ES2289544T3

ES2289544T3 - Oligonucleotido antisentido para inhibir la actividad inhibidora de melanoma mia.

Info

Publication number: ES2289544T3
Application number: ES04763992T
Authority: ES
Inventors: Karl-Hermann Schlingensiepen; Reimar Schlingensiepen
Original assignee: Antisense Pharma GmbH
Current assignee: Isarna Therapeutics GmbH
Priority date: 2003-08-12
Filing date: 2004-08-11
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2024-08-11
Also published as: US7910563B2; WO2005014812A3; JP2007501621A; EP1660656A2; US20070299022A1; DE602004008085T2; JP4649408B2; WO2005014812A2; ATE369422T1; DE602004008085D1; EP1660656B1

Abstract

Un oligonucleótido antisentido seleccionado entre el grupo de - la secuencia 5'' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG- 3'' y modificaciones de ella, - un fragmento que tiene al menos 8 nucleótidos de la secuencia 5'' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG- 3'' y modificaciones de ella.

Description

Oligonucleótido antisentido para inhibir la Actividad Inhibidora de Melanoma MIA.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un oligonucleótido, o modificaciones de él, para la inhibición de la expresión y/o actividad funcional de la "Actividad Inhibidora de Melanoma" MIA, a una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido o sus modificaciones y a su uso para la prevención o el tratamiento de neoplasmas, infecciones y/o trastornos inmunosupresores.

Antecedentes

El polipéptido "Actividad Inhibidora de Melanoma" MIA se descubrió en 1989 e inicialmente se describió como un factor que inhibe el crecimiento de las células tumorales de melanoma. La proteína de la actividad inhibidora de melanoma (MIA) se identificó dentro de las actividades inhibidoras del crecimiento purificada desde el material sobrenadante del cultivo de células de la línea HTZ-19 de melanoma humano (Bogdahn y otros, Cancer Res. 49:5358-5363, 1989). Wellbach y otros demostraron además que MIA inhibe la proliferación celular por prolongar la fase S y detener las células en el compartimiento G2 (Cancer Res. 50; 6981-86, 1990). La acción antiproliferativa de MIA se demostró también en otras células tumorales y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), en las que rMIA recombinante humana inhibía la proliferación de PBMCs inducida por IL-2 o PHA de manera dependiente de la dosis. Adicionalmente, MIA exhibía también citotoxicidad LAK autogénica y halogénica (Jachimczak y otros, Proceeding of AACR, 41:115, 2000).

Blesch y otros identificaron MIA como un precursor de 131 aminoácidos procesado en una proteína madura de 107 aminoácidos. Esta publicación confirmó que MIA actúa como un potente inhibidor del crecimiento de células tumorales para células de melanoma maligno y además extendió esta observación a otros tumores neuroectodérmicos. Los autores concluyeron que "...MIA ...puede ser atractiva como una sustancia terapéutica antitumoral del futuro" (Cancer Res. 54; 5695-5701, 1994).

Sin embargo, otros estudios revelaron patrones de expresión inconsistentes con un supresor de tumores. A diferencia, Groningen y otros encontraron expresión de mRNA de MIA en líneas de células sin metástasis y una correlación inversa de la expresión de mRNA de MIA con pigmentación en lesiones con metástasis de melanoma, pero se encontró que no había expresión notable en líneas de células con alta metástasis (Cancer Res. 55; 6237-6243; 1995).

Más recientemente, Bosserhoff y otros han observado que MIA inhibe específicamente la unión de células de melanoma a fibronectina y laminina, enmascarando así los sitios de unión de las integrinas a estos componentes de matriz extracelular y promoviendo la invasión y metástasis in vivo (Bosserhof y otros, Hautarzt 49, 762-769, 1998; Stoll y otros, EMBO J 20, 340-349, 2001). Por tanto, la actividad inhibidora del crecimiento in vitro puede reflejar la capacidad de MIA de interferir con la unión de células a placas de cultivo observada por Blesch y otros (Cancer Res. 54; 5695-5701, 1994).

Otros experimentos realizados en hamster por Guba y otros (Brit. J. Cancer 83, 1216-1222, 2000) analizaron el papel in vivo de MIA durante la metástasios de melanoma. La expresión forzada de MIA en células de melanoma de hamster A-mel3 transfectadas con MIA aumentó significativamente su potencial metastático en comparación con células transfectadas de control. Además, células que superexpresan MIA presentaban una velocidad más alta tanto de invasión como extravasación de células tumorales. Bosserhoff y otros confirmaron estos resultados usando células de melanoma de ratón B16 transfectadas establemente con MIA (Bosserhoff y otros, Melanoma Res. 11; 417-421, 2001). La capacidad de estas células de formar metástasis de pulmón en ratones singénicos C57B16 se correlacionó estrictamente con el nivel de secreción de MIA en ratones.

La correlación clínica de la expresión de MIA con la progresión de melanoma fue descubierta por Bosserhoff y otros (Cancer Res. 57; 3149-53, 1997) y confirmada por otros (Stahlecker y otros, Anticancer Res. 19, 2691-3, 2000). 81% de lo sueros obtenidos de pacientes con melanomas malignos con metástasis en la etapa III reveló valores de MIA incrementados e incluso 97% de los sueros de pacientes en la etapa IV. Los pacientes en la etapa I o II de la enfermedad tenían niveles de MIA sólo ligeramente aumentados, de 13 y 23%, respectivamente (Bosserhoff y otros, Cancer Res. 57; 3149-53, 1997).

Además, hay evidencia de que MIA puede ser útil como marcador en otros tipos de tumores malignos, puesto que también se ha dado cuenta de seropositividad en algunos pacientes con carcinoma gastrointestinal avanzado con un prognóstico muy malo. (Wagner y otros, Med. Oncol. 1735-38; 2000). Recientemente se han medido niveles de MIA en muestras de fluido cerebroespinal de pacientes con enfermedades espinales (Natsume y otros, Spine 26(2), 157-60, 2001).

