyden chamber) ensayos de invasión (ver por ejemplo, Grimes et al (1995) FEBS Lett 369, 290-294; y Smith et al (1998) FEBS Lett. 423, 19-24). Los ensayos apropiados pueden incluir también la medición de efectos sobre la secreción de PSA de líneas celulares de cáncer de próstata, por ejemplo tal como describe Abdul & Hoosein (2001) Anticancer Res 21, 2045-2048.

También aportamos los métodos mediante los cuales el tratamiento está dirigido a células cancerosas identificando células que expresen dicho VGSC, tal como se apuntó anteriormente respecto al acceso a dichas células por parte de constructores genéticos. Por ejemplo, los anticuerpos de dichos VGSC (VGSC-Abs) conjugados con una tintura pueden aplicarse a la próstata in vivo (eg Yasmuch et al (1993) "Antibody targeted photolysis" Critical Review Revue Ther. Drug Carrier System 10, 197-252; Pogrebniak et al (1993) "Targetted phototherapy with sensitizer-monoclonal antibody conjugate and light" Surgical Onoclogy 2, 31-42). La glándula es irradiada entonces localmente con una longitud de onda de luz/láser que corresponde al pico de absorción de la tintura "anexada". La absorción de la energía de la luz por parte de la tintura conlleva a un calentamiento local y a la muerte celular. De esta forma, solo las células etiquetadas (esto es, metastáticas) serán afectadas. Los VGSC-Abs etiquetados con las tinturas siguientes pueden utilizarse: fluoresceína (Pelegrin et al (1991) "Antibody fluorescein conjugates for photoimmunodiagnosis of human colon-carcinoma in nude-mice" Cancer 67, 2529-2537); rodamina (Haghighat et al (1992) "Laser-dyes for experimental phototherapy of human cancer - comparison of 3 rhodamines" Laryngoscope 102, 81-87; cianinas (Folli et al (1994) "Antibody-indocyanin conjugates for immunophotodetection of human squamous-cell carcinoma in nude-mice" Cancer Research 54, 2643-2649; Lipshutz et al (1994) "Evaluation of 4 new carbocyanine dyes for photodynamic therapy with lasers" Laryngoscope 104, 996-1002; Haddad et al (1998) "In vitro and in vivo effects of photodynamic therapy on murine malignant melanoma" Annals of Surgical Oncology 5, 241-247).

Por tanto, también aportamos un compuesto que comprende una porción que enlaza selectivamente a la proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje y a una porción adicional.

Como "una porción que enlaza selectivamente a la proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado mediante voltaje" queremos decir cualquier resto apropiada de manera tal que enlace a dicho VGSC pero que no enlace sustancialmente a otras moléculas, por ejemplo otros VGSC's. El compuesto que comprende el resto de enlace es uno que preferiblemente, en uso, sea capaz de localizar a áreas de células cancerosas, particularmente células metastáticas, pero no de localizar sustancialmente a otras áreas en que no existan células cancerosas.

Preferiblemente, el resto de enlace es capaz de enlazar a dicho VGSC con alta afinidad. Por ejemplo, la constante de enlace para el enlace de el resto de enlace a dicho VGSC es preferiblemente entre 10^{-7} y 10^{-10} M. Típicamente el resto de enlace es un anticuerpo anti-hNe-Na. Con anterioridad se presentaron tales anticuerpos y métodos de preparación de los anticuerpos apropiados.

El resto adicional puede ser cualquier resto que confiera al compuesto una propiedad útil con respecto al tratamiento o diagnosis de cáncer. En particular, el resto adicional puede ser una que sea útil eliminando o contrastando células cancerosas, particularmente células metastáticas. Preferiblemente, el resto adicional es una capaz de eliminar las células cancerosas a las cuales está dirigido el compuesto.

En una realización preferente el resto adicional es directa o indirectamente citotóxica. En particular el resto adicional es preferiblemente directa o indirectamente tóxica respecto a células cancerosas, particularmente células metastáticas.

Como "directamente citotóxica" incluimos el significado de que el resto es una que por sí misma es citotóxica. Como "indirectamente citotóxica" incluimos el significado de que el resto es una, que aunque no sea citotóxica por sí misma, puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, por su acción en una molécula adicional o por acción adicional sobre ella.

En una realización el resto citotóxico es un agente citotóxico quimioterapéutico. Los agentes citotóxicos quimioterapéuticos son bien conocidos en la técnica.

Los agentes citotóxicos quimioterapéuticos, tales como los agentes anticancerígenos, incluyen: agentes alquilantes que incluyan mostazas de nitrógeno tales como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ifosfamida, melpafal (L-sarcolisin) y clorambucil; etileniminas y metilmelaminas tales como hexametilmelamina, tiotepa; alquil-sulfonatos tales como busulfán; nitrosureas tales como carmustine (BCNU), lumistna (CCNU), semuestina (metil-CCNU) y estreptozocina (streptozotocina); y triacenos tales como decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazol-carboxamida); antimetabolitos incluyendo análogos del ácido fólico tales como el metotrexato (amtopterina); análogos de pirimidina tales como fluorouracil (5-fluorouracil; 5-FU), floxuridina (fluorodeoxiuridina; FUdR) y citarabina (citosina arabinosida); y análogos de purina e inhibidores relacionados tales como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) y pentostatina (2h-deoxicoformicina). Productos naturales que incluyen alcaloides zinca tales como vinblastina (VLB) y vincristina; epipodopillotoxinas tales como etoposida y teniposida; antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C); enzimas tales como L-asparaginasa; y modificadores de la respuesta biológica tales como alfenomas de interferón. Agentes misceláneos que incluyen complejos de coordinación del platino tales como el cisplatino (cis-DDP) y el carboplatino; antracenediona tal como mitoxantrona and antraciclina; urea sustituida tal como hidroxiurea; derivados de la metil hidrazina tales como procarbazina (N-metilhidrazina, MIH); y supresores adrenocorticales tales como el mitotane (o,ph-DDD) y aminoglutetimida; taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas hormonales tales como flutamida y tamoxifeno.

Varios de estos agentes han sido previamente anexados a antibióticos y, a otros agentes de suministro dirigido, y de esta manera los compuestos aquí presentados que comprenden estos agentes pueden producirse fácilmente por parte de personas conocedoras de la técnica. Por ejemplo, la conjugación de carbodiimida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159;) incorporada aquí como referencia, puede utilizarse para conjugar una variedad de agentes, incluyendo doxorubicina, a anticuerpos o péptidos.

Las carboiimidas comprenden un grupo de compuestos que tienen la formula general R-N=C=N-R', en la que R y R' puede ser alifáticos o aromáticos y se utilizan para síntesis de enlaces de péptidos. El procedimiento de preparación es simple, relativamente rápido y se lleva a cabo bajo condiciones sencillas. Los compuestos de carbodiimida atacan a los grupos carboxílicos para cambiarlos a sitios reactivos para grupos libres amino.

La carbodiimida soluble en agua, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) es particularmente útil para la conjugación de un resto funcional a un resto de enlace y puede utilizarse para conjugar la doxorubicina a los péptidos que albergan al tumor. La conjugación de doxorubicina y un resto de enlace requiere de la presencia de un grupo amino aportado por la doxorubicina y un grupo carboxilo que es aportado por el resto de enlace tal como un anticuerpo o péptido.

En adición al uso de carbodiimidas para la formación directa de enlaces de péptidos, también puede utilizarse el EDC para preparar ésteres activos tales como N-hidroxisuccinimida, éster (NHS). El éster NHS que enlaza solo a grupo amino, puede entonces utilizarse para inducir la formación de un enlace amida con el grupo amino simple de la doxorubicina. El uso de EDC y NHS en combinación se utiliza comúnmente para la conjugación con el objeto de aumentar la productividad de formación del conjugado (Bauminger & Wilchek, supra, 1980).

Pueden utilizarse otros métodos para la conjugación de un resto funcional a un resto de enlace. Por ejemplo, puede utilizarse la oxidación del periodato de sodio seguida de una alquilación reductora de reactantes apropiados, como puede ser la vinculación cruzada de glutaraldehído. Sin embargo, se reconoce que, independientemente del método de producción de un conjugado que se seleccione, debe tomarse la determinación de que el resto mantenga su capacidad de identificación y dirección y que el resto funcional mantenga su función relevante.

En una realización adicional, el resto citotóxica es un péptido citotóxico o resto de polipéptido mediante el cual incluimos cualquier resto que lleve a la muerte de la célula. El péptido citotóxico y las porciones de polipéptidos son bien conocidas en la técnica e incluyen por ejemplo, ricina, abrina, exototina de Pseudomonas, factor de tejido y similares. Los métodos de vinculación de éstos a las porciones objetivo tales como anticuerpos, también so conocidas en la técnica. El uso de ricino como un agente citotóxico se describe en Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8996-9000, incorporado aquí como referencia y el uso del factor de tejido, que lleva a la coagulación sanguínea localizada y la infarctación de un tumor, se ha descrito en Ran et al (1998) Cancer Res. 58, 4646-4653 and Huang et al (1997) Science 275, 547-550. Tsai et al (1995) Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074 describe la cadena de abrina A conjugada a un anticuerpo monoclonal y se incorpora aquí como referencia. Se describen como agentes citotóxicos otras proteínas desactivadotas de ribosomas en WO 96 106 641. La exotoxina de Pseudomonas puede utilizarse también como el resto citotóxica de polipéptido (ver por ejemplo, Aiello et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461; incorporada aquí como referencia).

Ciertas citoquinas, tales como el TNF y el IL-2 pueden ser útiles como agentes citotóxicos.

Ciertos átomos radioactivos pueden también ser citotóxicos si se suministran en dosis suficientes. Por tanto el resto citotóxica puede incluir un átomo radioactivo que, en uso, suministra una cantidad suficiente de radioactividad al sitio objetivo como para ser citotóxico. Los átomos radioactivos apropiados incluyen el fósforo-32, el yodo-125, el yodo-131, el indio-111, el renio-186, el renio-188 o el itrio-90, o cualquier otro isótopo que emita suficiente energía para destruir las células circundantes, los orgánulos o el ácido nucleico. Preferiblemente, los isótopos y densidad de los átomos radioactivos en el compuesto aquí brindado son tales que una dosis de más de 4 000cGy (preferiblemente al menos 6 000, 8 000 o unos 10 000 cGy) se suministra al sitio objetivo y, preferiblemente, a las células en el sitio objetivo y sus orgánulos, particularmente el núcleo.

El átomo radioactivo puede ser vinculado a el resto de enlace en formas conocidas. Por ejemplo el EDTA o cualquier otro agente de quelación puede ser vinculado a el resto de enlace y utilizado para vincular 111In o 90Y. Los residuos de tirosina pueden ser etiquetados con 125l o 131l.

El resto citotóxica puede ser un polipéptido apropiado indirectamente citotóxico. En una realización particularmente preferente, el polipéptido indirectamente citotóxico es un polipéptido que tiene una actividad enzimática y puede convertir un profármaco relativamente no tóxica en una droga citotóxica. Cuando el resto objetivo es un anticuerpo este tipo de sistema se conoce a menudo como ADEPT (Terapia de Profármaco de Enzimas Dirigida por Anticuerpos). El sistema requiere que el resto objetivo localice el resto enzimática en el sitio deseado en el cuerpo del paciente (esto es, el sitio que expresa los dichos VGSC's, tal como células metastáticas de cáncer) y después permita el tiempo para que la enzima localice en el sitio, administrando un profármaco que sea un sustrato para la enzima, siendo el producto final de la catálisis un compuesto citotóxico. El objeto del enfoque es el de maximizar la concentración del medicamento (droga) en el sitio deseado y el de minimizar la concentración del medicamento en tejidos normales (ver Senter, P.D. et al (1988) "Anti-tumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531-2; y Bagshawe, K.D. et al (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites" Br. J. Cancer. 58, 700-703.)

Claramente, puede utilizarse cualquier resto vinculante a dichos VGSCc en lugar de un anticuerpo anti-hNe-Na en este tipo de sistema de terapia mediante profármaco de enzima dirigida.

La enzima y el profármaco del sistema que utiliza dicha enzima objetivo localizada mediante VGSC tal como aquí se describe puede cualquiera de las propuestas anteriormente. La sustancia citotóxica puede ser cualquier droga anti-cáncer existente tal como un agente alquilante; un agente que intercala en el ADN; un agente que inhibe cualquier enzima clave tal como la reductasa de dihidrofolato, la sintetasa de timidita, la reductasa de ribonucleótido, las quinazas nucleósidas o la topoisomerasa; o un agente que efectúa la muerte celular interactuando con cualquier otro constituyente celular.

Los sistemas de profármacos reportados incluyen: un profármaco de fenol de mostaza activada mediante una E. coli-\beta-glucuronidasa (Wang et al, 1992 y Roffler et al, 1991); un profármaco de doxorubicina activada mediante una \beta-glucuronidasa humana (Bosslet et al, 1994); los profármaco adicionales de doxorubicina activadas mediante la \alpha-galactosidasa de grano de café (Azoulay et al, 1995); los profármaco de daunorubicina, activadas mediante la \alpha-D-galactosidasa de grano de café (Gesson et al, 1994); un profármaco de 5-fluororidina activada mediante una E.coli-\beta-D-galactosidasa (Abraham et al, 1994); y los profármaco de metotrexato (por ejemplo metotrexato-alanina) activado mediante carboxipeptidasa A (Kuefner et al, 1990, Vitols et al, 1992 y Vitols et al, 1995). Estos y otros se incluyen en la tabla siguiente.

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Esta tabla se ha adaptado a partir de Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, del cual pueden obtenerse referencias completas respecto a estos diversos sistemas; el derivado de taxol se describe en Rodrigues, M.L. et al (1995) Chemistry & Biology 2, 223).

