ES2290970T3 - Mutantes termoestables de enzimas de la biosintesis del almidon. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS MOLECULAS DE POLINUCLEOTIDO MUTANTES, QUE CODIFICAN PARA ENZIMAS QUE PRESENTAN UNA TERMOESTABILIDAD INCREMENTADA. DICHOS POLINUCLEOTIDOS, CUANDO SE EXPRESAN EN PLANTAS, PRODUCEN UN RENDIMIENTO ELEVADO EN PLANTAS CULTIVADAS BAJO CONDICIONES DE ESTRES TERMICO. LAS MOLECULAS DE POLINUCLEOTIDO DE LA PRESENTE INVENCION, CODIFICAN PARA LAS ACTIVIDADES DE LA ADP GLUCOSA PIROFOSFORILASA (AGP) Y DE LA SINTESIS DE ALMIDON SOLIDO (SSS) DEL ENDOSPERMO DEL MAIZ. LAS PLANTAS Y EL TEJIDO VEGETAL SELECCIONADOS DE FORMA QUE CONTENGAN O ESTEN TRANSFORMADOS CON DICHOS POLINUCLEOTIDOS MUTANTES, Y QUE EXPRESAN LOS POLIPEPTIDOS CODIFICADOS POR DICHOS POLINUCLEOTIDOS, SE INCLUYEN ASIMISMO EN LA INVENCION. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A PROCEDIMIENTOS DE AISLAMIENTO DE POLINUCLEOTIDOS Y POLIPEPTIDOS DE LA INVENCION, ASI COMO A LOS PROCEDIMIENTOS PARA INCREMENTAR EL RENDIMIENTO EN LAS PLANTAS CULTIVADAS BAJO LAS MEJORES CONDICIONES DE ESTRES.

Description

Mutantes termoestables de enzimas de la biosíntesis del almidón.

Antecedentes de la invención

La naturaleza sésil de la vida vegetal genera una exposición constante a factores medioambientales que ejercen efectos positivos y negativos sobre su crecimiento y desarrollo. Uno de los principales impedimentos con que se enfrenta la agricultura moderna son las condiciones medioambientales adversas. Un factor importante que ocasiona pérdida significativa de la cosecha es el estrés por calor. El estrés a la temperatura reduce en gran medida el rendimiento de los granos en muchas cosechas de cereales tales como el maíz, trigo, y cebada. El rendimiento disminuye debido al estrés por calor en un intervalo de 7 a 35% en los cereales de importancia mundial.

Numerosos estudios han identificado las probables consecuencias fisiológicas del estrés por calor. Los trabajos pioneros por Hunter et al. (Hunter, R. B., Tollenaar, M., y Breuer, C. M. [1977] Can. J. Plant Sci. 57: 1127-1133) utilizando condiciones de cámara de crecimiento mostraron que la temperatura disminuyó la duración de llenado del grano en el maíz. Resultados similares en los cuales la duración de llenado del grano se alteró de manera adversa mediante temperaturas incrementadas se identificaron por Tollenaar y Bruulsema (Tollenaar, M. y Bruulsema, T. W. [1988] Can. J. Plant Sci. 68: 935-940). Badu-Apraku et al. (Badu-Apraku, B., Hunter, R. B., y Tollenaar, M. [1983] Can. J. Plant. Sci. 63: 357-363) midieron una reducción notable en el rendimiento del crecimiento de las plantas de maíz bajo el régimen de temperatura de día/noche de 35/15ºC en comparación con el crecimiento en un régimen de temperatura de 25/15ºC. Los rendimientos reducidos debido a las temperaturas incrementadas también están apoyados por los estudios históricos así como por estudios climatológicos (Thompson, L. M. [1986] Agron. J. 78: 649-653; Thompson, L. M. [1975] Science 1988: 535-541; Chang, J. [1981] Agricul. Metero. 24: 253-262; y Conroy, J. P., Seneweera, S., Basra, A. S., Rogers, G., y Nissen-Wooller, B. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21: 741-758).

Es evidente que los procesos fisiológicos del desarrollo de las semillas son afectados adversamente por el estrés por calor a partir de los estudios utilizando un sistema de cultivo de grano in vitro (Jones, R. J.,Gengenbach, B. G., y Cardwell, V. B. [1981] Crop Science 21: 761-766; Jones, R. J., Ouattar, S., y Crookston, R. K. [1984] Crop Science 24: 133-137; y Cheikh, N., y Jones, R. J. [1995] Physiol. Plant. 95: 59-66). Los granos de maíz cultivados a la temperatura óptima anteriormente mencionada de 35ºC mostraron una reducción dramática del peso.

El trabajo con el trigo identificó la pérdida de actividad de sintasas solubles del almidón (SSS) como un distintivo de la respuesta del endospermo de trigo al estrés por calor (Hawker, J. S. y Jenner, C. F. [1993] Aust. J Plant Physiol. 20: 197-209; Denyer, K., Hylton, C. M., y Smith, A. M. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21: 783-789; Jenner, C. F. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21: 791-806). Los estudios adicionales con SSS del endospermo de trigo muestran que es lábil al calor (Rijven, A. H. G. C. [1986] Plant Physiol. 81: 448-453; Keeling, P. L., Bacon, P. J., Holt, D. C. [1993] Planta. 191: 342-348; Jenner, C. F., Denyer, K., y Guerin, J. [1995] Aust. J. Plant Physiol. 22: 703-709).

Los papeles de SSS y de la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) bajo condiciones de estrés por calor en el maíz son menos claros. (AGP) cataliza la conversión de ATP y de \alpha-glucosa-1-fosfato a ADP-glucosa y pirofosfato. ADP-glucosa se utiliza como un donante de glucosilo en la biosíntesis del almidón por las plantas, y en la biosíntesis de glucógeno por las bacterias. La importancia de la ADP-glucosa pirofosforilasa como una enzima clave en la regulación de la biosíntesis del almidón se evidenció en el estudio de mutantes deficientes en la formación de almidón del endospermo de maíz (Zea mays) (Tsai, C. Y., y Nelson, Jr., O. E. [1966] Science 151: 341-343; Dickinson, D. B., J. Preiss [1969] Plant Physiol. 44: 1058-1062).

