ES2289131T3 - Nuevos derivados de oligorribonucleotidos para la inhibicion dirigida de la expresion genica. - Google Patents

Abstract

Oligonucleótido de la fórmula I 5''-(N)x-(Z)n fórmula I en donde N son ribonucleótidos que se presentan o no en la naturaleza, que son complementarios, al menos en parte, a un ARN diana, x, independientemente, es igual a 10 hasta 100, n es igual a 2 hasta 20, Z son nucleótidos que se presentan o no en la naturaleza, que están enlazados con un enlace 2''5''-internucleósido, con la condición de que sus ARN dianas homólogos presenten uno de los siguientes modelos de secuencia 5''-(U)v-(N'')z-(U)w 5''-(U)v-(N'')z-UX 5''-UX-(N'')z-UX y 5''-(U)v-(N'')z, en donde v, independientemente, es igual a 2 hasta 20, en donde w, independientemente, es igual a 2 hasta 20, z, independientemente, es 15 a 25, U es igual a uridina, N es igual a adenosina (A), guanosina (G), citidina (C) o U, y X es igual a A, G o C, de preferencia A. o bien sus sales fisiológicamente tolerables.

Description

Nuevos derivados de oligorribonucleótidos para la inhibición dirigida de la expresión génica.

La presente invención se refiere a nuevos derivados de oligorribonucleótidos, que en el extremo 3' presentan un radical oligonucleótido 2'5'-enlazado sin radical 5'-fosfato y a su uso para la inhibición dirigida de la expresión génica.

La inhibición de la expresión génica con ayuda de ácidos nucleicos sintéticos adquiere una importancia creciente. Representantes típicos de estos ácidos nucleicos sintéticos (oligonucleótidos) son oligonucleótidos antisentido, ribozimas, enzimas del ADN y secuencias guía externas (EGS - siglas en inglés). "Oligonucleótidos antisentido" son derivados de ácido nucleico monocatenarios cortos que se unen a un ácido ribonucleico mensajero (ARNm) complementario a través de un apareamiento de bases de Watson-Crick, cuya traducción debe ser inhibida en la correspondiente proteína. En la mayoría de los casos, los oligonucleótidos antisentido despliegan su efecto según un mecanismo que es sustentado por la ribonucleasa H celular (RNasa H), lo cual se confirma por numerosos estudios. La RNasa H, que aparece en todas las células, reconoce una doble cadena a base de ADN y ARN y corta el ARNm complementario al oligonucleótido mediante hidrólisis de uno o varios enlaces fosfodiéster. Se conoce cómo deben estar modificados los oligonucleótidos con el fin de que pueda tener lugar una activación de la RNasa H. Esto se describe, por ejemplo, en "Uhlmann (2000) Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 3, 203-213". Ribozimas sintéticas llevan consigo esta actividad de nucleasa en su secuencia. El tipo de ribozima más conocido son las denominadas ribozimas de "cabeza de martillo", en los cuales la secuencia consenso GAAAC, derivada de ribozimas que se presentan de forma natural, forma la parte de la RNasa, y las secuencias flanqueantes forman la parte del oligonucleótido antisentido. De manera similar actúan las enzimas del ADN, las cuales, no obstante, no se derivan de motivos de ribozima que se presentan de forma natural, sino que se encontraron por una selección in vitro. EGS son análogos de ARN sintéticos, las cuales activan la RNasa P celular y se unen al ARNm diana a través de correspondientes secuencias flanqueantes e inician una degradación específica del ARNm.

Un problema común de la inhibición de la expresión génica con ayuda de oligonucleótidos sintéticos consiste en que siempre se debe testar un mayor número de oligonucleótidos frente a distintas zonas del ácido nucleico diana, con el fin de identificar una secuencia eficiente. Además, a menudo la inhibición de la expresión génica por parte de oligonoucleótidos antisentido se realiza solamente de forma ineficaz o incompleta. Además de ello, se observaron efectos secundarios no específicos de la secuencia, los cuales se pueden basar en que secuencias parciales relativamente cortas, de aproximadamente cinco bases de longitud, ya activan la RNasa H. Esto se muestra, por ejemplo, por "Woolf et al. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7305-7309)". Sin embargo, también existen efectos secundarios que se basan en la interacción de los oligonucleótidos antisentido con proteínas.

Recientemente se describió el uso de ARN de doble cadena para la inhibición de la expresión génica. El ARN de doble cadena (ARNds) es para determinadas células y organismos una señal para iniciar una degradación, específica de la secuencia, del ARNm según un proceso que es conocido como interferencia del ARN (ARNi). El fenómeno del ARNi se observó en una serie de diferentes organismos tal como, por ejemplo, C. elegans, moscas, hongos, plantas y embriones de ratón. Se piensa que el ARNi es muy similar al silenciamiento del gen post-transcripcional (PTGS - siglas en inglés) observado en plantas o bien es idéntico a éste. Mediante la simple inyección de ARNds con una longitud de más de 500 pares de bases (pb), cuya secuencia de la cadena sentido es idéntica a la del ARNm diana a inhibir, se puede inhibir específicamente la expresión de un gen diana con la correspondiente secuancia de ADN. En este caso no se perjudica la expresión génica de genes no homólogos. La secuencia de bases del gen diana no se modifica en este caso. El ARNi es un proceso post-transcripcional en el cual el ARNds es separado primeramente en fragmentos más pequeños, los cuales encuentran luego aplicación, probablemente, para la degradación específica de la secuencia del ARNm diana.

Hasta ahora, una inhibición eficiente de la expresión génica se alcanzó principalmente con ARNds de más de 100 pb de longitud. A este ARNds relativamente largo sólo se puede acceder a través de una transcripción in vitro o in vivo a partir del ADN correspondiente a través de sistemas de transcripción adecuados. Otra limitación del ARNi con ARNds largo consiste en que solamente determinados organismos, tales como C. elegans, pez cebra, plantas, determinadas especies de hongos, Drosophila, oocitos y embriones de ratones, permiten una inhibición específica de la secuencia con ARNds, mientras que la mayoría de las células animales desencadena una apoptosis en el caso de tratamiento con ARNds. En el caso de ARNds largo también se observa aún una inhibición de la expresión génica, si la homología de la secuencia asciende a 70 hasta 90%. Por lo tanto, en el caso de familias de genes con una elevada homología de la secuencia pueden producirse interpretaciones erróneas del fenotipo, inhibiéndose al mismo tiempo la expresión de varios genes no totalmente homólogos.

El tratamiento de células con ARNds tal como, por ejemplo, con virus de ARNds conduce, en general, a un proceso apoptótico o bien a la degradación inespecífica de la secuencia del ARNm como consecuencia de la inducción de una actividad 2'5'-oligoadenilato-sintasa. Como respuesta al ARNds viral la célula infestada sintetiza adenilato trímero o tetrámero (2'5'-A) con el puente internucleósido 2'5'-fosfodiéster no habitual. El 2'5'-A es fosforilado por cinasas celulares en el extremo 5' y activa entonces a una nucleasa, denominada RNasa L. El 2'5'-A también se puede sintetizar químicamente y aportar a la célula (Torrence et al. (1994) Curr. Med. Chem 1,176-191). Sin embargo, el 2'5'-A sintético activa solamente a la RNasa L cuando fue transformado en el 5'-fosfato ó 5'-trifosfato. La RNasa L activada por 5'-p-2'5'-A (p significa fosfato, difosfato o trifosfato) degrada luego todo el ARN de la célula de un modo inespecífico para la secuencia. Se demostró también que, con ayuda de conjugados de oligonucleótidos antisentido con un radical 5'-p-2'5'-A se puede inhibir la expresión génica de un modo específico para la secuencia. Sin embargo, para ello es esencial que el extremo 5' del radical 2'5'-A no esté enlazado con el oligonucleótido, sino que esté presente en forma de fosfato, tiofosfato o trifosfato (Torrence et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 1300-4). Además, la parte del oligonucleótido que reconoce al ARN diana (parte antisentido) debe estar presente en forma de cadena sencilla. Oligonucleótidos con radicales 2'5'-A en los extremos 3' que, como consecuencia, no presentan ninguna función 5'-fosfato o trifosfato libre, no se han descrito hasta ahora, por los motivos arriba mencionados, para la inhibición de la expresión génica. La inhibición de la expresión génica con los conjugados de oligonucleótidos 5'-p-2'5'-A-antisentido 5'-fosforilados de cadena sencilla es una variación del principio antisentido y, por consiguiente, se ve sometida también a las limitaciones de la tanda de oligonucleótidos antisentido. En este caso, el radical 2'5'-A es colgado, a través de un espaciador (enlazador) al extremo 5' del oligonucleótido, de modo que el extremo 2' ó 3' del radical 2'5'-A se presenta unido. La parte que une el ARN se compone, preferiblemente, de ADN (figuras 4 a 6 en Torence, Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1, 307).