Las enzimas apropiadas para formar parte de el resto enzimática de la invención incluyen: exopeptidasas, tales como carboxipeptidasas G, G1 y G2 (para profármacos de mostasa glutamiladas), carboxipeptidasas A y B (para profármacos de base MTX) y aminopeptidasas (para productos MTC 2-\alpha-aminocil); endopeptidasas, tales como por ejemplo la trombolisina (para profármacos de trombina); hidrolasas tales como las fosfatasas (por ejemplo fosfatasa alcalina) o sulfatasas (por ejemplo arilo sulfatasas) (para profármacos fosfiladas o sulfatadas); amidasas, tales como las amidasas de penicilina y la aracil amidasa; lactamasas, tales como \beta-lactamasas; glicosidasas, tales como la \beta-glucuronidasa (para -antracicilinas de glucuronomida), \alpha-galactosidasa (para amigdalina) y \beta-galactosidasa (para \beta-antraciclina galactosa); deaminasas, tales como la citosina deaminasa (para 5FC); quinasas tales como la uroquinasa y kinasa de timidita (para ganciclovir); reductasas, tales como la nitroreductasa (para CB19454 y análogos), azoreductasa (para mostasas de azobenceno) y DT-diaforasa (para CB 1954); oxidasas tales como la glucosa oxidasa (para glucosa), xantino oxidasa (para xantina) y lactoperoxidasa; DL-rracemasas, anticuerpos catalíticos y ciclodextrinas.

Es posible que el resto capaz de convertir un profármaco en droga citotóxica sea activa en aislamiento del resto del compuesto, pero es necesario que solo sea activa cuando (a) está en combinación con el resto del compuesto y (b) el compuesto sea anexado o, adyacente o, introducido en las células objetivo.

Cuando cada resto activo del compuesto es un polipéptido, las dos porciones pueden ser vinculadas mediante cualquier vía convencional de vinculación cruzada de polipéptidos, tales como las descritas en O'Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108. Por ejemplo, dicha resto de enlace a los VGSC's puede ser enriquecida con grupos tiol y el resto adicional reaccionada con un agente bifuncional capaz de reaccionar con esos grupos tiol, por ejemplo el éster N-hidroxisuccinimida de ácido yodo-acético (NHIA) o el propionato N-succinimidilo-3-(2-piridilditio) (SPDP). Los enlaces amida y tio-éter, por ejemplo alcanzados con éster m-maleimidobenzoilo-N-hieroxuccinimida, son generalmente más estables in vivo que los enlaces bisulfuro.

De manera alternativa, puede producirse el compuesto como un compuesto de fusión mediante técnicas de ADN recombinante en las que una longitud del ADN comprende regiones respectivas que codifican a las dos porciones del compuesto de la invención o adyacentes una con otra o separadas mediante una región que codifica un péptido de enlace que no destruye las propiedades deseadas del compuesto. De manera concebible, las dos porciones del compuesto pueden solaparse total o parcialmente.

El ADN se expresa entonces en un hospedero apropiado para producir un polipéptido que comprenda el compuesto de la invención.

El resto citotóxico puede ser un radiosensibilizador. Los radiosensibilizadores incluyen fluropirimidinas, análogos de timidita, hidroxiurea, gemcitabina, fludarabina, nicotinamida, pirimidinas halogenadas, 3-aminobenzamida, 3-aminobenzodiamida, etanixadol, pimonidazol y misonidazol (ver, por ejemplo, McGinn et al (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587; Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, 533-551; Mitchell et al (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836; Iliakis & Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241; Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Cancer 55, 2222-2228).

También el suministro de genes dentro de las células puede radiosensibilizarlas, por ejemplo el suministro del gen p53 o la ciclina D (Lang et al (1998) J. Neurosurg. 89, 125-132; Coco Martin et al (1999) Cancer Res. 59,
1134-1140).

El resto adicional puede ser aquella que se convierta a citotóxica, o libere un resto citotóxica mediante irradiación. Por ejemplo, el isótopo de boro-10, cuando se irradia apropiadamente, libera partículas que son citotóxicas (ver por ejemplo, la EE.UU. 348 376 otorgada Goldenberg; Primus et al (1996) BioConug. Chem. 7, 532-535).

De manera similar, el resto citotóxica puede ser aquella útil en terapia fotodinámica tal como la fotofrina (ver por ejemplo, Dougherty et al (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90, 889-905).

El resto adicional puede comprender una molécula de ácido nucleico que sea directa o indirectamente citotóxica. Por ejemplo, la molécula de ácido nucléico puede ser un oligonucleótido de reacción inversa que, mediante localización en el sitio objetivo es capaz de penetrar las células y eliminarlas. El oligonucleótido, por tanto, puede ser aquel que evite la expresión de un gen esencial, o uno que lleve a un cambio en la expresión del gen que cause apoptosis.

Los ejemplos de oligonucleótidos apropiados incluyen los dirigidos a bcl-2 (Ziegler et al (1997) J. Natl. Cancer Inst. 89, 1027-1036), y polimerasa de ADN \alpha (Leey topoisomerasa II\alpha et al (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811.

Los ácidos nucleicos péptidos pueden ser útiles en lugar de los ácidos nucleicos convencionales (ver Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118).

En una realización adicional, el resto de enlace puede estar contenido en un vehículo suministrador para suministrarle el ácido nucléico al objetivo, por ejemplo un ácido nucléico de los que se presentan aquí. El vehículo suministrador puede ser cualquier vehículo apropiado. Puede ser por ejemplo, un liposoma que contenga ácido nucléico, o puede ser un virus o particular similar a un virus capaz de suministrar ácido nucléico. En estos casos, el resto que enlaza selectivamente a dicho VGSC está típicamente presente en la superficie del vehículo de suministro. Por ejemplo, el resto que enlaza selectivamente a dicho VGSC, tal como un fragmento apropiado de anticuerpo, puede estar presente en la superficie externa de un liposoma y el ácido nucléico a suministrar puede estar presente en el interior del liposoma. En otro ejemplo, un vector viral, tal como un vector retroviral o adenoviral, es manipulado de manera que el resto que enlaza selectivamente a dicho VGSC se anexa o se localiza en la superficie de la partícula viral permitiendo por tanto que la partícula viral objetivo sea dirigida al sitio deseado. También se conocen sistemas de suministro objetivo, tales como el sistema de adenovirus modificado anteriormente presentado.

Pueden utilizarse los inmunoliposomas (liposomas dirigidos a anticuerpos) en los cuales el resto que enlaza selectivamente a dicho VGSC es un anticuerpo. La preparación de inmunoliposomas se describió anteriormente.

El ácido nucleico suministrado al sitio objetivo puede ser cualquier ADN apropiado que lleve, directa o indirectamente a la citotoxicidad. Por ejemplo, el ácido nucléico puede codificar una ribozima que sea citotóxica a la célula, o puede codificar una enzima que sea capaz de convertir una por-droga sustancialmente no tóxica en una droga citotóxica (a éste último sistema se le llama con frecuencia GDEPT: Terapia de Enzima Profármaco Dirigida al Gen).

Las ribozimas que pueden codificar en el ácido nucléico a ser suministrado al objetivo se describen en las referencias antes citadas. Los objetos apropiados para las ribozimas incluyen factores de transcripción tales como c-fos y c-myc y bcl-2. Durai et al (1997) Anticancer Res. 17, 3307-3312 describes un ribozima cabeza de martillo contra bcl-2.

La Patente Europea 0 415 731 describe el sistema GDEPT. Consideraciones similares respecto a la elección de enzima y profármaco aplican al sistema GDEPT al igual que al sistema ADEPT antes descrito.

El ácido nucléico suministrado al sitio objetivo puede codificar un polipéptido directamente citotóxico.

En una realización adicional, el resto adicional contenida en el compuesto aquí brindado es un resto fácilmente detectable.

Por "resto fácilmente detectable" incluimos el sentido de que el resto es tal que, al ser localizada en el sitio objetivo luego de la administración del compuesto al paciente, puede ser detectada, típicamente de manera no invasiva desde el exterior del cuerpo localizando el sitio del objetivo. Por tanto, los compuestos son útiles en contraste y diagnosis.

Típicamente, el resto fácilmente detectable es o incluye un átomo radioactivo que es útil en imaginología. Los átomos radioactivos útiles incluyen el tecnecio-99m o el yodo-123 para estudios de centegrafía. Otras porciones fácilmente detectables incluyen por ejemplo, etiquetas giratorias para contraste mediante resonancia magnética (MRI) tales como el yodo-123 de nuevo, el yodo-131, el indio-111, el flúor-19, el carbono-13, el nitrógeno-15; el oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Claramente, el compuesto debe tener una cantidad suficiente de los isótopos atómicos apropiados para que la molécula sea fácilmente detectable.

El radio- u otras etiquetas pueden estar incorporados en el compuesto de la invención en formas conocidas. Por ejemplo, si el resto de enlace es un polipéptido éste puede ser biosintetizado o puede ser sintetizado mediante síntesis química de aminoácido utilizando precursores apropiados de aminoácidos que involucren, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las etiquetas tales como ^{99m}Tc, ^{123}l, ^{186}Rh, ^{188}Rh y ^{111}In pueden, por ejemplo, anexarse vía residuos de cisterna en el resto de enlace. El Itrio-90 puede ser anexado vía un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) puede utilizarse para incorporar el yodo-123. La referencia ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) describe en detalle otros métodos.

En una realización adicional preferida el resto adicional es capaz de enlazar selectivamente a un resto directa o indirectamente citotóxica o a un resto fácilmente detectable. Por tanto, en esta realización, el resto puede ser cualquier resto que enlace a un compuesto adicional o componente que sea citotóxico o fácilmente detectable.

El resto adicional puede, por tanto ser un anticuerpo que selectivamente enlace al compuesto adicional o componente, o puede ser alguna otra resto adicional tal como estreptoavidina o biotina o similar. Los siguientes ejemplos ilustran los tipos de moléculas que se presentan aquí, otras moléculas similares son fácilmente aparentes a partir de estas enseñanzas.

Un anticuerpo biespecífico en el cual un sitio de enlace comprende el resto que enlaza selectivamente a dicho VGSC y el segundo sitio de enlace comprende un resto que enlaza, por ejemplo, a una enzima que es capaz de convertir un profármaco sustancialmente no tóxica a una droga citotóxica.

El compuesto puede ser un anticuerpo que selectivamente enlaza a dicho VGSC, al cual se enlaza la biotina. La avidina o estreptoavidina que han sido etiquetadas con una etiqueta fácilmente detectable pueden ser utilizadas en conjunción con anticuerpo etiquetado por la biotina en un sistema de contraste de dos fases en el cual el anticuerpo etiquetado por la biotina se localiza primeramente al sitio objetivo en el paciente, y entonces la avidina o estreptoavidina etiquetada se administra al paciente. Los anticuerpos específicos y los sistemas biotina/estreptoavidina (avidina) se reseñan en Rosebrough (1996) Q J Nucl. Med. 40, 234-251.

En una realización preferida, el resto que enlaza selectivamente a dicho VGSC y el resto adicional son polipéptidos que se funden.

También brindamos una codificación de la molécula de ácido nucléico presentada aquí.

También brindamos un compuesto para uso en medicina. Típicamente, el compuesto se empaca y presenta como un medicamento o un agente de contraste o como un agente de diagnóstico para uso en un paciente.

También brindamos una composición farmacéutica que comprende un compuesto presentado aquí y un portador farmacéuticamente aceptable.

Típicamente, las composiciones farmacéuticas o formulaciones son para administración parenteral, más particularmente para administración intravenosa.

Las formulaciones apropiadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes, búferes, bacteriostatos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del recipiente previsto y suspensiones acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes en suspensión y agentes espesantes.

También brindamos el uso de un compuesto presentado aquí para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o diagnóstico de un paciente humano con un o un riesgo de cáncer.

También brindamos un método para el tratamiento del cáncer, comprendiendo el método la administración al paciente humano de una cantidad efectiva de un compuesto presentado aquí en el que el resto adicional del compuesto es una que directa o indirectamente es de beneficio terapéutico al paciente.

También brindamos un método de contraste del cáncer (que puede ser útil en la determinación de la susceptibilidad de un paciente humano al cáncer, o para el diagnóstico de cáncer en un paciente humano, o de predicción de perspectivas relativas respecto a un desenlace particular de un cáncer), en un paciente humano, que comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de un compuesto presentado aquí, en el que el resto adicional del compuesto comprende un resto fácilmente detectable.

Se aprecia fácilmente que, en dependencia del compuesto utilizado en particular en el tratamiento, contraste o diagnosis, el tiempo de administración puede variar y también puede variar el número de los otros componentes utilizados en los sistemas terapéuticos presentados aquí.

Por ejemplo, en el caso en que el compuesto comprenda un resto fácilmente detectable o un resto directamente citotóxica, puede ser que solamente el compuesto, en una formulación apropiado, se administre al paciente. Por supuesto, pueden administrarse otros agentes tales como inmunosupresores y similares.

Respecto a los compuestos que son detectables mediante etiquetado, el contraste tiene lugar una vez que el compuesto ha localizado al sitio objetivo.

Sin embargo, si el compuesto requiere de un componente adicional para ser útil en el tratamiento, contraste o diagnosis, el compuesto debe administrarse y permitírsele la localización en el sitio objetivo y entonces debe administrarse el componente adicional en un momento apropiado posterior.

Por ejemplo, con respecto al ADEPT y sistemas similares al ADEPT anteriores, el compuesto de resto de enlace resto -enzima se administra y localiza al sitio objetivo. Una vez hecho esto, se administra el profármaco.

De manera similar por ejemplo, con respecto a los compuestos en los que el resto adicional comprendida en el compuesto enlaza a un componente adicional, el compuesto puede administrarse primero y permitirle que localice al sitio objetivo, y subsiguientemente se administra el componente adicional.

Por tanto, en una realización se administra al paciente un anticuerpo anti-hNe-Na de biotina etiquetada y, después de un período apropiado de tiempo, se administra una estreptoavidina etiquetada detectable. Una vez que la estreptoavidina se ha localizado a los sitios en los que el anticuerpo ha localizado (esto es, los sitios objetivo) el contraste tiene lugar.

Se cree que los compuestos presentados aquí en los que el resto adicional es un resto fácilmente detectables, pueden ser útiles en la determinación de estados metastáticos de células cancerosas. Esto puede ser un factor importante de influencia en la naturaleza y evolución de terapias futuras.

