ES2290340T3

ES2290340T3 - Metodo in-vitro para la produccion de una valvula cardiaca homologada "stentada" producida por ingenieria tisular.

Info

Publication number: ES2290340T3
Application number: ES02780963T
Authority: ES
Inventors: Bruno Covelli
Original assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Priority date: 2002-08-01
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2022-09-04
Also published as: AU2002347023A1; ATE367833T1; EP1499366B1; US20060246584A1; CA2494792C; CA2494792A1; EP1499366A1; WO2004018008A1; JP2006506108A; DE50210575D1; DE10235237A1

Abstract

Un método in vitro para la producción de una válvula cardiaca homóloga, que comprende las siguientes etapas: - puesta a disposición de un soporte biológicamente degradable (armazón), - colonización del soporte con fibroblastos y/o miofibroblastos homólogos para la formación de una matriz de tejido conjuntivo, - en un caso dado, colonización de la matriz de tejido conjuntivo con células endoteliales - fijación de la matriz sobre una construcción estructural (stent) no degradable o difícilmente degradable, donde la matriz de tejido conjuntivo colonizada en un caso dado con células endoteliales se introduce, antes y/o después de la fijación sobre la construcción estructural, en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede someter a caudales crecientes, y el caudal se aumenta de forma continua o discontinua.

Description

Método in-vitro para la producción de una válvula cardiaca homóloga "stentada" producida por ingeniería tisular.

Cada año mueren, solamente en los EEUU, aproximadamente 20.000 pacientes debido a las consecuencias de una disfunción de válvulas cardiacas, y más de 60.000 pacientes se ven obligados, debido a una disfunción ya detectada, a sustituir una o varias válvulas cardiacas mediante cirugía. Como sustitutivo de la propia válvula cardiaca se pueden considerar prótesis valvulares mecánicas o biológicas (xenoinjertos), menos frecuentemente se usan homoinjertos crioconservados o fijados con glutaraldehído.

Sin embargo, las prótesis valvulares mecánicas conducen a menudo a reacciones de cuerpo extraño con complicaciones tromboembólicas, que se ven beneficiadas por las condiciones de flujo en el corazón modificadas por la válvula cardiaca artificial. Por tanto, se requiere una anticoagulación de por vida del paciente afectado, que conduce a un mayor riesgo permanente de hemorragias. Una complicación adicional, a menudo con riesgo vital, en pacientes con una válvula cardiaca mecánica, son las infecciones.

Los xenoinjertos son la mayoría de las ocasiones válvulas de cerdo, que están tratadas con glutaraldehído. Las prótesis valvulares de cerdo se pueden usar con buenos resultados en pacientes de más edad, sin embargo, tienden a la degeneración después de solamente aproximadamente entre 12 y 15 años, de manera que por regla general no se tienen en cuenta para personas jóvenes. Además, con prótesis valvulares de cerdo, en comparación con el corazón sano, hay un mayor riesgo de infecciones. Además de esto, las válvulas de cerdo tienden a la calcificación, por lo que no son adecuadas para su uso en niños y personas jóvenes, que presentan un mayor metabolismo del calcio. Finalmente, también representan tejido extraño que, con una cierta probabilidad, se detectará por el propio sistema inmune como extraño y, de este modo, pueden desencadenar procesos inmunes adversos.

Como tercera posibilidad se dispone de homoinjertos, es decir, válvulas cardiacas aisladas de donantes humanos, fijadas. Los homoinjertos son relativamente resistentes frente a infecciones, sin embargo, también representan tejido extraño que provocará, con una cierta probabilidad, reacciones inmunes. Por los demás, los homoinjertos tienden, al igual que las prótesis valvulares de cerdo, a la calcificación y están sometidas, por tanto, a una considerable degeneración, que por regla general hará necesaria una operación posterior después de entre 7 y 12 años. Los homoinjertos, además, solamente están disponibles en un alcance extremadamente limitado.

Además de las desventajas que se han descrito anteriormente de las prótesis valvulares usadas hasta ahora como sustitutos de válvulas, es decir, el desencadenamiento de reacciones inmunes, el mayor riesgo de infecciones, el riesgo de procesos tromboembólicos y la tendencia a la degeneración, todas las válvulas conocidas hasta ahora tienen en común que se componen de material inorgánico o material orgánico fijado y, por tanto, carecen de importantes características de matriz viva, por ejemplo, la capacidad de realizar procesos de reparación, de reconfiguración o de crecimiento. De esto se deduce, entre otras cosas, que en pacientes de válvula infantiles hasta ahora se han tenido que asumir regularmente operaciones posteriores. Adicionalmente al riesgo inherente a cada operación cardiaca, sin embargo, con cada operación posterior aumenta el riesgo de morbilidad y mortalidad, ya que debido a las anteriores operaciones se presentan considerables adherencias en el tórax.

