ES2291191T3

ES2291191T3 - Antagonistas del canal gardos.

Info

Publication number: ES2291191T3
Application number: ES00907283T
Authority: ES
Inventors: Grant Andrew Mcnaughton-Smith; Gregory Cooksey Rigdon; Jonathan Walter Stocker
Original assignee: Icagen Inc
Current assignee: Icagen Inc
Priority date: 1999-02-23
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2020-02-10
Also published as: AU2880700A; HK1045262B; AP1465A; AU762039B2; JP4038337B2; CA2371857A1; KR20020002393A; JP2007262075A; OA11838A; CA2371857C; IL145012A0; KR100705726B1; ATE370728T1; EP1158971A1; WO2000050026A1; CN1344158A; BR0008416A; AP2001002268A0; DE60036093D1; DE60036093T2

Abstract

Un compuesto que tiene la estructura: en la que, m, n y p se seleccionan independientemente entre 0 y 1 y al menos uno de m, n y p es 1; cuando m, n y p son todos 1, los sustituyentes fluoro en el anillo 1 y en el anillo 2 están localizados en una posición seleccionada independientemente entre orto respecto al sustituyente acetamida, meta respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida, y el sustituyente en el anillo 3 está en una posición seleccionada entre orto respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida; y cuando p es 0, y m es 1 y n es 1, el sustituyente fluoro en el anillo 1 está en posición para respecto al sustituyente acetamida, y el sustituyente en el anillo 2 está localizado en una posición seleccionada entre orto respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida.

Description

Antagonistas del canal Gardos.

Remisión a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº de Serie 60/135.511, presentada el 24 de marzo de 1999.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos orgánicos que son inhibidores específicos, potentes y seguros del canal de potasio activado por Ca^{2+} (canal Gardos) de los eritrocitos. Más particularmente, la invención se refiere a inhibidores basados en triarilmetano sustituido con flúor que muestran una resistencia remarcadamente potenciada a la degradación en medios biológicos in vitro y muestran semi-vidas prolongadas in vivo con relación a sus homólogos no fluorados.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de células falciformes se ha reconocido en África Occidental desde hace varios siglos. La anemia de células falciformes y la existencia de hemoglobina falciforme (Hb S) fue la primera enfermedad genética en entenderse a nivel molecular. Hoy en día se reconoce como el resultado morfológico y clínico de una sustitución de glicina a valina en la posición Nº 6 de la cadena de beta globina (Ingram, Nature 178: 792-794 (1956)). El origen del cambio aminoacídico y de la patología es la consecuencia de una sustitución de un único nucleótido (Marotta y col., J. Biol. Chem. 252:5040-5053 (1977)).

La fuente principal de morbilidad y mortalidad de pacientes que padecen la enfermedad de células falciformes es la oclusión vascular causada por las células falciformes, que causa episodios repetidos de dolor de forma tanto aguda como crónica y también causa daño orgánico creciente con el paso del tiempo. Desde hace tiempo se ha reconocido y aceptado que la deformación y distorsión de los eritrocitos falciformes después de la desoxigenación completa está causada por la polimerización y gelificación intracelular de la hemoglobina falciforme, hemoglobina S (Hb S). El fenómeno está bien revisado y analizado por Eaton y col., Blood 70: 1245 (1987). La gelificación y polimerización intracelular de Hb S puede suceder en cualquier momento durante un retorno del eritrocito a través de la vasculatura. Por tanto, los eritrocitos en pacientes con enfermedad de células falciformes que no contienen hemoglobina S polimerizada pueden pasar a través de la microcirculación y volver a los pulmones sin distorsionarse, pueden distorsionarse en las venas o pueden distorsionarse en los capilares.

La probabilidad de cada uno de estos acontecimientos está determinada por el retraso en el tiempo de la gelificación intracelular con relación al tiempo de tránsito capilar apropiado (Eaton, y col., Blood 47: 621 (1976)). A su vez, el retraso en el tiempo depende del estado de oxigenación de la hemoglobina, acortando la desoxigenación el retraso en el tiempo. Si es termodinámicamente imposible que la gelificación intracelular tenga lugar, o si el retraso en el tiempo a presiones de oxígeno venoso es más de aproximadamente 15 segundos, no sucederá la distorsión de las células. Si el retraso en el tiempo es entre aproximadamente 1 y 15 segundos, los glóbulos rojos probablemente se distorsionarán en las venas. Si el retraso en el tiempo es menor de aproximadamente 1 segundo, los glóbulos rojos se distorsionarán en los capilares.

Para glóbulos rojos que se distorsionan en los capilares, son posibles varios acontecimientos consecuentes. Estos varían desde la ausencia de efecto en el tiempo de tránsito, hasta la oclusión transitoria del capilar, a un bloqueo más permanente que finalmente puede provocar isquemia o infarto de las células adyacentes, y en la destrucción posterior del glóbulo rojo.

Los eritrocitos normales están compuestos de aproximadamente un 70% de agua. El agua cruza la membrana de un eritrocito normal en milisegundos. La pérdida de agua de la célula causa un aumento exponencial en la viscosidad citoplasmática ya que la concentración media de hemoglobina celular (MCHC) se eleva por encima de aproximadamente 32 g/dl. Como la viscosidad citoplasmática es un determinante principal de la deformabilidad y distorsión de los eritrocitos, la deshidratación del eritrocito tiene consecuencias reológicas y patológicas sustanciales. La regulación de la deshidratación de los eritrocitos está reconocida como un enfoque terapéutico importante para tratar la enfermedad de células falciformes. Como el agua celular sigue cualquier cambio osmótico en la concentración de iones intracelulares, el mantenimiento de la concentración de potasio en los glóbulos rojos es de particular importancia (Stuart y col., Brit J. Haematol. 69:1-4 (1988)).

Se han intentado muchos enfoques para tratar terapéuticamente las células falciformes deshidratadas (disminuyendo de este modo la polimerización de la hemoglobina S bajando la osmolalidad del plasma) con éxito limitado, incluyendo los siguientes enfoques: infusión intravenosa de agua destilada (Gye y col., Am. J. Med. Sci. 266: 267-277 (1973)); administración de la hormona antidiurética vasopresina junto con una elevada ingesta de fluido y restricción salina (Rosa y col., M. Eng. J. Med. 303:1138-1143 (1980)); Charache y col., Blood 58: 892-896 (1981)); el uso de monensina para aumentar el contenido de cationes de la célula falciforme (Clark y col., J. Clin. Invest. 70: 1074-1080(1982)); Fahim y col., Life Sciences 29: 1959-1966(1981)); administración intravenosa de citrato de cetiedilo (Benjamin y col., Blood 67: 1442-1447 (1986)); Berkowitz y col., Am. J Hematol. 17: 217-223 (198/1)); Stuart y col., J. Clin. Pathol. 40: 1182-1186 (1987)); y el uso de oxpentifilina (Stuart y col., supra).

Otro enfoque hacia el tratamiento terapéutico de células falciformes deshidratadas implica alterar el flujo de potasio en el eritrocito dirigiéndose un canal de potasio dependiente de calcio (Ishi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (21): 11651-6 (1997)). Este canal de potasio activado por calcio también se menciona como el canal Gardos (Brugnara y col., J. Clin. Invest. 92: 520-526 (1993)). Recientemente, un canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia humano clonado, hlK1, demostró ser sustancialmente similar al canal Gardos en términos tanto de sus propiedades biológicas como farmacológicas (Ishi, supra).

Los procedimientos que se han usado para inhibir el canal Gardos incluyen la administración a eritrocitos de imidazol, nitroimidazol y agentes antimicóticos de triazol tales como clotrimazol (Patente de Estados Unidos Nº 5.273.992 de Brugnara y col.). El clotrimazol, un agente antimicótico que contiene imidazol, ha demostrado ser un inhibidor específico, potente del canal Gardos de eritrocitos normales y falciformes, y evita la deshidratación dependiente de Ca^{2+} de las células falciformes tanto in vitro como in vivo (Brugnara, supra; De Franceschi y col., J. Clin. Invest. 93: 1670-1676 (1994)). Cuando se combina con un compuesto que estabiliza la oxiconformación de Hb S, el clotrimazol induce una reducción aditiva en la velocidad de coagulación de un filtro de microporos y puede atenuar la formación de células irreversiblemente falciformes (Stuart y col., J. Haematol. 86: 820-823 (1994)). Otros compuestos que contienen un resto heteroarilo tipo imidazol que se creía que eran útiles para reducir la deshidratación de los eritrocitos falciformes mediante la inhibición del canal Gardos incluyen miconazol, econazol, butoconazol, oxiconazol y sulconazol. Aunque estos compuestos han demostrado ser eficaces para reducir la deshidratación de las células falciformes, se ha descubierto
que otros compuestos de imidazol son incapaces de inhibir el canal Gardos y evitar la pérdida de potasio.

El documento WO 97/34589 describe una clase de compuestos químicos descritos como fármacos eficaces en el tratamiento de la enfermedad de células falciformes y enfermedades caracterizadas por proliferación celular no deseada o anormal. Los compuestos activos son compuestos de triarilmetano sustituidos o análogos de los mismos en los que uno o más de los grupos arilo está reemplazado con un grupo heteroarilo, cicloalquilo o heterocicloalquilo y/o el átomo de carbono terciario está reemplazado con un átomo diferente tal como Si, Ge, N o P. Se ha informado de que los compuestos inhiben la proliferación de células de mamífero, inhiben el canal Gardos de los eritrocitos, reducen la deshidratación de eritrocitos falciformes y/o retrasan la aparición de distorsión o deformación de los eritrocitos.

Como la anemia de células falciformes es una enfermedad crónica, los agentes indicados para el tratamiento mostrarán de forma ideal ciertas características que son menos esenciales en los fármacos para tratar una enfermedad curable (por ejemplo, infecciones fúngicas). Un inhibidor del canal Gardos clínicamente útil mostrará toxicidad extremadamente baja durante un transcurso prolongado de administración, tendrá una excelente biodisponibilidad, será altamente específico para el canal Gardos y será potente en sus interacciones con este canal.

Aunque el clotrimazol y ciertos compuestos relacionados han demostrado inhibir el canal Gardos y evitar la pérdida de potasio, estos compuestos son menos ideales como agentes clínicos para el tratamiento de la anemia de células falciformes. Es de preocupación principal el hecho de que la administración prolongada de antimicóticos de imidazol ha demostrado provocar hepatotoxicidad (véase, por ejemplo, Rodriguez y col., Toxicology 6: 83-92 (1995); Findor y col., Medicina 58: 277-81 (1998); y Rodriguez y col., J. Biochem. Toxicol. 11: 127-31 (1996)). La tendencia a la toxicidad de un agente debe equilibrarse con otras características tales como biodisponibilidad, selectividad de diana y potencia.