La concentración de MIA en la mielopatía cervical, estenosis de canal lumbar y hernia de disco lumbar era significativamente más alta que en el grupo de control. Es interesante que MIA no se expresa en el sistema nervioso central en condiciones fisiológicas.

Además, en experimentos de hibridación in situ, la inmunohistoquímica localiza MIA en el embrión en desarrollo dentro de la zona de crecimiento del sistema esquelético y se está expresando, secretando y depositando en torno a los condrocitos. Adicionalmente, se expresa patológicamente en el condrosarcomo (Bosserhoff y otros, Dev Dyn 208(4): 516-525, 1997).

Muller-Ladner y otros encontraron concentraciones aumentadas de MIA en pacientes con enfermedades reumáticas con destrucción de articulaciones, osteoartritis, oligoartritis asociada a HLA-27, artritis psoriática.

Puesto que se encontraron niveles altos de MIA en condrocitos, se investigó MIA también como marcador potencial para la artritis reumatoide y lesión de cartílago. Muller-Ladner y otros encontraron concentraciones aumentadas de MIA en suero en pacientes con enfermedades reumáticas con destrucción de articulaciones, osteoartritis, oligoartritis asociada a HLA-27, artritis psoriática y artritis reumatoide, en las que se encontró el más significativo aumento de MIA (Muller-Ladner y otros, Rheumatology 38, 148-154, 1999).

Sin embargo, en el caso de los tumores, se encontró que MIA se expresa y secreta al suero por todos los melanomas malignos examinados, pero no en otros tumores de piel, incluidos cáncer basal de células y cáncer escamoso de células, ni en melanocitos y queratinocitos normales (Bosserhoff y otros, J. Pathol 187(4):446-454, 1999). Además, se encontró expresión de MIA en todos los cánceres de mama en etapa avanzada y metástasis analizados, lo que sugiere una expresión mucho más amplia de MIA en neoplasmas epiteliales que la determinada anteriormente por estudios del suero (Bosserhoff y otros, J. Pathol. 187(4): 446-454, 1999).

Técnica anterior

Las moléculas para la inhibición de la expresión y/o actividad funcional de MIA se han publicado en el documento WO 01/68122. La inhibición se logra usando como mínimo una molécula de ácido nucleico, péptido, proteína o sustancia de bajo peso molecular en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula antisentido y/o un ribozima. La solicitud de patente anterior se refiere a moléculas, incluidos oligonucleótidos, capaces de inhibir la expresión y/o función de MIA invirtiendo así la inmunosupresión (WO 01/68122).

Era objetivo de la invención desarrollar oligonucleótidos antisentido de MIA con mayor eficacia.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a oligonucleótidos antisentido con la secuencia siguiente: 5' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG - 3', modificaciones suyas, partes del oligonucleótido antisentido con al menos 8 nucleótidos y/o modificaciones suyas. Presentan una inhibición sorprendentemente más eficaz de la expresión y/o función de la invasión tumoral y/o la inhibición de la metástasis y una estimulación más eficaz de células inmunes y/o el sistema inmune que los oligonucleótidos antisentido de la técnica anterior. La presente invención corresponde también a una composición farmacéutica que comprende como mínimo uno de los oligonucleótidos antisentido o sus modificaciones y a su uso para la prevención o el tratamiento de neoplasmas, infecciones y/o trastornos inmunosupresores.

Aunque hasta el momento se han ensayado varios de los nucleótidos (véase documento WO 01/68122), el oligonucleótido con la secuencia 5' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG - 3' presentó sorprendentemente la inhibición más fuerte de MIA en comparación con los oligonucleótidos antisentido de la solicitud de patente WO 01/68122 con la ID secuencia n^{os} 1-8.

Descripción detallada

En una realización de la invención, el oligonucleótido que tiene la secuencia 5' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG - 3' o sus modificaciones tiene una estructura de tipo DNA o RNA capaz de hibridar con una zona de la región de gen que codifica MIA reduciendo así y/o inhibiendo la expresión de MIA. Las personas expertas en la técnica entenderán también que fragmentos que tienen subsecuencias del nucleótido antisentido dada antes con como mínimo 8 nucleótidos o modificaciones de ella actúen de acuerdo con la invención en tanto que se reduzca o inhiba a producción de MIA.

En lo que sigue, el oligonucleótido con la secuencia 5' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG - 3' y los oligonucleótidos antisentido que representan partes de esta secuencia con como mínimo 8 nucleótidos se denominan oligonucleótidos antisentido.

En otra realización de la invención, los oligonucleótidos antisentido se modifican en uno o más restos de azúcar, las bases y/o las uniones internucleótidos así como los restos de fosfato. Por ejemplo, las modificaciones de los oligonucleótidos comprenden modificaciones tales como uniones internucleótidos de fosforotioato (S-ODN), uniones internucleótidos de metilfosfonato, uniones fosforoamidato, uniones peptídicas, modificaciones 2'-O-alquilo del azúcar, en particular de metilo, etilo, propilo, butilo, etc., modificaciones 2'-metoxietoxi del azúcar y/o modificaciones de las bases. Las varias modificaciones se pueden combinar en un oligonucleótido.

En una realización, la estructura anular del grupo ribosa de los nucleótidos en el oligonucleótico o polinucleótido modificado tiene el oxígeno en la estructura anular con N-H, N-R, S y/o metileno.

En otras realizaciones, las modificaciones del esqueleto incluyen 2'-O-metilrribonucleósidos (2'-O-Me). Estos tipos de sustituciones se describen extensamente en la bibliografía y, en particular, con respecto a sus propiedades inmunoestimuladoras, por Zhao y otros, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9:24:3453. Zhao y otros describen procedimientos para preparar modificaciones 2-0-Me en ácidos nucleicos, que se incorporan a esta memoria por referencia.