Por tanto, existe una necesidad urgente de un sustituto de válvulas cardiacas que evite las desventajas que se han descrito anteriormente. Con este propósito ya se ha propuesto producir válvulas cardiacas artificiales mediante "ingeniería tisular". La "ingeniería tisular" se ocupa del desarrollo de implantes "biohíbridos", que crecen en el cuerpo hasta tejidos o incluso hasta sistemas de órganos completos. Ya se ha descrito incluso la producción de válvulas cardiacas biohíbridas en forma de valvas de válvula individuales, sin embargo, las valvas de válvulas cardiacas producidas mediante "ingeniería tisular" tenían hasta ahora la desventaja de que presentaban estructuras de tejido conjuntivo inadecuadas, no suficientes, y por tanto, no pueden resistir las condiciones de flujo presentes en el corazón después de la degradación de la estructura de soporte biodegradable.

El documento DE 19919625 describe un método in vitro para producir una válvula cardiaca homóloga. La válvula cardiaca descrita en ese documento se basa en un soporte biológicamente degradable, que se incuba con fibroblastos y/o miofibroblastos homólogos para la formación de una matriz similar a tejido conjuntivo y después se coloniza con células endoteliales. La matriz similar a tejido conjuntivo se transfiere a continuación para la maduración del tejido a un biorreactor. Esta válvula cardiaca adaptada excelentemente a las condiciones de flujo en el cuerpo humano. La válvula cardiaca descrita en el documento DE 19919625 se compone, en el momento de su implante, casi completamente de material celular autólogo, que después se cose en el corazón receptor. Una desventaja de esta válvula cardiaca, en determinadas circunstancias, puede ser que el implante quirúrgico sea técnicamente difícil de realizar. Además se podría producir un problema si la sutura se tiene que conducir por el tejido de ingeniería tisular autólogo que se tiene que coser. Debido a la carga extremadamente grande a la que se somete la válvula cardiaca a continuación en el cuerpo humano, se podrían producir desgarros en la zona de la sutura.

Por tanto, es objetivo de la invención poner a disposición válvulas cardiacas homólogas mejoradas y un método para su producción.

\newpage

De acuerdo con la invención, el objetivo se resuelve mediante un método in vitro para producir una válvula cardiaca homóloga, que comprende las siguientes etapas:

-: puesta a disposición de un soporte biológicamente degradable (armazón),

-: colonización del soporte con fibroblastos y/o miofibroblastos homólogos para la formación de una matriz de tejido conjuntivo,

-: en un caso dado, colonización de la matriz de tejido conjuntivo con células endoteliales

-: fijación de la matriz de tejido conjuntivo sobre una construcción estructural (stent) no degradable o difícilmente degradable,

donde la matriz de tejido conjuntivo colonizada en un caso dado con células endoteliales, antes o después de la fijación sobre la construcción estructural, se introduce en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede someter a caudales crecientes, y el caudal aumenta de forma continua o discontinua.

En un método alternativo, una válvula cardiaca homóloga se produce por

-: la puesta a disposición de un soporte biológicamente degradable (armazón), que se une firmemente con una construcción estructural (stent) no degradable,

-: en un caso dado, colonización de la matriz de tejido conjuntivo con células endoteliales,

-: introducción de la construcción estructural con la matriz de tejido conjuntivo unida con la misma en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede exponer a caudales crecientes,

-: aumento continuo o discontinuo del caudal.

Con el método de acuerdo con la invención se pueden producir válvulas cardiacas homólogas, que presentan todas las ventajas de la válvula cardiaca conocida a partir del documento DE19919625 y además evitan que en el momento del implante de la válvula se tenga que conducir una sutura por las estructuras de tejido conjuntivo de la válvula cardiaca. Están a la altura de las condiciones de flujo que se presentan en el cuerpo y se pueden implantar quirúrgicamente de forma sencilla.

Los métodos para producir la válvula cardiaca de acuerdo con la invención y la válvula cardiaca producida de ese modo se explicarán la continuación con más detalle.

En la siguiente descripción, el término "soporte" significa una estructura acelular, que, como se explica más detalladamente a continuación, está formada por fibras sintéticas o por un armazón acelular de tejido conjuntivo. El término "matriz" indica una estructura de tejido conjuntivo que contiene, además de fibroblastos y miofibroblastos, componentes típicos de una matriz extracelular, es decir, colágeno, elastina y glicosaminoglicanos. Las estructuras denominadas matriz contienen típicamente componentes de soporte incluidos en la degradación o incluso ningún componente de soporte.

Para la realización del método de acuerdo con la invención, en primer lugar se proporciona un soporte biológicamente degradable. El material de soporte, por un lado, tiene que ser estable durante un periodo de tiempo determinado, para hacer posible una colonización o penetración suficiente con fibroblastos y/o miofibroblastos y poder realizar la formación de una matriz de tejido conjuntivo, por otro lado, se tiene que puede degradar en su totalidad en el plazo de un tiempo razonable, que de forma ideal es menor que el tiempo que requiere la formación de la prótesis valvular homóloga. Es preferible que la degradación comience después de aproximadamente 8 días; por regla general, tiene que terminar en menos de 3 meses, preferiblemente incluso después de entre 4 y 6 semanas.

