ES2290953T3 - Quelatos de lantanidos luminiscentes y procedimientos de uso. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA QUELATOS LANTANIDAS CAPACES DE TENER UNA LUMINISCENCIA INTENSA. LOS QUELATOS COMPRENDEN UN QUELATOR COVALENTE UNIDO CON UN SENSIBILIZADOR SEMEJANTE A QUINOLONA O SEMEJANTE A CUMARINA. LOS SENSIBILIZADORES EJEMPLARES INCLUYEN 2 O 4 QUINOLONAS, 2 O 4 CUMARINAS, O LOS DERIVADOS DE LOS MISMOS, COMO POR EJEMPLO, CARBOSTIRILO 124 (QUINOLONA-2 METILO-4-AMINO7), CUMARINO 120 (CUMARINO-2-METILO-4-AMINO-7), CUMARINO 124 (CUMARINO-2(TRIFLUOROMETILO)-4-AMINO-7), AMINOMETILTRIMETILPSORALENO, ETC. LOS QUELATOS FORMAN UNOS COMPLEJOS DE AFINIDAD ALTA CON LANTANIDAS, TALES COMO TERBIO O EUROPIO, A TRAVES DE GRUPOS QUELATORES, TALES CONO DTPA. LOS QUELATOS PUEDEN ESTAR UNIDOS A UNA AMPLIA VARIEDAD DE COMPUESTOS PARA CREAR ETIQUETAS ESPECIFICAS, SONDAS, REACTIVOS TERAPEUTICOS Y/O DIAGNOSITCOS, ETC. LOS QUELATOS TIENEN UN USO PARTICULAR EN LA TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE RESONANCIA ENTRE LOS COMPLEJOS LANTANIDAS-QUELATOS Y OTRO ACTIVO LUMINISCENTE, QUE ES A MENUDO UN FLUORESCENTE NO METALICO BASADO EN UN ACEPTADOR DE ENERGIA DE RESONANCIA. LOS METODOS PROPORCIONAN UNA INFORMACION UTIL SOBRE LA ESTRUCTURA, CONFORMACION, POSICION RELATIVA Y/O INTERACCIONES DE LAS MACROMOLECULAS.
Description
Quelatos de lantánidos luminiscentes y
procedimientos de uso.
El campo de esta invención es quelatos de
lantánidos luminiscentes.
Los marcadores luminiscentes (que incluyen
fluorescentes y fosforescentes) encuentran una amplia variedad de
aplicaciones en la ciencia, medicina e ingeniería. En muchos casos,
estos marcadores proporcionan sustituciones competentes por
radiomarcadores, cromógenos, colorantes opacos a la radiación, etc.
Han aumentado las mejoras en instrumentación fluorimétrica que
pueden conseguirse con sensibilidades y análisis cuantitativos
permitidos.
Quizás la única limitación más significativa al
uso de marcadores luminiscentes es generar una relación señal a
ruido aceptable. Las propiedades dependientes de marcadores tales
como máximos de absorción y emisión, desplazamiento de Stoke,
rendimiento de cuantos, etc. llevan a cabo la facilidad de
distinguir la señal de autofluorescencia o fluorescencia de fondo.
Por tanto, existe una necesidad continua de proporcionar marcadores
luminiscentes mejorados; especialmente marcadores luminiscentes
con luminiscencia de larga duración y/o un gran desplazamiento de
Stoke con largas emisiones de longitud de onda. Otras propiedades
útiles y deseables incluyen; síntesis fácil y rentable; estabilidad
química, especialmente en un entorno acuoso; capacidad de unión
conveniente a una amplia variedad de macromoléculas que incluye
proteínas y ácidos nucleicos; excitabilidad eficiente mediante un
láser conveniente; capacidad de intensa luminiscencia; la capacidad
de trabajar como buenos donantes de transferencia de energía por
resonancia luminiscente, permitiendo la determinación de distancias
moleculares más allá de 100 \ring{A}; y utilidad como fluorófos
endurecidos por radiación en microscopía de rayos X.
Patentes relevantes incluyen las patentes de los
EE.UU. números 4.637.988 (1987) y 4.837.169 (1989). Para una
solicitud de patente que usa criptatos de lantánidos como donantes
de transferencia de energía véase la patente de los EE.UU.
5.512.493 (1996).
Bailey y col. (1984)
Analyst 109, 1449-1450 informan de
DTPA-pAS-Tb. Para artículos previos
sobre otros quelantes de lantánidos véase Diamandis
(1992) Analyst 117, 1879-1884,
Canfi y col. (1989) Analyst 114,
1405-1406, Ando y col. (1993)
Biochimica et Biophysica Acta. 1102,
186-194, Georges y Ghazarian
(1993) Analytica Chimica Acta, 276,
401-409, Mathis y col. (1993) Clin.
Chem, 39, 1953 y Desai y col. (1993) J. Am.
Chem. Soc. 115, 11032, Seveus y col. (1992) 13,
329-338, Saavedra y Picozza
(1989) Analyst 114, 835-838, de
Brenndorff y col. (1993) en Proceedings, 4th Intnl
Conf on X-ray Microscopy, Chemogolovoka, Moscow
District, Rusia, Clark y col. (1993) Analytical
Biochemistry 210, 1-6.
Para una revisión actualizada de la
transferencia de energía por resonancia fluorescente, véase Selvin
(1994) Fluorescent Resonance Energy Transfer, en Biochemical
Spectroscopy, un tomo de Methods in Enzymology, Academic Press, Ed.
Kenneth Sauer, en prensa.
La invención proporciona:
- un quelato de lantánido que comprende un
quelante de lantánido covalentemente unido a un sensibilizador, en
el que dicho quelante comprende una pluralidad de grupos
carboxilato o fosfonato, en el que dicho quelato puede unir un
lantánido con una constante de equilibrio de al menos 10^{6}
M^{-1}, en el que un complejo de dicho quelato y dicho lantánido
puede mejorar la luminiscencia del lantánido y en el que dicho
sensibilizador está representado por la fórmula general:
en la que X comprende un átomo del
grupo 5 ó 6 del sistema periódico, en el que un primer átomo de
carbono en la posición 2-8 de dicho sensibilizador
que es el átomo de carbono en la posición 2 ó 4 está sustituido con
un átomo de oxígeno mediante un doble enlace covalente, y un
segundo átomo de carbono sencillo en la posición 2-8
de dicho sensibilizador que es el átomo de carbono en la posición
7 está sustituido con un grupo de enlace a través del que dicho
sensibilizador está covalentemente unido a dicho
quelante,
en el que un complejo de dicho quelato y un
lantánido que puede unir dicho quelato con una constante de
equilibrio de al menos 10^{6} M^{-1} puede ser de intensidad de
luminiscencia al menos superior al 500% de la de dicho
lantánido;
- una marca molecular que comprende un quelato
de la invención covalentemente unido a un reactivo selectivo por
analito;
- un procedimiento para mejorar la luminiscencia
de un lantánido, comprendiendo dicho procedimiento: formar una
mezcla de un quelato de lantánido de la invención y un lantánido
que puede unir dicho quelato con una constante de equilibrio de al
menos 10^{8} M^{-1} mediante el que se forma un complejo de
quelato de lantánido-lantánido luminiscente;
- un procedimiento para detectar un analito que
puede estar presente en una parte de una muestra mediante
luminiscencia, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
poner en contacto una parte de muestra con un
complejo luminiscente de un quelato de lantánido de la invención y
un lantánido que puede unir dicho quelato con una constante de
equilibrio de al menos 10^{8} M^{-1}, en el que dicho quelato
está covalentemente unido a un reactivo que puede unir
selectivamente dicho analito;
incubar dicha parte de muestra en condiciones en
las que dicho reactivo pueda unir selectivamente dicho
analito;
exponer dicha parte de muestra a luz a una
primera longitud de onda que puede inducir una primera transición
electrónica en dicho quelato;
detectar una emisión de luz de dicha parte de
muestra a una segunda longitud de onda, en el que dicha segunda
longitud de onda es más larga que dicha primera longitud de onda y
resulta de una segunda transición electrónica en dicho quelato;
en el que la detección de dicha emisión de luz
está relacionada con la presencia de dicha parte de muestra de
analito; y
- un procedimiento para detectar una distancia
entre una primera posición y una segunda posición en una parte de
una muestra mediante transferencia de energía por resonancia usando
un donante de quelato de lantánido luminiscente y un aceptor
orgánico de energía por resonancia, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
exponer una parte de muestra que comprende dicho
donante localizado en dicha primera posición y dicho aceptor
localizado en dicha segunda posición a luz a una primera longitud
de onda que puede inducir una primera transición electrónica en
dicho donante, en el que dicho donante comprende un complejo de un
quelato de lantánido de la invención y un lantánido que puede unir
dicho quelato con una constante de equilibrio de al menos 10^{8}
M^{-1}, y en el que el solapamiento espectral de la emisión del
donante y la absorción del aceptor es suficiente para permitir la
transferencia de energía de dicho donante a dicho aceptor como se
mide mediante extinción detectable de la intensidad de
luminiscencia del donante o tiempo de vida o aumento detectable en
la intensidad de luminiscencia del aceptor o tiempo de vida;
detectar al menos uno de:
la intensidad de una primera emisión de luz de
dicha parte de muestra a una segunda longitud de onda, en el que
dicha segunda longitud de onda es más larga que dicha primera
longitud de onda y resulta de una segunda transición electrónica en
dicho donante, en el que la intensidad de dicha primera emisión de
luz está relacionada inversamente con una distancia entre dicha
primera y segunda posición de dicha parte de muestra; y
la intensidad de una segunda emisión de luz de
dicha parte de muestra a una tercera longitud de onda, en el que
dicha tercera longitud de onda es más larga que dicha primera
longitud de onda y resulta de una transición electrónica en dicho
aceptor, en el que la intensidad de dicho segundo emisión de luz
está relacionada con una distancia entre dicha primera y segunda
posición de dicha parte de muestra.
Por tanto, los quelatos de lantánidos de la
invención comprenden un quelante de lantánido que está
covalentemente unido a un sensibilizador aromático heterocíclico
polinuclear de fórmula general:
en la que X comprende un átomo del
grupo 5 ó 6 del sistema
periódico.
El sensibilizador tiene un primer átomo de
carbono sustituido en la posición 2-8 con un átomo
de oxígeno mediante un doble enlace covalente y un segundo átomo de
carbono sencillo en la posición 2-8, diferente del
primer átomo de carbono en la posición 2-8,
sustituido con un grupo de enlace a través del que el
sensibilizador está covalentemente unido al quelante. En quelatos
preferidos, el sensibilizador tiene un tercer átomo de carbono
sustituido en la posición 2-8, diferente del primer
y segundo átomo de carbono en la posición 2-8. El
primer átomo de carbono en la posición 2-8 es el
átomo de carbono en la posición 2 ó 4 y el segundo átomo de
carbono es el átomo de carbono en la posición 7. Frecuentemente, el
sensibilizador y quelante están unidos mediante un grupo amina o
carboxilo, y/o el tercer átomo de carbono en la posición
2-8 es el carbono en la posición 4 y está
sustituido con un hidrocarburo o hidrocarburo sustituido con
halógeno. Sensibilizadores a modo de ejemplo incluyen 2- o
4-quinolonas, 2- o 4-coumarinas, o
derivados de las mismas, por ejemplo carboestirilo 124
(7-amino-4-metil-2-quinolona),
coumarina 120
(7-amino-4-metil-2-coumarina),
coumarina 124
(7-amino-4-(trifluorometil)-2-coumarina),
etc.
Los quelatos pueden formar complejos de alta
afinidad con lantánidos, tales como terbio o europio, mediante
grupos quelantes, tales como DTPA. Los quelantes comprenden una
pluralidad de grupos aniónicos estructuralmente impedidos tales
como grupos carboxilato o fosfonato. Las disoluciones de complejos
quelato-lantánido pueden ser de luminiscencia
intensa. Los quelatos pueden acoplarse a una amplia variedad de
compuestos para crear marcadores, sondas, reactivos diagnósticos
y/o terapéuticos específicos, etc.
