ES2290134T3 - Entidades apoptoticas que se utilizan en el tratamiento de trastornos neuro-degenerativos y otros trastornos neurologicos. - Google Patents

Abstract

La utilización de cuerpos y/o células apoptóticas en la preparación de un medicamento para el tratamiento y la profilaxis de un trastorno neuro-degenerativo o neurológico en un paciente mamífero, siendo los cuerpos y/o células apoptóticas compatibles con las células de la sangre del paciente.

Description

Entidades apoptóticas que se utilizan en el tratamiento de trastornos neuro-degenerativos y otros trastornos neurológicos.

La presente invención se refiere a composiciones biológicas y bioquímicas y a las utilizaciones de las mismas en el tratamiento y/o la profilaxis de diversos trastornos neuro-degenerativos y otros trastornos neurológicos en pacientes mamíferos. Más particularmente, se refiere al tratamiento y a la profilaxis de trastornos neuro-degenerativos y otros trastornos neurológicos mediante la administración de composiciones que contienen los materiales celulares de un mamífero y fragmentos de los mismos, así como a las composiciones que contienen los materiales celulares de un mamífero y fragmentos de los mismos, así como a procesos para la preparación de dichas composiciones.

Se reconocen dos mecanismos de muerte celular en el cuerpo: la necrosis y la apoptosis. La apoptosis es el proceso de muerte celular programada, descrito por Kerr et al en 1992 [Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR (1992). "Apoptosis; a Basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics". "British Journal of Cancer 26: 239-257"] (Apoptosis un fenómeno biológico básico con implicaciones de gran alcance en la cinética de los tejidos), mediante el cual se mantienen niveles constantes de los diversos sistemas y tejidos orgánicos en el cuerpo, mientras se produce una diferenciación y división celular continua. Las células sometidas a apoptosis suelen presentar cambios morfológicos distintivos, como una reducción pronunciada del volumen celular, modificación de los cito-esqueletos con el resultado de formación pronunciada de exudados en la membrana, condensación de la cromatina y degradación del ADN en fragmentos oligo nucleosomales. Tras estos cambios morfológicos, una célula apoptótica puede romperse en cierto número de pequeños fragmentos, conocidos como cuerpos apoptóticos, que consisten esencialmente en cuerpos unidos por la membrana, que contienen organelas intactas, cromatina, etc. Los cuerpos apoptóticos suelen ser eliminados rápidamente del cuerpo por fagocitosis a cargo de macrófagos, células dendríticas y otras células que presentan antígeno antes de que puedan ser lisados y liberen su contenido intracelular potencialmente pro-inflamatorio.

Esquemáticamente, se piensa que la apoptosis procede del siguiente modo. Se pueden identificar tres fases en el mecanismo apoptótico de la muerte celular programada.

Fase de inducción;

Fase efectora; y

Fase de degradación.

La fase de inducción depende, en parte, de interacciones específicas de señales que inducen la muerte en la membrana de la superficie celular. Se inicia una señal común mediante la fijación de ligandos específicos a receptores de la familia de los receptores TNF presentes sobre la membrana celular. Uno de estos receptores importantes es Fas (APO-1, CD95) que interactúa con el ligando Fas para iniciar la apoptosis.

La fase efectora, activada por la fijación de receptores y ligandos de la fase de inducción, conduce a la activación de caspasas, proteinasas que requieren cistinil-aspartato (enzimas proteolíticas), inclusive caspasas 1 y 8. Esta activación puede ir asociada con un cambio en la permeabilidad de las mitocondrias, que permite la liberación de citocromo-c que interviene en la activación de la caspasa. Las caspasas activadas inician una cadena de eventos proteolíticos letales que culminan en los cambios en cromatina y componentes citoesqueletales que se ven en la apontosis.

Muchas células sometidas a apoptosis pueden ser identificadas por un laddering característico del ADN que se ve en la electrofóresis de gel agarosa, que resulta de la división del ADN en una serie de fragmentos. Estos cambios ocurren unas pocas horas antes de la muerte de la célular definida por la aptitud en una célula para excluir tinciones vitales. La aparición del laddering del ADN en la electrofóresis de gel agarosa tras la extracción de ADN de las células constituye un método reconocido de identificación de apoptosis en células [Loo, D.T. and Rillema, J.R. (1998) "Measurement of Cell Death" (Medida de la muerte celular) Methods in Cell Biology 57: 251-265], aunque no resulta siempre suficientemente sensible para detectar la apoptosis. El rotulado in situ de fragmentación de ADN nuclear, p. ej. usando ensayos de marcado del extremo libre de dUTP terminal que se puedan encontrar en el comercio (TUNEL), constituyen una medida alternativa y más reproducible para la determinación de ADN fragmentado en células apoptóticas y células sometidas a apoptosis [Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA (1992), "Identification of programmed cell death in situ vía specific labelling of nuclear ADN fragmentation" Journal of Cell Biology 119:493-501] (Identificación de muerte celular programada in situ mediante marcado específico de fragmentación de ADN nuclear).