Los inhibidores del canal Gardos actualmente conocidos tienen bajas semi-vidas in vivo y bajas biodisponibilidades. Estas deficiencias son de particular preocupación en conexión con estos fármacos, ya que deben administrarse de forma regular durante una parte significativa de la vida de una persona. Con dichos fármacos, el cumplimiento del paciente con el régimen de dosificación es crucial, y cuanto más simple es el régimen, será más probable que el paciente cumpla el régimen. Los inhibidores del canal Gardos que tienen bajas biodisponibilidades deben administrarse frecuentemente, elevando el riesgo de dosis olvidadas y los consiguientes niveles inadecuados en plasma de los fármacos para evitar la deshidratación de los eritrocitos. Además de la dosificación frecuente, los agentes que tienen bajas biodisponibilidades generalmente deben administrarse en dosificaciones mayores que agentes análogos con mejores biodisponibilidades. A mayores dosificaciones, los efectos secundarios indeseables y la toxicidad llegan a ser una preocupación muy real.

Bartroli y col., Arzneim. Forsch. / Drug Res., 42, 6, 832-835 (1992) describen la síntesis y las actividades comparativas in vitro de derivados difluoro de compuestos trifenilmetano imidazol y otros compuestos relacionados frente a una serie de hongos.

Además de su baja biodisponibilidad, los inhibidores del canal Gardos conocidos tales como clotrimazol también tienen potencia relativamente baja en su interacción con el canal Gardos. La baja potencia de los compuestos se exacerba por su baja biodisponibilidad y la rápida eliminación sistémica. Un inconveniente adicional de muchos inhibidores del canal Gardos conocidos es la naturaleza no específica de sus interacciones con los canales de potasio activados por calcio: estos agentes interaccionan fácilmente con canales de potasio activados por calcio diferentes del canal Gardos. Tomado en conjunto, la baja potencia, la baja especificidad y baja biodisponibilidad de los inhibidores del canal Gardos conocidos obligan a una dosificación mayor y más frecuente, aumentando de este modo el riesgo de efectos secundarios indeseables y toxicidad.

En vista de los inconvenientes descritos anteriormente de los inhibidores del canal Gardos actualmente conocidos, se espera un avance sustancial en el tratamiento de la anemia de células falciformes a partir del descubrimiento de inhibidores del canal Gardos que no contengan imidazol como componente estructural, estén apreciablemente biodisponibles, se metabolicen y se excreten lentamente y sean tanto potentes como específicos en sus interacciones con el canal Gardos. De forma bastante sorprendente, la presente invención proporciona inhibidores del canal Gardos que tienen estas características.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de la concentración plasmática media frente al tiempo para los compuestos 1 (i.v. (\blacklozenge), oral (\ding{115})), 3 (i.v. (*), oral (\bullet)) y 18 (i.v. (\sqbullet), oral (x)). Las dosificaciones fueron, i.v. (1 mg/kg) y oral (10 mg/kg).

Sumario de la invención

Reducir la deshidratación de los eritrocitos falciformes mediante el bloqueo del canal Gardos es un enfoque terapéutico poderoso hacia el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de células falciformes. Los compuestos capaces de inhibir el canal Gardos como medio para reducir la deshidratación de las células falciformes son muy deseables, y son un objetivo de la presente invención. Aunque son de demostrable eficacia, los inhibidores del canal Gardos basados en imidazol que se han explorado hasta la fecha están impedidos por varios inconvenientes que incluyen un potencial bien documentado de hepatotoxicidad. Esta toxicidad está exacerbada por las bajas potencias de los inhibidores, interacciones no específicas con canales de potasio activados por calcio diferentes del canal Gardos y bajas biodisponibilidades, cada uno de los cuales motiva la administración de dosificaciones mayores y más frecuentes de los inhibidores.

En contraste con estos agentes conocidos, un inhibidor del canal Gardos de segunda generación farmacéuticamente útil mostrará estabilidad prolongada en un medio biológico y potencia y selectividad para el canal Gardos. Un agente ideal se degrada a menos del 60% después de dos horas de incubación en un medio biológico (por ejemplo, una preparación microsómica) y tiene una CI_{50} para el canal Gardos de no más de 30 nM. Además, estos agentes son al menos 100 veces más selectivos para el canal Gardos que para otros canales de potasio, tales como I_{Ks}.

Ahora se ha descubierto que inhibidores basados en trifenilacetamida del canal Gardos, en los que uno o más grupos fenilo están sustituidos con uno o más átomos de flúor o restos que contienen flúor, tienen semi-vidas in vivo y estabilidades metabólicas in vitro que están potenciadas a un grado sorprendente con relación tanto a clotrimazol como a trifenilacetamidas no fluoradas análogas. Por ejemplo, el clotrimazol (19) se degrada al 94,2% después de incubar dos horas en una preparación microsómica de hígado y una trifenilmetilacetamida no fluorada (20) se degrada al 87% después de 2 horas. En marcado contraste, los compuestos difluorados representativos de la invención 3 y 5 se degradan, respectivamente, solamente al 24% y al 29% después de una incubación similar.

Aunque estudios sobre antimicóticos de trifenilimidazol fluorados demostraron que estos agentes fluorados se metabolizaban menos rápidamente que sus análogos clorados, estos agentes también eran menos activos farmacológicamente que derivados clorados análogos (véase,Conte y col., Arneim-Forsch./Drug Res. 42: 854-858 (1992); y Bartoli, y col., Arneim-Forsch./Drug Res. 42: 832-835 (1992)). Sorprendentemente, sin embargo, se observa una tendencia bastante opuesta para los compuestos de la invención: los compuestos fluorados no son solamente más potentes, sino también inhibidores más selectivos del canal Gardos que el clotrimazol. Por ejemplo, los compuestos 3 y 5 son aproximadamente 8 y 10 veces más potentes que el clotrimazol respecto al canal Gardos. Además, los compuestos 3 y 5 son aproximadamente 16 y 17 veces más selectivos para el canal Gardos sobre otros canales de iones potasio (por ejemplo, I_{Ks}) que el clotrimazol.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula (I):

1

en la que,

m, n y p se seleccionan independientemente entre 0 y 1 y al menos uno de m, n y p es 1;

cuando m, n y p son todos 1, los sustituyentes fluoro en el anillo 1 y en el anillo 2 están localizados en una posición seleccionada independientemente entre orto respecto al sustituyente acetamida, meta respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida, y el sustituyente en el anillo 3 está en un posición seleccionada entre orto respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida; y

cuando p es 0, y m es 1 y n es 1, el sustituyente fluoro en el anillo 1 está en posición para respecto al sustituyente acetamida, y el sustituyente en el anillo 2 está localizado en una posición seleccionada entre orto respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la Fórmula (I) en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha preparación puede administrarse en procedimientos de la invención.

El control de las enfermedades (por ejemplo, enfermedad de células falciformes) mediante la alteraciónde los flujos iónicos celulares de las células afectadas por una enfermedad es un enfoque terapéutico poderoso. Además, la comprensión básica del papel de los flujos iónicos celulares tanto en procesos patológicos como en la fisiología normal promete proporcionar nuevas modalidades terapéuticas, regímenes y agentes. Los compuestos que alteran los flujos iónicos celulares, particularmente los que inhiben el flujo de potasio, son muy deseables como fármacos y como sondas para dilucidar los mecanismos básicos subyacentes a estos flujos iónicos. De forma similar, los procedimientos que utilizan estos compuestos en investigación básica y en aplicaciones terapéuticas son herramientas valiosas en el arsenal tanto del investigador como del médico. Por lo tanto, dichos compuestos y procedimientos también son un objetivo de la presente invención.

Por tanto, en un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir el flujo de potasio de una célula. El procedimiento comprende poner en contacto una célula con una cantidad de un compuesto de acuerdo con la Fórmula (I) eficaz para inhibir el flujo de potasio.

Una vía terapéutica importante para el tratamiento de la enfermedad de células falciformes es prevenir o retardar la deshidratación de los eritrocitos manipulando los flujos iónicos celulares de los eritrocitos. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para reducir la deshidratación de los eritrocitos. El procedimiento comprende poner en contacto un eritrocito con una cantidad de un compuesto de acuerdo con la Fórmula (I) eficaz para reducir la deshidratación de los eritrocitos.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad de células falciformes. El procedimiento comprende administrar a un sujeto que padece la enfermedad de células falciformes una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula (I).

Los compuestos de la invención representan una nueva clase de inhibidores del flujo de potasio activado por calcio que presentan excelente resistencia a la degradación metabólica y tanto selectividad como potencia hacia el canal Gardos que están potenciadas con relación a sus análogos no fluorados. Por tanto, en un sexto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para potenciar la resistencia a la degradación en un medio biológico de un inhibidor del canal de potasio, que comprende un resto trifenilmetilo.

Estos y otros objetivos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos.

Descripción detallada de la invención y las realizaciones preferidas Abreviaturas y Definiciones

"MCHC", es la "concentración de hemoglobina corpuscular media".

"SAD-1" es un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de células falciformes como se describe por Trudel y col., EMBO J., 10 (11): 3157-3165(1991).

"Medio biológico", como se usa en este documento se refiere a medios biológicos tanto in vitro como in vivo. Los "medios biológicos" in vitro ejemplares incluyen cultivo celular, cultivo tisular, homogeneizados, plasma y sangre. Las aplicaciones in vivo generalmente se realizan en mamíferos, preferiblemente seres humanos.

"Fluoroalquilo" se refiere a una subclase de "alquilo sustituido" que abarca grupos alquilo o alquilo sustituido que están parcialmente fluorados o per-fluorados. La sustitución con flúor puede ser solamente una sustitución del resto alquilo o puede ser en sustancialmente cualquier combinación con cualquier otro sustituyente o grupo de
sustituyentes.

