ES2289505T3 - Inmunoensayo turbidimetrico para lipoproteina (a) y reactivo para el mismo. - Google Patents
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Abstract
Inmunoensayo turbidimétrico con látex que usa una reacción antígeno-anticuerpo de lipoproteína (a) que tiene varios fenotipos, en el que, en la detección que utiliza el inmunoensayo, se ajusta la cantidad de un anticuerpo contra la lipoproteína (a) que se añade a un sistema de ensayo y se añade al sistema de ensayo un aminoácido básico, evitando con ello la variabilidad de un valor de medición atribuible a diversidad de fenotipo y obteniendo un valor de medición que tiene una correlación elevada con un valor de medición de la lipoproteína (a) en una muestra biológica que se mide sobre una base molecular.
Description
Inmunoensayo turbidimétrico para lipoproteína
(a) y reactivo para el mismo.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a un
procedimiento para medir cuantitativamente un antígeno que tiene
diversos fenotipos con precisión en inmunoensayo.
En inmunoensayo, la determinación cuantitativa
sobre una base molecular de un antígeno que tiene diversos
fenotipos que difieren cada uno en su peso molecular ha requerido
enzimoensayo inmunoabsorbente (ELISA) usando varios anticuerpos
monoclonales que reconocen un sitio antigénico diferente. Por
ejemplo, la lipoproteína (a), una proteína de la sangre, tiene una
estructura en la que apo(a), una de las apoproteínas, está
unida a LDL. Apo(a) tiene repeticiones de estructuras de
dominios que exhiben una elevada homología con plasminógeno kringle
4. Dado que el número de esta repetición varía según el individuo,
el peso molecular de apo(a) se diversifica y Lp(a)
(lipoproteína (a)) puede tener diversos fenotipos. Por ejemplo,
Utermann, G., y col. han informado que la lipoproteína (a) se
divide en términos generales en 6 fenotipos (Utermann, G., y col., J
Coin Invest 1987; 80: 458-465). Por lo tanto,
cuando una molécula de un fenotipo con un cierto peso molecular se
usa como material de referencia para medir moléculas de otros
fenotipos con pesos moleculares diferentes de aquella en mediciones
sobre una base ponderal usada habitualmente en inmunoensayo, se
obtiene un valor que se desvía del valor de medición medido sobre
una base molecular debido a la diferencia en el peso molecular de
cada fenotipo. En este caso también existe el problema de que las
diferencias fenotípicas dan como resultado una diferencia en
reactividad con un cierto anticuerpo. Para medir cuantitativamente
con precisión moléculas de todos los fenotipos independientemente
de las diferencias fenotípicas, lo ideal no es la medición basada
en la concentración en peso que se usa generalmente para medir
proteínas en suero, sino la medición sobre una base molecular por
concentración molar. Teóricamente, para realizar la reacción en base
molecular usando inmunoensayo es deseable un enzimoensayo
inmunoabsorbente usando un anticuerpo monoclonal que reacciona en
relación uno-a-uno con un antígeno,
y se requiere el uso de varios anticuerpos monoclonales para tratar
con diversos fenotipos en la medición (Clin Chem 1995;
41:246-255). Por otra parte, en la medición de
lipoproteína (a), también se usa ampliamente inmunoensayo
turbidimétrico usando un anticuerpo policlonal, lo que generalmente
apunta a mediciones basado en la concentración en peso. Por lo
tanto, el inmunoensayo turbidimétrico ha presentado el problema de
que el valor de medición se desvía de los obtenidos por enzimoensayo
inmunoabsorbente debido a las diferencia fenotípicas de un
antígeno, (Curr Cardiol Rep 1999; 1: 105-111).
Abe, A. y col.; Clinica Chimica Acta;
International Journal of Clinical Chemistry, Marzo 1994, vol. 225,
nº 2, págs. 105-113, se refiere a un inmunoensayo
turbidimétrico de lipoproteína (a) realzado con látex. No hay
indicación en este documento de que se añada un aminoácido básico al
sistema de ensayo.
El documento US 4.672.045 se refiere a un
inmunoensayo basado en una interacción anticuerpo antígeno. La
columna 3 describe que se puede usar aglutinación con látex con
turbidimetría en infrarrojo cercano (líneas 18 a 23). Este
documento no describe reacción anticuerpo antígeno de lipoproteínas
que tengan varios fenotipos. Además, no indica específicamente que
se añada un aminoácido básico al sistema de ensayo.
La lipoproteína (a) se asocia con
arterioesclerosis, enfermedad isquémica del corazón, y similares. La
concentración de lipoproteína (a) en sangre se puede usar en la
evaluación del riesgo de morbilidad para estas enfermedades. En
tales circunstancias, se ha deseado un procedimiento capaz de medir
rápidamente y convenientemente la concentración precisa de
lipoproteína.
Un objetivo de la presente invención es resolver
el problema de que un valor de medición obtenido por inmunoensayo
turbidimétrico se desvíe del obtenido por enzimoensayo
inmunoabsorbente debido a las diferencias fenotípicas de un
antígeno. Específicamente, la presente invención se diseña para
proporcionar un procedimiento de poner de acuerdo un valor de
medición obtenido por inmunoensayo turbidimétrico con los obtenidos
por enzimoensayo inmunoabsorbente mediante el ajuste de componentes
reactivos.