En otras realizaciones más, con el fin de intensificar la resistencia a exonucleasa de oligonucleótidos y polinucleótidos 2'-sustituidos, preferiblemente, los extremos 3' y/o 5' de la secuencia de oligorribonucelótidos se unen a grupos de bloqueo de exonucleasa.

Una lista parcial de grupos de bloqueo incluye bases invertidas, nucleótidos 2'- o 3'-O-arilo (pereferiblemente, el arilo es metilo, etilo o propilo), didesoxinucleótidos, metilfosfatos, grupos alquilo, grupos arilo, cordicepina, citosinaarabanósido, fosforamidatos, una unión pèptídica, grupo dinitrofenilo, fluoresceína, colesterol, biotina, análogos de biotina, avidina, análogos de avidina, estrepavidina, acridina, rodamina, psolareno, glicerilo, fosfonatos de metilo, butanol, butilo, hexanol y 3'-O-alquilos.

En una realización preferente, al menos un grupo de bloqueo es una biotina, un análogo de biotina o análogo de avidina. Estas moléculas tienen la capacidad de (1) bloquear la degradación del oligonucleótido o polinucleótido protegido y (2) proporcionar medios para la unión por alta afinidad de los ácidos nucleicos modificados al soporte sólido. Entre los derivados de avidina y biotina que se pueden usar para preparar los reactivos de esta invención están incluidos estreptavidina, avidina succinilada, avidina monómera, biocitina (bitin-, epsilon.-N-lisina), hidrazida de biocitina, derivados amina o sulfhidrílicos de 2-iminobiotina e hidrazide del ácido biotinil-epsilon.-aminocaproico. También se pueden usar como grupos terminales de bloqueo sobre los polinucleótidos de la presente invención otros derivados más de biotina, tales como éster de biotin-N-hidroxisuccinimida, éster de biotinil-, epsilon.-ácido aminocaproico-N-hidroxisuccinimida, 6-(biotinamido)hexanoato de sulfosuccinimidilo, N-hidroxisuccinimidaiminobiotina, biotinbromoacetilhidrazida, p-diazobenzoilbiocitina y 3-(N-maleidopropionil)-biocitina.

En una realización preferente, al menos un bloque terminal del oligonucleótido es una biotina, un análogo de biotina, avidina o análogo de avidina. Estas moléculas tienen la capacidad de (1) bloquear la degradación del oligonucleótido o polinucleótido protegido y (2) proporcionar medios para una unión por alta afinidad de los ácidos nucleicos modificados al soporte sólido. Entre los derivados de avidina y biotina que se pueden usar para preparar los reactivos de esta invención están incluidos estreptavidina, avidina succinilada, avidina monómera, biocitina (bitin-, epsilon..N-lisina), hidracida de biocitina, drivados amina o sulfhidrílcos de 2-iminobiotina e hidrazide del ácido biotinil-epsilon.-aminocaproico. También se pueden usar como grupos terminales de bloqueo sobre los polinucleótidos de la presente invención otros derivados más de biotina, tales como éster de biotin-N-hidroxisuccinimida, éster de biotinil-, epsilon.-ácido aminocaproico-N-hidroxisuccinimida, 6-(biotinamido)hexanoato de sulfosuccin-imidilo, N-hidroxisuccinimidaiminobiotina, biotinbromoacetilhidrazida, p-diazo-benzoilbiocitina y 3-(N-meleidopropionil)-biocitina.

En una realización preferente, los oligonucleótidos antisentido o una de sus modificaciones eficaces es un oligodesoxinucleótido fosforotioato.

Los expertos en la técnica conocen procedimientos para sintetizar oligonucleótidos antisentido de la invención. El principio de un posible procedimiento de síntesis emplea síntesis en fase sólida usando química de triéster fosfito haciendo crecer la cadena de nucleótido en la dirección 3' \rightarrow 5', y se describe seguidamente:

El nucleótido respectivo se acopla al primer nucleósido que se une por covalencia a la fase sólida comprendiendo las etapas siguientes:

(a): escisión del grupo protector 5'DMT del nucleótido previo,

(b): adición del nucleótido respectivo para propagación de la cadena,

(c): modificación del grupo fosfito y posterior remate de grupos 5'-hidroxilo que no han reaccionado,

(d): ciclos repetitivos de (a) a (c) para el oligonucleótido de cadena entera,

(e): escisión del oligonucleótido del soporte sólido,

(f): elaboración del producto de síntesis.

Los aril- y alquil-fosfonatos se pueden preparar, por ejemplo, como se describe en la patente U.S. nº. 4.469.863; y los alquilfosfotriésteres (en los que el resto cargado de oxígeno está alquilado como se describe en la patente U.S. nº. 5.023.243 y la patente europea nº. 092.574) se pueden preparar por síntesis automatizada en fase sólida usando reactivos disponibles comercialmente.

Se han descrito procedimientos para hacer otras modificaciones y sustituciones del esqueleto de DNA (Uhlmann, E. Y Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990).

Entre otros procedimientos adicionales para convertir en resistentes a la nucleasa oligonucleótidos o polinucleótidos están incluidos, aunque no únicamente, la modificación por covalencia de bases de purina o pirimidina. Por ejemplo, las bases se pueden metilar, hidroximetilar o sustituir de otra manera (por ejemplo, glicosilar) de manera que los oligonucleótidos o polinucleótidos se conviertan en sustancialmente resistentes a ácidos y nucleasa.

Otras bases heterocíclicas representativas se describen en la patente U.S. nº. 3.687.808, expedida a Merigan y otros. Los términos "purinas" o "pirimidinas" o "bases" se usan aquí para referirse a purinas, pirimidinas o bases naturales o sintéticas.

La estructura química de oligonucleótidos y sus modificaciones se indican en la Figura 2. La cadena del oligonucleótido ha de entenderse como un detalle fuera de una cadena de nucleótido más larga.