En los últimos tiempos se utilizan oligonucleótidos, en medida creciente, como herramientas para el estudio de la función de nuevos genes (Functional Genomics). El empleo de oligonucleótidos antisentido y de ribozimas para la inhibición específica para la secuencia de la expresión génica de nuevos genes, que codifican proteínas con función desconocida, se dificulta debido a que, por lo general, deben testarse muchos oligonucleótidos diferentes de diferentes secuencias, lo cual es un impedimento, particularmente a gran escala.

Así, el documento US 5.886.165 da a conocer oligonucleótidos a base de desoxirribonucleótidos con enlaces 3'-5' y ribonucleótidos con enlaces 2'-3'. El documento WO 00/04189 da a conocer oligonucleótidos modificados con al menos un enlace 2',5'.

La misión de esta invención consistía, por lo tanto, en poner a disposición nuevos oligonucleótidos, químicamente modificados, con una inhibición significativamente mejorada de la expresión génica, que eviten las limitaciones, arriba mencionadas, de los métodos y agentes habituales. En particular, la expresión génica debería inhibirse en un proceso similar a la interferencia de ARN.

El problema se resolvió, de acuerdo con la invención, mediante nuevos derivados de oligonucleótidos que presentan en el extremo 3' un radical oligonucleótido 2'5'-enlazado, en donde éste no porta ningún grupo fosfato, tiofosfato o trifosfato libre. La secuencia de los nuevos derivados de oligonucleótidos es complementaria a la secuencia de ARN cuya traducción debe ser inhibida.

La invención se refiere, por lo tanto, a derivados de oligonucleótidos de la fórmula I,

fórmula I5'-(N)_{x}-(Z)_{n}

en donde

N son ribonucleótidos que se presentan o no en la naturaleza, que al menos son complementarios, en parte, a un ARN diana,

x, independientemente, es igual a 10 hasta 100, con preferencia 15 a 45 y con preferencia especial 16 a 25,

n es igual a 2 hasta 20, con preferencia 3 a 10 y con preferencia especial 3 a 6,

Z son nucleótidos que se presentan o no en la naturaleza, que están enlazados con un enlace 2'5'-internucleósido,

con la condición de que sus ARN dianas homólogos presenten los siguientes modelos de secuencia:

5'-(U)_{v}-(N')_{z}-(U)_{w}

5'-(U)_{v}-(N')_{z}-UX

5'-UX-(N')_{z}-UX y

5'-(U)_{v}-(N')_{z},

en donde

v y w, independientemente uno de otro, son iguales a 2 hasta 20, de preferencia 2 a 10, y con preferencia especial 3 a 6 y

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z es igual a 15 hasta 25, con preferencia 16 a 23 y con preferencia especial 19 a 21 y U es igual a uridina, N es igual a adenosina (A), guanosina (G), citidina (C) o U, y X es igual a A, G o C, de preferencia A. N puede ser, en una forma de realización preferida, un ribonucleótido.

Si el gen, cuya expresión ha de ser inhibida, contiene, por ejemplo, la siguiente secuencia de ADN

5'-TTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTG

(Seq ID nº 1)

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o la siguiente secuencia de ARN

5'-UUUUGAAGCGAAGGUUGUGGAUCUG

(Seq ID nº 2)

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entonces el ARN diana tiene el siguiente modelo de secuencia

5'-(U)_{v}-(N)_{z}-UX, en donde v es igual a 4, z es igual a 19 y X es igual a G.

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Se prefieren, además, oligonucleótidos de la fórmula I, en los que uno o más enlaces fosfodiéster están reemplazados, por ejemplo, por enlaces fosforotioato o enlaces N3',P5'-fosforoamidato. Se prefieren particularmente oligonucleótidos de la fórmula I, en los que uno o más enlaces fosfodiéster están reemplazados por enlaces fosforotioato. La introducción de los radicales fosforotioato se efectúa, preferiblemente, en los extremos 3', los extremos 5', así como en los nucleótidos de pirimidina C y U, en especial cuando se suceden varios nucleótidos de pirimidina en la secuencia.

Una forma de realización particular consiste en emplear dos o más derivados de oligonucleótidos conformes a la fórmula I en forma de mezcla para la inhibición de la expresión génica. En este caso, los derivados de oligonucleótidos pueden estar dirigidos contra diferentes regiones de un ARN o contra el ARN de diferentes genes.

Los oligonucleótidos de cadena sencilla de la fórmula I se emplearon originalmente como oligonucleótidos control para ensayos de ARNi con ARNds corto. En virtud del carácter monocatenario no se podía contar, por lo tanto, con una inhibición de la expresión génica. Sorprendentemente, sin embargo también inhibían determinados oligonucleótidos de cadena sencilla la expresión, en particular cuando éstos presentaban una estabilidad suficiente frente a nucleasas. También era sorprendente que los oligonucleótidos de la fórmula I, en los que el radical oligoadenilato 2'5'-enlazado no presenta ningún radical 5'-fosfato, 5'-tiofosfaton ó 5'-trifosfato, inhibían la expresión génica de una manera específica para la secuencia. También era totalmente sorprendente que en este caso el radical oligoadenilato 2'5'-enlazado pueda estar unido a través de la función 5' directamente al ARN 3'5'-enlazado. Hasta ahora se cumplía el dogma, que el radical oligoadenilato 2'5'-enlazado debe portar en el extremo 5' un radical fosfato, tiofosfato o trifosfato libre, con el fin de que se inhiba la expresión génica. Además, hasta ahora una inhibición inducida por 2'5'-oligoadenilato siempre se había relacionado con un efecto inespecífico, es decir independiente de la secuencia (Bass, Nature (2001) 411, 428). Por lo tanto, era evidente que los oligonucleótidos de la fórmula I no sólo se apartan en su estructura de los conjugados de oligonucleótidos descritos por Torrence (Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1, 307), sino que, además de ello, muestran un efecto inhibidor mucho mejor que, como consecuencia, se basa en otro mecanismo de acción.

Sorprendentemente, los oligonucleótidos de acuerdo con la invención también eran eficaces desde un punto de vista inhibidor de forma específica para la secuencia en células humanas primarias. A saber de los autores de la invención, la inhibición de la expresión génica por parte de oligonucleótidos 2'5'-enlazados hasta ahora no había sido observada en células humanas primarias.

Los oligonucleótidos de la fórmula I de acuerdo con la invención pueden emplearse también para la inhibición de la expresión génica en células que expresan solamente poco, no expresan o expresan 2'5'-oligoadenilato-sintasa defectuosa.

Además, los oligonucleótidos de la fórmula I pueden emplearse también para el tratamiento de pacientes con una deficiencia o un defecto de la 2'5'-oligoadenilato-sintasa. Por ejemplo, también pueden ser tratados pacientes con CFS (Chronic Fatigue Syndrome - síndrome de la fatiga crónica).