Los autores de la presente invención han
encontrado que el ajuste de componentes reactivos permite el control
de un valor de medición en inmunoensayo turbidimétrico para medir
un antígeno que tiene varios fenotipos. A saber, los inventores de
la presente han completado la presente invención encontrando que
cuando añaden a los componentes reactivos una gran cantidad de un
anticuerpo y una cantidad dada de un aminoácido básico tal como
arginina, evitan con ello la influencia de las variaciones en los
valores de medición atribuibles a diferencias fenotípicas y
obtienen un valor de medición que tiene una alta correlación con un
valor de medición obtenido por enzimoensayo inmunoabsorbente que es
capaz de medición sobre una base molecular.
Esto es, la presente invención es como
sigue:
[1]: Inmunoensayo turbidimétrico con látex que
usa una reacción antígeno-anticuerpo de lipoproteína
(a) que tiene varios fenotipos, en la que, en la detección que
utiliza el inmunoensayo, se ajusta la cantidad de un anticuerpo
contra la lipoproteína (a) que se añade a un sistema de ensayo y se
añade al sistema de ensayo un aminoácido básico, evitando con ello
la variabilidad de un valor de medición atribuible a diversidad de
fenotipo y obteniendo un valor de medición que tiene una correlación
elevada con un valor de medición de la lipoproteína (a) en una
muestra biológica que se mide sobre una base molecular;
\global\parskip1.000000\baselineskip
[2]: El inmunoensayo de [1], en el que la
cantidad del anticuerpo que se añade es mayor que o igual a 0,16
mg/ml en una solución de reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo;
[3]: El inmunoensayo de [2], en el que la
cantidad del anticuerpo que se añade es de 0,16 mg/ml a 0,23 mg/ml
incluida en la solución de reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo;
[4]: El inmunoensayo de cualquiera de [1] a [3],
en el que la cantidad del aminoácido básico que se añade es mayor
que o igual a 15% en peso en la solución de reacción en el momento
de la reacción antígeno-anticuerpo;
[5]: El inmunoensayo de [4], en el que la
cantidad del aminoácido básico que se añade es de 15% en peso a 17%
en peso incluida en la solución de reacción en el momento de la
reacción antígeno-anticuerpo;
[6]: El inmunoensayo de cualquiera de [1] a [5],
en el que el aminoácido básico es arginina;
[7]: Un reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex usando una reacción
antígeno-anticuerpo de lipoproteína (a) que tiene
fenotipos, comprendiendo el reactivo: un anticuerpo contra la
lipoproteína (a) en una cantidad tal que la cantidad del anticuerpo
es mayor que o igual a 0,16 mg/ml en una solución de reacción en el
momento de la reacción antígeno-anticuerpo; y un
aminoácido básico en una cantidad tal que la cantidad del
aminoácido básico es mayor que o igual a 15% en peso en la solución
de reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo, en la que el inmunoensayo
turbidimétrico con látex evita la variabilidad de un valor de
medición atribuible a diversidad de fenotipo y obtiene un valor de
medición que tiene una correlación elevada con un valor de medición
de la lipoproteína (a) en una muestra biológica que se mide sobre
una base molecular;
[8]: El reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex de [7], en el que la cantidad del
anticuerpo que se añade es de 0,16 mg/ml a 0,23 mg/ml incluida en la
solución de reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo;
[9]: El reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex de [7] u [8], en el que la cantidad de
aminoácido básico que se añade es de 15% en peso a 17% en peso
incluida en la solución de reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo; y
[10]: El reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex de cualquiera de [7] a [9], en el que el
aminoácido básico es arginina.
La presente memoria descriptiva abarca
contenidos que se describen en las memorias descriptivas y/o dibujos
de la solicitud de patente japonesa Nº 2003-094059
que sirve como base para la prioridad de la presente invención.
La Figura 1 es un diagrama que muestra la
correlación entre valores de medición obtenidos por ensayo de
control y valores de medición obtenidos por un procedimiento de
aglutinación con látex en cada concentración de un anticuerpo;
La Figura 2 es un diagrama que muestra la
desviación de valores de medición de muestras de cada fenotipo de
una recta de regresión en cada concentración de un anticuerpo;
La Figura 3 es un diagrama que muestra la
correlación entre valores de medición obtenidos por ensayo de
control y valores de mediciones obtenidos por un procedimiento de
aglutinación con látex en cada concentración de arginina; y
La Figura 4 es un diagrama que muestra la
desviación de valores de medición de muestras de cada fenotipo de
una recta de regresión en cada concentración de arginina.
En lo sucesivo, la presente invención se
describirá en detalle.