Los complejos quelato-lantánido
son útiles como marcadores detectables en una amplia variedad de
aplicaciones. Generalmente, los procedimientos implican poner en
contacto una parte de muestra con un complejo luminiscente; exponer
la parte de muestra a luz a una primera longitud de onda que puede
inducir una primera transición electrónica en el quelato; y
detectar una emisión de luz de la parte de muestra a una segunda
longitud de onda que es más larga que la primera longitud de onda y
resulta de una segunda transición electrónica en el quelato.
Analitos específicos en la muestra pueden detectarse acoplando el
quelato a un reactivo que puede unir selectivamente analito.
Los quelatos también se usan en transferencia de
energía por resonancia entre complejos
quelato-lantánido y otro agente luminiscente,
frecuentemente un fluorescente no metálico basado en aceptor de
energía por resonancia. Por ejemplo, acoplando el donante del
complejo quelato-lantánido a un átomo y el aceptor a
un segundo átomo puede medirse una distancia entre dos átomos.
Generalmente, el solapamiento espectral de la emisión del donante y
la absorción del aceptor es suficiente para permitir la
transferencia de energía del donante al aceptor como se mide
mediante extinción detectable de la intensidad de luminiscencia del
donante del tiempo de vida o aumento detectable en la
luminiscencia del aceptor.
Si los átomos están en la misma molécula, los
procedimientos proporcionan información útil sobre la estructura o
conformación de la molécula. Por ejemplo, los procedimientos se
usan para monitorizar el estado de una reacción en cadena de la
polimerasa acoplando el donante y el aceptor a átomos separados de
un oligonucleótido de diagnóstico. Como aumenta la concentración de
ADN diana, el porcentaje de oligonucleótidos de diagnóstico
hibridados a ADN diana aumenta, que a su vez aumenta la distancia
media entre los átomos marcados. Este aumento en la distancia media
se detecta como una disminución en la transferencia de energía
entre el donante y el aceptor. Si los átomos están en diferentes
moléculas, los procedimientos proporcionan información útil sobre
las interacciones o localizaciones relativas de las dos
moléculas.
Se ha sintetizado una serie de nuevos compuestos
químicos que se unen a elementos lantánidos que incluyen terbio y
europio, y los sensibiliza eficientemente, es decir, permite que se
exciten eficientemente y posteriormente luminescen eficazmente. Los
compuestos también permiten acoplarse convenientemente a
macromoléculas. Estos compuestos se llaman quelatos de
lantánidos.
La importancia de la invención es múltiple:
primero, los quelatos de lantánidos pueden usarse como
sustituciones no isotópicas para marcadores radioactivos. Segundo,
pueden usarse como alternativas a tintes fluorescentes
convencionales, especialmente en aplicaciones de obtención de
imágenes, con potencial para contraste aumentado. Este contraste
aumentado se produce debido a que la luminiscencia de lantánidos es
extremadamente larga (0,6-2,3 milisegundos). Si se
usa una fuente de excitación por pulsos y detección controlada
(resuelta en el tiempo), la autofluorescencia intensa (ruido)
decaerá con los marcadores todavía emitiendo. Tal autofluorescencia
evita actualmente imágenes fluorescentes de muchas muestras de
tejido. Tercero, debido a que todos los quelatos están excitados
en la misma región espectral son posibles dos obtenciones de
imágenes en color. Cuarto, los quelatos de lantánidos pueden usarse
como donantes extremadamente eficaces en análisis de transferencia
de energía luminiscente. Este uso permite mediciones de distancias
más allá de 100 \ring{A}, distancias que actualmente no pueden
medirse con técnicas habituales de transferencia de energía de
fluorescencia, pero de importancia en biología estructural y
medicina.
medicina.
Los quelatos tienen varias ventajas importantes:
1. Son fáciles de sintetizar y unir a macromoléculas; 2. Se
excitan eficazmente por un láser de nitrógeno (a 337 nm); 3.
Algunos de ellos (por ejemplo, DTPA-cs124) pueden
sensibilizar tanto terbio como europio; 4. La luminiscencia de
lantánidos de los quelatos es extremadamente intensa; por ejemplo,
el quelato de terbio ilustrado más adelante luminesce
aproximadamente sesenta y cinco veces más intensamente que
paraaminosalicilato de DTPA (DTPA-pAS) cuando se
excita a 337 nm; 5. Son químicamente estables; 6. Pueden usarse
para marcar ácidos nucleicos y proteínas en condiciones químicas
usadas en sintetizadores automatizados (por ejemplo en la creación
de fosforamiditos en tecnología de ADN/ARN o tecnología de
proteínas); 7. Son donantes de transferencia de energía por
resonancia extremadamente buenos. Un elemento importante en el
éxito de los quelatos en la transferencia de energía es el hecho de
que hay muy poco solapamiento espectral o temporal entre la
emisión del sensibilizador y la emisión del lantánido. A
diferencia, DTPA-pAS tiene un solapamiento temporal
y espectral muy significativo y proporciona un donante pobre de
transferencia de energía; y, 8. Son útiles como fluoróforos
endurecidos por radiación en microscopía de rayos X.
Los quelatos de lantánidos comprenden un
sensibilizador aromático heterocíclico polinuclear de fórmula
general:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X comprende un átomo del
grupo 5 ó 6 del sistema
periódico.
Sensibilizadores adecuados pueden incluir una
variedad de estructuras adicionales que incluyen estructuras en las
que la fórmula general anterior comprende una parte estructuralmente
menor del sensibilizador. Al menos uno de los átomos de carbono en
la posición 2-8, en particular la posición 2 ó 4, se
oxida, preferentemente a un carbonilo (es decir, con doble enlace
a un átomo de oxígeno). Las posiciones se enumeran
convencionalmente: en el sentido contrario a las agujas del reloj
desde el heteroátomo que es la posición número 1. Frecuentemente,
otro átomo de carbono en la posición 2-8,
preferentemente la otra posición 2 ó 4, se sustituye (es decir, se
reemplaza un átomo de hidrógeno) con un grupo que comprende un
grupo alquilo, vinilo, oxi (que incluye hidroxilo, alcoxi,
carboxilo), carbonilo o nitrógeno sustituido (por ejemplo nitro,
amino que incluye aminas sustituidas, etc.), ciano, acetato, etc.,
o un derivado de los mismos, particularmente derivados de haluro.
Sensibilizadores a modo de ejemplo incluyen rodamina 560, 575 y 590,
fluoresceínas, 2- o 4-quinolonas, 2- o
4-coumarinas, o derivados de las mismas, por
ejemplo coumarina 445, 45 0, 490, 500 y 503,
4-trifluorometilcoumarina (TFC),
7-dietil-amino-cumarin-3-carbohidrizida,
etc., y especialmente carboestirilo 124
(7-amino-4-metil-2-quinolona),
coumarina 120
(7-amino-4-metil-2-coumarina),
coumarina 124
(7-amino-4-(trifluorometil)-2-coumarina),
aminometiltrimetilpsoralenos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como sensibilizadores puede usarse una amplia
variedad de derivados de la fórmula general anterior, siempre y
cuando el quelato resultante proporcione la unión de lantánido
requerida y mejora de la luminiscencia. Por luminiscencia mejorada
se indica que una disolución del quelato complejado con un
lantánido, cuando se expone a luz a una longitud de onda, el
lantánido complejado emite luz de mayor intensidad o tiempo de vida
que una muestra idéntica ausente de quelato. La mejora es
normalmente de intensidad superior a al menos el 50%,
preferentemente al menos el 500%, más preferentemente al menos el
5000%, lo más preferido al menos el 50.000%, en al menos un
conjunto de condiciones (por ejemplo concentración especificada,
sistema de disolvente, etc.), por ejemplo, véanse las condiciones
descritas en este documento.
Para excitar eficazmente el lantánido vecino,
los quelatos proporcionan generalmente máximos de absorción entre
150 y 750 nm, normalmente entre 200 y 650 nm, más normalmente entre
250 y 550 nm, lo más normal entre 300 y 450 nm. Generalmente, las
emisiones detectadas son al menos 50 nm, normalmente al menos 100
nm, más normalmente al menos 150 nm superiores a la luz incidente.
Por ejemplo, emisiones detectadas preferidas para terbio y europio
son 492 y 546 nm y 617 y 695 nm, respectivamente. Los coeficientes
de extinción generalmente superan 5.000, normalmente 8.000, más
normalmente 11.000.
La selección de combinaciones
quelante-sensibilizador particulares depende de la
aplicación prevista. Los criterios incluyen el lantánido
seleccionado, fuentes de fluorescencia de fondo potencial, agentes
de extinción, la fuente de luz incidente, etc. Funcionalmente, los
quelatos adecuados para un lantánido dado se identifican acoplando
un sensibilizador candidato a un quelante tal como DTPA,
complejándolo con el lantánido e identificando complejos que pueden
mejorar al lantánido luminiscente. Los detalles del ensayo se
describen más adelante.
Los quelatos pueden formar complejos de alta
afinidad con lantánidos, tales como terbio o europio. Los quelatos
unen al menos un lantánido, preferentemente al menos uno de terbio
y europio, con una constante de equilibrio de al menos 10^{6}
M^{-1}, preferentemente al menos 10^{8} M^{-1}, más
preferentemente al menos 10^{10} M^{-1} en al menos un conjunto
de condiciones descritas en este documento. Puede usarse una amplia
variedad de restos estructurales para proporcionar la afinidad de
unión del lantánido requerido, siempre y cuando el quelato
resultante proporcione la luminiscencia requerida. Sin embargo, el
lantánido está normalmente unido iónicamente mediante grupos
aniónicos tales como grupos carboxilato o fosfonato.
Frecuentemente, los quelatos comprenden una o
más partes quelantes estructuralmente distintas. Estas partes
quelantes comprenden una pluralidad de grupos aniónicos
estructuralmente impedidos tales como grupos carboxilato o
fosfonato. En una realización preferida, estas partes se
seleccionan de compuestos que por sí solos pueden funcionar como
quelantes de lantánidos con las afinidades de unión anteriormente
mencionadas. Por ejemplo, tales partes quelantes incluyen EDTA,
DTPA, DOTA, NTA, HDTA, etc. y sus análogos de fosfonato tales como
DTPP, EDTP, HDTP, NTP, etc. La afinidad del lantánido de quelato
también puede ser un resultado cooperativo (sinérgico) de la
interacción de una pluralidad de grupos funcionales. Por ejemplo,
uno o más restos de aminoácidos, por ejemplo glicina, del quelato
pueden colocarse estructuralmente para unir sitios de coordinación
vacantes del lantánido para mejorar la afinidad de unión
global.
Si el quelato comprende una parte quelante
estructuralmente distinta, normalmente está unido covalentemente a
la parte de sensibilizador, normalmente mediante un grupo de
enlace. Pueden usarse cualquier grupo de enlace que pueda ligar
covalentemente el sensibilizador con el quelante y no excluya la
unión de lantánido y luminiscencia requerida. Por tanto, el grupo
de enlace puede comprender una amplia variedad de estructuras.
Frecuentemente, el grupo de enlace comprende un grupo nitrógeno,
carboxilo, carbonilo o alcohol o un derivado de nitrógeno o
carboxilo y está covalentemente unido a un átomo de carbono en la
posición 2-8 en la fórmula general. El grupo de
enlace está frecuentemente unido covalentemente a uno de los átomos
de carbono anteriores en la posición 2-8,
frecuentemente en la posición 7. Grupos de enlace comunes son
aminas alifáticas y aromáticas, que pueden ser primarias o
secundarias, carboxilos y sulfhidrilos. El quelante y
sensibilizador se unen frecuentemente mediante un enlace amida,
anhídrido, disulfuro, tio-urea, tioéter, etc.