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Introducción

Como se ha analizado anteriormente, el bloqueo de la deshidratación falciforme mediante la inhibición del canal Gardos es un enfoque terapéutico poderoso para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de células falciformes. Estudios in vitro han demostrado que el clotrimazol, un agente antimicótico que contiene imidazol, bloquea el flujo de K^{+} activado por Ca^{2+} y la deshidratación celular en eritrocitos falciformes (Brugnara y col., J. Clin. Invest. 92: 520-526 (1993)). Estudios en un modelo de ratón transgénico para la enfermedad de células falciformes, el ratón SAD-1 (Trudel y col., EMBO J. 11: 3157-3165 (1991)), muestran que la administración oral de clotrimazol conduce a la inhibición del canal Gardos de los glóbulos rojos, un contenido aumentado de K^{+} en los glóbulos rojos, una concentración disminuida de hemoglobina corpuscular media (MCHC) y densidad celular disminuida (De Franceschi y col., J. Clin. Invest. 93: 1670-1676 (1994)). Además, la terapia con clotrimazol oral induce la inhibición del canal Gardos y reduce la deshidratación de los eritrocitos en pacientes con la enfermedad de células falciformes (Brugnara y col., J. Clin. Invest. 97: 1227-1234 (1996)). Otros agentes antimicóticos, que inhiben el canal Gardos in vitro, incluyenmiconazol, econazol butoconazol, oxiconazol y sulconazol (Patente de Estados Unidos Nº 5.273.992 expedida a Brugnara y col.). Todos estos compuestos contienen un anillo tipo imidazol, es decir, un anillo heteroarilo que contiene dos o más nitrógenos.

Aunque es de eficacia demostrable, los inhibidores basados en imidazol del canal Gardos que se han explorado hasta la fecha están impedidos por varios inconvenientes que incluyen un potencial bien documentado de hepatotoxicidad. Esta toxicidad está exacerbada por las bajas potencias de los inhibidores, las interacciones no específicas con canales de potasio diferentes del canal Gardos y las bajas biodisponibilidades, cada uno de los cuales motiva la administración de dosificaciones mayores y más frecuentes de los inhibidores.

Para proporcionar agentes farmacéuticos superiores capaces de inhibir el canal Gardos, deben cumplirse tres criterios farmacológicos. Primero, los compuestos deben ser estables en un medio biológico, de modo que al menos el 40% del compuesto permanezca intacto después de dos horas en este medio. Además, los compuestos deben ser inhibidores potentes del canal Gardos, que tengan una CI_{50} para este canal de menos de o igual a 30 nM. Además de su potencia para el canal Gardos, los compuestos también deben ser selectivos en su interacción con este canal. Los compuestos deben tener una selectividad medida por un índice CI_{50} (I_{Ks}/Gardos) de más de o igual a 80.

Los compuestos

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula (I):

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en la que,

cuando m, n y p son todos 1, los sustituyentes fluoro en el anillo 1 y en el anillo 2 están localizados en una posición seleccionada independientemente entre orto respecto al sustituyente acetamida, meta respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida, y el sustituyente en el anillo 3 está en una posición seleccionada entre orto respecto al sustituyente acetamida y para respecto al sustituyente acetamida; y

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En una realización actualmente preferida, los compuestos de la invención tienen una estructura de acuerdo con la Fórmula (II):

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en la que, m, n y p se seleccionan independientemente entre 0 y 1, y al menos uno de m, n y p es 1.

Los compuestos de acuerdo con esta estructura se presentan en la Tabla 1 e incluyen los compuestos 1-5.

En otra realización preferida, los compuestos de la invención tienen una estructura de acuerdo con la Fórmula III:

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en la que m es 0 ó 1.

Los compuestos de acuerdo con la Fórmula III se presentan en la Tabla 1 e incluyen los compuestos 3 y 5.

Los compuestos que están estructuralmente muy relacionados con compuestos de la invención también se presentan en la Tabla 1. Los compuestos que están estructuralmente relacionados con los compuestos de la invención sirven como "medida inicial" para la evaluación de las ventajas y propiedades inesperadas y beneficios de los compuestos fluorados de la invención.

TABLA 1

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Síntesis de los Compuestos

Los compuestos de la invención pueden prepararse por técnicas que son convencionales en la técnica de la síntesis orgánica. Los materiales de partida y reactivos apropiados pueden obtenerse en el mercado o pueden prepararse por técnicas de química orgánica convencionales. Los procedimientos preferidos se ilustran por los ejemplos específicos. Una vía sintética ejemplar se proporciona en el Esquema 1.

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Esquema 1

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En el Esquema 1, la síntesis de una trifenilacetamida sustituida con flúor transcurre desde el trifenilmetanol sustituido con flúor correspondiente que se prepara a partir de una benzofenona sustituida con flúor y un reactivo que añade un resto fenilo o fenilo sustituido con flúor a la cetona benzofenona. El trifenilmetanol sustituido con flúor se convierte posteriormente en el trifenilacetonitrilo sustituido con flúor correspondiente exponiendo el alcohol a cloruro de acetilo seguido de cianuro de cobre. La acetamida puede formarse haciendo reaccionar el nitrilo intermedio con una mezcla de ácido sulfúrico y acético glacial. Otras vías sintéticas que conducen a especies de trifenilmetano sustituido con flúor, particularmente acetamidas, pertenecen a las capacidades de los especialistas en la técnica.

Estabilidad de los Compuestos

Para que los compuestos funcionen como inhibidores farmacéuticamente útiles del canal Gardos, los compuestos candidatos deben demostrar tanto biodisponibilidad como estabilidad in vivo aceptables. Se considera que los compuestos tienen un nivel suficiente de estabilidad cuando al menos el 40% de una cantidad inicial del compuesto permanece intacto después de dos horas de incubación en un medio biológico (por ejemplo, preparación microsómica). Este nivel de estabilidad es particularmente importante para tratar un síndrome crónico tal como anemia de células falciformes. A los sujetos que experimentan tratamiento par la anemia de células falciformes se les debe dosificar de forma regular el agente anti-distorsión (por ejemplo, el inhibidor del canal Gardos) durante toda su vida. Entre otras preocupaciones, dicho régimen de dosificación de por vida presenta un grave riesgo de cumplimiento variable del paciente con el régimen. Si el título de la medicación en el sistema del paciente disminuye como resultado de un mal cumplimiento, esto eleva el riesgo de la existencia de un acontecimiento de células falciformes y el dolor y daño físico y fisiológico consecuente. Los compuestos que tienen tiempos de residencia in vivo aumentados y biodisponibilidad aumentada permiten un régimen de dosificación simplificado (es decir,menos dosis/día y/o menos medicación). Además, la reducción de la cantidad de compuesto administrado conlleva la reducción de los efectos secundarios como resultado de la medicación y/o sus metabolitos. Por tanto, es muy deseable proporcionar inhibidores del canal Gardos que demuestren buenas biodisponibilidades y estabilidades potenciadas in vivo.

La estabilidad de los compuestos en diversos medios biológicos puede ensayarse por procedimientos conocidos en la técnica. En una realización, la estabilidad de los compuestos se ensaya en una preparación in vitro. En una realización preferida, la preparación in vitro es una preparación microsómica de hígado. Los resultados de dichos ensayos in vitro proporcionan datos relevantes para la estabilidad in vivo de los compuestos de la invención. Se conocen en la técnica otros ensayos in vitro útiles para ensayar la estabilidad de los compuestos de la invención.

Además de los procedimientos in vitro, pueden realizarse procedimientos in vivo tales como estudios farmacocinéticos en un intervalo de modelos animales. Pueden administrarse uno o más compuestos de la invención a un animal, preferiblemente una rata, a diferentes dosificaciones y/o por diferentes vías (por ejemplo,i.v., i.p., p.o.). Pueden recogerse muestras de sangre, orina y/o heces en momentos puntuales en serie y las muestras pueden ensayarse para la presencia y/o concentración del(de los) compuesto(s) de la invención y/o los metabolitos del(de los) compuesto(s).

Puede utilizarse cualquier cantidad apropiada para comparar datos de diferentes compuestos. Las cantidades ejemplares incluyen, semi-vida, biodisponibilidad, cantidad de compuesto que permanece intacto después de un periodo de tiempo predeterminado y similares. En una realización preferida, se utiliza la cantidad de compuesto que permanece intacto después de un periodo de tiempo predeterminado. Como se usa en este documento, "intacto" se refiere a compuesto que no se ha metabolizado o degradado de otro modo en una especie diferente a partir del compuesto original.

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En una realización preferida, el periodo de tiempo predeterminado es de aproximadamente dos horas a aproximadamente setenta y dos horas, más preferiblemente de aproximadamente 4 horas a aproximadamente veinticuatro horas. En otra realización preferida la cantidad de compuesto intacto que permanece después de un periodo de tiempo predeterminado de dos horas es al menos el 40% de la muestra inicial, preferiblemente al menos el 50% y más preferiblemente al menos el 70%.

Cualquier técnica que permita la detección y, preferiblemente, la cuantificación del(de los) compuesto(s) y/o metabolitos es apropiada para su uso en el ensayo de los compuestos de la invención. Estos procedimientos incluyen procedimientos espectrométricos (por ejemplo,RMN (por ejemplo, ^{19}F RMN), EM, IR, UV/vis), procedimientos cromatográficos (por ejemplo,CL, CG, HPCL) y procedimientos híbridos que utilizan procedimientos tanto espectrométricos como cromatográficos (por ejemplo, CG/EM, CL/EM, CL/EM/EM). Además, los procedimientos pueden utilizar marcadores detectable tales como compuestos de la invención que están marcados con radioisótopos (por ejemplo, ^{3}H, ^{15}N, ^{14}C) o marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina). Otros procedimientos para ensayar la persistencia in vivo de pequeñas moléculas orgánicas, particularmente las aplicables a moléculas bioactivas, serán evidentes para los especialistas en la técnica.

Actividad de los Compuestos

Para desarrollar inhibidores del canal Gardos farmacéuticamente útiles, los compuestos candidatos deben demostrar actividad aceptable hacia el canal diana. Los compuestos se consideran suficientemente potentes si tienen una CI_{50} para el canal Gardos de no más de 30 nM.

Como se ha analizado anteriormente en el contexto de la estabilidad de los compuestos, este nivel de actividad es particularmente importante para tratar un síndrome crónico tal como anemia de células falciformes. Las diversas preocupaciones acerca del cumplimiento del paciente y los efectos secundarios están bien abordados por los inhibidores del canal Gardos que tienen una potencia para el canal Gardos de 30 nM.

La actividad de los compuestos de la invención hacia los canales iónicos, tales como el canal Gardos puede ensayarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase, Brugnara y col., J. Biol. Chem., 268(12): 8760-8768 (1993). Utilizando los procedimientos descritos en esta referencia, puede ensayarse tanto el porcentaje de inhibición del canal Gardos como la CI_{50} de los compuestos de la invención.

En un ensayo ejemplar, la inhibición por los compuestos de ensayo de un canal Gardos de eritrocito puede ensayarse usando glóbulos rojos humanos. El grado de inhibición puede medirse usando un material detectable tal como ^{86}Rb. En un ensayo ejemplar, utilizando ^{86}Rb, puede ensayarse la inhibición del canal Gardos exponiendo glóbulos rojos a ^{86}Rb y un compuesto de ensayo y midiendo la cantidad de ^{86}Rb captada por las células. Numerosas variaciones de este ensayo serán evidentes para los especialistas en la técnica.