Ou-Lee y Setter (Ou-Lee, T. y Setter, T. L. [1985] Plant Physiol. 79: 852-855) examinaron los efectos de la temperatura sobre las regiones apicales o puntas de las mazorcas del maíz. Con temperaturas elevadas, la actividad de AGP fue más baja en los granos apicales cuando se comparó con los granos basales, durante el tiempo de depósito intenso del almidón. Por el contrario, en los granos que se desarrollaron a temperaturas normales, la actividad de AGP fue similar en los granos apicales y basales durante este periodo. No obstante, la actividad de sintasa del almidón durante este periodo no se vio afectada de manera diferencial en los granos apicales y basales. Adicionalmente, los granos apicales tratados con calor mostraron un incremento en la actividad de sintasa del almidón con respecto al control. Esto no se observó con la actividad de AGP. Singletary et al., (Singletary, G. W., Banisadr, R., y Keeling, P. L. [1993] Plant Physiol. 102: 6 (suplemento); Singletary, G. W., Banisadra, R., Keeling, P. L. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21: 829-841) utilizando un sistema de cultivo in vitro cuantificaron el efecto de diversas temperaturas durante el período de llenado del grano. El peso de las semillas disminuyó de manera constante conforme la temperatura se incrementaba desde 22-36ºC. Un papel para AGP en la pérdida del rendimiento también se apoya por el trabajo a partir de Duke y Doehlert (Duke, E. R. y Doehlert, D. C. [1996] Environ. Exp. Botany. 36: 199-208).

El trabajo por Keeling et al. (1994, anteriormente mencionado) cuantificó la actividad de SSS en el maíz y en el trigo utilizando análisis Q_{10}, y mostró que SSS es un punto de control importante en el flujo del carbono dentro del almidón.

Los estudios bioquímicos in vitro con AGP y SSS muestran claramente que ambas enzimas son lábiles al calor. La AGP del endospermo de maíz pierde 96% de su actividad cuando se calienta a 57ºC durante cinco minutos (Hannah, L. C., Tuschall, D. M., y Mans, R. J. [1980] Genetics 95: 961-970). Esto está en contraste con la AGP de la patata, la cual es completamente estable a 70ºC (Sowokinos, J. R. y Preiss, J. [1982] Plant Physiol. 69: 1459-1466; Okita, T. W., Nakata, P. A., Anderson, J. M., Sowokinos, J., Morell, J., y Preiss, J. [1990] Plant Physiol. 93: 785-90). Los estudios de inactivación mediante calor con SSS mostraron que ésta también es lábil a temperaturas mayores, y los estudios cinéticos determinaron que el valor Km para la amilopectina se elevó exponencialmente cuando la temperatura se incrementó desde 25-45ºC (Jenner et al., 1995, anteriormente mencionado).

Las pruebas bioquímicas y genéticas han identificado a la AGP como una enzima clave en la biosíntesis del almidón en las plantas superiores, y en la biosíntesis del glucógeno en E. coli (Preiss, J. y Romeo, T. [1994] Progress in Nuc. Acid Res. y Mol Biol. 47: 299-329; Preiss, J. y Sivak, M. [1996] "Starch synthesis in sinks and sources," en Photoassimilate distribution in plants and crops: source-sink relationships. Zamski, E., ed., Marcil Dekker Inc. p. 139-168). AGP cataliza lo que se ve como el paso inicial en la ruta biosintética del almidón, siendo el producto de la reacción el donante glucosilo activado, ADP glucosa. Este se utiliza por la sintasa del almidón para la extensión del polímero de polisacárido (revisado en Hannah, L. Curtis [1996] "Starch synthesis in the maize endosperm," en Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants, Vol. 4. B. A. Larkins and I. K. Vasil (editores). Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos, (en prensa)).

Los estudios iniciales con la AGP de la patata mostraron que la expresión en E. coli produjo una enzima con propiedades alostéricas y cinéticas muy similares a las de la enzima nativa del tubérculo (Iglesias, A., Barry, G. F., Meyer, C., Bloksberg, L., Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M. J., Okita, T. W., Kishore, G. M., y Preiss, J. [1993] J. Biol Chem. 268: 1081-86; Ballicora, M. A., Laughlin, M. J., Fu, Y., Okita, T. W., Barry, G. F., y Preiss, J. [1995] Plant Physiol. 109: 245-251). Greene et al. (Greene, T. W., Chantler, S. E., Kahn, M. L., Barry, G. F., Preiss, J., y Okita, T. W. [1996] Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1509-1513; Greene, T. W., Woodbury, R. L., y Okita, T. W. [1996b] Plant Physiol. (en prensa)) mostraron la utilidad del sistema de expresión bacteriano en los estudios de estructura-función con la AGP de la patata. Se identificaron múltiples mutaciones importantes en el mapeo de los sitios alostéricos y de unión al sustrato (Okita, T. W., Greene, T. W., Laughlin, M. J., Salamone, P., Woodbury, R., Choi, S., Ito, H., Kavakli, H., y Stephens, K. [1996] "Engineering Plant Starches by the Generation of Modified Plant Biosynthetic Enzymes," en Engineering Crops for Industrial End Uses, Shewry, P. R., Napier, J. A., y Davis, P., editores., Portland Press Ltd., Londres (en prensa)).

Las enzimas AGP se han aislado tanto a partir de bacterias como de plantas. La AGP bacteriana consiste en un homotetrámero, mientras que la AGP vegetal procedente de tejidos fotosintéticos y no fotosintéticos es un heterotetrámero compuesto de dos subunidades diferentes. La enzima vegetal está codificada por dos genes diferentes, siendo una subunidad más grande que la otra. Esta característica se ha evidenciado en numerosas plantas. Las subunidades de la AGP en la hoja de espinaca tienen pesos moleculares de 54 kDa y 51 kDa, según se estima mediante SDS-PAGE. Ambas subunidades son inmunorreactivas con anticuerpos generados contra AGP purificada procedente de hojas de espinaca (Copeland, L., J. Preiss (1981) Plant Physiol. 68: 996-1001; Morell, M., M. Bloon, V. Knowles, J. Preiss [1988] J. Biol. Chem. 263: 633). El análisis inmunológico utilizando antisuero preparado contra las subunidades pequeña y grande de la hoja de espinaca mostró que la AGP del tubérculo de la patata también está codificada por dos genes.(Okita et al., 1990, anteriormente mencionado). También se han aislado y secuenciado los clones de ADNc de las dos subunidades del tubérculo de la patata (50 y 51 kDa) (Muller-Rober, B. T., J. Kossmann, L. C. Hannah, L. Willmitzer, U. Sounewald [1990] Mol. Gen. Genet. 224: 136-146; Nakata, P. A., T. W. Greene, J. M. Anderson, B. J. Smith-White, T. W. Okita, J. Preiss [1991] Plant Mol. Biol. 17: 1089-1093). La subunidad grande de la AGP del tubérculo de la patata es estable al calor (Nakata et al. [1991], anteriormente mencionado).