La presente invención se diseña para un
procedimiento para evitar la variabilidad de un valor de medición
atribuible a diferencias fenotípicas de un antígeno en la detección,
usando inmunoensayo turbidimétrico, del antígeno que tiene diversos
fenotipos. El antígeno que se ha de detectar no está limitado
mientras que sea una proteína que tenga varios fenotipos. Es
preferible una proteína que tenga un peso molecular variable
atribuible a diferencias fenotípicas, con lipoproteína (a)
particularmente preferida. Se sabe que la lipoproteína (a) tiene 6
fenotipos designados como F, B, S1, S2, S3, y S4 (Nippon Rinsho in
Japanese (Japanese Journal in Chemical Medicine) 1999, 57 Suppl:
42-44). Estos fenotipos se pueden determinar por el
procedimiento de Utermann y col. (Utermann, G. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 1989, 86:4171-4174: los fenotipos
se clasifican según su movilidad relativa en comparación con la
movilidad de apo-B sobre SDS-PAGE,
como F (más rápido, con un peso molecular más pequeño que el de
apo-B), B (igual), y S1, S2, S3 y S4 (todos más
lentos, en orden descendente de movilidad).
El inmunoensayo turbidimétrico es un
procedimiento en el que un anticuerpo contenido en un reactivo de
ensayo se somete a una reacción antígeno-anticuerpo
con un antígeno en una muestra biológica para formar un agregado
cuya formación se mide por absorbancia para determinar
cualitativamente o cuantitativamente el antígeno en la muestra
biológica. Por ejemplo, el anticuerpo que se usa en el inmunoensayo
turbidimétrico se sensibiliza (se une) a un vehículo insoluble. No
se impone limitación sobre el vehículo usado, y, por ejemplo, se
pueden usar partículas de látex, bentonita, colodión, caolín, y
eritrocitos inmovilizados de oveja. Se prefieren las partículas de
látex. El inmunoensayo turbidimétrico que usa partículas de látex se
denomina inmunoensayo turbidimétrico con látex, en el que las
partícula de látex se sensibilizan (se unen) con un anticuerpo que
se mezcla con un antígeno en una muestra biológica que se ha de
medir para formar la aglutinación de partículas de látex cuyo grado
se mide por absorbancia para determinar el antígeno cualitativamente
o cuantitativamente. La muestra biológica que se usa en la presente
invención no está limitada, y se pueden usar preferentemente
sangre, suero y plasma.
Ejemplos de partículas de látex incluyen
partículas de látex de poliestireno de homopolímeros y/o copolímeros
de monómeros de vinilo tales como cloruro de vinilo, acrilonitrilo,
acetato de vinilo, éster acrílico, y éster metacrílico, partículas
de látex de copolímero basado en butadieno tales como copolímeros de
estireno-butadieno y copolímeros de
butadieno-metacrilato de metilo y partículas de
látex de poli(viniltolueno). Entre ellos, se prefieren las
partículas de látex poliestirénicas porque tienen la excelente
propiedad de absorber, por ejemplo, una diversidad de proteínas o
polipéptidos y pueden mantener establemente actividad biológica
durante un largo período. Las partículas de látex anteriormente
descritas tienen un tamaño de partícula preferentemente de 0,01 a 1
\mum, más preferentemente 0,1 a 1 \mum. Las partículas de látex
que tienen un tamaño de partícula de menos de 0,01 \mum conducen
a frecuente presencia de aglutinación fina y no uniformidad del
tamaño de partícula aparente y afectan adversamente a la
reproducibilidad simultánea y similar. Además, en algunos casos,
estas partículas de látex no se aglutinan suficientemente para
cierto número de anticuerpos. Si el tamaño de partícula es más
grande de 1 \mum, se fomenta la autoaglutinación y se reduce la
dispersabilidad.
El anticuerpo usado en la sensibilización de las
partículas de látex es preferentemente un anticuerpo policlonal de
conejo, cabra, oveja, cerdo, caballo o similar. El anticuerpo
policlonal se puede obtener inmunizando un animal con lipoproteína
(a) purificada que sirve como inmunógeno para dar antisuero, desde
el que se purifica a continuación el anticuerpo policlonal por un
procedimiento o unos procedimientos combinados apropiadamente
seleccionados de procedimientos conocidos en la técnica tales como
precipitación con sulfato amónico, cromatografía de intercambio
iónico que emplea un intercambiador de anión tal como celulosa DEAE,
cromatografía de tamiz molecular que realiza una separación según
tamaños y formas moleculares, cromatografía de hidroxiapatito, y
cromatografía de afinidad. No se impone limitación al fenotipo de la
lipoproteína (a) usada en esta inmunización. Para la lipoproteína
(a), se pueden obtener fracciones con un peso específico de 1,063 a
1,15, por ejemplo, de suero humano normal por ultracentrifugación.
La fracción se puede purificar por cromatografía que usa una
columna de Sepharose CL-4B y similares.
Un procedimiento para sensibilizar partículas de
látex con el anticuerpo no está limitado particularmente. Por
ejemplo, el anticuerpo se puede absorber físicamente o se puede unir
químicamente al vehículo. Para ser más específicos, el vehículo se
puede sensibilizar con el anticuerpo mezclando el anticuerpo con el
vehículo, seguido por calentamiento y agitación de 30 a 37ºC
durante 1 ó 2 horas. La cantidad del anticuerpo con la que se
sensibiliza el vehículo se puede establecer apropiadamente según el
tamaño de partícula del vehículo usado. Se prefiere que sitios no
sensibilizados en la superficie del vehículo deberían ser bloqueados
con albúmina de suero bovino, albúmina de suero humano, albúmina de
suero de conejo, ovoalbúmina, o similares, después de que el
vehículo se ha sensibilizado con el anticuerpo. Se prefiere que el
vehículo sensibilizado con el anticuerpo policlonal se debería
almacenar como una dispersión en un medio hasta que se haga
reaccionar con la muestra biológica. Por ejemplo, se puede usar un
tampón de fosfato, un tampón de glicina y similares como medio para
dispersar el vehículo. El contenido del vehículo sensibilizado con
el anticuerpo policlonal puede ser típicamente 0,05 a 0,5% en peso,
preferentemente 0,1 a 0,3% en peso, con relación a la cantidad de
dispersión en el medio. Si es necesario, se pueden añadir al medio
albúmina de suero bovino, gelatina, goma arábiga, o similares.