La elección de las secuencias de los oligonucleótidos de la fórmula I, que se emplean para la inhibición de la expresión génica de determinadas dianas se efectúa con ayuda de las correspondientes secuencias de genes. Las secuencias de estos genes se obtienen mediante secuenciación o a partir de bancos de datos de genes. Como ejemplo se puede mencionar aquí la inhibición de la luciferasa (luciérnaga) con ácidos nucleicos de doble cadena. El número de acceso para este gen es U47298. El intervalo codificante de la luciferasa de la luciérnaga abarca 1653 nucleótidos. Entre otros, pueden elegirse, por ejemplo, los siguientes cuatro intervalos como secuencias diana para la inhibición con ácidos nucleicos de doble cadena.

100

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101

El ARN correspondiente para estos intervalos tiene entonces la secuencia siguiente.

GCUUUUACAGAUGCACAUAUCGAGGUGGACAUCACUUACG

(Seq ID nº 7)

CCGCGAACGACAUUUAUAAUGAACGUGAAUUGCUCAACAG

(Seq ID nº 8)

GCGGUCGGUAAAGUUGUUCCAUUUUUUGAAGCGAAGGUUG

(Seq ID nº 9)

AUUUUUUGAAGCGAAGGUUGUGGAUCUGGAUACCGGGAAA

(Seq ID nº 10)

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Los oligonucleótidos complementarios de la fórmula I de acuerdo con la invención, derivados de lo anterior, tienen las siguientes secuencias y se caracterizan porque dos o más nucleótidos (caracterizados aquí por letras minúsculas) están enlazados por un enlace 2'5'-internucleósido. Se prefieren radicales adenilato 2'5'-enlazados.

3' aaaaAUGUCUACGUGUAUAGCUCCAC

Seq ID nº 11

3' aaaaAUAUUACUUGCACUUAACGAG

Seq ID nº 12

3' aaaaCCAUUUCAACAAGGUAAAAAA

Seq ID nº 13

3' aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC

Seq ID nº 14

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Los oligonucleótidos pueden modificarse también para mejorar la estabilidad metabólica, por ejemplo en forma de fosforotioato (asterisco). La estabilización por parte de fosforotioato se efectúa preferiblemente en los extremos y nucleótidos de pirimidina internos.

3' a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C

La especificidad de la inhibición de la expresión de luciferasa puede verificarse con ayuda de oligonucleótidos control, que no son totalmente complementarios al ARN diana y, por ejemplo, presentan 4 apareamientos erróneos de bases.

3' a*a*a a C*U*U*C U*C U*U*C A A C*C A*C*C G A*G A*C

Seq ID nº 15

Oligonucleótidos de la fórmula I tienen, por ejemplo, la siguiente estructura:

1

en donde

B es una nucleobase que se presenta de forma natural o no natural,

U, V y W, independientemente uno de otro, son O, S, NH o CH_{2}, preferiblemente O o S,

R^{1}, independientemente uno de otro, es OH, SH, CH_{3} o BH_{3}, preferiblemente OH o SH ist, o bien sus sales fisiológicamente compatibles

R^{2}, independientemente uno de otro, es OH, H, O-alquilo C_{1} a C_{12}, preferiblemente OH (ribonucleótido), en donde alquilo C_{1} a C_{12} es preferiblemente CH_{3} o CH_{3}-O-CH_{2}CH_{2},

R^{3}, independientemente uno de otro, es OH, H, O-alquilo C_{1} a C_{12}, preferiblemente OH o H, en donde alquilo C_{1} a C_{12} es preferiblemente CH_{3} o CH_{3}-O-CH_{2}CH_{2},

x, independientemente, es igual a 10 hasta 100, con preferencia 15 a 45 y con preferencia especial 16 a 25,

n es igual a 2 hasta 20, con preferencia 3 a 10 y con preferencia especial 3 a 6,

A representa adenina o un derivado de adenina, por ejemplo 8-bromoadenina, 8-metiladenine o hipoxantina.

Para testar la inhibición de la expresión génica con ayuda de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención en células animales, en especial en células humanas primarias, éstas se dirigen, por ejemplo, contra un gen humano o bien el ARN correspondiente y se testan en células humanas (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells - células endoteliales del cordón umbilical humanas). Para ello, por ejemplo el ADN de Edg-1 (número de acceso M31210) procedente del banco de datos de genes se transcribe en el correspondiente ARN mensajero y se eligen los dos siguientes intervalos (175 y 725) para la síntesis de oligonucleótidos correspondientes.

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ARN de Edg-1:

"175"

GACCUCGGUGGUGUUCAUUCUCAUCUGCUGCUUUAUCAUCCUGGAGAACAUCUUUGUCUU

(Seq ID nº 16)

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"725"

AUUUCCAAGGCCAGCCGCAGCUCUGAGAAUGUGGCGCUGCUCAAGACCGUAAUUAUCGUC

(Seq ID nº 17)

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Los oligonucleótidos correspondientes tendrían, por ejemplo, una estructura dada a conocer como sigue:

3'-aaaaUAGUAGGACCUCUUGUAGAAA	Seq ID nº 18;
3'-aaaaGGUUCCGGUCGGCGUCGAGAC	Seq ID nº 19;

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Control del apareamiento erróneo

3'-aaaaGGUGCCUGUCUGCGGCGACAC

Seq ID nº 20;

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El control del apareamiento erróneo no coincide en 5 nucleótidos (subrayados como apareamiento erróneo) con el ARN de edg-1.

Además, se prepararon los siguientes oligonucleótidos dirigidos contra edg-1 con una estabilidad a la nucleasa mejorada y actividad inhibidora aumentada que se derivan de las secuencias edg-1 anteriores.

3'-a*a*a a U*A G*U A G G A C*C*U C*U*U G*U*A G A A*A

3'-a*a*a a G G U*U*C*C G G*U*C G G*C G*U*C G A G A*C

3'-a*a*a a G G U*G C*C*U G*U*C*U G*C G G*C G A*C A*C

Los derivados de ácido nucleico de la fórmula I de acuerdo con la invención están constituidos por oligonucleótidos. Un oligonucleótido puede estar constituido, por ejemplo, totalmente por los nucleótidos adenosinafosfato, guanosinafosfato, inosinafosfato, citidinafosfato, uridinafosfato y timidinafosfato. Se prefieren oligonucleótidos que están constituidos por ribonucleótidos, los denominados oligorribonucleótidos. En otras formas de realización de la invención el oligonucleótido puede contener, eventualmente, una o varias modificaciones, por ejemplo modificaciones químicas. Un oligonucleótido puede presentar varias modificaciones iguales y/o diferentes.

El radical 2'5'-enlazado pude contener, por ejemplo, adenosina, 3'-desoxiadenosina (cordicepina), inosina, 8-bromoadenosina, 8-metiladenosina y otros derivados de adenosina sustituidos en posición 8. El radical ribosa puede estar derivatizado también como 3'-O-metiladenosina. Los enlaces internucleósidos en la parte 2'5'-enlazada son preferiblemente enlaces fosfodiéster y fosforotioato. Derivados habituales del 2'5'-adenilato, su síntesis y activación de la RNasa L están descritos en la bibliografía (Player et al. (1998) Pharmacol. Ther. 78, 55).

Ejemplos de modificaciones químicas son conocidas por el experto en la materia y están descritos, por ejemplo, en E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 y "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, EE.UU. 1993, J. Hunziker y C. Leumann 'Nucleic Acid Analogs: Sythesis and Properties' in Modern Synthetic Methods (Ed. Beat Ernst y C. Leumann) Editorial Helvetica Chimica Acata, Basilea, págs.331-417, RP Iyer et al. Curr Opin Mol Therap (1999) 1:344-358; S. Verma y F. Eckstein , Annu Rev Biochem (1998) 67:99-134; JW Engels y E. Uhlmann : Chemistry of oligonucleotides. En: Pharmaceutical aspects of oligonucleotides. Couvreur P, Malvy C (Eds), Taylor & Francis, Londres, (2000): 35-78.