Los quelatos pueden sintetizarse de cualquier
modo conveniente. Muchos de los sensibilizadores y sensibilizadores
de quelantes descritos están comercialmente disponibles - otros se
sintetizan o modifican a partir de materiales de partida
comerciales según procedimientos convencionales. Los dos pueden
acoplarse mediante cualquier química conveniente, aunque se acoplan
más frecuentemente directamente mediante grupos funcionales como se
describen en este documento - por ejemplo, algunos de los quelatos
preferidos se basan en una reacción entre un anhídrido (por ejemplo
de ácido dietilenotriaminapentaacético, caDTPA) y un sensibilizador
(el DTPA actúa como el quelante, uniendo fuertemente el lantánido y
evitando la desactivación no radiativa mediante agua, y el
compuesto orgánico actúa como un sensibilizador, permitiendo una
excitación eficiente del lantánido). Estos quelatos pueden hacerse
mediante una modificación del procedimiento de Bailey y col. (1984)
Analyst 109, 1449-1450, en el que un sensibilizador
que contiene amina reemplaza pAS. El anhídrido de DTPA se disuelve
separadamente en un disolvente orgánico anhidro, normalmente
dimetilsulfóxido seco. Entonces, el anhídrido y el sensibilizador
seleccionado se mezclan y se dejan reaccionar durante
aproximadamente una hora. El anhídrido reacciona con la amina sobre
el sensibilizador para formar un enlace amida estable.
Si se desea, el quelato puede acoplarse a un
reactivo específico por analito, polímero orgánico, macromolécula
(especialmente biomoléculas similares a ácidos nucleicos y
proteínas), etc. de cualquier modo. Por ejemplo, para acoplamiento
covalente a una proteína (u otra amina que contiene macromolécula),
el quelato puede formarse originalmente usando el dianhídrido de
DTPA. Después de acoplarse al sensibilizador, la mezcla se añade
entonces a la macromolécula que contiene amina, bien en un
disolvente orgánico o en un disolvente inorgánico. Entonces, el
segundo dianhídrido reacciona con la(s) amina(s)
sobre la macromolécula, formando otro enlace amina. La reactividad
de la amina es suficientemente grande para que esa reacción pueda
realizarse en un medio acuoso (aún cuando el agua compita por la
reacción con el anhídrido).
Alternativamente puede usarse un ligador
bifuncional para acoplar el quelato y la macromolécula. Por
ejemplo, un ligador adecuado puede comprender tanto un grupo
reactivo de tiol (por ejemplo maleinida, haluro de acetilo, etc.)
como un grupo reactivo de amina (por ejemplo tiourea,
isotiocianato, etc.). Por ejemplo, el
mono-anhídrido de DTPA puede acoplarse a una
proteína reaccionando con hidrazida de
3-(2-piridilditio)propionilo (PDPH).
Los complejos quelato-lantánido
son útiles como marcadores detectables en una amplia variedad de
aplicaciones. Generalmente, los procedimientos implican poner en
contacto una parte de muestra con un complejo luminiscente de un
quelato y un lantánido; exponer la parte de muestra a luz a una
primera longitud de onda que puede inducir una primera transición
electrónica en el quelato; y detectar, ventajosamente con un
retardo en el tiempo para minimizar la detección de luminiscencia
de fondo de vida más corta, una emisión de luz de la parte de
muestra a una segunda longitud de onda que es más larga que la
primera longitud de onda y resulta de una segunda transición
electrónica en el quelato. Analitos específicos en la muestra
pueden detectarse acoplando el quelato a un reactivo que puede unir
selectivamente analito.
Los procedimientos pueden adaptarse a una amplia
variedad de muestras que incluyen muestras y extractos biológicos
(tales como fluidos fisiológicos, disoluciones de ácidos nucleicos
y/o proteináceas, cultivos microbianos, etc.), muestras
medioambientales (tales como fuentes de agua), reactivos
industriales, especialmente químicos, productos y desechos, etc.
Los quelatos pueden estar libres en disolución o contenidos en una
variedad de formas. Por ejemplo, los quelatos pueden fraccionarse
preferencialmente en o sobre una fase, sólida o líquida, tal como
adsorbidos sobre una superficie sólida o membrana o contenidos
dentro de una perla (por ejemplo microesferas de látex). Por tanto,
los procedimientos son útiles conjuntamente con clasificación (por
ejemplo clasificación celular), cromatografía, separaciones
electroforéticas, osmóticas y centrífugas. Los quelatos estables al
calor y organoestables se seleccionan para aplicaciones que
implican temperatura elevada (por ejemplo destilaciones,
combustiones, etc.) y extracciones orgánicas.
La primera longitud de onda (la de la luz
incidente) se selecciona para optimizar la última relación señal a
ruido de la emisión de lantánido. Frecuentemente, la luz incidente
se proporciona en una forma para minimizar la absorción de ruido.
Fuentes útiles incluyen láser (por ejemplo láser de nitrógeno,
helio-cadmio, láser de colorante, etc.) y lámparas
de arco (por ejemplo de alta presión, de mercurio, xenón, cuarzo,
etc.). Se prefieren particularmente los láser de nitrógeno porque
su frecuencia de emisión de 337 nm está próxima a un máximo de
absorción de lantánido. Similarmente, la segunda longitud de onda
se selecciona para optimizar la relación señal a ruido y en vista
de la instrumentación disponible.
Los quelatos objeto pueden acoplarse a una
amplia variedad de compuestos para crear marcadores, sondas,
reactivos diagnósticos y/o terapéuticos, etc. Ejemplos incluyen
biomoléculas tales como proteínas (anticuerpos, enzimas,
receptores, etc.), ácidos nucleicos (ARN, ADN, etc.), moléculas
bioactivas (fármacos, toxinas, etc.); sustratos sólidos tales como
vidrio o perlas poliméricas, láminas, fibras, membranas (por
ejemplo nailon, nitrocelulosa), portaobjetos (por ejemplo vidrio,
cuarzo) y sondas; etc.
Muchos de los quelatos son particularmente
susceptibles a lo que se denomina transferencia de energía por
resonancia de luminiscencia, o LRET. LRET es una versión
generalizada de transferencia de energía por resonancia
fluorescente, o FRET, una técnica ampliamente basada en ciencia de
polímeros, bioquímica y biología estructural. FRET puede usarse
para medir las distancias entre dos puntos que están marcados con
colorantes fluorescentes y están separados aproximadamente
10-75 \ring{A}. La técnica es valiosa debido a
que las mediciones pueden hacerse en condiciones fisiológicas (u
otras) con resolución casi de Angstrom y con la exquisita
sensibilidad de mediciones de fluorescencia. FRET se basa en una
transferencia de energía dependiente de una distancia de un
colorante fluorescente - el donante - a otros colorantes de
absorción o fluorescentes - el aceptor. El donante y aceptor están
situados específicamente en el sitio en los dos puntos que se
desee medir la distancia.
Aunque los lantánidos no fluorescen, el uso de
quelatos les permite que se exciten eficazmente. Entonces, una
transición de cuantos no fluorescentes del lantánido puede efectuar
una transferencia de energía no radiativa a un aceptor adecuado y
apropiadamente distanciado. Para efectuar la transferencia, en la
absorción del aceptor debe superponerse una emisión de lantánidos.
El par quelato-aceptor se selecciona para
solapamiento óptimo: para mediciones de grandes distancias se
prefiere mayor solapamiento. Debido a que los lantánidos tienen
tiempos de vida del orden de un milisegundo, la relación señal a
ruido de emisión sensibilizada del aceptor en LRET mejora mediante
la detección de emisión mediante resolución en el tiempo (retardo
del pulso) o modulación de fase. La transferencia de energía puede
detectarse mediante extinción del donante o, preferentemente
luminiscencia del aceptor.
Usando quelantes de lantánidos luminiscentes
como donantes (en lugar de colorantes convencionales), y
colorantes fluorescentes convencionales como aceptores, se ha
mejorado aproximadamente 100 veces la señal respecto al ruido de
LRET. Esta mejora permite mediciones más allá de 100 \ring{A},
una distancia que actualmente no se puede medir usando colorantes
fluorescentes pequeños convencionales. Este régimen de distancia es
importante en muchos problemas biológicos. Usando quelantes de
lantánidos como donantes también se hacen más exactas las
mediciones de distancias debido a que los quelantes minimizan la
incertidumbre en la dependencia de la orientación de la
transferencia de energía. También se ha demostrado la medición del
primer tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor, una
medición de LRET que elimina problemas asociados con el marcado no
específico o incompleto.
\newpage
Son útiles una amplia variedad de aceptores con
los donantes de quelato. Generalmente, el aceptor seleccionado
tendrá un máximo de absorbancia a una longitud de onda entre 25 nm
y 250 nm mayor que el del quelato donante. Aceptores a modo de
ejemplo incluyen colorantes de xanteno tales como fluorescentas y
rodaminas, coumarinas, colorantes de bencimida, colorantes de
fenantridina, colorantes de etidio, colorantes de acridina,
colorantes de cianina tales como naranja de tiazol, azul de tiazol,
Cy5, Cy5.5, Cy3, etc., colorantes de carbazol, colorantes de
fenoxazina, colorantes de porfirina, colorantes de quinolona,
proteínas ficobílicas, por ejemplo aloficocianina,
R-ficoeritrina, B-ficoeritrina,
colorantes Bodipy, etc. Los aceptores emiten generalmente en
intervalos visibles o infrarrojos.
LRET es particularmente útil para obtener
información estructural y cinética sobre macromoléculas en
disolución, en tiempo real. Por ejemplo, los oligonucleótidos
marcados en los dos extremos proporcionan señalización de LRET
detectable cuando están unidos por proteínas de unión de ácidos
nucleicos, por ejemplo factores de transcripción. Por consiguiente,
los procedimientos se usan para seleccionar potenciales agentes
terapéuticos que alteran la estructura o interacciones de
biomoléculas; por ejemplo, los agentes antivirales se seleccionan
para la capacidad de alterar las alteraciones inducidas por el
factor de transcripción viral en conformación de ácido
nucleico.
El procedimiento general basado en LRET para
detectar la distancia entre una primera posición y una segunda
posición en una parte de una muestra implica: exponer una parte de
muestra que comprende el complejo lantánido
donante-quelato localizado en la primera posición y
el aceptor localizado en la segunda posición a luz a una primera
longitud de onda que puede inducir una primera transición
electrónica en el donante. El solapamiento espectral de la emisión
del donante y la absorción del aceptor es suficiente para permitir
la transferencia de energía del donante al aceptor como se mide
mediante extinción detectable de intensidad de luminiscencia del
donante o tiempo de vida o aumento detectable en la intensidad de
luminiscencia del aceptor o tiempo de vida. Entonces se detecta la
intensidad de una primera emisión de luz de la parte de muestra a
una segunda longitud de onda, siendo la segunda longitud de onda
más larga que la primera longitud de onda y resulta de una segunda
transición electrónica en el donante, en el que la intensidad de la
primera emisión de luz está relacionada con una distancia entre la
primera y segunda posición. En otras palabras, cuanto más cerca
estén las posiciones, mayor es la transferencia de energía y mayor
es la extinción del donante. Alternativamente puede detectarse la
intensidad de una segunda emisión de luz de parte de muestra a una
tercera longitud de onda, siendo la tercera longitud de onda más
larga que la primera longitud de onda y resulta de una transición
electrónica en el aceptor, en el que la intensidad de la segunda
emisión de luz está relacionada inversamente con la distancia entre
la primera y la segunda posición de la parte de muestra. En otras
palabras, cuanto más cerca estén las posiciones, mayor es la
transferencia de energía y mayor es la luminiscencia del
aceptor.
Este procedimiento general tiene gran
aplicación, siempre que la distancia estática o dinámica entre dos
posiciones, por ejemplo dos átomos o moléculas, sea de interés. En
una realización específica, el procedimiento se usa para
monitorizar el estado de una reacción en cadena de la polimerasa.
