ES2291332T3

ES2291332T3 - Mezclas de proteinas para curacion de heridas.

Info

Publication number: ES2291332T3
Application number: ES01952918T
Authority: ES
Inventors: Rama Akella; John P. Ranieri
Original assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Current assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2021-06-22
Also published as: EP1328288A2; WO2002000244A2; US7081240B1; EP1328288B1; JP2004501203A; WO2002000244A3; CA2413338A1; US20060286157A1; DE60130008D1; DE60130008T2

Abstract

El uso de una composición que comprende un cóctel BP proteico derivado de hueso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de heridas, en el que el cóctel BP proteico se puede preparar mediante la extracción proteica por hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas, siendo filtrada la disolución extracto y, a continuación, sometida a un proceso de ultrafiltración en dos etapas en el cual en la primera etapa de ultrafiltración se emplea una membrana de ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular (MWCO, del Inglés "Molecular Weight Cut Off") de 100 kD, siendo descartado el retenido y siendo sometido el filtrado a una segunda etapa de ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un MWCO nominal de aproximadamente 10 kD, siendo a continuación sometido el retenido a diafiltración, sustituyendo urea por guanidina, siendo a continuación sometida la disolución de urea que contiene proteína a cromatografía de intercambio iónico secuencial,que comprende primero la cromatografía de intercambio aniónico seguida de la cromatografía de intercambio catiónico, en la que las proteínas osteoinductivas producidas por el anterior proceso se somete, a continuación, a HPLC con una columna VYDAC tm preparativa y eluidas con gradiente creciente superficial de acetonitrilo, siendo juntadas fracciones de un minuto del eluato de la columna de HPLC para realizar el cóctel BP.

Description

Mezclas de proteínas para curación de heridas.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere al uso de un cóctel proteico derivado de hueso mediante la extracción proteica por hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas para el uso en el tratamiento de heridas.

La curación de herida es un proceso complejo que implica varios tipos celulares y factores de crecimiento para un cierre eficaz. El proceso de curación de herida normal se puede clasificar en líneas generales en tres fases concretamente las fases inflamatoria, proliferativa y de maduración. La fase inflamatoria dura 0-2 días e implica un reclutamiento ordenado de células a la zona de la herida. A esto le sigue la fase proliferativa de 2-6 días, en la cual los fibroblastos, queratinocitos y otras células en el lecho de la herida comienzan a proliferar de forma activa para cerrar la herida. La fase de maduración sigue a la fase proliferativa, alcanzando su nivel máximo a los 21 días, tiempo durante el cual la herida se cura completamente mediante la reconstrucción del tejido cicatriz inicial.

Una herida problemática no sigue el programa normal para el proceso curativo tal como se ha descrito anteriormente. Una herida problemática podría dejar de seguir el proceso curativo normal por cualquier número de razones, incluyendo nutrición, estado vascular, factores metabolíticos, edad, estado inmune, terapia de fármaco, estado neurológico y estado psicológico, entre otros. Varios factores locales también juegan un importante papel en la curación de herida, incluyendo la presencia de tejido necrótico en la zona, infección, presencia de cuerpo extraño, grado de desecación, presencia de edema, presión, frotamiento, maceración del corte y dermatitis.

Se ha demostrado a partir de los estudios de composición del fluido de herida que los factores de crecimiento juegan un importante papel en las tres fases de la curación de herida. Los tipos celulares que se reclutan para la zona de la herida secretan factores de crecimiento que ayudan y estimulan el proceso de curación de la herida. Las plaquetas, por ejemplo, son el primer tipo celular que se recluta en el lugar de la herida e inicia el proceso de curación de la herida mediante la secreción de factores de crecimiento (es decir, factores de crecimiento derivados de plaquetas, o PDGF, del Inglés "Platelet Derived Growth Factor") que son quimiotácticos para otros tipos celulares. Al hacerlo así, las plaquetas ayudan en el reclutamiento y proliferación de tipos celulares adicionales que estimulan la síntesis de tejidos nuevos. Además de las propiedades funcionales anteriormente mencionadas, los factores de crecimiento también tienen la capacidad de regular la síntesis proteica dentro de la célula y controlar la señalización intracelular permitiendo así que las células se comuniquen unas con otras.

Puesto que la curación de herida es un proceso complejo, el cual implica la formación de tejido conectivo y nuevos vasos sanguíneos para nutrir el lugar, es evidente que se ponen en juego varios factores de crecimiento. En las heridas crónicas hay un incremento en la actividad colagenasa y mayores niveles de citoquinas inflamatorias. Además, hay una ausencia de factores de crecimiento en el fluido de la herida, lo cual causa que las células sean mitóticamente incompetentes. Todos estos factores causan problemas de curación de la herida. Algunos de estos factores han sido estudiados en los modelos animales preclínicos así como en los clínicos. La mayoría de los estudios del factor de crecimiento implicados en el proceso de curación de herida implican ensayos en el intervalo de 20-25 días, que parece imitar adecuadamente el proceso normal de curación de herida. Sin embargo, ahora se han dado cuenta que para conseguir el cierre al 100% de las heridas problemáticas, sería ventajoso periodos de estudios mayores tan largos como 6 meses o más.