En la Figura 2a lit. B significa una base orgánica tal como adenina (A), guanina (G), citosina (C) o timina (T) (presentadas en la Fig 2b) en oligodesoxi-ribonucleótidos y las bases adenina (A), guanina (G), citosina (C), uracilo (U) (presentadas en la Figura 2C) en oligo-ribonucleótidos. Las bases se acoplan a través del nitrógeno N9 en el caso de las bases A y G o a través del nitrógeno N1 en el caso de las bases C, T y U a la desoxirribosa o ribosa, respectivamente. La secuencia de las bases es el complemento inverso de la secuencia genética diana de MIA.

Las modificaciones de los oligodesoxi-ribonucleótidos y oligo-ribo-nucleótidos de la Fig. 2a son las siguientes, designándose en ellas oligonucleótidos tanto los oligodesoxi-ribonucleótidos como los oligo-ribonucleótidos:

1. Oligonucleótidos en los que todos los R^{1} son

1.1: R^{1} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

1.2: R^{1} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

1.3: R^{1} = CH_{3},

1.4: R^{1} = C_{2}H_{5},

1.5: R^{1} = OCH_{3} o

1.6: R^{1} = OC_{2}H_{5}.

2. Oligonucleótidos en los que R^{1} varía en los fosfatos internucleótidos dentro del oligonucleótido. En la fórmula siguiente, R^{1} de la Figura 2a se designa R^{1a} o R^{1b},

1

en la que

B= una de las bases A, C, G o T en oligodesoxi-ribonucleótidos o, consecuentemente, las bases A, C, G o U en oligo-ribonucleótidos,

p= fosfato internucleótido,

(B-p)_{n} = un tramo de oligodesoxi-ribonucleótido u oligo-ribonucleótido en el que

n= 1-12, preferiblemente 2-11,

R^{1a}, R^{1b} se seleccionan entre el grupo de

2.1: R^{1a} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

\quad: R^{1b} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

2.2: R^{1a} = CH_{3},

\quad: R^{1b} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

2.3: R^{1a} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

\quad: R^{1b} = CH_{3},

2.4: R^{1a} = CH_{3},

\quad: R^{1b} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+}.

3. Oligodesoxi-ribonucleótidos en los que R^{1} es alternativo en los fosfatos internucleótidos dentro de un oligonucleótido. En la fórmula siguiente, R^{1} de la figura 2a se designa R^{1a} o R^{1b}.

2

en la que

B= una de las bases A, C, G o T comprendidas en oligodesoxi-ribonucleótidos o, consecuentemente, las bases A, C, G o U comprendidas en oligo-ribonucleótidos dependiendo de la secuencia de genes ,

p= fosfato internucleótido,

(B-p-B-p)_{n} = un tramo de oligodesoxi-ribonucleótido u oligo-ribonucleótido en el que n = 2-8, preferiblemente 3-7,

R^{1a}, R^{1b} se seleccionan entre el grupo de

3.1: R^{1a} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

\quad: R^{1b} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

3.2: R^{1a} = CH_{3},

\quad: R^{1b} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

3.3: R^{1a} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

\quad: R^{1b} = CH_{3}.

4. Oligonucleótidos o modificaciones de ellos, en los que R^{2} es H o colesterol acoplado covalentemente, poli-(L)lisina o transferrina.

5. Oligonucleótidos o modificaciones de ellos, en los que R^{3} es H o colesterol acoplado covalentemente, poli-(L)lisina o transferrina.

6. Cualquiera de las modificaciones descritas en 1.1-1,6; 2.1-2,4; 3,1-3,3; 4,5 en las que todos los R^{4} se seleccionan entre el grupo constituido por:

6.1: R^{4} = H,

6.2: R^{4} = F,

6.3: R^{4} = CH_{3},

6.4: R^{4} = C_{2}H_{5},

6.5: R^{4} = OH,

6.6: R^{4} = OCH_{3},

6.7: R^{4} = OC_{2}H_{5}.

Las modificaciones de oligonucleótidos antisentido son ventajosas puesto que no son destruidas tan fácilmente por factores endógenos cuando se aplican, como es válido para secuencias de nucleótidos naturales. Sin embargo, una persona experta entiende que también se pueden usar de acuerdo con la invención los oligonucleótidos naturales que tienen una de las secuencias descritas. En una realización muy preferente, la modificación es una modificación de fosforotioato.

Entre varios procedimientos de síntesis de oligodesoxi-nucleótidos conocidos por los expertos en la técnica, seguidamente se describe más detalladamente un ejemplo de posible procedimiento.

Se sintetizan oligodesoxi-nucleótidos en etapas mediante adición 5' de nucleótidos protegidos usando química de triester fosfito. El nucleótido A se introduce como 5'-dimetoxitritil-desoxiadenosina (N^{4}-benzoil)-N,N'-diisopropil-2-cianoetil fosforoamidita); se introduce el nucleótido C por una 5'-dimetoxi-tritildesoxicitidina(N^{4}-benzoil)-N,N'-diisopropil-2-cianoetil fosforoamidita; el nucleótido G se introduce como 5'-dimetoxitritil-desoxiguanosina(N^{8}-isobutiril)-N,N'-diisopropil-2-cianoetil fosforoamidita y el nucleótido T se introduce como 5'-dimetoxitritil-desoxitimidina-N,N'-diisoproil-2-cianoetil fosforoamidita. Los nucleótidos se aplican preferiblemente en una concentración 0,1 M disueltos en acetonitrilo.

La síntesis se puede realizar, por ejemplo, sobre partículas de vidrio de poro controlado, de aproximadamente 150 mm de diámetro (diámetro de poro 500 \ring{A}) a los que se une covalentemente el 3'-nucleósido mediante un conector de alquilamina de cadena lineal (carga media, 30 \mumol/g de soporte sólido de síntesis).

