ES2291219T3 - Mono-oxigenasas del citocromo p450, modificadas. - Google Patents

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Abstract

Mono-oxigenasa del citocromo P450, modificada, que presenta un perfil modificado del substrato, mediante mutagénesis localmente específica de su región de fijación con el substrato, en comparación con el tipo natural, en la hidroxilación enzimática terminal y/o subterminal de los ácidos carboxílicos alifáticos; derivada de la mono-oxigenasa BM-3 del citocromo P450 procedente de de Bacillus megaterium, con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2, que contiene, al menos, respectivamente una mutación funcional en las posiciones 87 y 188 de la secuencia de aminoácidos y, en caso dado, al menos una mutación funcional en una de las posiciones de la secuencia de aminoácidos siguientes: 26, 47, 72, 74 y 354; verificándose que Phe 87 está reemplazado por Val, por Ala o por Leu; Leu 188 está reemplazado por Asn, por Gln, por Arg, por Lys, por Ala, por Gly, por Ser o por Trp; Ala 74 está reemplazado por Val o por Gly; Arg 47 está reemplazado por His, por Tyr o por Phe; Val 26 está reemplazado por Ser o por Thr, Ser 72 está reemplazado por Ala, por Val, por Leu, por Ile o por Gly; o Met 354 está reemplazado por Ser o por Thr.

Description

Mono-oxigenasas del citocromo P450, modificadas.
La presente invención se refiere a mono-oxigenasas del citocromo P450, modificadas, con un perfil modificado del substrato, a secuencias de ácidos nucleicos, a construcciones de expresión y a vectores, que las codifican, a microorganismos recombinantes, que contienen a estos vectores, así como a procedimientos para la obtención microbiológica de ácidos carboxílicos alifáticos hidroxilados de manera terminal o subterminal.
La mono-oxigenasa con la denominación P450 BM-3 es un enzima del citocromo P450 procedente de Bacillus megaterium y tiene una marcada homología secuencial con los enzimas P450 de mamíferos (1). Debido a estas coincidencias, la P450 BM-3 representa un excelente sistema modelo para esta clase de enzimas P450. La P450 BM-3 hidroxila, en primer lugar, a los ácidos grasos saturados de cadena larga en su átomo de carbono \omega-1, \omega-2 y \omega-3. Del mismo modo, son transformadas las amidas o los análogos alcohólicos y los epóxidos de los ácidos grasos insaturados de cadena larga (1-3). La actividad catalítica para los ácidos grasos saturados depende de la longitud de la cadena, encontrándose el óptimo de las longitudes de las cadenas entre 14 y 16 átomos de carbono. El enzima no muestra actividad catalítica para los ácidos grasos con una longitud de cadena menor que 12 átomos de carbono (1).
Resumen de la invención
La tarea de la presente invención consistía, por lo tanto, en proporcionar mutantes de la mono-oxigenasa del citocromo P450, que mostrasen un perfil modificado del substrato en comparación con el enzima de tipo natural. Especialmente, debían proporcionarse nuevos mutantes, que hidroxilasen a los ácidos carboxílicos alifáticos, saturados, en otra posición de la cadena y/o que tuviesen una especificidad modificada con respecto al substrato. Ante todo, debían proporcionarse aquellos mutantes, que tuviesen actividad catalítica frente a los ácidos carboxílicos alifáticos con una longitud media de la cadena, especialmente con una longitud de la cadena comprendida entre 8 y 12, tal como por ejemplo comprendida entre 8 y 10 átomos de carbono y que los hidroxilasen de manera subterminal, ante todo, en las posiciones \omega-1, \omega-2 y/o \omega-3.
Esta tarea se resolvió, sorprendentemente, mediante la preparación de mono-oxigenasas del citocromo P450, modificadas, que muestran un cuadro de reactividad, o bien un perfil con respecto al substrato, modificado, en el caso de la hidroxilación enzimática terminal y/o subterminal de los ácidos carboxílicos alifáticos, por medio de una combinación de una evolución dirigida y de una mutagénesis localmente específica de su región de fijación con el substrato, en comparación con el tipo natural.
Descripción detallada de la invención
Para los mutantes según la invención debe observarse un "perfil modificado del substrato" en comparación con el enzima de tipo natural. Un "perfil modificado del substrato" significa, en el ámbito de la presente invención, a) una mejora de la reactividad, tal como, por ejemplo, un aumento de la actividad específica (expresada como nmoles de ácido carboxílico transformado/minuto/nmol de enzima P450) y/o un aumento de, al menos, un parámetro cinético seleccionado entre Kcat, Km y Kcat/Km, por ejemplo de, al menos, un 1%, tal como por ejemplo entre un 10 y un 1.000%, entre un 10 y un 500%, o entre un 10 y un 100% de los mutantes con respecto a, al menos, un ácido carboxílico alifático, que puede ser hidroxilado o con respecto a un derivado de un ácido carboxílico alifático, que puede ser hidroxilado y/o b) una modificación, especialmente un aumento, de la regioselectividad en el caso de la hidroxilación de los ácidos carboxílicos. Esto consiste, por ejemplo, en un desplazamiento de la posición de la hidroxilación preferentemente terminal o subterminal (\omega-1, \omega-2, \omega-3, \omega-4, especialmente \omega-1 hasta \omega-3), al menos, en un ácido carboxílico, que puede ser hidroxilado, o en un derivado de un ácido carboxílico alifático, que puede ser hidroxilado. Los ácidos carboxílicos alifáticos, que pueden ser hidroxilados, o sus derivados, en los cuales debe observarse, según la invención, un "perfil modificado del substrato", son los ácidos carboxílicos ramificados o, preferentemente, de cadena lineal con 8 hasta 30 átomos de carbono. En este caso, la modificación, según la invención, del perfil del substrato puede estar claramente marcada a través de todo el intervalo de tamaño (es decir entre 8 y 30 átomos de carbono) o puede estar marcada únicamente en intervalos parciales, por ejemplo en el caso de los ácidos carboxílicos con 8 hasta 12 átomos de carbono, con 10 hasta 12 átomos de carbono, con 12 hasta 30 átomos de carbono, con 12 hasta 25 átomos de carbono o con 12 hasta 20 átomos de carbono o puede estar marcada en los ácidos carboxílicos individuales, contenidos en estos intervalos parciales.
Como ejemplos, no limitativos, de los ácidos carboxílicos, que puede ser hidroxilados, según la invención pueden citarse: el ácido caprílico, el ácido perlargónico, el ácido cáprico, el ácido undecanoico, el ácido láurico, el ácido tridecanoico, el ácido mirístico, el ácido pentadecanoico, el ácido palmítico, el ácido margarínico, el ácido esteárico, el ácido nonadecanoico, el ácido araquínico, el ácido behénico, el ácido lignocerínico, el ácido cerotínico y el ácido melísico. Ejemplos de derivados adecuados de los ácidos carboxílicos son los ésteres de alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono, las amidas o los anhídridos, preferentemente, de los ácidos carboxílicos de cadena corta con 1 hasta 4 átomos de carbono.
De manera preferente, las mono-oxigenasas, según la invención, se derivan de las mono-oxigenasas del citocromo P450 de las clases de enzimas E.C. 1.14.-.-, especialmente de la familia CYP102 de P450, y son eucariotas o procariotas, especialmente de origen bacteriano.
Un grupo, especialmente preferente, de mutantes se deriva de la mono-oxigenasa BM-3 del citocromo P450 procedente de Bacillus megaterium con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2, que presenta, al menos, una mutación funcional en una de las siguientes regiones de la secuencia de aminoácidos: 24-28, 45-51, 70-72, 73-82 (hélice 5), 86-88 (hélice 6), 172-224 (bucle F/G) y 352-356 (\beta-hebra 8), con la condición de que esté mutada más de una de estas regiones, cuando el enzima porte la mutación F87A; así como los equivalentes funcionales de estos mutantes.
La mutación correspondiente se indicará, en el ámbito de la presente descripción, según el código de letras para los aminoácidos. Por delante del número, que indica la posición de la mutación en la secuencia, se ha indicado el aminoácido original, detrás del número se ha indicado el aminoácido modificado.