El único factor de crecimiento aprobado por FDA para la curación de herida usado en lo clínico es el factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) comercializado por Ortho-McNeil Pharmaceutical como REGRANEX®. REGRANEX® contiene becaplermina, un factor de crecimiento derivado de plaqueta humano y recombinante
(rhPDGF-BB) para la administración tópica. La becaplermina está producida por tecnología de ADN recombinante mediante la inserción del gen para la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) en levadura. La becaplermina tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y es un homodímero compuesto de dos cadenas polipeptídicas idénticas que se juntan mediante enlaces disulfuro. REGRANEX® es un gel tópico basado en carboximetilcelulosa (CMC) de sodio, conservado, de baja carga biológica y no estéril, que contiene el ingrediente activo becaplermina y los ingredientes inactivos cloruro de sodio, trihidrato de acetato de sodio, ácido acético glacial, agua para la inyección, y metilparaben, propilparaben y m-cresol como conservantes e hidrocloruro de L-lisina como estabilizador.

Se han dirigido estudios de diversos factores de crecimiento en el proceso de curación de herida. Algunos de las conclusiones de estos estudios se resumen a continuación:

1) PDGF-BB (el factor de crecimiento en REGRANEX®) es un quimioatrayente para los neutrófilos, monocitos y fibroblastos. En las aplicaciones de curación de herida se ha demostrado que se incrementa la deposición de la matriz extracelular y aumenta la proliferación de fibroblastos. Sin embargo, PDFG no es un angiógeno. Por tanto, se requerirán factores de crecimiento adicionales para el mantenimiento de la salud de la neodermis.

2) El factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF, del Inglés "Fibroblast Growth Factor") incrementa la densidad capilar y la proliferación de fibroblastos. Se ensayó una aplicación tópica en forma de gel y se demostró que no había absorción sistémica de la proteína (<1% de la dosis detectada).

3) El factor de crecimiento transformante \beta-2 (TGF \beta-2, del Inglés "Transforming Growth Factor \beta-2") es un factor de crecimiento que aumenta la proliferación de varios tipos celulares tanto in vitro como in vivo y se ha ensayado en la curación de úlcera venosa y en ensayos de úlcera de pie diabético. En un estudio clínico de dos brazos se observó una reducción del 40% del tamaño de la herida en comparación con la herida control en 6 semanas cuando se usa a 0,5 \mug/cm^{2}. Sin embargo, en un estudio clínico de 3 brazos cuando se ensayó 2,5 \mug/cm^{2} por comparación frente a vendaje de XEROFORM^{TM} estándar, los resultados no fueron muy alentadores.

4) El factor de crecimiento epidérmico (EGF, del Inglés "Epidermal Growth Factor") producido por plaquetas y macrófagos es un mitógeno para las células epiteliales. Primero se ensayó este factor de crecimiento en pacientes quemados y los resultados iniciales fueron prometedores. Sin embargo, cuando se ensayó en voluntarios no hubo diferencias entre los tratamientos con el factor de crecimiento y el placebo. Esto se podría deber al hecho de que EGF no es bueno para la migración de queratinocitos, pero es un buen agente mitótico.

5) Se ensayó la capacidad para incrementar la epitelialización del Factor de Crecimiento de Keratinocitos-2 (KGF-2, del Inglés "Keratinocyte Growth Factor-2"). Al día 6 se cerraron los intersticios. KGF-2 estimula la reepitelización en animales jóvenes y viejos sugiriendo mecanismos indirectos para la formación de tejido de neogranulación. Xia Y.D., et al., J. Pathol. (1999) 188:431-438. Hay una resistencia incrementada al estrés mecánico de las heridas curadas; por lo tanto, KGF-2 puede ser útil para el tratamiento de heridas quirúrgicas. Jiminez, P.A. & Rampy, M.A., (1999) J. Surg. Res. 81:238-242.

6) El factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF, del Inglés "Connective Tissue Growth Factor") es un factor secretado, mitógeno, quimiotáctico e inducido por la matriz celular codificado por un gen sensible de crecimiento temprano inmediato. La implicación del CTGF en la ateroesclerosis humana y los trastornos fibróticos sugiere un papel en la regeneración de tejido como reparación de herida, pero también en la deposición aberrante de la matriz extracelular. De hecho, los anticuerpos anti-CTFG se han usado para bloquear la cascada fibrótica.

Los estudios sobre las cinéticas de acción de diversos factores de crecimiento demostraron que algunos factores de crecimiento tales como el factor estimulante de la colonia granulocito-macrófago (GMCSF, del Inglés "Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor") y el FGF bovino actuaron secuencialmente. Se planteó la hipótesis de que una combinación de factores de crecimiento sería mejor que un tratamiento de un único factor de crecimiento. Sin embargo, en modelos animales, una combinación de estos dos factores realmente retardó el proceso regenerativo y la curación nunca alcanzó el 100%. Por lo tanto, se intentó la liberación secuencial de estos factores: primero se administró GMCSF seguido de la liberación de FGF 25 días después. En un estudio sencillo, se podría demostrar la no implicación sobre el control.

En otro estudio que combinaba TGF-\beta, bFGF (FGF básico) y CTGF se encontró que TGF-\beta1, TGF-\beta2 ó TGF-\beta3 causaban fibrosis en la piel después de 3 días de inyección continua pero el cambio fue transitorio y desapareció después de 7 días de inyección continua. A diferencia, se observó fibrosis irreversible tras la inyección simultánea de TGF-\beta y bFGF o TGF-\beta y CTGF, o la inyección de TGF-\beta durante los 3 primeros días seguido por la inyección de bFGF o CTGF durante los próximos 4 días. Estas observaciones sugieren que TGF-\beta1 induce la fibrosis de la piel y bFGF o CTGF lo mantiene en diversos trastornos fibróticos de piel.

Otro modo de obtener mezclas de factor de crecimiento consideró el uso del liberado de plaqueta el cual contiene una colección de factores de crecimiento liberados a partir de las plaquetas derivadas de la sangre. Las ventajas de este material son que es autólogo u homólogo y está fácilmente disponible y es de suponer que contiene los factores requeridos en la proporción apropiada. Para datar, aunque inicialmente se observó alguna implicación en el proceso de curación, a las 24 semanas no hubo diferencia entre los tratamientos con factor de crecimiento y con placebo.