El soporte sólido de síntesis se carga en una columna cilíndrica de síntesis rematada en ambos extremos con filtros que permiten una corriente adecuada de reactivos pero que retienen el soporte sólido de síntesis. Los reactivos se suministran y eliminan desde la columna de síntesis usando una presión positiva de gas inerte. Los nucleótidos se añaden a la cadena de oligonucleótido en crecimiento en la dirección 3' \rightarrow 5'. Cada nucleótido se acopla usando una vuelta del siguiente ciclo de síntesis:

Se realiza con ácido 3-cloroacético en diclorometano la escisión del grupo protector 5'DMT (dimetoxitritilo) del nucleótido previo y seguidamente se lava la columna con acetonitrilo anhidro. Luego se añade una de las bases en forma de su derivado protegido dependiendo de la secuencia más tetrazol en acetonitrilo. Después de la reacción, se separa la mezcla de reacción y el fosfito se oxida con una mezcla de azufre (S_{8}) en disulfuro de carbono/piridina/trietilamina. Después de la reacción de oxidación, se retira la mezcla y se lava la columna con acetonitrilo. Los grupos 5'-hidroxilo que no han reaccionado se rematan añadiendo simultáneamente 1-metilimidazol y anhídrido acético/lutidina/ tetrahidrofurano. Luego se lava la columna con acetonitrilo y se inicia el ciclo siguiente.

El proceso de elaboración y purificación de los productos de síntesis se puede realizar como sigue:

Después de añadir el último nucleótido, se escinden los desoxinucleótidos del soporte sólido por incubación en solución de amoniaco. Se eliminan los grupos protectores de bases exocíclicas por más incubación en amoniaco. Luego se evapora el amoniaco en vacío. Los productos de síntesis de longitud entera que todavía tienen el grupo protector 5'DMT se separan de los contaminantes de fallo más corto usando cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (HPLC) en fase estacionaria C_{18}. Se recogen los eluyentes del pico de producto, se secan en vacío y el grupo protector 5'-DMT se escinde por incubación en ácido acético, que luego se evapora en vacío. Los productos de síntesis se disuelven en agua desionizada y se someten tres veces a extracción con dietil éter. Luego se secan los productos en vacío. Se realiza otra cromatografía HPLC-AX (HPLC-intercambio aniónico) y los eluyentes del pico de producto se dializan frente a un exceso de tampón Tris y se dializan una segunda vez frente a agua desionizada. Los productos finales se liofilizan y almacenan en seco.

Ha de entenderse que éste es un posible procedimiento para la síntesis de fosforotioato-oligodesoxinucleótidos. Es evidente que los expertos en la técnica idearán mejoras y modificaciones de la descripción dada y que seguirán incluidas en el ámbito de la invención.

Los procedimientos para la síntesis de oligo-ribonucleótidos son conocidos por los expertos en la técnica. Un posible procedimiento utilizando química de 2'-ACE RNA es descrito por Scaringe, S.A., RNA Oligonucleotide Síntesis via 5'-Silyl-2'-Orthoester Chemistry, Methods 23, 206-217, 2001).

Se entiende que éste es un posible procedimiento para la síntesis de oligo-ribonucleótidos. Es evidente que los expertos en la técnica idearán mejoras y modificaciones de la descripción dada.

En una realización, los oligonucleótidos antisentido o sus modificaciones se pueden usar para la estimulación del sistema inmune por inhibir la expresión y/o la actividad funcional de "Actividad Inhibidora de Melanoma" MIA.

En otra realización, los oligonucleótidos antisentido o sus modificaciones se usan en una combinación con al menos una de las moléculas, virus, péptidos y/o extractos de células indicadas en la siguiente lista de (a) a (m):

(a): moléculas seleccionadas entre el grupo constituido por qumioquinas, incluidas linfotactina y/o factores de atracción de células inmunes;

(b): virus y/o partes de virus, incluidos adenovirus, papiloma virus, virus de Epstein-Barr, virus que no son patógenos, incluidos virus de la enfermedad de Newcastle, virus de vacuna de viruela;

(c): moléculas de MCH-autólogas y/o heterólogas;

(d): moléculas implicadas en el procesamiento de antígenos;

(e): moléculas implicadas en la presentación de antígenos;

(f): moléculas implicadas en la mediación de efectos de células inmunes;

(g): moléculas implicadas en la mediación de efectos citotóxicos de células inmunes;

(h): moléculas implicadas en el transporte de antígenos;

(i): moléculas coestimulantes:

(j): péptidos que intensifican el reconocimiento por efectos de células inmunes y/o citotóxicos de células inmunes;

(k): péptidos que contienen uno o más aminoácidos que difieren entre una proteína de la célula diana y otras células dentro de un organismo, incluidos, no limitativamente, antígenos, específicos para células de melanoma y/o melanocitos y/o células de mama y/o células de cáncer de mama; de acuerdo con la invención, la inhibición de las síntesis y/o la función de MIA se logra usando una molécula del grupo I), en la que

(l): moléculas seleccionadas entre el grupo constituido por

-: péptidos que contienen una o más mutaciones y/o sustituciones de aminoácidos de la aminoproteína Ras, la proteína p53, la proteína receptora de EGF, péptidos de fusión y/o proteínas de fusión, la proteína de riboblastoma, péptidos que contienen una o más mutaciones y/o sustituciones de aminoácidos causadas por reordenación de genes y/o translocaciones de genes, péptidos que contienen una o más mutaciones y/o sustituciones de aminoácidos de proteínas codificadas por oncogenes y/o protooncogenes, proteínas codificadas por antioncogenes y/o genes supresores de tumores;,

-: péptidos derivados de proteínas que difieren en la célula diana en un aminoácido o en aminoácidos de las proteínas expresadas por otras células en el mismo organismo;

-: péptidos derivados de antígenos virales y/o codificados por ácidos nucleicos virales;

-: péptidos derivados de proteínas superexpresadas en la célula diana en comparación con una célula normal,

-: y combinaciones de ellos.

(m): extractos de células tumorales y/o lisados de células tumorales y/o coadyuvantes.

Las moléculas, incluido al menos un oligonucleótido antisentido, virus, péptidos y/o extractos de células mencionados en (a) a (m) se pueden aplicar por los siguientes procedimientos, no estando limitada la aplicación a estos procedimientos:

-: por vacunación a un organismo humano con codificación de DNA y/o RNA para la totalidad o parte de las moléculas indicadas de (a) a (m) y/o polipéptidos contenidos en las moléculas indicadas de (a) a (m);

-: por transfección de un organismo humano y/o transfectando las células diana y/o patógenos diana con genes que codifican las moléculas indicadas de (a) a (m);

-: parenteralmente por inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, subcutánea, intraperitoneal o intramuscuñlar y/o localmente por administración oral, epidérmica o transdérmica.

En otra realización, los oligonucleótidos o sus modificaciones se pueden combinar con un agente inmunoestimulante seleccionadom entre el grupo de citoquinas, y/o inhibidores de la expresión y/o función de interleuquina-10 y/o el factor beta transformante del crecimiento (TGF-\beta) y/o prostaglandina B2 y/o receptores de prostaglandina E2 y/o inhibidores de VEGF.

En otra realización, los oligonucleótidos antisentido o sus modificaciones se pueden combinar con al menos una de las siguientes moléculas, procedimientos, péptidos y/o extractos de células:

-: moléculas que intensifican la respuesta inmune frente a células enfermas o patógenos;

-: procedimientos y/o moléculas que intensifican la inmunogenia de células diana y/o patógenos diana;

-: moléculas inmunoestimulantes, comprendidas citoquinas que incluyen interleuquinas, tales como IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18;

-: procedimientos para intensificar la expresión de citoquinas en células diana o patógenos por estimular su expresión y/o por transfectar sistemas de expresión en la célula diana o el patógeno diana, capaces de expresar estas citoquinas y/o

-: quimioquinas que atraen células inmunes, incluida linfotactina;

-: procedimientos para intensificar la expresión de quimioquinas en células diana o patógenos por estimular su expresión y/o por transfectar sistemas de expresión en la célula diana y/o el patógeno diana, capaces de expresar estas quimioquinas;

-: péptidos y/o moléculas de DNA y/o RNA y/u otros antígenos que se encuentran en células de tumores y/o patógenos, pero no en células normales;

-: procedimientos para intensificar la expresión de péptidos y/o antígenos que se encuentran en células de tumores y/o patógenos, pero no en células normales;

-: extractos de células de tumores y/o lisados de células de tumores y/o coadyuvantes.

Estas moléculas, en las que está incluidos al menos un oligonucleótido antisentido, péptidos y/o extractos de células se pueden aplicar parenteralmente por inyección o infusión intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, y/o localmente, por administración oral, epidérmica, intradérmica y transdérmica. Los sujetos preferidos para administración son mamíferos, muy preferentemente los sujetos son seres humanos.

En otra realización, las secuencias de codificación de los oligonucleótidos se integran en un sistema de suministro de DNA que comprende vectores virales y/o no virales junto con lípidos seleccionados entre el grupo de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y mezclas de ellos.

Los oligonucleótidos antisentido pueden contener así secuencias flanqueantes y/o secuencias de vectores y/o secuencias que intensifican la expresión y/o transfección de las moléculas de ácido nucleico.

En una realización preferente de la invención, las secuencias de codificación de los oligonucleótidos antisentido son parte de uno o más vectores y/o secuencias virales y/o vectores virales.

En otra realización de la invención, los oligonucleótidos antisentido o sus modificaciones están acoplados o mezclados con ácido fólico, hormonas, hormonas esteroides tales como estrógeno, progesterona, corticoesteroides, corticoides minerales, péptidos, proteoglicanos, glicolípidos, fosfolípidos y derivados de ellos.

En otra realización más, los oligonucleótidos o sus modificaciones se pueden usar para la preparación de un medicamento.

En una realización más preferida, los oligonucleótidos antisentido se combinan con uno o más de los agentes inmunoestimulantes antes mencionados para la preparación de un medicamento, medicamento que se puede aplicar local o sistémicamente a un tumor u otro sitio u órgano afectado patológicamente.

En otra realización, el medicamento se usa para la prevención o el tratamiento de neoplasmas o trastornos seleccionados entre el grupo de melanomas, carcinoma gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma de ovario, condrosarcoma, enfermedades espinales, mielopatía cervical, estenosis de canal lumbar, hernia de disco lumbar, artritis reumatoide, osteoartritis, oligoartritis asociada a HLA-27, artritis psoriática y artritis reumatoide, lesión de cartílago y/o destrucción de articulación.

La cantidad eficaz del oligonucleótido aplicado varía dependiendo de si la composición farmacéutica se usa en unidosis o en dosis múltiples y de si en la composición farmacéutica hay sólo un oligonucleótido antisentido o varios.

Las dosis dadas en esta memoria son para adultos. Un experto sabe que estas dosificaciones se han de adaptar si el ser humano es un niño, una persona afectada por otra enfermedad o por otras circunstancias.

La dosis eficaz depende también del procedimiento y el medio de administración.

Entre las vías de administración están incluidas, no limitativamente, la electrocorporación, la epidérmica, impresión en la piel, intraarterial, intrabucal, intracraneal, intradérmica, intralesiva, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraprostática, intrapulmonar, intraespinal, intratecal, intratraqueal, intratumoral, intravenosa, intravesical, colocación en cavidades del cuerpo, inhalación nasal, oral, inhalación pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluida mediante nebulizador), subcutánea, subdérmica, tópica (incluido el suministro oftálmico y a membranas de mucosas, incluido el suministro vaginal y el rectal) y transdérmica.

En una realización, las dosis para personas de los oligonucleótidos descritos típicamente varían de aproximadamente 0,05 \mug/kg a aproximadamente 500 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg y, más preferiblemente, de aproximadamente 100 \mug/kg a aproximadamente 50 mg/kg por administración, que se puede realizar cada hora, diariamente, semanalmente o mensualmente y en cualquier otra cuantía de tiempo intermedia dependiendo del modo de aplicación.