También brindamos un conjunto de partes (o un sistema terapéutico) que comprende (1) un compuesto presentado aquí en el que el resto adicional es un resto citotóxica que es capaz de convertir un profármaco relativamente no tóxica en una droga citotóxica y (2) un profármaco relativamente no tóxica. El conjunto de partes puede comprender cualquiera de los compuestos presentados aquí y los profármaco apropiadas tal como aquí se describen.

También brindamos un conjunto de partes (o un sistema terapéutico) que comprende (1) un compuesto presentado aquí en el que el resto adicional es capaz de enlazar selectivamente a un resto directa o indirectamente citotóxica o a un resto fácilmente detectable y (2) cualquiera de un resto directa o indirectamente citotóxica o un resto fácilmente detectable a la cual el resto adicional es capaz de enlazar.

Por ejemplo, un conjunto de partes puede contener un anticuerpo anti-hNe-Na etiquetado con botina y estreptoavidina etiquetada con una etiqueta fácilmente detectable tal como se definió anteriormente.

La invención será descrita ahora por referencia a los siguientes ejemplos y figures no limitantes.

Figura 1: Correspondencia del polinomio de tercer orden con los datos del análisis de imagen PN1 de VGSC\alpha. Se muestran correspondencias para las tres repeticiones realizadas en el primer extracto MAT-LyLu. La masa de producto PCR (en nanogramas) se plotea contra el número del ciclo PCR. El inserto superior muestra las imágenes de gel de las cuales se derivaron los datos. Los números representativos del ciclo PCR para bandas dadas se indican sobre los
geles.

Figura 2: Detalles de la línea de variantes de empalme de los VGSC\alpha encontradas en las células de cáncer de próstata. Se muestran las variantes de empalme de productos de genes (a) SCN2A, (b) SCN3A, (c) SCN8A y (d) SCN9A, determinadas a partir de pruebas PCR específicas, encontradas en líneas de células en ratas (RB2 y PN1) y en humanos (HB2, HB3, Hna6 y hNe-Na). Las imágenes mediante gel típicas SQT-PCR se muestran a la izquierda; las bandas idealizadas que representan a cada producto PCR se indican al costado. Se muestra a la derecha una representación esquemática de las características estructurales que corresponden a cada producto y el tamaño del producto se indica (en nucleótidos). También se muestran las ubicaciones de las posiciones de los intrones (las zonas de sombreado diferente representan axones diferentes) y las posiciones de las plantillas PCR (flechas), con respecto a la estructura del dominio normal de los VGSC\alpha. Los números representativos del ciclo PCR para bandas dadas se indican sobre los geles. N y A denotan axones neonatos y adultos empalmados alternativamente. \Delta indica productos cuyos axones faltan en ambos empalmes alternativos.

Figura 3: Imágenes de gel SQT-PCR para los VGSC\alphas de ratas. Se muestran SQT-PCRs para (a) PN1, (b) SCL-11, (c) RB1, (d) rSkM1, (e) RB2 y (f) Na/NSNS2; y (g) el control de rCytb5R. Los números representativos del ciclo PCR para bandas dadas se indican sobre los geles. En cada panel, la imagen superior se derivó de extractos celulares MAT-LyLu; la imagen inferior, de extractos AT-2.

Figura 4: Imágenes de gel SQT-PCR para los VGSC's\alpha humanos. Se muestran losSQT-PCRs para (a) hNe-Na, (b) hNa6, (c) HB2 y (d) HB3; y (e) el control hCytb5R; y las variantes hNa6 (f) neonatal y (g) adultos empalmados. Los números representativos del ciclo PCR para bandas das se indican sobre los geles. En cada panel, la imagen superior se derivó de extractos celulares PC-3; la imagen inferior, de extractos celulares LNCaP.

Figura 5: Niveles propuestos de expresión de los diversos ARNms de "VGSC\alpha funcionales" en las líneas celulares fuertes (barras blancas) y débiles (barras negras) metastáticas de cáncer de próstata. En cada caso, el eje vertical denota el nivel aproximado de expresión respecto a los niveles funcionales de los VGSC en la contraparte fuertemente metastática (MAT-LyLu y PC-3 para células de ratas y humanas respectivamente). Los niveles de expresión se determinaron a partir de identificaciones (screens) degenerados utilizando RB1 (ratas) y hCytb5R (humano) como estándares. La abundancia relativa de ARNms de VGSC\alpha puede ser ligeramente sobreestimada para los VGSC\alphas expresados en formas de empalmes múltiples (más notorio el HB2, del cual una gran proporción está presente en la forma HB2.)\Delta.

Figura 6. Secciones de próstata humana en diversas etapas patológicas marcadas inmunoquímicamente con anticuerpos de VGSC. A. Hiperplasia prostática benigna. B. S, stroma, 1,lumen PIN de baja gradación. C. PIN de alta gradación. D. Malignidad in situ -InsM. E. Células cancerosas invasivas -InvCs (se muestran diversos ejemplos indicados mediante flechas). Se aplicaron métodos inmunoquímicos a los tejidos clínicos que habían sido fijados en un 10% de formalina y colocados en parafina. Se utilizaron las secciones de 10 pacientes diferentes con edades y gradaciones Gleason diversas. Los tejidos, luego de ser tratados en horno de microondas para eliminar los antígenos, se incubaron con un anticuerpo de canal Na^{+} (Upstate BioTechnology Inc.) que es un anticuerpo péptido que reconoce cualquier tipo de VGSC vertebrado ((England et al (1991) Brain Res. 548, 334-337). Las secciones se trataron primeramente con este anticuerpo (2 mg/ml) a 4ºC durante la noche. Para la detección de la señal, se utilizaron: un anticuerpo secundario biotinilado, un complejo biotina-avidina y diaminobencidina como el cromógeno. Para bloquear los sitios secundarios de enlace, se aplicó el suero del receptor del anticuerpo secundario. Se realizaron dos tipos diferentes de controles negativos: (1) se ignoró el anticuerpo primario; (2) se preabsorbió el anticuerpo primario con el péptido inmunizante. En ninguno de los casos, se mostró marca alguna de VGSC. Para el análisis cuantitativo, las imágenes se lograron con un cámara digital codificada tricolor (Pixera Corporation, Los Gastos, C.A. EE.UU.) utilizando un microscopio Nikon y computadora Apple Mac. Las mediciones de densidad óptica se hicieron utilizando un programa de análisis de imagen (OPTIMAS, versión 5,2 (Stemmer, Alemania). Escala de 13,5 \mum.

Figura 7: Alineación de las secuencias de aminoácidos de la región Yj1/YJC2 de VGSC's vertebrados. La alineación se generó utilizando el software MEGALIGN de Lasergene. Todas las secuencias se alinearon utilizando el método Clustal con la tabla de pesos PAM250. Los residuos conservados se guardaron en cajas y se colocaron a la sombra. Los números de secuencia de acceso son los siguientes:

PN1 (GB: U79568); célula de Conejo Schwann (GB: U35238); hNe-Na (PIR: S54771); Eel (GB: X01119); SkM1 (GB: U25990) de Caballo; hSkM1 (GB: M81758); rSkM1 (GB: M26643); mNav2.3 (PIR: A55138) de Ratón; SCL-11 (GB: Y09164); hNav2.1 (GB: M91556); RB1 (SW: P04774); HB1 (GB: 571446); RB3 (SW: P08104); HB3 (GB: S69887); RB2 (PIR: B25019); HB2 (GB: M94055); SCN8a (GB: U26707) de Ratón; rNa6 (GB: L39018); (GB: D37977) de Pez Puffer; SNS (GB: Y09108) de Ratón; Rat SNS/PN3 (GB: X92184); (PIR: A38195) Cardíaco Humano; (SW: P15389) Cardíaco de Rata; NaN (GB: AF059030).

Figura 8: Topografía pronosticada de variantes de empalme de (A) hNa6 y (B) PN1, hNe-Na y IIB2 expresadas en las líneas celulares de cáncer de próstata de rata y humano, según se determina a partir de la plantilla específica de PCRs. Las barras oscuras (-) indican posiciones de intrones conservadas en genes VGSC\alphas. Adaptado de Oh & Waxmn (1998).

Figura 9: (A) Registros actuales de línea celular de rata con cáncer de próstata MAT-LyLu educida mediante depolarización de la membrana de un potencial de mantenimiento de -100 mV a 0 mV siguiendo 24 h de incubación en 0% FBS, 100 ng/ml EGF y 1 mM AG1478. La expresión de canal de Na^{+} regulado por voltaje fue sobrerregulada en la presencia de EGF. (B) Histogramas que muestran el error estándar (\pm) del pico medio de densidad de la corriente Na^{+} luego de 24 h de incubación en 0% FBS, 100 ng/ml EGF, 1 \muM AG1478 y receptor anticuerpo EGF (1 \mug/ml). La significación estadística se indica como as **=p<0.01 y ***=p <0.001, respectivamente.

Ejemplo 1

Perfiles de expresión en líneas celulares de cáncer de próstata humano y en ratas de genes de subunidad-\alpha de canal de Na^{+} regulado por voltaje: expresión predominante de canal y subunidades de PN1/hNe-de Na^{+} regulado por voltaje en líneas celulares altamente metastáticas de cáncer de próstata humano y en ratas.

Los canales de Na^{+} regulado por voltaje (VGGSs) controlan una diversidad de actividades celulares y su disfunción ha sido implicada en un número de condiciones pato-fisiológicas, incluyendo la metástasis de cáncer de próstata. Aunque los VGSC's pueden aparecer como conjuntos de subunidades múltiples, las subunidades-\alpha (VGSC\alphas) por sí solas pueden codificar a canales funcionales. Hemos desarrollado dos métodos nuevos de reacción en cadena de transcripción inversa de la polimerasa (RT-PCR), de identificación (screening) de plantilla degenerada y una técnica novedosa semicuantitativa de PCR. Estos han permitido una detallada investigación cualitativa y cuantitativa de la expresión de los ARNm de VGSC en células en ratas (MAT-LyLu/AT-2) y humanos (PC-3/LNCaP) de diferente potencial metastático de cáncer de próstata y la producción de resultados altamente consistente. Solo las células altamente metastáticas (MAT-LyLy y PC-3) mostraron poseer previamente actividad funcional de los VGSC. Las identificaciones de PCR de plantillas degeneradas de VGSC\alpha identificaron ocho genes de VGSC\alpha diferentes.: SCNIA-4A, SCN7A-9A and SCN11A. Los PCRs específicos de plantilla demostraron que la mayoría de los VGSC\alpha se expresaban como variantes de empalme múltiple que codificarían tanto a proteínas funcionales como no funcionales (altamente truncadas). Los resultados semicuantitativos de PCR (SQT-PCR) fueron consistentes con un nivel basal de expresión de los VGSC\alpha de ARNm que ocurría en células débilmente metastáticas (AT-2/LNCaP) y esta expresión se elevaba grandemente en células de potencial metastático más fuerte (MAT-LyLu/PC-3). El incremento marcado en la expresión del gen SCN9A específicamente (también denominado PN1/hNe-Na) era en gran medida responsable de esta elevación en los niveles de los ARNm de VGSC\alpha tanto en células de ratas como en humanas. Por tanto, el SCN9A es altamente probable que sea la fuente principal de los VGSC funcionales detectados.

^{1}Abreviaturas: VGSC's: canales de Na^{+} regulado por voltaje; VGSC\alpha, subunidad-\alpha de canales de Na^{+} regulado por voltaje; VGSC\beta, subunidad-\beta de canales de Na^{+} regulado por voltaje; DRG, ganglio de raíz dorsal; RT-PCR, reacción en cadena de transcripción inversa de la polimerasa; S, segmento trans-membrana; D, dominio trans-membrana; ID, entre losdominio; TTX, tetrodotoxina; ssCDNA, ADN de hebra simple; R6, plantillas aleatorias de hexámeros; nt, nucleótidos; SQT-PCR, resultados semicuantitativos de la reacción en cadena de la polimerasa; TBE, búfer trizma-borato EDTA; Cytb5R, reductasa NADH-citocromo b5; NGF, factor de crecimiento nervioso.

Fundamentos

Los canales de Na^{+} regulado por voltaje (VGSCs)^{1} son grandes membranas de glicoproteínas en expansión compuestas de un gran(=240kD), cuatro subunidades-\alpha de dominio de transmembranas (VGSC\alpha), y hasta dos subunidades-\beta auxiliares diferentes (VGSC\betas) (1). La expresión de los VGSC\alpha por sí sola es suficiente para la formación funcional de canal (2). Los VGSC\betas sirven un número de roles de apoyo tales como los de facilitar la disponibilidad funcional de canal (3), la modulación de la cinética de canal (4,5) y quizás aún la alteración de las características farmacológicas (6).

Los VGSC\alpha constituyen una familia de al menos 11 genes diferentes en vertebrados superiores (7), se denominados SCN1A a SC11A; sus productos han sido clonados a partir de una diversidad de tipos celulares excitables. Al menos dos subfamilias de genes VGSC\alpha han sido descritas basándose en los datos de secuencia: Nav1 y Nav2 (8). Aunque no se ha determinado experimentalmente todavía, se asume generalmente que estas subfamilias representan VGSC\alphas con propiedades electrofisiológicas marcadamente diferentes (9). De hecho la falta de conservación de secuencias del patrón VGSC\alpha en Nv2 VGSC\alpha implica que éstos pueden incluso no ser regulados mediante voltaje o Na^{+} selectivos (9,10). La existencia de una tercera subfamilia, Nav3, se ha propuesto recientemente con la clonación de un ADNc (NaN/SNS2) de células de ganglio de raíz dorsal de rata (DRG). Aunque el NaN/SNS2 comparte menos del 50% de homología de secuencia con otros VGSC\alphas, su secuencia aminoácido deducida posee todas las secuencias características del Nav1 VGSC\alpha (11).

Al utilizar métodos de hibridización RT-PCR e in situ, varios estudios han documentado la expresión simultánea de múltiples VGSC\alpha dentro de diversos tipos de células (12-14). Se ha encontrado que VGSC\alpha particulares se expresan a diferentes nivele, con expresión bajo control dinámico (por ejemplo, durante el desarrollo u ocurrencia de lesión). Por ejemplo, se encontraron ARNms para al menos ocho tipos diferentes de VGSC\alpha en células de rata adulta DRG, con un rango amplio de niveles de expresión: ARNms RB1, NHNa6, NaN/SNS2 y SCL-11 se expresaron a niveles muy altos, PN1 y SNS/PN3 a niveles intermedios y RB2 y RB3 a niveles muy bajos, mientras que la expresión de RB1 y RB3 fue sobrerregulada (17,18).