Después de la formación de una estructura de matriz sólida de tejido conjuntivo, cuyo soporte degradable no tiene porqué estar todavía degradado, la misma se coloniza en un caso dado con células endoteliales. Después de la colonización realizada, la matriz de tejido conjuntivo se aplica sobre una construcción estructural no degradable o difícilmente degradable. Sin embargo, alternativamente, un soporte ya unido de forma firme con una construcción estructural, se puede someter a las etapas de colonización. Las posibles variantes alternativas del método se describirán a continuación más detalladamente.

En una variante del método de acuerdo con la invención, el soporte biológicamente degradable (armazón) es colonizado en primer lugar con fibroblastos y/o miofibroblastos homólogos para la formación de una matriz de tejido conjuntivo. A continuación, la matriz, en un caso dado, se coloniza con células endoteliales. De acuerdo con la invención, la estructura preformada análoga a una válvula cardiaca, a continuación, en una etapa adicional del método, para la maduración del tejido y optimización de la función hemodinámica, se puede introducir en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede someter a caudales crecientes. Por el aumento continuo o discontinuo del caudal se adapta a las condiciones de flujo del cuerpo humano. Para la estabilización adicional, la estructura análoga a una válvula cardiaca se fija sobre una construcción estructural biocompatible de material no degradable o difícilmente degradable, que, en un caso dado, se vuelve a introducir en la cámara de flujo pulsátil. En el caso de que, después de la fijación sobre la construcción estructural, se realice la adaptación en la cámara de flujo a las condiciones de flujo del corazón humano, la primera incubación en la cámara de flujo pulsátil se puede omitir. Por este método se obtienen prótesis valvulares cardiacas vitales, que están a la altura de las condiciones de flujo del cuerpo humano.

En una variante alternativa del método de acuerdo con la invención, el soporte biológicamente degradable (armazón) se puede unir de forma firme con la construcción estructural (stent) no degradable o difícilmente degradable incluso antes de la colonización. En una etapa adicional, después, el soporte unido con la construcción estructural, para formar una matriz de tejido conjuntivo, se coloniza con fibroblastos y/o miofibroblastos homólogos, y a continuación, en un caso dado, con células endoteliales. Para la maduración del tejido y optimización de la función hemodinámica, la estructura preformada análoga a una válvula cardiaca, a continuación, se introduce en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede someter a caudales crecientes. Por el aumento continuo o discontinuo del caudal también se obtiene una prótesis valvular cardiaca vital, que está a la altura de las condiciones de flujo del cuerpo humano.

En total, por lo tanto, se obtienen las siguientes variantes del método:

Variante 1:

-: Puesta a disposición de un soporte sin construcción estructural

-: Colonización

-: Adaptación en una cámara de flujo pulsátil

-: Fijación sobre una construcción estructural (stent) no degradable o difícilmente degradable

-: En un caso dado, adaptación posterior de la válvula cardiaca "stentada"

Variante 2

-: Puesta a disposición de un soporte sin construcción estructural

-: Colonización

-: Adaptación de la válvula cardiaca "stentada"

Variante 3

-: Puesta a disposición de un soporte sobre una construcción estructural no degradable o difícilmente degradable

-: Colonización

-: Adaptación

El material de soporte es preferiblemente una estructura construida a partir de fibras poliméricas, una estructura polimérica porosa o un tejido biológico acelular. Los polímeros sintéticos adecuados para este uso comprenden polímeros biodegradables, como por ejemplo, ácido poliglicólico (PGA), ácido poliláctico (PLA), polihidroxialcanoato (PHA) y poli-4-hidroxibutirato (P4HB), policaprolactona (PLGA), policarbonatos, poliamidas, polianhídridos, poliaminoácidos, poliortoéster, poliacetatos, policianoacrilatos y poliuretanos degradables y polímeros no degradables como poliacrilatos, polímeros de etilenvinilacetato y otros acetatos de celulosa sustituidos y derivados de los mismos. Se usan preferiblemente poliésteres.

Los polímeros biológicamente degradables preferibles comprenden polímeros que se seleccionan del siguiente grupo: poliésteres de ácidos hidrocarboxílicos, polianhídridos de dicarboxiéster, y copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos y de los dicarboxiésteres.

En una realización adicional, el material se compone de un polímero sintético de al menos uno de los siguientes monómeros: glicólico, láctico, p-dioxanona, caprolactona, trimetilencarbonato, butirolactona. En realizaciones particulares, el material se selecciona de un grupo compuesto por polímeros o copolímeros de ácido glicólico, ácido láctico y ácido sebácico. Se usan preferiblemente polímeros de ácido poliglicólico.

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Estos polímeros se pueden usar puros y en mezclas de dos o más de las sustancias mencionadas o mezcla de estas sustancias con otros polímeros biológicamente degradables. En una realización preferida se usa un polímero de mezcla de un 85% de PGA al y un 15% de PLA.