En algunas realizaciones, sin embargo, se pueden usar dosis en un intervalo incluso de 2 a 100 veces más alto o más bajo que las dosis típicas antes descritas. Por ejemplo, para administración oral, el límite superior de las dosis dadas antes puede ser de hasta 1 mg/kg o incluso de hasta 5 mg/kg.

En unas realización, la aplicación de la solución del oligonucleótido se realiza en infusión continua; en otra realización, se aplican varias soluciones como bolus o infusiones de la solución a corto plazo. Las dosis de los oligonucleótidos administrados por infusión típicamente están en el intervalo de aproximadamente 0,05 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg, más preferiblemene de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 50 mg/kg y, muy preferiblemente, de aproximadamente 100 \mug/kg a aproximadamente 30 mg/kg/ al día. En algunas realizaciones, la infusión o la inyección de bolus se repite aproximadamente de 1 a 100 veces o incluso más, preferiblemente de aproximadamente 3 a 30 veces y, más preferiblemente, de 5 a aproximadamente 10 veces.

Infusión a corto plazo significa, en el contexto de esta solicitud, infusiones de aproximadamente 0,1 h a aproximadamente 4 h, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 h a aproximadamente 3 h y, muy preferiblemente, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 2 h.

Infusión continua significa, en el contexto de esta solicitud, infusiones de aproximadamente 5 h hasta aproximadamente 24 h, varios días, semanas o incluso meses.

Las infusiones continuas en realizaciones especiales se repiten aproximadamente 1 a 100 veces o incluso más; en otras realizaciones se repiten aproximadamente de 3 a 30 veces y, en otras realizaciones más, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 veces.

En algunas realizaciones, durante el tiempo en que no se aplica solución de oligonucleótido, se aplican soluciones isotónicas tales como solución estándar de infusión, por ejemplo, solución de cloruro sódico al 0,9%, solución Ringer-lactato, dextranos, etc.

Hay revisiones detalladas de dosis en terapia antisentido, por ejemplo, en Flaherty Current Opinión in Oncology 2001, 13:499-505, que se incorpora a esta memoria por referencia.

Los oligonucleótidos de esta invención se aplican en forma pura o en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el contexto de esta invención, vehículo farmacéuticamente aceptable significa cualquier composición o formulación farmacéutica adecuada para la administración de oligonucleótidos.

En algunas realizaciones, las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o en medio no acuoso, cápsulas, saquitos o comprimidos.

En otras realizaciones, en las composiciones y formulaciones para aplicación parenteral, los oligonucleótidos están disueltos en soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes u otros aditivos adecuados, por ejemplo, compuestos vehículo, otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otras realizaciones más, las composiciones y formulaciones para administración tópica incluyen parches transdérmicos, ungüentos, lociones, gotas, cremas, geles, esprays, líquidos y polvos.

En otras realizaciones, las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración rectal incluyen ungüentos, cremas, geles, supositorios y líquidos.

En otras realizaciones, las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración nasal incluyen ungüentos, cremas, geles, gotas, líquidos para esprays y polvos.

En realizaciones para administración pulmonar, las composiciones y formulaciones farmacéutica comprenden esprays y polvos.

Para las composiciones y formulaciones farmacéuticas mencionadas, se pueden añadir vehículos, intensificadores de la penetración, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesativos, agentes saboreadores, emulsivos, coadyuvantes dispersivos, aglutinantes y otros excipientes. Las composiciones y formulaciones para administración oral están revestidas entéricamente en una realización.

Además del uso terapéutico de los compuestos antisentido, los compuestos de la invención son también útiles para investigación y diagnosis porque estos compuestos hibridrizan con el ácido nucleico que codifica MIA, permitiendo construir así ensayos sándwich y otros para explotar este hecho. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido de la invención con un ácido nucleico que codifica MIA se puede detectar por medios conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir conjugación de una enzima al oligonucleótido, radiomarcación del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También se pueden preparar kits usando tales medios de detección para detectar el nivel de MIA en una muestra.

La Figura 1 describe la inhibición de la expresión de MIA por diferentes oligonucleótidos en células de melanoma HTZ-19. Las barras indican expresión de MIA residual de un oligonucleótido tratado en comparación con un medio de control no tratado (Medium) o células tratadas con Lipofectina (Lipofectin). Los números 1-8 corresponden a oligonucleótidos antisentido del estado de la técnica de la solicitud de patente WO 01/68122 que tienen las secuencias ID n^{os}. 1-8 o al oligonucleótido antisentido de la presente invención con la secuencia 5' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG - 3', denominado "nuevo", La inhibición más fuerte se alcanzó con el oligonucleótido "nuevo" que era capaz de inhibir en 84% la expresión de MIA en comparación con los oligonucleótidos antisentido del estado de la técnica
1 - 8 (que corresponden a las secuencias ID n^{os}. 1-8 de la solicitud de patente WO 01/68122), para los que la inhibición de la expresión de MIA variaba entre 48% y 65%.

La Figura 2a-c describe la estructura de oligonucleótidos.

Ejemplo Ejemplo 1 Inhibición de la secreción de MIA por oligonucleótidos antisentido

Se comparó la eficacia de la inhibición de MIA por los oligonucleótidos de esta invención con la de los oligonucleótidos del estado de la técnica que se describen en el documento WO 01/68122 con las secuencias ID n^{os}. 1-8. Por tanto, las células de melanoma se transfectaron con oligonucleótidos y la expresión de MIA en el material sobrenadante del cultivo de células de las células se midió por el ensayo inmunosorbente asociado a una enzima.

El día 0 se sembraron 75.000 células en 1 ml de medio (DMEM/10% de FCS) en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Los días 1 y 2 las células se transfectaron con 200 nM de oligonucleótido antisentido usando Lipoofectin (Gibco BRL, Eggenstein, Alemania) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Cada oligonucleótido antisentido se transfectó por triplicado. Al final de la segunda transfección el día 2, las células se cultivaron durante otros tres días en DMEM/10% de FCS que contenía 5 \muM del correspondiente oligonucleótido antisentido. Se recogieron los materiales sobrenadantes y se almacenaron a -20ºC hasta la cuantificación de la proteína de MIA.