El documento US-A-6054122 revela el uso de un sellante de tejido o pegamento de fibrina que contiene una composición que comprende al menos dos factores de crecimiento tales como BMP-3, TGF-beta y FGF-1 para el uso en la curación de herida. Además, el documento revela el uso de un sellante de tejido o pegamento de fibrina que contiene matriz ósea desmineralizada.

El documento US-A-5116738 revela una composición de BMP-3 para el uso en la curación de herida (y reparación del tejido) que puede comprender otros factores de crecimiento tales como las proteínas de BMP, el FGF y TGF.

El documento US-A-5141905 revela una composición de BMP-7 para el uso en la curación de herida (y reparación del tejido) que puede comprender otros factores de crecimiento tales como la BMP-3, el FGF y TGFbeta (TGFbeta-1,-2,-3).

El documento US-A-5187076 revela una composición farmacéutica para el uso en la curación de herida que comprende además de BMP-6, BMP-3, TGF-beta y FGF.

El documento WO-A-9641818 revela el uso de un hidrogel derivado de quitina que contiene una composición que comprende al menos un factor de crecimiento incluyendo BMP1-8, FGF-1 y TGFbeta que estimula la curación de herida. Además, el documento revela el uso del hidrogel derivado de quitina que contiene matriz ósea desmineralizada (DMB contiene BMP3, TGFbeta 2 y FGF-1) para el uso en la curación de herida. Además, se describe la formulación y liberación de TGFbeta 2 del sellante de Fibrina para la curación de herida.

El documento EP-A-0747066 revela el uso de composiciones adhesivas biocompatibles basadas en colágeno que contienen combinaciones o mezclas de dos o más factores de crecimiento seleccionados entre el grupo de TGF-beta-1,-2,-3, BMP1-9 y FGFs para estimular la curación de herida.

El documento US-A-5356630 revela una mezcla de proteínas osteogénicas solubles en agua (incluyendo BMP1-8) derivadas de la matriz ósea desmineralizada, TGF-beta y FGF para la curación de herida.

Por tanto, está claro que aunque varios factores de crecimiento polipeptídicos han mostrado significativa actividad biológica en los modelos de reparación de herida preclínicos, el único factor de crecimiento que ha demostrado ser eficaz en lo clínico es el PDGF-BB recombinante humano. Esto puede deberse a la escasa liberación, la inestabilidad del fármaco o la incapacidad de un único factor de organizar el proceso complejo de la curación de herida. Un tratamiento eficaz se debería dirigir a cuestiones tales como la angiogénesis, la deposición eficaz de colágeno y la epitelialización apropiada para cerrar la herida.

Compendio de la invención

La invención comprende un cóctel proteico derivado de hueso mediante la extracción proteica por hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas para mejorar el proceso de curación de herida en animales vivos, incluyendo seres humanos. En las realizaciones preferidas, la invención comprende una mezcla de factores de crecimiento, los cuales mejoran el proceso de curación de herida. En este contexto, los términos "excluyendo", "exclusión" o "excluido" se refiere a la supresión de sustancialmente todo un componente indicado, hasta el punto de que dicho componente se puede suprimir de una mezcla con cromatografía de inmunoafinidad o sino no se incluye en la mezcla. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se usa en la presente memoria en el sentido normal del término e incluye todos los vehículos conocidos incluyendo el agua.

"BP" es un cóctel proteico derivado de hueso tal como el descrito en los documentos de Patente Americana Nº: 5.290.763, 5.371.191 y 5.563.124. En resumen, se preparó el cóctel mediante la extracción proteica por hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas. Se filtró la disolución del extracto y se sometió a un proceso de ultrafiltración en dos etapas. En la primera etapa de ultrafiltración se emplea una membrana de ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular nominal (MWCO, del Inglés "Molecular Weight Cut Off") de 100 kD. El retenido se descarga y el filtrado se somete a una segunda etapa de ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un MWCO nominal de aproximadamente 10 kD. A continuación, el retenido se somete a diafiltración para sustituir la urea por guanidina. A continuación, la disolución de urea que contiene proteína se somete a cromatografía de intercambio iónico secuencial, primero cromatografía de intercambio aniónico seguida por cromatografía de intercambio catiónico. A continuación, las proteínas osteoinductivas producidas por el anterior proceso se someten a HPLC con una columna VYDAC^{TM} preparativa y se someten a elución con gradiente creciente superficial de acetonitrilo. Se juntan fracciones de un minuto del eluato de la columna de HPLC para producir el cóctel BP (el número de fracción puede variar ligeramente con la composición del disolvente, el tamaño de la resina, el volumen del lote de producción, etc.). Una realización del cóctel BP se caracteriza tal como se muestra en la Figura 1-6. Se pueden variar las cantidades absolutas y relativas de los factores de crecimiento presentes en el cóctel BP recogiendo diferentes fracciones del eluato de HPLC. En una realización particularmente preferida, se juntan las fracciones 29-34. También se contempla que ciertas proteínas se pueden excluir de la mezcla BP sin afectar la actividad de la curación de herida.