Como postularon Hannah y Nelson (Hannah, L. C., O. E. Nelson (1975) Plant Physiol. 55: 297-302.; Hannah, L. C., y Nelson, Jr., O. E. [1976] Biochem. Genet. 14: 547-560), tanto Shrunken-2 (Sh2) (Bhave, M. R., S. Lawrence, C. Barton, L. C. Hannah [1990] Plant Cell 2: 581-588) como Brittle-2 (Bt2)(Bae, J.M., M. Giroux, L.C. Hannah [1990] Maydica 35: 317-322) son genes estructurales de la ADP-glucosa pirofosforilasa del endospermo del maíz. Sh2 y Bt2 codifican la subunidad grande y subunidad pequeña de la enzima, respectivamente. A partir de la secuenciación del ADNc, se ha pronosticado el peso molecular de las proteínas Sh2 y Bt2 de 57.179 Da (Shaw, J.R., L.C. Hannah [1992] Plant Physiol. 98: 1214-1216) y 52.224 Da, respectivamente. El endospermo es el sitio de mayor deposición de almidón durante el desarrollo del grano de maíz. Los mutantes del endospermo de maíz Sh2 y bt2 tienen niveles de almidón reducidos en gran medida, que corresponden a niveles deficientes de actividad de AGP. Se ha mostrado que las mutaciones de cualquier gen reducen la actividad de AGP en aproximadamente 95% (Tsai y Nelson, 1966, anteriormente mencionado; Dickinson y Preiss, 1969, anteriormente mencionado). Además, se ha observado que las actividades enzimáticas se incrementan con la dosis de alelos funcionales de tipo salvaje Sh2 y Bt2, mientras que las enzimas mutantes tienen propiedades cinéticas alteradas. La AGP es la etapa limitante de velocidad en la biosíntesis de almidón en las plantas. Stark et al. colocaron una forma mutante de la AGP de E. coli en el tubérculo de la patata, y obtuvieron un incremento del 35% en el contenido de almidón (Stark et al. [1992] Science 258: 278).

Se ha dado a conocer para diversas plantas la clonación y caracterización de los genes que codifican las subunidades de la enzima AGP. Estas incluyen el ADNc de Sh2 (Bhave et al., 1990, anteriormente mencionado), el ADN genómico de Sh2 (Shaw y Hannah, 1992, anteriormente mencionado), y el ADNc de Bt2 (Bae et al., 1990, anteriormente mencionado) procedentes del maíz; el ADNc de la subunidad pequeña (Anderson, J. M., J. Hnilo, R. Larson, T. W. Okita, M. Morell, J. Preiss [1989] J. Biol. Chem. 264: 12238-12242) y el ADN genómico (Anderson, J. M., R. Larson, D. Landencia, W. T. Kim, D. Morrow, T. W. Okita, J. Preiss [1991] Gene 97: 199-205) procedentes del arroz; y los ADNc de las subunidades pequeña y grande procedentes de la hoja de espinaca (Morell et al., 1988, anteriormente mencionado) y del tubérculo de la patata (Muller-Rober et al., 1990, anteriormente mencionado; Nakata, P. A., Greene, T. W., Anderson, J. W., Smith-White, B. J., Okita, T. W., y Preiss, J. [1991] Plant Mol. Biol. 17: 1089-1093). Además, se han aislado clones de ADNc a partir del endospermo y del tejido de la hoja de trigo (Olive, M. R., R. J. Ellis, W. W. Schuch [1989] Plant Physiol. Mol. Biol. 12: 525-538) y de la hoja de Arabidopsis thaliana (Lin, T., Caspar, T., Sommerville, C. R., y Preiss, J. [1988] Plant Physiol. 88:1175-1181).

La AGP funciona como una enzima alostérica en todos los tejidos y organismos investigados hasta la fecha. Inicialmente se mostró que las propiedades alostéricas de la AGP eran importantes en E. coli. Se aisló un mutante de E. coli que sobreproduce glucógeno, y la mutación se mapeó hasta el gen estructural para AGP, designado como glyC. Se mostró que la E. coli. mutante, conocida como glyC-16, era más sensible al activador, fructosa-1,6-bisfosfato, y menos sensible al inhibidor, AMPc (Preiss, J. [1984] Ann. Rev. Microbio. 419-458). A pesar de que las AGP vegetales también son alostéricas, éstas responden a diferentes moléculas efectoras que las AGP vegetales. En las plantas, el ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) funciona como un activador, mientras que el fosfato (PO_{4}) sirve como un inhibidor (Dickinson y Preiss, 1969, anteriormente mencionado).

Utilizando un sistema de mutagénesis in vivo creado por la escisión mediada por Ac de un elemento transponible Ds fortuitamente localizado de manera cercana a un sitio conocido de unión a activador, Giroux et al. (Giroux, M. J., Shaw, J., Barry, G., Cobb, G. B., Greene, T., Okita, T. W., y Hannah, L. C. [1996] Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5824-5829) fueron capaces de generar mutantes específicos del sitio en una región funcionalmente importante de la AGP del endospermo de maíz. Un mutante, Rev 6, contenía un inserto de tirosina-serina y condicionó un incremento de
11-18% del peso de la semilla.

El documento WO91/11520 describe el uso de formas modificadas de polinucleótidos que codifican AGP que tienen una estabilidad mejorada al calor, para potenciar la producción de almidón en una planta, por ejemplo Zea mays.