La potencia de los compuestos de la invención puede ensayarse usando eritrocitos por un procedimiento tal como el descrito por Brugnara y col., J. Clin. Invest., 92: 520-526 (1993). En resumen, los eritrocitos se exponen a un compuesto de ensayo y un medio que contiene ^{86}Rb. La velocidad inicial de transporte de ^{86}Rb puede calcularse a partir de un parámetro tal como la pendiente de mínimos cuadrados lineal de la captación de ^{86}Rb por la(s) célula(s). Las constantes de inhibición pueden calcularse por procedimientos convencionales usando ajuste a curvas no lineales asistido por ordenador.

Se conocen en la técnica otros procedimientos para ensayar la actividad de los canales iónicos y la actividad de agentes que afectan a los canales iónicos. La selección de un procedimiento de ensayo apropiado pertenece a la capacidad de los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Hille, B., IONIC CHANNELS OF EXCITABLE MEMBRANES, Sinaner Associates, Inc. Sunderland, MA (1992).

Los resultados de los ensayos de inhibición del canal Gardos y eritrocitos utilizando compuestos de la invención y otros compuestos muy relacionados se presentan en la siguiente Tabla 2. Los números de compuesto en la Tabla 2 son remisiones a las estructuras de los compuestos presentados en la Tabla 1.

TABLA 2

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Selectividad de los Compuestos

Para que los compuestos funcionen como inhibidores del canal Gardos farmacéuticamente útiles, los compuestos candidatos deben demostrar selectividad aceptable hacia el canal diana. Los compuestos que tienen selectividad por el canal Gardos, medida por el índice de CI_{50} de un compuesto para I_{Ks} frente a su CI_{50} para el canal Gardos de al menos 80 se consideran suficientemente selectivos. Los registros de corriente I_{Ks} se hicieron usando la metodología de pinzamiento zonal de células completas en miocitos de cobaya como se describe en Turgeon y col., Circulation Research 75: 879-86 (1994).

La selectividad de un compuesto particular por el canal Gardos con relación a otro canal de iones potasio se determina convenientemente como una proporción de dos cantidades relacionadas con la unión del compuesto (por ejemplo,CI_{50}). En una realización preferida, la selectividad se determina usando las actividades determinadas como se ha analizado anteriormente, sin embargo, se conocen otros procedimientos para ensayar la actividad de los canales iónicos y la actividad de agentes que afectan a los canales iónicos en la técnica. La selección de procedimientos de ensayo apropiados pertenece a las capacidades de los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Hille, B., IONIC CHANNELS OF EXCITABLE MEMBRANES, Sinaner Associates, Inc. Sunderland, MA (1992).

Los resultados de las determinaciones de selectividad para los compuestos de la invención y otros compuestos muy relacionados se presentan en la Tabla 2. La selectividad de los compuestos por el canal Gardos se determinó con relación a I_{Ks}, un canal de iones potasio ejemplar. Los números de compuesto en la Tabla 2 son remisiones a las estructuras de los compuestos presentados en la Tabla 1.

Como puede observarse a partir de los resultados presentados anteriormente, los compuestos de la invención demuestran una selectividad marcado por el canal Gardos frente a otros canales de iones potasio (por ejemplo, I_{Ks}). Además, los compuestos de la invención son inhibidores potentes del canal Gardos. Además, las semi-vidas in vivo de estos compuestos están potenciadas de forma demostrable con relación a compuestos no fluorados tales como clotrimazol.

En una realización, los compuestos de la invención son inhibidores potentes, selectivos y estables del flujo de potasio, tal como el mediado por el canal Gardos.

Los compuestos de la invención son preferiblemente estables en un medio biológico, tal como una preparación enzimática microsómica in vitro permaneciendo al menos un 40% del compuesto intacto después de dos horas de incubación en el medio biológico, preferiblemente más del 50% y más preferiblemente más del 70%.

Aunque sin el deseo de limitarse por ninguna teoría particular de funcionamiento, actualmente se cree que ciertas características estructurales de los compuestos de la invención (es decir, reemplazo de hidrógeno con flúor) están actualmente implicadas en la estabilidad, selectividad y potencia de estos compuestos. Por tanto, en una realización preferida, los inhibidores de la invención comprenden un resto arilo, en el que al menos un átomo de hidrógeno del resto arilo está reemplazado por un radical que comprende un átomo de flúor. En esta realización, la invención abarca derivados fluorados de los compuestos que inhiben el flujo de iones potasio, particularmente los que tienen actividad inhibidora del canal Gardos (por ejemplo, agentes antimicóticos, por ejemplo, miconazol, econazol, butoconazol, oxiconazol y sulconazol). Otros agentes que tienen actividad inhibidora del canal de iones potasio, y particularmente el canal Gardos
y al menos un resto arilo que lleva al menos un átomo de flúor están dentro del alcance de la presente invención.

En una realización preferida, el resto arilo es un grupo fenilo. En otra realización preferida, el resto arilo es un constituyente de un grupo trifenilmetilo.

El(los) compuesto(s) de la invención pueden administrarse per se o en forma de una composición farmacéutica en la que el(los) compuesto(s) activos(s) está(n) en mezcla con uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Por tanto, además de los compuestos que afectan a los flujos de iones celulares (por ejemplo, actividad inhibidora del canal Gardos), la presente invención también proporciona formulaciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la invención.

Formulaciones Farmacéuticas

En un segundo aspecto, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de la invención de acuerdo con la Fórmula (I) en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, los compuestos son aquellos de acuerdo con la Fórmula (II) y más preferiblemente de acuerdo con la Fórmula (III).

Los compuestos descritos en este documento, o sales de adición o hidratos farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden formularse para suministrarse a un paciente usando una amplia diversidad de vías o modos de administración. Las vías de administración adecuadas incluyen, administración por inhalación, transdérmica, oral, ocular, rectal, a través de la mucosa, intestinal y parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intravenosas.

Los compuestos descritos en este documento, o sales y/o hidratos farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden administrarse individualmente, en combinación con otros compuestos de la invención, y/o en cócteles combinados con otros agentes terapéuticos. La elección de los agentes terapéuticos que pueden co-administrarse con los compuestos de la invención dependerá, en parte, de la afección que se está tratando.

Por ejemplo, cuando se administra a pacientes que padecen la enfermedad de células falciformes, los compuestos de la invención pueden administrarse en cócteles que contienen agentes usados para tratar el dolor, infección y otros síntomas y efectos secundarios habitualmente asociados con la enfermedad de células falciformes. Dichos agentes incluyen, por ejemplo,analgésicos, antibióticos, etc. Los compuestos también pueden administrarse en cócteles que contienen otros agentes que se usan comúnmente para tratar la enfermedad de células falciformes, incluyendo butirato y derivados de butirato (Perrine y col., N. Engl. J. Med. 328(2): 81-86 (1993)); hidroxiurea (Charache y col., N. Engl. J. Med. 323(20): 1317-1322 (1995)); eritropoyetina (Goldberg y col., N. Engl. J. Med. 323(6): 366-372 (1990)); y sales de la dieta tales como magnesio (De Franceschi y col., Blood 88(648a): 2580 (1996)).

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Para inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o tampón salino fisiológico. En una realización actualmente preferida, la formulación comprende y un alcohol y/o glicol. Otros componentes útiles de esta formulación incluyen, por ejemplo, tensioactivos, emulsivos y materiales tales como aceites etoxilados. Una formulación ejemplar comprende un compuesto de la invención, poli(etilenglicol) 400, etanol y agua en una proporción 1:1:1.
Otra formulación ejemplar comprende un compuesto de la invención, agua, poli(etilenglicol) 400 y Cremophor-EL.

Para administración a través de la mucosa (por ejemplo,bucal, rectal, nasal, ocular, etc.), se usan en la formulación penetrantes apropiados para atravesar la barrera. Dichos penetrantes son conocidos en líneas generales en la técnica.

Para administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando el(los) compuesto(s) acti-
vos(s) con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos posibilitan que los compuestos de la invención se formulen en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden combinarse con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después añadiendo auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de comprimido o gragea. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico.

Los núcleos de gragea están provistos de revestimientos adecuados. Para este propósito, pueden usarse soluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de gragea para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse de forma oral incluyen cápsulas de ajuste por presión fabricadas de gelatina, así como cápsulas precintadas, blandas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener los ingredientes activos en mezcla con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para cada administración.

Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de una manera convencional.

Para administración por inhalación, los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, enampollas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, tales como los descritos anteriormente para administración intravenosa. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse en forma de suspensiones de inyección oleosas adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo,agua libre de pirógenos estéril, antes de su uso.

Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo,que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden formularse en forma de una preparación de depósito. Dichas formulaciones de larga acción pueden administrarse por implante o suministro transcutáneo (por ejemplo, de forma subcutánea o intramuscular), inyección intramuscular o un parche transdérmico. Por tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes en fase sólida o gel adecuados. Los ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.

Dosificaciones Eficaces

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso con la presente invención incluyen composiciones en las que el ingrediente activo está contenido en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, en una cantidad eficaz para conseguir su propósito pretendido. La cantidad eficaz real para una aplicación particular dependerá, entre otros, de la afección que se está tratando. Por ejemplo, cuando se administra en procedimientos para reducir la deshidratación de células falciformes y/o el retardo de la existencia de deformación o distorsión de los eritrocitos in situ, dichas composiciones contendrán una cantidad de ingrediente activo eficaz para conseguir este resultado. La determinación de una cantidad eficaz pertenece a las capacidades de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada de este documento.

Para cualquier compuesto descrito en este documento, la cantidad terapéuticamente eficaz puede determinarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Las concentraciones plasmáticas diana serán aquellas concentraciones de compuesto(s) activo(s) que son capaces de inducir la inhibición del canal Gardos. En realizaciones preferidas, la actividad del canal Gardos está al menos un 25% inhibida. Las concentraciones plasmáticas diana de compuesto(s) activo(s) que son capaces de inducir al menos aproximadamente el 50%, 75%, o incluso el 90% o mayor de inhibición del flujo de potasio del canal Gardos se prefieren actualmente. El porcentaje de inhibición del canal Gardos en el paciente puede controlarse para evaluar lo apropiado de la concentración plasmática de fármaco conseguida, y la dosificación puede ajustarse a la alza o a la baja para conseguir el porcentaje de inhibición deseado.

Como se sabe bien en la técnica, las cantidades terapéuticamente eficaces para su uso en seres humanos también pueden determinarse a partir de modelos animales. Por ejemplo, una dosis para seres humanos puede formularse para conseguir una concentración en circulación que se haya descubierto que es eficaz en animales. Un modelo animal particularmente útil par la enfermedad de células falciformes es el modelo de ratón SAD-1 (Trudel y col., EMBO J. 11: 31573165 (1991)). La dosificación en seres humanos puede ajustarse controlando la inhibición del canal Gardos y ajustando la dosificación a la alza o a la baja, como se ha descrito anteriormente.