En este documento, la parte de muestra comprende una cadena de
ácido nucleico diana que comprende una primera parte de cadena y
una cadena de ácido nucleico de diagnóstico marcada proximal a un
extremo con el aceptor y proximal al otro extremo con el donante
(es decir, que comprende un primer átomo covalentemente unido al
donante y un segundo átomo covalentemente unido al aceptor, estando
el primer y segundo átomo separados por una segunda parte de
cadena). La primera y segunda parte de cadena son suficientemente
complementarias para hibridarse en condiciones de apareamiento, y
la segunda parte de cadena es de longitud suficiente para
proporcionar una diferencia detectable en la transferencia de
energía total del donante al aceptor cuando la primera y segunda
parte de cadena se hibridan como se compara con la transferencia de
energía total del donante al aceptor cuando la primera y segunda
parte de cadena no están hibridadas. La diferencia detectable se
mide como al menos un aumento de una extinción detectable de
luminiscencia del donante o aumento detectable en la luminiscencia
del aceptor, y la distancia entre el primer y segundo átomo indica
si las cadenas de ácido nucleico se han hibridado. Por tanto, a
medida que avanza la reacción, el aumento progresivo en la cantidad
de ácido nucleico diana se refleja en una disminución progresiva
en la transferencia de energía.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
En este ejemplo se ilustra la técnica de
transferencia de energía por resonancia luminiscente (LRET)
introduciendo un quelato de terbio luminiscente como donante, y un
colorante orgánico, tetrametilrodamina, como aceptor. Los resultados
concuerdan con una teoría de Förster de transferencia de energía,
siempre que se usen los parámetros apropiados. En general, el uso
de donantes de lantánidos y, en particular, este par, tiene muchas
ventajas respecto a pares de FRET más convencionales que se basan
mucho en colorantes orgánicos. La distancia a la que se produce el
50% de transferencia de energía (R_{o}) es grande, 65 \ring{A};
el tiempo de vida del donante es exponencial sencillo y largo
(milisegundo), haciendo fáciles y exactas las mediciones del tiempo
de vida; la incertidumbre en el factor de orientación
(\kappa^{2}) que crea incertidumbre en las distancias medidas se
minimiza por las múltiples transiciones electrónicas del donante y
el largo tiempo de vida; la emisión sensibilizada del aceptor puede
medirse con poco o sin fondo interferente, dando una mejora > 25
veces en la señal respecto al fondo respecto a pares
donante-aceptor habituales. Se espera que estas
mejoras hagan distancias mayores de 100 \ring{A} que pueden
medirse mediante LRET. También se informa de la medición del tiempo
de vida de la emisión sensibilizada, una medición que es
completamente insensible a la concentración total y marcado
incompleto.
En FRET, una molécula de donante fluorescente
transfiere energía mediante una interacción
dipolo-dipolo no radiativa a una molécula de
aceptor (que normalmente es una molécula fluorescente). FRET es un
técnica espectroscópica habitual para medir distancias en el
intervalo de 10-70 \ring{A}. Con la transferencia
de energía, que depende de la distancia R^{-6} entre el donante y
el aceptor, se reducen el tiempo de vida del donante y el
rendimiento de cuantos, y aumenta la fluorescencia del aceptor, o
se sensibiliza (1). FRET se usa frecuentemente tanto en la ciencia
de los polímeros como en biología estructural y se ha usado
recientemente para estudiar complejos macromoleculares de ADN, ARN
y proteínas (2-4).
A pesar de estos éxitos, FRET ha tenido varios
errores graves que han limitado su utilidad. Primero, la distancia
máxima que puede medirse ha sido inferior a la óptima para muchas
aplicaciones biológicas. Segundo, el tiempo de vida de fluoróforos
donantes comúnmente usados es corto (normalmente unos pocos
nanosegundos) y multiexponencial, haciendo difíciles las mediciones
del tiempo de vida y de exactitud limitada. Tercero, la relación
señal a ruido de la emisión sensibilizada ha sido baja debido a
fluorescencia interferente del donante y de excitación directa del
aceptor. Cuarto, han sido difíciles distancias precisas para
determinar porqué la eficiencia de transferencia de energía depende
no sólo de la distancia R^{-6} entre el donante y aceptores, sino
también de su orientación relativa, como se expresa por el factor
\kappa^{2}. (La eficiencia de transferencia de energía = 1/
(1+R^{6}/R_{o}^{6}), en la que R_{o} es una función de
\kappa^{2}: véase el apéndice).
Los elementos lantánidos luminiscentes terbio y
europio son donantes de FRET atractivos porque vencen
potencialmente muchos de estos problemas. Debido a que la emisión
de lantánidos no se produce de una transición singlete a singlete,
la transferencia de energía usando donantes de lantánidos se llama
más exactamente transferencia de energía por resonancia de
luminiscencia (LRET). Los lantánidos se han usando principalmente
en FRET potenciada por difusión (5) y como sustituciones isomorfas
en proteínas de unión a calcio (6-8). Además,
Mathis ha usado criptatos de europio con la aloficocianina
multicromófora para lograr una R_{o} extremadamente larga de 90
\ring{A} (9). Recientemente se han presentado resultados que
muestran numerosas ventajas de usar un
policarboxilato-quelato de europio como donante
conjuntamente con un colorante orgánico tal como
CY-5 como aceptor (10). En este documento se
amplían estos resultados al uso de terbio como donante.
Como un sistema de modelo, se une covalentemente
donante y aceptor a los extremos 5' de una serie de oligómeros de
ADN de cadena doble de longitud variable. El uso de ADN en un
sistema de modelo tal se ha mostrado previamente como válido para
las mediciones de transferencia de energía entre colorantes
orgánicos (11).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de oligómeros de ADN marcados. Los ADN
complementarios de 10, 12, 14 bases de longitud se sintetizaron
usando procedimientos de fosforamidita habituales. Se incorporó un
grupo amino unido mediante un ligador de seis carbonos (Glen
Research) en el extremo 5'. La secuencia del aceptor fue la usada
por Clegg y col. (11):
5'-CCA-CTC-TAG-G-3'
(10 pb);
5'-CCA-CTG-GCT-AGG-3'
(12 pb);
5'-CCA-CTG-CTG-CTA-GG-3'
(14 pb). El 5-isómero de
tetrametilrodamina-isotiocianato (sondas
moleculares. T-1480: abreviatura: TMR) se unió
mediante procedimientos habituales y se purificó mediante HPLC de
fase inversa. Los coeficientes de extinción para TMR unida a ADN se
determinaron que eran e_{260} = 33 mM^{-1}cm^{-1} y
e_{556} = 93 mM^{-1}cm^{-1}. La cadena de donante
estaba constituida por ADN complementario marcado en el extremo 5'
con un quelato de terbio. El quelato es ácido
dietilenotriaminapentaacético acoplado a un colorante láser,
carboestirilo 124 (DTPA-cs124). Los detalles de la
síntesis de quelatos de donantes se presentarán en cualquier sitio.
También se sintetizaron los oligómeros de ADN sin marcar.
Condiciones de hibridación: las cadenas de
donante y aceptor se mezclaron en relación deseada en un tampón
basado en D_{2}O que contiene Tris 10 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 10
mM, NaCl 150 mM. Los experimentos también se realizaron en un
tampón basado en H_{2}O. La concentración de cadena de donante
fue de aproximadamente 200 nM. Los oligómeros se apararon mediante
calentamiento hasta 75ºC y se enfriaron hasta la temperatura final
(22ºC o 5ºC) durante 15 minutos.
Espectroscopia: las mediciones de absorción se
hicieron en un espectrómetro Hewlett Packard 8452A. Las mediciones
de fluorescencia en estado estacionario fueron en un fluorimetro
SPEX Fluorolog. Las mediciones de luminiscencia resuelta en el
tiempo y controlada se hicieron en un espectrómetro construido en
laboratorio utilizando detección de ángulo recto con un láser de
nitrógeno pulsado Laser-Photonics (ancho de pulsos
de 5 ns, velocidad de repetición de 40 Hz), un detector de conteo
de fotones de arseniuro de galio, un discriminador controlado (Ortec
584) y un contador multicanal con 2 \mus de resolución en el
tiempo. También se realizaron estudios de polarización, aunque los
experimentos de transferencia de energía que se realizaron sin un
analizador dieron los mismos resultados que aquellos usando un
analizador. Por tanto, rutinariamente se omitió un analizador. Se
usó un portacubetas regulado por temperatura y una cubeta de 3 mm x
3 mm de cuarzo. Los datos del tiempo de vida se ajustaron usando el
software TableCurve (Jandel Scientific).
\newpage
La estructura del quelato donante,
DTPA-csl24-Tb, y el sistema de
modelo usado para la transferencia de energía se muestra a
continuación:
El quelato donante tiene varias características
importantes. Primera, el quelato une terbio (y europio)
extremadamente fuerte - la titulación con un exceso de 100 veces de
EDTA (K_{b} \leq 10^{17} M^{-1}) no puede desplazar una
cantidad medible de terbio. Esto está de acuerdo con otros
quelantes basados en DTPA (12) y garantiza que no hay terbio libre.
Segundo, el quelato permite unión específica a sitio de terbio a
macromoléculas. Tercera, el quelato protege el terbio de mecanismos
de desexcitación no radiativa, dando probablemente como resultado
un rendimiento de cuantos para luminiscencia de terbio próxima a la
unidad en D_{2}O (véase el apéndice I). Finalmente, la unión
covalente del colorante láser carboestirilo 124 supera la sección
transversal de absorción extremadamente baja de terbio (<1
M^{-1}cm^{-1}) (6). La cs124 absorbe luz
(\varepsilon_{328} = 11,000 M^{-1}cm^{-1};
\varepsilon_{338}= 8,000 M^{-1}cm^{-1}) y debido a su intima
proximidad al terbio, transfiere energía al lantánido (13, 14).
Los resultados muestran las características
espectrales del quelato de terbio y la tetrametilrodamina que lleva
a transferencia de energía eficiente y una R_{o} larga de 65
\ring{A} en D_{2}O (60 \ring{A} en H_{2}O). R_{o} se
calcula a partir de ecuaciones habituales (véase el apéndice). En
este documento se mencionan dos aspectos inusuales de usar un
quelato de lantánido como donante: 1) puede ajustarse la eficiencia
de transferencia de energía, y por tanto optimizarse R_{o} para
el sistema particular que está midiéndose, simplemente variando la
relación de H_{2}O a D_{2}O en el disolvente. La relación
H_{2}O/D_{2}O afecta la eficiencia de transferencia de energía
alterando el rendimiento de cuantos del lantánido (q_{D}) en el
quelato (q_{D} = 1 en D_{2}O; q_{D} = 0,6 en H_{2}O; véase
el apéndice I) (15). 2) se minimiza la dependencia de la
orientación del procedimiento de transferencia de energía porque el
terbio tiene múltiples transiciones electrónicas degeneradas y, por
tanto, es un donante isótropo, aunque estacionario. Esto minimiza
la incertidumbre en la distancia medida debido a efectos de
orientación de +/- 12% en el peor caso (16).
Los resultados también muestran la naturaleza
con sumamente muchas puntas de la emisión de terbio. La extinción
del donante puede medirse sin interferencia de la emisión del
aceptor a 492 nm y 546 nm. Similarmente, la emisión sensibilizada
del aceptor puede medirse sin interferencia significativa de la
luminiscencia del donante debido a que el terbio es casi silencioso
a aproximadamente 570 nm, en el que la TMR es un 70% de su máximo
de emisión. La señal del terbio a 570 nm es 240 veces inferior a su
máximo, 546 nm.
Cuando se mida la emisión sensibilizada también
podemos eliminar la fluorescencia directa del aceptor mediante
discriminación temporal. Se usa excitación por pulsos y sólo se
recogen datos después de un retraso de 90 \mus, tiempo durante el
que ha decaído la fluorescencia directa de la rodamina. (La
fluorescencia del aceptor, con un tiempo de vida de unos pocos
nanosegundos, decae rápidamente; también se encontró un pequeño
componente - probablemente o fluorescencia retrasada o un artefacto
detector - que decae dentro del retardo de 90 \mus.) El donante,
debido a su tiempo de vida de milisegundos, permanece excitado y
puede transferir energía al final del periodo de retardo. Por
consiguiente, cualquier señal que aparece aproximadamente a 570 nm
después del retardo sólo es debida la emisión sensibilizada, es
decir, fluorescencia del aceptor debido a transferencia de
energía.
Los resultados muestran los resultados de un
experimento de transferencia de energía en un ADN
10-mero parcialmente hibridado. La transferencia de
energía media es el 77%. La señal respecto al fondo de la emisión
sensibilizada a 570 nm es 54:1. En comparación, la señal respecto
al fondo para la emisión sensibilizada cuando se usa
fluoresceína-rodamina como pares de transferencia de
energía en el mismo ADN es aproximadamente 1. Debido al ruido es
tan pequeño en nuestro caso, las señales pequeñas pueden medirse y,
por tanto, se espera que sean posibles las distancias mucho mayores
que R_{o}. Horrocks y Bruno, por ejemplo, han demostrado la
capacidad para medir distancias de 4R_{o} (R_{o} = 3,1
\ring{A}) utilizando la emisión sensibilizada de fondo oscuro de
la transferencia de energía de tirosina respecto a terbio (6).