Charing et al., [1994], J. Biol. Chem. 269(39):214107-24113, describe la preparación de un mutante de AGP de la hoja de espinaca, que se denomina allí como "K419R", y que retiene más actividad que la enzima de tipo salvaje después del tratamiento con calor a 60ºC durante 5 minutos.

Greene et al., [1996], PNAS USA 93:1509-1513, describe una mutación de aminoácido que aumenta el peso de la semillas.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, un polinucleótido que codifica un polipéptido de ADP glucosa fosforilasa (AGP) vegetal mutante comprende una mutación de aminoácido en su subunidad grande, y muestra un aumento de estabilidad al calor con relación a un polipéptido de AGP de tipo salvaje, en el que la mutación comprende la sustitución del aminoácido correspondiente a His-333, Ala-177, Asp-400, Val-454, Arg-104, Thr-460 o Arg-216 en maíz. Otros aspectos de la invención son un método para aumentar la resistencia de una planta al calor, plantas transformadas y tejido vegetal, y un polipéptido de AGP mutante.

Esta invención proporciona enzimas estables al calor que se pueden usar para proporcionar plantas que tienen una mayor tolerancia a temperaturas más elevadas, potenciando así la producción de la cosecha de estas plantas. En una realización particularmente preferida, la planta mejorada es un cereal. Los cereales a los que se aplica esta invención incluyen, por ejemplo, maíz, trigo, arroz y cebada.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Mutantes de la subunidad grande de la AGP del endospermo de maíz estables al calor. Se muestra el porcentaje de actividad de la AGP remanente después de cinco minutos de tratamiento con calor a 60ºC.

Figura 2. Alineamiento de secuencia primaria de la región que rodea a la mutación HS 33 con subunidades grandes de maíz, trigo, cebada, y patata. Se recuadran las regiones conservadas.

Figura 3. Alineamiento de secuencia primaria de la región que rodea a la mutación HS 40 con subunidades grandes de maíz, trigo, cebada, y patata. Se recuadran las regiones conservadas. El resto de ácido aspártico en negrita corresponde al mutante alostérico D413A de la patata LS (Greene, T. W., Woodbury, R. L., y Okita, T. W. [1996] Plant Physiol. (en prensa). La secuencia de la AGP de la hoja de espinaca es el péptido del sitio 2 del activador identificado en estudios con análogos de 3-PGA (Ball, K. y Preiss, J. [1994] J. Biol. Chem. 269: 24706-24711). El resto marcado de lisina se encuentra en negrita.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a nuevas moléculas polinucleotídicas mutantes, y a los polipéptidos codificados por las mismas, que confieren un rendimiento incrementado en el crecimiento vegetal bajo condiciones de estrés por calor, con relación a las plantas que tienen el genotipo de tipo salvaje. En realizaciones específicas, las moléculas polinucleotídicas de la presente invención codifican las actividades de las enzimas ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) del endospermo de maíz y de la sintasa soluble del almidón (SSS). Las enzimas mutantes confieren aumento de estabilidad de las semillas a las condiciones de estrés por calor durante el desarrollo de las semillas, en comparación con las actividades de las enzimas de tipo salvaje.

En una forma de realización, un polinucleótido mutante de la presente invención codifica una subunidad grande de la AGP que contiene una sustitución de aminoácidos de histidina a tirosina en la secuencia del polipéptido. Esta sustitución se produce en el resto número 333 de los aminoácidos, según el número aceptado de los aminoácidos en esta proteína (Shaw y Hannah, 1992, anteriormente mencionado). La posición de esta sustitución se puede identificar fácilmente por una persona experta en la técnica. Una segunda mutación ejemplificada en la presente invención es una sustitución de treonina a isoleucina en la posición número 460 de la proteína AGP. A continuación se muestran en la Tabla 1 mutantes adicionales que confieren un aumento de estabilidad al calor.

1

Los clones de ADNc para las subunidades de la AGP del endospermo de maíz (SH2 y BT2) y una cepa de E. coli deficiente en la AGP bacteriana endógena (glg C^{-})(AC70R1-504) han facilitado el establecimiento de un sistema de expresión bacteriano para estudiar a la AGP del endospermo del maíz. La expresión de una subunidad particular es incapaz de complementar el mutante glg C^{-}, y no se produce glucógeno (Iglesias, A., Barry, G.F., Meyer, C., Bloksberg, L., Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M. J., Okita, T. W., Kishore, G. M., y Preiss, J. [1993] J. Biol Chem. 268: 1081-86). No obstante, la expresión tanto de las subunidades grande como pequeña en vectores de expresión compatibles complementa completamente la mutación glg C^{-} y restablece la producción de glucógeno como se evidencia por una tinción oscura, café rojiza de las colonias expuestas a yodo. Por lo tanto, la complementación se identifica fácilmente mediante la simple exposición de las colonias al yodo.

En una forma de realización, se utilizaron las células glg C^{-} de E. coli que expresan los genes estructurales ya sea para la AGP del endospermo de patata o de maíz. Las células que contenían los genes de la AGP de patata pueden sintetizar niveles abundantes de glucógeno cuando se hacen crecer a 37º o a 42ºC. No obstante, las células que expresan la AGP del endospermo de maíz solamente sintetizan glucógeno a 37ºC. Este resultado demuestra la sensibilidad al calor de la AGP del endospermo de maíz de tipo salvaje. El hecho de que haya una diferencia entre las AGP de patata y de maíz proporciona a este respecto un sistema eficiente para seleccionar células mutantes que tienen variantes estables al calor de la AGP del endospermo de maíz.

Un aspecto de la presente invención se refiere a la identificación eficiente de la AGP la cual es estable al calor. Por consiguiente, se mutagenizó químicamente un plásmido que comprende un polinucleótido que codifica la subunidad SH2 de la AGP de maíz, como se describe a continuación, colocado en células mutantes de E. coli que expresan la subunidad BT2, y se hizo crecer a 42ºC. También se pueden usar otros mutágenos conocidos en la técnica. Se aislaron once mutantes heredables, que se tiñen con yodo, denominados mutantes estables al calor (HS). Se prepararon los extractos sin purificar de estos mutantes, y se monitorizó la estabilidad al calor de la AGP resultante. Los mutantes retuvieron entre 8-59% de su actividad después de la incubación a 60ºC durante cinco minutos (figura 1). Esto se compara con el 1-4% observado habitualmente para la AGP de tipo salvaje a esta temperatura.

Los resultados muestran que las formas estables al calor de las enzimas se pueden crear según la presente invención mediante mutación. De manera inesperada, la actividad total de la AGP del endospermo de maíz antes del tratamiento con calor se elevó alrededor de 10 veces en la mayoría de estos mutantes. Este resultado sorprendente hace a estos mutantes particularmente ventajosos para uso en agricultura. Las técnicas de mutagénesis como se describen en la presente invención se pueden usar según la presente invención para identificar otros genes que codifican enzimas de la biosíntesis del almidón estables al calor.

Se secuenciaron completamente los genes que codifican varios de los mutantes estables al calor, incluyendo los dos mutantes HS más estables al calor, HS 33 y HS 40. HS 33, que retiene 59% de su actividad después del tratamiento con calor, contiene una mutación de un solo par de bases que cambia un resto de histidina en la posición 333 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido por una tirosina (figura 2). Los alineamientos de la secuencia primaria con las subunidades grandes a partir de las AGP de trigo y de cebada muestran que también está presente una histidina en el resto análogo (figura 3) (Ainsworth, C., Hosein, F., Tarvis, M., Weir, F., Burrell, M., Devos, K. M., Gale, M. D. [1995] Planta 197: 1-10). El análisis de secuencia de HS 40, que retiene 41% de su actividad después del tratamiento con calor, también contenía una mutación de histidina a tirosina en la posición 333. Se identificó una mutación puntual adicional que generó una sustitución de treonina a isoleucina. El resto de treonina está altamente conservado en las subunidades grandes de la AGP, mientras que en las subunidades pequeñas de la AGP el resto análogo es una cisteína o una serina (Ainsworth et al., 1995, anteriormente mencionado). La sustitución de treonina a isoleucina se localiza próxima al término carboxilo de la subunidad grande, y próxima a un sitio de unión conocido para el activador 3-PGA (figura 3).

La presente invención también se refiere a mutantes de la AGP estables al calor que tienen mutaciones en la subunidad pequeña de la enzima. También se engloban dentro del alcance de la invención polinucleótidos que codifican las subunidades mutantes pequeñas de la AGP. También se pueden preparar fácilmente e identificar utilizando los métodos de la presente invención mutaciones en la subunidad pequeña de la AGP que confieren estabilidad al calor a la enzima.

También se contemplan mediante la presente invención las plantas y los tejidos vegetales procreados para que contengan, o que se transformen con, los polinucleótidos mutantes, y que expresen los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Las plantas y los tejidos vegetales que expresan los polinucleótidos mutantes producen tejidos que tienen, por ejemplo, una menor pérdida inducida por calor del peso o del rendimiento cuando se someten a estrés por calor durante el desarrollo.

La presente invención también se refiere a métodos para producir e identificar polinucleótidos y polipéptidos contemplados dentro del alcance de la invención. En una forma de realización, se puede usar una mutación génica, seguido de la selección usando un sistema de expresión bacteriano, para aislar moléculas polinucleotídicas que codifican enzimas que pueden aliviar la pérdida inducida por calor de la síntesis de almidón en las plantas.

La presente invención se refiere además a plantas y a tejido vegetal que tienen un gen mutante de AGP incorporado en su genoma. También se pueden incorporar en un genoma vegetal otros alelos descritos aquí. En una realización preferida, la planta es una planta de cereal. Más preferiblemente, la planta es Za mays. Las plantas que tienen un gen mutante de AGP se pueden hacer crecer a partir de semillas que comprenden un gen mutante en su genoma. Además, se conocen en la técnica técnicas para transformar plantas con un gen.

Debido a la degeneración del código genético, una variedad de diferentes secuencias polinucleotídicas puede codificar cada una de las variantes polipeptídicas de la AGP descritas en la presente invención. Además, se encuentra dentro de la capacidad de una persona experta en la técnica el crear secuencias polinucleotídicas alternativas que codifica el mismo polipéptido, o esencialmente el mismo polipéptido, de la presente invención. Estas secuencias polinucleotídicas variantes o alternativas están dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en la presente invención, las referencias a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a las secuencias que codifican las sustituciones, supresiones, adiciones o inserciones de aminoácidos, que no alteran materialmente la actividad funcional del polipéptido codificado por el polipéptido mutante de la AGP descrito en la presente invención.

También se contempla dentro del alcance de la presente invención la sustitución de aminoácidos diferentes a aquellos específicamente ejemplificados en los mutantes descritos en la presente invención. Los aminoácidos se pueden colocar en las siguientes clases: no polar, polar no cargado, básico, y ácido. Las sustituciones conservativas mediante las cuales un polipéptido mutante de la AGP que tiene un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido de la misma clase caen dentro del alcance de la presente invención siempre y cuando el polipéptido mutante de la AGP que tiene la sustitución aún retenga estabilidad incrementada al calor con relación a un polipéptido de tipo salvaje. La Tabla 2 a continuación proporciona una lista de los ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

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Por ejemplo, la sustitución de la tirosina en la posición 333 en el mutante HS 33, HS 39, HS 40 y HS 47 de la AGP del endospermo de maíz por otros aminoácidos, tales como Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Asparagina, y Glutamina, están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican fragmentos del polipéptido mutante de longitud completa, siempre y cuando aquellos fragmentos retengan sustancialmente la misma actividad funcional que el polipéptido de longitud completa. También se encuentran dentro del alcance de la presente invención los fragmentos del polipéptido mutante de la AGP codificados por estos polinucleótidos.

La presente invención también comprende aquellas moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias que son suficientemente homólogas con la secuencia de ADN de Sh2 de tipo salvaje de manera que permita la hibridación con esa secuencia en condiciones estándares muy restrictivas. Dichas condiciones de hibridación son convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook [1989] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención se pueden usar para transformar plantas para expresar en aquellas plantas la enzima AGP mutante estable al calor. Además, los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para expresar la enzima AGP variante recombinante. Estos también se pueden utilizar como sondas para detectar enzimas relacionadas. Los polinucleótidos también se pueden utilizar como estándares de tamaño de ADN.

Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención también incluyen aquellos polinucleótidos que codifican enzimas AGP que confieren un aumento de peso a la semilla, además de estabilidad mejorada al calor, a una planta. La combinación de una mutación estabilizante al calor, HS 40, con una mutación que confiere un aumento de peso a la semilla, por ejemplo, Rev6, está contemplada específicamente en la presente invención. Véase, por ejemplo, las patentes U.S. Nº 5.589.618 y 5.650.557.

Las mutaciones en las subunidades de AGP que confieren estabilidad al calor se pueden combinar según la presente invención con mutantes del maíz insensibles al fosfato, tal como la mutación Rev6, para mejorar la estabilidad de la subunidad grande codificada por Rev6.

Se espera que la actividad enzimática de SSS se dañará a mayor temperatura, según se observó con AGP. De este modo, las formas mutagenizadas de SSS se pueden expresar en condiciones térmicas incrementadas (42ºC), para aislar variantes estables al calor. Estas formas mutagenizadas estables al calor de SSS son aspectos adicionales de la presente invención.

Todas las publicaciones y patentes citadas aquí se incorporan aquí como referencia.

A continuación se proporcionan ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deben considerarse como limitativos. Todos los porcentajes están en peso, y todas las proporciones de las mezclas de disolventes están en volumen excepto que se indique de otra manera.

Ejemplo 1 Uso de mutagénesis para obtener variantes estables al calor de AGP del endospermo de maíz

Se utilizó inicialmente el mutágeno químico hidroxilamina-HCl para la mutagénesis al azar del plásmido de expresión de la subunidad grande. La hidroxilamina hidroxila preferiblemente el nitrógeno del amino en la posición C-4 de la citocina, y conduce a una transición de GC a AT (Suzuki, D. T., Griffith, A. J. F., Miller, J. H., y Lewontin, R. C. [1989] en Introduction to genetic analysis, Freeman, NY, 4ª edición, p. 475-499). El mutágeno químico se eligió por su alta frecuencia de mutación. Se reconocen limitaciones del mutágeno químico, y si no se aísla una gran variedad de variantes genéticas, se puede llevar a cabo la mutagénesis al azar basada en PCR. La mutagénesis mediante PCR genera un espectro de mutaciones más amplio que incluyen frecuencias similares de transiciones y transversiones, y proporciona una excelente alternativa al método químico. Se puede seguir el método descrito por Cadwell y Joyce (Cadwell, R. C. y Joyce, G. F. [1992] PCR Methods and Applications 2: 28-33) para el método basado en PCR.

Puesto que se usa el plásmido de expresión completo en la mutagénesis al azar, es posible que se produzcan mutaciones fuera de la región codificante. A pesar de que se espera que dichas mutaciones no tendrán ningún efecto sobre la estabilidad al calor de la AGP del endospermo de maíz, cada variante se puede subclonar dentro de un plásmido de expresión sin mutar, antes de realizar cualquier caracterización adicional a nivel enzimático. Tanto los plásmidos de expresión de la subunidad pequeña como de la subunidad grande se pueden construir de manera que una digestión de NcoI/SacI liberará la región codificante completa. Esta se puede clonar fácilmente de nuevo dentro de un plásmido de expresión sin mutar digerido con Ncol/Sacl.

Ejemplo 2 Caracterización molecular y análisis de las variantes de la AGP estables al calor

Inicialmente, se obtuvieron 11 variantes estables al calor de la subunidad grande del endospermo del maíz. Se han secuenciado completamente 2. La secuenciación se llevó a cabo utilizando equipo de instrumentos DuPont y ABI.

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Los datos de secuencias se pueden comparar habitualmente con el alelo progenitor de tipo salvaje. Este análisis revela el grado de diversidad de los cambios que condicionan la estabilidad al calor.

Varios de los mutantes HS secuenciados contienen el cambio idéntico de histidina a tirosina en la subunidad grande. Los mutantes HS derivados mediante PCR se pueden seleccionar rápidamente en busca de la alteración de histidina a tirosina, mediante el uso de mutagénesis específica del sitio usando cebadores que cambian la tirosina nuevamente por histidina.

Ejemplo 3 Expresión, purificación y análisis cinético de las variantes genéticas

Se han caracterizado completamente las condiciones para la expresión de la AGP del endospermo del maíz de tipo salvaje en E. coli. Las condiciones óptimas de crecimiento e inducción varían en cierto modo a partir de aquellas previamente publicadas para la AGP de la patata expresada en E. coli (Iglesias et al., 1993, anteriormente mencionado; Ballicora et al., 1995, anteriormente mencionado). La inducción a temperatura ambiente durante 12-14 h en presencia de IPTG 0,3 mM y 25 \mug/ml de ácido nalidíxico produce de manera consistente niveles elevados de expresión y de actividad. La adición de sulfato de amonio al 30% y de KH_{2}PO_{4}^{-}/K_{2}HPO_{4}^{-} 10 mM al tampón de extracción estabiliza la AGP del maíz en el extracto sin purificar.

La AGP concentrada con el sulfato de amonio se purificó adicionalmente mediante cromatografía de interacción hidrófoba utilizando medio Tentacle C3 aminopropilo (EM Separations) empaquetado en una columna de HR 10/10 de Pharmacia. La proteína se une a la columna en un tampón que contiene sulfato de amonio 1 M. La AGP se eluye de la columna mediante etapas sucesivas de gradientes de lavados con un tampón que contiene sulfato de amonio 0,75 M,
0,5 M, 0,25 M, y 0 M. La AGP del endospermo de maíz de tipo salvaje eluye típicamente en el lavado de 0,25 M.
La AGP del endospermo de maíz purificada mediante C3 se purifica adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando medio para intercambio aniónico Macro-Prep DEAE (BioRad) empaquetado dentro de una columna HR 10/10 de Pharmacia. La AGP se eluye mediante un gradiente lineal de KCl de 100-500 mM, y típicamente eluye a una concentración de sal de alrededor de 300 mM. Para todas las etapas de cromatografía se uso un sistema FPLC de Pharmacia. Las condiciones para las etapas de purificación individuales se caracterizaron completamente. La actividad de la AGP durante la purificación se monitorizó mediante el ensayo de pirofosforilisis, y las etapas de purificación se monitorizaron mediante SDS-PAGE, tinción de Coomassie, y análisis Western utilizando anticuerpos policlonales específicos para las unidades grande y pequeña de la AGP del endospermo de maíz.