Una dosis terapéuticamente eficaz también puede determinarse a partir de datos humanos para los compuestos que se sabe que muestran actividades farmacológicas similares, tales como clotrimazol y otros agentes antimicóticos (véase, por ejemplo, Brugnara y col., JPET 273:266272 (1995)); Benzaquen y col., Nature Medicine 1: 534-540 (1995); Brugnara y col., J. Clin. Invest. 97 (5): 1227-1234 (1996)). La dosis aplicada puede ajustarse en base a la biodisponibilidad relativa y potencia del compuesto administrado en comparación con clotrimazol.

El ajuste de la dosis para conseguir la eficacia máxima en seres humanos en base a los procedimientos descritos anteriormente y otros procedimientos que son bien conocidos en la técnica pertenece a las capacidades de los especialistas en la técnica.

En el caso de administración local, la concentración sistémica en circulación del compuesto administrado no será de particular importancia. En dichos casos, el compuesto se administra para conseguir una concentración en el área local eficaz para conseguir el resultado pretendido.

Para su uso en la profilaxis y/o tratamiento de la enfermedad de células falciformes, incluyendo episodios crónicos de células falciformes y crisis agudas de células falciformes, una concentración en circulación de compuesto administrado de aproximadamente 0,001 \GammaM a 20 \GammaM se considera eficaz, siendo preferido de aproximadamente 0,01 \GammaM a
5 \GammaM.

Las dosis del paciente para administración oral de los compuestos descritos en este documento, que es el modo preferido de administración para la profilaxis y para el tratamiento de episodios crónicos de células falciformes, típicamente varía de aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 10.000 mg/día, más típicamente de aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 1.000 mg/día, y mucho más típicamente de aproximadamente 50 mg/día a aproximadamente 500 mg/día. Indicado en términos de peso corporal del paciente, las dosificaciones típicas varían de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 150 mg/kg/día, más típicamente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 15 mg/kg/día, y mucho más típicamente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg/día.

Para otros modos de administración, la cantidad de dosificación y el intervalo pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del compuesto administrado eficaces para la indicación clínica particular que se está tratando. Por ejemplo, si las crisis falciformes agudas son la manifestación más dominante, en una realización, un compuesto de acuerdo con la invención puede administrarse en concentraciones relativamente elevadas múltiples veces por día. Como alternativa, si el paciente muestra solamente crisis falciformes periódicas en una base poco frecuente, periódica o irregular, en una realización, puede ser más deseable administrar un compuesto de la invención a concentraciones eficaces mínimas y usar un régimen de administración menos frecuente. Esto proporcionará un régimen terapéutico que puede ser proporcional a la gravedad de la enfermedad de células falciformes del individuo.

Utilizando los contenidos proporcionados en este documento, puede programarse un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz que no causa toxicidad sustancial y aún sea completamente eficaz para tratar los síntomas clínicos demostrados por el paciente particular. Esta programación debe implicar la elección cuidadosa del compuesto activo considerando factores tales como la potencia del compuesto, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, presencia y gravedad de los efectos secundarios adversos, modo preferido de administración y el perfil de toxicidad del agente seleccionado.

Toxicidad de los Compuestos

La proporción entre toxicidad y efecto terapéutico para un compuesto particular es su índice terapéutico y puede expresarse como la proporción entre DL_{50} (la cantidad de compuesto letal en un 50% de la población) y DE_{50} (la cantidad de compuesto eficaz en un 50% de la población). Se prefieren compuestos que muestran índices terapéuticos elevados. Los datos de índices terapéuticos obtenidos de ensayos de cultivo celular y/o estudios animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos preferiblemente está dentro de un intervalo de concentraciones plasmáticas que incluyen la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Véase, por ejemplo Fingl y col., en: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Cap.1, pág.1, 1975. La formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden elegirse por le médico individual en vista de la afección del paciente y el procedimiento particular en que el compuesto se
usa.

Procedimientos

Además de los compuestos y formulaciones farmacéuticas analizados en detalle anteriormente, la presente invención proporciona varios procedimientos en los que los compuestos de la invención encuentran uso. Los procedimientos varían entre aquellos que podrían usarse en un ajuste de laboratorio para sondear los mecanismos básicos de, por ejemplo, farmacocinética, actividad del fármaco, origen de la enfermedad y progresión y similares.

Por tanto, en un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir el flujo de potasio de una célula. El procedimiento comprende poner en contacto una célula con una cantidad eficaz de un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula I. En una realización preferida, los compuestos tienen una estructura de acuerdo con la Fórmula II y más preferiblemente de acuerdo con la Fórmula III.

Este aspecto de la invención tiene un amplio intervalo de usos, pero se prefiere como una modalidad para el estudio de los mecanismos básicos subyacentes al flujo de potasio y el mecanismo de la actividad de los agentes que modulan este flujo. Además, los compuestos de la invención pueden utilizarse como herramientas en el descubrimiento de nuevos agentes que modulen el flujo de potasio. Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden utilizarse en ensayos, tales como ensayos competitivos, para ensayar la eficacia de inhibidores putativos del flujo de potasio. Estos procedimientos de la invención pueden realizarse tanto in vitro como in vivo. Los ensayos de acuerdo con la presente invención pueden realizarse, por ejemplo, modificando procedimientos reconocidos en la técnica para permitir la incorporación de los compuestos de la invención en ellos. Dicha modificación pertenece a las capacidades de los especialistas en la técnica.

En otra realización preferida, este procedimiento se usa terapéuticamente para tratar o prevenir una afección que pueda verse afectada positivamente por la modulación del flujo de potasio. En una realización actualmente preferida, la afección es la enfermedad de células falciformes.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para reducir la deshidratación de los eritrocitos. Este procedimiento comprende poner en contacto un eritrocito con una cantidad eficaz de un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula I. En una realización preferida, los compuestos tienen una estructura de acuerdo con la Fórmula II y más preferiblemente de acuerdo con la Fórmula III.

Este aspecto de la invención tiene una amplia fama de uso incluido, por ejemplo, el estudio del mecanismo de la deshidratación de los eritrocitos, la investigación de los compuestos que inhiben o invierten la deshidratación de los eritrocitos y el tratamiento o prevención de las afecciones asociadas con la deshidratación de los eritrocitos.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad de células falciformes. El procedimiento comprende administrar a un sujeto que padece la enfermedad de células falciformes, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula I. En una realización preferida, los compuestos tienen una estructura de acuerdo con la Fórmula II y más preferiblemente de acuerdo con la Fórmula III.

Este aspecto de la invención puede utilizarse para prevenir la aparición de acontecimientos agudos de células falciformes o para mejorar los efectos de estos acontecimientos. Además, el procedimiento puede usarse para tratar y/o prevenir la enfermedad crónica de células falciformes. Los procedimiento pueden hacer uso de los compuestos de la invención per se o, preferiblemente, las formulaciones farmacéuticas de la invención. Los modos de administración relevantes, la elección de los niveles de dosificación y la frecuencia de la dosificación se han analizado anterior-
mente.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para potenciar la resistencia a la degradación en un medio biológico de un inhibidor del canal de potasio, que comprende un resto fenilo. El procedimiento comprende sustituir un radical que comprende un resto fenilo por un átomo de hidrógeno en el radical fenilo del inhibidor.

El procedimiento puede practicarse usando inhibidores del canal de potasio que tienen un intervalo de estructuras. La única limitación en la estructura del inhibidor es que el anillo fenilo debe estar presente como un componente de la estructura del inhibidor. En una realización preferida, el anillo fenilo es un componente de un radical trifenilmetilo. En una realización preferida adicional, la degradación se reduce a menos del 60% del compuesto que se está degradando después de ponerse en contacto con un medio biológico durante dos horas.

La sustitución del radical flúor por hidrógeno puede conseguirse por los procedimientos descritos en ese documento o por otros procedimientos convencionales en química orgánica. Puede ensamblarse un amplio intervalo de compuestos que tienen la sustitución requerida a partir de los compuestos fluoro-arilo que están fácilmente disponibles de proveedores comerciales tales como Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI). Además, existen numerosas vías sintéticas convencionales para el fácil ensamblaje de materiales de partida apropiados para los compuestos ensamblados de acuerdo con el procedimiento de la invención.

Al elegir las dianas para convertir los derivados fluoro, un especialista en la técnica entenderá que es deseable comenzar con compuestos que contienen arilo que tienen actividad conocida hacia el canal Gardos. Muchos agentes reconocidos en la técnica que tienen propiedades antimicóticas tienen actividad demostrable de canal Gardos. Por tanto, un especialista en la técnica elegiría agentes que tienen la actividad antimicótica, o análogos de estos compuestos, para preparar análogos fluorados de ellos. El ensayo de los nuevos agentes para la potencia y resistencia a degradación biológica puede conseguirse de forma rutinaria por un especialista en la técnica utilizando los procedimientos proporcionados en este documento además de los conocidos en la técnica. Además, a través de la experimentación rutinaria utilizando estos procedimientos, un especialista en la técnica puede ensayar rápidamente una o más moléculas que contienen arilo para la actividad hacia el canal Gardos. Los derivados fluorados de dianas prometedoras después pueden prepararse y ensayarse, como se ha analizado anteriormente.

Propiedades Farmacéuticas Optimizadas a. Resistencia Metabólica

Los presentes inhibidores del canal Gardos basados en trifenilacetamida, en los que uno o más de los grupos fenilo está sustituido con uno o más átomos de flúor o restos que contienen flúor, tienen estabilidades metabólicas sorprendentemente elevadas con relación a inhibidores conocidos tales como clotrimazol. Por ejemplo, el clotrimazol 19 está un 94,2% degradado después de dos horas de incubación en una preparación microsómica de hígado. En contraste, los compuestos fluorados representativos de la invención, tales como 3 y 5 están solamente un 24% y un 29% degradados después de una incubación similar. Estas trifenilacetamidas fluoradas también son notablemente más estables que sus análogos no fluorados. Por ejemplo, el compuesto 20 está un 87% degradado después de una incubación similar.

Aunque se observa una tendencia general hacia la estabilidad potenciada después de la sustitución con flúor, esto no es cierto para todos los derivados fluorados. Por ejemplo, una trifenilacetamida sustituida 9 en dos de los anillo fenilo en las posiciones 3 y 3' estaba un 97% degradada después de dos horas en una preparación microsómica. Por tanto, en este caso, la sustitución de fluoro aumentó aparentemente la cantidad de degradación con relación tanto a clotrimazol como a una trifenilacetamida no fluorada.