El inmunoensayo turbidimétrico con látex se
puede realizar mezclando partículas de látex sensibilizadas con
anticuerpo con una muestra biológica en un tampón apropiado. En la
presente invención, se permite que exista una cantidad más grande
del anticuerpo y de un aminoácido básico en un sistema de reacción
cuando las partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo se
mezclan con la muestra biológica y se aglutinan. La concentración
final de un anticuerpo añadido a un sistema de reacción es 0,05 a
0,1 mg/ml en inmunoensayo turbidimétrico típico, mientras que en la
presente invención, el anticuerpo se añade a una concentración mayor
que o igual a al menos 0,15 mg/ml, preferentemente mayor que o
igual a 0,16 mg/ml. Un límite superior a la misma no se establece a
la luz del efecto de suprimir la variabilidad de un valor de
medición atribuible a la diversidad de fenotipo. Sin embargo, la
concentración es preferentemente 1 mg/ml o menos, más
preferentemente 0,3 mg/ml o menos, particularmente preferentemente
0,23 mg/ml o menos, desde el punto de vista de obtener una imagen
de aglutinación favorable en el inmunoensayo turbidimétrico con
látex. Para ajustar la cantidad del anticuerpo que se añade, se
puede aumentar la cantidad de partículas de látex sensibilizadas con
anticuerpo que se añade al sistema de reacción, o se puede aumentar
la cantidad, por unidad de partícula de látex, del anticuerpo usado
para sensibilización de las partículas de látex. Alternativamente,
se puede permitir que las partículas de látex sensibilizadas con
anticuerpo, que se preparan como partículas de látex sensibilizadas
a una concentración de 0,05 a 0,5% en peso con relación a la
dispersión en el medio según se ha descrito anteriormente, tengan
una concentración más elevada en la dispersión en el medio.
Ejemplos del aminoácido básico incluyen
arginina, histidina, y citrulina. Entre ellos, se prefiere
particularmente arginina. La cantidad del aminoácido básico que se
añade es mayor que o igual a 12%, preferentemente mayor que o igual
a 15%, en términos de su concentración final en el sistema de
reacción cuando las partículas de látex sensibilizadas con
anticuerpo se mezclan con la muestra biológica y se aglutinan. Un
límite superior de la concentración de aminoácido no se limita a la
luz del efecto de suprimir la variabilidad de un valor de medición
atribuible a la diversidad de fenotipo. Por ejemplo, el aminoácido
básico se puede usar a una concentración del orden del 40%. Sin
embargo, la concentración es preferentemente 25% o menos, más
preferentemente 20% o menos, particularmente preferentemente 17% o
menos, desde el punto de vista de obtener una imagen de
aglutinación favorable, aunque sea con arginina.
Un procedimiento de aglutinación con látex según
la presente invención se realiza típicamente mezclando 1 volumen de
una muestra biológica con 40 volúmenes de un primer reactivo que
contiene un tampón y 20 volúmenes de una solución de partículas de
látex sensibilizadas (segundo reactivo). Sin embargo, se puede usar
cualquier relación en la que las relaciones de abundancia de un
antígeno en la muestra biológica y una partícula de látex
sensibilizada sean apropiadas y se obtenga una imagen de
aglutinación favorable sin que se limite a esta relación de
mezclado. Alternativamente, el primer reactivo y el segundo reactivo
se pueden usar en una solución única. La concentración de la
partícula en la solución de partículas de látex sensibilizadas se
puede ajustar apropiadamente según una relación del volumen de la
solución de partículas de látex sensibilizadas que se añade a un
sistema de reacción respecto al volumen total del sistema de
reacción. Por ejemplo, un tampón de fosfato, pH 7, o un tampón de
glicina pH 7, se usan como el tampón que constituye el primer
reactivo. Un aminoácido básico se puede añadir al primer reactivo,
al segundo reactivo o a ambos, mientras que su concentración final
caiga en el intervalo de concentración anteriormente descrito. En el
ejemplo típico que se ha descrito anteriormente, la concentración
preferida del anticuerpo en la solución de partículas de látex
sensibilizadas es de 0,5 mg/ml a 0,7 mg/ml inclusive. Por ejemplo,
cuando el aminoácido básico se añade a ambos primer reactivo y
segundo reactivo, el aminoácido básico se puede añadir a una
concentración de 7 a 10% para el primer reactivo y 30% para el
segundo reactivo. La concentración preferida del anticuerpo o del
aminoácido básico en estos reactivos se puede determinar fácilmente
a partir de la concentración final en el sistema de reacción final
y la relación de volumen de cada uno de los reactivos.