Ejemplo 4 Interacción mejorada de la subunidad

Un efecto pleiotrópico completamente inesperado de los mutantes de la AGP del endospermo de maíz HS es una elevación de dos veces de la actividad antes del tratamiento con calor. Una posible explicación para este resultado es que tenemos, mediante cambio mutacional, un desplazamiento de la relación de monómeros y polímeros de SH2 y BT2 que existen dentro de la célula de E. coli. Tal vez, en el tipo salvaje, solamente 10% o menos de las proteínas totales existen en la forma heterotetramérica activa, mientras que, en los mutantes, este porcentaje es mucho mayor. Si el polímero es más resistente al calor que los monómeros, entonces el fenotipo de los mutantes podría ser idéntico a lo que se ha observado. El análisis cinético se puede usar para determinar cambios en las afinidades por sustratos y/o éfectores alostéricos.

Para probar la idea de que la relación del monómero/polímero se puede alterar en estos mutantes, se pueden monitorizar las cantidades de monómeros y polímeros en el tipo salvaje y en los mutantes seleccionados tanto antes como después del tratamiento con calor. La disponibilidad de los anticuerpos (Giroux, M.J. y Hannah, L. C. [1994] Mol. Gen. Genetics 243: 400-408) para ambas subunidades hace posible este enfoque. Esto se puede examinar tanto a través de ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa como a través de cromatografía en gel, y determinará fácilmente qué método es más eficiente y definitivo.

Puesto que la AGP de plantas superiores consiste en dos subunidades similares pero distintas que se oligomerizan para formar la estructura heterotetramérica nativa, las mutaciones que mejoran esta interacción pueden proporcionar estabilidad añadida a la enzima. Se puede usar un sistema de dos híbridos de levadura (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) para evaluar las interacciones de las subunidades. Se pueden construir cebadores específicos para la amplificación de las regiones codificantes. Estos cebadores añaden sitios de restricción únicos a los extremos 5' y 3' de manera que la clonación facilita la fusión traduccional de la subunidad individual al dominio de unión del ADN de GAL4 (pGBT9) o al dominio de activación GAL4 (pGAD424). Si las proteínas clonadas en los vectores interaccionan, el dominio de unión al ADN y el dominio de activación formarán un activador de la transcripción funcional. Esto a su vez activa la expresión del gen informador, lac Z, clonado detrás de un promotor GAL4.

Inicialmente, las condiciones se pueden caracterizar con las subunidades de tipo salvaje. Las regiones codificantes de las subunidades grande y pequeña de tipo salvaje se pueden clonar en los vectores de expresión de levadura pGBT9 y pGAD424. Se pueden generar y evaluar todas las posibles combinaciones. Los vectores pGBT9 y pGAD424 que contienen Sh2 y Bt2 se pueden cotransformar de la misma cepa de levadura, y se pueden seleccionar en busca del crecimiento en medio que carece de triptófano (pGBT9) y leucina (pGAD424). La interacción de la subunidad como una función de la expresión de lacZ se puede detectar de dos maneras. Las colonias positivas se identifican visualmente mediante un ensayo de filtro con B-galactosidasa. Con este ensayo las colonias se unen al filtro, se lisan, y se incuban con una disolución de X-gal. Se pueden analizar colonias que exhiben un color azul. La interacción de la subunidad se puede analizar adicionalmente mediante un ensayo enzimático específico para B-galactosidasa. Esto permite la cuantificación de la interacción. Las mutaciones que mejoran las interacciones de las subunidades producirán niveles más elevados de actividad de la B-galactosidasa cuando se ensayan.

Ejemplo 5 Mejoría adicional de la estabilidad

Los mutantes de la subunidad grande aislados varían en sus características de estabilidad al calor, sugiriendo la posibilidad de múltiples mutaciones. A pesar de que el análisis de secuencia de los mutantes HS 33 y HS 40 revela que las secuencias mutantes no son idénticas, ambos mutantes contenían el cambio idéntico de histidina a tirosina. Dada la identificación de diferentes alteraciones HS dentro de la proteína SH2, es posible construir eficientemente estos cambios dentro de una proteína. Además, cualesquiera de las mutaciones HS dentro de la subunidad pequeña se pueden coexpresar con los mutantes HS SH2 para mejorar adicionalmente la estabilidad de la enzima del endospermo de maíz.

Se pueden combinar fácilmente múltiples mutantes HS dentro de una subunidad. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes sitios de restricción únicos que dividen las regiones codificantes de Sh2 en tres fragmentos distintos. Cuando sea apropiado, se pueden generar combinaciones de mutaciones subclonando el fragmento correspondiente que contiene la mutación añadida. Si dos mutaciones se encuentran en estrecha proximidad, entonces se puede usar la mutagénesis dirigida al sitio para diseñar dichas combinaciones. Un método para mutaciones específicas del sitio implica PCR, cebador mutagénico, y el uso de la endonucleasa de restricción DpnI. Se pueden construir cebadores que contengan la mutación en el extremo 5', y se puede usar para amplificar mediante PCR utilizando la polimerasa Vent de corrección de lectura. El ADN amplificado se puede digerir entonces con Dpnl. El ADN progenitor aislado de E. coli se metila y por lo tanto es susceptible a Dpnl. El ADN digerido se fracciona por tamaños mediante electroforesis en gel, se liga, y se clona en de los vectores de expresión. Las mutaciones se confirman mediante análisis de secuencia, y se transforman en la cepa AC70R1-504 que porta la subunidad pequeña de tipo salvaje. Después, se pueden analizar los mutantes combinatorios.