Los genes VGSC pueden ocurrir como un número de isoformas alternativamente empalmadas, cuya expresión está también bajo control dinámico. El empalme alternativo de axones que codifican para el tercer segmento (S3) del primer dominio trans-membrana (D1), se ha encontrado que puede ser regulada en su desarrollo poro parte de SCN2A y SCN3A (19,20), aportando formas "neonatales" y "adultas". Esto codifica para proteínas que difieren en solo un aminoácido, posicionado en el extremo extra-celular de S3. El efecto de este cambio sobre la función VGSC\alpha no está claro actualmente. Existen axones empalmados alternativamente de manera similar en la posición correspondiente en SCN8 y SCN9A (21, 22) pero no en SCN4A, SCN5A, SCN10A, y SCN11A (23-26). Hasta la fecha, no se ha encontrado evidencia de tal empalme alternativo para SCN1A o SCN7A.

El empalme alternativo también ocurre en otra regios de los VGSC\alpha, particularmente entre los dominios (ID) 1-2 y D3.

La regulación estricta de genes múltiples VGSC\alpha y de expresión de empalme de producto dentro del conjunto disponible de ARNm de VGSC\alpha, entre diversos tipos de tejidos y durante el desarrollo o a continuación de una lesión (por ejemplo 17, 18, 27) sugieren que diferentes productos de gen de VGSC\alpha y sus isoformas pueden tener papeles funcionales significativamente diferentes, que en el presente, son desconocidos.

Los papeles funcionales de VGSC's son mejor comprendidos en el sistema nervioso central en el que la actividad de los VGSC controla no solo la generación y conducción de impulsos básicos, sino también el crecimiento direccional y su patrón, incluyendo la migración axonal de objeto específico y la conectividad sináptica regional (28-30). Los VGSC's han estado implicados también en varias enfermedades hereditarias de tejidos excitables (7,31) y en padecimientos patológicos más complicados, incluyendo síndromes de dolor crónico (32), epilepsia (33), infarto isquémico (34) y la enfermedad de Alzheimer (35). Hay aumento de la evidencia de que la expresión de los VGSC también se asocia con altos potenciales metastáticos en modelos de cáncer de próstata en ratas (MAT-LyLu) y humano (PC-3) (36-38). Es más, la expresión de VGSC's funcionales puede tener una influencia positiva directa en los procesos metastáticos. En correspondencia, el bloqueo de corrientes VGS en estas líneas celulares altamente metastáticas, mediante de tetrodotoxina (TTX), redujo significativamente (aproximadamente en un 30%) el potencial invasivo celular. Las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de la corriente en la rata fueron consistentes con el hecho de que los canales eran neuronales, del tipo TTX-sensibles (Nav1) (39). La expresión del gen SCN4A se encontró en líneas celulares tanto fuertemente como débilmente metastáticas de humanos y ratas (40). Sin embargo, las propiedades farmacológicas de las corrientes de VGS en las células de ratas MAT-LyLu no fueron consistentes con las reportadas para este VGSC. Esto pudiera ser resultado de (1) las numerosas diferencias determinadas en la secuencia primaria MAT-LyLu/AT-2 rSkM1; (2) las diferencias en mecanismos post-traductores (por ejemplo, asociación con subunidades auxiliares, nivel de glicosilación/fosforilación de canal) en estas células; o (3) la presencia de otros VGSC\alpha en las células MAT-LyLu que producen las corrientes VGS registradas.

En el presente estudio, extendemos nuestro trabajo para determinar la expresión de ARNms de otros VGSC\alpha en las células de cáncer de próstata altamente metastáticas (MAT-LyLu y PC-3) y pobremente metastáticas (AT-2 y LNCaP) utilizando un enfoque comparativo, cuantitativo RT-PCR.

Procedimientos experimentales

Cultivos celulares. Se cultivaron y cosecharon líneas de células MAT-LuLy, AT-2, LNCaP y PC3 tal como se describió previamente (36,37).

Extracción del ARN. Esto se llevó a cabo como se nota en (41) o tal como se describe a continuación. Brevemente, las células se homogenizaron en una solución (A), utilizando un homogenizador IKA, de manera tal que se utilizara 1 ml de solución por 0,1 g de tejido. La solución A contenía 4M de tiocianato de guanidina, 25 mM de citrato de Na^{+} (pH 7,0), 0,5 sarcosil y 0,72% (v/v) de \beta-mercaptoetanol. Los siguientes componentes se adicionaron entonces y agitaron vigorosamente durante 10 segundos: 2 m de acetato de Na^{+}, pH 4,0 (10% volumen de solución A), fenol (igual volumen al de la solución A) y cloroformo (20% del volumen de la solución A). Se llevó a cabo la centrifugación a 10 000 x g durante 20 min. a 4ºC. El producto suspendido se recolectó y precipitó con isopropanol. Entonces, las muestras se centrifugaron como anteriormente y la pelotilla se re-suspendió en alrededor de 30% del volumen inicial de la solución A. Se realizó un segundo precipitado de isopropanol, la pelotilla se lavó con un 7% de etanol y se re-suspendió en agua destilada estéril.

Se obtuvieron tres extractos diferentes de ARN a partir de tres tandas diferentes de células de cada una de las líneas celulares de ratas (denominadas MLL.1, MLL.2, MLL.3, AT.1, AT.2, AT.4) y dos extractos de dos tandas diferentes de células de líneas celulares humanas (denominadas PC.1, PC.2, LN.1, LN.2).

Identificación (screening) de plantillas degeneradas de VGSC\alpha. Se utilizó una estrategia PCR capaz de amplificar todos los VGSC\alpha conocidos para amplificar y subsecuentemente identificar mediante clonación y secuenciación, todos los VGSC\alphas expresados en las líneas celulares de cáncer de próstata. Se utilizaron plantillas de VGSC's específicos, siguiendo los resultados iniciales de secuenciación, para permitir una identificación rápidamente de los PCR de los numerosos VGSC's derivados de cada línea celular.

Brevemente, se retiró el AND de los extractos mediante digestión con DNasa I y 5 mg de ARN total se utilizaron como el patrón para la síntesis del ADNc de hebra simple (ADNssc) (Superscript II, GIBCO BRL.) La síntesis del ADNssc fue emplantillada con una mezcla de hexámero aleatoria (R6) en un volumen final de 20 \mul. El ADNc de VGSC se amplificó entonces a partir del conjunto de ADNR6-ssc mediante PCR (polimerasa etiquetadora de ADN, Amersham Pharmacia) utilizando plantillas degeneradas PCR (YJ1 y YJ2C) utilizadas previamente para amplificar ambos los VGSC's Nav1 y Nav2 de células epiteliales de pigmento de retina de ratas adultas (42), y VGSC\alphas, nóveles de un ascidio protocordato (43). Las reacciones PCR se llevaron a cabo sobre 4 \mul del patrón de R6-ADNssc, utilizando 200 \muM de cada dNTP, 1 unidad de Taq, 1 x Taq búfer y 1 \muM de cada plantilla, en un volumen final de 20 \mul. La amplificación se realizó vía: (i) denaturación inicial a 94ºC durante 5 min.; (ii) adición de 1enzima U; (iii) 33-35 ciclos de denaturación a 94ºC durante 1 min, temple a 40ºC durante 1 min y elongación a 72ºC durante 1 min; y (iv) elongación a 72ºC durante 10 min. Para este y todos los PCRs realizados, las reacciones sin adición de ADNssc se llevaron a cabo también para controlar la contaminación cruzada de otras fuentes de ADN.

Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis y se purificaron de geles antes de la ligación al vector pGEM-T (gGEMTr Easy Vector System, Promega). Estos se utilizaron entonces para transformar E.coli (pMosBlue, Amersham). El ADN plásmido se recuperó a partir de los cultivos bacterianos utilizando una versión modificada del procedimiento mini-preparatorio Vistra Labstation 625 (Vistra DNA Systems, Amersham), Se seleccionaron positivamente cincuenta clones con "insertos" mediante electroforesis de gel para cada uno de los diez extractos de ARN. Luego de secuenciación del ADN de un subconjunto de aproximadamente 10 clones de cada identificación (screen), realizado utilizando el equipo de secuenciación de ciclo fluorescente Amersham Thermo Sequenase y el VistraDNA725, un secuenciador automático (Amersham Internacional), se designaron plantillas PCR específicas a los VGSC\alphas más abundantes encontrados en las identificaciones (screens) y utilizados en conjunción con las plantillas universales de vectores, permitiendo la identificación rápida de PCR de los clones sin necesidad de una secuenciación extensa. Las plantillas correspondieron a nucleótidos (nt) 4118-4137, 3406-3425, 4441-4460, 4066-4085, 4139-4158, 4265-4284 and 4325-4344 for PN1 (58ºC), SCL-11 (50ºC), RB1(46ºC), rSkM1 (64ºC), hNe-Na (54ºC), HB2 (56ºC) y hNa6 (54ºC de VGSC\alphas, respectivamente (numeración de acuerdo a GenBank; la temperatura de temple de la reacción utilizada se indica en paréntesis). Estas plantillas se probaron sobre clones secuenciados para confirmar que ellos arrojaban solamente los productos específicos. Los clones que no resultaron positivos para estos VGSC\alpha se identificaron mediante secuenciación. Los porcentajes de clones que representan un VGSC\alpha ado (de los 50 clones en cada identificación (screen)) se promediaron. Los datos se presentan como media \pm errores estándar.

Pruebas PCR de VGSC\alphas específicos. La región entre las dos plantillas degeneradas contiene sitios de intrones no conservados en los genes VGSC\alpha estudiados (22-25). Consecuentemente, se llevaron a cabo PCRs a lo largo de sitios de intrones de genes VGSC\alpha para confirmar que los VGSC\alpha encontrados en las identificaciones no estaban amplificados a partir de ADN genómico contaminado. Adicionalmente, varios VGSC\alpha encontrados en las identificaciones de plantillas degeneradas (particularmente SCN2A, SCN3A, SCN8A y CN9A) se ha determinado que existen en numerosas formas de empalme. Por tanto, las plantillas específicas mero-20 estaban diseñadas para amplificar productos que expandían los intrones conservados de D1:S2 a D1:S5/S6, permitiendo la identificación de la forma(s) empalmada expresada de SCM2A (rata y humana), SCN3A (humana) y SCN9A (rata y humana) y el control de la contaminación genómica del ADN. Las plantillas de hNa6 (SCN8A) y NaN7SNS2 (SCN11A) se designaron a D3, sin embargo donde ocurre empalme alternativo similar al de D1:S3 en los hNa6 VGSC (22,24). Las reacciones amplificaron los nucleótidos correspondientes a 424-847; 386-879; 684-1160; 632-1129; 870-1347; 3353-3674; 474-862; 3855-4370; 512-1024; 493-897, para PN1 (60ºC), SCL-11 (58ºC), RB1 (58ºC), RB2 (59ºC), rSkM1 (58ºC), NaN/SNS2 (58ºC), hNe-Na (59ºC), hNa6 (60ºC), HB2 (58ºC) and HB3 (60ºC), respectivamente.

Las reacciones se llevaron a cabo como anteriormente, utilizando 2,5 \mul de la mezcla R6-ADNssc y 0,5 \muM de cada plantilla, reciclando 30-35 veces. Los PCRs se llevaron a cabo en extracto tanto de líneas celulares fuertemente como débilmente metastáticas, independientemente de si estos VGSC's habían sido encontrados previamente en pesquisas. Los productos observados se clonaron y secuenciaron, y se produjo luego una secuencia de consenso para cada VGSC\alpha en cada línea celular (utilizando al menos cuatro clones derivados cada uno de diferentes extractos de ARN). Para RB2, HB2, HB3, PN1 y hNe-Na al menos cuatro clones derivados de cada extracto de línea celular se secuenciaron parra obtener los productos PNR de 498nt, 513nt, 405nt, 424nt y 389nt, respectivamente (ilustrado en la Figura 2).

PRs semicuantitativos (SQT-PCRs). Se utilizaron ocho extractos "ADNseados" de ARN (dos extractos para cada línea celular) para producir tres conjuntos de R6-ssADNs para cada extracto. Se utilizaron 2,4 \mul de estos R6-ssADNs como patrón de PCR específicos de VGSC (realizados como anteriormente se describe), en un volumen final de 60 \mul. Para permitir la comparación directa de los resultados obtenidos de líneas celulares fuertemente y débilmente metastáticas, se llevaron a cabo simultáneamente todas las reacciones R6-ADNssc y PCR.

Se adoptó un enfoque cinético de observación (45; Hoof et al (1991) Anal. Biochem. 196, 161-169; Wiesner et al (1992)Biochem. Biophys. Res. Comm. 183, 553-559) de manera tal que se tomó una alícuota de 5 \mul de la reacción de 60 \mul al final de cada ciclo de amplificación, mientras que las reacciones se llevaban a cabo a 72ºC. El ciclo de amplificación en e cual se tomaron primeramente las alícuotas difería en dependencia de los VGSC estudiados. Estas alícuotas se sometían entonces a electroforesis (0,8% de gel de agarosa) con marcadores de ADN de concentración conocida. Los geles se post-marcaban durante 15 minutos (Búfer de TBE contentivo de 0,8 mg/\mul bromuro de etidio) y se le tomaba imagen digital (GDS 7500 Advanced Gel Documentation System, Ultraviolet Products, Cambridge, R.U.) La masa total del producto (nanogramo) en cada alícuota se determinó mediante análisis de imagen (1D Image Analysis Software, Kodak Digital Science, NY). Se cuantificaron dos etapas características en cada reacción
PCR:

(1)

Número de ciclo del umbral PCR (CNt) en el cual un producto PCR dato podía ser detectado mediante software de análisis de imagen.

(2)

Número de ciclo PCR al cual la fase exponencial de la reacción terminaba (CNe).

La acumulación del producto de reacción con un número de ciclo PCR en aumento sigue una curva sigmoide (45). Sin embargo, los dos extremos de esta curva eran desconocidos o indeterminados respecto a los datos del SQT-PCR (esto es, la masa inicial de ADNc en ciclos cero era desconocida y la masa del producto final al término del PCR indeterminada). Por tanto no podía incluirse una curva sigmoide en los datos. En su lugar se utilizó una ecuación de polinomio de tercer orden, que también tenía un único punto de inflexión posible, (que aquí corresponde al final de la fase exponencial del PCR) para aproximar una curva sigmoide. Se realizó un ajuste de la curva utilizando STATISTICA (SoftStat Inc., Tulsa, OK) y se calculó entonces la segunda derivada para aportar CNe. Este procedimiento pudo ser llevado a cabo con éxito, cayendo los valores calculados de CN_{e} dentro de los puntos de datos obtenidos experimentalmente (Fig. 1). Los datos se presentan como media y errores estándar para cada línea celular (tres repeticiones en dos extractos para cada VGSC). Los valore de CN_{t} y CN_{e} se utilizaron directamente para comparar los niveles de expresión de cada VGSC\alpha en las líneas celulares fuertemente y débilmente metastáticas.

La reductasa b5 citocroma-NADH (Cytb5R), que se expresa a niveles muy similares en células normales, cancerosas y fuertemente metastáticas derivadas de numerosos tipos de tejido (46,47), estaban presentes tanto en las identificaciones de plantilla degenerada de ratas como de humanos como un constituyente principal de los productos no específicos encontrados (los clones "no VGSC\alpha"). Consecuentemente, esto se utilizó como una amplificación del control en SQT-PCRs. Los nucleótidos amplificaron las plantillas del Cytb5R mero-20 385-809 y 299-790 de homólogos de ratas y humanos, respectivamente (temperatura de temple, 60ºC para ambos).

Los PCRs específicos para PN1, hNe-Na, RB2, HB2, hNa6 y HB3 produjeron múltiples productos VGSC, debido al empalme alternativo, haciendo más difícil la determinación de los niveles de expresión de los VGSC\alpha. Para obtener productos individuales de estos VGSC\alpha, se llevaron a cabo diferentes PCRs utilizando nuevas plantillas mero-20 que amplificaban los nucleótidos 20-345; 172-544; 5941-6308; 3827-4344; 5914-6270; 1594-1875, para PN1 (60ºC), RB2 (60ºC), hNe-Na (56ºC), hNa6 (60ºC), HB2 (58ºC) y HB3 (59ºC), respectivamente. Los productos hNe-Na, hNa6, HB2 y HB3 no expandieron los sitios de los intrones conservados por tanto se llevaron a cabo reacciones de control de PCR en las cuales el patrón ADNssc se reemplazó con una alícuota de una reacción de transcripción invertida que no tenía añadida ninguna transcriptasa invertida. Todos los productos fueron clonados y secuenciados.

Se utilizaron dos plantillas mero-20 adicionales ("neonatal": nt 500-519, numeración GenBank, y "adulto": nt 3996-4015), para determinar los niveles relativos de expresión de las formas empalmadas neonatales y adultas de hNa6 en las células de cáncer de próstata. Las reacciones se llevaron a cabo en un solo extracto de ARN de las líneas celulares PC-3 y LNCaP en conjunción con la plantilla 3'hNa6 específica utilizada para las pruebas PCR específicas de VGSC (la temperatura de temple "neonatal", 58ºC, PCR "adulta", 57ºC.)

Números de la secuencia de nucleótidos GenBank. La numeración de nucleótidos se realizó de acuerdo a los números de acceso U79568, Y03639, X03638, X03639, Y17153, AF059030, X82835, AB027567, AF050730, M94055, AF035685, D00636, Y09501 for PN1, SCL-11, RB1, RB2, rSkM1, NaN/SNS2, hNe-Na, hNa6, hNa6 "neonatal", HB2, HB3, rCytb5R y hCytb5R, respectivamente.

Resultados

Identificación (screening) degenerada de plantillas de VGSC\alpha. Los resultados combinados de los PCR y las identificaciones secuenciadas de los clones minipreparados para las diferentes líneas celulares se muestran en la Tabla 1. Ocho tipos diferentes de VGSC\alpha se encontraron en las identificaciones, representando productos de genes de SCN1A-4A, SCN7A-9A y SCN11A. De estos, se encontraron seis VGSC\alpha diferentes en la rata y cuatro en el humano; los homólogos de dos VGSC\alpha encontrados en las identificaciones humanas también estaban presentes en las células de ratas (PN1 derivado de SCN9A y RB2 de SCN2A). Todos los VGSC\alpha encontrados eran idénticos a la secuencia respectiva publicada en la región amplificada (delineada por las plantillas degeneradas).

TABLA I Resumen de los resultados de la identificación de plantillas degeneradas de VGSC\alpha

Los resultados se muestran como porcentaje de los clones puestos a prueba (n=50 en cada caso). Cada identificación es el resultado de 2-3 extractos de cada línea celular. Los errores indican errores estándar. Las líneas quebradas (-) indican la ausencia de clones con esa identidad en particular de VGSC\alpha en las identificaciones realizadas.

2

Las plantillas degeneradas se diseñaron para amplificar todas las combinaciones posibles de ADNc que pueden codificar a dos motivos de secuencia de aminoácidos perfectamente conservados en todos los Nav1 VGSC\alphas así clonados y secuenciados (YJ1=FWLIFSIM; YJ2C=QVATFKGW) y productos resultado de 225-237 bps. Es posible (al menos para los canales Nav1 por tanto, que la proporción de clones que representa a cada tipo de VGSC\alpha reflejara aproximadamente la proporción actual de ese VGSC\alpha dentro del conjunto del ARNm de VGSC\alpha.

La secuencia entre las dos regiones altamente conservadas de enlace de plantilla es muy diferente en todos los VGSC\alpha, permitiendo discriminación entre tipos de VGSC\alpha mediante secuenciación de ADN o mediante PCR (utilizando plantillas específicas de VGSC\alpha que solo amplificarían productos de un tipo de VGSC\alpha)

Los productos de un solo tipo de gen de Na_{v}1de VGSC\alpha, SCN9A (PN1/hNe-Na), eran abundantes en las identificaciones de todos los extractos altamente metastáticos (tanto derivados de ratas como de humanos): 37,3 \pm 8,7% y 45,0 + 3,0% para las células MAT-LyLy y PC-3, respectivamente. En contraste, no se encontraron productos del gen SCN9A en las identificaciones realizadas en las células correspondientes débilmente metastáticas. El SCL-11 fue también más frecuente en las identificaciones del MAT-LyLu (55,3 \pm 7,3%) en comparación con las células AT-2 (10,7 \pm 7,7%).

Se identificaron numerosos clones no VGSC. Como es aparente a la persona experta en la técnica, los clones se clasificaron como no VGSC si podían ser equiparados a entradas de secuencia conocidas de ADN GenBank que no codificaban a los VGSC\alphas o si representaban ADNcs previamente no publicados que no poseyeran secuencias con motivos de secuencia conservados de los VGSC\alpha en la región delineada de la plantilla degenerada. El porcentaje de clones con una identidad no VGSC\alpha fue mayor en las células débilmente metastáticas en comparación con la contraparte fuertemente metastática (tanto en ratas como en humanos). Es más, los niveles generales fueron superiores en las identificaciones humanas que en las de ratas. El hCytb5R fue el no VGSC\alpha encontrado con mayor frecuencia en las identificaciones en células humanas (100% de clones no VGSC\alpha en PC-3 y 61% en LNCaP).

Pruebas PCR específicas de VGSC\alpha. Estas arrojaron productos para todos los VGSC\alpha encontrados en las identificaciones degeneradas (SCN1A, SCN7A y SCN9A para ADNssc derivados de MAT-LyLy; SCN1A, SCN2A, SCN4A, SCN7A, SCN11A para ADNssc derivados de AT-2), indicando que todos se expresaban como transcripciones de ARNm (y no derivados de ADN genómico). Adicionalmente, VGSC\alpha de ratas encontrado solamente en identificaciones AT-2 se expresaron en las células MAT-LyLu (RB2(SCN2A), rSkM1 (SCN4A) y NaN(SCN11A)). Los VGSC\alpha (SCN9A) encontrados solamente en las identificaciones de células fuertemente metastáticas (MAT-LyLu y PC-3) se expresaban en algunos o en todos los extractos de células débilmente metastáticas (PN1 detectado en uno de tres extractos AT-2; hNe-Na en ambos extractos LNCaP).

El análisis de secuencias indicó que diversas formas de empalma de SCN2A, SCN3A, SCN8A y SCN9A se expresaban tanto en células fuertemente y débilmente metastáticas (Fig. 2). Estas formas empalmadas consistían tanto en formas neonatales como adultas de SCN2A, SCN3A y SCN8A pero solo la forma neonatal de SCN9A (10 y 12 clones secuenciados, respectivamente para células de ratas y humanos). De manera interesante, las formas neonatales eran aparentemente más abundantes que las formas adultas tanto en las células humanas fuertemente como débilmente metastáticas para SCN2A y SCN3A (8 vs. 1 clon para ambos VGSC\alpha). En contraste, la forma adulta de SCN2A era más abundante en ambas células MAT-LyLu y AT-2 (13 vs. 2 clones).

Las formas empalmadas truncadas (denominadas \Delta), sin todos los axones debido al des-empalme de axones adultos y neonatales de la transcripción del ARNm, también se amplificaron y secuenciarios a partir de SCN2A (en las células AT-2), SCN8A y SCN9A (Fig. 2). El \DeltaSCN9A se encontró solo en las células fuertemente metastáticas (rata y humanas). Asumiendo el marco publicado abierto de lectura, las transcripciones para SCN2A, SCN3A y SCN9A codificarían a proteínas de VGSC\alpha truncadas en D1:S3 y todas las D3:S4, tal como se describió anteriormente (48). Adicionalmente, una forma de empalme RB2 (SCN2A) contentiva de axones neonatales y adultos se secuenció (a partir de extractos AT-2), representando una transcripción Rb2 parcialmente empalmada. Esto se traduciría a una proteína RB2 truncada inmediatamente después del D1:S3 neonatal (Fig. 2).

Cuatro de los tipos de VGSC\alpha (SCL-11, RB2, HB3 y hNaN6) diferían ligeramente de las secuencias publicadas respectivas en las regiones clonadas. El análisis parcial de secuencia también reveló que los hNe-Na (en células PC-3 y LNCaP) diferían de la secuencia correspondiente GenBank en parte de la región no codificada 3'. Estos cambios se muestran en la Tabla II. Se espera que también estén presentes otros cambios, particularmente en las regiones no codificadas.

TABLA II Diferencias de nucleótidos (nt) en los VGSC\alpha parcialmente secuenciados en comparación con las secuencias GenBank. Se muestran los cambios de los aminoácidos deducidos y el grado de conservación relativa de los residuos cambiados en otros VGSC\alphas

3

4

SQT-PCRs. Los resultados típicos de electroforesis se ilustran en las Figuras 3 y 4 para VGSC\alpha de ratas y humanos respectivamente. Asumiendo que las reacciones de PCR realizadas sobre extractos celulares de ARN fuerte y débilmente metastáticos tuvieran eficiencias similares, las diferencias en los valores calculados CN_{t} y CN_{e} (derivados de las imágenes de gel) reflejarían diferencias reales en los niveles de expresión. En concordancia con este supuesto, el amplicón de control (Cytb5R) mostró una diferencia pequeña o ninguna en extractos de células de ratas (CNt = 18,3 \pm 0,2 vs. 17,3 \pm 0,4; Cne = 23,1 \pm 04 vs, 22,1 \pm 0,2) o humana (CNt = 19,2 \pm 0,3 vs, 19,5 \pm 0,4; CN_{e} = 23,5 \pm 0,2 vs. 23,4 \pm 0,3).

Aún más, la utilización de los valores derivados de CN_{t} y CN_{e} permite calcular las diferencias absolutas aproximadas en los niveles de expresión de los VGSC's (asumiendo un 80% de eficiencia PCR (Bishop et al (1997) Inmunol Cell Biol 75, 142-147)), como se muestra en la Tabla III (a y b).

En células MAT-LyLu versus AT-2, solo dos VGSC\alpha (PN1 y SCL-11) requirieron una amplificación marcadamente menor para aportar productos detectables y alcanzar CNe, indicando un mayor nivel de expresión en las células MAT-LyLu. De manera importante, la diferencia más significativa se vio en PN1: CN_{t} = 25,2 \pm 0,5; CNe = 29,2 \pm 0,4 (Fig 3a). De hecho, el PN1 nunca se detectó en los dos extractos celulares AT-2 estudiados extensivamente aún después de 45 ciclos; estaba presente un nivel aparentemente bajo de PN1 en un tercer extracto AT-2 (CNT = 35,7 \pm 0,3).

Otro VGSC (RB2) mostró una diferencia notable de dependencia celular en el perfil de amplificación (Fig. 3e); sin embargo, los resultados indicaron niveles generales bajos de expresión: CN_{t} = 35,4 \pm 0,4 (MAT-LyLu) vs. 29,8 \pm 0,8 (AT-2). También se constataron diferencias menores de dependencia celular para los rSkM1 (Fig. 3d) y NaN/SNS2 (Fig 3f), nuevamente el mayor nivel de expresión ocurrió aparentemente en las células débilmente metastáticas. Un VGSC\alpha, RB1, no mostró diferencia obvia en los niveles de expresión entre las dos líneas celulares (Fig. 3c).

En los extractos PC-3 vs LNCaP, la diferencia más sobresaliente de dependencia celular fue en el caso del hNe-Na (Fig. 4ª), el ortólogo de PN1: CN_{t} = 25,7 \pm 0,8 (PC-3) vs. 37,7 \pm 0,3 (LNCaP). También se produjeron diferencias entre los niveles de expresión de hNa6, HB2 y HB3 a lo largo de dos líneas celulares (CNt = 22,6 \pm 0,5 vs. 26,8 \pm 0,2; 26,8 \pm 0,5 vs. 30,7 \pm 0,5; 34,0 \pm 0,7 vs. 39,7 \pm 0,9, respectivamente), de nuevo con un mayor nivel en las células PC-3, pero mucho menores que para el hNe-Na.