En una realización adicional particular, el soporte se produce de un polihidroxialcanoato (PHA). El PHA se puede recubrir con un polímero adicional no degradable. Un polihidroxialcanoato preferido para este uso se degrada in vivo en el intervalo de menos de 9 meses, más preferiblemente en menos de 6 meses y mucho más preferiblemente menos de 3 meses. Una composición preferida de los polihidroxialcanoatos contiene 2-, 3-, 4- o 5-hidroxiácidos, por ejemplo, poli-4-hidroxibutiratos. Además, la composición puede contener un poli-4-hidroxibutirato-co-3-hidroxibutirato y combinaciones de los mismos. Se usa más preferiblemente poli-4-hidroxibutirato.

En una realización adicional particular, el soporte se compone de homopolímeros y copolímeros con una combinación cualquiera de los siguientes monómeros: 3-hidroxibutiratos, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxipropionato, 2-hidroxibutirato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato, 3-hidroxihexanoato, 3-hidroxiheptanoato, 3-hidroxioctanoato, 3-hidroxinonanoato, 3-hidroxitridecanoato, 3-hidroxitetradecanoato, 3-hidroxipentadecanoato, 3-hidroxihexadecanoato, 3-hidroxiheptadecanoato, 3-hidroxioctadecanoato.

Se ha comprobado que es razonable usar soportes biológicamente degradables con una densidad polimérica de aproximadamente entre 40 y 120 mg/cm^{3}. Por debajo de 40 mg/cm^{3} el tejido polimérico es demasiado débil, por encima de 120 mg/cm^{3}, el tejido es demasiado denso para permitir la penetración de fibroblastos en un intervalo de tiempo razonable. En realizaciones preferidas, la densidad del soporte biológicamente degradable comprende entre 50 y 80 mg/cm^{3}, particularmente preferiblemente 70 mg/cm^{3}. En la presente invención se usó con buenos resultados un soporte polimérico de la empresa Albany International Research, Mensville, MA, EEUU, con una densidad de aproximadamente 70 mg/cm^{3}, y un soporte polimérico de la empresa TRANSOME INC., Palm Bay, FL, EEUU.

Las fibras del soporte pueden tener un diámetro entre 6 y 20 \mum, preferiblemente de 10 a 18 \mum. Sin embargo, también se pueden concebir tejidos con otros grosores de fibra, que, sin embargo, por un lado tienen que proporcionar al soporte una determinada estabilidad, por otro lado, tienen que permitir la colonización y penetración del soporte con fibroblastos o miofibroblastos. Para formas poliméricas porosas (esponjosas) se han demostrado adecuados tamaño de poro de 80-240 \mum. Los poros se pueden conseguir por la denominada técnica de "salt-leaching", que se conoce por los especialistas en la técnica.

En vez de un soporte sintético, como se ha descrito anteriormente, se puede concebir el uso de un armazón de tejido conjuntivo acelular. Se podría transformar, a modo de ejemplo, una válvula de cerdo en un tejido inmunológicamente neutro (Bader et al., Eur. J.-Cardiothorac. Surg. 14, 279, 1998), que a continuación se podría colonizar con células homologas. También se pueden volver a colonizar válvulas cardiacas humanas después de la neutralización.

El soporte biológicamente degradable se incuba en primer lugar con una población de fibroblastos. Con el uso de fibroblastos y/o miofibroblastos homólogos, es decir, de miofibroblastos y/o fibroblastos de un ser humano, sin embargo, no necesariamente del paciente, se tiene que tener en cuenta la misma tipificación HLA. Las poblaciones de fibroblastos, por ejemplo, se pueden obtener de vasos sanguíneos periféricos, tanto de arterias como de venas. Para ello es particularmente adecuada la arteria radial del antebrazo, que, debido al suministro doble arterial del brazo, en la mayoría de los casos, está disponible para la extracción sin daños. Alternativamente se pueden obtener células vasculares de vasos sanguíneos de la pierna, por ejemplo, de la vena safena. Además, los miofibroblastos y células endoteliales se pueden obtener de células precursoras de medula ósea o de células madre pluripotenciales o células manipuladas genéticamente.

Las células se pueden obtener, a modo de ejemplo, de fragmentos vasculares, en los que los trocitos vasculares, en primer lugar, como se describe en Zünd et al. (Eur. J. Cardiothorac Surg. 13, 160, 1998), se trocean en pedazos vasculares y se incuban aproximadamente entre 1 y 2 semanas en condiciones de cultivo celular normales (37ºC, CO_{2} al 5%, 95% de humedad ambiental) hasta que las células forman una capa de células confluente en el fondo del recipiente de cultivo. A continuación se someten a múltiples pases para obtener un cultivo celular sin material tisular restante. Después de entre 2 y 3 pases, las poblaciones mezcladas de células se pueden purificar, incubándolas con un marcador fluorescente especifico para células endoteliales (Dil-Ac-LDL, de Medical Technologies Inc., Stoughton, MA) y separar mediante citometría de flujo (FACStar Plus, Becton Dickinson). Las células marcadas fluorescentemente son células endoteliales, las células no marcadas son fibroblastos y miofibroblastos. Los mismos se siguen cultivando entre dos y tres semanas adicionales y durante este tiempo se someten a entre dos y cuatro pases, para obtener un número suficiente de células para la posterior colonización del soporte.