La modificación química de un oligonucleótido puede, por ejemplo,

a) contener el reemplazo, completo o parcial, de los puentes diéster de ácido fosfórico, por ejemplo por ésteres de O-alquilo (C_{1}-C_{21}) de fosforotioato, fosforoditioato, NR^{1}R^{1'-}fosforoamidato, boranofosfato, fosfato, ésteres de [aril (C_{6}-C_{12})-O-alquilo (C_{1}-C_{21})]fosfato, puentes de alquil (C_{1}-C_{8})-fosfonato y/o aril (C_{6}-C_{12})-fosfonato,

en donde

R^{1} y R^{1'}, independientemente uno de otro, representan hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{18}), arilo (C_{6}-C_{20}), aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), preferiblemente representa hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{8}) y/o metoxietilo, preferiblemente representa hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}) y/o metoxietilo

o

R^{1} y R^{1'}, junto con el átomo de nitrógeno que los porta, forman un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie O, S, N;

b) contener el reemplazo, completo o parcial, de los puentes diéster de ácido 3'- y/ó 5'-fosfórico por parte de puentes "defosfo" (descritos, por ejemplo, en Uhlmann, E. y Peyman, A. en "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capítulo 16, 355 y sig.), por ejemplo mediante grupos formoacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetilhidrazo, dimetilensulfona y/o sililo;

c) contener el reemplazo parcial de la cadena principal de azúcar-fosfato, por ejemplo mediante oligómeros de "morfolino" (por ejemplo, descrito en E. P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129 y en J. Summerton y D. Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 7 (1997) 187-195) y/o mediante ácidos nucleicos de poliamida ("PNAs" - siglas en inglés) (por ejemplo, descrito en P. E. Nielsen et al, Bioconj. Chem. 5 (1994) 3) y/o ácidos nucleicos de ésteres de fosfomonoácidos ("PHONAs") (descrito, por ejemplo, en Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638);

d) contener el reemplazo parcial de las unidades de \beta-D-ribosa, por ejemplo mediante \beta-D-2'-desoxirribosa, \alpha-D-2'-desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxiarabinofuranosa, 2'-O-alquil (C_{1}-C_{6})-ribosa, 2'-O-alquenil (C_{2}-C_{6})-ribosa, 2'-[O-alquil (C_{1}-C_{6})-O-alquil (C_{1}-C_{6})]-ribosa, 2'-NH_{2}-2'-desoxirribosa, \beta-D-xilofuranosa, \beta-D-arabinofuranosa, \alpha-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-\beta-D-eritro-hexo-piranosa, análogos de azúcares limitados conformativamente tal como LNA (Locked nucleic acids - ácidos nucleicos bloqueados; Singh et al., Chem. Commun. 4 (1998) 455; Singh et al. Chem. Commun. 12 (1998) 1247) y análogos de azúcares carbocíclicos (descritos, por ejemplo, en Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320) y/o análogos de azúcares de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223) y/o análogos de biciclo-azúcares (descritos, por ejemplo, en M. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481). Los análogos de oligonucleótidos 2'-modificados se describen en detalle en Manoharan, Biochim. Biophys. Acta (1999) 117 y los análogos de oligonucleótidos limitados conformativamente se describen en detalle en Herdewijn, Biochim. Biopyhs. Acta (1999) 167.

e) contener la modificación o bien el reemplazo completo o parcial de las bases de nucleósidos naturales, por ejemplo mediante 5-(hidroximetil)uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, pseudoisocitosina, dihidrouracilo, 5-alquil (C_{1}-C_{6})-uracilo, 5-alquenil (C_{2}-C_{6})-uracilo, 5-alquinil (C_{2}-C_{6})-uracilo, 5-alquil (C_{1}-C_{6})-citosina, 5-alquenil (C_{2}-C_{6})-citosina, 5-alquinil (C_{2}-C_{6})-citosina, 5-fluorouracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina o purinas 7-deaza-7-sustituidas. Modificaciones de bases heterocíclicas se describen, por ejemplo, en Herdewijn, Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. (2000) 297.

La modificación química del oligonucleótido abarca, además, la conjugación de un oligonucléotido con una o varias moléculas que influyen favorablemente sobre las propiedades (por ejemplo estabilidad a la nucleasa, afinidad por la secuencia diana, farmacocinética) del oligonucleótido y/o atacan en la hibridación del oligonucleótido modificado a la secuencia diana bajo formación y/o reticulación (conjugados de oligonucleótidos). Ejemplos de ello son conjugados con poli-lisina, con intercaladores tales como pireno, acridina, fenazina, fenantridina, con compuestos fluorescentes tales como fluoresceína, con reticulantes tales como psoraleno, azidoproflavina, con moléculas lipófilas tales como alquilo (C_{12}-C_{20}), con lípidos tales como 1,2-di-hexadecil-rac-glicerina, con esteroides tales como colesterol o testosterona, con vitaminas tales como vitamina E, con poli- o bien oligo-etilengilcol, con diésteres de alquil (C_{12}-C_{18})-fosfato y/o con -O-CH_{2}-CH(OH)-O-alquilo (C_{12}-C_{18}). Moléculas de este tipo pueden estar conjugadas en el extremo 5' y/o en el extremo 3' y/o dentro de la secuencia, por ejemplo en una nucleobase. Conjugados de oligonucleótidos conocidos por el experto en la materia están descritos, por ejemplo, en Manoharan (2001) Conjugated Oligonucleotides in Antisense technology. En: Crooke (editor) Antisense Technology. Marcel Dekker, Nueva
York.

Una forma de realización especial de la modificación química se refiere a la conjugación del oligonucleótido a) con moléculas lipófilas, por ejemplo alquilo (C_{12}-C_{20}), b) con esteroides tales como colesterol y/o testosterona, c) con poli- y/u oligo-etilenglicol, d) con vitamina E, e) con intercaladores tales como pireno, f) con diésteres de alquil (C_{14}-C_{18})-fosfato y/o g) con -O-CH_{2}-CH(OH)-O-alquilo (C_{12}-C_{16}).

Otra forma de realización especial de la modificación química se refiere a la derivatización del oligonucleótido tal como se describe en HMR 99/L045 como conjugado de éster arílico, por ejemplo como conjugado de FDA, con lo cual se favorece la absorción celular de los oligonucleótidos.

Procedimientos para la preparación de los derivados de oligonucleótidos son conocidos por el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543 y/o M. Manoharan en "Antisense Research and Applications", Crooke y Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, Capítulo 17, pág..303 y sig. y/o en el documento EP-A 0 552 766.

En otras formas de realización especiales de la invención, el oligonucleótido puede presentar inversiones 5'-5' en el extremo 5'. Este tipo de modificación química es conocida por el experto en la materia y está descrita, por ejemplo, en M. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757. El extremo 5' es, además, una posición preferida para la conjugación del oligonucleótido con una o varias moléculas que influyen favorablemente sobre las propiedades (por ejemplo estabilidad a la nucleasa, absorción celular, afinidad por la secuencia diana, farmacocinética) del oligonucleótido.

La invención se refiere, además, a procedimientos para la preparación de los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos descritos se pueden preparar con ayuda de diferentes procedimientos químicos conocidos, por ejemplo como se describe en Eckstein, F. (1991) "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford. Los oligonucleótidos pueden prepararse también mediante procedimientos que eventualmente contienen una o más etapas enzimáticas.