Durante la apoptosis, queda expuesta exteriormente sobre la membrana celular fosfatidil serina [Fadok VA, Voelker Dr. Campbell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM (1992), "Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers especific recognition and removal by macrophages" (Exposición de fosfatidil serina sobre la superficie de activadores linfocitos apoptóticos reconocimiento y eliminación específica por macrófagos) Journal of Immunology 148:2207-2216] y esta fosfatidil serina expuesta interactúa con receptores específicos para mediar la absorción y depuración de células apoptóticas en mamíferos [Fadok Va, Bratton DL, Rose DM, Pearson A, Ezekewitz RAB, Henson PM (2000), "A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells" (Un receptor para la depuración específica de la fosfatidil serina de células apoptóticas) (Nature 405:85-90]. La expresión superficial de fosfatidil serina sobre células es otro método reconocido de identificación de células apoptóticas.

Los cambios en la integridad mitocondrial están íntimamente asociados con la apoptosis, con el resultado de alteraciones en la permeabilidad de la membrana mitocontrial y la liberación de citocromo-c de los mitocondrios en el citoplasma celular [Susin, S.A. Lorenzo, H.K., Zamzami, N., Marzo, I, Brenner, C., Larochetre, N., Prevost, M.C. Alzari, P.M. and Kroemer, G. (1999) "Mitochondrial Release of Caspase-2-and -9 during the Apoptotic Process" (Liberación mitocondrial de caspasa -2 y -9 durante el proceso apoptótico), Journal of Experimental Medicine, 189:381-394]. La medida de los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial, que reflejan cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial es otro método reconocido de identificación de células apoptóticas.

En la literatura científica, se han descrito también otros muchos métodos de identificación de células sometidas a apoptosis y de células apoptóticas, muchos de los cuales utilizan anticuerpos monoclonales contra marcadores específicos para células apoptóticas.

En un primer aspecto de la presente invención, se ofrece la utilización de cuerpos apoptóticos y/o células apoptóticas en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de un trastorno neuro-degenerativo o neurológico en un paciente mamífero, siendo compatibles los cuerpos apoptóticos y/o las células apoptóticas con las células de la sangre del paciente.

En un segundo aspecto de la presente invención, se presenta una composición farmacéutica que comprende una suspensión líquida de material celular, donde del 10% al 90% de dicho material celular está constituido por cuerpos apoptóticos y/o células apoptóticas.

La presente invención se centra, en parte, en el nuevo descubrimiento, inesperado, de que la administración a un mamífero de células apoptóticas y/o cuerpos apoptóticos previamente preparados ex vivo se puede usar en la profilaxis y/o en el tratamiento de trastornos neuro-degenerativos y/o otros trastornos neurológicos en el mamífero tratado.

Por consiguiente, en uno de los aspectos de su composición, la presente invención se centra en una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de células apoptóticas y/o anticuerpos apoptóticos.

Las composiciones farmacéuticas utilizan de preferencia un excipiente de base acuosa, farmacéuticamente aceptable, aunque también se pueden utilizar otros excipientes.

Según lo indicado más arriba, estas composiciones resultan útiles en la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos neuro-degenerativos y/o otros trastornos neurológicos en mamíferos. Por consiguiente, en uno de los aspectos de su método, la presente invención se centra en un método para el tratamiento de una profilaxis contra trastornos médicos neuro-degenerativos y otros trastornos neurológicos en un paciente mamífero, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de cuerpos apoptóticos y/o células apoptóticas.

Estos métodos se realizan de preferencia mediante la administración al paciente de las composiciones farmacéuticas aquí descritas.

La figura es un gráfico que muestra una comparación de la hinchazón neta en el oído de ratones tratados con las composiciones de la invención y un grupo de control.

La presente invención se centra en el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos neuro-degenerativos y/o otros trastornos neurológicos, mediante la administración de células y/o cuerpos apoptóticos.