Un cultivo purificado como se ha descrito anteriormente o cualquier otro cultivo puro de fibroblastos/miofibro-
blastos se puede utilizar a continuación para la colonización del soporte polimérico. Para ello se usan por centímetro cuadrado de superficie del soporte aproximadamente entre 10^{5} y 6 x 10^{8} fibroblastos y/o miofibroblastos. Con "superficie", en este caso, no se quiere decir la superficie real del polímero, sino la superficie que se puede observar durante la observación del soporte desde arriba en un plano. Habitualmente se de acuerdo con a los fibroblastos entre 60 a 90 min de tiempo para adherirse al soporte. A continuación se puede retirar el medio sobrante y se puede añadir de nuevo suspensión de fibroblastos. De forma ideal, sin embargo, se dejan transcurrir entre la primera y la segunda adición de suspensión de fibroblastos entre 2 y 36 horas, preferiblemente 24 horas.

En una realización preferida del método de acuerdo con la invención, al soporte o a la matriz que se está empezando a configurar después de la primera adición de fibroblastos, se añaden otras de 3 a 14 veces, particularmente preferiblemente entre 5 y 10 veces, fibroblastos y/o miofibroblastos.

En las condiciones usadas habitualmente para el crecimiento celular de fibroblastos (por ejemplo, CO_{2} al 5%, incubación a 37ºC, medio estéril), se desarrolla después de aproximadamente de una a tres semanas, una estructura de tejido conjuntivo sólida. En una realización preferida, esta estructura a continuación se incuba con una suspensión pura de células endoteliales. Las células endoteliales, se pueden, al igual que los fibroblastos, acumular mediante FACS y a continuación se pueden expandir en varios pases (preferiblemente 3). También para células endoteliales es preferible repetir la colonización varias veces con respectivamente aproximadamente entre 10^{5} y 5 x 10^{8} células endoteliales, por ejemplo, entre 3 y 14 veces. En realizaciones preferidas, la colonización con células endoteliales se repite entre 5 y 10 veces. Entre dos etapas de colonización tiene que haber al menos 60 minutos, preferiblemente, sin embargo, entre 2 y 24 horas. La etapa de colonización con células endoteliales, sin embargo, es opcional.

Las células usadas para la colonización del soporte son preferiblemente células humanas. Sin embargo, es particularmente preferible usar fibroblastos y/o miofibroblastos autólogos, y en un caso dado, células endoteliales. Para ello, al paciente cuya válvula cardiaca se tiene que sustituir, se le extrae tejido, por ejemplo, de uno de sus vasos. Como se ha mencionado anteriormente, son adecuadas la arteria radial y la vena safena o la medula ósea. El uso de las células autólogas para la construcción de la válvula cardiaca tiene la ventaja considerable de que la válvula, después del implante en el paciente, no representa tejido extraño y por lo tanto, las reacciones inmunes contra la válvula cardiaca artificial están prácticamente excluidas.

Aproximadamente 14 días después de la adición opcional de las células endoteliales se puede comprobar histológicamente e inmunohistoquímicamente un tejido con una capa unicelular superficial de células endoteliales y una estructura base de tejido conjuntivo.

En una realización preferida, la matriz de tejido conjuntivo tiene la forma de una válvula cardiaca y presenta un borde ancho de tejido conjuntivo, el denominado anillo de sutura, que se fija sobre una construcción estructural circular. Un ejemplo de tal válvula cardiaca con anillo de sutura se muestra en la Figura 1.

En una realización preferida adicional, la matriz de tejido conjuntivo tiene la forma de una cinta o un anillo. Esta realización requiere un anillo de sutura que presenta una estructura de apoyo de tres puntas, como construcción estructural. La cinta o el anillo se conduce alrededor de esta estructura de tres puntas. Un ejemplo de esta realización se representa en la Figura 3. El diámetro de la construcción estructural se puede seleccionar de forma individual y se adapta después a los requerimientos anatómicos del paciente.

La construcción estructural de acuerdo con la invención (stent) se puede construir de diferentes materiales. Para proporcionarle al tejido nuevo producido una vida útil lo más larga posible y una rigidez, el material se tiene que construir de material biocompatible no degradable o alternativamente de material biocompatible difícilmente degradable, por ejemplo, carbono, PTFE, Dacron, metal, PHA, preferiblemente poli-3-hidroxibutirato (P3HB). "Difícilmente degradable" significa un tiempo de degradación de más de un año.

La fijación de la matriz de tejido conjuntivo sobre la construcción estructural se puede realizar mediante técnica de sutura convencional. En una realización, la matriz se puede fijar mediante adhesivo de fibrina sobre la construcción estructural. Particularmente preferiblemente, la fijación de la matriz de tejido conjuntivo sobre el soporte se realiza mediante técnica de sutura convencional junto con adhesivo de fibrina. Las formas de las valvas de las válvulas cardiacas individuales se pueden estabilizar mediante una sutura o mediante adhesión con adhesivo de fibrina, cosiendo o adhiriendo los bordes que rodean las puntas en el sentido central del círculo.

De acuerdo con la invención, a continuación, en una etapa adicional del método, la estructura preformada análoga a una válvula cardiaca se puede introducir en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede someter a caudales crecientes. Se ha demostrado que mediante una adaptación lenta de los caudales se puede conseguir la formación de una matriz de tejido conjuntivo resistente a flujos.

Para la realización del método de acuerdo con la invención es adecuado, por ejemplo, el biorreactor descrito en el documento DE19919625.

En una realización de la invención se usan caudales de entre 5 ml/min y 8.000 ml/min, preferiblemente entre
30 ml/min y 5000 ml/min, particularmente preferiblemente 50 ml/min y 2000 ml/min. Las indicaciones se refieren al flujo por la prótesis valvular. Como caudal inicial se han demostrado adecuados caudales de entre 50 a 100 ml/min. Estos caudales, por ejemplo, se emiten con una frecuencia de pulso de entre 5 y 10 pulsos por minuto por la válvula cardiaca. A continuación, el caudal se aumenta de forma continua o discontinua hasta 5000 ml/min. Al mismo tiempo, la frecuencia de pulso se eleva hasta 180 pulsos/min. Los datos indicados son los valores limite, que normalmente no se sobrepasan.

En realizaciones preferidas, el caudal aumenta hasta 2000 ml/min, mientras que la frecuencia de pulso se eleva hasta entre 70 y 100, preferiblemente 80 pulsos/min. La carga de la válvula cardiaca que se está estabilizando se adapta de este modo a condiciones aproximadamente fisiológicas. Se ha demostrado como adecuado, sin embargo, no necesario, aumentar el caudal y la frecuencia de pulso respectivamente después de aproximadamente entre 24 y 48 horas. De este modo, a modo de ejemplo, partiendo de un caudal de entre 50 y 100 ml/min y una frecuencia de pulso de entre 5 a 10 pulsos/min el día 1 de la permanencia en la cámara de flujo pulsátil, se puede prever el día 3 un aumento hasta 300 ml/min con entre 20 y 25 pulsos/min, el día 5 hasta 700 ml/min y entre 35 y 45 pulsos/min, el día 7 hasta 1000 ml/min y entre 50 y 60 pulsos/min, el día 9 hasta 1300 ml/min y entre 70 y 80 pulsos/min, el día 11 hasta 1500 ml/min y aproximadamente 100 pulsos/min, el día 13 hasta 1750 ml/min y aproximadamente 120 pulsos/min y el día 15 hasta 2000 ml/min y 140 pulsos/min. Sin embargo, dependiendo del tiempo disponible, del tamaño de la válvula, el tamaño y la edad del paciente, etc., puede ser razonable un aumento mucho más lento de los caudales y de la frecuencia de pulso o el aumento hasta caudales y frecuencias de pulso mayores.

En una realización de la invención, en la cámara de flujo pulsátil se ajustan las presiones sistémicas reinantes hasta entre 10 y 240 mm Hg. Son preferibles presiones sistémicas entre 60 a 140, particularmente preferibles presiones sistémicas entre 80 y 120 mm Hg.

La válvula cardiaca homóloga o autóloga producida mediante el método de acuerdo con la invención presenta, respecto a las válvulas cardiacas convencionales mecánicas y biológicas, considerables ventajas. De este modo, la válvula cardiaca de acuerdo con la invención en su realización preferida se compone de tejido autólogo, es decir, de tejido del paciente que se tiene que someter a operación de válvula cardiaca, y de un material biocompatible estabilizador adicional, que se usa como construcción estructural. De este modo se evita una reacción de cuerpo extraño del receptor de la válvula respecto al implante. El riesgo de infecciones en receptores de una válvula cardiaca de acuerdo con la invención disminuye por lo tanto de forma considerable. No se requiere una terapia de anticoagulación; por lo tanto, se omite el riesgo de complicaciones hemorrágicas. La ventaja más convincente de la válvula cardiaca de acuerdo con la invención, sin embargo, es el hecho de que representa tejido vivo, y por lo tanto, después del implante, es capaz de regeneración y reparación permanente. Además, la válvula cardiaca de acuerdo con la invención, en su realización preferida, aúna las ventajas de una prótesis valvular cardiaca completamente autóloga y las muy buenas funciones hemodinámicas de prótesis valvulares cardiacas sintéticas. Finalmente, en las válvulas cardiacas de acuerdo con la invención, mediante el uso de la construcción estructural biocompatible, también se esperan con un uso más prolongado claramente menos modificaciones y/o disfunciones degenerativas, lo que aumenta claramente la vida útil de la válvula cardiaca y, por lo tanto, disminuye claramente el riesgo de una operación posterior.

La válvula cardiaca de acuerdo con la invención contiene una estructura interna de tejido conjuntivo, que, además de fibroblastos y miofibroblastos, contiene esencialmente componentes de una matriz extracelular normal, es decir, colágeno, elastina y glicosaminoglicanos. De este modo, las válvulas de acuerdo con la invención comprenden una parte correspondiente a la válvula nativa o a la valva nativa de la válvula, de colágeno (26-60%), elastina (2-15%) y glicosaminoglicanos correspondientes. Esta estructura interna de tejido conjuntivo construida sobre un soporte biológicamente degradable (armazón) y colonizada con células endoteliales se estabiliza adicionalmente mediante una construcción estructural biocompatible. La fijación de la estructura de tejido conjuntivo sobre la construcción estructural biocompatible se realiza como se ha descrito anteriormente. Tal prótesis valvular cardiaca aúna las ventajas de una prótesis valvular cardiaca autóloga y la muy buena capacidad de implante quirúrgico y función de prótesis valvulares cardiacas sintéticas.

Se ha podido demostrar que las válvulas cardiacas de acuerdo con la invención resisten caudales de más de
2000 ml/min, correspondientes a las condiciones de flujo que reinan en un corazón humano adulto. De este modo, de acuerdo con la invención se puede proporcionar una válvula cardiaca autóloga que sea incondicionalmente adecuada para el implante en pacientes infantiles y adultos.

Las siguientes Figuras y ejemplos explican la invención.

La Figura 1 muestra un soporte preformado a partir de un polímero (véase estrella) con anillo de sutura (véase flecha) después de la colonización con fibroblastos/miofibroblastos y células endoteliales.

La Figura 2 muestra una matriz colonizada tubular, de la que se pueden cortar anillos de 3,5 cm de anchura, que se colocan alrededor de la construcción estructural mostrada en la Figura 3.

La Figura 3 muestra una representación esquemática de la construcción estructural de la Fig. 3 con matriz colonizada conducida alrededor de la estructura de apoyo de tres puntas.

Ejemplo 1 Producción de soportes conduit (conductos) que llevan válvulas

Para la producción del soporte de conducto que lleva válvulas se usa un polímero de ácido poliglicólico no tejido (diámetro de fibras: 12-15 pm, densidad polimérica: 70 mg/ml, Albany International Research, Mansfield MA, EEUU). El polímero se recorta de forma que forma un conducto de 19 mm de diámetro. En este conducto se introducen 3 valvas triangulares. Este soporte se puede usar para producir válvulas de tres valvas, es decir, válvulas pulmonar, aórtica y tricúspide. Para válvulas mitrales se introducen dos valvas.

Ejemplo 2 Producción de una prótesis valvular cardiaca de tres valvas estabilizada por una construcción estructural

Se esteriliza un soporte de conducto que lleva válvulas de tres valvas y se introduce en un medio (DM EM, GIBCO BRL-Life Technologies) durante 24 horas para ablandar la superficie del polímero. A continuación, el soporte con forma de válvula se coloniza por centímetro cuadrado de superficie con 4 millones de fibroblastos cada 90 minutos en total 6 veces. Además, el soporte colonizado se incuba durante 2 semanas (CO_{2} al 5%, 37ºC, 95% de humedad). El medio se cambia cada 4 días en condiciones estériles. A continuación se aplican células endoteliales sobre el soporte con forma de válvula colonizado (3-4 millones de células endoteliales por centímetro cuadrado de superficie, 6 colonizaciones cada 90 minutos). Después de otras dos semanas adicionales, el tejido producido se aplica sobre una construcción estructural biológicamente compatible preparada y se une de forma firme con la construcción estructural mediante una sutura. A continuación se introduce toda la construcción en la cámara de flujo del biorreactor en condiciones estériles y se instala en posición de flujo. El biorreactor se llena a continuación con medio y se pone en el incubador celular. Después de que se haya producido, por el tubo de aire comprimido, la conexión con la bomba situada en el exterior del incubador, se comienza con flujos pulsátiles mínimos (50 ml/min). En etapas de 2 días, el caudal y la velocidad del pulso aumenta hasta 100 ml/min (pulso 10), 300 ml (pulso 25), 700 ml (pulso 35), 1000 ml (pulso 60) durante, en total, otros 4 días. A continuación (después de 14 días) se extrae el tejido formado en condiciones estériles y se suministra para el análisis bioquímico, histológico y mecánico.

Ejemplo 3 Producción de soportes con forma de válvula cardiaca de tres valvas estabilizados mediante una construcción estructural de varias puntas

Para la producción del soporte con forma de válvula cardiaca se usa copolímero de ácido poliglicólico (PGA) y polihidroxialcanoato (PHA) de 1-2 mm de grosor, no tejido (diámetro de fibras 12-15 \mum, densidad polimérica
70 mg/ml) y se corta de forma que se produce una cinta de 3,5 cm de anchura y 8,0 cm de longitud. Esta cinta se une en los puntos de los extremos usando material de sutura reabsorbible y se suelda adicionalmente en las zonas solapantes con aplicación de calor (60-70ºC). El anillo producido de este modo se vuelca sobre una construcción estructural de tres puntas (Dacron) y se une con la misma mediante sutura y usando adhesivo de fibrina. A continuación, las valvas individuales de válvulas cardiacas se moldean sobre la construcción estructural a su vez con aplicación de calor hasta la forma de tres valvas abombada típica de válvulas cardiacas.

Ejemplo 4 Producción de una prótesis de válvula cardiaca de tres valvas estabilizada por una construcción estructural de tres puntas

Se esteriliza un soporte de tres valvas estabilizado mediante una construcción estructural de tres puntas y se introduce en medio (DM, EM, GIBCO BRL-Life Technologies) durante 24 horas para ablandar la superficie del polímero. A continuación, el soporte con forma de válvula se coloniza por centímetro cuadrado de superficie con 4 millones de fibroblastos cada 90 minutos en total 6 veces. A continuación, el soporte colonizado se incuba durante 2 semanas (CO_{2} al 5%, 37ºC, 95% de humedad). El medio se cambia cada 4 días en condiciones estériles. A continuación se aplican células endoteliales sobre el soporte con forma de válvula colonizado (3-4 millones de células endoteliales por centímetro cuadrado de superficie, & colonizaciones cada 90 minutos). A continuación, toda la construcción se introduce en la cámara de flujo del biorreactor en condiciones estériles y se instala en la posición de flujo. El biorreactor se llena a continuación con medio y se pone en el incubador celular. Después de que se haya producido por el tubo de aire comprimido la conexión con la bomba situada en el exterior del incubador, se comienza con flujos pulsátiles mínimos (50 ml/min). En etapas de 2 días, el caudal y la velocidad del flujo aumentan hasta 100 ml/min (Pulso 10), 300 ml (pulso 25), 700 ml (pulso 35), 1000 ml (pulso 60) durante en total otros 4 días. A continuación (después de 14 días), se extrae el tejido formado en condiciones estériles y se suministra para el análisis bioquímico, histológico y mecánico.

Claims

1. Un método in vitro para la producción de una válvula cardiaca homóloga, que comprende las siguientes etapas:

-: fijación de la matriz sobre una construcción estructural (stent) no degradable o difícilmente degradable,

donde la matriz de tejido conjuntivo colonizada en un caso dado con células endoteliales se introduce, antes y/o después de la fijación sobre la construcción estructural, en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede someter a caudales crecientes, y el caudal se aumenta de forma continua o discontinua.

2. Un método in vitro para producir una válvula cardiaca homóloga, que comprende las siguientes etapas:

-: puesta a disposición de un soporte biológicamente degradable (armazón), que se une firmemente con una construcción estructural (stent) no degradable o difícilmente degradable,

-: introducción de la construcción estructural con la matriz de tejido conjuntivo unida a la misma en una cámara de flujo pulsátil, en la que se puede someter a caudales crecientes,

-: aumento continuo o discontinuo del caudal.

3. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el soporte biológicamente degradable es una matriz polimérica biológicamente degradable o una matriz biológica acelular.

4. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el soporte comprende un ácido poliglicólico (PGA), ácido poliláctico (PLA), polihidroxialcanoato (PHA), poli-4-hidroxibutirato (P4HB) o una mezcla de dos o más de estos polímeros.

5. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el soporte presenta una densidad polimérica entre 40 y 120 mg/cm^{3}, preferiblemente entre 50 y 80 mg/cm^{3}.

6. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el soporte es un polímero poroso con un tamaño de poro entre 80 y 240 \mum.

7. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las fibras del soporte presentan un diámetro entre 6 y 20 \mum, preferiblemente entre 10 y 18 \mum.

8. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el soporte es un armazón de tejido conjuntivo de una válvula cardiaca animal o humana.

9. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la etapa de la colonización con fibroblastos y/o miofibroblastos se repite entre 3 y 14 veces, preferiblemente entre 5 y 10 veces.

10. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque por centímetro cuadrado de soporte/matriz y etapa de colonización se usan aproximadamente entre 10^{5} y 6 x 10^{8} fibroblastos y/o miofibroblastos.

11. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la etapa de la colonización con células endoteliales se repite entre 3 y 14 veces, preferiblemente entre 5 y 10 veces.

12. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque por centímetro cuadrado de soporte/matriz y etapa de colonización se usan aproximadamente entre 10^{5} y 5 x 10^{8} células endoteliales.

13. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque los fibroblastos y/o miofibroblastos y/o células endoteliales son células humanas.

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14. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque los fibroblastos y/o miofibroblastos y/o células endoteliales son células autólogas.

15. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la construcción estructural se compone de un material biocompatible no degradable.

16. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la construcción estructural se compone de un material biocompatible difícilmente degradable.

17. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la fijación del soporte sobre la construcción estructural se realiza mediante técnica de sutura convencional y/o adhesivo de fibrina.

18. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque en la cámara de flujo pulsátil se ajustan caudales entre 5 ml/min y 8000 ml/min, preferiblemente entre 50 y 2000 ml/min.

19. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el caudal se aumenta a lo largo de un intervalo temporal de 1 semana a 12 semanas.

20. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el caudal inicial comprende entre 50 y 100 ml/min.

21. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque la frecuencia inicial de pulso comprende entre 5 y 10 pulsos/min.

22. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el caudal se aumenta hasta 5000 ml/min.

23. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque la frecuencia de pulso se aumenta hasta 180 pulsos/min.

24. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque en la cámara de flujo pulsátil se ajustan presiones sistémicas entre 10 y 240 mm Hg.

25. Una válvula cardiaca autóloga, caracterizada porque se ha producido según un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 24.