Originalmente BP se descubrió como una mezcla de proteínas conocidas por tener actividad osteogénica. Sin embargo, contiene una pluralidad de factores de crecimiento y es fuertemente angiogénico. En particular, BP contiene un número de proteínas morfogénicas óseas (BMPs, del Inglés "Bone Morphogenetic Proteins"), incluyendo BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, así como TGF-\beta1, TGF-\beta2 y TGF-\beta3. FGF-1 también está presente en la mezcla. Se detectó la presencia de cada una de las anteriores proteínas usando técnicas de inmunotransferencia, tal como se representa en la Figura 14. Cuando se ensayó BP en un modelo animal para determinar si sería eficaz para ayudar al cierre de herida, sorprendentemente se descubrió que BP estimulaba la curación de herida, aunque fuese un proceso marcadamente diferente a la osteogénesis.

Las composiciones proteicas de la invención se pueden combinar de forma ventajosa con los vendajes de herida tradicionales que incluyen los vendajes primarios y secundarios, los vendajes del método "wet-to-dry", los vendajes absorbentes, los vendajes no adherentes, los vendajes semipermeables, los vendajes transparentes, los vendajes hidrocoloidales, hidrogeles, los vendajes en espuma , los vendajes de alginato, cintas quirúrgicas y similares como sean apropiados para el tipo de herida a tratar.

Las composiciones de acuerdo con la presente invención también se puede combinar con una diversidad de otros ingredientes activos, tales como aloe vera, arginina, glutamina, zinc, cobre, vitamina C, vitaminas B y otros suplementos nutricionales, antibióticos, antisépticos, antifúngicos, desodorantes y similares. Las realizaciones de la invención también se pueden combinar con una diversidad de agentes antiinflamatorios que inhiben la acción de citoquinas proinflamatorias tales como interleuquina-1, interleuquina-6 y factor de necrosis tumoral alfa. Muchos de dichos inhibidores son muy conocidos, tal como IL-1Ra, el receptor de TGF-\beta soluble, corticoesteroides y se cree que se descubrirán más en el futuro.

Se ha detectado la presencia de un número de proteínas, que se cree que no tienen actividad de factor de crecimiento en BP. Por consiguiente, estas proteínas, que incluyen proteínas de histona, proteínas ribosómicas o ambas, se pueden excluir de las composiciones de la presente invención. Si no, la composición puede comprender la mezcla BP aislada tal como se describe en los documentos de Patente Americana Nº 5.290.763, 5.371.191 y 5.563.124 tal como se muestra en las Figuras 2 y 3 (carriles dentro del recuadro juntados para producir BP). Las histonas y los ribosomas se pueden excluir del BP mediante, por ejemplo, la unión a anticuerpo u otras técnicas conocidas en la técnica. Además, la composición en cuestión puede contener uno o más de los componentes activos enumerados suministrados como proteína producida de forma recombinante. Preferentemente, los componentes se aíslan de una fuente natural y son al menos parcialmente fosforilados y glicosilados.

En otra realización, las anteriores composiciones se usan en las aplicaciones de curación de herida junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable incluye vendajes tales como vendajes hidrocoloidales, hidrogeles, vendajes en espuma y vendajes de alginato. Los ingredientes activos adicionales pueden incluir arginina, glutamina, zinc, cobre, vitamina C, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, vitamina B6, vitamina B12 y folato o factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento derivado de plaqueta, el factor de crecimiento similar a la insulina, el factor de crecimiento de queratinocitos, el factor de crecimiento endotelial vascular, el factor de crecimiento transformante alfa, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento de tejido conectivo y el factor estimulante de colonia granulocito-monocito. También se pueden añadir a la composición un inhibidor de la inflamación tal como el inhibidor de interleuquina-1, el inhibidor de interleuquina-6 y el inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa. Por supuesto, también se pueden añadir agentes de alivio del dolor, desinfectantes, antibióticos y otros ingredientes activos adecuados para aplicaciones a herida particulares.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra un SDS-PAGE de una mezcla proteica de acuerdo con la presente invención, tanto en formas reducidas como no reducidas.

La Figura 2 es un gel de SDS-PAGE de las fracciones 27-36 de la HPLC de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 3 es un gel de SDS-PAGE con bandas identificadas indicadas de acuerdo con la leyenda de la Figura 4.

La Figura 4 es un gel de SDS-PAGE de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención con bandas identificadas indicadas tal como se proporciona en la leyenda.

La Figura 5 es un gel de SDS-PAGE en dos dimensiones (2-D) de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención con patrones internos indicados por flechas.

La Figura 6 es un gel de SDS-PAGE de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención con proteínas rodeadas identificadas como en la leyenda.

Las Figuras 7A-O son los resultados de un espectrómetro de masas para los fragmentos trípticos de geles de una dimensión (1-D) de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 8 es una transferencia tipo "Western" del gel 2-D de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención marcada con anticuerpo anti-fosfotirosina.

Las Figuras 9A-D son transferencias tipo "Western" del gel en 2-D de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención, marcadas con anticuerpos indicados. La Figura 9A indica la presencia de BMP-3 y BMP-2. La Figura 9B indica la presencia de BMP-3 y BMP-7. La Figura 9C indica la presencia de BMP-7 y BMP-2 y la figura 9D indica la presencia de BMP-3 y TGF-\beta1.

La Figura 10 es un gel de SDS-PAGE teñido con PAS (ácido peryódico de schiff) de las fracciones de la HPLC de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 11 es un gel de SDS-PAGE teñido con anti-BMP-7 de una mezcla proteica tratada con PNGasa F de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 12 es un gel de SDS-PAGE teñido con anti-BMP-2 de una mezcla proteica tratada con PNGasa F de acuerdo con una realización de la presente invención.

Las Figuras 13A-B son gráficos de barras que muestran masa de explante de componentes glicosilados en una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención (Figura 13A) y el resultado de ALP (Figura 13B) de los mismos componentes.

La Figura 14 es un cuadro que muestra el listado de anticuerpo y reactividad.