Los trastornos neuro-degenerativos, que incluyen el síndrome de Down, la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, están asociados con un aumento en los niveles de especies reactivas de oxígeno (ERO), ciertas citoquinas inflamatorias, inclusive interleucina-1\beta (IL-1\beta) [véase Griffin WST, Stanley LC, Ling C, White L. Macleod V. Perrot LJ, White CL, Araoz C (1989). La inmuno-actividad de la interleucina 1 y S-100 del cerebro es elevada en el síndrome de Down y en la enfermedad de Alzheimer. Proceedings of the Nacional Academy of Sciences USA 867611-76; Mogi M, Harada M, Narabayashi H, Inagaki H, Minami M, Nagatsu T (1996). Los niveles alfa del nivel de crecimiento de transformación e interleucina (IL)-1 beta, IL-1, IL-4, IL-6 son elevados en el fluido cerebro-espinal ventricular en el parkinsonismo juvenil y en la enfermedad de Parkinson. Neuroscience Letters 211:13-16]. También se ha mostrado que IL-1\beta inhibe la potenciación a largo plazo en el hipocampo [Murray CA, Lynch MA (1998). Prueba de que el aumento de la expresión hipocampal de la citoquina-interleucina-1\beta es un activador común de los deterioros por la edad y los inducidos por el estrés en potenciación a largo plazo. Journal of Neuroscience 18:2974-2981]. La potenciación a largo plazo en el hipocampo es una forma de plasticidad sináptica y se considera en general como un modelo apropiado para la memoria y el aprendizaje [Bis TVP, Collinridge GL, (1993). Un modelo sináptico de memoria: potenciación a largo plazo en el hipocampo, Nature 361:31-39]. Por consiguiente, se cree que la expresión inapropiada de citoquina en el cerebro interviene en el desarrollo y en la progresión de las patologías neuro-inflamatorias.

Entre los trastornos neuro-degenerativos y otros trastornos neurológicos que se pueden tratar según la invención, se pueden citar: el síndrome de Down, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la demencia senil, la depresión y similares. En suma, puede ser cualquier trastorno neuro-degenerativo u otro trastorno neurológico.

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Los términos "células apoptóticas" y "cuerpos apoptóticos" que se utilizan aquí se refieren a células y cuerpos celulares que presentan uno o más de los rasgos caracteresticos siguientes de la apoptosis: exposición superficial de fosfatidil serina, detectada por métodos standard aceptados de detección, como p. ej. la tinción Annexin V; alteraciones en la permeabilidad de la membrana mitocondrial, medidas con métodos standard aceptados (p. ej. Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C. Cosarizza, A. (1997) JC-1, pero no DiOC6(3) o Rodamina 123 es una Sonda Fluorescente Fiable para evaluar los cambios Delta Psi en células intactas: implicaciones para estudios sobre la funcionalidad mitocondrial durante la apoptosis, "FEBS Letters" 411:77-82]; evidencia de fragmentación de ADN como la aparición de "laddering" de ADN en la electrofóresis de gel agarosa tras la extracción de ADN de las células [Teiger, E., Dam, T.V. Richard, L., Wisnewsky, C., Tea, B.S. Gaboury, L., Tremblay, J., Schwartz, K. and Hamet, P. (1996). "Apoptosis en hipertrofia cardiaca inducida por sobrecarga de presión en la rata" Journal of Clinical Investigation 97: 2891-2897], o por marcación in situ (véase Gavrieli et al., 1992, señalado más arriba).

Las células y/o los cuerpos apoptóticos que se utilizan en la invención comprenden de preferencia no más de aprox. 35% en peso de células necróticas y/o cuerpos necróticos sobre la base del peso total de las células/cuerpos apoptóticos y células/cuerpos necróticos; de preferencia, no más de 20% en peso e incluso todavía mejor, no más de aprox. 10%. A estos niveles, la presencia de estas células y/o cuerpos necróticos no alteran de forma significativa, según se cree, los procesos in vivo. En su realización preferida, las células/cuerpos apoptóticos carecen prácticamente de células y/o cuerpos necróticos (es decir, menos de aprox. el 2% en peso de células/cuerpos necróticos).

Las células y/o cuerpos apoptóticos que se utilizan en la presente invención se preparan ex vivo a partir de células de mamífero compatibles con las del paciente mamífero. Pueden prepararse a partir de cualquier tipo de célula de mamífero, inclusive líneas celulares cultivadas. De preferencia, se preparan a partir de un tipo celular derivado del cuerpo mismo del paciente mamífero o de una línea celular establecida. Todavía mejor, se preparan a partir de glóbulos blancos de la sangre, compatibles con los del paciente mamífero, y todavía mejor a partir de los propios glóbulos blancos del propio paciente, y todavía mucho mejor a partir de los propios T linfocitos del paciente. Una solución todavía mejor es la preparación a partir de una línea celular establecida. Las células y/o los cuerpos apontóticos se preparan extra-corporalmente antes de la administración al paciente. Por consiguiente, en una realización, se puede retirar una porción de sangre del paciente, p. ej. por venipunción y someter extra-corporalmente por lo menos una porción de los glóbulos blancos de la misma a condiciones que inducen la apoptosis.