Se puede aislar la señal de emisión
sensibilizada de la luminiscencia del donante incluso en regiones
en las que la luminiscencia del donante es significativa. En un
procedimiento análogo al usado por Clegg y col. (11), la
luminiscencia del donante puede restarse a todas las longitudes de
onda, quedando la señal de señal de emisión sensibilizada.
Entonces, la eficiencia de energía transferida es simplemente el
área de la emisión sensibilizada corregida dividida por el área
corregida total:
(1)Eficiencia
de transferencia de energía = (f_{A}/q_{A}) / (f_{A}/q_{A} +
f_{D})
en la que f_{A} es el área bajo
la curva de emisión sensibilizada, q_{A} es el rendimiento de
fluorescencia de cuantos del aceptor y f_{D} es el área bajo la
curva de la luminiscencia del donante. Puede determinarse el
rendimiento de cuantos del aceptor mediante una comparación con los
datos de extinción del donante. Basado en un rendimiento de cuantos
de 0,174 para TMR (véase el apéndice II), la ecuación 1 da una
transferencia de energía media del
77%.
Los resultados muestran los datos de tiempos de
vida en una serie de oligómeros de ADN 10-meros. La
señal (de ADN de cadena sencilla) con sólo donante es exponencial
sencilla con un tiempo de vida de 2,14 ms. (Un oligómero de ADN
marcado con terbio hibridado a su complemento es exponencial
sencilla con un tiempo de vida de 2,80 ms. La diferencia en el
tiempo de vida entre ADN con sólo terbio de cadena doble y de cadena
sencilla es probablemente debido a las diferentes velocidades
relativas que se producen de simetrías diferentes que rodean el
terbio, en vez de diferentes rendimientos de cuantos). Una
titulación con cantidades crecientes de cadena de aceptor muestra
extinción biexponencial del donante. El componente de largo tiempo
de vida se corresponde con ADN de cadena sencilla con sólo donante
sin hibridar; el componente corto se corresponde con aquellas
cadenas de terbio que están hibridazas con cadenas de aceptor. Como
se espera, aumentar la cantidad de cadena de aceptor aumenta la
amplitud del componente corto y disminuye la amplitud del
componente largo, mientras que sus tiempos de vida permanecen
invariables. Que el componente de largo tiempo iguale la señal con
sólo donante es un control interno importante que muestra que la
transferencia intermolecular de energía no es significativa. El
tiempo de vida del componente corto se corresponde con una
transferencia de energía en el complejo
donante-aceptor del 88% (1-331
\mus/2809 \mus). En comparación, la transferencia de energía en
el mismo ADN 10-mero con los mismos ligadores de
seis carbonos usando el par fluoresceína-TMR es del
23% (11).
En el cálculo de la eficiencia de transferencia
de energía basada en la curva de emisión sensibilizada se ignora
el componente de tiempo corto ya que esto es debido a señal
residual que se produce de la fluorescencia directa del aceptor.
(Para estos datos no se usó control). Múltiples experimentos
muestran que el componente de tiempo largo puede repetirse dentro
del 10% en el peor caso, y normalmente puede repetirse dentro de
un pequeño porcentaje. Sin embargo, el componente de tiempo corto
es sumamente variable debido a que hay una punta muy corta, muy
larga debido a fluorescencia directa que no puede resolverse.
En un exceso de dos veces de cadena de aceptor
todavía hay un componente sin hibridar al 10-12%. Se
ha observado un fenómeno similar con oligómeros marcados con
colorante (17) y en experimentos de FRET con europio sustituido en
el quelato (10). En este caso no parece ser un simple fenómeno de
la temperatura de fusión ya que está presente tanto a 5ºC como a
22ºC. La razón para esto está en investigación. Es improbable que
esta señal residual de donante sin extinguir sea debida a
fotofísica fundamental del lantánido ya que esto requeriría una
transición de dipolo magnético sin acoplar, una situación que no
está presente ya que toda la luminiscencia del terbio (y europio)
se produce a partir del mismo estado excitado (18, 19).
Los resultados también muestran el tiempo de
vida de la emisión sensibilizada a 570 nm correspondiente a la
extinción biexponencial del donante. El decaimiento de la emisión
sensibilizada puede ajustarse exactamente a la ecuación: y =
33%exp(-t/45 \mus) + 67%exp(-t/326 \mus). El componente de 45
ms se corresponde con la fluorescencia directa del aceptor o un
artefacto detector (que puede eliminarse mediante supresión). El
componente de 326 \mus es debido a la transferencia de energía en
el complejo donante-aceptor y concuerda
extremadamente bien con la extinción de 329-331
\mus del componente del donante. Obsérvese que después de
aproximadamente 90 \mus, las únicas especies que contribuyen a la
señal de emisión sensibilizada es el complejo
donante-aceptor - no contribuyen el donante solo o
el aceptor solo. Esto minimiza significativamente el problema de
marcado incompleto. La señal del tiempo de vida de la emisión
sensibilizada también es insensible a concentración total, a
rendimientos de cuantos y a efectos de transferencia de no energía
que pueden producir extinción del donante.
La tabla 1 resume los datos de tiempo de vida y
transferencia de energía en dúplex de ADN marcados con
donante-aceptor de 10, 12 y 14 pb de longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de múltiples experimentos que muestran
tiempos de vida de extinción del donante y emisión sensibilizada
para un ADN de longitud dada siempre concuerdan dentro del 10%,
normalmente dentro de un pequeño porcentaje. Como se espera, hay
una disminución en la transferencia de energía con distancias
crecientes. Para comparar se incluyen las distancias determinadas
por Clegg y col. usando fluoresceína-TMR (11).
Ambos resultados concuerdan con la geometría de doble hélice del
ADN, aunque diferentes condiciones de sales y tiempos de vida del
donante conducen a diferentes posiciones del colorante, y por tanto
a diferentes distancias medidas. Se ha ajustado las distancias
usando el modelo de Clegg y col. de la hélice de ADN y se han unido
colorantes. Con sólo tres puntos de datos no es posible resolver
únicamente todos los parámetros en el modelo, pero sin embargo, se
logra un buen ajuste a su modelo si se supone que el quelato de
terbio y/o aceptor están bastante próximos a la hélice de ADN. Esto
reduce la modulación vista en sus datos de FRET, que se produce
debido a la geometría helicoidal del ADN y al hecho de que su
donante y aceptor estén alejados de la hélice (19 \ring{A} y 13
\ring{A}, respectivamente). Esta diferencia es cualitativamente
razonable debido a que se espera el tiempo de vida largo del
donante permita la difusión forzada del donante y aceptor dentro de
los limites colocados por los ligadores de seis carbonos, y debido
a la gran fuerza fónica usada aquí, que minimiza la repulsión de
cargas.
En resumen, los datos concuerdan con la
geometría del ADN de doble hélice si los datos de transferencia de
energía están derivados basados en el mecanismo
dipolo-dipolo de tipo Förster. Numerosas ventajas
técnicas de transferencia de energía por resonancia de
luminiscencia hacen que ésta sea una técnica muy apta para
mediciones en macromoléculas biológicamente interesantes.
Apéndice
I
Cálculo de R_{o}: R_{o}, la distancia a la
que el 50% de la energía del estado excitado del donante se
transfiere al aceptor, se calcula a partir de ecuaciones habituales
(1):
(2)R_{o} =
(8,79 x 10^{-5} J \kappa^{-2} n^{-4} q_{D})^{1/6}
\ring{A}
en la que q_{D} es el rendimiento
de cuantos de luminiscencia para la emisión del donante en ausencia
de aceptor, J es el solapamiento espectral de la emisión del
donante (f_{D}) y la absorción del aceptor (e_{A}) (J =
\intfD\varepsilon_{A}\lambda^{4}d\lambda), n es el índice de
refracción y \kappa^{2} es un factor geométrico relacionado con
los ángulos relativos de los dos dipolos. En este documento se
evalúa cada uno de los términos en la ecuación 2 y se trata su
incertidumbre.
El índice de refracción, n, varía de 1,33 para
agua a 1,39 para muchas moléculas orgánicas. Se ha usado 1,33. Una
integración numérica lleva a una integral del solapamiento J de
3,8x10^{15} nm^{4}M^{-1}. Éste es un límite superior para J
ya que el pico de terbio a 546 nm puede producirse a partir de
dipolo magnético, además de transiciones de dipolo eléctrico (19),
y el primero no transfiere significativamente energía (18). La
fracción de contribución de dipolo magnético puede calcularse
teóricamente (20, 21), o el problema puede evitarse usando la línea
de terbio a 492 nm, que es conocida por ser exclusivamente una
transición de dipolo eléctrico (20).
Si se usan colorantes orgánicos en FRET,
\kappa^{2} es frecuentemente una fuente significativa de
incertidumbre y en el peor caso puede variar de 0 a 4 (22). Sin
embargo, con terbio, la emisión se produce de múltiples
transiciones electrónicas que limitan \kappa^{2}: 1/3 <
\kappa^{2} < 4/3. Además, es probable que el aceptor pueda
experimentar movimiento rotacional durante el tiempo de vida del
donante de milisegundos. Esto limita adicionalmente \kappa^{2} y
se asume \kappa^{2} = 2/3, correspondiente a una orientación al
azar que rota rápidamente dentro del tiempo de vida del
donante.
El rendimiento de cuantos de luminiscencia del
terbio, q_{D}, es difícil de determinar con exactitud debido a la
absorbancia intrínsecamente baja del terbio. Sin embargo, q_{D},
está probablemente muy próximo a 1 en D_{2}O (véase más
adelante). Obsérvese que cuando se calcula R es importante usar el
rendimiento de cuantos de terbio (= 1 en D_{2}O), no el
rendimiento de cuantos de todo el quelato. El rendimiento de
cuantos de todo el quelato es igual al rendimiento de cuantos de
lantánido por la fracción de energía absorbida por la cs 124 que se
transfiere al lantánido.
Rendimiento de cuantos de emisión de lantánidos:
hay varias líneas de evidencia (indirecta) que argumentan q_{D}
= 1 en D_{2}O. Primera, la emisión se produce de electrones de la
corteza interna 4f-4f que están protegidos del
disolvente y otras fuentes de desexcitación no radiativa por el
quelato. Las 1,2 moléculas de H_{2}O en la esfera de coordinación
primaria del terbio en el quelato (datos no mostrados) son la
fuente primaria de desexcitación no radiativa, pero éstas están
sustituidas por D_{2}O, que no desactivan significativamente
terbio (15, 23). Los ligandos no acuosos, grupos carboxilato y
nitrógenos de amina son extremadamente ineficientes en la
desactivación del estado excitado del terbio (23). Mediante
estudios de temperatura (24) también se ha buscado extinguir los
efectos de la cs124 y no se ha encontrado ninguno.
Una segunda línea de evidencia que soporta
q_{D} = 1 en D_{2}O procede del trabajo de Elbanowski y
colaboradores, que midieron directamente el rendimiento de cuantos
de una mezcla 1:3 de terbio:EDTA en H_{2}O y encontraron un
valor de 0,54 (25). Esta medición es difícil y de exactitud
desconocida, pero sin embargo sugiere un alto rendimiento de
cuantos incluso en H_{2}O, y se espera que el rendimiento de
cuantos en D_{2}O sea considerablemente mayor. (Probablemente hay
2 moléculas de agua coordinadas con el terbio en su complejo
(23)).
La tercera línea de evidencia procede de los
experimentos de transferencia de energía usando terbio como donante
en termolisina (8, 26), y como aceptor en calmodulina invertebrada
(6), en la que la suposición (algunas veces implícita) de
rendimiento de cuantos unidad en D_{2}O concuerda bien con datos
de cristalografía de rayos X.
Apéndice
II
Cálculo del rendimiento de cuantos de
fluorescencia del aceptor: comparando los datos del tiempo de vida
de extinción del donante con las áreas y usando la ecuación es
posible medir el rendimiento de cuantos del aceptor. Esto en un
procedimiento general y nuevo para medir rendimientos de cuantos de
cualquier colorante cuya absorción solape la emisión de terbio (o
europio). Tiene la ventaja respecto a más procedimientos
convencionales de medir rendimientos de cuantos en los que la
medición sólo implica una muestra - la muestra actual de interés -
en vez de comparar una referencia con la muestra.