Las Figuras 15A-B comprenden juntas un cuadro que muestra los datos de secuenciación de fragmento tríptico para componentes de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

Las Figuras 16A-F comprenden juntas un cuadro que muestra los datos de la espectrometría de masas de fragmento tríptico para componentes de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

Las Figuras 17A-B son un gel con SDS (Figura 17B) y un escaneo por densitómetro de barrido (Figura 17A) del mismo gel para una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 18 es un cuadro que ilustra la masa relativa, a partir de la cuantificación del densitómetro de barrido, de los componentes proteicos en una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

Las Figuras 19A-D comprenden juntas un cuadro que muestra los datos de la espectrometría de masas de diversos fragmentos de proteína a partir de geles 2D de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención Ejemplo 1 BP en la aplicación de dosis única a ratones "nude"

Se ha encontrado que una aplicación de dosis única de BP a heridas de máximo grosor en ratones "nude" cubiertos con injertos de piel humana del grosor de la hendidura enredada cura la herida completamente y más rápido que las heridas que no reciben la mezcla de factor de crecimiento. Aunque no se entiende totalmente la manera específica en la cual los factores de crecimiento en BP afectan al proceso de curación de herida, se propone la hipótesis de que la acción sinérgica de los múltiples factores de crecimiento presentes en BP ayuda a recuperar las heridas mejor que aquellas en los animales control que han recibido solamente el vehículo.

Se crearon heridas de máximo grosor en ratones "nude" de modo que la zona de la herida comprendía aproximadamente el 20% de la superficie corporal total. Se preparó BP tal como en los documentos de Patente Americana Nº. 5.290.763, 5.371.191 y 5.563.124 y se suministró a la herida en un vehículo de povidona. A continuación, se cubrió la herida con injertos de piel humana del grosor de la herida enredada. El grupo control de animales recibieron solamente el vehículo de povidona. Los lugares del injerto se vendaron y se cerraron con "band-aids" para mantener el vendaje seguro en el sitio. Los primeros cambios de vendaje se llevaron a cabo el día 5 post operatorio y después cada tres días. El protocolo básico también se describe en "Clinical and Experimetal Approaches to Dermal and Epidermal Repair: Normal and Chronic Wounds", pp. 429-442 (1991) Wiley-Liss, Inc. y Cooper M.L. et. al., "The Effects of Epidermal Growth factor an basic Fibroblast Growth factor on Epithelialization of Meshed Skin Graft Interstices", Prog. Clin. Biol. Res. (1991) 365:429-42. Dichos protocolos son conocidos por los expertos en la técnica.

Los resultados fueron fuertemente alentadores. Se ensayaron la aplicación única de dos concentraciones (o bien 100 \mug/lugar de herida o 200 \mug/lugar de herida) del factor de crecimiento. No hubo diferencia ni en el índice ni en el grado de curación de la herida entre los dos grupos. Sin embargo, había una marcada diferencia entre el grupo de los animales que recibieron el tratamiento con el factor de crecimiento y los animales control que no recibieron el factor de crecimiento. Al día 11 POD (día post operatorio), se observó un cierre de la herida del 95% en los animales que recibieron el factor de crecimiento mientras que los animales controles mostraron únicamente un cierre del 74%. Al día 14 POD todos los animales tratados con factor de crecimiento tenían un cierre del 100% mientras que los animales control tenían únicamente un cierre del 85% a partir del día 20 POD.

El grosor de la capa epitelial en las heridas tratadas con BP fue significativamente mayor en los animales tratados con BP en comparación con los animales control, tal como se muestra en la Tabla 1. Los datos representan el grosor de la neodermis en mm medido el día 11 para los animales tratados con BP y el día 16 para los animales control de modo que las mediciones se realizan a grados equivalentes de curación. Los análisis histológicos revelaron que las heridas se cerraban por las células humanas del material injertado y había deposición de colágeno en las heridas cerradas tal como se reveló mediante tinción inmuno histológica con involucrina y colágeno tipo 1 (los datos no se muestran). La densidad de la capilaridad en el lecho de la herida después del tratamiento con BP también fue significativamente mayor en el momento del cierre de la herida en comparación con los controles no tratados, tal como se muestra en la Tabla 1. Además, en los animales tratados con la dosis de BP más baja, hay un incremento significativo en el recuento de células de músculo liso (SMC, del Inglés "Smooth Muscle Cell") en las heridas tratadas con BP en comparación con los controles, tal como también se ve en la Tabla 1.

TABLA 1 Grosor de la herida, Recuento de Capilaridad y Recuento de SMC para Heridas Tratadas con BP y Control

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En resumen, una aplicación de dosis única de BP era eficaz en reducir el tiempo de curación de la herida de grosor máximo en ratones "nude" injertados con piel humana del grosor de la herida enredada. Además, el grosor de la neodermis y la densidad de los capilares en las heridas tratadas eran significativamente mayores en comparación con el grupo control de animales. A diferencia, se demostró que bFGF, también un factor de crecimiento angiogénico, tiene un efecto perjudicial sobre la epitelización cuando se ensaya en un modelo animal similar. (Cooper, M.L. et al., 1991; "Clinical and experimental approaches to dermal and epidermal repair: normal and chronic wounds", pp. 429-442; Weilly-Liss, Inc.)