De forma similar, los compuestos análogos que tienen dos sustituyentes fluoro en un anillo también se degradaron rápidamente. Por ejemplo, después de dos horas en una preparación microsómica, los derivados sustituidos en las posiciones 2, 4 (8) y las posiciones 3, 4 (7) estaban un 61% y un 85% degradados, respectivamente. Además, ciertos compuestos que se monosustituyeron en cada uno de los tres anillo fenilo también se degradaron rápidamente. Por ejemplo, un derivado sustituido en las posiciones 3, 3' y 3'' (17) estaba un 82% degradado después de dos horas en una preparación microsómica.

En vista de lo anterior, se ha descubierto que solamente patrones de sustitución seleccionados confieren el nivel necesario de estabilidad a las trifenilacetamidas fluoradas. También se observa una variación similar en la potencia y selectividad del compuesto con patrón de sustitución.

b. Potencia

Un resultado inesperado de que sea sustituido hidrógeno por flúor en los anillos fenilo es una potencia notablemente potenciada de los compuestos de la invención para el canal Gardos con relación a clotrimazol y trifenilacetamidas no fluoradas. Por ejemplo, una trifenilacetamida no fluorada 20 tiene una CI_{50} de 50 nM para el canal Gardos. En contraste, una trifenilacetamida monofluorada análoga 2 tiene una CI_{50} de 15 nM, que refleja una mejora del 330% en la potencia.

Aunque se observa una tendencia general hacia la potencia mejorada para los derivados de trifenilacetamida fluorada, ciertos patrones de sustitución parecen mejorar de forma más profunda la potencia con relación al compuesto precursor sin sustituir. Un aspecto particular de esta tendencia general es que los derivados en los que más de un anillo está sustituido son generalmente más potentes que aquellos en los que solamente un anillo está sustituido. Por ejemplo, el compuesto 8 tiene dos sustituyentes fluoro en un único anillo en las posiciones 2 y 4 y una CI_{50} de 34 nM. En contraste, el compuesto 12, tiene un sustituyente fluoro en un anillo en la posición 2, un sustituyente fluoro en otro anillo en la posición 4', y una CI_{50} de 5 nM. Esto refleja una mejora en la potencia de 12 sobre 8 de casi un 700%. Además, el compuesto 12 tiene una potencia del 1000% mayor que la del compuesto precursor no fluorado 20. Esto refleja un aumento en la potencia sobre el clotrimazol del 2000%.

A pesar de la tendencia hacia el aumento de la potencia, el grado de mejora en la potencia del compuesto no es predecible, a priori, a partir de la cantidad de sustituyentes por anillo. Por ejemplo, el compuesto 9 tiene un sustituyente fluoro en un anillo en la posición 3, un sustituyente fluoro en otro anillo en la posición 3' y una CI_{50} de 30 nM. Un compuesto similar 11, que tiene un sustituyente fluoro en un anillo en la posición 2, un sustituyente fluoro en otro anillo en la posición 4' y una CI_{50} de 5 nM, tiene un aumento en la potencia de 11 sobre 9 del 600%.

Como se ha analizado anteriormente, se ha descubierto que la potencia de trifenilacetamidas fluoradas para el canal Gardos puede manipularse por la elección sensata tanto de la cantidad de sustituyentes fluoro como de su colocación en los anillos fenilo de estos compuestos. Sorprendentemente, se observan efectos similares para la selectividad por el canal Gardos de estos compuestos.

c. Selectividad

Además de la potencia y biodisponibilidad, un agente farmacéutico para tratar la anemia de células falciformes inhibiendo el flujo de iones debe ser selectivo por el canal de iones que es su diana. La interacción del agente con canales diferentes de la diana probablemente causará efectos secundarios indeseados y potencialmente dañinos. Por ejemplo, se sabe que el clotrimazol y algunos de sus análogos interaccionan con el componente lento de la corriente de potasio de rectificación retardada en miocitos, I_{Ks}. El bloqueo de esta corriente está unido a una muerte repentina debida a fibrilación ventricular (Turgeon y col., Circulation Research 75: 879-86 (1994)). Por lo tanto, los compuestos que muestran selectividad por el canal Gardos sobre I_{Ks} probablemente demostrarán ser agentes farmacéuticos más seguros y más eficaces.

Otro resultado inesperado más de la fluoración de uno o más de los anillos de los inhibidores del canal Gardos es una selectividad aumentada de estos compuestos por el canal Gardos con relación a otros canales de potasio. Varias de las trifenilacetamidas sustituidas con fluoro de la invención demuestran una selectividad drásticamente mejorada por el canal Gardos frente a I_{Ks}, con relación tanto al clotrimazol como a la trifenilacetamida no fluorada precursora. Por ejemplo, los compuestos 3 y 5 son aproximadamente 16 veces y 18 veces más selectivos para el canal Gardos frente a I_{Ks} que el clotrimazol. Además, estos compuestos son ambos aproximadamente 6 veces más selectivos para el canal Gardos que la trifenilacetamida no sustituida precursora 20.

Ahora se ha descubierto que los derivados de trifenilmetano sustituido con flúor, particularmente los compuestos de nitrógeno sustituidos con flúor tales como trifenilacetamidas inhiben de forma eficaz el canal Gardos de los eritrocitos. Además, los compuestos sustituidos con flúor presentan una resistencia a la degradación en un medio biológico que está potenciada a un grado sorprendente con relación a los compuestos correspondientes que no están sustituidos con flúor.

Los compuestos, composiciones y procedimientos de la presente invención se ilustran adicionalmente por los siguientes ejemplos.

Ejemplos

El Ejemplo 1 ilustra procedimientos para la síntesis y caracterización de compuestos de la invención. Los compuestos de la invención se aislaron en forma sustancialmente pura y en buenos rendimientos utilizando los procedimientos detallados en este Ejemplo.

El Ejemplo 2 ilustra el ensayo de los compuestos de la invención para su resistencia la degradación en un medio biológico. En este Ejemplo, microsomas de hígado humano forman el medio biológico. Se ha descubierto que los compuestos de la invención presentan una resistencia remarcable a la degradación por la preparación microsómica, con relación a compuestos de trifenilmetilo no fluorados.

El Ejemplo 3 expone un estudio farmacocinético de los compuestos de la invención en rata. Se ha descubierto que los compuestos fluorados de la invención muestran una semi-vida in vivo que estaba potenciada con relación a derivados no fluorados.

El Ejemplo 4 describe un bioensayo para medir la inhibición del canal de potasio (canal Gardos) por los compuestos de la invención.

Ejemplo 1

Este Ejemplo ilustra procedimientos para la síntesis y caracterización de compuestos de la invención. Los compuestos de la invención se aislaron en forma sustancialmente pura y en buenos rendimientos utilizando los procedimientos detallados a continuación. El ejemplo proporciona procedimientos de alcance general que pueden usarse para sintetizar compuestos de la invención diferentes de los específicamente ejemplificados.

1.1 Materiales y Procedimientos

Los reactivos se usaron según se recibieron a menos que se indique otra cosa. El procedimiento de Franco y col., J. Chem. Soc. Perkins Trans. II, 443 (1988), se usó para preparar reactivos de fluorofenillitio no comerciales y fluorobenzofenonas. Todas las reacciones sensibles a la humedad se realizaron en una atmósfera de nitrógeno usando material de vidrio secado en horno. Las reacciones se controlan por CCF en gel de sílice 60 F_{254} con detección revelando con tinción de Hanessian (Khadem y col., Anal. Chem., 1958, 30, (1965)). La cromatografía en columna se realizó usando gel de sílice Selecto (32-63 \GammaM). Los puntos de fusión se determinaron en una unidad Electrothermal IA9000 y están sin corregir. Los espectros ^{1}H (300 MHz) y ^{19}F (282 MHz) se registraron en una máquina de RMN Varian (Gemini 2000) a temperatura ambiente en CDCl_{3.} Se usó tetrametilsilano como referencia interna. La separación quiral de compuesto 1 se realizó por Tecnologías Quirales usando una columna CHUZ-ACEL OD-R y acetonitrilo/agua como eluyente.

1.2 Preparación de Compuesto 1

El Compuesto 1 se preparó en un rendimiento del 28% en cuatro etapas a partir de precursores disponibles en el mercado.

1.2a Síntesis de (2-fluorofenil)-(4-fluorofenil)fenilmetanol

Se añadió gota a gota bromuro de fenilmagnesio (1,83 ml, 5,5 mmol) a una solución en agitación de 2,4'-difluorobenzofenona (1,09 g, 5,0 mmol) en t-butilmetil éter (12 ml) a temperatura ambiente ("ta", \sim25ºC). Después de que se completara la adición la reacción se calentó a reflujo durante 3 h. La solución se enfrió a ta y se vertió en HCl 1,0 M enfriado en hielo (ac.) (20 ml). Los extractos orgánicos se extrajeron con EtOAc (3x10 ml) y se secaron (Na_{2}SO_{4}). La concentración a presión reducida dio el producto deseado (2-fluorofenil)-(4-fluorofenil)fenilmetanol en forma de un aceite marrón pálido que se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.

1.2b Síntesis de (2-fluorofenil)-(4-fluorofenil)fenilacetonitrilo

Se añadió (2-fluorofenil)-(4-fluorofenil)fenilmetanol (1,47 g, 5,0 mmol) a una solución al 20% de cloruro de acetilo en diclorometano (10 ml) a ta. La solución resultante se agitó durante 12 h después de lo cual el disolvente se retiró por evaporación. Se añadió tolueno (2 x 20 ml) al residuo y se evaporó produciendo 2-fluorofenil-(4-fluorofenil)fenilclorometano en bruto que se usó sin purificación en la siguiente etapa.

Se añadió cianuro de cobre (0,50 g, 5,5 mmol) al residuo y la mezcla resultante se calentó a 130ºC durante 2,5 h. Una vez que la reacción se hubo enfriado a aproximadamente 110ºC, se añadió tolueno (30 ml) y la mezcla se agitó vigorosamente durante 10 min. La mezcla se filtró y el disolvente se retiró a presión reducida. Se añadió hexano caliente (30 ml) al material en bruto y la mezcla se agitó vigorosamente durante 30 min. La filtración y el lavado con más hexano dieron el producto ciano deseado en forma de un sólido blanco, que se usó sin purificación adicional.