En el estado de la técnica, se conoce toda una serie de métodos para inducir la apoptosis en células de mamífero, con el objeto de crear células y cuerpos apoptóticos y se puede aportar prácticamente cualquiera de ellos en la preparación de cuerpos apoptóticos que se utilizan en la presente invención. Uno de estos métodos consiste en someter las células a radiación de ionización (rayos y, rayos x, etc.) y/o radiación electromagnética no ionizante, inclusive ultravioleta. La apoptosis se puede inducir sometiendo las células a ultrasonido.

Otro método es el tratamiento de las células con fármacos como inhibidores de quinasa de proteína no específica, ejemplificada por la staurosporina (véase Bombeli, Karsan, Tait and Hirlan, (1997). "Las células endoteliales vasculares apoptóticas se vuelven procoagulantes", Blood, vol. 89:2499-2442). Asimismo ciertos agentes quimioterapéuticos utilizados para el tratamiento de tumores malignos inducen la apoptosis; p. ej. adriamicina con fármacos statin (can statin drugs) (inhibidores de 3-hidroxi-3metil glutaril coenzima A reductosa) [Guijarro C, Blanco-Colio LM, Ortego M. Alonso C, Ortiz C. Ortiz A, Plaza JJ, Díaz C, Hernández G. Edigo J. (1998), "los inhibidores de isoprenilación y 3-hidroxi-3metil glutaril coenzima A reductasa inducen la apoptosis de músculo liso vascular en cultivo" Circulation Research 83: 490-500] and colcicine [Suzuki Y (1998) "Muerte celular, fagocitosis y neurogénesis en epitelio olfatorio del ratón y órgano vomeronasal tras el tratamiento con colcicina" Annals of the New York Academy of Sciences 855:252-254]. La utilización de ligandos para receptores letales en células, como ligando Fas es algo evidente para la inducción de la apoptosis, según se desprende de lo indicado anteriormente sobre la apoptosis.

Otro método más es la aplicación de estrés oxidativo a células, extracorporalmente (véase p. ej. Buttke and Sandstrom (1994) "Estrés oxidativo como mediador de la apoptosis" Immunology Today Vo1.15:7-10). Esto se puede lograr tratando las células, en suspensión, con agentes químicos oxidantes, como el peróxido de hidrógeno, otros peróxidos e hidro-peróxidos, ozono, permanganatos, periodatos y similares. Aceptables desde el punto de vista biológico, estos agentes oxidantes se utilizan de preferencia para reducir problemas potenciales asociados con residuos y contaminaciones de las células y cuerpos apoptóticos así formados.

La presente invención no se limita a ningún método particular de producción de células y cuerpos apoptóticos, que aquí se utilizan, y se puede recurrir a cualquier proceso conocido adecuado.

Se pueden utilizar métodos de detección y cuantificación de apoptosis para determinar la presencia y el nivel de la apoptosis en la preparación que se va a administrar al paciente en la presente invención. Por lo menos se deberá utilizar uno de los métodos descritos en la introducción anterior, para confirmar el nivel de apoptosis logrado antes de la administración. Se purifican adecuadamente antes de la utilización, utilizando métodos conocidos en el estado del arte, como p. ej. la centrifugación diferencial.

Al preparar las células y/o los cuerpos apoptóticos habrá que procurar no aplicar niveles excesivos de estrés oxidativo, radiación, tratamiento con fármacos, etc., ya que, de otro modo, existe un elevado riesgo de causar la necrosis de por lo menos algunas de las células bajo tratamiento. La necrosis es la causante de la ruptura de la membrana celular y la liberación del contenido celular, muchas veces con resultados biológicamente nocivos, particularmente eventos inflamatorios, de modo que es preferible evitar la presencia de células necróticas y de sus componentes junto con los cuerpos apoptóticos.

Los niveles adecuados de tratamiento de las células para crear cuerpos apoptóticos que se utilizan en la presente invención dependen, en alguna medida, de la naturaleza de las células elegidas y de la composición celular y le tipo de tratamiento elegido para inducir la apoptosis. Estos niveles adecuados se pueden determinar fácilmente, como saben los expertos en la materia, habida cuenta de la literatura científica disponible sobre el tema, inclusive los artículos antes citados.