Ejemplo 2 BP en hidrogel

Se trataron un pequeño número de animales (n=3) con BP disuelto en un hidrogel (carboximetilcelulosa) en el mismo modelo animal que se ha descrito anteriormente. En este estudio, se observó que las heridas (n=2) tratadas con BP en el hidrogel mostraron inicio de epitelización ya a los 5 días post operatorios en comparación con las heridas tratadas con BP disuelto en povidona al 1%, las cuales mostraron inicio de epitelización únicamente a los 8 días post operatorio (los datos no se muestran). En ambos ejemplos, los animales control que recibieron el vehículo solo no mostraron inicio de epitelización hasta POD 8. Se está llevando a cabo la histología detallada sobre las muestras de tejido para determinar el grosor de la neodermis y el grado de angiogénesis en las heridas tratadas con la formulación de hidrogel. Sin embargo, a continuación, en la Tabla 2 se presentan los datos de cierre de herida.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Cierre de Herida en Porcentaje para Heridas Tratadas con BP y Control

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En resumen, los resultados eran muy prometedores aunque preliminares, mostrando cierre de herida más grueso en animales tratados con BP que en animales control. Por tanto, se emprendieron experimentos más exhaustivos para confirmar los resultados, tal como se describe a continuación.

Ejemplo 3 Estudio comparativo entre REGRANEX® y BP

REGRANEX® (PDGF-BB), el único producto de factor de crecimiento aprobado en el mercado para tratar úlceras de pie diabético, mostró curación completa en el 50% de la población paciente en comparación con el 35% del tratamiento con gel placebo que demostró curación completa después de repetir la aplicación durante aproximadamente 20 semanas en pacientes diabéticos (véase la completa información prescrita por REGRANEX® U.S.-introducida en el paquete). Por lo tanto, se emprendió una comparación de REGRANEX®(^{TM}) frente a BP en un estudio similar al anteriormente descrito. Los resultados se presentan en las Tablas 3 y 4.

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TABLA 3 Heridas Tratadas con BP, Hidrogel (HG) y Regranex® y Cierre de Herida en Porcentaje (%), Grosor Epitelial (mm) y Grado de Angiogénesis (Nº de Capilares Estimados por Campo20x)

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Los resultados de cierre en porcentaje se resumen tal como sigue:

TABLA 4 Resumen

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Por tanto, el tratamiento con BP es tan bueno como con REGRANEX^{TM} en el cierre de heridas aunque inicialmente se observa unos índices de curación ligeramente más bajos. El tratamiento con BP también muestra un engrosamiento ligeramente menor del epitelio y muestra angiogénesis considerablemente mejorada en la zona de la herida.

Ejemplo 4 Aplicaciones futuras

Debido a que el BP ha prometido como agente de curación de herida, próximamente se ensayará en aplicaciones donde se sabe que la curación de herida es deficiente. Se realizarán experimentos similares a los anteriormente descritos con animales diabéticos para ensayar la curación de heridas de grosor máximo y parcial. También se ensayará la respuesta de las úlceras por estasis venosa y las úlceras diabéticas a BP.

En experimentos preliminares, ratas Sprague Dawley Macho que pesaban más de 325 g se volvieron diabéticas mediante tratamiento con estreptozotocina y se confirmó la hiperglicemia mediante glucometría. Se introdujeron cuatro heridas incisionales de grosor máximo en la superficie dorsal del eje perpendicular al longitudinal de cada animal. Se cerraron las heridas con suturas de seda y se aplicó el factor de crecimiento o el placebo en el hueco de la herida o sobre la incisión después del cierre. La aplicación se hizo en dos veces: 1) el día 0, el cual es el día de inserción de la herida (cirugía) y una segunda aplicación 2) el día 3 después de la inserción de la herida. Se midió la intensidad incisional el día 7 y el día 10 después de la cirugía. En la Tabla 5 se dan los datos y es muy alentador que el tratamiento con BP será particularmente útil para tratar una diversidad de úlceras diabéticas u otras heridas caracterizadas por curación retardada o escasa.

TABLA 5 Resistencia a la Tensión de las Heridas en Ratas Diabéticas

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Ejemplo 5 Caracterización adicional de BP

El BP se ha caracterizado parcialmente tal como sigue: fracciones de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del Inglés "High Performance Liquid Chromatography") se han desnaturalizado, se han reducido con DTT y se han separado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE, del Inglés "Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide-Gel Electrophoresis"). En la Figura 2 se muestran las fracciones de la HPLC de un minuto entre 27 y 36 minutos. Los patrones (ST) de tamaño de 14, 21, 31, 45, 68 y 97 kDa se obtuvieron como patrones de tamaño a Bajo Rango de BIORAD^{TM} y se muestran en ambos finales del gel teñido con azul de Coomassie. En el protocolo normal, se juntan las fracciones 29 hacia 34 de la HPLC para producir BP (véase los recuadros, Figuras 2 y 3), tal como se muestra en un gel de SDS-PAGE similarmente preparado en la Figura 17B.

Se caracterizaron los diversos componentes de BP mediante espectrometría de masas y secuenciación de aminoácidos de fragmentos trípticos donde había suficientes niveles de proteína para el análisis. Se extrajeron las bandas principales en el gel 1D (tal como se identifica numéricamente en la Figura 3), se sometieron a elución, sometieron a digestión tríptica y los fragmentos se purificaron con HPLC y se secuenciaron. Los datos de secuencia se compararon frente a las secuencias conocidas y las mejores correspondencias se muestran en las Figuras 15A-B. Estas identificaciones son algo provisionales en el sentido de que solamente se han secuenciado las porciones de las proteínas completas y, en algunos casos, hay variación entre los análogos humanos y bovinos para una proteína dada.

Se analizaron los mismos fragmentos de proteína trípticos mediante espectrometría de masas y los espectrogramas de masas se muestran en las Figuras 7A-O. Los resultados tabulados y las homologías se muestran en las Figuras 16A-F que proporcionan información de identificación para las bandas identificadas en las Figuras 3-4. Tal como anteriormente, la asignación de identidad de la mancha puede ser provisional en base a las diferencias de especie y las modificaciones post-translación. Un resumen de todas las identificaciones de proteína a partir de los geles 1D se muestran en la Figura 4.