La reacción se realiza mezclando la muestra
biológica con el primer reactivo y el segundo reactivo. Aunque el
orden de mezclado no está limitado, la muestra biológica se puede
mezclar inicialmente con el primer reactivo con agitación durante
varios minutos, preferentemente 1 a 5 minutos, más preferentemente 5
minutos, y posteriormente se puede mezclar con el segundo reactivo
con agitación. La reacción de aglutinación se realiza durante 1 a 4
minutos para examinar el grado de aglutinación. La temperatura a la
que se realizan los procedimientos anteriormente descritos no está
limitada, pero preferentemente es 37ºC. Estos procedimientos también
se pueden realizar dentro de una celdilla de plástico o una
celdilla de vidrio. En este caso, la celdilla se irradia desde el
exterior con luz desde luz visible hasta luz en la región del
infrarrojo cercano, por ejemplo, una luz que tenga una longitud de
onda habitualmente de 400 a 2400 nm, preferentemente 550 a 800 nm. A
continuación se detecta un cambio en absorbancia o un cambio en
intensidad de dispersión de la luz para medir el grado de
aglutinación de las partículas de vehículo. En este caso, el uso de
una curva de calibración preparada con antelación permite el
cálculo de la cantidad (concentración) de la lipoproteína (a) en la
muestra. El fenotipo de la lipoproteína que se usa para preparar
esta curva de calibración no está limitado. La aglutinación se
puede medir usando, por ejemplo, un aparato de aglutinación de látex
completamente automático LPIA-S500 (Mitsubishi
Chemical), un analizador automático TBA-200FR
(Toshiba), y un analizador automático Hitachi 7170 (Hitachi).
La reacción de aglutinación se puede realizar en
una solución tal como una solución salina fisiológica o un tampón
apropiado (pH 5 a 10), por ejemplo, un tampón de fosfato, un tampón
de borato, un tampón de Tris y similares.
Según el procedimiento de la presente invención,
se evita la variabilidad de un valor de medición atribuible a
diversidad de fenotipo y se obtiene un valor de medición que tiene
una correlación elevada con un valor de medición de lipoproteína
(a) en una muestra biológica que se mide sobre una base molecular.
El "valor de medición de lipoproteína (a) en una muestra
biológica que se mide sobre una base molecular" que se usa en
este documento se refiere, por ejemplo, a un valor medido por
enzimoensayo inmunoabsorbente (ELISA) realizado en condiciones
particulares.
El procedimiento ELISA (enzimoensayo
inmunoabsorbente) es un procedimiento en el que un anticuerpo se
marca con un enzima y se detecta una sustancia (antígeno) que se
une al anticuerpo. Especialmente, el procedimiento ELISA se usa
ampliamente como procedimiento para detectar una proteína antígena y
como un procedimiento de ensayo que usa reacción
antígeno-anticuerpo para detectar una proteína
antígena en una muestra o recíprocamente, un anticuerpo que se une
a una proteína antígena particular. El procedimiento ELISA detecta
un anticuerpo que ha reaccionado con un antígeno que se ha de
medir, usando un segundo anticuerpo unido químicamente con
antelación con un enzima tal como peroxidasa o galactosidasa, y
detecta la presencia o ausencia de la cantidad del antígeno de
interés sobre la base del grado de color desarrollado añadiendo, a
un sistema de reacción, un sustrato que desarrolla un color a
través de la reacción con el enzima.
La corriente principal general de la detección
de una proteína de interés en el procedimiento ELISA es la
detección por un procedimiento de emparedado basado en anticuerpos
en el que un antígeno se empareda entre un anticuerpo inmovilizado
y un anticuerpo etiquetado usando la combinación de un anticuerpo
policlonal y un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y
un anticuerpo monoclonal, o un anticuerpo policlonal y un
anticuerpo monoclonal ("Seikagaku Jikkenho in Japanese
(Experiments in Biochemistry) 11 - Immunoassay", publicado por
Tokyo Kagaku Dozin, 15 Nov. 1989).
En el procedimiento ELISA, generalmente se
establece la unión de una molécula del anticuerpo inmovilizado y
una molécula del antígeno-una molécula del
anticuerpo marcado. Con la excepción de varios epitopos
(determinantes antigénicos) que están presentes en una molécula de
antígeno reconocidos por el anticuerpo etiquetado, la unión
anteriormente descrita se establece incluso para cualquier fenotipo
de un antígeno que tenga diversos fenotipos, de modo que se hace
posible la medición sobre una base molecular. Esto es, incluso
cuando se usa como material de referencia una molécula de cualquier
fenotipo, se pueden medir con precisión moléculas de otros
fenotipos sobre una base molecular.