1.2c Síntesis de (2-fluorofenil)-(4-fluorofenil)fenilacetamida (1)

Se añadió una solución de ácido sulfúrico concentrado (10 ml) y ácido acético glacial (10 ml) a (2-fluorofenil)-(4-fluorofenil)fenilacetonitrilo en bruto (1,48 g, 5,0 mmol) a ta. La solución naranja resultante se agitó y se calentó a 130ºC durante 3 h. La reacción se enfrió a 0ºC y se neutralizó por la adición gota a gota de hidróxido de amonio. Se añadió agua (30 ml) y los extractos orgánicos se extrajeron con cloroformo (3 x 30 ml). Las fracciones orgánicas se combinaron y se lavaron secuencialmente con agua (2x10 ml) y salmuera (20 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. Se añadió hexano (30 ml) al aceite marrón claro resultante iniciando la precipitación. El precipitado se molió y se lavó secuencialmente con hexano caliente (30 ml). La cristalización en hexano/diclorometano dio el producto deseado (2-fluorofenil)-(4-fluorofenil) fenilacetamida en forma de un sólido cristalino blanco (0,45 g, 1,4 mmol, 28%, 4 etapas).

1.3 Preparación de Compuesto 3

El Compuesto 3 se preparó en tres etapas a partir de los precursores disponibles en el mercado en rendimiento del 58%.

1.3a Síntesis de bis(4-fluorofenil)fenilmetanol

Se añadió gota a gota bromuro de fenilmagnesio (100 ml, 0,1 mol) a una solución en agitación de 4,4'-difluorobenzofenona (20 g, 0,092 mol) en t-butilmetil éter (150 ml) a ta. Después de que se completara la adición, la reacción se calentó a reflujo durante 3 h. La solución se enfrió a ta y se vertió en HCl 1,0 M acuoso enfriado en hielo (100 ml). Los extractos orgánicos se extrajeron con EtOAc (2 x 50 ml) y se secaron (Na_{2}SO_{4}). La concentración a presión reducida dio bis(4-fluorofenil)fenilmetanol en forma de un aceite marrón pálido. Después de secar al vacío durante 2 h, el material en bruto se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.

1.3b Síntesis de bis(4-fluorofenil)fenilacetonitrilo

Se añadió bis(4-fluorofenil)fenilmetanol (0,092 mol) a una solución al 20% de cloruro de acetilo en diclorometano (50 ml) a ta. La solución púrpura resultante se agitó durante 12 h después de lo cual el disolvente se retiró por evaporación. Se añadió tolueno (100 ml) al residuo y después se evaporó, produciendo bis(4-fluorofenil)fenilclorometano en bruto que se usó sin purificación en la siguiente etapa.

Se añadió cianuro de cobre (8,24 g, 0,11 mol) al residuo en bruto y la mezcla se calentó a 140ºC durante 3 h. La reacción se enfrió a 100ºC y se añadió tolueno (100 ml). La mezcla resultante se agitó vigorosamente durante 10 min., se enfrió a ta, se filtró a través de un corto lecho de gel de sílice y el disolvente se retiró a presión reducida produciendo un sólido marrón. Se añadió hexano caliente (100 ml) al material en bruto en polvo y la mezcla se agitó vigorosamente durante 4 h. La filtración y el lavado con hexano adicional dieron el bis(4-fluorofenil)fenilacetonitrilo deseado en forma de un sólido blanco (18,9 g, 67%).

1.3c Síntesis de bis(4-fluorofenil)fenilacetamida (3)

Se añadió una solución de ácido sulfúrico concentrado (50 ml) y ácido acético glacial (50 ml) a bis(4-fluorofenil)fenilacetonitrilo (18,9 g, 0,06 mol) a ta. La solución naranja resultante se agitó y se calentó a 130ºC durante 3 h. La reacción se enfrió a 0ºC, se vertió en agua en hielo (150 ml) y se neutralizó con hidróxido de amonio. Los extractos orgánicos se extrajeron con cloroformo (3 x 100 ml), se combinaron y se lavaron con salmuera (2 x 50 ml). Los extractos orgánicos se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron a presión reducida produciendo un sólido amarillo-naranja. El sólido se agitó con hexano caliente (100 ml) durante 30 min. y se filtró. La cristalización en diclorometano/hexano dio bis(4-fluorofenil) fenilacetamida (3) en forma de un sólido cristalino blanco (16,9 g, 0,052 mol, 87%).

1.4 Preparación de Compuesto 5

El Compuesto 5 se preparó en un rendimiento del 66% en cuatro etapas a partir de precursores disponibles en el mercado.

1.4a Síntesis de bis(4-fluorofenil)-2-fluorofenilmetanol

Se añadió gota a gota bromuro de p-fluorofenilmagnesio (124 ml, 0,12 mol) a una solución en agitación de 2,4'-difluorobenzofenona (24,5 g, 0,11 mol) en t-butilmetil éter (100 ml) a ta. Después de que se completara la adición, la reacción se calentó a reflujo durante 3 h. La solución después se enfrió a ta y se vertió en HCl 1,0 M enfriado en hielo (ac.) (100 ml). Los extractos orgánicos se extrajeron con EtOAc (3 x 70 ml) y se secaron (Na_{2}SO_{4}). La concentración a presión reducida dio el producto deseado bis(4-fluorofenil)-2-fluorofenilmetanol en forma de un aceite amarillo pálido que se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.

1.4b Síntesis de bis(4-fluorofenil)-2-fluorofenilacetonitrilo

Se añadió una solución al 20% de cloruro de acetilo en diclorometano (60 ml) a bis(4-fluorofenil)-2-fluorofenilmetanol en bruto a ta. La solución resultante se agitó durante 12 h después de lo cual el disolvente se retiró por evaporación. Se añadió tolueno (100 ml) al residuo y después se evaporó produciendo bis(4-fluorofenil)-2-fluorofenilclorometano en bruto que se usó sin purificación en la siguiente etapa.

Se añadió cianuro de cobre (12 g, 0,13 mol) al material en bruto y la mezcla resultante se calentó a 160ºC durante 3 h. La reacción se enfrió a aproximadamente 110ºC, se añadió tolueno (100 ml) y la mezcla se agitó vigorosamente durante 10 min. La mezcla se enfrió, se filtró a través de un corto lecho de sílice y se concentró a presión reducida. Se añadió hexano caliente (100 ml) al material en bruto y la mezcla se agitó vigorosamente durante 30 min. La filtración y el lavado con más hexano dieron el bis(4-fluorofenil)-2- fluorofenilacetonitrilo deseado en forma de un sólido blanco (25,3 g, 70%).

1.4c Síntesis de bis(4-fluorofenil)-2-fluorofenilacetamida (5)

Se añadió una solución de ácido sulfúrico concentrado (10 ml) y ácido acético glacial (10 ml) a bis(4-fluorofenil)-2-fluorofenilacetonitrilo (5,0 g, 0,015 mol) a ta. La solución naranja resultante se agitó y se calentó a 130ºC durante 2 h. La reacción se enfrió a 0ºC y se vertió en hielo (50 g). La mezcla resultante se neutralizó por la adición gota a gota de hidróxido de amonio. Se añadió CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y los extractos orgánicos se extrajeron con CH_{2}Cl_{2} adicional (3 x 30 ml). Las fracciones orgánicas combinadas se lavaron secuencialmente con agua (2x10 ml) y salmuera (20 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida produciendo un sólido amarillo/naranja. El sólido se transformó en un polvo y se lavó repetidamente con hexano caliente (50 ml) hasta que no fue evidente ninguna coloración en el filtrado. La cristalización en hexano/diclorometano dio el producto deseado bis(4-fluorofenil)-2- fluorofenilacetamida 5 en forma de un sólido cristalino blanco (4,98 g, 0,0145 mol, 94%).

1.5 Preparación de Compuesto 16

El Compuesto 16 se preparó en un rendimiento del 11% en cuatro etapas a partir de precursores disponibles en el mercado.

1.5a Síntesis de bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilmetanol

Se añadió gota a gota n-butillitio (4 ml, 10 mmol) a una solución en agitación de bromo-3-fluorobenceno (1,75 g, 10 mmol) en THF (25 ml) a -78ºC. Después de 20 minutos se añadió 4,4'-benzofenona (1,96 g, 9 mmol). La reacción se dejó calentar a 0ºC en un periodo de 30 min. Se añadió NH_{4}Cl saturado (ac.) (30 ml) y la agitación se continuó durante 30 min. Se añadió EtOAc (20 ml), los extractos orgánicos se separaron, se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (hexano al 100% a CH_{2}Cl_{2} al 100%) produciendo bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilmetanol (2,81 g, 92%).

1.5b Síntesis de bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilacetonitrilo

Se añadió bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilmetanol (999 mg, 3,18 mmol) a una solución al 20% de cloruro de acetilo en diclorometano (10 ml) a ta. La solución púrpura resultante se agitó durante 12 h después de que el disolvente se retirara por evaporación. Se añadió tolueno (20 ml) al residuo y después se evaporó produciendo bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilclorometano en bruto que se usó en la siguiente etapa sin purificación.

Se añadió cianuro de cobre (344 mg, 3,82 mmol) al material en bruto y la mezcla resultante se calentó a 140ºC durante 3 h. La reacción se enfrió a aproximadamente 110ºC, se añadió tolueno (50 ml) y la mezcla se agitó vigorosamente durante 10 min. La mezcla se enfrió a ta, se filtró a través de un corto lecho de sílice y el disolvente se retiró a presión reducida produciendo un sólido beige. Se añadió hexano caliente (100 ml) al material en bruto en polvo y la mezcla se agitó vigorosamente durante 1 h. La filtración y el lavado con hexano adicional dieron bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilacetonitrilo en forma de un sólido blanco que se usó sin purificación adicional.

1.5c Síntesis de bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilacetamida (16)

Se añadió una solución de ácido sulfúrico concentrado (10 ml) y ácido acético glacial (10 ml) a bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilacetonitrilo (3,18 mmol) a ta. La solución naranja resultante se agitó y se calentó a 130ºC durante 3 h. La reacción se enfrió a 0ºC, se vertió en agua en hielo (50 ml) y se neutralizó con hidróxido de amonio. Los extractos orgánicos se extrajeron con cloroformo (3 x 50 ml). Las fracciones orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (2 x 20 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron a presión reducida produciendo un sólido amarillo-naranja. El sólido se agitó con hexano caliente (50 ml) durante 30 minutos y se filtró. La cristalización en diclorometano/hexano dio el producto deseado bis(4-fluorofenil)-3-fluorofenilacetamida 16 en forma de un sólido cristalino blanco (147 mg, 0,43 mmol, 11%, 4 etapas).

1.6 Caracterización de Compuestos por Espectroscopía ^{1}H y ^{19}F RMN y Punto de Fusión

Los compuestos de la invención se caracterizaron por una combinación de espectroscopia ^{1}H y ^{19}F RMN y se determinaron los puntos de fusión de los compuestos.