Los componentes proteicos identificados de BP, tal como se describen en las Figuras 15A-B, 16A-F y 19A-D, se cuantificaron tal como se muestra en las Figuras 17A y 17B. La Figura 17B es un gel de SDS-PAGE teñido de BP y la Figura 17A representa un rastro del densitómetro de barrido del mismo gel. Las proteínas identificadas se marcaron y cuantificaron mediante la medición del área bajo la curva. Estos resultados se presentan en la Figura 18 como un porcentaje del área de pico total.

Por tanto, hay 11 bandas principales en el gel de SDS-PAGE de BP que representan aproximadamente el 60% de la proteína en BP. Las proteínas identificadas se dividen en líneas generales en tres categorías: las proteínas ribosómicas, las histonas y los factores de crecimiento, incluyendo factores morfogénicos óseos (BMPs). Se espera que las proteínas ribosómicas y las proteínas de histona se puedan suprimir del BP sin pérdida de actividad, puesto que se sabe que estas proteínas no tienen actividad de factor de crecimiento. Tras esta separación, se espera que la actividad específica se incremente de manera proporcionalmente.

Los experimentos se planean para confirmar la hipótesis de que las proteínas de histona y ribosómicas se pueden suprimir del BP sin pérdida resultante, o incluso un incremento, en la actividad específica. Las histonas se suprimirán del cóctel BP mediante cromatografía de inmunoafinidad usando o bien anticuerpos específicos de proteína de histona o un anticuerpo de panhistona. Se ensayará BP mermado de histona (BP-H) tal como se ha descrito anteriormente para la curación de herida y/o actividad osteogénica. Igualmente, se quitarán las proteínas ribosómicas conocidas y se ensayará la mezcla restante (BP-R).

También se analizó un gel de SDS-PAGE de BP mediante inmunotransferencia tipo "Western" con una serie de anticuerpos, como los enumerados en la Figura 14. La visualización de la reactividad del anticuerpo fue mediante peroxidasa de rábano picante conjugado con un segundo anticuerpo y usando un sustrato quimioluminiscente. Además, se cuantificó TGF-\beta1 usando TGF-\beta1 comercialmente puro como patrón y se determinó para representar menos del 1% de la proteína de BP. El análisis del anticuerpo indicó que cada una de las proteínas enumeradas en la Figura 14 están presentes en BP.

El BP se caracterizó más mediante electroforesis en gel 2D, tal como se muestra en las Figuras 5-6. Se separaron las proteínas en dirección horizontal de acuerdo con la carga (pI) y en dirección vertical por el tamaño tal como se describe en la electroforesis en dos dimensiones adaptada para la resolución de proteínas básicas se realizó de acuerdo con el método de O'Farrell et al. (O'Farrell, P.Z., Goodman, H.M. y O'Farrell, P.H., Cell, 12:1.133-1.142, 1977) por el Kendrick Laboratory (Madison, WI). Las técnicas de electroforesis en gel en dos dimensiones son conocidas por los expertos en la técnica. Se llevó a cabo electroforesis en gradiente de pH en condiciones de no equilibrio ("NEPHGE", de sus siglas en Inglés) usando anfolinas a pH 3,5-10 al 1,5% y a pH 9-11 al 0,25% (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 200 V durante 12 Horas. Se añadieron tropomiosina purificada (mancha inferior, 33.000 kDa, pI 5,2) y lisozima purificada (14.000 kDa, pI 10,5-11)(Merck Index) a las muestras como marcadores de pI internos y están marcados con flechas.

Después de la calibración durante 10 min en tampón "0" (glicerol al 10%, ditiotreitol 50 mM, SDS al 2,3% y Tris 0,0625 M, pH 6,8) se selló el gel en tubo a la superficie de un gel apilado que está por encima de un gel de lámina en acrilamida al 12,5% (0,75 mm de grosor). Se llevó a cabo electroforesis en gel en lámina con SDS durante aproximadamente 4 horas a 12,5 mA/gel.

Después de la electroforesis en gel en lámina se tiñeron dos de los geles con azul de Coomassie y los otros dos se transfirieron al tampón de transferencia (Tris 12,5 mM, pH 8,8, Glicina 86 mM, MeOH al 10%) sometido a transferencia sobre papel PVDF durante toda la noche a 200 mA y aproximadamente 100 voltios/dos geles. Las siguientes proteínas (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se añadieron como patrones del peso molecular a la agarosa que sellaba el gel en tubo al gel en lámina: miosina (220.000 kDa), fosforilasa A (94.000 kDa), catalasa (60.000 kDa), actina (43.000 kDa), anhidrasa carbónica (29.000 kDa) y lisozima (14.000 kDa). La Figura 5 muestra el gel 2-D teñido con patrones de tamaño indicados a la izquierda. La tropomiosina (flecha izquierda) y la lisozima (flecha derecha) también están indicadas.

En la Figura 6 se muestra el mismo gel con varias proteínas identificadas indicadas por los círculos enumerados. Se identificaron las proteínas mediante espectrometría de masas y secuenciación de aminoácidos de péptidos trípticos, tal como se ha descrito anteriormente. La identidad de cada uno de los círculos marcados está proporcionado en la leyenda de la Figura 6 y los datos que identifican las diversas manchas de proteína se presentan en las Figuras 19A-D.