Por ejemplo, en lipoproteína (a), una molécula
de apo(a), una de proteínas estructurales, tiene repeticiones
de estructuras denominadas kringle 4, que se dividen en 10 tipos
diferentes de tipo 1 a tipo 10. De estos tipos, kringle 4 tipo 1 y
tipo 3 a tipo 10 están presentes en una única copia en todas las
especies apo(a), mientras que kringle 4 tipo 2 está presente
en un número variable de repeticiones en cada molécula
apo(a), que supuestamente varía de 3 a 40. A saber, las
variaciones en peso molecular atribuibles a las diferencias
fenotípicas de lipoproteína resultan principalmente del número de
repeticiones de kringle 4 tipo 2. Esto indica que una medición
precisa sobre una base molecular no se puede realizar en la medición
que usa ELISA, de lipoproteína (a) a partir del número de la
repetición de cada tipo de kringle 4, si un anticuerpo contra
kringle 4 tipo 2 está contenido en ambos anticuerpos tanto
inmovilizados como etiquetados (Clin Chem 1995; 41:
245-255). Además, epitopos idénticos o similares
están presentes en dominios de diferentes tipos de kingle 4. Esto
permite razonablemente mediciones sobre una base molecular, porque
se establece la unión de una molécula del anticuerpo
inmovilizado-una molécula del
antígeno-una molécula del anticuerpo etiquetado sin
excepción cuando el anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo
etiquetado se seleccionan entre los anticuerpos capaces de unirse a
cualquiera de los kringle 4 tipo 1 y kringle 4 tipo 3 a tipo 10 y
reconocer un epitopo que no está presente habitualmente en
diferentes tipos de kringle 4 y el anticuerpo inmovilizado y el
anticuerpo etiquetado se unen a un tipo de kringle 4 separado. Un
anticuerpo que reconoce un epitopo presente en un dominio distinto
del dominio kringle 4 y presente en una copia única en
apo(a) se puede usar al menos como el anticuerpo etiquetado,
preferentemente como ambos anticuerpo inmovilizado y anticuerpo
etiquetado. En la presente invención, el "valor de medición de
lipoproteína (a) que se mide sobre una base molecular" se refiere
a un valor de medición obtenido por ELISA realizado en una
condición tal que se establece la unión de una molécula del
anticuerpo inmovilizado-una molécula del
antígeno-una molécula del anticuerpo etiquetado.
Ejemplos de ELISA de este tipo incluyen ELISA descrito en Clin Chem
1995; 41:246-255. Cuando un valor de medición
obtenido por un procedimiento ELISA de este tipo se correlaciona
con el valor de medición obtenido por el procedimiento de la
presente invención, su coeficiente de correlación (R^{2}) es 0,97
o más, preferentemente 0,98 o más, todavía más preferentemente 0,99
o más.
El inmunoensayo turbidimétrico de la presente
invención, que evita la variabilidad de un valor de medición
atribuible a diversidad de fenotipo y obtiene un valor de medición
que tiene una correlación elevada con un valor de medición de
lipoproteína (a) en una muestra biológica que se mide sobre una base
molecular, es un inmunoensayo turbidimétrico en el que una curva de
calibración preparada por la misma medición que usa más adelante
como muestra cualquier fenotipo de lipoproteína (a) sustancialmente
muestra paralelismo con una curva de calibración preparada
representando gráficamente la relación de valores de medición
expresados como concentraciones teóricas y variaciones de
absorbancia en la medición por inmunoensayo turbidimétrico, de una
preparación obtenida usando un material de referencia de
lipoproteína (a) (PRM; material de referencia propuesto de IFCC)
certificado por IFCC (International Federation of Clinical
Chemistry and Laboratory Medicine, Via Carlo Farini 81, 20159
Milán, Italia) como muestra que a su vez se somete a dilución en
serie con solución fisiológica salina.
El procedimiento de la presente invención evita
la variabilidad de un valor de medición atribuible a diversidad de
fenotipo y obtiene un valor de medición que tiene una correlación
elevada con un valor de medición de lipoproteína (a) en una muestra
biológica que se mide sobre una base molecular. Esto significa que
se obtiene un valor de medición casi idéntico todas las veces,
incluso si se cambia el fenotipo de una molécula que se usa como
material de referencia. Así, el procedimiento de la presente
invención es un procedimiento que obtiene un valor de medición
constante, independientemente del fenotipo de la molécula que se usa
como material de referencia.
En lo sucesivo, se describirá específicamente la
presente invención con referencia a Ejemplos. Sin embargo la
presente invención no pretende limitarse a los Ejemplos a
continuación.
Ejemplo
1
Un anticuerpo policlonal de lipoproteína (a)
anti-humana de conejo (disponible en DAKO) se mezcló
con partículas de látex (disponibles en Sekisui Chemical) y se
calentó a temperatura ambiente durante 60 minutos y posteriormente
en un baño termostático a 60ºC durante 50 minutos, seguido de
enfriamiento en agua fría durante 20 minutos para realizar con ello
la sensibilización. El anticuerpo policlonal se sensibilizó en una
cantidad de 0,14 mg por mg de partículas de látex. Las partículas
de látex sensibilizadas se dispersaron a una concentración de 0,5%
en peso en tampón de glicina 0,17M, pH 7, para dar una dispersión de
anticuerpo policlonal de lipoproteína anti-humana
de conejo.
Se prepararon suspensiones dispersas de
partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo policlonal de
lipoproteína (a) anti-humana de conejo de modo que
las concentraciones finales del anticuerpo en segundos reactivos se
llevaron a aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, y 0,7 mg/ml,
respectivamente. Las suspensiones dispersas se usaron como los
segundos reactivos. Como primer reactivo se usó un tampón de glicina
suplementado con NaCl 0,1 M, EDTA 0,05 M, BSA al 1%, y 25 mg/ml de
globulina de conejo normal con el fin de prevenir reacción no
específica. Se añadió arginina como aminoácido básico a una
concentración de 10% para el primer reactivo y de 30% para el
segundo reactivo. La concentración final de arginina en la solución
de reacción fue 16,7%.
