ES2291295T3 - Construccion con enlace gpib-lipido y su uso. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado que comprende GPIb y un lípido, que están unidos mediante poli(óxido de alquileno) (PAO), en el que la GPIb es (i) una propia GPIb, (ii) una cadena a de GPIb, o (iii) un fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF) de una cadena a de GPIb.
Description
Construcción con enlace
GPIb-lípido y su uso.
La presente invención se refiere a un conjugado
de una GPIb y un lípido unidos mediante un poli(óxido de alquileno)
(también se hará referencia a él en lo sucesivo como un conjugado de
GPIb-lípido), a un complejo de lípido que contiene
el conjugado y a un lípido libre, y al uso de los mismos.
Diversas glicoproteínas (a las que se hace
referencia en lo sucesivo como GP) están presentes en la superficie
de una membrana de plaquetas, y están implicadas en la expresión de
funciones de plaquetas. De tales glicoproteínas de membrana de
plaquetas, son conocidas GPIb, GPIIb, GPIIIa, GPIIIb, GPIV, GPIX y
similares. De éstas, la GPIb funciona como un receptor del Factor
de von Willebrand (al que se hace referencia en adelante como vWF).
La GPIb es un heterodímero que tiene un peso molecular de 160.000,
en el que una cadena \alpha y una cadena \beta están unidas
mediante un enlace disulfuro (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84,
págs 5615-5619, 1987, Hematology & Oncology,
Vol. 31, Nº 1, págs. 5-10, 1995 y similares).
Cuando se causan daños vasculares, las plaquetas
se adhieren rápidamente a la lesión vascular y forman un trombo de
plaquetas por agregación y similares. En la formación del trombo de
plaquetas, el vWF juega un papel importante como proteína adhesiva.
Se considera que la GPIb se une con vWF como su receptor y activa o
promueve la adhesión y agregación de plaquetas mediante vWF en
dicha lesión vascular. Además, la unión de vWF y GPIb funciona
deteniendo la hemorragia en la lesión vascular, pero también forma
un trombo patológico. Así, se espera el uso eficaz de GPIb para el
examen y diagnosis de lesión vascular, detección de trombo
patológico y tratamiento de los mismos.
No obstante, no se ha probado que tenga éxito el
uso de GPIb aislada en la expresión artificial de la actividad
fisiológica como se ha mencionado antes. En otras palabras, se
necesita alguna idea en el aspecto de formulación de preparaciones
farmacéuticas para usar prácticamente GPIb como un agente o reactivo
farmacéutico.
Los presentes inventores encontraron primero más
pronto que podía expresarse la actividad fisiológica de GPIb
preparando un complejo de lípido que contiene un conjugado de GPIb y
un lípido particular, y un lípido general (documentos WO97/29128,
JP-A9-208599,
USP-6177059 y
EP-894807-A).
Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry,
(1997), 111-118, describen liposomas injertados con
PEG con ligandos de oligopéptidos u oligosacáridos.
A la vista de la situación mencionada antes, los
presentes inventores han estudiado adicionalmente, y como
resultado, encontrado que puede prepararse un conjugado de
GPIb-lípido que muestra una propiedad de retención
superior en la sangre introduciendo poli(oxido de alquileno)
(al que se hace referencia en adelante como PAO) entre la GPIb y el
lípido, y han estudiado además intensamente para completar la
presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a
(1) un conjugado que comprende GPIb y un lípido
que están unidos mediante poli(óxido de alquileno) (PAO) (al que se
hace referencia también en adelante como un conjugado de
GPIb-lípido), en el que la GPIb es
- (i)
- una propia GPIb,
- (ii)
- una cadena \alpha de GPIb, o
- (iii)
- un fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF) de una cadena \alpha de GPIb;
(2) el conjugado de (1) anterior, en el que el
fragmento de (iii) es un fragmento de la cadena \alpha de GPIb
que carece de un lugar transmembrana;
(3) el conjugado de (1) anterior, en el que el
lípido tiene un grupo funcional que es un grupo amino, un grupo
carboxilo, un grupo tiol o un grupo aldehído;
(4) el conjugado de (3) anterior, en el que el
lípido que tiene un grupo funcional es un fosfolípido, un
glicolípido, un ácido graso, un glicérido, un colesterol o un
líquido anfipático;
(5) el conjugado de (1) anterior, en el que el
PAO es polietilenglicol, polipropilenglicol o un glicol obtenido
copolimerizando óxido de etileno y óxido de propileno;
(6) el conjugado de (1) anterior, en el que el
PAO tiene un peso molecular medio numérico de
100-100000;
(7) el conjugado de (3) anterior, en el que la
GPIb y el PAO, y el PAO y el lípido que tiene un grupo funcional,
están unidos respectivamente químicamente por un agente de
reticulación;
(8) el conjugado de (3) anterior, en el que la
relación molar de GPIb:PAO es 1:1-1:20 y la relación
molar del PAO:lípido que tiene un grupo funcional es 1:1;
(9) un complejo que comprende el conjugado de
(1) y un lípido libre (al que se hace también referencia en
adelante como un complejo de GPIb lípido);
(10) el complejo de (9) anterior, que está en
forma de un liposoma;
(11) el complejo de (9) anterior, en el que el
lípido libre es un fosfolípido, un glicolípido, un colesterol, un
ácido graso o un derivado de ellos;
(12) el complejo de (9) anterior, en el que la
relación molar de GPIb:lípido libre es
1:10-1:1000;
(13) el complejo de (9) anterior, en el que el
complejo es agregable en presencia de ristocetina;
(14) el complejo de (9) anterior, en el que se
prepara el conjugado que comprende GPIb y el lípido unido mediante
PAO y se prepara después el complejo de dicho conjugado y un lípido
libre;
(15) una composición farmacéutica que contiene
el complejo de (9) anterior;
(16) la composición farmacéutica de (15)
anterior, que es un sustituto de plaquetas;
(17) la composición farmacéutica de (16)
anterior, que es un agente para la profilaxis o tratamiento de un
trastorno vascular, un daño vascular o trombosis;
(18) un agente farmacéutico para examen o
diagnosis que comprende, como ingrediente activo, una sustancia de
marcado y el complejo de (9) anterior;
(19) el agente farmacéutico de (18) anterior, en
el que la sustancia de marcado es un radioisótopo, un metal
paramagnético para MRI, un compuesto yoduro para formación de imagen
de rayos X, una sustancia fluorescente o un pigmento;
(20) una composición que contiene fármaco que
comprende un fármaco y el complejo de (9) anterior como ingredientes
activos, en la que el fármaco es un agente hemostático, un
vasoconstrictor, un agente antiinflamatorio, un agente
trombolítico, un anti-coagulador de la sangre o un
agente anti-plaquetas;
La presente invención se describe con detalle en
lo que sigue.
El conjugado de GPIb-lípido de
la presente invención es un conjugado en el que (A) GPIb y (B) un
lípido están unidos mediante (C) PAO.
La GPIb a usar en la presente invención puede
ser cualquiera en tanto en cuanto tenga capacidad de unión con vWF,
e incluye la propia GPIb natural, una cadena \alpha de GPIb o un
fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF)
de una cadena \alpha de GPIb.
Los ejemplos específicos incluyen fragmentos de
GPIb tales como cadena \alpha
[His(1)-Leu(610)] de GPIb, un
fragmento de una región de unión a vWF de la cadena \alpha (a lo
que se hace también referencia en adelante como un fragmento de
cadena \alpha de GPIb) y similares, fragmentos de GPIb en los que
se ha suprimido el lugar transmembrana y similares. En la presente
invención, se usan más preferiblemente fragmentos de GPIb sin el
lugar transmembrana.
Los fragmentos de cadena \alpha de GPIb más
específicos incluyen His(1)-Cys(485),
His(1)-Pro(340),
His(1)-Thr(304),
His(1)-Ala(302),
His(1)-Arg(293) [documentos
JP-A-1-221394,
EP-317278-A],
Ala(165)-Leu(184),
Gln(180)-Phe(199),
His(195)-Leu(214),
Asn(210)-Val(229),
Glu(225)-Ala(244) y
Thr(240)-Tyr(259) [documento
JP-A-1-100196],
Asn(61)-Thr(75),
Gln(71)-Ser(85),
Thr(81)-Leu(95),
Gln(97)-Arg(111),
Leu(136)-Leu(150),
Asn(210)-Ala(224),
Gln(221)-Asp(235) y
Ser(241)-Asp(255) [Solicitud de
Patente Japonesa bajo PCT abierta a inspección por el público bajo
kohyo Nº 5-503708, documento WO91/09614] y
similares. Los ejemplos del sustituto incluyen un fragmento de
cadena \alpha de GPIb consistente en
His(1)-Ala(302), en el que
Gly(223) o Met(239) está sustituido con Val, y
similares [documento WO93/16712]. Estos fragmentos de cadena
\alpha de GPIb carecen todos de lugar transmembrana. El lugar
transmembrana en la cadena \alpha de GPIb es
Leu(486)-Gly(514) (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 84, págs. 5615-5619, 1987).
La GPIb puede prepararse por cualquier método, y
se ponen como ejemplos un método que comprende extracción y
aislamiento de membrana de plaquetas, un método que usa cultivo de
células y un método de producción que usa ingeniería genética.
El lípido que está unido a GPIb mediante PAO
tiene un grupo funcional unible directa o indirectamente a PAO. Son
ejemplos de tal grupo funcional un grupo amino (NH_{2}), un grupo
carboxilo (COOH), un grupo tiol (SH), un grupo aldehído (CHO) y
similares. En tanto en cuanto el grupo funcional pueda formar un
enlace directo o indirecto con PAO, no está limitado a los puestos
como ejemplo.
Son ejemplos de la clase del lípido fosfolípido,
glicolípido, ácido graso, glicérido, colesteroles y similares,
dándose preferencia los anfipáticos.
Son ejemplos del lípido fosfatidiletanolamina (a
la que se hace referencia en adelante como PE) y fosfatidiltioetanol
(por ejemplo,
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiltioetanol)
para fosfolípido. Como glicolípido, por ejemplo, se mencionan
ceramida, cerebrosida, esfingosina, sulfatida, gangliósidos y
gliceroglicolípidos (por ejemplo, galactosildiacilglicerol) y
similares. Es ejemplo de ácido graso un ácido graso saturado o
insaturado que tenga de 12 a 18 átomos de carbono, que puede ser,
por ejemplo, ácido palmítico, ácido oleico o ácido láurico. Como
glicérido, se mencionan, por ejemplo, monoglicérido, diglicérido,
triglicérido y similares. Los colesteroles incluyen colesterol,
éster de colesterol y alocolesterol. El grupo funcional en estos
lípidos puede estar en forma de un haluro de ácido, un anhídrido de
ácido o un éster activo, para aumentar la reactividad con PAO y los
agentes de reticulación a mencionar más tarde.
Para una unión indirecta de un lípido y PAO,
puede usarse también uno obtenido haciendo reaccionar un agente de
reticulación (es decir, espaciador o enlazador) con el grupo
funcional de un lípido de antemano. Los ejemplos de tal agente de
reticulación incluyen un ácido dicarboxílico, un ácido
aminocarboxílico, un compuesto de bismaleimida, un compuesto de
bishalocarbonilo, un compuesto de halocarbonilmaleimida,
ditiomaleimida, un ácido ditiocarboxílico, un ácido
maleimidocarboxílico y similares. Estos agentes de reticulación
tienen preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono. Estos agentes
de reticulación y el grupo funcional de un lípido se hacen
reaccionar según un método convencional.
Son ejemplos del fosfolípido formado haciendo
reaccionar dicho agente de reticulación con el grupo funcional
PE-N-carbonilamina (por ejemplo,
PE-N-caproilamina,
PE-N-dodecanilamina,
PE-N-glutarilamina y similares),
PE-N-carbonilo (por ejemplo,
PE-N-succinilo,
PE-N-glutarilo (NGPE),
PE-N-dodecanilo (NDPE) y similares),
PE-N-ditioacilato (por ejemplo,
PE-N-3-(2-piridilditio)propionato),
PE-N-maleimidoacilato (por ejemplo,
PE-N-4-(p-maleimidofenil)butirato
y similares), PE-biotinilo y similares.
PAO está presente entre (A) GPIb y (B) un
lípido, y une a los dos. El PAO es igual que polialquilenglicol y
tiene como ejemplos polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, un
glicol obtenido por copolimerización de óxido de etileno y óxido de
propileno, y similares. PAO tiene un peso molecular medio numérico
alto de aproximadamente 100-100.000,
preferiblemente alrededor de 1.000-10.000.
Como PAO, además, puede usarse también uno
obtenido haciendo reaccionar uno o ambos de los términos de PAO con
un agente de reticulación (es decir, espaciador, enlazador) de
antemano. Los ejemplos del agente de reticulación incluyen un ácido
dicarboxílico, un ácido aminocarboxílico, un compuesto de
bismaleimida, un compuesto de bishalocarbonilo, un compuesto de
halocarbonilmaleimida, ditiomaleimida, un ácido ditiocarboxílico, un
ácido maleimidocarboxílico y similares. Estos agentes de
reticulación y PAO se hacen reaccionar según un método
convencional.
La unión entre GPIb y PAO, y la unión entre PAO
y un lípido que tiene un grupo funcional, se forman químicamente
directa o indirectamente, es decir, mediante o no mediante un grupo
derivado de un agente de reticulación. En la presente invención, se
prefiere una unión indirecta. La relación molar de mezclado de
GPIb:PAO o un lípido que tiene un grupo funcional es
aproximadamente 1:1-1:20, preferiblemente alrededor
de 1:1-1:10.
Cuando el enlace químico entre GPIb o un lípido
que tiene un grupo funcional y PAO no puede formarse directamente,
puede emplearse un método que comprende hacer reaccionar el grupo
funcional de un lípido o PAO con el agente de reticulación
mencionado antes, o pueden usarse un agente de condensación
conocido, un agente de activación que activa el grupo funcional en
el lípido, un agente de reticulación divalente y similares. Los
ejemplos del agente de condensación y el agente de activación
incluyen carbodiimidas (por ejemplo,
N,N'-diciclohexilcarbodiimida,
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC) y similares), succinimidas (por ejemplo,
N-hidroxisuccinimida,
N-hidroxisulfosuccinimida (NHSS) y similares), un
compuesto usado para reacción de intercambio de grupo tiol (por
ejemplo, ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico),
2,2'-ditiobispiridina y similares), y similares.
El agente de reticulación divalente puede ser un
agente de reticulación que tenga la misma o diferente reactividad.
Los ejemplos del agente de reticulación que tiene la misma
reactividad incluyen adipimidato de dimetilo, suberato de
disuccinimidilo y similares, y los ejemplos del agente de
reticulación que tiene diferente reactividad incluyen
3-(2-piridilditio)propionato de
succinimidilo,
N-(6-maleimidocaproiloxi)succinimida,
6-maleimidohexanoato de
N-succinimidilo y similares.
N-succinimidilo y similares.
Como unión directa de GPIb o lípido y PAO, se
mencionan -COO- [por ejemplo, obtenido por enlace éster del grupo
carboxilo de GPIb o lípido (por ejemplo, ácido graso) y el grupo
hidroxilo de PAO], -O- (por ejemplo, obtenido por enlace éter del
grupo hidroxilo de GPIb o lípido y el grupo hidroxilo de PAO],
-CONH- (por ejemplo, obtenido por enlace amida del grupo carboxilo
de GPIb o lípido y el grupo amino introducido en PAO), -CH=N- (por
ejemplo, obtenido por enlace de Schiff del grupo aldehído en la
cadena de azúcar de GPIb o el grupo aldehído introducido en el
lípido y el grupo amino introducido en PAO), -CH_{2}NH- (obtenido
por reducción adicional de enlace de Schiff), -NH- y similares.
De los métodos específicos para unir
indirectamente GPIb o lípido y PAO, son ejemplos del modo de unión
del agente de reticulación (incluyendo el agente de reticulación
divalente, en adelante el mismo) y PAO -COO-, -O-,
-CONH-, -CH=N-, -CH_{2}NH-, -NH- y similares, como los mencionados antes. Como modo de unión de GPIb o lípido y el agente de reticulación, se mencionan, además de los similares a los mencionados antes, -S-S- [obtenido por enlace disulfuro del grupo tiol de GPIb o lípido (por ejemplo, fosfatidiltioetanol) y el resto ditio del agente de reticulación tal como ditiomaleimida, compuesto de ditiocarbonilo y similares], -S- (obtenido por unión del grupo tiol de GPIb o lípido y el agente de reticulación tal como compuesto de maleimida, compuesto de halocarbonilo y similares, por alquilación reductora), -NH- (por ejemplo, obtenido haciendo reaccionar el grupo amino de GPIb o lípido (por ejemplo, PE) y el resto maleimida del agente de reticulación, tal como ácido maleimidocarboxílico y similares), -CO- y similares.
-CONH-, -CH=N-, -CH_{2}NH-, -NH- y similares, como los mencionados antes. Como modo de unión de GPIb o lípido y el agente de reticulación, se mencionan, además de los similares a los mencionados antes, -S-S- [obtenido por enlace disulfuro del grupo tiol de GPIb o lípido (por ejemplo, fosfatidiltioetanol) y el resto ditio del agente de reticulación tal como ditiomaleimida, compuesto de ditiocarbonilo y similares], -S- (obtenido por unión del grupo tiol de GPIb o lípido y el agente de reticulación tal como compuesto de maleimida, compuesto de halocarbonilo y similares, por alquilación reductora), -NH- (por ejemplo, obtenido haciendo reaccionar el grupo amino de GPIb o lípido (por ejemplo, PE) y el resto maleimida del agente de reticulación, tal como ácido maleimidocarboxílico y similares), -CO- y similares.
El conjugado de GPIb-lípido
puede prepararse en presencia de un tensioactivo. El tensioactivo no
está limitado particularmente siempre que solubilice el lípido. Es
preferible el uso de un tensioactivo no iónico, de manera que no se
influya en la estructura de la GPIb. En particular, es preferible un
tensioactivo no iónico que tenga una alta concentración de micelas
crítica (CMC), tal como una CMC de no menos de 1 mM. Los ejemplos
de ellos incluyen octil glucósido (por ejemplo,
n-octil-\beta-D-glucósido,
octil tioglucósido (por ejemplo,
n-octil-\beta-D-tioglucósido),
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]propanosulfato
(CHAPS) y
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)desoxicolamida
(desoxi-BIGCHAP). La relación de mezclado de
lípido:tensioactivo es preferiblemente de alrededor de
0,01:1-0,1:1 por mol.
Como un compuesto intermedio para sintetizar un
conjugado (conjugado de GPIb-lípido) consistente en
GPIb-PAO-lípido, puede usarse un
lípido activado consistente en sustituyente
reactivo-PAO-lípido. Según se usa
aquí, por el "lípido activado" se entiende un producto unido
de PAO y lípido que tiene un sustituyente reactivo en el terminal
de PAO. El PAO y el lípido están unidos químicamente directa o
indirectamente mediante o no mediante un grupo derivado de un
agente de reticulación. El sustituyente reactivo no está sujeto a
limitación particular en tanto en cuanto tenga la acción de activar
un enlace con una proteína. Por ejemplo, puede obtenerse haciendo
reaccionar succinimida, maleimida y similares con el terminal de
PAO. El modo del enlace entre el sustituyente reactivo y PAO, y el
PAO y un lípido
en el lípido acivado es como se ha mostrado en la (D) Preparación de conjugado de GPIb-lípido mencionada antes.
en el lípido acivado es como se ha mostrado en la (D) Preparación de conjugado de GPIb-lípido mencionada antes.
Uniendo directa o indirectamente lípido activado
y GPIb químicamente, es decir, mediante o no mediante un agente de
reticulación, puede obtenerse un conjugado de
GPIb-lípido.
Como lípido activado, se ponen como ejemplo
específicamente los siguientes compuestos. Estos lípidos activados
son conocidos y pueden producirse según un método conocido.
Alternativamente, pueden usarse productos disponibles
comercialmente.
- DSPE-34HCSI:
- diestearoilfosfatidil-N-(succinimidilsuccinil-polioxietilen-succinil)etanolamina. El peso molecular medio numérico de PEG es 3400.
- DSPE-20HMAL:
- diestearoilfosfatidil-N-(maleimidopropionilamino-polioxietilen-oxicarbonil)etanolamina. El peso molecular medio numérico de PEG es 2000.
El conjugado de GPIb-lípido de
la presente invención comprende GPIb y PAO o lípido en una relación
molar constituyente de aproximadamente 1:1-1:20. La
relación molar constituyente de PAO y lípido es 1:1.
El complejo de la presente invención que
contiene el conjugado de GPIb-lípido mencionado
antes y lípido libre puede tomar la forma de un liposoma, micela o
emulsión de lípido, prefiriéndose un liposoma. Como ejemplo del
complejo de la presente invención, se explica un complejo de GPIb
lípido en forma de un liposoma. La explicación del siguiente
complejo de GPIb lípido es de aplicación a otras formas además de
liposoma.
El lípido a usar aquí está exento de limitación
en tanto en cuanto pueda tomar la forma de un complejo de lípido,
tal como un liposoma, y puede usarse solo o en combinación con otro
lípido. Los ejemplos de tal lípido incluyen fosfolípido,
glicolípido, colesterol, ácido graso y derivados de ellos. El lípido
libre a usar en la presente invención para formar el complejo puede
ser cualquier lípido no tóxico siempre que sea aceptable
fisiológicamente y metabolizable. Nótese que un lípido libre
significa un lípido distinto de un lípido que constituye el
conjugado de GPIb-lípido, y puede ser homólogo o
heterólogo con el lípido que constituye el conjugado de
GPIb-lípido.
Los ejemplos del fosfolípido incluyen
fosfatidilcolina (a la que se hace referencia en adelante como PC),
fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol,
fosfatidilinositol, esfingomielina, fosfato de dicetilo,
cardiolipina, lisofosfatidilcolina y similares. Estos lípidos pueden
extraerse y purificarse de un material natural tal como aceite de
soja o yema de huevo, o prepararse por hidrogenación de ellos para
saturar el ácido graso constituyente (fosfolípido hidrogenado), u
obtenerse sustituyendo el ácido graso constituyente con un ácido
graso específico, tal como ácido palmítico y ácido mirístico (por
ejemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidilglicerol y
similares). Sus ejemplos específicos incluyen lecitina de yema de
huevo purificada, lecitina de soja purificada hidrogenada,
fosfatidilcolina originada de yema de huevo,
dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol,
diestearilfosfatidilcolina, dimiristilfosfatidilcolina y
similares.
El glicolípido puede ser, por ejemplo, ceramida,
cerebrosida, esfingosina, sulfatida, gangliósidos o
gliceroglicolípidos.
Los colesteroles incluyen colesterol, éster de
colesterol y alocosterol.
Son ejemplos del ácido graso ácido oleico, ácido
láurico, ácido mirístico, ácido palmítico y ácido esteárico. Los
ejemplos del derivado de lípido incluyen derivado de polioxietileno
que tiene fosfatidiletanolamina y ácido graso, y derivado de
polisacárido que tiene ácido graso y colesterol. Específicamente,
puede ser
diestearil-N-(monometoxipolieti-
lenglicolsuccinil)-fosfatidiletanolamina, poli(palmitato de oxietileno), N-[2-(estearoilcarboxiamino)etil]carbamoilmetilmanan o N-[2-(colesterilcarboxiamino)etil]carbamoilmetilpluran.
lenglicolsuccinil)-fosfatidiletanolamina, poli(palmitato de oxietileno), N-[2-(estearoilcarboxiamino)etil]carbamoilmetilmanan o N-[2-(colesterilcarboxiamino)etil]carbamoilmetilpluran.
Como relación de mezclado de conjugado de
GPIb-lípido:lípido libre, la relación molar de
mezclado de GPIb:lípido libre es aproximadamente
1:10-1:1000, preferiblemente alrededor de
1:50-1:200.
Puede prepararse un complejo de GPIb lípido (por
ejemplo, liposoma) mediante, por ejemplo, método de separación de
tensioactivo, método de hidrato, ultrasonicación, método de
evaporación en fase inversa, método de
congelación-descongelación, método de inyección de
etanol, método de extrusión o emulsionamiento a alta presión. El
método de separación de tensioactivo es generalmente filtración en
gel, diálisis o ultrafiltración. En la presente invención, es más
preferible un método que comprende formar un complejo después de
unir GPIb y un lípido mediante PAO, o formar un complejo de lípido
después de preparar un conjugado de GPIb-lípido.
También es posible preparar un complejo de GPIb lípido añadiendo
GPIb después de preparar un complejo de lípido (por ejemplo,
liposoma) consistente en el lípido de (I)(B) y el lípido libre de
(II)(A), para unir por ello el lípido de (I)(B) y GPIb mediante
PAO. El complejo de GPIb lípido puede aislarse y purificarse por un
método conocido per se, tal como centrifugación y filtración
en gel.
Se pone como ejemplo en lo que sigue el método
de producción del complejo de GPIb lípido.
Un lípido [(I)(B)] se solubiliza con un
tensioactivo y se une con PAO para dar un producto unido. Este
producto unido, GPIb y un lípido libre [(II)(A)] se mezclan en un
disolvente acuoso adecuado para permitir la unión de GPIb y el
líquido [(I)(B)] mediante PAO, y se separa después el tensioactivo
para formar un complejo de GPIb lípido. Alternativamente, un
producto unido del lípido [(I)(B)] y PAO y GPIb se mezclan en
presencia de un tensioactivo para preparar un conjugado de
GPIb-lípido, se mezcla un lípido libre [(II)(A)] y
se separa el tensioactivo, para dar por ello un complejo de GPIb
lípido. La GPIb no reaccionada, el lípido [(I)(B)], el lípido libre
[(II)(A)] y similares pueden separarse y retirarse para dar un
producto purificado. El tensioactivo es el mismo que los
mencionados antes. La relación de mezclado (lípido libre
[(II)(A)]:tensioactivo) es aproximadamente
0,001:1-0,1:1 (relación molar).
El producto unido de lípido [(I)(B)] y PAO, y
lípido libre [(II)(A)], se disuelven y mezclan en un disolvente
orgánico tal como cloroformo y etanol, y el disolvente orgánico se
separa para dar una membrana de lípido delgada. Se añade un
disolvente acuoso adecuado y se trata la mezcla por un método
conocido, tal como sacudidas y agitación, para dar un complejo de
lípido. Se añade GPIb para formar un enlace de GPIb y el lípido
mediante PAO, por lo que se forma un complejo de GPIb lípido.La
GPIb no reaccionada, el lípido y similares pueden separarse y
retirarse para dar un producto purificado.
Para este método, se usa un lípido libre
[(II)(A)] que no reacciona/se une con GPIb. Especialmente, se usan
fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina y similares.
La proporción de GPIb a lípido libre [(II)(A)]
en el complejo de GPIb lípido obtenido es 0,01-10
partes en peso, preferiblemente 0,1-5 partes en
peso, por parte en peso del lípido libre [(II)(A)].
El complejo de GPIb lípido obtenido tiene un
tamaño de partículas de aproximadamente 50-500 nm,
preferiblemente alrededor de 100-400 nm. El número
de moléculas de GPIb por partícula es 100-10000,
preferiblemente 250-3000, y la densidad superficial
de GPIb es 10^{10}-10^{13}, preferiblemente
10^{11}-10^{12}.
El complejo de GPIb lípido (por ejemplo,
liposoma) tiene una estructura de vesícula multilaminar (MLV),
pequeña vesícula unilaminar, gran vesícula unilaminar y similares.
Puede estar revestido con un polímero hidrófilo tal como
polietilenglicol (PEG), pluronic (marca comercial registrada)
(copolímero de bloques de polioxietileno polioxipropileno) y
similares.
Cuando sea necesario, el complejo de GPIb lípido
obtenido se lava con una solución acuosa aceptable fisiológicamente,
se esteriliza por filtración, se dispensa y formula en una
preparación líquida, de glóbulos o en suspensión.
El complejo puede elaborarse por un método
conocido para ser utilizable para la preparación de productos
farmacéuticos. Las preparaciones mencionadas antes pueden
proporcionarse como preparaciones liofilizadas congelando una
preparación líquida y secándola bajo presión reducida. Para
liofilización, pueden añadirse monosacáridos (por ejemplo,
glucosa), disacáridos (por ejemplo, sacarosa) y similares.
Las preparaciones de complejo de GPIb lípido
pueden contener, como estabilizante, un polímero seleccionado entre
albúmina, dextrano, polímero vinílico, gelatina e hidroxiletil
almidón.
El polímero puede incorporarse a los huecos
presentes en dicho complejo de lípido junto con un fármaco.
Alternativamente, el polímero puede añadirse o contenerse en dicha
preparación de complejo de lípido que contiene un fármaco. Esto
significa que el polímero puede añadirse o incorporarse fuera del
liposoma. Es innecesario decir que puede incorporarse dentro y
fuera del complejo de lípido.
El estabilizante se añade en una cantidad de
0,5-10 partes en peso, preferiblemente
1-5 partes en peso, por parte en peso del lípido
libre [(II)(A)].
El complejo de GPIb lípido de la presente
invención puede realizarse como diagnóstico de la localización de
lesión vascular o formación de trombo, deficiencia de Factor de von
Willebrand y similares añadiendo una sustancia de marcado
(denominada un marcador). Los ejemplos de tal sustancia de marcado
incluyen RI (radioisótopo), metal paramagnético para MRI, compuesto
yoduro para formación de imagen de rayos X, sustancia fluorescente y
pigmento.
Son ejemplos de RI ^{3}H, ^{14}C,
^{99m}Tc, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{87m}Sr,
^{113m}In, ^{197}Hg y similares. Los ejemplos de metal
paramagnético para MRI son ion divalente e ion trivalente de un
metal paramagnético de cromo (Cr), gadolinio (Gd), manganeso (Mn),
hierro (Fe), cobalto (Co), niquel (Ni), praseodimio (Pr), neodimio
(Nd), samario (Sm), iterbio (Yb), terbio (Tb), disprosio (Dy),
holmio (Ho), erbio (Er), cobre (Cu) y similares, prefiriéndose un
ion divalente y un ion trivalente de gadolinio, terbio, disprosio,
holmio, erbio e hierro.
El compuesto yoduro para formación de imagen de
rayos X puede ser un compuesto conocido para formación de imagen de
rayos X. Los ejemplos de él incluyen adipiodona, ácido
amidotrizoico, ácido iotalámico, ácido iopanoico, ácido
iobenzámico, iopodato, ácido tiropanoico, iopidol, iopidona,
propiliodona, iodamida y sales de ellos (por ejemplo, sal sódica y
sal de meglumina). La sustancia fluorescente puede ser, por ejemplo,
isotiocianato de fluoresceína (FITC), carboxifluoresceína (CF) y
similares.
Estas sustancias de marcado pueden encapsularse
en un complejo de lípido (por ejemplo, liposoma) por un método
conocido. Por ejemplo, pueden encerrarse en un complejo de lípido en
forma de una sal o después de quelación con un agente de quelación
tal como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) y ácido
dietilentriaminapentaacético (DTFA). En el caso de ^{99m}Tc, por
ejemplo, pueden usarse pertecnato sódico, polifosfato de tecnecio o
^{99m}Tc DTPA.
El agente farmacéutico para examen o diagnosis,
que contiene una sustancia de marcado y el complejo de GPIb lípido
de la presente invención, puede ser un complejo de GPIb lípido de la
presente invención, que se prepara según un método mencionado antes
y usando GPIb marcada con una sustancia de marcado (por ejemplo,
RI).
El complejo de GPIb lípido de la presente
invención es acumulativo en la lesión vascular, y así, puede
formarse en una composición que contenga un fármaco (vehículo de
fármaco). El fármaco a contener está exento de cualquier limitación
particular siempre que se pruebe eficaz fisiológica y
farmacológicamente por acumulación del mismo en la lesión vascular,
y puede ser, por ejemplo, un agente hemostático, un vasoconstrictor,
un agente antiinflamatorio, un agente trombolítico, un
anti-coagulador de la sangre, un agente
anti-plaquetas y similares.
Son ejemplos del agente hemostático
carbazocromo, factor de coagulación de sangre (FVIII, FIX),
trombina, agente antiplasmina (por ejemplo, ácido
\varepsilon-aminocaproico y ácido tranexámico),
sulfato de protamina, etamsilato, fitonadiona y estrógeno conjugado
(por ejemplo, sulfato de sodio y estrona y sulfato de sodio y
equilina) y similares.
Son ejemplos del vasoconstrictor noradrenalina,
norfenefrina, fenilefrina, metaraminol, metoxamina, prostaglandina
F_{1} \alpha, prostaglandina F_{2} \alpha, tromboxano
A_{2} y similares. Son ejemplos del agente antiinflamatorio un
agente antiinflamatorio esteroidal (por ejemplo, dexametasona,
hidrocortisona, prednisolona, betametasona, triamcinolona,
metilprednisolona y similares), un agente antiinflamatorio no
esteroidal (por ejemplo, indometacina, acemetacina, flurbiprofeno,
aspirina, ibuprofeno, ácido flufenámico, cetoprofeno y similares) y
similares.
Son ejemplos del agente trombolítico plasmina,
activador de plasminógeno de tejidos, uroquinasa, precursores de
ellos y derivados de ellos. Son ejemplos del
anti-coagulador de la sangre monopolisacárido ácido
(por ejemplo, heparina), anti-coagulador de la
sangre de cumarina, extracto natural (por ejemplo, hirudina) y
derivados de ellos, sustancias activas fisiológicamente (por
ejemplo, trombomodulina, proteína activa C y similares) y
similares. Son ejemplos del agente anti-plaquetas
aspirina, ticlopidina, cilostazol, prostaciclina y similares. Estos
fármacos pueden encapsularse en un complejo de lípido por un método
conocido.
El complejo de GPIb lípido de la invención se
administra en una cantidad de aproximadamente
0,001-1000 mg como GPIb por día. La dosis puede
cambiarse apropiadamente dependiendo del sexo, la edad y los
síntomas de los pacientes.
El complejo de GPIb lípido se administra más
preferiblemente parenteralmente. Para ser específico, se administra
por inyección intravascular (intraarterial o intravenosa), goteo
intravenoso, administración subcutánea, administración local,
administración intramuscular y similares.
La composición farmacéutica que contiene el
complejo de GPIb lípido de la invención es útil como sustituto de
plaquetas, un producto farmacéutico para la profilaxis o tratamiento
de angiopatía, daños vasculares y trombosis, un diagnóstico para
deficiencia de vWF y similares, un reactivo biológico o médico, un
reactivo para examinar supresor de la agregación de plaquetas o
antitrombosis, y similares. También es útil para un diagnóstico
para encontrar la localización de lesión vascular o formación de
trombo, o un agente terapéutico de ellos.
La presente invención se explica con más detalle
en lo que sigue mediante Ejemplos y Ejemplos experimentales, que no
han de considerarse como limitativos. La GPIb sometida a los
Ejemplos y Ejemplos experimentales de la presente invención era un
fragmento de cadena \alpha de GPIb
[His(1)-Arg(293), peso molecular
45000, documento
JP-A-9-208559]
producida por ingeniería genética usando una célula CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió a solución salina fisiológica (100
\mul) que contenía GPIb (100 mg/ml) fosfatidilcolina de yema de
huevo (EPC) (221 mg), colesterol (45,4 mg) y octil glucósido (OG)
(2,33 g), disueltos en agua para inyección (1,5 ml). La cantidad de
EPC correspondía a una relación molar de 100 veces de GPIb. Se
añadió después DSPE-34HCSI (comprado de NOF
Corporation) disuelto en tampón HEPES (pH 8,0) que contenía 0,1% de
OG. La cantidad de DSPE-34HCSI añadida era una
cantidad molar de 10 veces de GPIb. Después de reaccionar a 4ºC
durante 16 h, se separó OG por filtración en gel (el vehículo fue
Sephadex G-75, Pharmacia Biotech) para dar un
liposoma. El liposoma de GPIb se recuperó por separación centrífuga
por el método de gradiente de densidad de CsCl. Las condiciones
para ello fueron como sigue. Se disolvió CsCl en una muestra
(1-1,5 ml) hasta una concentración del 35%, y se
estratificaron sobre ella 0,5 ml de CsCl del 25% y 0,1 ml de
solución salina fisiológica, y se trataron a 214000 x g durante 10
min. La fracción que contenía liposoma se recuperó y dializó durante
la noche frente a una membrana de diálisis (peso molecular de la
fracción 10.000 daltons,
Slide-A-Lyzer 10K, Pierce
Biotechnology, Inc.) usando solución salina fisiológica. El liposoma
de GPIb preparado tenía una concentración de PC de 0,61 mg/ml, una
concentración de GPIb de 0,24 mg/ml y un tamaño medio de partículas
de 0,25 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió a
1,3,4,6-tetracloro-3\alpha,6\alpha-difenilglicourilo
(200 \mug) solución de Na^{125}I (448 MBq/ml, 30 \mul) y
después solución salina fisiológica (100 \mul) que contenía GPIb
(100 mg/ml), y la mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente
durante 10 min. Se añadió NaI 25 mM (100 \mul) y la mezcla se
sometió a filtración en gel (MicroSpin
G-25, Pharmacia Biotech) y ultrafiltración (Ultrafree-MC10K, Millipore Corporation) para dar GPIb marcada con yodo (^{125}I-GPIb).
G-25, Pharmacia Biotech) y ultrafiltración (Ultrafree-MC10K, Millipore Corporation) para dar GPIb marcada con yodo (^{125}I-GPIb).
La operación siguió la del Ejemplo 1 excepto que
se usó la ^{125}I-GPIb mencionada antes en lugar
de GPIb. El liposoma de GPIb preparado tenía una concentración de PC
de 3,54 mg/ml, una concentración de GPIb de 1,00 mg/ml,
un tamaño medio de partículas de 0,33 \mum y una radioactividad de 9,3 x 10^{7} cpm/ml.
un tamaño medio de partículas de 0,33 \mum y una radioactividad de 9,3 x 10^{7} cpm/ml.
\newpage
Ejemplo experimental
1
Se confirmó la capacidad de agregación del
liposoma de GPIb. El liposoma de GPIb preparado en el Ejemplo 1 se
ajustó a una concentración de PC de 0,2 mg/ml. Se añadieron a la
solución (200 \mul) 2 mg/ml de una solución de vWF (25 \mul) y
la mezcla se incubó y agitó a 37ºC. Después de 2 min, se mezclaron
15 mg/ml de una solución de ristocetina (25 \mul). El agregado se
midió durante el total de 15 min desde inmediatamente antes de la
incubación usando un agregómetro (AG-10, Kowa
Company, Ltd.). Se calculó el total de los valores de número de
agregados multiplicado por la intensidad de dispersión y se usó como
índice del grado de formación de agregados. Los resultados se
muestran en la Tabla 1.
Se realizó un experimento similar usando, como
testigo, un liposoma de GPIb (descrito en el Ejemplo 1 del documento
JP-A-9-208599) sin
PEG. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El liposoma de GPIb de la presente invención
reaccionó específicamente con vWF en presencia de ristocetina y
formó un agregado. Esto ha demostrado que el liposoma de GPIb es
útil como sustituto de plaquetas. Además, se ha clarificado que el
liposoma de GPIb de la presente invención tiene la capacidad de
agregación mejorada en comparación con el testigo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
2
Se confirmó la hemodinámica del liposoma de
GPIb. El liposoma de GPIb marcado con yodo preparado en el Ejemplo
2 se administró a cobayas Hartley (n = 3) con la dosis de 1 mg/kg de
peso corporal de GPIb en la vena femoral. Se extrajo la sangre de
la orbital con un lapso de tiempo durante 60 min después de la
administración y se contó la radioactividad de la sangre (100
\mul) en un contador gamma (1 min). Se realizó un experimento
similar usando, como testigo, un liposoma de GPIb (descrito en el
Ejemplo 1 del documento
JP-A-9-208599) sin
PEG. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Se ha clarificado que el liposoma de GPIb de la
presente invención tiene una propiedad de retención en sangre
mejorada en comparación con el testigo.
El complejo de GPIb lípido de la presente
invención puede unirse con vWF y formar un agregado. Así, se espera
que tenga potencial para uso práctico en un amplio intervalo como
sustituto de plaquetas, agente farmacéutico para la profilaxis o
tratamiento de angiopatía, daño vascular y trombosis, diagnóstico
para deficiencia de vWF y similares, reactivo biológico o médico,
reactivo para examen de supresor de la agregación de plaquetas o
antitrombosis, y similares. El complejo de GPIb lípido de la
presente invención también es útil como diagnóstico para encontrar
la localización de una lesión vascular o formación de trombo, o un
agente terapéutico de lo mismo, porque se acumula específicamente
en lesiones vasculares. Además, el complejo de GPIb lípido de la
presente invención también es superior en propiedad de retención en
sangre, lo que permite la expresión continua de una acción
farmacológica.
El conjugado de GPIb-lípido de
la presente invención es altamente utilizable como ingrediente
activo del complejo de GPIb lípido de la presente invención.
Claims (21)
1. Un conjugado que comprende GPIb y un lípido,
que están unidos mediante poli(óxido de alquileno) (PAO), en el que
la GPIb es
- (i)
- una propia GPIb,
- (ii)
- una cadena \alpha de GPIb, o
- (iii)
- un fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF) de una cadena \alpha de GPIb.
2. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el
que el fragmento de (iii) es un fragmento de cadena \alpha de
GPIb que carece de un lugar transmembrana.
3. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el
que el lípido tiene un grupo funcional que es un grupo amino, un
grupo carboxilo, un grupo tiol o un grupo aldehído.
4. El conjugado de la reivindicación 3ª, en el
que el lípido que tiene un grupo funcional es un fosfolípido, un
glicolípido, un ácido graso, un glicérido, un colesterol o un lípido
anfipático.
5. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el
que el PAO es polietilenglicol, polipropilenglicol o un glicol
obtenido copolimerizando óxido de etileno y óxido de
polipropileno.
6. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el
que el PAO tiene un peso molecular medio numérico de
100-100000.
7. El conjugado de la reivindicación 3ª, en el
que la GPIb y el PAO, y el PAO y el lípido que tiene un grupo
funcional, están unidos químicamente respectivamente por un agente
de reticulación.
8. El conjugado de la reivindicación 3ª, en el
que la relación molar de GPIb:PAO es 1:1-1:20, y la
relación molar de PAO:lípido que tiene un grupo funcional es
1:1.
9. Un complejo que comprende el conjugado de la
reivindicación 1ª y un lípido libre.
10. El complejo de la reivindicación 9ª, que
está en forma de un liposoma.
11. El complejo de la reivindicación 9ª, en el
que el lípido libre es un fosfolípido, un glicolípido, un
colesterol, un ácido graso o un derivado de ellos.
12. El complejo de la reivindicación 9ª, en el
que la relación molar de la GPIb:lípido libre es
1:10-1:1000.
13. El complejo de la reivindicación 9ª, en el
que el complejo es agregable en presencia de ristocetina.
14. El complejo de la reivindicación 9ª, en el
que se prepara el conjugado que comprende GPIb y el lípido unidos
mediante PAO y se prepara después un complejo de dicho conjugado y
un lípido libre.
15. Una composición farmacéutica que comprende
el complejo de la reivindicación 9ª.
16. La composición farmacéutica de la
reivindicación 15ª, que es un sustituto de plaquetas.
17. La composición farmacéutica de la
reivindicación 15ª, que es un agente para la profilaxis o
tratamiento de un trastorno vascular, un daño vascular o
trombosis.
18. Un agente farmacéutico para examen o
diagnosis, que comprende, como ingrediente activo, una sustancia de
marcado y el complejo de la reivindicación 9ª.
19. El agente farmacéutico de la reivindicación
18ª, en el que la sustancia de marcado es un radioisótopo, un metal
paramagnético para MRI, un compuesto yoduro para formación de imagen
de rayos X, una sustancia fluorescente o un pigmento.
20. Una composición que contiene fármaco que
comprende un fármaco y el complejo de la reivindicación 9ª como
ingredientes activos, en la que el fármaco es un agente hemostático,
un vasoconstrictor, un agente antiinflamatorio, un agente
trombolítico, un anti-coagulador de la sangre o un
agente anti-plaquetas.
21. El uso de un complejo de la reivindicación
9ª para preparar un sustituto de plaquetas o un medicamento para la
profilaxis o tratamiento de un trastorno vascular, un daño vascular
o trombosis.
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