La invención se refiere, además, al uso de los oligonucleótidos para la modulación, así como para la inhibición total o parcial de la expresión de determinados genes diana, por ejemplo para la inhibición total o parcial de la traducción. La invención se refiere, además, al uso de los oligonucleótidos para la modulación, así como para la inhibición total o parcial de la expresión en células que solamente presentan poca, ninguna ó 2'5'-oligoadenilato-sintasa defectuosa.

La invención se refiere, además, al uso de los oligonucleótidos como medicamentos o bien para el uso de los oligonucleótidos para la preparación de medicamentos. En particular, los oligonucleótidos pueden emplearse en medicamentos destinados a la prevención y/o tratamiento de enfermedades que van acompañadas de la expresión o de una sobre-expresión de determinados genes.

La invención se refiere, además, al uso de los oligonucleótidos o bien de medicamentos que contienen estos oligonucleótidos, para el tratamiento de enfermedades en las que tienen su origen o participan genes definidos mediante sobre-expresión.

Los medicamentos de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades que son provocadas por virus, por ejemplo por CMV, VIH, VHS-1, VHS-2, hepatitis B, hepatitis C o papilomavirus. Medicamentos de esta invención se adecuan particularmente para el tratamiento de virus de ARN tales como, por ejemplo, virus de la polio, VSV o influenza, en particular también de virus de ARN de doble cadena tal como, por ejemplo, reovirus.

Los medicamentos de la presente invención se adecuan, por ejemplo, también para el tratamiento del cáncer. A modo de ejemplo, en este caso también se pueden usar secuencias de oligonucleótidos que están dirigidas contra dianas que son responsables de la generación o el crecimiento del cáncer. Dianas de este tipo son, por ejemplo:

1) Oncoproteínas nucleares tales como, por ejemplo, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120

2) Oncoproteínas citoplasmáticas/asociadas a la membrana tales como, por ejemplo, EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets

3) Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor EGF, Her-2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1), receptores de retinoides, subunidad reguladora de la proteína quinasa, c-fms, Tie-2, c-raf-1 quinasa, PKC-alfa, proteína quinasa A (R1 alfa),

4) Citoquinas, factores de crecimiento, matriz extracelular tales como, por ejemplo, CSF-1, IL6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina, fibronectina.

5) Inhibidores de genes supresores de tumores tales como, por ejemplo, MDM-2.

Los medicamentos de la presente invención se adecuan, por ejemplo, además para el tratamiento de enfermedades que son influenciadas por integrinas o receptores de adhesión célula-célula, por ejemplo por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM.

Los medicamentos de la presente invención se adecuan, por ejemplo, también para evitar la restenosis. A modo de ejemplo, en este caso también se pueden usar secuencias de oligonucleótidos que están dirigidas contra dianas que son responsables de la proliferación o migración. Dianas de este tipo son, por ejemplo:

1) Proteínas de transactivadores nucleares y ciclinas tales como, por ejemplo, c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclina y cdc2-quinasa

2) Mitógenos o factores de crecimiento tales como, por ejemplo, PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF y TGF-\beta.

3) Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor bFGF, receptor EGF y receptor PDGF.

La invención se refiere, además, a oligonucleótidos para el tratamiento de asma, en donde la expresión del receptor A1 de adenosina, el receptor A3 de adenosina, el receptor de bradiquinina o de IL-13 es inhibida con ayuda de oligonucleótidos adecuados.

La invención se refiere, por ejemplo, también a oligonucleótidos para el tratamiento de enfermedades cardiocirculatorias, en las que se inhibe, por ejemplo, la expresión del receptor \beta1-adrenérgico o de una proteína de la familia de EDG tal como, por ejemplo, Edg-1.

La invención se refiere, por ejemplo, también a oligonucleótidos para el tratamiento de diabetes, en donde, por ejemplo, se inhibe la expresión de PTP-1B.

Los medicamentos pueden utilizarse, p. ej., en forma de preparados farmacéuticos que se pueden administrar por vía oral, p. ej. en forma de comprimidos, grageas, cápsulas de gelatina dura o blanda, soluciones, emulsiones o suspensiones. También se pueden administrar por vía rectal, p. ej. en forma de supositorios, o por vía parenteral, p. ej. en forma de soluciones para inyección. Para la producción de preparados farmacéuticos, estos compuestos se pueden elaborar en soportes orgánicos e inorgánicos terapéuticamente inertes. Ejemplos de tales soportes para comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina dura son lactosa, almidón de maíz o sus derivados, sebo y ácido esteárico o sus sales. Soportes adecuados para la preparación de soluciones son agua, polioles, sacarosa, azúcar invertido y glucosa. Soportes adecuados para soluciones para inyección son agua, alcoholes, polioles, glicerol y aceites vegetales. Soportes adecuados para supositorios son aceites vegetales y endurecidos, ceras, grasas y polioles semilíquidos. Los preparados farmacéuticos pueden contener también conservantes, disolventes, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, saboreantes, sales para modificar la presión osmótica, tampones, agentes de revestimiento, antioxidantes, así como, eventualmente, otras sustancias activas terapéuticas.

Las formas de administración preferidas son aplicaciones tópicas, aplicaciones locales tales como, por ejemplo, con ayuda de un catéter o por inhalación, inyecciones o infusiones y la administración por vía oral. Para la inyección se formulan los derivados de oligonucleótidos en una solución líquida, con preferencia en un tampón fisiológicamente aceptable tal como, por ejemplo, solución de Hank o solución de Ringer. Los oligonucleótidos también se pueden formular en forma sólida y disolver o suspender antes de usar. Las dosis preferidas para una administración sistemática son de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y día.

La invención se refiere, además, a preparaciones farmacéuticas que contienen oligonucleótidos y/o sus sales fisiológicamente tolerables, además de soportes y/o aditivos farmacéuticamente irreprochables.

Los oligonucleótidos y/o sus sales fisiológicamente tolerables se pueden administrar en los animales, con preferencia en los mamíferos, y en especial en los seres humanos como medicamentos en sí, en mezclas entre sí o en forma de preparaciones farmacéuticas que permiten una aplicación tópica, percutánea, parenteral o enteral y que contienen como componente activo una dosis eficaz de al menos un oligonucleótido, además de soportes y aditivos farmacéuticamente irreprochables. Las preparaciones contienen normalmente aprox. 0,1 a 90% en peso del compuesto de eficacia terapéutica. Para el tratamiento de enfermedades de la piel tales como, por ejemplo, psoriasis o vitiligo se prefiere una aplicación tópica, por ejemplo en forma de pomadas, lociones o tinturas, emulsiones, suspensiones. La producción de los preparados farmacéuticos se efectúa de manera en sí conocida (por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.), en donde se utilizan sustancias de soporte inorgánicas y/u orgánicas farmacéuticamente inertes. Para preparar píldoras, comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina dura se pueden utilizar, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz y/o sus derivados, talco, ácido esteárico y/o sus sales, etc. Las sustancias de soporte para cápsulas de gelatina blanda y/o supositorios son, por ejemplo, grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites naturales y/o endurecidos, etc. Como vehículos para la preparación de soluciones y/o jarabes son apropiados, por ejemplo, agua, sacarosa, azúcar invertido, glucosa, polioles, etc. Como sustancias de soporte para la preparación de soluciones para inyección son apropiados agua, alcoholes, glicerina, polioles, aceites vegetales, etc. Como sustancias de soporte para microcápsulas, implantes y/o parches son apropiados polimerizados mixtos de ácido glicólico y ácido láctico. Más allá de ello, son apropiadas formulaciones de liposomas que son conocidas por el experto en la materia (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; ``Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), por ejemplo liposomas HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878). La aplicación dérmica se puede realizar, por ejemplo, también con ayuda de métodos iontoforéticos y/o con ayuda de electroporación. Además de ello, pueden utilizarse lipofectinas y otros sistemas de soporte, por ejemplo los que encuentran aplicación en la terapia génica. En especial, son adecuados sistemas con cuya ayuda pueden incorporarse oligonucleótidos con gran eficiencia en células eucarióticas.