Los resultados de los SQT-PCRs que amplificaban las isoformas neonatales (HNa6N) y adultas (HNa6A) de hNa6 (Fig. 4f y 4g) indicaban que ambas formas se expresaban en niveles mayores en las células fuertemente metastáticas con respecto a las débilmente metastáticas: CN_{t} = 25,3 \pm 0,3 vs 28,0 \pm 0,0, CNe = 28,1 \pm 0,2 vs. 31,8 \pm 0,3 para la forma neonatal y CN_{t} = 36,7 \pm 0,3 vs> 45,0 para la forma adulta respectivamente. Estos valores de CN_{t} también sugieren que la forma neonatal se expresaba a un nivel mucho mayor en la forma adulta en ambas líneas celulares.

Los SQT-PCRs para SCN2A, SCN3A, SCN8A y SCN9A que arrojaban productos múltiples se muestran en la Figura 2. Por tanto, los niveles relativos de expresión de los VGSC\alpha de scn2a, scn3a, scn8a y scn9a determinados están compuestos de diferentes formas de estos VGSC\alpha. El producto múltiple de SQT-PCRs generalmente coincidía con los resultados del producto simple de los SQT-PCR; es importante por ejemplo que los niveles de expresión de los VGSC fueran superiores en PC-3s que en LNCaPs. Las formas neonatales/adultas aparecían consistentemente como las variantes de empalme expresadas de manera dominante de RB2, HB3, PN1 y hNe-Na, con productos evidentes a un número de ciclo más bajo que otras isoformas. Para el HB2, sin embargo, tanto las isoformas \Delta como las neonatales/adultas se expresaban aparentemente a niveles semejantes (Fig. 2a). En contraste, la expresión hNa6 parecía que era dominada por la forma neonatal en las células LNCaP y por las formas neonatales y \Delta en células PC-3 (Fig. 2c).

\newpage

Discusión

En este estudio desarrollamos métodos novedosos RT-PCR para investigar la expresión del gen múltiple de VGSC\alpha en líneas celulares de cáncer de próstata y demostramos (i) que los VGSC\alphas múltiples y sus variantes de empalme se expresaban tanto en líneas de células de cáncer de próstata fuertemente como débilmente metastáticas derivadas de fuentes humanas y de ratas; (ii) que el nivel general de expresión del VGSC\alpha era considerablemente mayor en células fuertemente metastáticas con respecto a las débilmente metastáticas; y (iii) que la expresión de tipo funcional particular de VGSC\alpha -el producto de SCN9A (PN1/hNe-Na)- era predominante, siendo grandemente sobrerregulado en las células fuertemente metastáticas tanto en los modelos de cáncer de próstata de ratas como humanos.

Las líneas celulares utilizadas fueron elegidas para su estudio debido a sus habilidades metastáticas muy diferentes. Las células de rata AT-2 eran débilmente metastáticas cuando se inyectaban subcutáneamente en ratas de Copenhague (menos del 10% de los animales desarrollan metástasis de pulmón y de nodos linfáticos (Isaacs et al (1986) Prostate 9, 26-281); en contraste, las células MAT-LyLu son fuertemente metastáticas (más del 80% de los animales desarrollan metástasis de pulmón y de nodos linfáticos (Isaacs et al (1986)). De manera similar, las células PC-3 humanas, cuando se inyectaban subcutáneamente en ratones atímicos desnudos, se metastatizaban fácilmente, resultando en metástasis de los nodos linfáticos en las axilas en el 56% de los animales (Shevrin et al (1989) Prostate 15, 187-194; Waters et al (1995) Prostate 26, 227-234), mientras que las células LNCaP no metastatizaron en ratones atímicos ((Lee et al (1993) Cancer Metastatsis Rev 12, 21-28). Es más, a la inyección ortotópica en la próstata de ratones recipientes desnudos, la variante metastática de células PC-3 trajo como consecuencia metástasis de nodos linfáticos en el 90% de los animales, a la vez que las células LNCaP también desplegaron tumorigenicidad pero no mostraron metástasis evidentes de nodos linfáticos (Stephenson et al (1992) J Natl Cancer Inst 84, 951-957).

Aspectos metodológicos - La técnica de identificación de plantilla degenerada PCR permitió, inicialmente, la determinación de los VGSC\alphas expresados en estas células. Otras técnicas, incluyendo una técnica de asimilación de una enzima degenerada de restricción PCR (Fiell, J et al (1997) Mol Brain Res. 50, 197-204) y mancha Blott utilizando ensayos comunes de VGSC\alphas (Beckh, S. (1990) FEBS Letts. 262, 317-322) han sido empleados de manera similar para muestrear la expresión de VGSC\alphas. Sin embargo, a diferencia de tales métodos, las identificaciones degeneradas también arrojan información cuantitativa. Debido a que nuestras plantillas degeneradas PCR estaban diseñadas para dos regiones altamente conservadas de todos los VGSC\alphas publicados (en D3:S5 y D3:S5/S6), es probable que todos los VGSC\alphas de la subfamilia Nav1 fueran amplificados esencialmente con la misma eficiencia, esto es, las proporciones relativas de los VGSC\alphas en las identificaciones reflejan en líneas generales sus abundancias relativas en el ARNm celular. Esto es corroborado por los datos de los SQT-PCR, que se corresponden muy de cerca con los resultados de las identificaciones, particularmente cuando se comparan las diferencias estimadas en los niveles de expresión de los VGSC\alphas entre células fuertemente y débilmente metastáticas (Tabla IIIa y IIIb). Por tanto, aunque la identificación y los resultados de los SQTPCR no pueden utilizarse directamente para determinar los niveles absolutos de la expresión de los VGSC\alphas, la información concerniente a los niveles de los ARNm de VGSC\alphas relativa entre sí estaba representada por el porcentaje de clones de cada tipo en las identificaciones (screens).

De manera importante, la diferencia más significativa radicaba en el SCN9A, que se expresaba al menos 1 000 veces mayor en la células fuertemente metastáticas. El SCN9A también era el VGSC predominante en las líneas celulares fuertemente metastáticas, representando alrededor del 80% de la población de ARNm "de VGSC\alphas funcionales" en las células MAT-LyLu y PC-3.

La utilidad del PCR para el análisis cuantitativo está limitada por la pérdida de cuantificación en una cierta etapa de la amplificación más allá de la cual la reacción cesas de amplificar exponencialmente y eventualmente alcanza una meseta (Morrison, C. & Gannon, F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1219, 493-498). Consecuentemente, la mayoría de las técnicas PCR "cuantitativas" comúnmente utilizadas (revisadas en Morrison & Gannon 1994), requieren de atención a esta evolución de la amplificación no exponencial. Este punto se determinó fácilmente con los novedosos análisis de datos SQT-PCR introducidos en el presente estudio. Se aplicó el análisis de datos de polinomio de tercer orden a una técnica simple y breve de SQT-PCR, basada en la observación cinética, para determinar la etapa del PCR (representada como el número de ciclo CN_{e}) en la cual cesaba la amplificación exponencial. El CN_{e} podía entonces ser utilizado como un valor de referencia, para una comparación fácil y directa de los niveles de ARNm de VGSC en diferentes líneas celulares, de manera similar a las comparaciones de CN_{t}. Sin embargo, el CN_{e} es probable que sea un parámetro más confiable que el CN_{t} ya que (1) se deriva de varios puntos de datos en lugar de una lectura del CNT; y (2) es un valor no continuo y no discreto, y por tanto más preciso.

En conclusión, nuestras técnicas novedosas de identificación degenerada y de SQT-PCR produjeron un perfil cuantitativo consistente de la expresión de los VGSC\alphas en estas células. El nivel de confianza en este análisis se acrecentó adicionalmente debido a la robustez de los datos de control Cytb5R obtenidos a partir de diferentes líneas celulares. Ambos métodos, especialmente en combinación, representan por tanto nuevos medios poderosos para un análisis rápido, confiable, cualitativo/cuantitativo de la expresión del ARNm de VGSC\alphas, particularmente útil al comparar células de diferente fenotipo, o del mismo tipo de célula bajo condiciones diferentes.

TABLA III Diferencias calculadas en los niveles de expression de cada VGSC\alpha entre líneas celulares fuertemente y débilmente metastáticas (a) de ratas y (b) humanas

Las diferencias se muestran para valores CN_{t}, CN_{e} (de SQT-PCR) y para los datos de la identificación y se presentan como factores de multiplicación. Los valores positivos y negativos indican niveles de expresión más elevados y más bajos respectivamente, en las células fuertemente metastáticas versus débilmente metastáticas. Las diferencias CN_{t} y CN_{e} se calcularon asumiendo un 80% de eficiencia PCR en cada caso (similar a la reportada en Bishop et al (1997) Immunol Cel BIOI 75, 142-147)), de acuerdo a la siguiente ecuación: 1,8[^{valor MAT-LyLu} - valor AT-2] (45). Las diferencias de las identificaciones degeneradas se calcularon asumiendo un nivel de expresión equivalente de los estándares degenerados (RB1 para las identificaciones de ratas; hCytb5R para las de humanos), anotadas como "std" en las células fuertemente y débilmente metastáticas. "ND" indica que la diferencia no pudo ser determinada.

TABLA III a

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Los resultados de la identificación fueron consistentes con el nivel total de los ARNms de VGSC siendo muy diferentes entre las células fuertemente y débilmente metastáticas. Los datos SQT-PCR sugirieron que los niveles de expresión de Cytb5R en células de diferente potencial metastático (tanto en ratas como en humanos) eran muy similares. En correspondencia, la incidencia incrementada de este clon no VGSC\alphas en las identificaciones degeneradas de las células débilmente metastáticas LNCaP y AT-2 (Tabla I) indicaban una tasa inferior VGSC\alphas objetivo a ruido en estas células en comparación con su contraparte fuertemente metastático (de ahí un nivel inferior de expresión del VGSC\alphas).

Los resultados de este estudio muestran por tanto, que ocurre un nivel basal de la expresión del ARNm de VGSC\alpha en las células débilmente metastáticas y que este se sobre regula considerablemente en el fenotipo fuertemente metastático. Tal nivel basal de la expresión del ARNm de VGSC\alpha en células débilmente metastáticas concurre con resultados previos de citometría de flujo (38) que revelaron un nivel bajo de proteína VGSC\alpha en células LNCaP y AT-2, a pesar de la ausencia de corrientes VGS detectables electrofisiológicamente. La expresión de VGSC\alpha en células epiteliales no cancerosas de próstata no ha sido investigada en este Ejemplo. Se requiere de un trabajo adicional para determinar si la expresión basal de los VGSC\alphas está asociada con neoplasma o es característica de células epiteliales de próstata normal.

Los resultados de las identificaciones (screening) y de los SQT-PCR no pueden utilizarse directamente para determinar niveles absolutos de la expresión de los VGSC\alphas. Sin embargo, los PCRs de identificaciones degeneradas podrían amplificar todos los VGSC\alphas de una subfamilia dada (esto es, Na_{v}1s) con aproximadamente la misma eficiencia que los PCR, reteniendo por tanto información de los niveles de expresión de los VGSC\alphas entre sí en el ARNm celular. Por tanto, debe ser posible comparar las abundancias relativas de éstos en las identificaciones y relacionar estas abundancias a las proporciones relativas de VGSC\alphas particulares en el ARNm de las células. Los datos disponibles son consistentes con los perfiles relativos de expresión de los VGSC\alphas mostrados en la Figura 5. En esta estimación, los productos del gen SCN9A representan un 80% de la población de ARNm de e" VGSC\alpha funcional" en las células MAT-LyLu y PC-3.

Multiplicidad de expresión de los VGSC\alphas. Aunque el nivel de expresión del ARNm de VGSC\alpha fue mucho mayor en las células fuertemente metastáticas MAT-LyLy, y que muchos tipos de VGSC\alphas se expresaron en niveles superiores en células fuertemente versus débilmente metastáticas, se encontró que estaban presentes tres genes VGSC\alphas de baja expresión (SCN2A, SCN4A y SCN11A) en niveles ligeramente superiores en las células débilmente metastáticas. Esto indica fuertemente que estos VGSC\alphas no contribuyen normalmente a las corrientes de VGS detectadas en las células MAT-LyLu, pero que la significación fisiológica, de existir, y los mecanismos que controlan esta subregulación de expresión, tienen que ser determinados. En contraste, en las líneas celulares humanas, todos los VGSC\alphas detectados se expresaban a niveles superiores en las células PC-3 fuertemente metastáticas.

La expresión de VGSC\alphas múltiples se ha demostrado previamente en células DRG de ratas adultas, células PC12 (49) y cultivos de astrositos de la médula espinal (12). Las líneas de células epiteliales de cáncer de próstata estudiadas aquí representan otro tipo de célula en la que se ha mostrado la existencia de la expresión simultánea de VGSC\alphas múltiples dentro de las células. En el presente, la consecuencia funcional de esta expresión múltiple dentro de un tipo de célula individual no está clara. La expresión de VGSC\alphas en estas células puede ser dramáticamente y rápidamente sobre o subregulada en respuesta a numerosos estímulos, tales como factores de crecimiento y axotomía (14, 17, 49) en una manera de subtipo específico. Esto implicaría fuertemente que diferentes VGSC\alphas poseen diferentes funciones, cuya importancia relativa puede cambiar rápidamente bajo condiciones diferente. Puede ocurrir rápidamente una sintonización para poder equiparar el perfil de la expresión de los VGSC\alphas de la célula a la respuesta funcional requerida. Es muy probable que tales cambios en el perfil funcional de los VGSC\alphas puede lograrse solamente mediante la regulación de diferentes VGSC\alphas que ya se hayan expresado y no mediante el proceso más lento de "encendido" de los genes de VGSC\alphas. Por tanto, la expresión de VGSC\alphas multiple de bajo nivel, pudiera capacitar a las células para enfrentar requerimientos funcionales necesitados por parte de cambios dinámicos en su microentorno.

Se han detectado VGSC's en numerosos tejidos "no excitables" incluyendo tipos epiteliales tales como el pigmento de retina, los lentes y el epitelio de la córnea, donde su papel funcional es mayormente desconocido (42, 50, 51). Se ha determinado un papel funcionales de los VGSC's que no involucra la producción de potenciales de acción en astrositos de la médula espinal in Vitro (52). En estas células, los VGSC's en su lugar, aportan un recorrido de regreso para el Na^{+}, manteniendo la actividad Na^{+}/KTPAse. Otros papeles de los VGSC's en células no excitables pueden incluir la producción de potenciales graduados involucrados en homeostasis intercelular del Ca^{2+} o la activación de diversos recorridos intracelulares de señalización (52).

Altos niveles de expresión de "VGSC\alphas no funcionales" en células de cáncer de próstata. La capacidad de las transcripciones del ARNm de los SCN7A y SCN8A encontradas en las células MAT-LyLu y PC3 para crear VGSC's funcionales es dudosa. El SCN7A codifica a un VGSC\alpha que no tiene una capacidad probada de formación de canales. Aunque se conoce que el gen SCN8A es capaz de producir proteínas funcionales de VGSC, es cuestionable si los productos específicos del gen SCN8A expresados en las células cancerosas de próstata humana pueden funcionar como canales viables en estas células. El hNa6N codifica para una proteína VGSC\alpha altamente truncada que posee solamente D1 y D2 (44). Esta variante se encontró en tejidos no neuronales y neonatos y propuso ser incapaz de formar VGSC's funcionales, actuando por el contrario como un mecanismo "libre de fallos" para evitar la síntesis de proteína adulta HNa6 de VGSC\alpha de longitud total (44). En efecto, se ha utilizado con éxito una subunidad-\alpha altamente truncada de canal K^{+} regulado por voltaje para suprimir artificialmente corrientes K^{+} endógenas en las células anteriores de la pituitaria de ratas (53). La isoforma adulta del hNa6 también se encontró que se expresaba tanto en células humanas fuertemente como débilmente metastáticas a un nivel muy bajo, pero es probable que la presencia de la isoforma neonatal evita la expresión funcional del hNa6A. La variante hNa6A, que ha perdido efectivamente el segmento S4 sensor de voltaje en D3, es similar a las formas empalmadas \DeltahNe-Na, \DeltaPN1, \DeltaHB2 y \DeltaRB2 encontradas en las pruebas PCR específicas. Es probable que estas transcripciones representen formas des-empalmadas no viables de genes SCN8A, SCN9A y SCN2A de VGSC\alpha (48). La ocurrencia de de VGSC\alphas aparentemente no funcionales pudiera ser un medio adicional de regulación de la expresión efectiva de los VGSC en las células del cáncer de próstata.

Expresión predominante de PN1/hNe-Na en células fuertemente metastáticas. Los resultados de las identificaciones degeneradas y los SQT-PCR demostraron consistentemente que el PN1/hNe-Na era el VGSC\alpha predominante expresado en las células fuertemente metastáticas. Es más, los datos de secuencia indicaron que la mayoría de las transcripciones de SCN9A estaban en la forma neonatal. De hecho, la forma empalmada adulta solamente se ha encontrado hasta la fecha a niveles muy bajos en células neonatas de conejo Schwann (21), así que al presente no está claro si el empalme alternativo D1:S3 del gen SCN9A está regulado en su desarrollo. Puede ser notable que todos los VGSC's que se encontraron empalmados alternativamente en D1:S3 en las células de cáncer de próstata, excepto en el RB2, se expresaban también principalmente en la forma neonatal.

El presente estudio brinda un ejemplo de la expresión del gen SCN9 en carcinoma, indicando que la sobrerregulación de la expresión del gen SCN9A podría ser un fenómeno común asociado a un carcinoma. El hNe-Na se clonó originalmente y secuenció a partir de la línea celular clonal C de un carcinoma humano medular de tiroides (células hMTC) y se encontró que se expresaba en el tejido de células C de carcinoma humano (54). El clon PN1 se obtuvo a partir de células PC12, derivadas de un feocromocitoma de la médula adrenal de la rata (49). No hay sugerencia de un vínculo entre la expresión del hNe-Na o PN1 y el carcinoma en estos estudios.

Los productos de SCN9A se encontraron previamente a altos niveles en sistema nervioso periférico y a niveles mucho más bajos en el cerebro, médula espinal, células Schwann, corazón y glándulas adrenal y tiroides (49, 54-56), particularmente en células neuro-endocrinas (54,55). Las células neuro-endocrinas también están presentes en la próstata. Estudios recientes sugieren que su proliferación y diferenciación pueden predecir la progresión del cáncer de próstata (Cohen et al (1994) Cancer 74, 1899-1903; Anthony di Sant'Agnese, P. (1998) Prostate Suppl. 8, 74-79; Bonkhoff, H. (1998) Prostate Suppl. 8, 18-22). Las células neuro-endocrinas prostáticas carecen de receptores nucleares andrógenos detectables (Bonkhoff, H et al (1993) Virchows Arch. A. Pathol. Anat. 423, 291-294; Krijnen, J et al (1993) Histochemistry 100, 393-398), sugiriendo que ellas son andrógeno-insensibles. Esta insensibilidad neuro-endocrina puede jugar un papel en los mecanismos responsables de la progresión de adenocarcinomas prostáticos a la insensibilidad andrógena. De forma intrigante, los andrógenos pueden inhibir la actividad los VGSC's (Tabb, J.S et al (1994) J. Neurosci. 14, 763-773) y pueden también disminuir la expresión de los ARNm de VGSC\alpha como se ha visto que lo hace otras hormonas de esteroides (Rich, M.M., Kraner, S.D. and Barchi, R.L. (1999) Neurobiol. Dis. 6, 515-522). Por tanto, puede ser que ocurra un alto nivel de expression de los ARNm de VGSC\alpha en células epiteliales prostáticas con el cambio a insensibilidad andrógena.

Donde puedan hacerse las comparaciones, las características electrofisiológicas y farmacológicas del PN1 y
VGSC's del tipo hNe-Na son muy similares a las de las corrientes VGS observadas en las células de cáncer de próstata altamente metastáticas en ratas y humanos, (36, 37, 39, 49, 54, 56). Esto es consistente con el hecho de que los productos SCN9A sean específicamente la fuente de las corrientes VGS registradas en estas células. Como estos VGSC se ha demostrado que potencian el proceso invasivo (36-38), puede esperarse que tengan un patrón particular de distribución subcelular, la interacción con el citoesqueleto y/o propiedades electrofisiológicas especializadas que faciliten esta actividad. De hecho un estudio reciente electrofisiológico ha resaltado una propiedad aparentemente singular del hNe-Na, un ritmo muy bajo de desactivación de estado cerrado. Esto permite la producción de "corrientes de rampa" en respuesta al estímulo lento pero gradualmente incrementado del subumbral (Cummins et al (1998) J. Neurosci. 18, 9607-9619); los VGSC's con ritmos de desactivación más rápidos de estado cerrado son incapaces de responder a tal estímulo.

La proteína PN1 también tiene una localización subcelular específica en el factor de crecimiento de nervios (NGF) de células diferenciadas PC12 y cultivos de neuronas DRG de ratas, estando presente específicamente en terminales de neuritas y en bordes directores de los conos de crecimiento (49). El NGF sobrerregula la expresión PN1 en células PC12 y esto es seguido por la diferenciación morfológica de una configuración redonda a altamente ramificada, indicando un papel para este VGSC\alpha en el enriquecimiento de la morfología celular (57). Consistente con esto, el tratamiento TTX tuvo el efecto opuesto sobre la morfología de las células MAT-LyLu, causando la retracción de sus procesos y haciéndose compactas (58).

La determinación de productos del gen SC9A específicamente como el origen de expresión funcional de los VGSC en células metastáticas de cáncer de próstata, tanto en modelos humanos como de ratas de la enfermedad, permite ahora el uso de experimentos más específicos para dilucidar aún más todos los aspectos del mecanismo metastático: (1) elementos en el curso superior del gen SCN9A, que efectúan el incremento en la expresión de este gen específicamente, por ejemplo hormonas, factores de crecimiento y factores/represores de transcripción; (2) elementos en el curso inferior que permiten la expresión del SCN9A para potenciar la invasión/metástasis.

Expresión posible de otras subnidades de VGSC en células de cáncer de próstata. El presente estudio solo intenta caracterizar la expresión del ARNm de VGSC en las células fuertemente y débilmente metastáticas, ya que los VGSC\alpha por sí solos son suficientes para codificar a VGSC's funcionales. La multiplicidad de la expresión de los VGSC's determinada por las células de próstata puede complicarse más debido a la posible expresión a niveles aún más bajos de transcriptos de otros VGSC\alphas y por la expresión de VGSC\alphas. Los productos de los genes SCN1A, SCN2A, SCN3A, SCN4A SCN8A se asocian comúnmente con uno o más VGSC\alphas y por tanto es probable que alguna expresión de los VGSC\alphas ocurra en estas células. Sin embargo, los productos del gen SCN9A no parecen asociarse con los VGSC\alphas (54,55), así que no es probable que estas subunidades auxiliares hagan una contribución fundamental a los mecanismos responsables del alto nivel de la expresión de los VGSC's funcionales en las células metastáticas.

No es cierto que todos los genes de VGSC\alpha que se encontró se expresaban en estas células se traduzcan realmente en proteínas. Si todos los genes de VGSC\alpha expresados pueden ser traducidos potenciales, tal multiplicidad en las células pudiera capacitar la rápida sobrerregulación o subregulación de los VGSC\alphas (potencialmente más rápido que "el encendido" de la transcripción de los genes de VGSC\alpha), en una manera específica de subtipo, en la respuesta de las células a diversos estímulos, tales como factores de crecimiento y daño (Fjell et al (1999) Molec Brain Res 67, 267-282; Dib-Hajj et al (1996) PNAS 93, 14950-14954; Toledo-Aral et al (1997) PNAS 94, 1527-1532). Esto implicaría que diferentes VGSC\alphas subsirven diferentes funciones, cuya importancia relativa puede cambiar fácilmente bajo condiciones diversas. Por tanto, la expresión múltiple, de bajo nivel de los VGSC\alphas pudiera capacitar a las células para enfrentar requerimientos funcionales necesitados debido a los cambios dinámicos en su microentorno.

Observaciones concluyentes

El presente estudio tiene dos grandes implicaciones. Primero, la caracterización de los perfiles de expresión de los ARNm de VGSC\alphas funcionalmente diferentes de las células epiteliales prostáticas establece que estas células constituyen un modelo conveniente para el estudio de los patrones, regulaciones y consecuencias funcionales de (i) la expresión de VGSC en células no excitables y (ii) el concepto emergente de la multiplicidad de expresión de los VGSC, esto es, la expresión de múltiples subunidades de VGSC's y las múltiples formas de empalme de estas subunidades en un solo tipo de célula. Segundo, con respecto al cáncer de próstata en sí mismo, existe una limitante seria en los métodos actuales de manejo consistente en que los marcadores para el fenotipo metastático (tal como un antígeno específico de próstata) no sean confiables (59,60). Por tanto, los cánceres clínicamente importantes no pueden distinguirse con rapidez de aquellos que no sean clínicamente importantes y de hecho no requieran un tratamiento agresivo (que está asociado con una alta morbilidad del paciente). La identificación de los productos del gen SCN9A como VGSC\alpha predominante tanto en los modelos humanos como de rata del cáncer de próstata subraya la conservación de la expresión de los VGSC\alphas en las líneas celulares fuertemente metastáticas de cánceres de próstata. En correspondencia, el presente estudio apoya aún más el valor potencial de estos canales de iones en el posible diagnóstico y terapia de la enfermedad.

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TABLA 1 Plantillas de PCR utilizadas en identificación de plantillas degeneradas de VGSC de líneas celulares de cáncer humano y de próstata. Las temperaturas y posiciones de temple respecto a las secuencias publicadas se indican entre corchetes. Los números de accesión de secuencias son: hNe-Na (X82835), HB2 (M94055), HB3 (AF035685), RB1 (X03638), RB2 (X03639), SCL-11 (Y09164), PN1 (U79568), rSkM1 (Y17153), NaN (AF059030)

600

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Ejemplo 2 Diseño de oligonucleótidos de reacción inversa para la supresión de la expresión de VGSC's en cáncer humano de próstata

1. Alineación de todos los tipos de VGSC's conocidos actualmente para identificar sitios potenciales para el diseño de oligonucléotidos de reacción inversa de subtipos específicos de VGSC

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En la alineación anterior se ha utilizado el equivalente de VGSC humano donde haya sido posible. La alineación ha sido optimizada mediante la introducción de baches de secuencia indicados por un guión aunque los baches no están presentes actualmente en la secuencia real o en algún diseño de oligonucleótido. Los nucleótidos de ocurrencia más común se indican en la línea de consenso (Cons). Los sitios potenciales para el diseño de oligonucleótidos de reacción inversa 20-meros están resaltados y subrayados en los cuatro tipos de VGSC humanos que han sido encontrados tanto en las identificaciones degeneradas como en las pruebas específicas de PCR con respecto a las líneas de células PC-3 y LNCaP. La región menos conservada del fragmento producido por la identificación degenerada ha sido utilizada para producir esta alineación.

También sería posible diseñar oligos de reacción inversa de 20-ómeros en el vinculador citoplásmico ¾ (donde la secuencia de VGSC está altamente conservada a lo largo de todos los tipos) que sean capaces individualmente de "silenciar" simultáneamente a un número de tipos de VGSC. Por ejemplo, a continuación se muestran alineadas las mismas secciones de 20 nucleótidos del vinculador de ¾ de tres tipos de VGSC's. En esta sección, las secuencias del hNe-Na y del cerebro humano 2 son idénticas y la secuencia hSkM1 difiere en solo dos posiciones de nucleótidos. Por tanto, en esta región es posible diseñar dos oligonucleótidos de reacción inversa que desactivarán al menos tres de los canales (posiblemente cuatro cuando la secuencia Na6 (humana) sea confirmada para esta región).