Para evaluar el rendimiento de cuantos de TMR se
supone que la incógnita en la ecuación 1 es q_{A} y la eficiencia
de transferencia de energía media toma el 77,6%. Basado en las
áreas integradas (620 para f_{A} y 1032 para f_{D}, en unidades
arbitrarias), esto da q_{A} = 0,174. En comparación,
tetrametilrodamina libre en solución salina tamponada con fosfato
tiene un rendimiento de cuantos de 0,25, como se mide mediante
técnicas habituales (27).
1) Cantor y Schimmel,
(1980) Biophysical Chemistry. (W. H. Freeman y Co.,
San Francisco); 2) Clegg, (1992) Methods
Enzymol. 211:353-388; 3) Selvin,
(1994) Methods Enzymol. 246, (en prensa); 4)
Coker y col., (1994) Resonance Energy
Transfer. (VCH Publishers, Inc.) (en prensa); 5) Stryer
y col., (1982) Annu. Rev. of Biophys. y Bioengin.
11:203-222; 6) Bruno y col., (1992)
Biochem. 31:7016-7026; 7) Cronce y
Horrocks, (1992) Biochem.
31:7963-7969; 8) Horrocks, y col.,
(1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
72:4764-4768; 9) Mathis, (1993)
Clin. Chem. 39:1953-1959; 10) Selvin
y col., (1994) JACS (en prensa); 11) Clegg y
col., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU.
90:2994-2998; 12) Oser y col., (1990)
Anal. Biochemistry 191:295-301; 13)
Abusaleh y Meares, (1984) Photochem. &
Photobiol. 39:763-769; 14) Kirk y col.,
(1993) J. Phys. Chem. 97:10326-10340;
15) Horrocks y col., (1977) JACS
99:2378-2380; 16) Stryez, (1978)
Ann. Rev. Biochem. 47:819-46; 17)
Cooper y Hagerman, (1990) Biochemistry
29:9261-9268; 18) Dexter, (1953) J.
Chem. Phys. 21:836-850; 19) Bunzli,
(1989) Luminescent Probes, ed. Bunzli, J.-C.G., Choppin, G.R
(Elsevier, Nueva York), pp. 219-293; 20)
Carnall y col., (1968) J. Chem. Phys.
49:4412-4423; 21)
Gorller-Walrand y col., (1991) J.
Phys. Chem. 95:3099-3106; 22) Dale y
col., (1979) Biophys. J. 26:161-194;
23) Horrocks y Sudnick, (1979) J. Am. Chem.
Soc. 101:334-350; 24) Alpha y col.,
(1990) Photochem. y Photobiol.
52:299-306; 25) Elbanowski y col.,
(1989) Monat. Chem. 120:699-703; 26)
Berner y col., (1975) Biochem. & Biophys. Res.
Commun. 66:763-768; y 27) Waggoner,
(1994) Methods Enzymol. 246 (en prensa).
En este ejemplo se ilustra la técnica de
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)
introduciendo un quelato de europio como donante y un colorante
orgánico, CY-5, como aceptor. En general, el uso de
donantes de lantánidos y, en particular, este par, tiene muchas
ventajas respecto a pares de FRET más convencionales que se basan
mucho en colorantes orgánicos. R_{o} es larga, 70 \ring{A}; el
tiempo de vida del donante es exponencial sencillo y largo (2,5 ms
en D_{2}O); el factor de orientación que crea incertidumbre en
distancias medidas se minimiza por las múltiples transiciones
electrónicas del donante y largo tiempo de vida; la emisión
sensibilizada del aceptor puede medirse con poco o sin fondo
interferente, dando una mejora > 50 veces en la señal respecto
al fondo respecto a pares donante-aceptor
habituales. Se espera que esta mejora en 1 señal respecto al fondo
haga factibles mediciones de distancias mayores de 100 \ring{A}.
También se mide el tiempo de vida de la emisión sensibilizada, una
medición es completamente independiente de la concentración total y
marcado incompleto.
Se ha usado un quelato de europio luminiscente
como donante y un colorante orgánico, CY-5, como
aceptor. Esta transferencia de energía por resonancia de
luminiscencia (LRET) tiene varias ventajas respecto a la FRET2 más
convencional. La distancia a la que el 50% de la energía se
transfiere (R_{o}) es larga, 70 \ring{A}; el tiempo de vida del
donante es exponencial sencillo y largo (0,63 ms en H_{2}O; 2,5
ms en D_{2}O), haciendo las mediciones del tiempo de vida fácil y
sumamente exactas; la dependencia de la orientación (\kappa^{2})
de transferencia de energía se minimiza por las múltiples
transiciones electrónicas del donante y largo tiempo de vida,
limitando la incertidumbre en la distancia medida debido a efectos
de orientación hasta +/-12% en el peor caso^{3}; la emisión
sensibilizada del aceptor puede medirse con poco o sin fondo
interferente, dando una mejora > 50 veces en la señal respecto
al fondo respecto a pares donante-aceptor
habituales y permitiendo que se midan distancias de varias veces
R_{o}^{4}. También se mide el tiempo de vida de la emisión
sensibilizada que, en este caso, es independiente de la
concentración total y marcado incompleto.
Se ha usado tanto terbio^{5} como europio como
donantes, y los resultados para europio se presentan en este
documento. A continuación se muestra un diagrama esquemático
sistema de modelo donante-aceptor que comprende ADN
de cadena doble con quelato de europio (donante) en un extremo 5' y
CY-5 en el otro extremo 5':
El quelato de europio, (ácido
dietilenotriaminapentaacético-carboestirilo
124-Eu: nombre trivial,
DTPA-csl24-Eu) se hizo mediante una
modificación del procedimiento de Bailey^{12}, partiendo con el
dianhídrido de DTPA (Sigma), carboestirilo 124 (Aldrich) y el ADN
sintético protegido por base y en la columna para garantizar que el
marcado se produce en el grupo amino de 5'. La cs 124 aumenta
eficazmente la sección transversal de absorción del europio hasta
aproximadamente 8000 M^{-1}cm^{-1} a 337 nm, cuando se
excita el donante con un láser de nitrógeno pulsado. Un exceso de
100 veces de EDTA no eliminó ninguna cantidad perceptible de
europio del quelante de DTPA-cs124. El aceptor se
marcó en 5' con CY-513 (Biological Detection
Systems) mediante procedimientos habituales. Los oligómeros de ADN
complementarios sin marcar se hicieron como controles. Todo el ADN
se purificó por HPLC en fase inversa. En este sistema, el oligómero
de ADN de cadena doble sirve como una cadena rígida para establecer
una distancia definida entre el donante de europio y el aceptor de
CY5. Los puntos de unión del donante y aceptor están separados por
42 \ring{A}, aunque las posiciones del colorante retienen
variabilidad limitada debido a los flexibles ligadores de seis
carbonos usado para la unión 6,7.
Los resultados muestran las características
espectrales que conducen a la R_{o} excepcionalmente larga de 70
\ring{A} en D_{2}O (56 \ring{A} en H_{2}O). R_{o} se
determina a partir de ecuaciones habituales' basadas en un
solapamiento espectral (J) calculado de 6,55 x 10^{15}
M^{-1}nm^{4}, un factor de orientación (\kappa^{2}) de
2/3, un índice de refracción de 1,33 y un rendimiento de cuantos
para luminiscencia de europio en D_{2}O de uno (0,25 en
H_{2}O)^{8}. En el cálculo de R_{o} es importante usar
el rendimiento de cuantos de la emisión de lantánidos, y no el
rendimiento de cuantos de todo el quelato, e incluir en el cálculo
del solapamiento espectral (J) sólo aquellas transiciones que son
dipolo eléctrico. Se ha mostrado que la emisión de europio a 617
nm, que se usa en aquí para la transferencia de energía, es un
dipolo eléctrico "forzado"^{9} y por tanto puede aplicarse
la teoría de transferencia de energía de Förster. La emisión de
europio a 596 nm no puede acoplarse a un aceptor porque es una
transición de dipolo magnético y por tanto no está incluida en el
cálculo de solapamiento espectral^{10}.
Puede medirse la emisión sensibilizada del
aceptor sin interferencia significativa de ninguna emisión de
donante o fluorescencia directa del aceptor. A 668 nm, el europio
es casi silencioso (emisión de europio a 668 nm es 125 veces
inferior que a su máximo de 617 mn) y usando excitación por pulsos
y supresión del detector durante 90 ms, la fluorescencia directa
del sensibilizador de carboestirilo en el complejo del donante y la
fluorescencia directa del CY-5 se eliminan
completamente, mientras que el europio permanece excitado y puede
transferir energía^{11}.
Los resultados muestran un experimento de
emisión sensibilizada de fondo oscuro. En este caso, a relación de
donante respecto a cadenas de aceptor es aproximadamente 1:0,6;
intencionadamente se añade menos aceptor que donante para mostrar
la capacidad del sistema para analizar señales heterogéneas. La
fracción media de transferencia de energía en estos resultados es
el 57%. La señal a 668 nm se produce a partir de emisión
sensibilizada de CY-5, es decir, fluorescencia
debida solamente a la transferencia de energía. Se calcula que
señal/ruido a 668 nm es 94:1 (en la que el ruido es una pequeña
cantidad de luminiscencia de europio), un factor de mejora del
50-100 en señal/ruido respecto a la señal de
emisión sensibilizada de fluoresceína-rodamina, uno
de los mejores pares donante-aceptor, unido al
mismo 10-mero.
Los datos del tiempo de vida muestran que la
señal con sólo donante es exponencial sencilla con un tiempo de
vida de 2,52 ms. La señal de extinción del donante se justa
extremadamente bien a un biexponente (r^{2} = 0,998): y =
63%exp(-t/0,22 ms) + 37%exp(-t/2,40 ms). El componente de tiempo
largo se corresponde con las especies con sólo donante Que el
componente de largo tiempo casi iguale el tiempo de vida con sólo
donante es un control interno que muestra que la transferencia
intermolecular de energía es como mucho el 5%. El componente de
tiempo corto se produce a partir de transferencia intramolecular de
energía en el complejo donante-aceptor hibridado y
se corresponde con la extinción del 91% (1-0,2,2
ms/2,52 ms) y una distancia donante-aceptor de 46
\ring{A}. (Fluoresceína-rodamina en el mismo ADN
con ligadores de 6 C da 22% de transferencia de energía^{7}.) Una
titulación con concentración de aceptor creciente aumenta la
fracción del componente de tiempo corto, pero no cambia su tiempo
de vida, como se espera. A un exceso de dos veces de cadena de
aceptor permanece un componente del 10% correspondiente a señal con
sólo donante, supuestamente debido a cadenas de donante sin
hibridar.
Los resultados también muestran el tiempo de
vida de la emisión sensibilizada. La señal del tiempo de vida de
emisión sensibilizada se ajusta a una biexponencial (r^{2} =
0,999): y = 40%exp(-t/59 \mus) + 60%exp(-t/0,25 ms). El
componente de tiempo corto es debido a fluorescencia directa del
aceptor y puede eliminarse suprimiendo el detector. El componente
de 0,25 ms es debido a una transferencia de energía del 90%
(1-0,25/2,52 ms), en excelentes concordancia con el
componente de tiempo corto de la extinción del donante. Puede
observarse un componente de tiempo muy pequeño (\approx1%) debido
a fluorescencia directa del donante.
En resumen, la transferencia de energía de
luminiscencia da resultados que concuerdan con una teoría de
Fórster que supone que se usan parámetros apropiados. Basado en la
R_{o} larga, la facilidad y reproducibilidad de las mediciones
del tiempo de vida y la excelente señal respecto al fondo pueden
medirse distancias significativamente mayores a
100 \ring{A}.
100 \ring{A}.
(1) Cantor y Schimmel,
(1980) Biophysical Chemistry, W. H. Freeman y Co.,
San Francisco, volumen 2; (2) Los lantánidos en la transferencia de
energía se han usado en FRET potenciada por difusión
(Stryer, L., Thomas, D. D., Meares, C. F.
(1982) en Annual Review of Biophysics and
Bioengineering, L. J. Mullins, Ed., Annual Reviews, Inc., Palo
Alto, CA, 11: 203-222). También se ha usado con
aloficocianina multicromófora (Mathis, (1993) Clin-
Chem, 39:1953) y como sustituciones isomorfas en proteínas de
unión a calcio (Horrocks y col., Proc. Nat. Acad. Sci.
EE.UU. (1975), 72:4764; Cronce y Horrocks,
(1992) Biochem. 31:7963); (3) Stryer,
(1978) Ann. Rev. Biochem. 47:819-846;
(4) La capacidad para medir transferencia de energía más allá de
R_{o} usando emisión sensibilizada se ha mostrado por Bruno y
Horrocks. Usaron terbio como aceptor y tirosina como donante. Con
una R_{o} de 3 \ring{A} midieron hasta 12 \ring{A}.
(Bruno y col., (1992) Biochem. 31:7016); (5)
Selvin y Hearst, (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci, EE.UU. (presentado), (6) Cardullo y col.,
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8780; (7)
Clegg y col., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:2994; (8) El rendimiento de cuantos exacto es difícil de
determinar, aunque la vida de largo tiempo y la falta de mecanismos
de desactivación no radiativa hacen probablemente que el
rendimiento de cuantos sea próximo a uno en D20. Esta suposición ha
dado distancias que concuerdan con estudios de cristalografía por
rayos X (véase referencia 4). En H_{2}O, el rendimiento de
cuantos disminuye porque hay 1,3 moléculas de agua en la esfera de
coordinación primaria del lantánido en el quelato (Horrocks
y Sudnick, (1979) J. Am. Chem. Soc. 101:334);
(9) Bunzli, J.-C.G. (1989) en Lanthanide Probes in
Life, Chemical and Earth Sciences, Theory and Practice Luminescent
Probes; Bunzli, J.-C.G. & Choppin, G.R. Ed., Elsevier, Nueva
York, páginas 219-293; (10) Dexter,
(1953) J. Chem. Phys. 21: 836; (11) Morrison ha usado
integración controlada para aumentar la señal respecto al fondo de
la emisión sensibilizada con colorantes orgánicos. Morrison,
(1988) Anal. Biochem. 174:101; (12) Bailey y
col., (1984) Analyst 109:1449; y (13) Mujumdar
y col., (1993) Bioconj. Chem. 4:105.
Este ejemplo empleó un quelato de terbio
(terbio-ácido dietilenotriaminapentaacético acoplado a
carboestirilo 124) que transfiere energía a fluoresceína. El donante
y aceptor están separados por un oligonucleótido de dúplex de ADN
8-mero modificado con una amina primaria en el
extremo 5'. El aceptor está unido al extremo 5' de un
oligonucleótido complementario. La emisión sensibilizada se mide sin
ruido a aproximadamente 520 nm. Además, hay solapamiento excelente
entre la línea de emisión del donante de 492 nm y la absorbancia de
fluoresceína, conduciendo a una gran R_{o}. Usando una fuente de
excitación por pulsos y monitorizando a 520 nm, cualquier señal
sólo se produce de emisión sensibilizada. El oligonucleótido
8-mero se usa para separar rígidamente el donante y
aceptor, y el complejo se sumerge en una disolución viscosa de
sacarosa para eliminar interacciones intermoleculares, aunque la
disolución de sacarosa generalmente no es necesaria cuando la
concentración de oligonucleótido se mantiene por debajo de
aproximadamente 0,25 uM. La relación de señal de emisión
sensibilizada respecto al fondo a 520 nm es aproximadamente 400:1.
El grado de transferencia de energía basado tanto en la extinción
de la intensidad del donante como en el área de emisión
sensibilizada integrada es del 70%. Las mediciones del tiempo de
vida del donante sin extinguir (1,5 ms) en ausencia de aceptor, y
el tiempo de vida de la emisión sensibilizada en el complejo
donante-aceptor (tiempo de vida 250 us), indican
una extinción del 85%. La diferencia entre el 70 y el 85% es debida
a la pequeña fracción de ADN marcado con donante sin hibridar que
no puede transferir energía.
Se ha usado la transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia (FRET) para estudiar la actividad
enzimática, en la que la distancia entre dos puntos marcados cambia
como una función de esta actividad. En general, si se ha usado
FRET, también puede usarse LRET, frecuentemente con mejoras
significativas. Por ejemplo, Matayoshi y col. (1990) Science
247:954-958, usaron FRET para medir actividad de la
proteasa del VIH marcando un péptido de sustrato con un donante y
aceptor sobre cualquier lado de un sitio de unión/corte de
proteasa. Debido a la íntima proximidad del donante y aceptor, la
fluorescencia del donante en el péptido intacto se extinguió
sumamente. Con la adición de una proteasa se escindió el péptido,
el donante y aceptor difunden el uno del otro y la fluorescencia
del donante aumentó aproximadamente cuarenta veces. La sensibilidad
del ensayo se determina en gran parte por el grado de extinción
del donante en el péptido intacto. La falta de extinción al 100%
produce fluorescencia de fondo incluso en ausencia de actividad
proteolítica. Los autores observan que usaron un donante con un
tiempo de vida relativamente largo (decenas de nanosegundos) porque
esto ayuda a aumentar la extinción del donante del péptido
intacto. (La razón es que el péptido es flexible y un tiempo de
vida largo permite que el tiempo del péptido tiempo se flexibilice
tal que el donante y aceptor se acerquen, dando como resultado la
extinción del donante.)
La sustitución de un donante fluorescente
habitual con un quelato de lantánido proporciona ruido
significativamente reducido y, por tanto, mejor sensibilidad. El
quelato de lantánido tiene un tiempo de vida que es >10^{5}
veces más largo que el fluoróforo orgánico, que conduce a mayor
extinción del donante debido a la flexibilidad del péptido. Además,
puede discriminarse cualquier luminiscencia residual del donante
usando excitación por pulsos y desconectando el detector durante
alguna fracción de un milisegundo después del pulso. Si el donante
se enfría, por ejemplo, el 90% en el péptido intacto, el 10%
restante de luminiscencia tendrá un tiempo de vida 1/10 del quelato
sin extinguir, o aproximadamente 100 us. Suprimiendo el detector
durante unos pocos cientos de microsegundos se evita que esta
luminiscencia residual del donante alcance el detector, mientras
que la luminiscencia sin extinguir que se produce después de la
proteolisis, que tiene aproximadamente un tiempo de vida de
milisegundos, se ve relativamente poco afectada por la supresión.
Finalmente, la excepcional eficiencia de transferencia de energía
de los quelatos de lantánidos respecto a aceptores permite que los
puntos de unión del donante y aceptor se sitúen lo más apartados
posibles sobre el péptido de lo que es posible con colorantes
habituales. Esto es una consideración importante cuando el sitio de
unión de la enzima es grande.
Se ha usado FRET para detectar secuencias de ADN
específicas, Morrison y col. (1989) Analytical Biochemistry 183:
231-244, y Lee y col. (1993) Nucleic Acids Research
21:3761-3766. La ventaja principal de usar FRET en
esta aplicación es que la técnica es potencialmente sensible (es
decir, puede detectar uno o unas pocas secuencias de ADN
"diana") y puede hacerse en un formato homogéneo. La misma
técnica descrita por Lee y col. es ahora un producto comercialmente
disponible de Applied Biosystems conocido como
"Taq-Man". En esta aplicación, una sonda de ADN
complementaria a la secuencia de ADN diana se hace con donante y
aceptor unido. Si la sonda está intacta y es de una única cadena,
el donante se extingue sumamente porque el aceptor está en íntima
proximidad. Si la sonda hibrida al ADN diana, la sonda se degrada
por una endo o exonucleasa específica. Entonces, el donante es
libre para difundir de la molécula de aceptor, y aumenta la
fluorescencia del donante. Si no hay ADN diana, no se produce
degradación específica y no se produce aumento específico en la
fluorescencia del donante.
Este sistema también puede aprovecharse de
amplificación: hay muchas moléculas de ADN sonda y cada vez une
una, la sonda en el producto de cadena doble se hidroliza por la
nucleasa y aumenta la fluorescencia. Tan pronto como una sonda se
degrada, otra molécula de sonda puede unir y la enzima repite el
procedimiento. Por tanto, para sólo una sonda, la fluorescencia
puede generarse de muchas moléculas de sondas. Una variedad de
exonucleasas y endonucleasas son compatibles con la amplificación;
por ejemplo, Applied Biosystems utiliza polimerasa para marcar, que
tiene una actividad exonucleasa en 5'. Si la sonda comprende ARN,
puede usar RNAasaH para aprovecharse de amplificación.
En cualquiera de estos sistemas basados en FRET
para la detección de ADN, la sustitución del donante del colorante
orgánico con un quelato de lantánido mejora el ensayo. El grado de
extinción del donante en la sonda de cadena sencilla intacta se
considerablemente mayor debido al tiempo de vida largo del
lantánido y transferencia de energía eficiente. Cualquier
luminiscencia residual del donante puede discriminarse con la
supresión del Liempo. El resultado es ruido significativamente
reducido (exactamente análogo al experimento de la proteasa
explicado brevemente anteriormente).
Como se trata anteriormente, los lantánidos
pueden usarse como marcadores luminiscentes en microscopía y
detección en general. Usando excitación con pulsos y detección
retardada en el tiempo, el tiempo de vida largo del estado excitado
del lantánido (milisegundos) permite aislar la señal de
fluorescencia de fondo, que tiende a ser de duración de
nanosegundos. Sin embargo, el largo tiempo de vida tiene el
inconveniente de que la señal de intensidad por molécula es
necesariamente débil: una molécula con un tiempo de vida del estado
excitado de 1 ms puede emitir como mucho 1.000 fotones/s. Esto es
particularmente significativo a altas intensidad de iluminación, en
las que las moléculas de baja emisión pueden saturarse. A baja
intensidad de iluminación, el largo tiempo de vida no es
perjudicial porque ningún lantánido está siendo excitado a una
velocidad inferior a la inversa del tiempo de vida. Idealmente, uno
tendría una marca de luminiscencia en la que el tiempo de vida
puede confeccionarse al tiempo de vida de la escala de tiempo
óptima suficiente para que el ruido pueda disminuir, tan suficiente
no se comprometa significativamente la intensidad de señal. Debido
a que el ruido tiende a tener un tiempo de vida de nanosegundos,
una sonda con, por ejemplo, un tiempo de vida de microsegundos
todavía tendría un tiempo de vida mil veces más largo, permitiendo
la discriminación en función del tiempo de la señal, pero
potencialmente podría emitir 1.000 veces más fotones/s que el
lantánido de milisegundos. Tales colorantes confeccionados al
tiempo de vida puede hacerse utilizando transferencia de energía de
luminiscencia entre un quelato de lantánido (como donante) y un
aceptor fluorescente. La señal será la emisión del aceptor debido a
la transferencia de energía. El tiempo de vida de esta emisión
(\tau) será igual al tiempo de vida del donante extinguido y
será:
(1)\tau=
\tau_{o}
(1-E)
en el que \tau_{o} es el tiempo
de vida del quelato de lantánido en ausencia de aceptor y E es la
fracción de energía transferida (también llamada la eficiencia de
energía transferida). La distancia entre el donante y aceptor (R)
para conseguir una \tau dada puede calcularse fácilmente usando
la fórmula habitual para FRET, Cantor y col. (1980) Biophysical
Chemistry, WH Freeman y Co, SF, una fórmula que se ha mostrado que
puede aplicarse a LRET (Selvin y col., (1994) PNAS USA
91:10024-10028; Selvin y col. J. Amer. Chem. Soc.
116:6029-6030; Selvin y col. (1994) Methods in
Enzymology, K Sauer, ed., Academic Press,
Orlando):
(2)E = 1/ [1+
(R/R_{o})^{6}]
en la que R_{o} puede calcularse
de las propiedades espectrales del donante y aceptor. Combinando
las ecuaciones 1 y 2 da el tiempo de vida como una función de la
distancia entre donante y
aceptor:
(3)\tau=
\tau_{o}/ [1+
(R/R_{o})^{6}]
Si \tau_{o} es 1,5 ms, entonces con 90% de
transferencia de energía la emisión sensibilizada decaerá con un
tiempo de vida de 150 us. Con 99% de transferencia de energía, el
tiempo de vida es 15 us. Si se desea una marca luminiscente con un
tiempo de vida de 15 us, entonces el donante y aceptor debe
colocarse tal que se produzca ese 99% de transferencia de energía.