1: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,39-7,26 (8H, m), 7,16-6,90 (5H, m), 5,83 (1H, s a), 5,72 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -103,4 (1F, s), -115,8 (1F, s); p.f. 180-181ºC.

2: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,37-7,28 (6H, m), 7,15, 7,05 (2H, m), 6,93 (1H, dt, J = 8 y 2 Hz), 5,90 (1H, s a), 5,68 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -103,4 (1F, m); p.f. 210ºC.

3: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,37-7,20 (9H, m), 7,04-6,91 (4H, m),5,81 (1H, s a), 5,71 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -115,7 (2F, s);p.f. 180-181ºC.

4: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,37-7,24 (12H, m), 6,97 (2H, t, J = 8,5 Hz), 5,83 (1H, s a), 5,75 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -116,2 (1F, s); p.f. 193-194ºC.

5: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,41-7,34 (1H, m), 7,29-7,23 (4H, m), 7,16 (1H, ddd, J = 18,1, 8,1 y 1,2 Hz), 7,15 (1H, d,
J = 7,7 Hz), 7,05-6,97 (4H, m), 6,93-6,87 (1H, dt, J = 8,0 y 1,4 Hz), 5,90 (1H, s a), 5,74 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -103,3 (1F, s), -115,5 (2F, s); p.f. 168-169ºC.

6: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,64-7,54 (4H, m), 7,40-7,34 (6H, m), 5,70 (2H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): 137,3 (2F, d, J = 19,2 Hz), -155,8 (1F, t, J = 21,4 Hz), -161,9 (2F, dd, J = 21,4 y 17,1 Hz).

7: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,37-7,31 (6H, m), 7,28-7,20 (5H, m), 7,12-7,04 (2H, m), 5,90 (1H, s a), 5,74 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -137,8 a -137,9 (1F, m), -140,3 a -140,4 (1F, m); p.f. 174-175ºC.

8: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,37-7,28 (10H, m), 6,95-6,83 (2H, m), 6,81-6,75 (1H, m), 5,92 (1H, s a), 5,80 (H, sa); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -99,1 (1F, dd, J = 19,2 y 8,5 Hz), -111,6(1F, m); p.f. 187-188ºC.

9: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,38-7,22 (7H, m), 7,09-6,96 (6H, m), 5,83(1H, s a), 5,77 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -112,6 (2F, dd, J = 17,1 y 6,4 Hz); p.f. 195-196ºC.

13: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,26-7,19 (6H, dd, J = 9,0 y 5,4 Hz), 7,20-7,01 (6H, t, J = 8,7 Hz), 5,83 (1H, s a), 5,69 (1H, sa); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -115,3 (3F, s); p.f. 180-181ºC.

14: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,39-7,27 (9H, m), 7,17-7,03 (4H, m), 5,90 (1H, s a), 5,85 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -102,9 (2F, s); p.f. 166-167ºC.

15: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,41-7,34 (2H, m), 7,29-7,23 (4H, m), 7,17-7,05 (4H, m), 6,99 (2H, t, J = 8,7 Hz), 5,78 (2H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -103,0 (2F, s), -115,9 (1F, m); p.f. 187-188ºC.

16: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,34-7,20 (6H, m), 7,06-6,97 (6H, m), 5,90 (1H, s a), 5,71 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -112,2 (1F, dd, J = 17,1 y 7,4 Hz), -115,1 a -115,2 (2F, m); p.f. 165-166ºC.

17: ^{1}H RMN \Gamma(CHCl_{3}): 7,35-7,21 (3H, m), 7,06-6,97 (9H, m), 7,17-7,05 (4H, m), 5,96 (1H, s a), 5,76 (1H, s a); ^{19}F RMN \Gamma(CHCl_{3}): -112,2 (3F, dd, J= 17,1 y 8,5 Hz); p.f. 186-188ºC.

Ejemplo 2

Ese Ejemplo ilustra el ensayo de los compuestos de la invención para su resistencia a la degradación en un medio biológico. En este Ejemplo, los microsomas de hígado humano forman el medio biológico. Se descubrió que los compuestos de la invención presentaban una resistencia remarcable a la degradación por la preparación microsómica, con relación a compuestos de trifenilmetilo no fluorados.

2.1 Materiales y Procedimientos

Se ensayaron diecisiete compuestos de triarilmetano fluorados, clotrimazol, y un compuesto de triarilmetano clorado 18 para la estabilidad metabólica in vitro enuna mezcla de reacción de microsomas de hígado humano. La mezcla de reacción contenía 1,0 mg/ml de proteína microsómica de hígado humano, fosfato potásico 100 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 10 mM y un sistema de generación de NADPH. Los compuestos se ensayaron a una concentración de 5 \GammaM a 37ºC y se calculó la cantidad de compuesto intacto que permanecía en la mezcla después dos horas en términos de porcentaje de la dosis original que permaneces.

2.2 Resultados

Los resultados de este estudio demuestran que los compuestos fluorados de la invención tienen una resistencia potenciada a la degradación en un medio biológico que compuestos no fluorados análogos. Los resultados se recogen en la Tabla 2, anterior.

Ejemplo 3

Este Ejemplo ilustra un estudio farmacocinético de los compuestos de la invención en rata. Se descubrió que los compuestos fluorados de la invención mostraban una semi-vida in vivo que estaba potenciada con relación a derivados no fluorados.

3.1 Materiales y Procedimientos

Los estudios farmacocinéticos se realizaron en ratas para ampliar el descubrimiento de que la sustitución seleccionada con fluoro de los anillos fenilo aumentaba la estabilidad metabólica in vitro a un estudio in vivo. El compuesto 1, compuesto 3 y compuesto 18 se administraron a grupos de tres a cinco ratas Sprague-Dawley macho a dosis de 1 mg/kg i.v. y 10 mg/kg p.o. para determinar el T½ y la biodisponibilidad oral. Se recogieron muestras de sangre en 9 momentos puntuales desde la predosificación hasta 24 horas después de la dosificación p.o. y en 11 momentos puntuales desde la predosificación hasta 24 horas después de la dosificación i.v. Las muestras se prepararon y analizaron para la concentración plasmática de compuesto usando CL-EM/EM.

3.2 Resultados

Como se ha predicho a partir de los datos de metabolismo in vitro, el compuesto 18 tenía muy mala biodisponibilidad oral con solamente niveles muy bajos (31 a 65 ng/ml) que aparecen en plasma entre 0,25 y 1 hora después de la dosificación y no presentando niveles detectables en la muestra a las 2 horas después de la dosis. Por vía i.v., la eliminación del torrente sanguíneo fue rápido. Como los niveles plasmáticos eran tan bajos en las muestras después de la dosificación oral, el porcentaje de biodisponibilidad no podía calcularse para el compuesto 18.

En marcado contraste con los resultados obtenidos con el compuesto 18, el compuesto 1 tenía mucho mejor biodisponibilidad oral, el 35%, y la disponibilidad oral para el compuesto 3 se calculó como el 100%.

Los resultados de este experimento farmacocinético se presentan gráficamente en la Fig. 1.

Ejemplo 4

El Ejemplo 4 describe un bioensayo para medir la inhibición de un canal de potasio activado por calcio, el canal Gardos, en glóbulos rojos por los compuestos de la invención.

4.1 Materiales y Procedimientos

Se lavó sangre completa heparinizada tres veces con Tampón de Flujo Modificado (MFB: NaCl 140 mM; KCl 5 mM; Tris 10 mM; EGTA 0,1 mM; pH = 7,4). Las células lavadas después se incubaron durante 3 horas con ^{86}Rb (5 \muCi/ml). Después de este periodo de incubación, los RBC se lavaron tres veces con MFB frío. Los RBC cargados con ^{86}Rb lavados después se incubaron con un compuesto de ensayo de la invención durante 10 minutos. El flujo de ^{86}Rb después se inició por la adición de 20 \mul/ml de una solución MFB que contenía CaCl_{2} 10 mM y A23187 100 \muM, un ionóforo de calcio. Esto produjo una concentración final de CaCl_{2} 200 \muM y A23187 2 \muM en el medio de incubación. Las células se incubaron durante 10 minutos, se centrifugaron y se retiró el sobrenadante. Las muestras se contaron en un contador de centelleo líquido Wallace Microbeta por emisión Cerenkov. Se determinó el contenido total de RBC ^{86}Rb lisando los RBC con agua y después precipitando la proteína usando una mezcla 50:50 de etanol:cloroformo. Después de una centrifugación en microfuga de 20 minutos, se separaron las fases acuosa y orgánica y la fase acuosa se retiró y se contó. El eflujo se expresa como un porcentaje del contenido celular inicial de ^{86}Rb.

4.2 Resultados

El bioensayo descrito anteriormente demostró que los compuestos de la invención son inhibidores excelentes del canal Gardos. Los resultados numéricos para los estudios de inhibición se presentan en la Tabla 2, supra.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la EPO exime toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

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Claims

1. Un compuesto que tiene la estructura:

10

en la que,

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la estructura:

11

en la que,

m, n y p se seleccionan independientemente entre 0 y 1, y al menos uno de m, n y p es 1.

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene la estructura:

12

en la que n es 0 ó 1.

\newpage

4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la estructura:

13

5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la estructura

14

6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la estructura

15

7. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en forma de un hidrato.

8. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como un compuesto farmacéutico.

9. Un compuesto de la reivindicación 8 para el tratamiento de anemia de células falciformes.

10. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Un producto farmacéutico que comprende una combinación de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y otro agente terapéutico.

12. Un producto de la reivindicación 11, en el que el otro agente terapéutico es para tratar un síntoma o efecto secundario asociado con la enfermedad de células falciformes.

13. Un producto de la reivindicación 11, en el que el otro agente terapéutico es para tratar la enfermedad de células falciformes, por ejemplo es butirato, derivados de butirato, hidroxiurea, eritropoyetina o una sal de la dieta, por ejemplo una sal de magnesio.

14. Un procedimiento para inhibir el flujo de potasio de una célula in vitro, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha célula es un eritrocito.

16. Un procedimiento para reducir la deshidratación de los eritrocitos in vitro, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho eritrocito con una cantidad de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 eficaz para reducir dicha deshidratación, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10.

17. Uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para inhibir el flujo de potasio de una célula.

18. Uso de un compuesto de una cualquiera de as reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para reducir la deshidratación de los eritrocitos.

19. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un acontecimiento de enfermedad de células falciformes.

20. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el medicamento comprende una combinación definida en cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13.

21. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el medicamento es para su administración en terapia de combinación con un segundo medicamento que comprende otro agente terapéutico.

22. Uso de la reivindicación 21, en el que el otro agente terapéutico es como se ha definido en la reivindicación 12 o la reivindicación 13.