Como muestras que se han de medir, se usaron
veinte muestras de suero humano que contenían un fenotipo de
lipoproteína (a) respectivamente diferente. Entre las 20 muestras,
se usaron 4 muestras de cada para cada uno de los fenotipos B, S1,
S2, S3 S4 y S5 (disponibles en Technoclone).
Para realizar la reacción, se añaden 160 \mul
del primer reactivo a 4 \mul de cada muestra de suero y se
agitan. Después de 5 minutos, se añadieron 80 \mul de cada segundo
reactivo y se agitaron para realizar la reacción de aglutinación.
Se usó un analizador automático Hitachi 7170 en la medición y se
ajustó para medir la reacción de aglutinación a 37ºC durante 4
minutos desde aproximadamente 1 minuto en la reacción como
variaciones de absorbancia a una longitud de onda de 570 nm. Para
calcular las concentraciones a partir de las variaciones de
absorbancia, se preparó con antelación una curva de calibración que
muestra la relación entre la concentración y las variaciones de
absorbancia usando un material de referencia (disponible en
Technoclone) que tenía una concentración conocida como muestra y
midiéndolo en las mismas condiciones.
Las 20 muestras anteriormente descritas se
midieron como sigue por enzimoensayo inmunoabsorbente que sirve
como procedimiento de control. El anticuerpo monoclonal usado se
puede obtener por un procedimiento que se describe en Clin Chem
1995; 41: 246-255. Un anticuerpo monoclonal de
lipoproteína (a) anti-humana (que se une a kringle
4 tipo 2 pero no se une a kringle 4 tipo 1 y tipo 3 a tipo 10) se
inmovilizó a 0,5 \mug/pocillo en una placa de microvaloración de
96 pocillos fabricada por Nunc (100 \mul de solución de anticuerpo
de 5 \mug/ml en tampón de bicarbonato sódico 0,1 M (pH 9,6) se
colocaron en el pocillo y se agitaron a temperatura ambiente
durante 1 hora, seguida de incubación durante la noche a 4ºC). Los
pocillos se lavaron tres veces con PBS, pH 7,4. La placa se bloqueó
por adición a los pocillos de 300 \mul de PBS que contenía 30 g/l
de BSA y una hora de incubación a temperatura ambiente. Después del
bloqueo, los pocillos se lavaron tres veces con PBS, pH 7,4. A
continuación, 100 \mul de cada una de las muestras anteriormente
descritas se añadieron a los pocillos y se agitaron a 28ºC durante
1 hora. Antes de la adición, las muestras se diluyeron
apropiadamente con PBS que contenía 1g/l de BSA y 0,5 ml/l de Tween
20. Después de que los pocillos se lavaran tres veces, con PBS, pH
7,4, se añadieron 100 \mul de solución de un anticuerpo monoclonal
de lipoproteína (a) anti-humana etiquetado con HRP
(que se une a un dominio kringle 4 distinto de dominio kringle 4
tipo 2) y se agitó a 28ºC durante 1 hora. Posteriormente, se
realizó la reacción de color añadiendo OPD y H_{2}O_{2}. Después
de 15 minutos, se detuvo la reacción añadiendo 100 \mul de ácido
sulfúrico de 1 mol/l. Se midió a 495 nm la absorbancia de las
soluciones de reacción después de la terminación de la reacción.
Para calcular las concentraciones a partir de las variaciones de
absorbancia, se preparó con antelación una curva de calibración que
muestra la relación entre la concentración y las variaciones de
absorbancia usando un material de referencia que tenía una
concentración conocida como muestra y midiéndolo en las mismas
condiciones.
Como resultado, se observaron muestras que
tenían valores de medición que se desviaban de la recta de regresión
determinada por una correlación con el enzimoensayo
inmunoabsorbente en la medición con los reactivos en los que las
concentraciones del anticuerpo en los segundos reactivos eran 0,3
mg/ml y 0,4 mg/ml, respectivamente, mientras que no se observó
ninguna muestra que tuviera un valor de medición que se desviara de
la recta de regresión determinada por una correlación con el
enzimoensayo inmunoabsorbente en la medición con los reactivos en
los que las concentraciones del anticuerpo en los segundos reactivos
eran 0,5 mg/ml y 0,6 mg/ml, respectivamente. La Figura 1 muestra la
correlación entre los valores de medición obtenidos por el ensayo de
control y los valores de medición obtenidos por el procedimiento de
aglutinación con látex en cada concentración del anticuerpo. La
Figura 2 muestra la desviación de los valores de medición de las
muestras de cada fenotipo de la recta de regresión.
Se ha confirmado que el ajuste de la
concentración de un anticuerpo en un reactivo permite el acuerdo con
un valor de medición obtenido por enzimoensayo inmunoabsorbente que
sirve como control.
Ejemplo
2
Se preparó una suspensión dispersa de partículas
de látex sensibilizadas con un anticuerpo policlonal de lipoproteína
(a) anti-humana de conejo de la misma manera que en
el Ejemplo 1.