Un proceso preferido según la presente invención supone el cultivo de células del paciente o de una línea celular de mamífero compatible. Las células cultivadas se pueden tratar entonces para inducir la apoptosis y crear células y/o cuerpos apoptóticos. Las células, suspendidas en el plasma del paciente o en otro medio de suspensión adecuado, como medio de cultivo de células de mamífero salino o equilibrado, se pueden administrar entonces en la forma indicada a continuación. Los números de células y/o cuerpos apoptóticos se pueden determinar según los métodos publicados, disponibles en la literatura científica sobre el tema, inclusive los artículos antes mencionados. El número de estas células y/o cuerpos apoptóticos necesario para administrar al paciente obteniendo el beneficio clínico deseado variará según la procedencia de las células, el estado, la edad y el peso del paciente y otros factores relevantes que el médico clínico podrá determinar fácilmente.

Por consiguiente, un ejemplo de un proceso preferido según la invención comprende la extracción de una porción de sangre del paciente que se va a tratar, la separación de los glóbulos blancos de la misma y el tratamiento de los glóbulos blancos en condiciones que causan la apoptosis, con el objeto de crear una composición celular en las que un número importante de glóbulos blancos han sido sometidos a apoptosis para crear números sustanciales de células o cuerpos apoptóticos. Seguidamente, se administra al paciente la composición tratada. De preferencia se pueden utilizar linfocitos T, aislados de la sangre utilizando medios conocidos, y suspendidos en la forma indicada anteriormente, como fuente de células y cuerpos apoptóticos.

El número de células viables elegidas para el tratamiento tendente a crear células y/o cuerpos apoptóticos es convenientemente de hasta 4 x 10^{9} de preferencia 1.000.000 a 1.000.000.000 aprox. y todavía mejor de 50.000.000 a 150.000.000 aprox. para cada administración a un paciente humano. Aproximadamente del 10% al 90%, de preferencia del 30% al 70% aprox. de la composición celular a administrar está constituido por cuerpos y/o células apoptóticas, siendo el resto células viables y células necróticas. Por tanto, las cantidades preferidas de células y/o cuerpos apontóticos de administración son las producidas sometiendo dichos números de células a condiciones de apoptosis. Cuando se utiliza sangre completa como fuente de las células que se va someter a condiciones inductoras de apoptosis, estos números de glóbulos blancos pueden obtenerse en porciones de sangre de un volumen de hasta 400 ml aprox., de preferencia hasta 100 ml. Más específicamente, de 50.000.000 a 150.000.000 de células constituye el equivalente de los glóbulos blancos en porciones de sangre con un volumen de 10-30 ml.

El volumen de la porción de sangre extraída del paciente para el tratamiento con el objeto de crear células y/o cuerpos apoptóticos es convenientemente de hasta 400 ml, de preferencia de aprox. 0,1 a 100 ml y todavía mejor de aprox. 5 a 15 ml. Por lo tanto, las cantidades preferidas de células y/o cuerpos apoptóticos para la administración son las correspondientes a los números derivables de los glóbulos blancos, o linfocitos T aislados, contenidos en dichas cantidades de sangre completa, tras haberlas sometido a condiciones inductoras de apoptosis.

La suspensión de células y/o cuerpos apoptóticos tratados para su administración al paciente se trata en un medio de suspensión líquido biológicamente aceptable, como el suero y plasma del paciente, medio de cultivo celular de mamífero salino o equilibrado. La adición de otros factores, como citoquinas, hormonas, productos de células estrenadas u otros materiales adecuados biológicamente activos puede potenciar el beneficio de los materiales celulares apoptóticos administrados. La porción se puede introducir en el cuerpo del paciente utilizando cualquier método adecuado, de preferencia mediante inyección intramuscular, aunque también puede hacerse mediante inyección subcutánea, mini injerto, inyección intra-peritoneal, inyección intra-arterial, inyección intravenosa y administración oral. Las entidades apoptóticas se pueden suministrar al órgano y/o zona corporal específica utilizando cualquier sistema de suministro adecuado conocido.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como ejemplo de excipientes adecuados se pueden citar los siguientes: agua estéril, salino estéril, salino con tampón de fosfato y similares.

Cuando se administran, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de cuerpos/células apoptóticas para inducir una respuesta profiláctica y/o terapéutica adecuada, en el paciente que padece o puede llegar a padecer un trastorno neuro-degenerativo. De preferencia, la composición administrada al paciente mamífero comprende de aprox. 10.000 a 10.000.000 de células o cuerpos apoptóticos por Kg. de peso corporal, de preferencia entre 500.000 y 5.000.000 y todavía mejor entre 1.500.000 y 4.000.000 aprox. de células y/o cuerpos apoptóticos por kg. de peso corporal. La dosis específica utilizada dependerá por supuesto de la edad, del peso y de la gravedad de la enfermedad del paciente tratado, algo que entra dentro de las competencias del médico que lo atiende.

Para un tratamiento y/o una profilaxis más eficaz de trastornos de mamífero que suponen un trastorno neuro-degenerativo o neurológico, se puede someter al paciente a toda una serie de tratamientos con células y/o anticuerpos apoptóticos, según la invención. Cada uno de los tratamientos puede comprender la administración al paciente de 1 a 6 porciones de material celular suspendido, según lo descrito anteriormente. No se podrá administrar más de una estas porciones al día, y el período máximo de descanso entre dos administraciones consecutivas no podrá exceder de 21 días aprox. Se pueden utilizar ventajosamente tratamientos de refuerzo, como los que se describen más abajo. Para mantener los efectos deseados, el paciente se puede someter a tratamientos de refuerzo, con otra tanda de administraciones de porciones de células y/o cuerpos apoptóticos suspendidos, según se describe más arriba, a intervalos comprendidos entre 3 y 4 meses.

Según lo indicado, la presente invención se puede aplicar al tratamiento y a la profilaxis de una amplia variedad de trastornos neuro-degenerativos y otros trastornos neurológicos de los mamíferos. Estos pueden ser, sin que suponga limitación alguna: el Síndrome de Down, la enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, la demencia senil, la depresión, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Huntington, las neuropatías periféricas, las patologías de la médula espinal, la patologías de las articulaciones neuropáticas, la enfermedad demielinante inflamatoria crónica (CIPD), las neuropatías, inclusive la mono-neuropatía, la poli-neuropatía, la neuropatia sensorial distal simétrica, la fibrosis cística, los trastornos de la articulación neuro-muscular y las miastenias. En suma, puede tratarse de prácticamente cualquier trastorno neuro-degenerativo u otro trastorno neurológico.

La invención se sigue describiendo, con fines ilustrativos, en los siguientes ejemplos específicos.

Ejemplo 1

Se realizaron experimentos, para mostrar la invención, en ratones de laboratorio, en condiciones aprobadas para realizar dichos experimentos.

La eficacia del tratamiento según una realización preferida de la presente invención, sobre hipersensibilidad de contacto (CHS), un ejemplo de trastorno inflamatorio de la célula Th-1 que, según se sabe, es mediado por citoquinas inflamatorias, se evaluó en ratones de laboratorio, según procedimientos de experimentación animal aprobados, utilizando el método descrito por Kondo et al., "Se necesita antígeno-1 (LFA-1) asociado a la función linfocítica para una máxima elicitación de la dermatitis alérgica de contacto" Br. J. Dermacol. 131:354-359 (1994), con variaciones mínimas. La descripción anterior se incorpora aquí a modo de referencia. En pocas palabras, para inducir CHS, se afeitó la piel abdominal de cada ratón y se pintó con dinitro difluir benceno DNFB, el producto químico sensibilizador, utilizando 25 \mul de 0,5% DNFB en solución 4:1 de acetona: aceite de oliva. Esta sensibilización se aplicó a dos grupos de ratones Balb/c, 10 animales en total.

Se prepararon cuerpos apoptóticos a partir de fibroblastos de murino. Los fibroblastos de murino se trataron con 50 mM de butirato sódico en medio RPMI, en confluencia durante un día, y luego se cambió el medio de butirato sódico. Para aumentar el número de células y cuerpos apoptóticos, las células se pueden irradiar además con luz UV (p. ej. 75 mj). Se eliminó el sobrenadante que contenía células flotantes 24 horas después de la irradiación.

Se cuantificaron los cuerpos apoptóticos centrifugando el sobrenadante (1200 rpm, 5 minutos), aspirando el sobrenadante, lavando la píldora celular resultante con PBS y centrifugando de nuevo, según lo indicado anteriormente. Se volvió a suspender en PBS la pastilla que contenía los cuerpos apoptóticos. Se almacenaron las células en PBS a 4° C mientras duraba el experimento. Se volvieron a suspender las células que se iban a teñir para la cuantificación en tampón de fijación 1X a una concentración de aprox. 1 x 10^{6} células/ml. 100 \mul de la célula se trasladaron a un tubo de 5 ml y se añadió \mul de annexin V conjugada con fluoresceína y 10 \mul de reactivo de yoduro de propidio. Las células se sometieron a un suave vórtice y la mezcla célula se incubó durante 15 minutos a 25°C en la oscuridad. Tras la incubación, se añadió 400 \mul de tampón de fijación 1X a cada tubo. La muestra se analizó sobre un citómetro de flujo durante una hora.

De los dos grupos de ratones sensibilizados, el primer grupo de control A no recibió ningún tratamiento. El segundo grupo de prueba B se trató con una inyección de cuerpos apoptóticos suspendidos, preparada en la forma descrita anteriormente, un volumen de 50 µl que contenía por lo menos 150.000 cuerpos por inyección de sangre sometida a factores estresantes, según lo descrito anteriormente. Los tratamientos, cada uno de ellos con una inyección intramuscular de 50 \mul de líquido respectivo, comenzaron el día de la sensibilización, y se repitieron cada día durante un total de seis días. El mismo día que el último tratamiento aunque después de su administración, se expusieron los animales a DNFB aplicando al oído derecho de cada animal 10 \mul de una solución 0,2% de DNFB en acetona y aceite de oliva. Se aplicó al oído izquierdo de cada animal el disolvente de acetona/aceite de oliva, sin DNFB. La inflamación debida a CHS se manifiesta en la hinchazón de los oídos derechos. Se midió el grosor del oído, 24 horas después de la exposición, con un micrómetro de resorte Peacock (Ozaki Co., Tokio, Japón). Los resultados se expresaron como grosor y diferencia de grosor de los oídos derechos e izquierdos de cada animal a las 24 horas después de la exposición.

Se repitieron los experimentos, utilizando más conjuntos de dos grupos de animales, un número suficiente de veces para garantizar un peso estadístico en los resultados. Se observó una notable y significativa reducción del grosor del oído (inflamación) en los animales tratados con la suspensión de cuerpos y células apoptóticas según la invención, comparado con el grupo no tratado, que mostraba una notable reducción de la inflamación. Los resultados se presentan en el siguiente cuadro, y en la figura adjunta, como gráfico de barras de hinchazón neta del oído (diferencia entre grosor del oído derecho e izquierdo) para cada grupo, con "desviación standard" mostrada por la línea vertical en la parte superior de cada columna.

CUADRO 1

1

Un análisis de la suspensión de las células y cuerpos apoptóticos administrados a los animales del grupo de prueba B indicó la presencia en el mismo de aprox. 40% de células y cuerpos apoptóticos, resto células viables y menores cantidades de células necróticas (no más de 20%), cuya presencia se considera insignificante en el proceso in vivo.

Ejemplo 2

Se repitió el procedimiento de la prueba anterior sobre grupos similares de animales, un grupo de control y un grupo de prueba, aunque usando una suspensión de células y cueros apoptóticos en el grupo de prueba, que comprendía aprox. 60% de células y cuerpos apoptóticos, resto células viables y una cantidad mínima (no más de 20%) de células necróticas. Se obtuvieron resultados prácticamente iguales.

La eficacia de los procesos y composiciones de la presente invención para evitar y aliviar la inflamación debida a CHS indica que la administración de células y cuerpos apoptóticos, según lo descrito, regula incrementando la generación in vivo de citoquinas derivadas de Th-2 anti-inflamatorio como IL-10 (que, según se sabe, está implicado en CHS- véase Kondo, McKenzie and Sauder, "The Journal of Investigative Dermatology", Vol. 103, 1994, página 811-814) y/o produce regulación decreciente de las citoquinas inflamatorias Th-1 como TNF \alpha e IL-6. Estas citoquinas inflamatorias están implicadas en trastornos del cerebro relacionados con la inflamación, es decir los trastornos neuro-inflamatorios, neuro-degenerativos y neurológicos como la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil, la esclerosis múltiple, la depresión, el Síndrome de Down, la enfermedad de Huntington, las neuropatías periféricas, los trastornos de la medula espinal, los trastornos de la articulación neuropática, la enfermedad demielinizante inflamatoria crónica (CIPD), las neuropatías, como las mono-neuropatías, las poli-neuropatías, la neuropatía sensorial distal simétrica, la fibrosis cística, los trastornos de la articulación neuromuscular, las miastenias y la enfermedad de Parkinson.

Las enfermedades neuro-degenerativas, como el Síndrome de Down, la enfermedad de Alzheimer y la de Parkinson están asociados con un aumento en los niveles de ciertas citoquinas inflamatorias, que incluyen la interleucina-1\beta (IL-1\beta) [véase Griffin WST, Stanley LC, Ling C. White L. Macleod V. Perrot LJ, White CL, Araoz C (1989). La inmuno-reactividad de S-100 interleucina 1 del cerebro es elevada en el Síndrome de Down y en la enfermedad de Alzheimer. Proceedings of the Nacional Academy of Sciences USA 867611-7615; Mogi M, Harada M, Narabayashi H, Inagaki H, Minami M, Nagatsu T (1996). Los niveles de transformación del factor de crecimiento-alfa y de interleucina (IL)-1 beta, IL-1, IL-4, I1-6 son elevados en el fluido cerebro espinal ventricular en el parkinsonismo juvenil y la enfermedad de Parkinson. Neuroscience Letters 211:13-16]. También se ha visto que IL-1\beta inhibe la potenciación a largo plazo en el hipocampo [Murray CA, Lynch MA (1998). Evidenciar ese aumento de la expresión hippocampal de la citoquina interleucina-1\beta es un disparador común para las debilitaciones por la edad e inducidas por el stress en una potentiation a largo plazo. Journal of Neuroscience 18:2974-2981]. La potenciación a largo plazo en el hipocampo es una forma de plasticidad sináptica y se considera generalmente que es un modelo apropiado para la memoria y el aprendizaje [Bliss TVP, Collinridge GL, (1993). Un modelo sináptico de memoria: potenciación a largo plazo en el hipocampo, Nature 361:31-39]. Por consiguiente, se cree actualmente que una expresión inadecuada de citoquina en el cerebro es la que interviene en el desarrollo y la progresión de las enfermedades neuro-degenerativas. Por lo tanto, el éxito obtenido en el tratamiento de CHS referido en los ejemplos anteriores, con su regulación decreciente concomitante de citoquinas inflamatorias Th-1 es indicativo de la utilización exitosa del proceso y de las composiciones en el tratamiento y profilaxis, en una amplia variedad de trastornos neurológicos, inclusive los tratados anteriormente.

Claims (16)

1. La utilización de cuerpos y/o células apoptóticas en la preparación de un medicamento para el tratamiento y la profilaxis de un trastorno neuro-degenerativo o neurológico en un paciente mamífero, siendo los cuerpos y/o células apoptóticas compatibles con las células de la sangre del paciente.

2. Utilización como en la reivindicación 1, en la que el medicamento es una suspensión líquida.

3. Utilización como en la reivindicación 1 o 2, donde los cuerpos y/o las células apoptóticas constituyen del 10% al 90% de la porción celular del medicamento.

4. Utilización como en la reivindicación 3, donde los cuerpos y/o las células apoptóticas constituyen del 30% al 70% de la porción celular del medicamento.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los cuerpos y/o las células apoptóticas se derivan del tratamiento extracorporal de células de la sangre compatibles con las del paciente mamífero.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde los cuerpos y/o células apoptóticas se derivan de líneas celulares cultivadas establecidas.

7. Utilización según la reivindicación 5, donde las células de la sangre son glóbulos blancos.

8. Utilización según la reivindicación 7, donde los glóbulos blancos de la sangre son los propios glóbulos blancos del paciente.

9. Utilización según la reivindicación 8, donde las células de la sangre son los propios linfocitos T del paciente.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el trastorno se elige dentro del grupo formado por: la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson, la depresión, el Síndrome de Down, la enfermedad de Huntington, las neuropatías periféricas, las patologías de la medula espinal, las patologías de la articulación neuropática, la patología demielinizante crónica (CIPD), las neuropatías que incluyen la mono-neuropatía, la poli-neuropatía, la neuropatía sensorial distal simétrica, la fibrosis cística, los trastornos de la articulación neuromuscular y las miastenias.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la preparación de una dosificación unitaria de medicamentos para la administración a un paciente humano, dosificación que contiene de 10.000 a 10.000.000 de cuerpos y/o células apoptóticas por kg. de peso corporal del paciente.

12. Utilización según la reivindicación 11, donde la citada dosificación contiene de 500.000 a 5.000.000 de cuerpos y/o células apoptóticas por kg. de peso corporal del paciente.

13. Utilización según la reivindicación 11, donde dicha dosificación contiene de 1.500.000 a 4.000.000 de cuerpos y/o células apoptóticas por kg. de peso corporal del paciente.

14. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medicamento se puede administrar por inyección intramuscular.

15. Composición farmacéutica que comprende una suspensión líquida de material celular, en el que del 10% al 90% de dicho material celular está constituido por cuerpos y/o células apoptóticas.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 15, donde los cuerpos y/o las células apoptóticas comprenden del 30% al 70% del material celular.