Una "mutación funcional", en el sentido de la presente invención, abarca un intercambio de aminoácidos en las citadas regiones de la secuencia, que conduzca a un "cuadro modificado de la reactividad" o bien a un "perfil modificado del substrato" según la definición dada precedentemente.
El objeto de la invención está constituido por mono-oxigenasas del citocromo P450, modificadas, según la reivindicación 1.
Los mutantes preferentes presentan, al menos, uno de los siguientes cuadros de substitución de los aminoácidos:
a)
F87A, L188K;
b)
F87V, L188K;
c)
F87A, L188K; A74G;
d)
F87V, L188K, A74G;
e)
F87A, L188K, A74G, R47F;
f)
F87V, L188K, A74G, R47F;
g)
F87A, L188K, A74G, R47F, V26T; o
h)
F87V, L188K, A74G, R47F, V26T.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto de la invención está constituido, además, por secuencias de ácidos nucleicos, que codifican una mono-oxigenasa mutada o un "equivalente funcional" según la definición precedente. Estas secuencias pueden ser obtenidas, preferentemente, de la SEQ ID NO: 1 mediante intercambio del codón de acuerdo con el cuadro anterior de substitución de los aminoácidos.
Según la invención, quedan abarcadas, también, aquellas secuencias de ácidos nucleicos, que abarquen las mutaciones denominadas silenciosas o que están modificadas, de acuerdo con la utilización del codón de un organismo original especial o de un organismo huésped especial, en comparación con una secuencia citada de manera concreta, así como sus variantes de origen natural. Según la invención, quedan abarcadas, además, las variantes de las secuencias de los ácidos nucleicos, obtenidas mediante degeneración del código genético (es decir, sin modificación de la correspondiente secuencia de aminoácidos) o mediante substitución conservadora de los nucleótidos (es decir, la substitución del correspondiente aminoácido por otro aminoácido con la misma carga, con el mismo tamaño, con la misma polaridad y/o con la misma solubilidad), así como las secuencias modificadas mediante la adición, la inserción, la inversión o la deleción de nucleótidos, que codifiquen las mono-oxigenasas según la invención con "perfil modificado del substrato", así como las correspondientes secuencias complementarias.
El objeto de la invención está constituido, además, por las construcciones de expresión, que contienen una secuencia de ácidos nucleicos, que codifique un mutante según la invención, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácidos nucleicos; así como por los vectores, que comprendan, al menos, una de estas construcciones de expresión.
De manera preferente, las construcciones, según la invención. abarcan un promotor en la posición 5' aguas arriba de la correspondiente secuencia codificante y una secuencia de terminación en la posición 3' aguas abajo, así como, en caso dado, otros elementos reguladores usuales y, concretamente, enlazados respectivamente de manera operativa con la secuencia codificante. Se entenderá por una fijación operativa la disposición secuencial del promotor, de la secuencia codificante, del terminador y, en caso dado, de otros elementos reguladores de tal manera, que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función, según lo establecido, en la expresión de la secuencia codificante. Ejemplos de secuencias que pueden ser enlazadas de manera operativa son las secuencias directrices así como los amplificadores de la traducción, los reforzadores, las señales de poliadenilación, los marcadores de selección, las señales de amplificación, los orígenes para la replicación y similares.
Conjuntamente con las secuencias artificiales de regulación, puede estar presente, además, la secuencia natural de regulación por delante del gen estructural propiamente dicho. En caso dado, con ayuda de la modificación genética puede desconectarse esta regulación natural y puede aumentarse o disminuirse la expresión de los genes. Sin embargo, la construcción génica puede estar constituida, también, de una manera más sencilla, es decir. que no se insertan señales adicionales de regulación por delante del gen estructural y no se eliminará el promotor natural con su regulación. En lugar de ello se mutará la secuencia natural de regulación de tal manera, que ya no se verifique cualquier regulación y que se aumente o se disminuya la expresión génica. Las secuencias de los ácidos nucleicos pueden estar contenidas en una o en varias copias en la construcción génica.
Ejemplos de promotores son: el promotor cos, el promotor tac, el promotor trp, el promotor tet, el promotor trp-tet, el promotor lpp, el promotor lac, el promotor lpp-lac, el promotor lacIq, el promotor T7, el promotor T5, el promotor T3, el promotor gal, el promotor trc, el promotor ara, el promotor SP6, el promotor 1-PR o el promotor 1-PL, que encuentran aplicación, de una manera ventajosa, en las bacterias gram-negativas; así como los promotores gram-positivos amy y SP02, los promotores de levaduras ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH o los promotores vegetales CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o los promotores ubiquitina o los promotores faseolina.
En principio, pueden emplearse todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación. Además, pueden emplearse ventajosamente, también, los promotores sintéticos.
Las citadas secuencias de regulación deben posibilitar la expresión específica de las secuencias de los ácidos nucleicos. Esto puede significar, por ejemplo, según el organismo huésped, que el gen sea expresado o que sea sobreexpresado sólo tras la inducción o que sea expresado y/o que sea sobreexpresado inmediatamente.
De manera preferente, las secuencias o bien los factores de regulación pueden influenciar, en este caso, de manera positiva sobre la expresión y, de este modo, pueden aumentarla o disminuirla. De este modo, podrá llevarse a cabo un reforzamiento de los elementos de regulación ventajosamente en el plano de la transcripción, empleándose potentes señales de transcripción tales como los promotores y/o los "reforzadores". Además, es posible también un refuerzo de la traducción dado que se mejora, por ejemplo, la estabilidad del ARNm.
La obtención de un casete de expresión se lleva a cabo mediante la fusión de un promotor adecuado con una secuencia adecuada de nucleótidos de la mono-oxigenasa, así como con una señal de terminación o de poliadenilación. Para ello se emplean técnicas usuales de recombinación y de clonación, como las que han sido descritas, por ejemplo, en las publicación de T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como en la publicación de T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en la publicación de Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
La construcción recombinante de ácidos nucleicos o bien la construcción génica se inserta, para la expresión, en un organismo huésped adecuado, ventajosamente en un vector específico para el huésped, que posibilite una expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son perfectamente conocidos por el técnico en la materia y pueden tomarse, por ejemplo, de la publicación "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Se entenderán por vectores, además de los plásmidos, también todos los otros vectores conocidos por el técnico en la materia, tales como, por ejemplo, los fagos, los virus, tales como SV40, CMV, los baculovirus y los adenovirus, los transposones, los elementos IS, los fásmidos, los cósmidos y el ADN lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o se replican de manera cromosómica.
Con ayuda de los vectores, según la invención, pueden prepararse microorganismos recombinantes, que puedan ser transformados, por ejemplo, con al menos un vector según la invención y que puedan ser empleados para la producción de mutantes. Ventajosamente, las construcciones recombinantes, según la invención, precedentemente descritas, se insertarán y se expresarán en un sistema huésped adecuado. En este caso se emplearán, preferentemente, los métodos de clonación y de transfeccción conocidos por el técnico en la materia, tales como, por ejemplo, la co-precipitación, la fusión de protoplastos, la electroporación, la transfección retroviral y similares, para provocar la expresión de los citados ácidos nucleicos en el correspondiente sistema de expresión. Los sistemas adecuados han sido descritos, por ejemplo, en la publicación Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997.
En principio, son adecuados como organismos huésped todos aquellos organismos, que posibiliten una expresión de los ácidos nucleicos, según la invención, de sus variantes alelofórmicas, de sus equivalentes o derivados funcionales. Se entenderán por organismos huésped, por ejemplo, las bacterias, los hongos, las levaduras, las células vegetales o animales. Los organismos preferentes son las bacterias, como aquellas de los géneros Escherichia, tales como por ejemplo Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus o Pseudomonas, los microorganismos eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, células eucariotas superiores procedentes de animales o de vegetales, por ejemplo las células Sf9 o las células CHO.
En caso deseado, podrá provocarse la expresión del producto génico, también, en organismos transgénicos tales como los animales transgénicos, como, especialmente, los ratones, lo corderos o las plantas transgénicas. Del mismo modo, los organismos transgénicos pueden estar constituidos por los denominados animales o plantas con genes inactivos (Knock-Out), en los que se ha desactivado el correspondiente gen endo-génico, tal como por ejemplo por medio de la mutación o por medio de la deleción parcial o completa.
La selección de los organismos, que han sido transformados con éxito, puede llevarse a cabo por medio de genes marcadores que, están contenidos, de igual modo, en el vector o en el casete de expresión. Ejemplos de tales genes marcadores son los genes para la resistencia a los antibióticos y para los enzimas, que catalicen una reacción proporcionadora de un color, que provoque una tinción de las células transformadas. Éstas pueden seleccionarse, entonces, por medio de una clasificación automática de las células. Los microorganismos, que hayan sido transformados con éxito con un vector, que porten un gen correspondiente, resistente a los antibióticos (por ejemplo a la G418 o la higromicina), pueden seleccionarse con ayuda de los correspondientes medios o substratos sólidos nutrientes, que contengan antibióticos. Las proteínas marcadoras, que están presentes en la superficie celular, pueden aprovecharse para la selección con ayuda de la cromatografía de afinidad.
La combinación formada por los organismos huésped y por los vectores adaptados a los organismos, tales como los plásmidos, los virus o los fagos, tales como, por ejemplo, los plásmidos con el sistema ARN-polimerasa/ promotor, los fagos \lambda, \mu u otros fagos moderadores o transposones y/o otras secuencias ventajosas de regulación, forma un sistema de expresión. A modo de ejemplo, debe entenderse por el concepto de "sistema de expresión" la combinación formada por células de mamíferos, tales como las células CHO, y por vectores, tal como el vector pcDNA3neo, que son adecuados para células de mamíferos.
Tal como se ha descrito precedentemente, podrá provocarse la expresión del producto génico, de manera ventajosa, también en animales transgénicos, por ejemplo en ratones, en corderos o en plantas transgénicas. Del mismo modo, es posible programar sistemas de traducción acelulares con el ARN derivado del ácido nucleico.
Además, el objeto de la invención está constituido por procedimientos para la obtención de una mono-oxigenasa, según la invención, mediante el cultivo de un microorganismo productor de la mono-oxigenasa, induciéndose, en caso dado, la expresión de la mono-oxigenasa y aislándose del cultivo la mono-oxigenasa. De este modo, la mono-oxigenasa, según la invención, puede producirse a escala industrial, cuando esto sea deseable.
El microorganismo puede ser cultivado y fermentado de conformidad con los procedimientos conocidos. Las bacterias pueden multiplicarse, por ejemplo, en el medio TB o en el medio LB y a una temperatura comprendida entre 20 y 40ºC y a un valor del pH comprendido entre 6 y 9. En particular, se han descrito las condiciones de cultivo adecuadas, por ejemplo, en la publicación de T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Las células serán sometidas a digestión a continuación, cuando la mono-oxigenasa no sea secretada en el medio de cultivo, y se obtendrá la mono-oxigenasa a partir del lisado de conformidad con los conocidos procedimientos para el aislamiento de las proteínas. Las células pueden someterse a una digestión, a elección, mediante la aplicación de ultrasonidos de alta frecuencia, mediante alta presión, tal como por ejemplo en una célula a presión de French, mediante la osmolisis, mediante la acción de los detergentes, mediante enzimas líticos o por medio de disolventes orgánicos, mediante homogenizadores o mediante la combinación de varios de los procedimientos indicados.
Una purificación de la mono-oxigenasa puede conseguirse con los conocidos procedimientos cromatográficos, tales como la cromatografía con tamices moleculares (filtración en gel), como la cromatografía con sefarosa Q, la cromatografía con intercambio de iones y la cromatografía hidrófoba, así como con otros procedimientos usuales, tales como la ultrafiltración, la cristalización, la separación mediante la formación de sales, la diálisis y la electrofóresis en gel natural. Los procedimientos adecuados han sido descritos, por ejemplo, en las publicaciones de Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlín, New York o de Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlín.
Para el aislamiento de la proteína recombinante es especialmente ventajoso emplear sistemas vectoriales u oligonucleótidos, que prolonguen al ADNc en un número determinado de secuencias de nucleótidos y, de este modo, que codifiquen polipéptidos o proteínas de fusión, modificados, que sirven para una purificación más sencilla. Tales modificaciones adecuadas son, por ejemplo, los denominados "Tags", que actúan como cola, tal como por ejemplo la modificación, conocida como cola de hexa-histidina, o los epitopos, que pueden ser reconocidos como antígenos por parte de los anticuerpos (descritos, por ejemplo, en la publicación de Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) en prensa).
Estas colas pueden servir para la unión de las proteínas sobre un soporte fijo, tal como, por ejemplo, una matriz polímera, que puede estar cargada, por ejemplo, en una columna para cromatografía, o que puede emplearse en una placa de microtitulación o sobre un soporte de otro tipo.
Al mismo tiempo, estas colas pueden emplearse también para el reconocimiento de las proteínas. Para el reconocimiento de las proteínas pueden emplearse, además, los marcadores usuales tales como los colorantes fluorescentes, los marcadores enzimáticos, que forman un producto de reacción, que puede ser detectado tras la reacción con un substrato, o marcadores radioactivos, solos o en combinación con las colas para la derivatización de las proteínas.
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El objeto de la invención está constituido, además, por procedimientos bioquímicos para la obtención enzimática de ácidos carboxílicos alifáticos hidroxilados en posición terminal o subterminal (\omega-1 hasta w-4), caracterizados porque
a1)
se cultiva, de manera aerobia, un microorganismo recombinante, según la invención, en presencia de un medio de cultivo, que contenga, al menos, un ácido carboxílico, que pueda ser hidroxilado o, al menos, un derivado de ácido carboxílico, que pueda ser hidroxilado; o
a2)
se incuba, de manera aerobia, un medio de reacción, que contenga, al menos, un ácido carboxílico, que pueda ser hidroxilado o, al menos, un derivado de ácido carboxílico que pueda ser hidroxilado, con un mutante según la invención; y
b)
se aísla del medio el producto hidroxilado o la mezcla de productos hidroxilados, que se han formado.
En el procedimiento según la invención pueden ser empleados los ácidos carboxílicos como tales (per se) o pueden emplearse los derivados de los mismos, tales como, por ejemplo, los ésteres de alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono o las amidas de los ácidos carboxílicos.
Como ácidos carboxílicos, que puede ser hidroxilados, se emplearán, de manera preferente, en el procedimiento, según la invención, los ácidos monocarboxílicos con 8 hasta 30 átomos de carbono o sus derivados.
De manera especialmente preferente, en el procedimiento, según la invención, se empleará como ácido carboxílico, que puede ser hidroxilado, un ácido monocarboxílico con 8 hasta 12 átomos de carbono o un derivado del mismo y, como mono-oxigenasa, se empleará un mutante según la reivindicación 1.
De manera usual, la reacción de oxidación, según la invención, se llevará a cabo en presencia del oxígeno del aire así como en presencia de un donador de electrones (o equivalente de reducción), tales como, especialmente, el NADH, el NADPH y el sepulcrato de Zn/Co(III). El empleo del sepulcrato de Zn/Co(III) ha sido descrito, por ejemplo, en la publicación DE-A-199 35 115, a la que se hace aquí referencia expresa.
Cuando se lleve a cabo la hidroxilación, según la invención, con un microorganismo recombinante, se llevará a cabo, preferentemente, en primer lugar el cultivo de los microorganismos en presencia de oxígeno y en un medio complejo, tal como, por ejemplo, el medio TB o el medio LB, a una temperatura para el cultivo comprendida, aproximadamente entre 20 y 40ºC y con un valor del pH comprendido, aproximadamente entre 6 y 9, hasta que se alcance una densidad celular suficiente. La adición de substrato exógeno se lleva a cabo según las necesidades. Para poder controlar mejor la reacción de oxidación, se da preferencia al empleo de un promotor inducible, especialmente inducible por medio de la temperatura. En este caso se aumenta la temperatura hasta la temperatura necesaria para provocar la inducción, por ejemplo hasta 42ºC en el caso del promotor P_{r}P_{1}, ésta se mantiene durante un lapso de tiempo suficiente, por ejemplo entre 1 y 10 o entre 5 y 6 horas, para la expresión de la actividad de la mono-oxigenasa y, a continuación, se reduce de nuevo la temperatura hasta un valor comprendido entre aproximadamente 30 y 40ºC. El cultivo se proseguirá entonces en presencia de oxígeno durante 12 horas hasta 3 días.
Por el contrario, cuando la oxidación, según la invención, se lleve a cabo con el enzima purificado o enriquecido, se disolverá el mutante enzimático, según la invención, en un medio, que contenga un substrato exógeno (aproximadamente desde 0,01 hasta 10 mM, o desde 0,05 hasta 5 mM), y se conducirá la reacción, preferentemente en presencia de oxígeno, a una temperatura comprendida entre aproximadamente 10 y 50ºC, tal como por ejemplo entre 30 y 40ºC, y con un valor del pH comprendido entre aproximadamente 6 y 9 (tal como por ejemplo el que se establece con de tampón de fosfato o con el de tampón tris 100 hasta 200 mM), así como en presencia de un agente reductor, pudiendo presentar el medio, que contiene el substrato, además, referido al substrato, que debe ser oxidado, aproximadamente un exceso molar comprendido entre 1 y 100 veces de equivalentes de reducción. En caso necesario, pude llevarse a cabo en porciones la adición del medio de reducción.
En caso necesario, podrá hacerse pasar oxígeno, en forma en sí conocida, a través del medio de la reacción.
Cuando se llevan a cabo los procedimientos, según la invención, con el enzima enriquecido o purificado, podrán establecerse, por ejemplo, condiciones de reacción siguientes:
1 
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Como paso previo al inicio de la reacción, mediante la adición del donador de electrones, podrá añadirse acetona en una concentración comprendida entre un 1 y un 5% (v/v) para aumentar la actividad y podrá efectuarse una incubación previa de corta duración (entre 1 y 5 minutos) (aproximadamente a 20 hasta 40ºC).
El técnico en la materia podrá optimizar las correspondientes condiciones de la reacción por medio de ensayos de rutina, que se desvíen de las condiciones anteriormente indicadas.
Para la generación de variantes con propiedades enzimáticas modificadas se dispone, en el ámbito de la ingeniería de las proteínas, de dos estrategias diferentes: por un lado se dispone del método del "diseño racional" (4) así como del método de la "evolución específica" (5-7). Para obtener éxito con un diseño racional tiene un significado central un modelo estructural tridimensional altamente resuelto así como un conocimiento profundizado del mecanismo enzimático. Mientras que, para el diseño racional se ha indicado la capacidad para generar mutantes enzimáticos, que tengan una elevada actividad frente a los substratos no naturales (4), frecuentemente no puede ser previsto el efecto que pueden tener las mutaciones individuales, puntuales, de los aminoácidos sobre la estabilidad, sobre la actividad y sobre la especificidad de los mutantes.
Aún cuando han sido depositadas las estructuras tomadas por medio de rayos X de la P450 BM-3 en el banco de datos de proteínas (8), sigue sin ser clara la coincidencia entre el substrato y la P450 durante la etapa crítica de la hidroxilación (9-11). Para el método de la evolución específica tiene un significado central un método eficaz para un cribado rápido de grandes bibliotecas de mutantes aleatorios. Se ha revelado como aplicable (12, 13) un ensayo óptico para el mutante F87A de la P450 BM-3, que utiliza los ácidos \omega-para-nitrofenoxicarboxílicos (pNCA). El mutante individual F87A desplaza la posición de la hidroxilación de los ácidos grasos desde la posición \omega-1, \omega-2 y \omega-3 hacia la posición \omega (13) y conduce, además, a una transformación completa de los 12-pNCA en comparación con una transformación del 33%, que se observa en el enzima de tipo natural (12). Puesto que, sin embargo, el dominio de la mono-oxigenasa de la P450 BM-3 abarca más de 400 aminoácidos, el cribado de una biblioteca de los mutantes aleatorios equivalente a buscar una aguja en un pajar.
Para mejorar la eficacia del procedimiento de busca se combinó, según la invención, el procedimiento del diseño racional con el procedimiento de la evolución específica para generar mutantes con una reactividad modificada, especialmente para generar mutantes con especificidad para los ácidos grasos con una longitud media de sus cadenas. El método, según la invención, de la "evolución racional" está basado en un modelado de las proteínas asistido por ordenador, para generar una biblioteca aleatoria virtual y para identificar los restos, que ejerzan una influencia sobre las propiedades deseadas con elevada probabilidad. Se forma una sub-biblioteca mediante una agrupación aleatoria de estos restos y llevándose a cabo un cribado con respecto a los mutantes positivos. A partir de un modelo estructural, se comienza con la determinación de aquellos restos, que sean significativos, posiblemente, para la especificidad de la longitud de la cadena. Para la generación de mutantes con propiedades mejoradas, se modificará el punto de mutación, propuesto por medio del modelo, con ayuda de la mutagénesis de saturación. A continuación, se combinarán entre sí los mutantes individuales, que presenten las mejores propiedades, teniéndose en consideración el diseño racional. Mediante el empleo de esta estrategia combinada pudo mejorarse, especialmente, la actividad de la P450 BM-3 para substratos con una longitud media de la cadena.
Mediante el empleo de esta estrategia, y debido a la homología de la secuencia con respecto al enzima P450 de otro origen, se proporciona al técnico en la materia la posibilidad de preparar, de manera análoga, otros mutantes, que constituyen, también, el objeto de la invención.
La presente invención se explicará ahora con mayor detalle por medio de la siguiente descripción experimental y haciéndose referencia a las figuras adjuntas. En este caso:
la figura 1 muestra la optimación escalonada de la P450 BM-3 para el nuevo substrato 8-pNCA. Se ha dado la eficacia catalítica con respecto al 8-pNCA para cada mutante (en la unidad s-^{1}M^{-1}); y
la figura 2 muestra un modelo del complejo del mutante LARVF de la P450 BM-3 en el substrato 8-pNCA. Se han representado las cadenas laterales, que presentan las cinco mejores posiciones de mutación y que se combinaron para dar el mutante LARVF (V26T, R47F, A74G, F87V, L188K).
Método 1 Modelado del complejo substrato-P450 BM-3
El modelado del complejo substrato-enzima está basado en la estructura, determinada por cristalografía, de la P450 BM-3, transformada en forma de complejo con el ácido palmitoleico (9). Esta estructura ha sido depositada en el banco de datos de proteínas (8). La estructura cristalina descrita, con una resolución de 2,9 \ring{A}, contiene cuatro moléculas en una celdilla elemental asimétrica. Se tomo como referencia a la cadena A para el complejo modelado. Como molécula substrato se generó un modelo de 8-pNCA mediante el empleo del "Molecule Builder" de SYBYL (Tripos, Inc., St. Louis, USA). La mutación F87A se generó mediante el empleo de la herramienta Biopolymer de SYBYL. Los átomos de carbono 1 hasta 4 del substrato se colocaron en el punto de fijación de acuerdo con los átomos de carbono 6 a 9 del ácido palmitoleico enlazado. Los ángulos de torsión de las cadenas de los ácidos grasos se seleccionaron de acuerdo con la configuración trans. Los ensayos realizados por medio de la RMN para el complejo P450 BM-3-laurato y P450 BM-12-bromolaurato muestran, que los protones de los átomos de carbono hidroxilados (C10 y C11) se encuentran a una distancia aproximada de 3,0 \ring{A} del hierro enlazado con la hemoglobina en el nivel de oxidación II (10, 13). Tomándose como base estos resultados se localizaron los correspondientes átomos C7 y C8 del 8-pNCA a una distancia de 4 \ring{A} o bien de 3,6 \ddot{A} del hierro enlazado con la hemoglobina. El grupo para-nitrofenoxi se dispuso manualmente en el casete de fijación. Además, se minimizó la energía del complejo a través de los átomos fijados de la cadena principal.
Método 2 Mutagénesis por saturación
Los mutantes, empleados según la invención, se prepararon con ayuda de la mutagénesis por saturación con empleo del estuche Stratagene QuikChange (La Jolla, California, USA). Para la mutación a través del modelado de la P450 BM-3 se seleccionaron nueve posiciones las proximidades del canal de fijación con el substrato y, concretamente, la P25, la V26, la R47, la Y51, la S72, la A74, la F87, la L188 y la M354. En la tabla 1 se han reunido los cebadores para cada una de estas posiciones.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
2
Las condiciones de la reacción fueron idénticas para todos los procedimientos de mutagénesis por RCP, con excepción de la temperatura de hibridización, que se varió de la manera siguiente: 50ºC para las posiciones 25, 26, 188 y 354; 52ºC para las posiciones 47 y 51; y 46ºC para las posiciones 72, 74 y 87. Las reacciones se llevaron a cabo con un volumen de reacción de 50 \mul, conteniendo cada carga 17,5 pmoles de cada cebador, 20 pmoles del ADN plásmido mensajero, 3 U de la Pfu-polimerasa y 3,25 nmoles de cada dNTP. La reacción se inició a 95ºC, durante 4 minutos, a continuación recorrió 20 veces el ciclo térmico siguiente: 95ºC, 1 minuto; 46-52ºC, 2,5 minutos; 72ºC, 17 minutos; al cabo de estos 20 ciclos se prosiguió la reacción durante 15 minutos a 72ºC. Para la mutagénesis localmente específica mediante la RCP se modificó un codón individual para el intercambio de un aminoácido. Para el agrupamiento aleatorio de un aminoácido específico se emplearon cebadores, en los cuales "nnn" codifica el aminoácido específico. Todas las soluciones del producto de la RCP se trataron con 20 U de DpnI a 37ºC durante 3 horas para digerir el ADN mensajero original, no mutado. A continuación se llevó a cabo la transformación en E. coli D85\alpha.
Método 3 Expresión y purificación del enzima de tipo natural así como de los mutantes
El gen de tipo natural de la P450 BM-3 y sus mutantes fueron expresados bajo el control del potente promotor P_{R}P_{L}, que puede ser inducido por medio de la temperatura, pCYTEXP1 en E. coli cepa DH5\alpha (supE44, lacU169 [80lacZ M15] hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1). La única mutación puntual F87A se insertó, como es conocido en el estado de la técnica (12). Las células transformadas se distribuyeron en los pocillos de placas de agar LB, que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Al cabo de 12 hasta 24 horas de crecimiento se recogieron las colonias con palillos de dientes estériles y se dispusieron en placas de microtitulación con 96 pocillos, conteniendo cada pocillo 200 \mul de medio TB (12 g de triptofano, 24 g de extracto de levadura, 4 ml de glicerina, H_{2}O (destilada) hasta 1 litro) con 100 \mug/ml de ampicilina. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC. A continuación se tomaron 40 \mul de cada pocillo y se transfirieron hasta tubitos de cultivo, que contenían 2 ml de medio TB con 100 \mug/ml de ampicilina y a continuación se incubaron durante 2 horas a 37ºC y seguidamente se incubaron durante 6 horas a 42ºC. Las células se separaron por centrifugación a 4.000 revoluciones por minuto, durante 5 minutos, se trataron con lisozima procedente de proteína de gallina (1 U/ml) y a continuación se congelaron y se descongelaron dos veces. El extracto celular bruto se obtuvo por centrifugación durante 10 minutos a 14.000 revoluciones por minuto. El sobrenadante, obtenido de este modo, se empleó para la medida de la actividad. Para la obtención de grandes cantidades del enzima se empleó un matraz de 2 litros, que puede someterse a trepidaciones, con 300 ml de medio TB con 100 \mug/ml de ampicilina, se incubó a 37ºC y se aplicaron trepidaciones durante 2 horas a 200 revoluciones por minuto (OD_{578nm} = 0,8 hasta 1,0) y a continuación se incubó durante 6 horas a 42ºC. Las células se recolectaron por centrifugación durante 10 minutos a 4.000 revoluciones por minuto y se suspendieron en 15 ml de tampón 0,1 M de fosfato de potasio, pH 7,4. La suspensión, enfriada con hielo, se sometió a digestión con ayuda de un Branson Sonifiers W25 (Dietzenbach, Alemania) (80 W, 2 minutos, 3 ciclos). La suspensión se centrifugó durante 20 minutos a 32.570 x g. El extracto bruto se empleó para la determinación de la actividad del enzima o para la purificación del enzima.
La purificación del enzima se llevó a cabo como se ha descrito en (14), empleándose, sin embargo, una instalación de cromatografía BioPilot (Pharmacia, Suecia). La pureza del enzima se fija por medio de la determinación de la proteína total así como mediante la determinación de la cantidad del enzima. La concentración en enzima purificado se determinó por medio de la diferencia entre el espectro de extinción del complejo de carbonilo de la forma hierro-(II), en comparación con la forma hierro-(II), con empleo de una capacidad molecular de absorción de 91 mM^{-1} cm^{-1} para el par de longitudes de onda formado por 450 nm y por 490 nm (1).
Método 4 Aislamiento de los mutantes con mayor actividad para substratos con una longitud más corta de las cadenas
Como ADN mensajero se empleó el mutante F87A de la P450 BM-3, en lugar de emplearse el tipo natural. Se prepararon las mutaciones para la posición correspondiente como se ha descrito precedentemente. Se recolectaron respectivamente, 100 colonias aproximadamente para la exploración del espacio secuencial en cada posición, se cultivaron en tubitos de cultivo y, a continuación, se aislaron células de los mismos y se sometieron a un lisado. Para el ensayo de actividad se emplearon los extractos celulares brutos de cada una de las colonias seleccionadas. Se secuenciaron, para la determinación de las mutaciones, todos los mutantes que mostraron, en comparación con el F87A, una mayor actividad para, al menos, un substrato con una longitud más corta de la cadena que la del 15-pNCA.
Se seleccionaron, para una combinación ulterior con otras mutaciones, los mutantes con la respectiva actividad máxima para el 12-pNCA, para el 10-pNCA o para el 8-pNCA de todos los mutantes para la misma posición. La mutación combinada se llevó a cabo por etapas mediante la mutagénesis localmente específica. La vía de la combinación ha sido representada en la figura 1. Para cada etapa de la combinación se aislaron seis colonias para la determinación de la especificidad con respecto al substrato. Se seleccionó una colonia con especificidad representativa con respecto al substrato y se determinó la especificidad con respecto al substrato para el enzima puro.
El plásmido de la colonia seleccionada se utilizó para la etapa siguiente de la mutagénesis localmente específica. Se determinaron las mutaciones en los mutantes finales por medio de la secuenciación del ADN (ABI PRISM^{R} BigDye^{TM} estuche Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction y ABI Prism^{TM} 377 DNA Sequencer).
Método 5 Ensayo de la actividad del enzima
Para el ensayo de la actividad del pNCA se emplearon 8 \mul de una solución 10 mM de pNCA en DMSO en una cubeta no reutilizable en un volumen final de 1 ml. Tras la adición de 850 \mul del tampón tris/HCl (0,1 M, pH 8,2) y de 0,1 hasta 0,4 nmoles de P450 a la correspondiente solución de pNCA-DMSO, se sometieron las muestras a una incubación previa durante 5 minutos, antes de efectuarse la iniciación de la reacción mediante la adición de 50 \mul de una solución acuosa de NADPH 1 mN. Para la determinación de Kcat y Km se estableció una serie de concentraciones para los diversos substratos de pNCA (respecto a los detalles relativos al procedimiento de detección puede hacerse referencia a (12)).
Para la realización del ensayo de los pNCA en una placa de microtitulación, se empleó una placa con 96 pocillos (Greiner, Frickenhausen, Alemania). La carga de la reacción contenía, en un volumen de reacción total de 250 \mul en el tampón tris/HCl (0,1 M, pH 8,2) bien 60 nmoles de 8-pNCA, o 15 nmoles de 10-pNCA, o 15 nmoles de 12-pNCA o bien 15 nmoles de 15-pNCA, disueltos respectivamente en 2,5 \mul de DMSO. Al cabo de una incubación previa durante 5 minutos, con 40 \mul de muestras de la P450 BM-3, se inició la reacción mediante la inyección de 30 \mul de una solución 1 mM de NADPH en cada pocillo. Las placas se midieron a 405 nm, inmediatamente después de la adición de la solución de NADPH, en un dispositivo láser para placas.
Método 6 Reacción de los ácidos carboxílicos con los mutantes según la invención y determinación de los productos a) Reacción química
Para la hidroxilación de los ácidos grasos, en presencia de la P450 BM-3 o bien de sus mutantes, se eligió la carga siguiente:
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3 
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El liofilizado del enzima se disolvió, como paso previo a la reacción, en 1 ml de tampón para la reacción y, en primer lugar, se efectuó una incubación durante 30 minutos a 36ºC. La incubación condujo, tal como la adición de un 2% en volumen de acetona, a un aumento de la actividad del 60 o bien del 75%.
Al cabo de una incubación durante 5 minutos, se llevó a cabo la adición de 500 \mul de la solución de NADPH preparada de antemano (12,5 mg/ml). El desarrollo de la reacción se siguió con ayuda de las medidas de la absorción a 340 nm, pudiéndose observar el consumo del NADPH. Para una conversión estequiométrica se requerirían teóricamente 4 ml de solución de NADPH, una concentración demasiado elevada en NADPH en la solución de la reacción conduce, sin embargo, a la inactivación del enzima, por lo tanto se añade el cofactor en etapas de 500 \mul.
Una vez concluida la reacción se acidificó la solución con ácido clorhídrico 5M hasta un valor del pH de 2. En este caso se separan por precipitación los ácidos grasos o bien los ácidos grasos hidroxilados y conducen a una turbidez visible de la solución. A continuación se extrajo dos veces con 10 ml, cada vez, de diclorometano y se secó sobre sulfato de sodio. Tras la filtración sobre un filtro de pliegues se llevó a cabo la separación del diclorometano en el evaporador rotativo o mediante evaporación en nitrógeno. El producto sólido blanco, remanente, se recogió a continuación de nuevo en 2 ml de diclorometano y se empleó para el análisis mediante la GC.
b) Análisis por cromatografía gaseosa
Para el análisis se utilizó un cromatógrafo para gases Fisons (Fisons Instruments Mega Series, Mainz, Alemania) con FID (columna Optima 5, 25 m x 0,25 mm diámetro interno, Macherey & Nagel, Düren, Alemania).
Para el análisis se sometieron los eductos y los productos a una sililación con MSHFBA. En este caso, se transformaron todos los grupos hidroxilo y todos los grupos ácido en los correspondientes trimetilsililéteres o bien en los trimetilsililésteres. En este caso deben tomarse precauciones para que la muestra sea anhidra, puesto que, en otro caso, se producen reacciones secundarias con los agentes de sililación. Se añadieron, por medio de una pipeta, a 10 \mul de la solución de diclorometano, que contiene los ácidos hidroxigrasos, 15 \mul de MSHFBA y se incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Tras la adición de 25 \mul de diclorometano se llevó a cabo el análisis por medio de la GC.
Para ello se inyectó 1 \mul de las muestras sililadas en el cromatógrafo para gases. La temperatura del inyector y del detector era de 350ºC. Se utilizaron los siguientes programas de temperatura:
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100 
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101 
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102 
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Ejemplo 1 Selección de los mutantes iniciales
Se empleó como matriz de partida el mutante individual F87A de la P450 BM-3. Tal como ya se ha indicado, con ayuda de esta mutación se desplaza (13) la posición de la hidroxilación en los ácidos grasos saturados con 12 y con 14 átomos de carbono de \omega-1, \omega-2 y \omega-3 hacia la posición \omega. Para la reacción del 12-pNCA y del 15-pNCA se observó, igualmente, que la \omega-hidroxilación es significativamente más potente (12) en comparación con la del tipo natural. Para la \omega-hidroxilación del 12-pNCA se obtiene una transformación completa, en comparación con una transformación al 33% para el tipo natural. Además de la mayor regioselectividad, se observan, también, mayores actividades para el 12-pNCA y para el 15-pNCA (véase la tabla 2).
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TABLA 2 Actividad específica de mutantes seleccionados de la P450 BM-3 para diversos derivados de pNCA con longitudes variables de la cadena^{1}
4
La mayor regioselectividad del F87A puede entenderse por medio del modelo estructural. La substitución del resto bloqueador F87 por la alanina aumenta la bolsa de fijación para el grupo p-nitrofenoxi, que se forma por el F87, además de por el V78, A82, el T260, el I263 y el A264. Por otra parte, se facilita el acceso del grupo p-nitrofenoxi grande a la bolsa de fijación y se eliminan las interacciones estéricas entre el F87 y los átomos de carbono \omega-2 y \omega-1 de los pNCA. Esto posibilita una orientación ventajosa de la posición \omega frente al átomo de hierro enlazado con la hemoglobina.
Ejemplo 2 Selección de posiciones individuales de la mutación por medio del modelado, de la mutagénesis aleatoria localmente específica de posiciones seleccionadas y cribado 1. Selección de las posiciones de mutación
El modelo del substrato C8-pNCA enlazado muestra, que el carboxilato se encuentra a una distancia de 9 y 11 \ring{A} con respecto a los restos fijadores del carboxilato R47 o bien Y51. Para inducir actividad frente a los substratos C8, es necesario generar un nuevo punto de fijación, que se encuentre a una distancia adecuada con respecto al grupo carboxilato del substrato. Para facilitar la fijación del 8-pNCA deberían colocarse restos adicionales dentro del punto de fijación. Se han seleccionado los restos siguientes: los restos R47 e Y51, que forman los puntos originales de fijación del carboxilato. Para R47 se ha propuesto la formación de un par de iones entre su grupo guanidinio y el resto carboxilato del substrato; Y51 forma un puente de H con el grupo carboxilato del substrato (9). Para el complejo de ácido palmitoleico/P450 BM-3, toma un valor de 12 \ring{A} la distancia entre el átomo de carbono C_{\alpha} de R47 y el átomo de carbono del grupo carboxilato de los ácidos grasos. Se determinaron todos los restos en el hemisferio con un radio de 12 \ring{A} alrededor del grupo carboxilato del modelo 8-pNCA y únicamente se seleccionaron aquellos con cadenas laterales dentro de la bolsa de fijación, que estuviesen dirigidas hacia el grupo carboxilato de los ácidos grasos. De este modo, se seleccionaron el P25, el V26, el S72, el A74, el L188 y el M354, que, probablemente, pueden formar un nuevo punto de fijación del carboxilato para compuestos de pNCA de cadena corta. Estos seis restos seleccionados se encuentran sobre elementos estructurales secundarios con una conformación flexible (11).
2. Mutación y cribado
Se generaron mutantes de cada uno de los ocho restos seleccionados mediante la distribución aleatoria localmente específica del codón de tipo natural sobre las posiciones correspondientes. Con el fin de asegurar que fuese ensayada la mayoría de los 19 posibles tipos de aminoácidos, se aislaron 100 colonias de cada posición, se cultivaron y se ensayaron en cuanto a la actividad. (De este modo la probabilidad de ensayar cada aminoácido es mayor que el 95%, con excepción de una probabilidad del 79% para el triptofano y para la metionina). Se seleccionaron los mutantes con un valor de actividad más elevado para, al menos, un substrato, con una longitud mas corta de la cadena más cortas que la del 15-pNCA para la secuenciación destinada a la determinación de la mutación (mutaciones).
Se observa que la posición 188 es relativamente variable. La mayoría de las 100 colonias mostraron actividad para los pNCA. Entre éstas se seleccionaron 37 colonias de acuerdo con su actividad frente al 8-pNCA. Se detectaron 16 tipos diferentes de aminoácidos, con inclusión del tipo natural. Este resultado demostró, además, que la elección de 100 colonias era suficiente para asegurar que pudiera ser ensayada la mayoría de los 20 posibles aminoácidos. Dentro de las 15 substituciones, las substituciones K, R, W, Q, N, G, A y S, aumentaron significativamente la actividad catalítica para substratos con una longitud mas corte de ja cadena. La substitución de L por aminoácidos, cargados negativamente, condujo a una actividad de tres a siete veces menor frente al 10-pNCA, frente al 12-pNCA y frente al 15-pNCA.
Las otras siete posiciones se distribuyeron de manera aleatoria de manera similar a la de la posición 188. Se seleccionaron entre 7 y 19 colonias de cada posición para la secuenciación del ADN con el fin de demostrar la mutación (mutaciones). La mayoría de estos genes no había sido mutada o el producto génico mostró una actividad menor para los substratos con una longitud más corta de la cadena (el ensayo se llevó a cabo con el enzima puro). Respectivamente, tan solo un mutante de las posiciones 26, 47, 74 y 354, dos mutantes de la posición 72 y ningún mutante de las posiciones P25 e Y51 mostraron una mayor actividad, en comparación con el 15-pNCA, para substratos con una longitud mas corta de la cadena. Los mutantes con la máxima actividad para el 8-pNCA en la posición 188 y en la posición 72 así como todos los mutantes individuales de las posiciones 26, 47, 74 y 354 fueron seleccionados para una combinación. Estas mutaciones, que han sido enumeradas en la tabla 2 anterior, contienen las siguientes substituciones: V26T, R47F, S72G, A74G, L188K y M354T. La actividad específica se aumentó frente al 8-pNCA, en comparación con el F87A, en un factor comprendido entre 0,5 y 33,5. Cada una de estas mutaciones se combinó por etapas con la mutación original F87A.
Ejemplo 3 Mutantes múltiples, preparados mediante la combinación por fases de mutantes y su cribado 1. Mutante L (F87A, L188K)
La elección del primer mutante es crítica, puesto que la combinación de los mutantes individuales no tiene que resultar, necesariamente, en una acumulación de los efectos individuales. Una elección errónea de la primera mutación podría derivarse hacia una vía de evolución, que no condujese a una mutación múltiple, óptima. Por lo tanto, en el caso de un gran conjunto inicial de mutantes individuales es probable una enorme multiplicidad combinatoria y, por consiguiente, es improbable encontrar los mutantes múltiples deseados.
\newpage
Para la elección del mutante L como punto de partida deben tenerse en cuenta dos criterios: su elevada actividad frente al 8-pNCA en comparación con todos los otros mutantes (tabla 2), así como las modificaciones en la interacción enzima-substrato y de las propiedades del punto de fijación. Para verificar estas modificaciones se generaron modelos estructurales de los mutantes seleccionados de tal manera, que se reemplazaron las cadenas laterales de las posiciones de la mutación con ayuda del método SYBYL. El L188 está localizado en el extremo C-terminal de la \alpha-hélice F. Esta hélice y la hélice G contigua sufren el mayor desplazamiento debido a una fijación sobre el substrato (9). El modelo pone de manifiesto, que un intercambio de leucina por lisina conduce a la formación de un nuevo punto putativo de fijación del carboxilato. La distancia entre el grupo amino de K188 y el resto carboxilato del 8-pNCA es de 6 \ring{A} y, por lo tanto, es comparable al valor de la distancia, determinado experimentalmente, entre el grupo carboxilato del ácido palmitoleico y el grupo guanidinio de R47 (el resto de fijación original). La distancia entre el grupo de guanidinio de R47 y el grupo carboxilato del 8-pNCA es de 11,4 \ring{A}. Por lo tanto, puede proponerse que las interacciones del par de iones entre el grupo carboxilato del substrato y del K188 se verifican junto con el átomo C8 hidroxilado a una distancia reactiva con respecto al átomo de hierro enlazado con la hemoglobina.
Los otros cinco mutantes se combinaron por etapas con el mutante L mediante mutagénesis localmente específica (véase la figura 1). Para cada etapa de la mutagénesis se generó un modelo estructural de los mutantes seleccionados. Por medio de este modelo se ensayó el influjo de los mutantes generados sobre la fijación con el substrato y se propuso, a partir de esto, una explicación racional para las propiedades optimizadas de los mutantes y de sus combinacio-
nes.
2. Mutante LA (F87A, L188K, A74G)
La efectividad catalítica frente al 8-pNCA quedó aumentada por medio de la introducción de la mutación A74G en el mutante L. El A74 se encuentra en el extremo N-terminal de la \alpha-hélice B'. Puesto que las cadenas laterales de A74 interaccionan estéricamente con el grupo amino de K188, se elimina esta interacción mediante un intercambio de A74 por glicina, con lo cual se posibilita una orientación más ventajosa de la cadena lateral frente al grupo carboxilato del substrato.
3. Mutante LAR (F87A, L188K, A74G, R47F)
La mejora de la eficacia catalítica para 8-pNCA se consigue mediante la inserción de la mutación adicional R47F. La mutación R47F tiene dos posibles efectos. La fenilalanina impide la fijación original del carboxilato y aumenta el segmento hidrófobo, sometido al disolvente, al inicio del canal de fijación, que está formado por los restos F11, L14, L17, P18, P45 y A191 (véase la figura 2). Este segmento hidrófobo tiene un significado especial para la fijación con el substrato (11).
4. Mutante LARV (F87A, L188K, A74G, R47F, V26T)
Cuando se introduzca la mutación M354T al mutante LAR, se reducirá Kcat para el 8-pNCA. Por lo tanto, no te tomó e consideración el M354T en otros ensayos combinatorios. Sin embargo, si se introduce la mutación V26T al mutante LAR, el mutante resultante LARV mostrará un valor Kcat ligeramente mayor y un valor Km ligeramente menor que el de LAR. Queda aumentada la eficacia catalítica frente al 8-pNCA. Si, en lugar de ello, se lleva a cabo la mutación S72G en el mutante LAR, se reducirá Kcat para el 8-pNCA. Por este motivo se seleccionó el mutante LARV para otras mutaciones.
El V26 está localizado en el extremo N-terminal de la \alpha-hélice A. El modelo indica que T26 podría jugar el papel del resto original Y51 del punto de fijación y que el grupo carboxilato del substrato podría estabilizarse mediante la formación de un puente de H. La distancia entre el grupo hidroxilo de T26 y el grupo amino de K188 es de 6,9 \ring{A}. En comparación con el punto de fijación original, esta distancia es aproximadamente 2 \ring{A} mayor (4,8 \ring{A} entre el grupo hidroxilo de Y51 y el grupo guanidinio de R47). Por lo tanto, existe la posibilidad de que la hélice F, que contiene al K188, sea sometida a otras modificaciones de conformación, debido a que su 8-pNCA está fijado en una posición más profunda en la región de fijación y a que se reduce la distancia comprendida entre T26 y K188.
5. Mutante LARVF (F87V, L188K, A74G, R47F, V26T)
Pudo observarse, que la posición 87 tiene un significado especial para la actividad catalítica y para la especificidad con respecto al substrato del enzima (3, 13). Por lo tanto, el mutante LARV se optimizó en la posición 87 mediante mutagénesis aleatoria, localmente específica. Se obtuvo un mutante, entre 100 colonias, que presentó una eficacia catalítica de 3,5*10^{4} s^{-1} M^{-1} frente al 8-pNCA. Los datos de la secuencia del ADN indicaron que la alanina había sido reemplazada en la posición 87 por la valina.
A partir de la estructura cristalina (11) y de experimentos anteriores (3, 13) se sabe que el R87 es importante para el acceso del substrato al hierro enlazado con la hemoglobina. El grupo bloqueador para-nitrofenilo de este substrato hizo necesario aumentar el tamaño del punto de fijación mediante el intercambio de la fenilalanina por alanina. Mediante el intercambio de A87 por valina se mejora el contacto del C_{\omega} con el átomo de hierro enlazado a la hemoglobina debido a las interacciones estéricas entre el oxígeno del éter y la cadena lateral de V87.
\newpage
Los datos muestran que dos etapas clave, la F87A para dar L y la LARV para dar LARVF, aumentan la eficacia catalítica frente al 8-pNCA. Por lo tanto, se plantea la cuestión si otras mutaciones en el mutante LARVF podrían retrotraerse de nuevo sin que se perdiese la actividad para el 8-pNCA. Por lo tanto, se prepararon mutantes que contenían la mutación F87V, en lugar de la mutación F87A. Estos mutantes portan las siguientes denominaciones:
1.)
L7V con las mutaciones F87V L188K
2.)
AL7V con las mutaciones F87V L188K A74G
3.)
ARL7V con las mutaciones F87V L188K A74G R47F
En los ensayos de actividad se obtuvieron los resultados siguientes:
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TABLA 3 Parámetros cinéticos de los mutantes P450 BM-3 para derivados de los pNCA con diversas longitudes de la cadena, determinados a pH 8,0 y a 25ºC 
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5 
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Los resultados muestran, que los mutantes F87V y L7V no presentan una conversión medible para el substrato 8-pNCA. Los resultados muestran, además, que el mutante cuádruple ARL7V presenta todavía una eficacia catalítica mejor que la del mutante quíntuple ARVLF.
Los mutantes ARL7V y ARVLF muestran, además, elevadas actividades para el ácido cáprico (C10), que es dos átomos de carbono más corto que el substrato natural de los ácidos grasos, de menor longitud, del enzima de tipo natural. Además, se observaron productos \omega-4-monohidroxilados, cuando se utilizó el ácido láurico (C12) como substrato, mientras que, por el contrario, el enzima de tipo natural de la P450 BM-3 es activo únicamente en las posiciones \omega-1, \omega-2 y \omega-3.
Ejemplo 4 Determinación de la posición preferente de la hidroxilación para ácidos carboxílicos con diversas longitudes de la cadena y con diversos mutantes y comparación con el enzima de tipo natural
Las cargas de la reacción se preparan y se analizan según el método 6, precedentemente descrito.
Los resultados han sido reunidos en la tabla 4 siguiente.
TABLA 4
7
En el caso de la hidroxilación del ácido láurico, es llamativo, en primer lugar, un cambio de la regioselectividad cuando se produce la transición desde el tipo natural a la P450 BM-3 F87V, que cataliza, preferentemente, una \omega-3-hidroxilación, igual que la P450 BM-3 L7V. En el caso de la transición para dar mutantes triples se modifica de nuevo la regioselectividad, dirigiendo el P450 BM-3 AL7V, el P450 BM-3 ARL7V y el P450 BM-3 ARVLF la hidroxilación, preferentemente, hacia la posición \omega-2.
Todos los análisis, realizados por medio de la GC, muestran que el ácido cáprico es convertido únicamente por el P450 BM-3 ARVLF y por el P450 BM-3 ARL7V, en el caso de los otros mutantes se observó una conversión por debajo del 1%. Ambos enzimas presentan una regioselectividad casi idéntica, con preferencia en la posición \omega-1.
Para la determinación de los rendimientos de la reacción, se registraron cromatogramas gaseosos de patrones. Como patrón del educto se utilizó una solución de ácido cáprico o bien de ácido láurico con diclorometano a modo de disolvente (concentración 0,5 mg/ml). Las superficies de los picos del educto y de los productos no pueden ser comparadas simplemente entre sí debido a los métodos de detección FID, puesto que las moléculas con una fórmula estructural y con una fórmula en bruto diferentes generan flujos diferentes de iones durante la combustión. Estos flujos de iones no son proporcionales a la relación másica cuantitativa entre el educto y los productos. Como patrón para el producto se utilizó, por lo tanto, el ácido 10-hidroxicáprico o bien el ácido 12-hidroxiláurico, que pueden ser adquiridos en el comercio. Las fórmulas brutas de los patrones y de los productos son iguales y la estructura se diferencia únicamente en la posición del grupo hidroxilo, con lo cual, en el caso de cantidades iguales del producto se supondrán flujos detectables aproximadamente iguales de iones.
En el caso de las hidroxilaciones del ácido cáprico con catálisis mediante el P450 BM-3 ARVLF y el P450 BM-3 ARL7V, los rendimientos acumulados en producto fueron del 57% o bien del 38%. En el caso de las hidroxilaciones del ácido láurico, el rendimiento fue del 51% con catálisis por medio del P450 BM-3 ARVLF, con todos los otros mutantes y con el tipo natural el rendimiento está comprendido entre el 38% y el 40%.
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<210> 1
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<211> 3150
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<212> DNA
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<213> Bacillus megaterium 
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<221> CDS
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<222> (4)..(3150)
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gcaggagacg ggttgnnnac aagctggacg 
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<400> 13
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cgaggcgcct ggtnnngtaa cgcgctactt atc 
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33 
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<210> 14
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<211> 33
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<400> 14
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gataagtagc gcgttacnnn accaggcgcc tcg 
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33 
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cctggtcgtg taacgcgcnn nttatcaagt cagc 
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34 
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<210> 16
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gctgacttga taannngcgc gttacacgac cagg 
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34 
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<400> 17
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gctttgataa aaacttannn caagcgctta aatttgtacg 
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40 
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<211> 40
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cgtacaaatt taagcgcttg nnntaagttt ttatcaaagc 
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<400> 19
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ggcgacgaac tannngttct gattcctcag 
\hfill
30 
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ctgaggaatc agaacnnnta gttcgtcgcc 
\hfill
30

Claims (11)

1. Mono-oxigenasa del citocromo P450, modificada, que presenta un perfil modificado del substrato, mediante mutagénesis localmente específica de su región de fijación con el substrato, en comparación con el tipo natural, en la hidroxilación enzimática terminal y/o subterminal de los ácidos carboxílicos alifáticos; derivada de la mono-oxigenasa BM-3 del citocromo P450 procedente de de Bacillus megaterium, con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2, que contiene, al menos, respectivamente una mutación funcional en las posiciones 87 y 188 de la secuencia de aminoácidos y, en caso dado, al menos una mutación funcional en una de las posiciones de la secuencia de aminoácidos siguientes: 26, 47, 72, 74 y 354; verificándose que
Phe 87
está reemplazado por Val, por Ala o por Leu;
Leu 188
está reemplazado por Asn, por Gln, por Arg, por Lys, por Ala, por Gly, por Ser o por Trp;
Ala 74
está reemplazado por Val o por Gly;
Arg 47
está reemplazado por His, por Tyr o por Phe;
Val 26
está reemplazado por Ser o por Thr,
Ser 72
está reemplazado por Ala, por Val, por Leu, por Ile o por Gly; o
Met 354
está reemplazado por Ser o por Thr.
2. Mono-oxigenasa según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta, al menos, uno de los siguientes cuadros de substitución de los aminoácidos:
b)
F87A L188K;
c)
F87V L188K;
d)
F87A L188K A74G;
e)
F87V L188K A74G;
f)
F87A L188K A74G R47F;
g)
F87VL188K A74G R47F;
h)
F87A L188K A74G R47F V26T; o
i)
F87V L188K A74G R47F V26T.
3. Secuencia de ácidos nucleicos, que codifica una mono-oxigenasa, según una de las reivindicaciones precedentes, y su secuencia complementaria de ácidos nucleicos.
4. Construcción de expresión, que contiene una secuencia codificante bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácidos nucleicos, que abarca una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3.
5. Vector, que abarca al menos una construcción de expresión según la reivindicación 4.
6. Microorganismo recombinante, que contiene, al menos, un vector según la reivindicación 5.
7. Microorganismo según la reivindicación 6, seleccionado entre bacterias del género Escherichia.
8. Procedimiento para la obtención enzimática de ácidos carboxílicos alifáticos hidroxilados en posición terminal o subterminal, caracterizado porque
a1)
se cultiva un microorganismo recombinante, según las reivindicaciones 6 o 7, en presencia de un medio de cultivo, que contenga, al menos, un ácido carboxílico, que pueda ser hidroxilado o, al menos, un derivado del ácido carboxílico, que pueda ser hidroxilado; o
a2)
se incuba un medio de reacción, que contenga, al menos, un ácido carboxílico, que pueda ser hidroxilado o, al menos, un derivado de ácido carboxílico, que pueda ser hidroxilado, con un enzima según una de las reivindicaciones 1 y 2; y
b)
se aísla del medio el producto hidroxilado formado.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque se emplea un ácidos monocarboxílico con 8 hasta 12 átomos de carbono, o un derivado del mismo, como ácido carboxílico, que puede ser hidroxilados,.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en presencia de un donador de electrones o de un equivalente de reducción.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el donador de electrones, o el equivalente de reducción, se elige entre el NADH, el NADPH y el sepulcrato de Zn/Co(III).
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