Se preparó la suspensión dispersa de partículas
de látex sensibilizadas con el anticuerpo policlonal de lipoproteína
(a) anti-humana de conejo de modo que la
concentración final del anticuerpo en un segundo reactivo se llevó
a aproximadamente 0,7 mg/ml. Se añadió arginina como aminoácido
básico al primer reactivo de modo que las concentraciones de
arginina en las soluciones de reacción se llevaron a 10%, 15% y 17%,
respectivamente (la concentración en el segundo reactivo es
30%).
Las condiciones de medición y las muestras que
se han de medir fueron las mismas que en el Ejemplo 1.
Como resultado, se observaron muestras que
tenían valores de medición que se desviaban de la recta de regresión
determinada por una correlación con el enzimoensayo
inmunoabsorbente cuando se usó la solución de reacción que tenía
una concentración de arginina de 10%, mientras que no se observó
ninguna muestra que tuviera un valor de medición que se desviara de
la recta de regresión determinada por una correlación con el
enzimoensayo inmunoabsorbente cuando se usaron las soluciones de
reacción que tenían concentraciones de arginina de 15% y 17%
respectivamente. La Figura 3 muestra la correlación entre los
valores de medición obtenidos por el ensayo de control y los
valores de medición obtenidos por el procedimiento de aglutinación
con látex en cada concentración de la arginina. La Figura 4 muestra
la desviación de los valores de medición de las muestras de cada
fenotipo de la recta de regresión.
Se ha confirmado que el ajuste de la
concentración de arginina en un reactivo permite el acuerdo con un
valor de medición obtenido por enzimoensayo inmunoabsorbente.
Como se ha descrito en los Ejemplos, el
inmunoensayo turbidimétrico con látex puede evitar la variabilidad
de un valor de medición atribuible a las diferencias fenotípicas de
lipoproteína (a) humana que tiene diversos fenotipos aumentando la
cantidad de anticuerpo que se añade a un sistema de reacción y
añadiendo un aminoácido básico que tiene una concentración dada al
sistema de reacción.
La presente invención permite medición rápida y
conveniente con un analizador automático, que da un valor de
medición que tiene una excelente correlación con un valor de
medición obtenido por enzimoensayo inmunoabsorbente, cuando se mide
un antígeno que tiene diversos fenotipos.
Claims (10)
1. Inmunoensayo turbidimétrico con látex que usa
una reacción antígeno-anticuerpo de lipoproteína (a)
que tiene varios fenotipos, en el que, en la detección que utiliza
el inmunoensayo, se ajusta la cantidad de un anticuerpo contra la
lipoproteína (a) que se añade a un sistema de ensayo y se añade al
sistema de ensayo un aminoácido básico, evitando con ello la
variabilidad de un valor de medición atribuible a diversidad de
fenotipo y obteniendo un valor de medición que tiene una correlación
elevada con un valor de medición de la lipoproteína (a) en una
muestra biológica que se mide sobre una base molecular.
2. El inmunoensayo según la reivindicación 1, en
el que la cantidad de anticuerpo que se añade es mayor que o igual
a 0,16 mg/ml en una solución de reacción en el momento de la
reacción antígeno-anticuerpo.
3. El inmunoensayo según la reivindicación 2, en
el que la cantidad de anticuerpo que se añade es de 0,16 mg/ml a
0,23 mg/ml incluida en la solución de reacción en el momento de la
reacción antígeno-anticuerpo.
4. El inmunoensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad de aminoácido básico
que se añade es mayor que o igual a 15% en peso en la solución de
reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo.
5. El inmunoensayo según la reivindicación 4, en
el que la cantidad de aminoácido básico que se añade es de 15% en
peso a 17% en peso incluida en la solución de reacción en el momento
de la reacción antígeno-anticuerpo.
6. El inmunoensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el aminoácido básico es
arginina.
7. Un reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex que usa una reacción
antígeno-anticuerpo de lipoproteína (a) que tiene
fenotipos, comprendiendo el reactivo: un anticuerpo contra la
lipoproteína (a) en una cantidad tal que la cantidad del anticuerpo
es mayor que o igual a 0,16 mg/ml en una solución de reacción en el
momento de la reacción antígeno-anticuerpo; y un
aminoácido básico en una cantidad tal que la cantidad del
aminoácido básico es mayor que o igual a 15% en peso en la solución
de reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo, en la que el inmunoensayo
turbidimétrico con látex evita la variabilidad de un valor de
medición atribuible a diversidad de fenotipo y obtiene un valor de
medición que tiene una correlación elevada con un valor de medición
de la lipoproteína (a) en una muestra biológica que se mide sobre
una base molecular.
8. El reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex según la reivindicación 7, en el que la
cantidad del anticuerpo que se añade es de 0,16 mg/ml a 0,23 mg/ml,
incluida en la solución de reacción en el momento de la reacción
antígeno-anticuerpo.
9. El reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex según la reivindicación 7 u 8, en el que
la cantidad del aminoácido básico que se añade es de 15% en peso a
17% en peso, incluida en la solución de reacción en el momento de
la reacción antígeno-anticuerpo.
10. El reactivo de detección para inmunoensayo
turbidimétrico con látex según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que el aminoácido básico es
arginina.
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