Una preparación farmacéutica puede contener, además de los principios activos y sustancias de soporte, aditivos tales como, por ejemplo, rellenos, extensores, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, reticulantes, estabilizantes, emulsionantes, conservantes, endulcorantes, colorantes, saborizantes o aromatizantes, espesantes, diluyentes, sustancias tampón, además disolventes y/o solubilizantes y/o agentes para lograr un efecto de depósito, así como sales para alterar la presión osmótica, recubrimientos y/o antioxidantes. También pueden contener dos o más oligonucleótidos diferentes y/o sus sales fisiológicamente tolerables, así como también, además de al menos un oligonucleótido, una o varias otras sustancias terapéuticamente eficaces.

La dosis puede variar dentro de amplios límites y se puede adaptar a cada caso individual.

Ejemplos 1. Síntesis de los oligonucleótidos de la fórmula 1

a) 3' aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC

(las bases caracterizadas con letras minúsculas presentan un enlace 2'5'-internucleósido).

Las síntesis se llevaron a cabo en el ADN ABI 394 o en el Sintetizador Expedite (firma Applied Biosystems, Weiterstadt). Se utilizaron los ciclos de síntesis aconsejados por el fabricante, duplicándose la condensación también para las ribonucleósido-2'-O-fosforoamiditas (en cada caso con un tiempo de acoplamiento de 400 s) y prolongándose la oxidación de yodo hasta 30 s. Como fase sólida se empleó un soporte de vidrio con poros controlados (CPG - Controlled Pore Glass) de 1000 Å, el cual mantenía unida la 5'-O-dimetoxitritil-N-6-benzoiladenosina (NSS-6101-10A, Chemgenes, Waltham, MA) a través de la posición 2' ó 3' del azúcar. Después de la separación del grupo 5'-O-dimetoxitritilo con ácido tricloroacético se constituyó la parte de oligonucleótido 2'5'-enlazada mediante condensación durante cinco veces con 5'-O-dimetoxitritil-N-6-benzoil-3'-O-terc.- butildimetilsilil-adenosina-2'-O-fosforoamidita (ANP-5681, Chemgenes). Después, la parte de oligonucleótido 3'5'-enlazada se constituyó mediante condensación repetida con las correspondientes 5'-O-dimetoxitritil-2'-O-terc.- butildimetilsilil-nucleósido-3'-O-fosforoamiditas (ANP-5671 a ANP-5680, Chemgenes). Para la separación del oligómero del soporte y la desprotección de los grupos protectores fosfato y amino se sacudió el soporte CPG con 750 \muL de amoniaco conc./etanol (3:1, v:v) durante 24 horas a 30ºC. El sobrenadante se separó del soporte y éste se lavó de nuevo dos veces con 150 \muL de amoniaco conc./etanol (3:1, v:v). Los sobrenadantes reunidos se concentraron en vacío, y el residuo se sacudió en 1200 \muL de trietilamina x 3HF (muy venenosa) para la separación de los grupos protectores sililo durante 24 horas a 30ºC. Luego se añaden 700 \muL de n-butanol, la mezcla se enfría durante 30 minutos sobre hielo seco y se centrifuga. El sedimento se lavó todavía dos veces con butanol. A continuación, se llevó a cabo aún una precipitación con sal común. Se obtuvieron 112 OD (260) del producto bruto deseado, que en la electroforesis en gel muestra solamente una banda principal. El producto se caracterizó adicionalmente mediante HPLC y electroscopía de masa por electroproyección (modo negativo) (inf. 8527.2, exp. 8527.5).

b) 3' a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C

La síntesis se llevó a cabo análogamente al Ejemplo 1a, en donde la parte de oligonucleótido 2'5'-enlazada se constituyó mediante condensación triple con 5'-O-dimetoxitritil-N-6-benzoil-3'-O-terc.-butildimetilsilil-adenosina-2'-O-fosforoamidita (ANP-5681, Chemgenes). Para la introducción del radical fosforotioato se empleó en la etapa de oxidación respectiva, en lugar de la solución de yodo, el reactivo Beaucage (RN-1535, Chemgenes, Waltham, MA). Se obtuvieron 128 OD (260) del producto bruto deseado, que en la electroforesis en gel muestra solamente una banda principal. El producto se caracterizó adicionalmente mediante HPLC y electroscopía de masa por electroproyección (modo negativo) (inf. 8061.6, exp. 8062.8).

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2. Inhibición de la expresión de luciferasa en células SL-3

Para el examen de la actividad biológica se prepararon los siguientes oligonucleótidos como se describe en el Ejemplo 1 y se examinaron en cuanto a la inhibición de la actividad de luciferasa.

a) 3' aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC

b) 3' a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C

Transfección: El día antes del experimento se sembraron 2x10^{6} células/mL en placas de 6 pocillos. Los oligonucleótidos se recogieron en 100 \muL de SF 900II SFM (medio contra insectos II exento de suero SF-900; Gibco BRL 10902-096). Para la transfección se mezclaron 10 \muL de lipofectina (1 mg/mL; Gibco BRL) con 100 \muL de SF 900II SFM y se incubaron durante 15 min a la temperatura ambiente. Luego se pipetearon juntos la mezcla de lipofectina y el ácido nucleico y se incubaron durante 15-45 min a la temperatura ambiente. Entretanto, las células se lavaron con 3 ml de medio exento de suero, se mezclaron sucesivamente con 800 \muL de SF 90011 SFM y la mezcla de ácido nucleico/lipofectina y se incubaron durante una noche a 25 grados. Al día siguiente, se añade 1 mL de medio y suero (Gibco BRL 10122-166; concentración final 2%).

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Sistema de Ensayo del Informador Dual de Luciferasa (DLR; Promega E1960): (http://www.promega.com/catalog).

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El ensayo DLR de Promega permite la determinación secuencial de la actividad de la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa de Renilla, las cuales se diferencian en su secuencia de ácidos nucleicos, a partir de una única muestra. Los oligonucleótidos conformes a la fórmula I a medir estaban dirigidos contra la luciferasa de luciérnaga. Por lo tanto, solamente se debía inhibir la luciferasa de luciérnaga, pero no la luciferasa de Renilla. Junto al efecto inhibidor, también se puede examinar la especificidad.

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Para la lísis pasiva de las células en las placas con pocillos se retiró primeramente el medio y las células se lavaron con PBS (solución de sal común tamponada con fosfato (Gibco BRL 14200-067)). El medio se filtró por completo con succión y, a continuación, se añadió el PLB (Passiver Lysis Puffer - tampón de lisis pasivo, diluido con agua 1:5; añadir 500 \muL de PLB (1 vez) a un pocillo de una placa de 6 pocillos). Después se incubó durante 15 minutos bajo sacudimiento a la temperatura ambiente.

Para la preparación del reactivo II del ensayo de luciferasa (LARII - siglas en inglés) el sustrato del ensayo de luciferasa (LAS - siglas en inglés) se resuspendió en 10 mL del tampón de ensayo de luciferasa II (LAB II - siglas en inglés). Para la preparación del reactivo Stop & Glo se añadieron 200 \muL del sustrato Stop & Glo (solución) en el frasquito, el cual contenía sustrato Stop & Glo seco, y se mezcló a fondo durante 10 segundos con el vórtice. Con el fin de obtener una solución 1x Stop & Glo, se añaden 20 \muL del sustrato 50x Stop & Glo y 1 mL de tampón Stop & Glo. Esto es suficiente para 10 ensayos.

Ensayo DLR: 100 \muL de LAR II se añadieron a un pocillo junto con 20 \muL de lisado de células y se mezclaron durante 2-3 segundos mediante pipeteado y despipeteado. Después de la medición luminométrica de la actividad de la luciferasa de luciérnaga se añadieron 100 \muL de reactivo Stop & Glo, se mezclaron y luego se midió la actividad de la luciferasa de Renilla. Para la determinación de la luminiscencia se utilizó el luminómetro Fluoroskan Ascent FL (firma Thermo Labsystems, Frankfurt).

2

El oligonucleótido a), complementario a la luciferasa de la luciérnaga inhibía la actividad de la luciferasa de la luciérnaga de forma esencialmente más intensa que el oligonucleótido c) no complementario. La estabilización del oligonucleótido con radicales fosforotioato (oligonucleótido b) en determinadas posiciones del oligómero condujo a un efecto significativamente mejor. Cuando se derivatizó toda la secuencia complementaria 3'5'-enlazada en forma de derivado 2'-O-metilo, no se podía detectar casi ninguna actividad (oligonucleótido d).

3. Inhibición de la expresión de edg-1 en células del cordón umbilical humanas primarias (HUVEC - siglas en inglés)

Para testar los oligonucleótidos de acuerdo con la invención en células humanas primarias en cuanto a la inhibición de la expresión génica, éstos también se dirigieron contra un gen humano o bien el ARN respectivo y se testaron en células humanas (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells, células endoteliales del cordón umbilical humanas).

Se sintetizaron los correspondientes oligonucleótidos. Las dos primeras secuencias son complementarias al ARN de edg-1 RNA, mientras que el tercer oligonucleótido presenta apareamientos incorrectos de bases.

4

Como oligonucleótidos control se utilizaron las secuencias complementarias (orientación sentido) sin el radical 2'5'-oligoadenilato.

en donde *fosforotioato; a*a*a a es un adenilato 2'5'-enlazado (parcial con * modificado), y teg es un trietileneglicolfosfato.

Los análogos de oligorribonucleótidos modificados con fosforotioato en determinadas posiciones se emplearon como sigue en células humanas primarias para la inhibición de la expresión génica de Edg-1 en células humanas (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells, células endoteliales del cordón umbilical humanas).

Células (HUVECs) y detección de la absorción celular

Transfección: 24 h antes de la transfección propiamente dicha se sembraron en placas de 6 pocillos revestidas con HUVECs primarias (2º paso, aisladas según Jaffe et al., 1973, J. Clin.Invest 52, págs. 2745) en una densidad de 2,5 x 10^{5} células/pocillo en colágeno-1 de ratas (Biocoat, #354400, Becton Dickinson). Para la transfección se mezclaron 6 \mul de lipofectina (1 mg/ml; Gibco BRL, # 18292-011) con 200 \mul de medio Opti-MEM 1 exento de suero ( Gibco BRL, 31985-047) y se incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Paralelamente a ello, se diluyeron 10 \muM (\rightarrow concentración final 0,1 \muM) o bien una solución de 100 \muM (\rightarrow concentración final 1 \muM) de oligonucleótidos (en PBS, pH 7,4) en la relación 1:10 con medio Opti-MEM 1 exento de suero y se mezclaron en el mismo volumen con la solución de lipofectina preincubada. Después de incubación durante 15 minutos a la temperatura ambiente, esta tanda se completó hasta 2 ml con medio Opti-MEM 1 exento de suero y el césped de células lavado una vez con PBS se incubó con esta tanda durante 4 horas a 37ºC, 5% de CO_{2} y humedad del aire de 95%. A continuación, el césped de células, lavado de nuevo con PBS, se revistió con medio EGM con contenido en suero (CellSystems, # CC-3024 + adiciones de EGM # CC-3124) y se incubó durante otras 24 ó 48 h. En el caso de los estudios de absorción con oligonucleótidos marcados por fluorescencia, las células se fijaron después de incubación durante 4 horas, con paraformaldehído al 5% (en PBS, pH 7,4) y se absorbieron directamente con un microscopio de fluorescencia inverso (Zeiss Axiovert 135M) mediante excitación con un filtro FITC (excitación: 490 nm, emisión: 510 nm) en un aumento de 200 veces con una cámara CCD enfriada (ORCA-1, Bfi optilas) y se procesaron mediante el software AQM2000 (Kinetic Imaging).

Análisis de transferencia Western: para la lisis de las células, el césped de células se lavó una vez con PBS y, a continuación, se revistió con 200 \mul/pocillo de tampón 2 x Laemmli (Bio-Rad #161-0737). Después de incubación durante cinco minutos a la temperatura ambiente, el lisado de células se recogió con un raspador de células (Becton Dickinson, #3085) y antes de la electroforesis de SDS-poliacrilamida al 12% discontinua (SDS-PAGE, Laemmli et al., 1970, Bio-Rad-Criterion-System #345-0014) se hirvió durante 5 minutos a 95ºC y de ello se aplicaron 45 \mul por cada pocillo. La elusión de gel se efectuó en tampón 1 x Tris/glicina/SDS (Bio-Rad # 161-0732). Para la inmunotransferencia el gel se transfirió, con ayuda del equipo Bio-Rad Criterion Westernblot (#170-4070) a una membrana de nitrocelulosa (NC) (Amersham # RPN 2020D) en tampón 1 x Tris/glicina (Bio-Rad #161-0732, + metanol al 10%). A continuación, la membrana de NC se saturó durante una hora a la temperatura ambiente con tampón 1 x TBS (Bio-Rad # 170-6435), que contenía 5% de polvo de leche ("Blotto", Bio-Rad #170-6404) y Tween 20 al 0,1% (Bio-Rad # 170-6531). Después de lavar tres veces la membrana en tampón TBS (TBST) exento de Blotto, la membrana se incubó con el anticuerpo primario anti-hEDG-1 (suero de conejo policlonal, que se obtuvo mediante inmunización con la secuencia peptídica CKAHRSSVSDYVNYD específica para EDG-1, acoplada a KLH, y se purificó por afinidad frente a la secuencia peptídica antes mencionada) durante una noche a 4ºC en una dilución 1:50 en TBST-Blotto. Después de lavar tres veces con TBST se incubó el anticuerpo secundario (anti-conejo, acoplado a fosfatasa alcalina, Dianova # 111-055-045) en una dilución 1:2000 en TBST-Blotto durante una hora a la temperatura ambiente. Después de lavado renovado (véase antes), se efectuó la reacción de detección ECF ("enhanced chemifluorescent" - quimiofluorescente reforzada) (Amersham #RPN5785), en donde la membrana de NC cubierta por una lámina de plástica se incubó a la temperatura ambiente con 1 ml de sustrato ECF (Amersham Pharmacia #RPN5785) durante 5 minutos y se detectó con un escáner Fluor-Imager 595 (Amersham Pharmacia). La cuantificación se efectuó con el software ImageQuant (Amersham Pharmacia), en donde se normalizó contra la señal de \beta-tubulina, la cual se obtuvo después de decolorar una vez (Alpha Diagnostic Kit # 90100) la membrana de NC y mediante incubación con el anticuerpo primario específico para \beta-tubulina (anticuerpo de conejo purificado por afinidad, Santa Cruz # sc-9104) según el método arriba descrito.

5

El tratamiento de las células HUVEC primarias con los oligorribonucleótidos monocatenarios, químicamente modificados y de acuerdo con la invención condujo a una inhibición, dependiente de la dosis, de la expresión de edg-1. Solamente los oligorribonucleótidos nº 3 y nº 6 con la orientación antisentido inhibían la expresión génica, mientras que los oligorribonucleótidos nº 2 y nº 5 con la orientación sentido no inhibían la expresión. La inhibición se manifestó como específica para el gen diana, ya que solamente habían disminuido los niveles de la proteína Edg-1, pero no los niveles de tubulina después de tratamiento con los oligorribonucleótidos nº 3 y nº 6 específicos para edg-1. La inhibición se manifestó también como específica para la secuencia en relación con los oligorribonucleótidos empleados, ya que sólo los oligorribonucleótidos nº 3 y nº 6 homólogos a edg-1 inhibían la expresión de edg-1, mientras que el oligorribonucleótido nº 8 con la orientación antisentido, el cual se diferencia en 5 nucleótidos de la secuencia edg-1, no inhibía la expresión de edg-1.