Las concentraciones de MIA en el material sobrenadante se midieron empleando ELISA de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Roche, Boehringer Mannheim, Alemania).

Resultados

La inhibición más fuerte de la expresión de MIA en el material sobrenadante en comparación con células de control no tratadas se consiguió con el oligonucleótido antisentido "nuevo" de la presente invención, que era capaz de inhibir en 84% la expresión de MISA en comparación con el oligonucleótido antisentido del estado de la técnica descrito en la solicitud de patente WO 01/68122 que tiene las secuencias ID n^{os}. 1-8, para el que la expresión de MIA variaba entre 48% y 66%.

<110> ANTISENTIDO PHARMA GMBH

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<120> un oligonucleótido antisentido para inhibir "Actividad Inhibidora de Melanoma" MIA

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<130> 041933wo CS/FM

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<140> PCT/EP/2004/008986

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<141> 2004-08-11

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido de polipéptido de la Actividad Inhibidora de Melanoma humano

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttgcataaac ccaaggag

\hfill

Claims

1. Un oligonucleótido antisentido seleccionado entre el grupo de

-: la secuencia 5' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG- 3' y modificaciones de ella,

-: un fragmento que tiene al menos 8 nucleótidos de la secuencia 5' - TTG CAT AAA CCC AAG GAG- 3' y modificaciones de ella.

2. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la modificación concierne a uno o más restos de azúcar, las bases y/o las uniones internucleótido y/o el acoplamiento del oligonucleótido a un intensificador de captación y/o actividad inhibidora.

3. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el oligonucleótido antisentido es un oligodesoxinucleótido fosforotioato.

4. Los oligonucleótidos de acuerdo con las reividicaciones 1 -3 con la respectiva estructura

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3

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en la que

-: B = las bases A, C, G o T en oligonucleótidos o consecuentemente las bases A, C, G o U en oligo-ribonucleótidos,

-: R^{1} = O^{-}M^{+} (M^{+} = Na^{+} o H^{+}), S^{-}M^{+} (M^{+} = Na^{+} o H^{+}), CH_{3}, C_{2}H_{5}, OCH_{3}, OC_{2}H_{5},

-: R^{2} y/o R^{3} son colesterol covalentemente acoplado, poli(L)lisina, transferrina o H,

-: R^{4} = H, F, CH_{3}, C_{2}H_{5}, OH, OCH_{3}, OC_{2}H_{5}

y la estructura ha de entenderse como detalle fuera de una cadena de nucleótido más larga.

5. Oligonucleótidos antisentido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 con la fórmula

4

en la que

B= las bases A, C, G o T en oligodesoxi-ribonucleótidos o, consecuentemente, las bases A, C, G o U en oligo-ribonucleótidos,

p= fosfato de internucleótido,

(B-p)_{n} = un tramo de oligodesoxi-tibonucleótido u oligo-ribonucleótido en el que

n= 1-12, preferiblemente 1-11, y

en el que R^{1}, designado R^{1a} o R^{1b}, varía en los fosfatos de internucleótido dentro de un oligonucleótido:

R^{1a} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+}, y R^{1b} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

o

R^{1a} = CH_{3} y R^{1b} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

o

R^{1a} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+} y R^{1b} = CH_{3},

o

R^{1a} = CH_{3} y R^{1b} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+}.

6. Oligonucleótidos antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con la fórmula

5

en la que

B= una de las bases A, C, G o T comprendidas en oligodesoxi-ribonucleótidos o, consecuentemente, las bases A, C, G o U comprendidas en oligo-ribonucleótidos dependiendo de la secuencia de genes,

p= fosfato de internucleótido,

(B-p-B-p)_{n} = un tramo de oligodesoxi-ribonucleótido u oligo-ribonucleótido en el que B = 2-8, preferiblemente 3-7,

y en el que R^{1} es alternativo en los fosfatos de internucleótido dentro de un oligonucleótido:

o

R^{1a} = CH_{3} y R^{1b} = O^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+},

o

R^{1a} = S^{-}M^{+}, siendo M^{+} en todos Na^{+} o H^{+}, y R^{1b} = CH_{3}.

7. Uso de los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para la inhibición in vitro de la expresión y/o actividad funcional de MIA y/o la reducción de la invasión y/o la metástasis y/o la estimulación de células inmunes y/o el sistema inmune.

8. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el oligonucleótido antisentido está integrado en un sistema de suministro de DNA que comprende vectores virales y/o no virales junto con ácidos lipídicos o derivados de ellos seleccionados entre el grupo de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y mezclas de ellos.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 o 9, que adicionalmente comprende un agente inmunoestimulante.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el agente inmunoestimulante adicional se selecciona entre el grupo de citoquinas, inhibidores de la expresión y/o la función de interleuquina-10 y/o el factor beta transformante del crecimiento (TGF-8) y/o prostaglandina B2 y/o receptores de prostaglandina E2 y/o inhibidores de VEGF.

12. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 8-11 para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de neoplasmas, infecciones y/o trastornos inmunosupresores.

13. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 8-11 para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de trastornos, neoplasmas, infecciones y/o trastornos inmunosupresores en los que la expresión anormal de MIA juega un papel.

14. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 8-11 para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de neoplasmas y/o trastornos seleccionados entre el grupo de melanomas, carcinoma gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma de ovario, condrosarcoma, enfermedades espinales, mielopatía cervical, estenosis de canal lumbar, hernia de disco lumbar, artritis reumatoide, osteoartritis, oligoartritis asociada a HLA-27, artritis psoriática y artritis reumatoide, lesión de cartílago y/o destrucción de articulación.

15. Una composición de diagnóstico que comprende un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6.