Ejemplo 6 Combinación de las mutaciones para estabilidad al calor con Rev6

Según la presente invención, las mutaciones estables al calor se pueden combinar con una mutación asociada con el peso incrementado de la semilla, tal como, por ejemplo, la mutación Rev6. El objetivo es mantener la característica de insensibilidad al fosfato de Rev6 a la vez que se mejora su estabilidad. Se pueden construir mutantes dobles Rev6/HS, y confirmar como se describe en la presente invención. Los mutantes dobles se pueden transformar en AC70R1-504 que porta la subunidad pequeña de tipo salvaje. La estabilidad incrementada al calor se puede identificar fácilmente mediante una tinción positiva al glucógeno en un medio con bajo contenido de glucosa. Rev6 no se tiñe cuando se hace crecer en este medio. Inicialmente, todas las combinaciones de mutantes se pueden seleccionar enzimáticamente buscando el mantenimiento de la insensibilidad al fosfato, y solamente se analizan adicionalmente las combinaciones que mantienen la insensibilidad al fosfato.

Ejemplo 7 Clonación de los mutantes SSS I

Se puede obtener una cepa de glg A^{-} E. coli, deficiente en la glucógeno sintasa bacteriana endógena, a partir de E. coli Stock Center. Los vectores de expresión bacteriana habitualmente usados para la expresión de AGP se pueden usar para la expresión de SSS.

Una estrategia de clonación, como se utiliza, por ejemplo, con Sh2 y Bt2 (Giroux et al., 1996, anteriormente mencionado), es la siguiente: un cebador contiene un sitio de restricción único más el término 5' del transcrito, mientras que el otro cebador contiene otro sitio de restricción único y las secuencias 3' con relación al codón de terminación de la traducción del gen bajo investigación. La clonación subsiguiente de estos produce la fusión traduccional dentro del plásmido. Estos cebadores específicos del gen se utilizan inicialmente en las reacciones de RT-PCR usando poli A+ARN a partir de los endospermos en desarrollo.

La expresión de la SSS I del endospermo de maíz complementará la ausencia de la actividad de la glucógeno sintasa en la cepa glg A^{-}. La complementación se debería de visualizar fácilmente con tinción con yodo como ocurre con la expresión de AGP en la cepa glg C^{-}. Los extractos sin purificar se pueden incubar a diversas temperaturas y longitudes de tiempo para determinar la estabilidad al calor de la SSS I. La cepa glg A^{-}que expresa la SSS I del endospermo del maíz se puede hacer crecer a diversas temperaturas para determinar si la función es sensible a la temperatura al igual que con el sistema de expresión bacteriana de la AGP. Una vez que se establece una temperatura restrictiva, se puede llevar a cabo una mutagénesis al azar con el clon de SSS I. Las formas mutantes de SSS I se pueden transformar dentro de la cepa glg A^{-}, que se hacen crecer a la temperatura restrictiva, y las variantes estables al calor se pueden identificar por su capacidad para producir a la temperatura de restricción glucógeno que se tiñe con yodo.

Claims (33)

1. Polinucleótido que codifica un polipéptido de ADP glucosa fosforilasa (AGP) vegetal mutante, que comprende una mutación de aminoácido en su subunidad grande y que muestra un aumento de estabilidad al calor con relación a un polipéptido de AGP de tipo salvaje, en el que la mutación comprende la sustitución del aminoácido correspondiente a His-333, Ala-177, Asp-400, Val-454, Arg-104, Thr-460 o Arg-216 en maíz.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido mutante es AGP del endospermo de maíz.

3. Polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido mutante retiene 8-59% de actividad cuando se coloca en células de E. coli que expresan la subunidad BT2 y se hacen crecer a 60ºC durante 5 minutos.

4. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mutación comprende la sustitución de His-333.

5. Polinucleótido según la reivindicación 4, en el que la sustitución es Tyr.

6. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mutación comprende la sustitución de Ala-177.

7. Polinucleótido según la reivindicación 6, en el que la sustitución es Pro.

8. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mutación comprende la sustitución de Asp-400.

9. Polinucleótido según la reivindicación 8, en el que la sustitución es His.

10. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mutación comprende la sustitución de Val-454.

11. Polinucleótido según la reivindicación 10, en el que la sustitución es Ile.

12. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mutación comprende la sustitución de Arg-104.

13. Polinucleótido según la reivindicación 12, en el que la sustitución es Thr.

14. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mutación comprende la sustitución de Thr-460.

15. Polinucleótido según la reivindicación 14, en el que la sustitución es Ile.

16. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mutación comprende la sustitución de Arg-216.

17. Polinucleótido según la reivindicación 16, en el que la sustitución es Pro.

18. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido mutante comprende además una mutación Rev 6 que confiere un aumento de peso de la semilla a una planta que expresa el polinucleótido.

19. Método para aumentar la resistencia de una planta al calor, que comprende incorporar un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el genoma de la planta, y expresar la proteína codificada de ese modo.

20. Método según la reivindicación 19, en el que la planta es una planta de cereal.

21. Método según la reivindicación 19, en el que el cereal es maíz, trigo, arroz o cebada.

22. Método según la reivindicación 19, en el que la planta es Zea mays.

23. Planta que expresa el polipéptido de AGP mutante definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

24. Planta según la reivindicación 23, que es una planta de cereal.

25. Planta según la reivindicación 24, en la que el cereal es maíz, trigo, arroz o cebada.

26. Planta según la reivindicación 23, en la que la planta es Zea mays.

27. Tejido vegetal cuyo genoma comprende la secuencia de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

28. Tejido vegetal según la reivindicación 27, en el que la planta es una planta de cereales.

29. Tejido vegetal según la reivindicación 28, en el que el cereal es maíz, trigo, arroz o cebada.

30. Tejido vegetal según la reivindicación 27, en el que la planta es Zea mays.

31. Tejido vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, que es una semilla.

32. Polipéptido de ADP glucosa fosforilasa (AGP) vegetal mutante, que comprende una mutación de aminoácido en su subunidad grande y que muestra un aumento de estabilidad al calor con relación a un polipéptido de AGP de tipo salvaje, en el que la mutación comprende la sustitución del aminoácido correspondiente a His-333, Ala-177,
Asp-400, Val-454, Arg-104, Thr-460 o Arg-216 en maíz.

33. Polipéptido según la reivindicación 32, que es como se define según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18.