Esto se corresponde con una distancia de 0,465 x R_{o}. Para
quelato de Tb como donante y tetrametilrodamina como aceptor
(Selvin, y col. 1995, antes), en el que R_{o} = 60 \ring{A},
esto se corresponde con 28 \ring{A}. Puede conseguirse una sonda
con un tiempo de vida de 1,5 us separando el donante y aceptor
0,316 R_{o} durante el 99,9% de transferencia de energía, o 19
\ring{A} para quelato de Tb y tetrametilrodamina.
Obsérvese que los colorantes confeccionados a
tiempo de vida pueden hacerse para emitir a cualquier color
diferente. Es posible cualquier aceptor que pueda tomar energía del
quelato de lantánido luminiscente. La absorción del aceptor no
necesita solapar con la línea de emisión principal del lantánido,
el solapamiento con líneas menos intensas todavía pueda dar
transferencia de energía muy eficiente siempre y cuando el aceptor
se coloque suficientemente próximo. Un par donante/aceptor con una
R_{o} de sólo 30 \ring{A} todavía tendrá 99,9% de transferencia
de energía a una distancia de 9,5 \ring{A}. Además, obsérvese que
puede producirse transferencia de energía eficiente aunque el
donante lantánido tenga un rendimiento de cuantos para emisión
relativamente pobre. Aunque los rendimientos de cuantos de Tb y Eu
tienden a ser realmente altos en el quelato apropiado, otros
lantánidos y elementos de transición con rendimientos de cuantos
insignificativamente menores, tales como Pr, Nd, Sm, Dy, Ho, Er, Tm
y Ru, Os, y Sm, también llegan a ser donantes útiles. Finalmente
obsérvese que, debido a la eficiencia de transferencia de energía,
casi cualquier protón que hubiera sido emitido del lantánido en
general será alto (>90%), ahora es emitido por el aceptor, pero
en un periodo de tiempo más corto. La única pérdida significativa
de fotones se produce del rendimiento distinto de la unidad de
cuantos del aceptor. Esto puede minimizarse eligiendo aceptores con
alto rendimiento de cuantos.
Puede usarse una amplia variedad de diferentes
moléculas ligadoras para crear estos colorantes confeccionados a
tiempo de vida. Generalmente, los ligadores objeto proporcionan
distancias de separación de aproximadamente 4 a 60, preferentemente
de aproximadamente 9 a aproximadamente 30 \ring{A}. La
composición del ligador se selecciona basada en las necesidades de
la aplicación, por ejemplo pueden usarse ligadores poliméricos
hidrófobos para proporcionar colorantes permeables de membrana. Los
péptidos se sintetizan fácilmente a longitudes útiles y sus
extremos de N y C pueden usarse para unir el donante y aceptor.
Mediante la introducción de aminofenilalanina interna (o una
lisina) se genera un isotiocianato reactivo para unir el complejo
a una macromolécula biológica (u otra). Los péptidos también tienen
la ventaja de que las propiedades del péptido pueden optimizarse
para una aplicación particular; por ejemplo, poliprolina es muy
rígida e hidrófoba; polilisina es hidrófila y carga sumamente
positiva; mientras que poliglutamato o poliaspartato son hidrófilos
y cargados negativamente. Otros ligadores incluyen polímeros tales
como polisacáridos, que tienen excelente solubilidad y reactividad,
poliimidas y ácidos nucleicos. Los polímeros pueden derivatizarse
para proporcionar sitios de unión mejorados, por ejemplo una amina
primaria puede insertarse en una cadena de ácido nucleico y
convertirse en un grupo isotiocianato para unirse a
macromoléculas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de bibliografía citada por el
solicitante sólo es para conveniencia del lector. No forma parte
del documento de patente europea. Aunque se ha puesto mucho
cuidado en recabar la bibliografía, no pueden excluirse errores u
omisiones y la OEP niega cualquier responsabilidad en este
aspecto.
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Claims (19)
1. Un quelato de lantánido que comprende un
quelante de lantánido covalentemente unido a un sensibilizador, en
el que dicho quelante comprende una pluralidad de grupos
carboxilato o fosfonato, en el que dicho quelato puede unir un
lantánido con una constante de equilibrio de al menos 10^{6}
M^{-1}, en el que un complejo de dicho quelato y dicho lantánido
puede mejorar la luminiscencia del lantánido, y en el que dicho
sensibilizador está representado por la fórmula general:
en la que X comprende un átomo del
grupo 5 ó 6 del sistema periódico, en el que un primer átomo de
carbono en la posición 2-8 de dicho sensibilizador
que es el átomo de carbono en la posición 2 ó 4 está sustituido con
un átomo de oxígeno mediante un doble enlace covalente, y un
segundo átomo de carbono sencillo en la posición 2-8
de dicho sensibilizador que es el átomo de carbono en la posición
7 está sustituido con un grupo de enlace a través del que dicho
sensibilizador está covalentemente unido a dicho
quelante,
en el que un complejo de dicho quelato y un
lantánido que puede unir dicho quelato con una constante de
equilibrio de al menos 10^{6} M^{-1} puede ser de intensidad de
luminiscencia al menos superior al 500% de la de dicho
lantánido.
2. Un quelato según la reivindicación 1, en el
que dicho grupo de enlace está constituido esencialmente por un
grupo amina o carboxilo.
3. Un quelato según la reivindicación 1 ó 2, en
el que un tercer átomo de carbono en la posición
2-8 de dicho sensibilizador, diferente de dicho
primer y segundo átomo de carbono en la posición
2-8, está sustituido.
4. Un quelato según la reivindicación 3, en el
que dicho tercer átomo de carbono en la posición
2-8 es el carbono en la posición 4 y está
sustituido con un hidrocarburo o hidrocarburo sustituido con
halógeno.
5. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que dicho sensibilizador comprende una 2- o
4-quinolona o una 2- o
4-coumarina.
6. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que dicho sensibilizador comprende carboestirilo
124
(7-amino-4-metil-2-quinolona),
coumarina 120
(7-amino-4-metil-2-coumarina)
o coumarina 124
(7-amino-4-(trifluorometil)-2-coumarina).
7. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que un complejo de dicho quelato y un lantánido
que puede unir dicho quelato con una constante de equilibrio de al
menos 10^{8} M^{-1} puede ser de intensidad de luminiscencia al
menos superior al 5.000% de la de dicho lantánido.
8. Un quelato según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que una primera disolución que
comprende complejos de dicho quelato y un lantánido que puede unir
dicho quelato con una constante de equilibrio de al menos 10^{8}
M^{-1} puede ser de intensidad de luminiscencia al menos superior
al 5.000% de la de una segunda disolución que comprende dicho
lantánido, en el que dicha primera y segunda disolución son
idénticas, excepto por la presencia de dicho quelato en dicha
primera disolución y ausencia de dicho quelato en dicha segunda
disolución.
9. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que dicho lantánido es terbio o europio.
10. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que dicho quelante puede unir dicho lantánido
con una constante de equilibrio de al menos 10^{10} M^{-1}.
11. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que dicho quelante comprende EDTA, DTPA, DOTA,
NTA o HDTA o un análogo de fosfonato correspondiente a DTPP, EDTP,
HDTP o NTP.
12. Un quelato según la reivindicación 11, en el
que dicho quelante comprende DTPA.
13. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que dicho quelato está covalentemente unido a
una macromolécula.
14. Un quelato según una de las reivindicaciones
precedentes, en el que dicha mejora de la luminiscencia del
lantánido es de intensidad superior a al menos el 50.000%.
15. Una marca molecular que comprende un quelato
según una de las reivindicaciones precedentes unida covalentemente
a un reactivo selectivo por analito.
16. Un procedimiento para mejorar la
luminiscencia de un lantánido, comprendiendo dicho procedimiento:
formar una mezcla de un quelato de lantánido según una de las
reivindicaciones precedentes y un lantánido que puede unir dicho
quelato con una constante de equilibrio de al menos 10^{8}
M^{-1}, mediante el que se forma un complejo de quelato de
lantánido-lantánido luminiscente.
17. Un procedimiento para detectar un analito
que puede estar presente en una parte de una muestra mediante
luminiscencia, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
poner en contacto una parte de muestra con un
complejo luminiscente de un quelato de lantánido según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un lantánido que
puede unir dicho quelato con una constante de equilibrio de al
menos 10^{8} M^{-1}, en el que dicho quelato está
covalentemente unido a un reactivo que puede unir selectivamente
dicho analito;
incubar dicha parte de muestra en condiciones en
las que dicho reactivo pueda unir selectivamente dicho
analito;
exponer dicha parte de muestra a luz a una
primera longitud de onda que puede inducir una primera transición
electrónica en dicho quelato;
detectar una emisión de luz de dicha parte de
muestra a una segunda longitud de onda, en el que dicha segunda
longitud de onda es más larga que dicha primera longitud de onda y
resulta de una segunda transición electrónica en dicho quelato;
en el que la detección de dicha emisión de luz
está relacionada con la presencia de dicha parte de muestra de
analito.
18. Un procedimiento para detectar una distancia
entre una primera posición y una segunda posición en una parte de
una muestra mediante transferencia de energía por resonancia usando
un donante de quelato de lantánido luminiscente y un aceptor
orgánico de energía por resonancia, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
exponer una parte de muestra que comprende dicho
donante localizado en dicha primera posición y dicho aceptor
localizado en dicha segunda posición a luz a una primera longitud
de onda que puede inducir una primera transición electrónica en
dicho donante, en el que dicho donante comprende un complejo de un
quelato de lantánido según una de las reivindicaciones precedentes
y un lantánido que puede unir dicho quelato con una constante de
equilibrio de al menos 10^{8} M^{-1}, y en el que el
solapamiento espectral de la emisión del donante y la absorción del
aceptor es suficiente para permitir la transferencia de energía de
dicho donante a dicho aceptor como se mide mediante extinción
detectable de intensidad de luminiscencia del donante o tiempo de
vida o aumento detectable en la intensidad de luminiscencia del
aceptor o tiempo de vida;
detectar al menos uno de:
la intensidad de una primera emisión de luz de
dicha parte de muestra a una segunda longitud de onda, en el que
dicha segunda longitud de onda es más larga que dicha primera
longitud de onda y resulta de una segunda transición electrónica en
dicho donante, en el que la intensidad de dicha primera emisión de
luz está relacionada inversamente con la distancia entre dicha
primera y segunda posición de dicha parte de muestra; y
la intensidad de una segunda emisión de luz de
dicha parte de muestra a una tercera longitud de onda, en el que
dicha tercera longitud de onda es más larga que dicha primera
longitud de onda y resulta de una transición electrónica en dicho
aceptor, en el que la intensidad de dicha segunda emisión de luz
está relacionada con la distancia entre dicha primera y segunda
posición de dicha parte de muestra.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18
usado para monitorizar el estado de una reacción en cadena de la
polimerasa, en el que
dicha parte de muestra comprende una cadena de
ácido nucleico diana que comprende una primera parte de cadena y
una cadena de ácido nucleico de diagnóstico que comprende un primer
átomo covalentemente unido a dicho donante y un segundo átomo
covalentemente unido a dicho aceptor, estando dicho primer y
segundo átomo separado por una segunda parte de cadena, en el que
dicha primera y segunda parte de cadena son suficientemente
complementarias para hibridarse en condiciones de apareamiento;
dicha segunda parte de cadena es de longitud suficiente para
proporcionar una diferencia detectable en la transferencia de
energía total de dicho donante a dicho aceptor cuando dicha primera
y segunda parte de cadena se hibridan como se compara con la
transferencia de energía total de dicho donante a dicho aceptor
cuando dicha primera y segunda parte de cadena no están
hibridadas,
en el que dicha diferencia detectable se mide
como al menos un aumento de una extinción detectable de
luminiscencia del donante o aumento detectable en la luminiscencia
del aceptor, y dicha distancia entre dicho primer y segundo átomo
indica si dichas cadenas de ácido nucleico se han hibridado.
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