<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH

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<120> Nuevos derivados de oligorribonucleótidos para la inhibición dirigida de la expresión génica

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<130> AVE D-2001/A034

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<140>

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<141>

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<160> 22

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<170> PatentIn Ver.2.1

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<210> 1

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttttgaagcg aaggttgtgg atctg

\hfill

25

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<210> 2

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

uuuugaagcg aagguugugg aucug

\hfill

25

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<210> 3

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<211> 80

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 3

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\hskip0.5cm

102

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<210> 4

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<211> 80

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 4

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\hskip0.5cm

103

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<210> 5

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<211> 80

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 5

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\hskip0.5cm

104

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<211> 80

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 6

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\hskip0.5cm

105

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<210> 7

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<211> 40

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg

\hfill

40

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<210> 8

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<211> 40

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag

\hfill

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 40

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug

\hfill

40

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<210> 10

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<211> 40

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 10

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auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa

\hfill

40

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<210> 11

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<211> 26

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

caccucgaua ugugcaucug uaaaaa

\hfill

26

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<210> 12

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagcaauuca cguucauuau aaaaa

\hfill

25

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<210> 13

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagauccaca accuucgcuu caaaa

\hfill

25

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<210> 14

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 14

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cagauccaca accuucgcuu caaaa

\hfill

25

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Bereich aus humaner EDG1

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagagccacc aacuucucuu caaaa

\hfill

25

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<210> 16

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<211> 60

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Bereich aus humaner EDG1

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaccucggug guguucauuc ucaucugcug cuuuaucauc cuggagaaca ucuuugucuu

\hfill

60

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<211> 60

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Bereich aus humaner EDG1

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<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

auuuccaagg ccagccgcag cucugagaau guggcgcugc ucaagaccgu aauuaucguc

\hfill

60

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<210> 18

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Bereich aus humaner EDG1

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaagauguuc uccaggauga uaaaa

\hfill

25

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<210> 19

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Bereich aus humaner EDG1

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagagcugcg gcuggccuug gaaaa

\hfill

25

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<210> 20

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Bereich aus humaner EDG1

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<400> 20

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\hskip-.1em\dddseqskip

cacagcggcg ucuguccgug gaaaa

\hfill

25

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<210> 21

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<211> 21

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 21

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gaagcgaagg uuguggaucu g

\hfill

21

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<210> 22

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<211> 16

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento de la luciferasa de Photinus pyralis

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<400> 22

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accagaccac aacccg

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16

Claims (27)

1. Oligonucleótido de la fórmula I

fórmula I5'-(N)_{x}-(Z)_{n}

en donde

N son ribonucleótidos que se presentan o no en la naturaleza, que son complementarios, al menos en parte, a un ARN diana,

x, independientemente, es igual a 10 hasta 100,

n es igual a 2 hasta 20,

Z son nucleótidos que se presentan o no en la naturaleza, que están enlazados con un enlace 2'5'-internucleósido,

con la condición de que sus ARN dianas homólogos presenten uno de los siguientes modelos de secuencia

5'-(U)_{v}-(N')_{z}-(U)_{w}

5'-(U)_{v}-(N')_{z}-UX

5'-UX-(N')_{z}-UX y

5'-(U)_{v}-(N')_{z},

en donde v, independientemente, es igual a 2 hasta 20,

en donde w, independientemente, es igual a 2 hasta 20,

z, independientemente, es 15 a 25,

U es igual a uridina, N es igual a adenosina (A), guanosina (G), citidina (C) o U, y X es igual a A, G o C, de preferencia A.

o bien sus sales fisiológicamente tolerables.

2. Oligonucleótido de la fórmula I según la reivindicación 1, en donde x es igual a 15 hasta 45.

3. Oligonucleótido de la fórmula I según la reivindicación 2, en donde x es igual a 16 hasta 25.

4. Oligonucleótido de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, en donde n es igual a 2 hasta 10.

5. Oligonucleótido de la fórmula I según la reivindicación 4, en donde n es igual a 3 hasta 6.

6. Oligonucleótido de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en donde v es igual a 2 hasta 10.

7. Oligonucleótido de la fórmula I según la reivindicación 6, en donde v es igual a 3 hasta 6.

8. Oligonucleótido de la fórmula I según de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde w es igual a 2 hasta 10.

9. Oligonucleótido de la fórmula I según la reivindicación 8, en donde w es igual a 3 hasta 6.

10. Oligonucleótido de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 9, en donde z es igual a 16 hasta 23.

11. Oligonucleótido de la fórmula I según la reivindicación 10, en donde z es igual a 19 hasta 21.

12. Oligonucleótido de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 11, en donde Z representa adenosina ó 3'-desoxiadenosina.

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13. Oligonucleótido de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, en donde uno o más puentes fosfodiéster naturales están reemplazados por puentes internucleótido no naturales, que estabilizan la degradación de nucleasa.

14. Oligonucleótido de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 13, en donde uno o más enlaces fosfodiéster naturales están reemplazados por enlaces fosforotioato.

15. Oligonucleótido de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 14, en donde uno o más enlaces fosfodiéster naturales están reemplazados por enlaces fosforotioato, en donde estas modificaciones se encuentran en los extremos y en los nucleótidos de pirimidina internos.

16. Procedimiento para la inhibición de la expresión génica de un gen diana en una célula in vitro con ayuda de uno o más oligonucleótidos según una o más de las reivindicaciones 1 a 15, en el que primero se prepara un oligonucleótido complementario a un gen diana correspondiente, este oligonucleótido se introduce en una célula, la célula se incuba y, a continuación, se determina la inhibición de la expresión génica del gen diana mediante mediciones comparativas en la cantidad del ARNm correspondiente o del correspondiente producto génico en una célula control.

17. Procedimiento in vitro según la reivindicación 16 para la inhibición de la expresión génica de un gen diana en una célula, en la que la 2'5'-oligoadenilato-sintasa está subexpresada o es defectuosa en comparación con una célula control.

18. Medicamento que contiene un oligonucleótido según una o más de las reivindicaciones 1 a 15, así como sustancias aditivas y/o de soporte y, eventualmente, coadyuvantes para la preparación o formulación de un medicamento.

19. Medicamento según la reivindicación 18 para uso en la terapia de tumores.

20. Medicamento según la reivindicación 18 para uso en la terapia o prevención de enfermedades infecciosas.

21. Medicamento según la reivindicación 18 para uso en la terapia o prevención de enfermedades víricas.

22. Medicamento según la reivindicación 18 para uso en la terapia o prevención de enfermedades inflamatorias o asmáticas.

23. Medicamento según la reivindicación 18 para uso en la terapia de enfermedades circulatorias del corazón o del metabolismo.

24. Uso de un oligonucleótido según una o más de las reivindicaciones 1 a 15 para la identificación o validación de nuevos genes diana terapéuticos.

25. Uso de un oligonucleótido según una o más de las reivindicaciones 1 a 15 para la identificación o validación de nuevos genes diana en la investigación fitoprotectora.

26. Procedimiento para la preparación de un oligonucleótido según una o más de las reivindicaciones 1 a 15, en el que los oligonucleótidos se preparan primero en solución o en fase sólida mediante acoplamiento sucesivo o en bloques y, después de la preparación, se aíslan y purifican.

27. Procedimiento para la preparación de un medicamento, en el que se prepara un derivado de oligonucleótido según la reivindicación 26, y eventualmente se mezcla con otras sustancias aditivas y/o de soporte y eventualmente coadyuvantes.