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7

TABLA 2a Resultados de la identificación de plantilla degenerada de VGSC\alpha de las líneas de células (a) para los MAT-LyLy y AT-2 derivados de ratas, y (b) para los PC-3 y LNCaP derivados de humanos, expresados como porcentajes de líneas celulares testadas

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TABLA 2b

9

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TABLA 3 Variantes empalmadas de VGSC\alpha encontradas hasta la fecha en las líneas celulares de cáncer de próstata altamente y débilmente metastáticas. Donde se describen formas adultas y neonatales del tipo VGSC\alpha, se especifica la forma encontrada en las células de cáncer de próstata. \Delta denota variantes de empalme con falta de codificación de axones para el segmento S4 de D1 o D3 (ver sección 4.3)

10

Ejemplo 3 La expresión de canal Na^{+} regulado por voltaje se corresponde con la progresión patológica en el cáncer humano de próstata

Los estudios electrofisiológicos previos han demostrado que los canales funcionales de Na^{+} regulados mediante voltaje (VGSC's) se expresan selectivamente mediante líneas de células altamente metastáticas del cáncer de próstata de ratas (MAT-LyLu) y humanos (PC-3). Es más, el bloqueo de estos canales con tetrodotoxina redujo significativamente la invasión de las células in Vitro (Grimes et al. (1995) FEBS Letts. 369, 290-294; Laniado et al (1997) Am. J. Pathol. 150 1213-1221. La correlación directa, positiva entre el nivel de invasión y la expresión de la proteína de canal Na^{+} mediante diversas líneas celulares de cáncer de próstata en ratas y en humanos se demostró subsecuentemente por Smith, et al. (1998) FEBS Lens. 423,19-24. Sin embargo, no se sabe si la expresión del VGSC ocurre en la próstata humana in vivo, y de ser así, si los niveles de expresión se relacionan con el perfil metastático de las células epiteliales malignas constitutivas.

La localización inmunohistoquímica de la proteína del VGSC en secciones de tejido de próstata humana que contienen conductos epiteliales de diverso carácter metastático, incluyendo células cancerosas in situ e invasivas, se ilustra en la Figura 6. Se observó un fuerte incremento en la intensidad de la coloración a medida que el carácter patológico de las células epiteliales progresaba de normal hacia la neoplasia invasiva (Fig. 6-A a E). En la hiperplasia prostática benigna (BPH), el nivel de la expresión de VGSC por parte de las células epiteliales constitutivas fue muy bajo y predominantemente restringido a células basales (Fig. 6A). En la neoplasia intraepitelial de bajo grado de próstata (PIN de bajo grado), el nivel total de expresión se incrementó con una coloración inmunohistoquímica de las células basales algo más intensa (Fig. 6B). Para ambos BPH y PIN de bajo grado tomados de conjunto, la tasa ápica: basal de densidad óptica fue de 0,7 \pm 0,05 (n = 45º conductos; 30 secciones, 10 pacientes). Se notó un incremento marcado paso a paso en la expresión del VGSC asociado con la aparición de PIN de alto grado reconocido mediante la arquitectura característica y los atributos citológicos de multicapas, discariosis severa y alargamiento nucleolar (Fig. 6C). Esta tendencia se mantuvo tanto en los conductos y acini que contenían malignidad in situ (InsM), donde las células basales estaban ausentes (Fig. 6D), así como en las células de cáncer invasivo (InvC) (Fig 6E). La expresión del VGSC fue prominente a lo largo de las membranas ápicas de plasma de las células epiteliales luminales en la etapa InsM (Fig. 6D). En el InvC, la coloración también fue intensa a lo largo de las membranas de plasma de las células (Fig 6E). Para un PIN de alto grado y las células epiteliales InsM tomados de conjunto, la tasa de densidad ápica: basal de coloración del VGSC fue de 1,57 \pm 0,19 (n = 750 conductos; 30 secciones; 10 pacientes). Esta tasa fue significativamente superior al compararla con la de conductos de PIN de bajo grado (P< 0,01).

En conclusión, el nivel enriquecido de la expresión del VGSC que hemos identificado previamente como el que está asociado con el fenotipo metastático de las células de cáncer de próstata in Vitro, ahora se ha confirmado que ocurre in vivo. Por tanto, parecería que la sobrerregulación de la expresión del VGSC funcional ocurre como un componente integral del potencial metastático incrementado. La actividad del VGSC pudiera contribuir a la metástasis enriqueciendo la extensión del proceso celular Fraser et al (1999) Cell Tissue Res. 295. 505-512), la motilidad (Fraser et al (1998) J. Physiol. 513.P, 131P), la invasividad (Grimes et al, 1995; Laniado et al, 1997; Smith et al, 1998) o la homeostasis intracelular (Foster et al (1999) Br. J. Urol. 83, 171-194). La polaridad citológica de la sobrerregulación del VGSC (apical vs. basal) pudiera a su vez, capacitar a la invasión direccional de los tejidos adyacentes. Las observaciones presentes traducen información fundamental obtenida previamente en sistemas modelo de líneas celulares derivadas de clones in Vitro a tejidos humanos primarios no seleccionados y no clonales. Estos resultados sugieren que la expresión de VGSC puede ser un requerimiento fenotípico de las células del cáncer metastático de próstata y por tanto representan un novedoso y valioso marcador para identificar dolencias potencialmente metastáticas al momento del diagnóstico primario del tejido.

Ejemplo 4 Regulación de la función del VGSC en las líneas celulares de cáncer de próstata

Se investigó la expresión funcional del VGSC en las células de roedores. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) sobrerregula la expresión funcional del VGSC. Como se muestra en la Figura 9, el EGF exógeno potencia la expresión funcional del VGSC. Este efecto se bloquea mediante la coaplicación del inhibidor EGF receptor de quinaza (AG1478; Calbiochem, San Diego, CA, USA). La aplicación del anticuerpo receptor EGF(Oncogene, Cambridge, MA, USA), también reduce la corriente basal del VGSC lo que implica que el fenómeno ocurre de forma endógena.

Otros factores de crecimiento (por ejemplo factor de crecimiento de nervios) y hormonas (incluyendo andrógenos) pueden tener efectos similares.

<110> Imperial College Innovations Limited

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<120> Diagnosis y tratamiento del Cancer

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<130> ICOY/P25041 PC

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<140>

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<141>

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<160> 71

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Peptido

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<400> 1

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\sa{Glu Tyr Thr Ser Ile Arg Arg Ser Arg Ile Met Gly Leu Ser Glu}

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<210> 2

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Peptido

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<400> 2

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\sa{Phe Trp Leu Ile Phe Ser Ile Met}

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<210> 3

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Peptido

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<400> 3

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\sa{Gln Val Ala Thr Phe Lys Gly Trp}

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<210> 4

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

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gcgaagctty tggytnatnt tynnnathat ggg

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

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ataggatcca nccnnnraan gcnacytg

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

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acgttagtgg aaatgtgcga

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<213> Secuencia Artificial

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atttaatgaa tcaatgccat

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atgttagtca aaatgtgcga

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<213> Secuencia Artificial

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attgctctca atgagagctt

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atttctttct attagtttta

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tgtatacagg ccaggtccgc

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aacaatacag agatcagatg

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\hskip-.1em\dddseqskip

tatgaccatg aataacccgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaggtttcc catgaacagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgcacgat tcttaccaac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtagtacc attcccatcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgacaatga gtaaccctcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgccgttg taatccgtag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attagtgttc tcaccgacag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatgacct tgagcaaccc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcccatg atcctgctcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtatctctgt ccattcagtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacagctgc tgaccgacca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgagcaacc ctcctgactg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggccactgc aaacatttat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttygargaya thtayathga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaatatggt actggcttcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaactgtgt gtttatgacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcagtacc attccaatcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catctgatct ctgtattgtt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtcaaagtt gatcttcacg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaggacct tccgtgtgct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcacacttg taccaccacg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgagtgtg aaagtcttat ggagagcaac aaaactgtcc gatggaaa

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtcggtgtg aaagccttct gtttaacgaa tccatgctat gggaa

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccgaatgtt ttgcccttat gaatgttagt caaaatgtgc gatggaaa

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgattgcc taaaactaat agaaagaaat gagactgctc gatggaaa

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hommo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgagtgca aagctctcat tgagagcaat caaactgcca ggtggaaa

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgactgtc aggctcttgg caagcaagct cggtggaaa

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgaatgtg aaaagcttat ggaggggaac aatacagaga tcagatggaa g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaagtctg agtgcgagag cctcatgcac acaggccagg tccgctggct c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaagagcc agtgtgagtc cttgaacttg accggagaat tgtactggac c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaagtccg agtgtcacaa tcaaaacagc accggccact tcttctgggt c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<403> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatgacaga agaacagaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<403> 45

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatgacaga agaacagaag

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatgacgga ggaacagaag

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

11

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Oryctolagus cuniculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

12

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<210> 49

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

13

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<210> 50

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Electrophorus electricus

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<400> 50

14

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<210> 51

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Equus caballus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

15

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<210> 52

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 52

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16

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<210> 53

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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\vskip0.400000\baselineskip

<403> 53

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17

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<210> 54

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 54

18

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<210> 55

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 55

19

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<210> 56

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 56

20

100

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<210> 57

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

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21

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<210> 58

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

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22

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<210> 59

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<211> 58

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

\newpage

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<400> 59

23

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<210> 60

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<211> 58

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 60

24

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<210> 61

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 61

25

\newpage

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<210> 62

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 62

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26

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<210> 63

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<211> 62

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

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27

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<210> 64

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<211> 62

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

\newpage

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<400> 64

28

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<210> 65

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<211> 62

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 65

29

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<210> 66

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<211> 62

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<212> PRT

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<213> Fugu rubripes

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

30

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<210> 67

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<211> 62

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

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31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

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<211> 62

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

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32

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<210> 69

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 69

33

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<210> 70

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 70

34

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<210> 71

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<211> 57

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 71

35

Claims (21)

1. Un método de ayuda para la determinación de la susceptibilidad de un paciente humano al cáncer de próstata que comprende el paso de determinar si la muestra que contiene ácido nucleico y/o proteína, obtenidos del paciente contiene un nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje asociado con el cáncer de próstata, en el que tal nivel se define como el nivel aumentado presente en células conocidas de próstata cancerosas o metastáticas con respecto a células conocidas de próstata no cancerosas o no metastáticas.

2. Un método de ayuda al diagnóstico de cáncer de próstata en un paciente humano que comprende el paso de determinar si una muestra que contiene ácido nucleico y/o proteína obtenida a partir del paciente contiene un nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje asociado con el cáncer de próstata, en el que tal nivel se define como el nivel aumentado presente en células conocidas de próstata cancerosas o metastáticas con respecto a células conocidas de próstata no cancerosas o no metastáticas.

3. Un método de ayuda en la predicción de las perspectivas relativas de una evolución particular de un cáncer de próstata en un paciente humano que comprende el paso de determinar si una muestra que contiene ácido nucleico y/o proteína obtenida a partir del paciente contiene un nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje asociado con el cáncer de próstata, en el que tal nivel se define como el nivel aumentado presente en células conocidas de próstata cancerosas o metastáticas con respecto a células conocidas de próstata no cancerosas o no metastáticas.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cáncer es metastático.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra contiene ácido nucleico y en el que el nivel de ácido nucleico de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje se mide al poner en contacto dicho ácido nucleico con un ácido nucleico que hibridiza selectivamente al ácido nucleico de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje.

6. Un método según la Reivindicación 5, en el que la muestra contiene ARNm, y el ácido nucleico como se ha dicho hibridiza selectivamente al ARNm de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje.

7. Un método según la Reivindicación 5 o la 6, en el que el ácido nucleico que hibridiza como se ha dicho es detectable por marcaje.

8. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a la 7, en el que el ácido nucleico que hibridiza selectivamente como se ha dicho es de hebra simple.

9. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a la 8, en el que el ácido nucleico que hibridiza selectivamente como se ha dicho es apropiado para uso en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

10. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a la 4, en el que la muestra contiene proteína y en el que se mide el nivel de proteína de canal bNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje

11. Un método según la Reivindicación 10 en el que el nivel de dicha proteína se mide al poner en contacto la proteína con una molécula que enlaza selectivamente a la proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje.

12. Un método según la Reivindicación 10, en el que la molécula de enlace selectivo es un anticuerpo o fragmento o derivado de éste, o una molécula tipo anticuerpo.

13. Un método según la Reivindicación 11 o la 12, en el que la molécula de enlace selectivo incluye un marcaje detectable.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra es una muestra del tejido en el que se sospecha cáncer, o en el que puede encontrarse o se ha encontrado cáncer, o que contiene células de dicho tejido.

15. Un método según la Reivindicación 14 en el que el tejido es de próstata.

16. Un método según la reivindicación 14 en el que la muestra es una cualquiera de orina, semen, sangre o de circulación linfática.

17. Uso de un agente capaz de utilizarse en la determinación del nivel de ácido nucleico o proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje en una muestra en la producción de un reactivo para diagnóstico de cáncer de próstata, en el que el agente es un ácido nucleico que hibridiza selectivamente al ácido nucleico de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje, o es una molécula que enlaza selectivamente a la proteína de canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje, en el que la molécula es un anticuerpo o fragmento o derivado de éste, o una molécula tipo anticuerpo.

18. Uso de un agente tal como se define en la Reivindicación 17 en un método de diagnóstico del cáncer de próstata.

19. Uso de un agente tal como se define en la Reivindicación 17 para el diagnóstico del cáncer de próstata.

20. Un juego de partes útil en el diagnóstico del cáncer de próstata que comprende un agente capaz de utilizarse en la determinación del nivel de ácido nucleico o proteína hNe-Na de VGSC en una muestra tal como se define en la reivindicación 17, así como medios adicionales para separar células epiteliales prostáticas a partir de una muestra, en el que tal medio utiliza un anticuerpo específico de próstata.

21. Un método de identificación de un compuesto que puede ser útil en el tratamiento del cáncer de próstata que inhibe selectivamente un canal hNe-Na de Na^{+} regulado por voltaje, que comprende (a) poner en contacto un compuesto de prueba con dicho canal Na^{+} regulado por voltaje y determinar si el compuesto es inhibitorio; (b) poner en contacto el compuesto de prueba con otros canales Na^{+} regulados por voltaje y determinar si dicho compuesto es inhibitorio; y (c) seleccionar un compuesto que es sustancialmente inhibitorio en (a) pero que no es sustancialmente inhibitorio en (b).