Debido a la variedad de las proteínas migradas a más de un tamaño (por ejemplo, BMP-3 que migra como 6 bandas) se emprendieron investigaciones para investigar el alcance de la modificación post translación de los componentes de BP. Se midió la fosforilación mediante inmunotransferencia anti-fosfotirosina y mediante estudios de fosfatasa. La Figura 8 muestra un gel 2D, sometido a electrotransferencia sobre papel de filtro y sondando con un anticuerpo monoclonal de ratón de fosfotirosina mediante SIGMA (Nº A-5964). Por tanto, se demostró que varias proteínas son fosforiladas en uno o más residuos de tirosina.

Se sondaron las electrotransferencias 2D similares con anticuerpos específicos a componente de BP, tal como se muestra en las Figuras 9A-D. Se sondaron los filtros con BMP-2, BMP-3 (Fig. 9A), BMP-3, BMP-7 (Fig. 9B), BMP-7, BMP-2 (Fig. 9C) y BMP-3 y TGF-\beta1 (Fig. 9D). Cada uno muestra la migración de banda de tamaño único característica a pI variante, como es típico de una proteína que existe en diversos estados de fosforilación.

Para los estudios de fosfatasa, se incubó BP en HCl 10 mM durante toda la noche a 37ºC con 0,4 unidades de fosfatasa ácida (AcP, del Inglés "Acid Phosphatase"). Se añadieron muestras tratadas y no tratadas a discos liofilizados de colágeno tipo I y se evaluaron uno al lado del otro en el bioensayo en rata de implante subcutáneo, tal como previamente se ha descrito en los documentos de Patente Americana Nº: 5.290.763, 5.563.124 y 5.371.191. En resumen, se añadió 10 g de BP en disolución a discos de colágeno liofilizados y los discos se implantaron subcutáneamente en el cuello de una rata. A continuación, se recuperaron los discos de la rata a las 2 semanas para el ensayo con fosfatasa alcalina ("ALP"- un marcador para células productoras de hueso y cartílago) o a las 3 semanas para el análisis histológico. Para el análisis con ALP de las muestras, se homogenizaron los explantes y se midieron los niveles de actividad de ALP usando un kit comercial. Para la histología, se cortaron secciones finas del explante con un microtomo y se tiñeron las secciones y se analizó para la formación de hueso y cartílago.

Se ensayaron la actividad morfogénica mediante la masa del implante subcutáneo (masa de explante) y el resultado de ALP en muestras de BP tanto naturales como tratadas con fosfatasa. Los resultados mostraron que el tratamiento con AcP reducía la masa de explante y el resultado de ALP desde el 100% al aproximadamente 60%. Por tanto, la fosforilación es importante para la actividad de BP.

También se analizó la glicosilación en el BP. La Figura 10 muestra un gel de SDS-PAGE teñido con ácido peryódico de schiff (PAS), un tinte de carbohidrato no específico, que indica que varios de los componentes de BP son glicosilados (proteína con asterisco identificada como BMP-3). Las Figuras 11-12 muestran la inmunodetección de dos proteínas específicas (BMP-7, Figura 11 y BMP-2, Figura 12) tratadas con niveles crecientes de PNGasa F (Péptido-N-Glicosidasa F). Tanto BMP-2 como BMP-7 muestran algún grado de glicosilación en BP, pero parece tener también algún nivel de proteína resistente a PNGasa F (los signos más indican niveles crecientes de enzima). Se ensayaron la actividad funcional de muestras tratadas con PNGasa F y sialadasa mediante masa de explante y mediante resultado de ALP, tal como se muestra en la Figura 13A y 13B que demuestra que se requiere la glicosilación para la actividad total.

En resumen, se modificaron los BMPs 2, 3 y 7 mediante fosforilación y glicosilación. Estas modificaciones post-translación afectan a la actividad morfogénica de la proteína, 33% y 50% respectivamente, y se debe tener cuidado al preparar el BP para no degradar estos derivados funcionales.

Claims

1. El uso de una composición que comprende un cóctel BP proteico derivado de hueso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de heridas, en el que el cóctel BP proteico se puede preparar mediante la extracción proteica por hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas, siendo filtrada la disolución extracto y, a continuación, sometida a un proceso de ultrafiltración en dos etapas en el cual en la primera etapa de ultrafiltración se emplea una membrana de ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular (MWCO, del Inglés "Molecular Weight Cut Off") de 100 kD, siendo descartado el retenido y siendo sometido el filtrado a una segunda etapa de ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un MWCO nominal de aproximadamente 10 kD, siendo a continuación sometido el retenido a diafiltración, sustituyendo urea por guanidina, siendo a continuación sometida la disolución de urea que contiene proteína a cromatografía de intercambio iónico secuencial, que comprende primero la cromatografía de intercambio aniónico seguida de la cromatografía de intercambio catiónico, en la que las proteínas osteoinductivas producidas por el anterior proceso se somete, a continuación, a HPLC con una columna VYDAC^{TM} preparativa y eluidas con gradiente creciente superficial de acetonitrilo, siendo juntadas fracciones de un minuto del eluato de la columna de HPLC para realizar el cóctel BP.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un hidrogel.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un vendaje seleccionado ente el grupo que consiste en vendajes hidrocoloidales, hidrogeles, vendajes en espuma y vendajes de alginato.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, incluyendo además la composición uno o más ingredientes activos seleccionados entre: arginina, glutamina, zinc, cobre, vitamina C, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, vitamina B6, vitamina B12 y folato.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, incluyendo además la composición uno o más factores de crecimiento seleccionados entre: factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaqueta, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de tejido conectivo y factor estimulante de colonia granulocito-monocito.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, incluyendo además la composición uno o más inhibidores de inflamación seleccionados entre: inhibidor de interleuquina-1, inhibidor de interleuquina-6 e inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa.