ES2291379T3

ES2291379T3 - Nanoparticulas lipidicas anfifilicas para la incorporacion de peptidos y/o proteinas.

Info

Publication number: ES2291379T3
Application number: ES01995691T
Authority: ES
Inventors: Maria Dorly Del Curto; Daniela Chicco; Pierandrea Esposito
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2021-12-17
Also published as: WO2002051390A2; DE60130791T2; EP1345597A2; JP2004519447A; ATE374603T1; IL156531A0; CY1106995T1; EP1345597B1; AU2002226374B2; DK1345597T3; DE60130791D1; PT1345597E; SI1345597T1; WO2002051390A3; CA2431888A1; US20040081688A1; JP4072057B2; AR032073A1; IL156531A; CA2431888C

Abstract

Nanopartículas lipídicas que comprenden un fármaco, una matriz lipídica y un tensioactivo, caracterizadas porque dicho fármaco es un péptido o una proteína y dicha matriz lipídica tiene un contenido de monoglicéridos que es al menos 70% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la matriz lipídica, en el que dichas nanopartículas están en el intervalo de 1 nm a 3.000 nm.

Description

Nanopartículas lipídicas anfifílicas para la incorporación de péptidos y/o proteínas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nanopartículas lipídicas que consisten en lípidos enriquecidos con componentes anfifílicos, que promueven la incorporación de péptidos y/o proteínas, un procedimiento para obtenerlas así como su uso.

Antecedentes de la invención

Los sistemas de suministro de fármacos, que han sido investigados durante muchos años, incluyen micropartículas; emulsiones de aceite-en-agua de liposomas (O/W) y nanopartículas basadas en polímeros sintéticos o macromoléculas naturales.

El uso de lípidos sólidos como material matriz para el suministro de fármacos es conocido desde los peletes lipídicos para el suministro de fármacos orales (por ejemplo, cápsulas retardantes de Mucosolvan®). La producción de micropartículas lipídicas mediante congelación por pulverización fue descrita por Speiser al principio de los años ochenta (Speiser et al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) seguido de los nanopeletes lipídicos para administración peroral (Speiser, documento EP 0167825 (1990)). Básicamente, los lípidos, los que pueden ser usados, son bien tolerados por el cuerpo (por ejemplo glicéridos compuestos de ácidos grasos que están presentes en las emulsiones para la nutrición parenteral).

Las vesículas de fosfolípidos redescubiertas como "liposomas" en 1965 por Bagham encontraron su camino en el mercado cosmético en 1986 (J. E. Diederichs et al., Pharm. Ind. 56 (1994) 267-275).

En cuanto a las micropartículas poliméricas, su número en el mercado es limitado, y ha habido sólo un aumento limitado del número de productos de micropartículas. La situación es aún peor para las nanopartículas poliméricas, después de que en más de 30 años de investigación, este sistema de suministro prácticamente no exista en el mercado. Hay motivos bastante conocidos para esto, entre los cuales dos deberían ser destacados: la citotoxicidad de los polímeros y la carencia de un método de producción adecuado a gran escala. Los polímeros aceptados para uso, como implantes, tampoco tienen necesariamente una buena tolerabilidad en forma de nanopartículas. En el intervalo de tamaños de nanómetros y teniendo un tamaño de unos pocos micrometros, el polímero puede ser interiorizado por las células (por ejemplo macrófagos) y la degradación dentro de la célula puede conducir al efecto citotóxico, por ejemplo, como se discute para los polímeros de poliéster (Int. J. Pharm. 30 (1986) págs. 215-220, A. Smith).

Considerando las limitaciones de los vehículos de fármacos convencionales, tales como liposomas, emulsiones lipídicas, nanopartículas y microesferas, hay una demanda obvia de un sistema vehículo para el suministro controlado de sustancias bioactivas tales como péptidos o proteínas para superar las desventajas de sistemas tradicionales, particularmente con respeto a la preparación, la estabilidad y la toxicidad.

Las nanopartículas lipídicas representan un sistema vehículo alternativo a los vehículos coloidales tradicionales tales como emulsiones, liposomas y micro- y nano-partículas poliméricas y poseen las propiedades mencionadas en lo sucesivo en este documento:

\bullet: capacidad biodegradable y atoxicidad;

\bullet: la capacidad de incorporar sustancias poco solubles en agua;

\bullet: mejor estabilidad química y física;

\bullet: la posibilidad de preparar una formulación de almacenamiento en seco;

\bullet: liberación controlada de sustancias incorporadas.

Es también conocido que las nanopartículas lipídicas son caracterizadas como partículas lipídicas de un estado físico sólido en el intervalo de tamaños de nanómetros combinando las ventajas de otros sistemas de suministro de fármaco como los siguientes:

\bullet: el estado sólido de la matriz lipídica permite una liberación del fármaco prolongada y

\bullet: protege el ingrediente incorporado contra la degradación química,

\bullet: los lípidos básicamente son bien tolerados (baja toxicidad celular y sistémica),

\bullet: la producción a gran escala es posible por homogeneización a alta presión, similar a emulsiones y liposomas.

Muchos fármacos diferentes han sido incorporados en nanopartículas lipídicas, y su capacidad de carga, según se ha valorado, evalúa la conveniencia de un sistema de vehículo de fármaco. Westesen et al. han estudiado la incorporación de fármacos para ubidecarenona (J. Control. Release 48 (1997) págs. 223-236). Varias clases de fármacos han sido descritas con capacidad de ser incorporadas a nanopartículas lipídicas, por ejemplo, la tetracaína o el etomidato (J. Microencapsulation, vol. 16, Nº. 2 (1999) págs. 205-213), palmitato de Vitamina E (Proc. Int. Symp. Control. Release Bioact. Mater. 25 (1998) págs. 433434), ciclosporina (documento WO 99/56733 (1999)), timolol (S.T.P. Pharma Sciences, 6 (1992) 514-518, Gasco et al.), doxorubicina e idarubicina (Int. J. Pharm. 89 (1993), Gasco et al.). Sin embargo, poco ha sido estudiado en cuanto a la incorporación de péptidos en nanopartículas lipídicas, como por ejemplo Müller et al. con nanopartículas lipídicas cargadas de lisozimas (Int. J. Pharm. 149 (1997) págs. 255-
265).

Hasta ahora, muchos investigadores han preparado nanopartículas lipídicas como vehículos coloidales para el suministro controlado de fármacos. Domb et al. (documento WO 91/07171) produjeron liposferas como vehículos de fármacos y otros agentes bioactivos. Usando ultrasonicación, Speiser et al. (Ger. Offen. DE 3421468 (1985)) obtuvieron nanopeletes lipídicos (80-800 nm) constituidos principalmente de ácidos grasos y sus ésteres con glicerol. Sjösrtöm y Bergenstahl obtuvieron nanopartículas lipídicas por precipitación en emulsiones de disolvente (Int. J. Pharm., 88 (1993) págs. 53-62). Siekmann y Westesen (Pharm. Pharmacol. Lett. 1 (1992) págs. 123-126), Westesen et al. (Int. J. Pharm. 93 (1993) págs. 189-199) y Müller et al. (J. Controlled Rel., 30 (1994) págs. 83-96) produjeron nanopartículas lipídicas por homogeneización a alta presión de lípidos fundidos dispersados en una solución de tensioactivo
acuosa.

Con respeto a la carga de péptidos y/o proteínas usando nanopartículas lipídicas como sistema de suministro de fármaco, todavía permanecen varios problemas:

\bullet: propiedades de solubilidad pobres en cuanto a dicho fármaco cargado,

\bullet: baja estabilidad del fármaco cargado,

\bullet: bajas interacciones entre el fármaco y la matriz lipídica,

\bullet: degradación enzimática y química,

\bullet: mala absorción a través del tracto gastrointestinal.

El documento DE 198 19 273 A describe partículas lipídicas sólidas que comprenden ciclosparina y opcionalmente un tensioactivo.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un nuevo tipo de nanopartículas lipídicas que comprenden lípidos anfifílicos adecuados para la incorporación de péptidos y/o proteínas, para proporcionar su liberación controlada, una vez que han sido administrados.

En particular, el objeto principal de la invención es proporcionar un nuevo tipo de nanopartículas lipídicas que comprenden un fármaco, una matriz lipídica y un tensioactivo caracterizado porque dicho fármaco es un péptido o una proteína y dicha matriz lipídica tiene un contenido de monoglicéridos que es al menos 70% p/p, estando basado el porcentaje en el peso en la matriz lipídica.

Para obtener una incorporación realzada de dichos péptidos y/o dichas proteínas en la matriz lipídica, han sido seleccionados varios lípidos con diferentes características hidrófilas/hidrófobas y composiciones químicas, tales como, por ejemplo, tri-, di- y monoglicéridos, PEG- o PPG-glicéridos, sacárido-glicéridos, ácidos grasos y sus mezclas.

Sorprendentemente, se ha observado que la carga máxima de péptido y/o proteína puede ser obtenida usando una matriz lipídica que contenga un alto contenido de monoglicéridos, lo que confiere propiedades anfifílicas a las nanopartículas lipídicas. Se ha encontrado que el contenido de monoglicéridos de dicha cantidad de matriz lipídica debe ser al menos del 70% p/p, preferiblemente del 75 al 99% p/p. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, puede ser usada cualquiera de los lípidos anteriormente mencionados o cualquier mezcla de uno o varios de ellos, con tal de que la cantidad total de contenido de monoglicérido sea al menos del 70%, como se explica
anteriormente.

De acuerdo con una realización preferida de la invención la matriz lipídica tiene un pico de fusión de al menos 65ºC, más preferiblemente de al menos 70ºC. El pico de fusión de la matriz lipídica puede ser determinado fácilmente por cualquier método conocido en la técnica. Un ejemplo de estos métodos es la calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Además, de acuerdo con otra realización preferida de la invención, la matriz lipídica tiene un alto contenido cristalino. El contenido cristalino puede ser determinado por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los experimentos de DSC pueden permitir establecer cualitativamente si la matriz lipídica tiene un alto contenido cristalino o es polimorfa. De hecho, la gráfica de DSC de una matriz lipídica polimorfa mostrará múltiples picos de fusión bajos y anchos, mientras que la gráfica de DSC de una matriz lipídica con un alto contenido cristalino mostrará un pico alto y estrecho.

La nanopartículas lipídicas cargadas con fármaco de acuerdo con la invención son estabilizadas por compuestos, tales como tensioactivos iónicos o no iónicos. Los tensioactivos adecuados incluyen, pero no están limitados a, los ejemplos siguientes: fosfolípidos sintéticos, sus derivados hidrogenados y sus mezclas, esfingolípidos y glicoesfingolípidos, ácidos grasos saturados o insaturados, alcoholes grasos, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, ácidos grasos etoxilados así como sus ésteres o éteres, dimiristoil-fosfatidil-colina, dimiristoil-fosfatidil-glicerol o una combinación de dos o más de los antedichos. Un tensioactivo preferido de acuerdo con la invención es el dimiristoil-fosfatidil-glicerol.

Dichas nanopartículas lipídicas además, opcionalmente, son estabilizadas por al menos un co-tensioactivo seleccionado en el grupo que comprende o que consiste en butanol, ácido butírico, ácido hexanoico, colato de sodio, taurocolato de sodio y glicocolato de sodio, más particularmente el colato de sodio.

Las nanopartículas lipídicas de la invención también pueden incluir otros excipientes, tales como polímeros que tienen propiedades bioadhesivas o de potenciación de la absorción y son seleccionados del grupo que comprende o consiste en polímeros acrílicos (Carbopol®, Polycarbophil, Noveon®), ácidos grasos de cadena media y polietilenglicoles. Los excipientes preferidos son los polímeros acrílicos anteriormente mencionados.

Toda la matriz lipídica, el tensioactivo, el co-tensioactivo y los otros excipientes se requiere que sean farmacéuticamente aceptables.

Típicamente cualquier péptido terapéuticamente eficaz o proteína puede ser incorporado en las nanopartículas lipídicas de la invención. La mayor parte de las proteínas terapéuticamente útiles pueden ser agrupadas en 3 clases:

\bullet: factores reguladores incluyendo hormonas, citoquinas, linfoquinas, quimiocinas, sus receptores y otros factores reguladores del crecimiento celular y del metabolismo que comprende enzimas;

\bullet: productos de la sangre incluyendo factores de la sangre derivados del suero y activadores de fibrinógeno enzimáticos;

\bullet: anticuerpos monoclonales.

De acuerdo con una realización de la invención, las proteínas adecuadas o los péptidos según se mencionan anteriormente incluyen, pero no están limitados con, los ejemplos siguientes: AAT, UK, PUK, estreptoquinasa, tPA, SOD, insulina, GH, GRF, ANF, GnRH, análogos de LHRH, eritropoyetina, granulocito CSF, macrófago de granulocito CSF, Interleuquina-1, Interleuquina-2, Interleuquina-3/multipotencial CSF, Interleuquina-4, Interleuquina-5 (o Eosinófilo-CSF), Interleuquina-6, Interleuquina-7, Interleuquina-8, Interleuquina-9, Interleuquina-10, Interleuquina-11, interferón-\alpha, interferón-\beta, interferón-\gamma, factor inhibitorio de la leucemia macrófago CSF, TNF, factor de células madre así como sus receptores.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, dicha proteína o dicho péptido se seleccionan a partir del grupo que consiste en Interleuquina-6, interferón-\alpha, interferón-\beta, interferón-\gamma, GnRH, análogos de LHRH, GH, GRF, gonadotropinas (tales como FSH, LH y hCG) y receptores de TNF o sus fragmentos solubles.

Más preferiblemente, el péptido se selecciona a partir del grupo que consiste en análogos de LHRH, y más particularmente un decapéptido que actúa como antagonista de LHRH.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, una lista no restrictiva de dichos péptidos incluye los compuestos siguientes:

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\bullet: Abarelix (descrito en el documento WO 9640757), actúa como antagonista de LHRH y se define por la fórmula siguiente:

: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-N-metil-L-Tyr-D-Asn-L-Leu-N6-(1-metiletil)-L-Lys-L-Pro.

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\bullet: Antarelix (descrito en el documento WO 9219651), actúa como antagonista de LHRH y se define por la fórmula siguiente:

: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-L-Tyr-N6-(aminocarbonilo)-D-Lys-L-Leu-N6-(1-metiletil)-L-Lys-L-Pro.

\newpage

\bullet: Azaline B (descrito en la patente de EE.UU. Nº. 5.296.468), actúa como antagonista de GnRH y se define por la fórmula siguiente:

: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-4-[(5-amino-1H-1,2,4-triazol-3-il)amino]-L-Phe-4-[(5-amino-1H-1,2,4-triazol-3-il)amino]-D-Phe-L-Leu-N6- (1-metiletil)-L-Lys-L-Pro.

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\bullet: Ganirelix (descrito en el documento EP 277829), actúa como antagonista de LHRH y se define por la fórmula siguiente:

: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-L-Tyr-N6-[bis(etilamino)metileno]-D-Lys-L-Leu-N6-[bis(etilamino)metileno]-L-Lys-L-Pro.

\vskip1.000000\baselineskip

En una realización más preferida de la presente invención, dicho péptido que actúa como antagonista de LHRH es un decapéptido específico llamado Antide. Este decapéptido (N-Ac-D-2-Nal, D-pClPhe, D-3-Pal, NicLys, D-NicLys, Ilys, D-Ala, NH_{2}) tiene una actividad antiovuladora impresionante así como propiedades antagonistas de LHRH y ha sido descrito con anterioridad (documento EP 377665 y patente de EE.UU. Nº. 5.470.947) como que actúa directamente sobre el metabolismo hormonal en la mujer.

Otro péptido preferido particular que actúa como antagonista de LHRH es otro decapéptido llamado Cetrotide, (cuyo INN es el Cetrorelix descrito en el documento EP 299402) que tiene la fórmula siguiente: D-alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-L-Tyr-N5-(aminocarbonilo)-D-ornitil-L-Leu-L-Arg-L-Pro.

A partir de aquí, se describe en este documento que las nanopartículas lipídicas cargadas de péptidos o proteínas son de hecho adecuadas para usarse como un medicamento, para la preparación de una composición farmacéutica. En el caso preferido, cuando el péptido es un decapéptido que actúa como antagonista de LHRH, la composición farmacéutica será útil para la modulación del metabolismo hormonal en un mamífero o para el tratamiento o la prevención de trastornos asociados con la actividad anormal del metabolismo hormonal en una mujer. Más específicamente, para el tratamiento o la prevención de trastornos asociados con una actividad anormal de la ruta de LHRH. En este caso específico, las nanopartículas lipídicas cargadas de péptidos son útiles para el tratamiento de enfermedades hormonales, estados patológicos o acciones anticonceptivas en las cuales el antagonismo de LHRH juega un papel principal, como agente anticonceptivo para inhibir la ovulación en un mamífero o inhibir el crecimiento de tumores hormonales dependientes, o la producción de testosterona en un mamífero. Las nanopartículas lipídicas cargadas de péptidos podrían ser empleadas solas o en combinación con otros agentes farmacéuticos.

Cuando se emplean como productos farmacéuticos, las nanopartículas lipídicas cargadas de péptido o proteína de la presente invención típicamente se administran en forma de una forma de dosificación farmacéutica. Como consecuencia, las composiciones farmacéuticas que comprenden las nanopartículas lipídicas cargadas de péptido o proteína y los excipientes farmacéuticos, tales como diluyentes, agentes antioxidantes, tensioactivos, co-tensioactivos, agentes espesantes, antimicrobianos, crio-protectivos están también en el alcance de la presente invención. Tal composición puede ser preparada de una manera conocida en la técnica farmacéutica. Generalmente, las nanopartículas lipídicas cargadas de péptido o proteína de la presente invención se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad administrada en realidad típicamente será determinada por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo la condición que se trata, la ruta de administración escogida, la edad, el peso, y la respuesta individual del paciente, la severidad de los síntomas del paciente, y otros similares.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas por una variedad de rutas incluyendo las rutas oral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, dérmica, sublingual, rectal, bucal, vaginal, nasal o pulmonar. La vía de administración oral es la preferida de acuerdo con la invención.

Dependiendo de la ruta pretendida de administración, los compuestos pueden ser formulados como formas líquidas o como sólidas. Las composiciones para la administración oral pueden tomar la forma de soluciones líquidas a granel o suspensiones, o polvos a granel.

Las formas líquidas adecuadas para la administración oral pueden incluir vehículos acuosos o no acuosos adecuados junto con tampones, agentes de suspensión y distribución, colorantes, aromatizantes y otros similares.

Las formas sólidas pueden incluir, por ejemplo, cualquiera de los ingredientes siguientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglomerante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente de desintegración tal como el ácido algínico, Primogel, o almidón de grano; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como hierbabuena, salicilato de metilo, o condimento de naranja.

\newpage

Las composiciones inyectables están típicamente basadas en una solución salina estéril inyectable o una solución salina tamponada de fosfato u otros vehículos inyectables conocidos en la técnica.

Un objeto más de la presente invención es un procedimiento para preparar las nanopartículas lipídicas cargadas de un péptido o una proteína, que han sido expuestas anteriormente.

De acuerdo con un método preferido de producción, las nanopartículas lipídicas cargadas de péptido o proteína de la presente invención pueden prepararse por un procedimiento que comprende las etapas siguientes (véase la
figura 2):

1.: incorporar el fármaco en la fase lipídica y disolver el tensioactivo y, opcionalmente, el co-tensioactivo en la fase acuosa, en condiciones de calentamiento controladas;

2.: mezclar la fase lipídica con la fase acuosa;

3.: homogeneizar a alta presión la preemulsión obtenida;

4.: enfriar la nano-emulsión en condiciones controladas de temperaturas con exactitud;

5.: opcionalmente, eliminar el agua.

Cada una de las etapas anteriormente mencionadas es detallada en lo sucesivo en este documento:

Primera etapa

Dicho péptido y/o dicha proteína son incorporados en matrices de lípidos por la técnica de co-fusión conocida. En particular, el lípido primero se funde en un baño termostatizado, a una temperatura apropiada, dependiendo del lípido usado. Dicho péptido y/o dicha proteína entonces son añadidos gradualmente al lípido fundido con agitación constante.

El fármaco también puede ser incorporado en la matriz lipídica utilizando la técnica de "eliminación del disolvente". El fármaco y el lípido primero son co-solubilizados a una temperatura adecuada en un disolvente apropiado, que posteriormente se elimina en condiciones apropiadas (bajo el vacío, a una temperatura adecuada).

En esta primera etapa la matriz puede ser modificada con excipientes adicionales, tales como fosfolípidos, con propiedades tensioactivas e hidrofilias que además pueden promover la incorporación del fármaco en la matriz. Los fosfolípidos comúnmente son usados en la industria farmacéutica para la preparación de emulsiones parenterales y enteras, así como para la estabilización de suspensiones, pulverizaciones y aerosoles, y para la producción de liposomas. Además, estos excipientes podrían tener un efecto beneficioso en la absorción del fármaco.

Dentro de la primera etapa los tensioactivos y opcionalmente los co-tensioactivos son disueltos en la fase acuosa. El tensioactivo tiene un efecto de estabilización sobre la emulsión/suspensión reduciendo la tensión interfacial entre el lípido y la fase acuosa.

El co-tensioactivo actúa también como un estabilizador, ya que se piensa que se colocan en la interfase entre las dos fases, confiriendo así una carga a la superficie de la partículas y previniendo la fusión de las partículas.

Empleando la técnica "eliminación del disolvente" para la incorporación del fármaco en la matriz lipídica, el disolvente usado se selecciona a partir del grupo que consiste en agua, etanol, propanol, alcohol bencílico, isopropanol, o una de sus mezclas, y más particularmente alcohol bencílico.

Segunda etapa

Las fases acuosas y lipídicas, mantenidas a la misma temperatura (entre 30ºC y 90ºC, particularmente 50ºC y 85ºC, más particularmente 65ºC y 85ºC), se mezclan enérgicamente para obtener una preemulsión.

Tercera etapa

La homogeneización a alta presión se aplica a una temperatura entre 30ºC y 90ºC, con una presión comprendida entre 50 bares y 2000 bares, particularmente entre 500 bares y 1800 bares, más particularmente entre 1000 y 1500 bares. Durante esta etapa, la ruptura de partículas ocurre por cavitación y la tensión mecánica que conduce a una nano-emulsión.

Cuarta etapa

La nano-emulsión obtenida se enfría en condiciones de temperaturas controladas. Las nanopartículas lipídicas sólidas aparecen después de la cristalización del lípido.

Las etapas anteriormente mencionadas son llevadas a cabo usando un intervalo de pH de entre 1 a 9, particularmente de entre 5 a 7.

En esta etapa las nanopartículas lipídicas de la invención son obtenidas en la fase sólida, pero en una suspensión acuosa.

El tamaño (diámetro promedio) de dichas nanopartículas dentro de una formulación de nanopartículas lipídicas tiene un perfil acampanado (la gráfica de la frecuencia frente al logaritmo del tamaño, véase la figura 3) que cubre un intervalo de unos pocos nm (10 nm) a aproximadamente 10 \mum. Por lo tanto, el tamaño de una población de partículas se describe mejor por los parámetros D (v, 0,1), D (v, 0,5) y D (v, 0,9), que definen la distribución de tamaños de la población como sigue:

\bullet: D (v, 0,1) = 10% (en volumen) de las partículas tienen un tamaño por debajo de este valor

\bullet: D (v, 0,5) = 50% (en volumen) de las partículas tienen un tamaño por debajo de este valor

\bullet: D (v, 0,9) = 90% (en volumen) de las partículas tienen un tamaño por debajo de este valor.

Para las formulaciones de nanopartículas lipídicas más prometedoras se seleccionan, parámetros de tamaño tales como:

\bullet: D (v, 0,1) = dentro del intervalo 0,15 \mum - 0,20 \mum

\bullet: D (v, 0,5) = dentro del intervalo 0,30 \mum - 0,60 \mum

\bullet: D (v, 0,9) = dentro del intervalo 1 \mum - 10 \mum

como puede observarse a partir de los datos mostrados en la Tabla 3 y a partir de la figura 6, donde se muestran las curvas superpuestas bajo el tamaño del volumen de LD de una formulación de nanopartículas lipídicas analizada varias veces hasta los 6 meses.

La composición de las formulaciones acuosas de nanopartículas lipídicas obtenidas de acuerdo con una realización preferida de la presente invención se describe en lo sucesivo en este documento:

1

De acuerdo con una composición preferida de la invención, el contenido de péptido o proteína es de 0,1 a 20% p/p, particularmente de 0,1 a 0,5% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la formulación acuosa final.

En una realización preferida de la invención, el contenido de la matriz lipídica es de 2 a 50% p/p, particularmente de 5 a 40% p/p, más particularmente de 8 a 30% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la formulación acuosa final.

De acuerdo con otra composición preferida de la invención, el contenido de tensioactivo es de 1 a 5% p/p, particularmente de 2 a 4% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la formulación acuosa final.

De acuerdo con una composición particularmente preferida de la invención, el contenido de co-tensioactivo es de 0 a 1% p/p, particularmente de 0,2 a 0,8% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la formulación acuosa final.

De acuerdo con una composición particularmente preferida de la invención, el contenido del excipiente potenciador de la absorción es de 0 a 5% p/p, más particularmente de 0,2 a 1% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la formulación acuosa final.

De acuerdo con una composición particularmente preferida de la invención, el contenido de excipiente bioadhesivo es de 0 a 0,05% p/p, particularmente de 0,005 a 0,05% p/p y más particularmente de 0,005 a 0,02% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la formulación acuosa final.

Bastante sorprendentemente, las nanopartículas lipídicas cargadas con péptido/proteína de acuerdo con la presente invención mostraron una estabilidad satisfactoria (6 meses y más) con una eficacia de encapsulación inalterada (véase la figura 6).

Una comparación entre nanopartículas lipídicas de compritol de acuerdo con la invención cargada de ciclosporina y nanopartículas lipídicas de imwitor cargadas con 900 ciclosporina (como se representa en el documento DE198119273) muestra una mejor estabilidad de la composición con respecto al tamaño (véanse la figura 4 y la figura 5)

Etapa quinta (Opcional)

Si las nanopartículas lipídicas, según se cree, son empleadas para composiciones farmacéuticas en formas de dosificación sólida, el agua de la suspensión acuosa tiene que ser eliminada. Esto puede ser llevado a cabo por cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, por filtración o ultrafiltración o liofilización.

Este párrafo proporciona abreviaturas y definiciones de los diversos términos biológicos y analíticos así como abreviaturas usadas en todas las partes de esta solicitud de patente y se requiere que se apliquen uniformemente en todas las partes de la memoria descriptiva y las reivindicaciones a no ser que y, de otra manera, expresen otra cosa.

"anfifílico" se refiere a un compuesto que tiene afinidad para dos ambientes diferentes, por ejemplo, una molécula con regiones hidrófilas (polares) y lipófilas (no polares). Los detergentes son ejemplos clásicos.

"AAT" se refiere \alpha-1-antitripsina

"ANF" se refiere al Factor Natriurético Atrial

"Antide", para el que Iturelix es el INN propuesto, se refiere al decapéptido siguiente:

N-Ac-D-2-Nal, D-pClPhe, D-3-Pal, Ser, NicLys, D-NicLys, Leu, Ilys, Pro, D-Ala, NH_{2}.

en el que:

"2-Nal" se refiere a 3-(2-naftil)-alanina

"Ilys" se refiere a la N-isopropilisina

"NicLys" se refiere a la N-nicotilnoilisina

"3-Pal" se refiere a 3-(3-piridil)alanina

"DSC" se refiere a calorimetría diferencial de barrido

"\DeltaH" se refiere a la variación de entalpia

"DMPC" se refiere a DiMiristoil-Fosfatidil-Colina

"DMPG" se refiere a DiMiristoil-Fosfatidil-Glicerol

"FACTOR VIII" se refiere a una glicoproteína que contiene 2331 aminoácidos

"FSH" se refiere a la Hormona de Estimulación Folicular.

"GH" se refiere a la Hormona del Crecimiento

"Glicéridos" se pretende que signifiquen ésteres de glicerol de ácidos grasos C_{4}-C_{30} saturados o insaturados

"GRF" se refiere a un Factor de Liberación de la Hormona del Crecimiento

"GnRH" se refiere a la Hormona de la Liberación de Gonadotropina

"HPH" se refiere a Homogeneización a Alta Presión

"LD" se refiere a Difractometría Láser

"LHRH" se refiere a la Hormona Liberadora de Lutropina

"Lípido", de acuerdo con la presente invención se refiere a una sustancia que es poco soluble en agua, pero que es soluble en disolventes orgánicos. De acuerdo con la presente invención, los lípidos incluyen ácidos grasos, mono- di- y tri-glicéridos, fofolípidos, PEG-glicéridos, sacárido-glicéridos o ceras y cualquiera de sus mezclas.

"LN" se refiere a nanopartículas lipídicas

"m.p." se refiere al punto de fusión

"Monoglicéridos" se refieren a compuestos obtenidos aplicando la esterificación por el ácido graso de una de las funciones alcohol del glicerol como se muestra en lo sucesivo en este documento:

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CH_{2}OH-CHOH-CH_{2}OH

\hskip0,3cm

\rightarrow

\hskip0,3cm

CH_{2}OCOR^{1}-CHOH-CH_{2}OH

Glicerol

\hskip4cm

Monoglicérido

\vskip1.000000\baselineskip

en el que R^{1} es una cadena de hidrocarburos C_{4}-C_{30} saturada o insaturada;

o por hidrólisis parcial de triglicéridos.

"nanopartículas" se refieren a partículas cuyo diámetro promedio está comprendido en el intervalo de 1 nm a 3000 nm.

"PCS" se refiere a Espectroscopia de Correlación de Fotón.

"PEG" se refiere a Polietilenglicol.

"Péptido" significa una estructura de poliamida que contiene átomos tetraédricos de carbono entre grupos amida. La cadena peptídica es obtenida a partir de la condensación de aminoácidos: el grupo amino de uno se une al grupo carboxilo del siguiente, formando una enlace peptídico.

"Farmacéuticamente aceptable" se entiende que abarca cualquier sustancia, que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico frente al huésped al cual se administra.

"Polimorfina" se refiere a una sustancia que tiene la capacidad de asumir varias formas cristalinas en su estado sólido.

"Proteínas" se refieren a una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos del polipéptido. La distinción principal entre péptidos y proteínas es de tamaño. De acuerdo con la presente invención los péptidos contienen no más de 100 aminoácidos, mientras que las proteínas contienen más de 100 aminoácidos.

"PUK" se refiere a Pro-uroquinasa

"Sacárido" se refiere a un grupo aldehído o un grupo cetona que tiene al menos dos grupos hidroxilo, adoptando dicho sacárido varias formas: forma de monómero (monosacárido), forma de dímero (disacárido), forma trímero (trisacárido), oligómero (oligosacárido) y polímero (polisacárido).

"SOD" se refiere a Superóxido Dismutasa.

"Tensioactivo" se refiere a un compuesto anfifílico capaz de estabilizar emulsiones y suspensiones de un material no polar en una solución acuosa.

"Co-tensioactivo" se refiere a un compuesto anfifílico capaz de completar y optimizar la acción del tensioactivo.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para afectar al curso y la severidad de las enfermedades descritas anteriormente, conduciendo a la reducción o remisión de tal patología. La cantidad eficaz dependerá de la ruta de administración y la condición del paciente.

"TNF" se refiere al Factor de Necrosis Tumoral

"tPA" se refiere al Activador de Plasminógeno de Tejido

"UK" se refiere a uroquinasa

"p/p" se refiere a peso/peso.

La presente invención será ilustrada mediante algunos ejemplos que hacen referencias a las Figuras siguientes.

Descripción de las figuras

Figura 1: Esta figura se refiere a la tensión superficial de soluciones de Antide en agua a concentraciones de fármaco diferentes.

Figura 2: El esquema de dicha figura 2 describe el método de producción de nanopartículas lipídicas cargadas de péptido de acuerdo con la invención.

Figura 3: Esta figura muestra las curvas de frecuencia de LD de una formulación de nanopartículas lipídicas con la composición siguiente: 0,2% de Antide, 9,8% de Compritol E ATO, 5% de Lutrol F68, agua hasta el 100%.

Figuras 4 y 5: Estas figuras muestran las curvas de frecuencia LD de dos formulaciones diferentes de LN cargadas de ciclosporina. La primera (figura 4) de acuerdo con la invención está compuesto de 0,2% de Ciclosporina, 9,3% de Compritol E ATO, 0,5% de DMPG Na, 2,5% de Tagat S y 0,5% de colato de Na.

La segunda (figura 5), según se describe en el documento DE19819273, está compuesta de 0,2% de Cidosporin, 9,3% de Imwitor 900, 2,5% de Tagat S y 0,5% de colato de Na.

Estas medidas han sido realizadas para valores de t diferentes:

..... t = 0;

---- t = 24 h

- - - - t = 14 días

100 t = 1 mes

Figura 6: Esta figura muestra curvas reducidas del volumen de LD superpuestas de una formulación de nanopartículas lipídicas (compuesta de 0,2% de Antide, 9,3% de Compritol E ATO, 0,5% de DMPG, 2,5% de Tagat S, 0,5% de Colato de Sodio, agua hasta el 100%), obtenido a partir del análisis de LD varias veces en 6 meses.

Figura 7: Esta figura se refiere a los análisis de DSC de Compritol ATO E puro (contenido de monoglicérido: 80%) e Imwitor 900 (contenido de monoglicérido: 40-50%).

Figura 8: Esta figura se refiere al perfil de liberación del fármaco in vitro en agua de LN27 y LN28 cargado con Antide.

LN27= 0,2% de Antide, 9,3% de Compritol E ATO, 0,5% de DMPG, 2,5% de Tagat S, 0,5% de Colato de Sodio.

LN28= 0,2% de Antide, 9,3% de Compritol E ATO, 0,5% de DMPG, 5% de Lutrol F68

Contenido de agua en todas las formulaciones = hasta el 100%.

Figura 9: Esta figura se refiere a la evaluación de la bioactividad in vitro del Antide incorporado a los sistemas lipídicos.

LN28= 0,2% de Antide, 9,3% de Compritol E ATO, 0,5% de DMPG, 5% de Lutrol F68

LN29= 0,2% de Antide, 9,8% Compritol E ATO, 5% de Lutrol F68

Contenido de agua en todas las formulaciones = hasta el 100%.

Figura 10: Esta figura muestra la liberación cinética de tres formulaciones de nanopartículas lipídicas diferentes cargadas con Antide cuando se inyectan a ratas subcutáneamente. Las curvas representan la concentración en plasma de Antide a lo largo del tiempo.

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Ejemplos

El péptido usado en los Ejemplos mencionados en este documento es Antide. Este péptido tiene características anfifílicas, como se demuestra por los datos siguientes:

Análisis de la tensión superficial: la medida de la tensión superficial, \gamma_{LV}, fue llevada a cabo usando un tensiómetro Kruss (sistema de análisis de forma de gota) con soluciones de Antide en agua a diferentes concentraciones de fármaco, es decir 0,01, 0,1, 1,0, 10 mM. Se muestran los resultados en la figura 1.

Coeficiente de partición: fue determinado usando octanol como fase orgánica y acuosa como fase hidrófila. Las dos fases primero fueron saturadas la una con la otra durante 24 horas a temperatura ambiente. El Antide entonces fue disuelto en la fase acuosa a una concentración por debajo de la saturación. Un volumen igual de la fase orgánica fue añadido posteriormente a la fase acuosa y la mezcla fue mantenida en agitación durante 24 horas a temperatura ambiente. La concentración de Antide en las dos fases fue determinada por RP-HPLC y el coeficiente de partición fue obtenido a partir de la relación entre la concentración de fármaco en la fase orgánica y acuosa.

El coeficiente de octanol/agua resultante fue de 8,56 x 10^{-2}.

Se muestran los resultados de evaluación de la solubilidad de Antide semicuantitativa en algunos lípidos, con el contenido de monoglicérido lipídico en la Tabla 1.

Preparación y caracterización de nanopartículas lipídicas cargadas de péptido

Algunos ejemplos que pertenecen a la presente invención son descritos más abajo utilizando composiciones diferentes. La figura 2 esquematiza la preparación de nanopartículas lipídicas por el método HPH.

Materiales y equipo

Antide a granel, Bachem.

Imwitor 900 (monoestearato de glicerilo), Condea Chemie-DE.

Compritol E ATO (monobehenato de glicerilo), Gattefossé-FR.

Compritol 888 ATO (behenato de glicerilo), Gattefossé-FR.

Imwitor 312 (monoglicérido de ácido láurico), Condea Chemie-DE.

Imwitor 928 (mono-/di-cocoato de glicerilo), Condea Chemie-DE.

Geleol (mono-palmitato/estearato de glicerilo), Gattefossè-FR.

Compritol HD 5 ATO (behenato de glicerilo/polietilenglicol), Gattefossè-FR.

Superpolystate (estearato de polietilenglicol), Gattefossè-FR.

Precirol ATO 5 (mono-/di-/tri-palmitato/estearato de glicerilo), Gattefossè-FR.

Witepsol E 85 (triglicéridos de ácidos grasos saturados C_{10}-C_{18}), Massa Witepsol

Softisan 142 (coco-glicéridos hidrogenados), Condea Chemie-DE.

Gelot 64 (glicerilo/palmitato de polietilenglicol/estearato), Gattefossè-FR.

Monosteol (Palmitato/estearato de propilenglicol), Gattefossè-FR.

Gelucire 44/14 (mezcla definida de mono-/di-/tri-ésteres de ácido láurico con glicerol y polietilenglicol),
Gattefossè-FR.

Gelucire 50/13 (mezcla definida de mono-/di-/tri-ésteres de ácido esteárico con glicerol y polietilenglicol),
Gattefossè-FR.

Alcohol cetílico, Sigma

Lutrol F68 (copolímero de bloque polioxietileno-polioxipropileno), Basf-D.

Tagat S (PEG30-glicerilestearato), Goldschmidt-D.

Ácido cáprico, Sigma

Sal de sodio de ácido cólico, ICN Aurora Ohio-USA.

Sal de sodio de 1,2-dimiristoil-fosfatidilglicerol (DMPG), Chemi-I.

1,2-dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), Chemi-I.

Noveon AA1 (Goodrich)

Pemulen TR-2 NF (Goodrich)

Calorímetro de barrido diferencial Perkin Elmer Pyris 1. Los análisis de DSC fueron realizados tanto en el modo de calentamiento como en el de enfríamiento con las condiciones operativas siguientes: Intervalo: 8ºC-100ºC; velocidad de exploración: 5ºC/min; capacidad del recipiente (agujereado): 50 \mul; flujo de N_{2}: 20 \mul/minuto. Los parámetros de DSC fueron evaluados en la segunda vuelta del calentamiento mostrando las transiciones térmicas princi-
pales.

Difractómetro láser Malvern Mastersizer Microplus MAF 5001.

Malvern Zetasizer 3000HS, (análisis de tamaños y análisis del potencial Zeta).

Homogeneizador de Alta Presión MICRON LAB 40 (APV), equipado con una camisa termostática

Sistema de análisis de forma de gota DSA 10 - Krüss

Sistema HPLC de Waters: Módulo de Separación 2690; columna RP, C18 Júpiter 5 \mum (250 x 4,6 mm, 5 \mum); Detector de Absorbancia 2487 Dual \lambda

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Ejemplo 1

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO, Tagat S y Colato de Sodio

Después de la dispersión del péptido (Antide, 0,08 g) en el lípido fundido (Compritol E ATO, 3,92 g) a 85ºC, fue añadida la fase caliente acuosa con el tensioactivo (Tagat S, 1,0 g) y el co-tensioactivo (colato de sodio, 0,2 g). La mezcla obtenida fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC. La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue 40 g.

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Ejemplo 2

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO, DMPG, Tagat S y Colato de Sodio (LN27)

Después de la dispersión del péptido (Antide, 0,08 g) en el lípido fundido (Compritol E ATO, 3,72 g) conteniendo DMPG (0,2 g) a 85ºC, fue añadida la fase caliente acuosa con el tensioactivo (Tagat la S, 1,0 g) y el co-tensioactivo (el colato de Sodio, 0,2 g). La mezcla obtenida fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC. La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue
40 g.

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Ejemplo 2A

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Imwitor 900, DMPG, Tagat S y Colato de Sodio

El ejemplo 2 fue repetido, pero usando Imwitor 900 en vez de Compritol E ATO. Al final del procedimiento las nanopartículas no se formaron porque las partículas tendieron a agregarse. Esto es debido a las diferencias en el contenido de monoglicérido, los picos de fusión y el contenido cristalino entre los dos lípidos. Todas tales diferencias han sido mencionadas en la figura 7.

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Ejemplo 3

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO, Imwitor 900, DMPG, Tagat S y Colato de Sodio

Después de la dispersión del péptido (Antide, 0,08 g) en la mezcla lipídica fundida (Compritol E ATO y Imwitor 900, 9:1, 3,72 9) conteniendo DMPG (0,2 g) a 85ºC, fue añadida la fase caliente acuosa con el tensioactivo (Tagat S, 1,0 g) y el co-tensioactivo (Colato de Sodio, 0,2 g). La mezcla obtenida fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC.

La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue 40 g.

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Ejemplo 4

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO, DMPG, y LUTROL F68 (LN28)

Después de la dispersión del péptido (Antide, 0,08 g) en el lípido fundido (Compritol E ATO, 3,72 g) conteniendo DMPG (0,2 g) a 85ºC, fue añadida la fase caliente acuosa con el tensioactivo (Lutrol F68, 2,0 g). La mezcla obtenida fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC. La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue 40 g.

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Ejemplo 5

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO y Lutrol F68 (LN29)

Después de la dispersión del péptido (Antide, 0,08 g) en el lípido fundido (Compritol E ATO, 3,92 g) a 85ºC, fue añadida la fase caliente acuosa con el tensioactivo (Lutrol F68, 2.0 g). La mezcla obtenida fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC. La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue 40 g.

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Ejemplo 6

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO, Ácido cáprico, Tagat S y Colato de Sodio

Después de la dispersión del péptido (Antide, 0,08 g) en la fase lipídica fundida (Compritol E ATO, 3,64 g y ácido cáprico, 0,08 g) a 85ºC, fue añadida la fase caliente acuosa con el tensioactivo (Tagat S, 1,0 g) y el co-tensioactivo (Colato de Sodio, 0,2 g). La mezcla obtenida fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC. La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue
40 g.

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Ejemplo 7

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO, DMPG, Lutrol F68 y Noveon AA1

El péptido (Antide, 0,08 g) fue dispersado en el lípido fundido (Compritol la E ATO, 3,92 g) conteniendo DMPG (0,4 g) a 85ºC. La fase acuosa fue preparada como sigue: el tensioactivo (Lutrol F68, 2,0 g) fue disuelto en la mitad del volumen de la fase acuosa (aproximadamente 17 mL de agua), mientras que Noveon AA1 (4 mg) fue dispersado en la otra mitad del volumen de la fase acuosa (aproximadamente 17 mL del agua). La fase acuosa caliente con el tensioactivo fue añadida primero a la fase lipídica fundida, y posteriormente la otra parte de la fase acuosa que contenía Noveon fue vertida en la mezcla, que entonces fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC. La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue
40 g.

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Ejemplo 8

Preparación de nanopartículas lipídicas usando Compritol E ATO, Lutrol F68 y Pemulen TR-2 NF

El péptido (Antide, 0,08 g) fue dispersado en el lípido fundido (Compritol E ATO, 3,92 g) conteniendo DMPG (0,4 g) a 85ºC. La fase acuosa fue preparada como sigue: el tensioactivo (Lutrol F68, 2,0 g) fue disuelto en la mitad del volumen de la fase acuosa (aproximadamente 17 mL de agua), mientras que Pemulen (4 mg) fue dispersado en la otra mitad del volumen de la fase acuosa (aproximadamente 17 mL del agua). La fase acuosa caliente con el tensioactivo primero fue añadida a la fase lipídica fundida, y posteriormente la otra parte de la fase acuosa que contenía Pemulen fue vertida en la mezcla, que entonces fue prehomogeneizada, a la misma temperatura, usando una herramienta de homogeneización ordinaria, para obtener una preemulsión. Dicha emulsión fue sometida a homogeneización a alta presión a una temperatura entre 80ºC y 90ºC. La nanoemulsion así obtenida fue enfriada en condiciones controladas de temperaturas, y se formaron nanopartículas sólidas después de la cristalización del lípido. El tamaño del lote fue
40 g.

La caracterización de las nanopartículas lipídicas preparadas como se describe en los Ejemplos 1-5 es comentada más abajo.

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Ejemplo 9

Evaluación de la eficacia de encapsulación Antide en nanopartículas lipídicas

La eficacia de encapsulación de Antide en nanopartículas lipídicas fue determinada por RP-HPLC. La suspensión de nanopartículas lipídicas primero fue disuelta completamente en acetona. El Antide entonces fue extraído añadiendo agua a la fase orgánica. La mezcla de dos fases fue agitada, sonicada y centrifugada, y la fase clara fue retirada posteriormente y fue inyectada en la columna HPLC. Debería ser apreciado que el contenido del fármaco determinado por este método tiene que ser considerado como un contenido de fármaco total, sin ninguna referencia al Antide incluido en las nanopartículas lipídicas o disuelto en la fase acuosa continua. Sorprendentemente, dicho Antide fue encapsulado con una eficacia del 85-90%. Además las nanopartículas lipídicas formadas eran físicamente y químicamente estables a 4ºC al menos 6 meses después de su preparación. En realidad, ninguna degradación del ingrediente activo ha sido encontrada y las características físicas de las nanopartículas lipídicas fueron inalteradas; no se observó ninguna agregación entre las partículas.

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Ejemplo 10

Liberación de Antide in vitro

Nanopartículas de Antide-lípido fueron incubadas en el medio de liberación (agua) y las muestras fueron retiradas varias veces, y posteriormente fueron filtradas por filtros de 0,22 \mum de Acrodisc. La solución clara fue analizada por RP-HPLC. Se muestran los resultados de la liberación de Antide de dos formulaciones en la figura 8.

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Ejemplo 11

Caracterización fisicoquímica de nanopartículas lipídicas

El tamaño de partículas y la distribución del tamaño de partículas de la formulación de nanopartículas lipídicas cargada con Antide fueron evaluados por Difractometría Láser (LD) y Espectroscopia de Correlación de Fotón (PCS), usando el Difractómetro láser de Malvern y Zetasizer, respectivamente. El potencial Zeta de las nanopartículas lipídicas también fue medido, usando el Zetasizer. Los resultados son mostrados en la Tabla 3. Para el análisis de LD, fueron dispersadas unas pocas gotas de nanopartículas lipídicas en 100 mL de agua desionizada, para así obtener un valor de oscurecimiento entre el 5% y el 30%. La muestra fue mantenida circulándose dentro de la unidad de dispersión a una velocidad de bomba de 1500 revoluciones por minuto. Al menos tres medidas fueron tomadas para cada muestra y los datos fueron tratados usando la presentación 5NFD (partícula RI = [1,456, 0,01] como partes verdaderas e imaginarias respectivamente, y dispersante RI=1,3300). El análisis de PCS-TAMAÑO fue llevado a cabo usando agua MilliQ filtrada (0,2 \mum) como medio de dispersión. La concentración de formulación de las nanopartículas lipídicas usada para el análisis fue de aproximadamente 1 \mul/ml, para así obtener un valor de velocidad de recuento por debajo de 500 Kcps. Para el análisis del Potencial Z de las nanopartículas lipídicas fue usada una solución de NaCl acuosa filtrada (0,2 \mum) con una conductividad de aproximadamente 50 \muS (medida exactamente con un conductímetro) como dispersante. La concentración de la formulación de nanopartículas lipídicas para este análisis fue de aproximadamente 0,3 \mul/ml, para obtener una velocidad de recuento de alrededor de 3000-
3500 Kcps.

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Resultados biológicos

Ejemplo 12

Ensayo in vitro

Los resultados mostrados en la figura 9 confirman que el método de preparación de nanopartículas lipídicas no causó ninguna modificación principal de la actividad del fármaco. Se ha mostrado en el ensayo de células de glándula pituitaria de rata, llevado a cabo como se describe en este documento.

Un cultivo primario de células de glándula pituitaria de rata fue establecido comenzando con la digestión enzimática de glándulas de glándula pituitaria eliminadas de ratas hembras. Las células recuperadas fueron puestas en placas a 2,5 x 10^{5}/pocillo en una placa de 24 pocillos y fueron cultivadas durante 72 horas a 37ºC y con 5% de
CO_{2}.

Los pocillos fueron lavados tres veces y luego fueron tratados durante 24 horas con 0,75, 1,5, 3, 6, y 12 ng/ml de tres formulaciones de nanopartículas-Antide lipídicas (LN27, LN28 y LN29) o en el estándar de Antide de referencia doméstico por triplicado. Los pocillos para el nivel basal y el máximo de LH secretada recibieron un medio de cultivo solo.

Entonces, después del lavado, las muestras y las diluciones de referencia de Antide fueron renovadas y LHRH (10^{-8} M) fue añadido en todos los pocillos excepto en los pocillos basales que recibieron un volumen igual del medio de cultivo. El medio acondicionado de cada pocillo fue recogido después de 4 horas de incubación (37ºC, 5% de CO_{2}) y fue almacenado a -20ºC hasta que se analizó por su contenido de LH.

Para la evaluación de la LH secretada, fue usado un RIA comercial (Amersham Pharmacia Biotech). Los resultados fueron expresados como porcentaje de inhibición de secreción de LH por Antide.

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Ejemplo 13

Ensayo in vivo

Ratas Sprague Dawley machos adultos (de 63-70 días y aproximadamente 300 g) fueron usadas en el estudio. La dieta estaba disponible "ad libitum" para todos los animales. También se les ofrecieron agua potable a los animales "ad libitum".

Las formulaciones de ensayo que contenían nanopartículas lipídicas de Antide fueron administradas como una dosis subcutánea sola de 0,6 mg (aproximadamente 2 mg/kg) como Antide a cada grupo de ratas por ruta subcutánea. Las nanopartículas lipídicas de Antide fueron administradas en una solución acuosa de glucosa de aprox.
5%.

El contenido de nanopartículas en el vehículo fue de aproximadamente 120 mg/ml. El volumen de administración fue de 400 \mul por rata.

Fue seguido el diseño experimental siguiente:

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2

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Los compuestos fueron administrados a animales que estuvieron en ayunas de la noche a la mañana antes de la administración.

A los animales de los grupos 1-4 aproximadamente 0,5-1 ml de sangre les fue extraída a partir de una vena sublingual o de la cola en cada tiempo de muestreo hasta 8 horas. A las 24 horas (72 horas para el grupo 1) los animales fueron anestesiados con éter y fueron sacrificados por exsanguinación de la aorta abdominal.

A los animales de los grupos 5-8 se les extrajo una muestra por exsanguinación de la aorta abdominal en los tiempos de muestreo indicados.

La sangre fue recogida en tubos heparinizados y el plasma fue separado por centrifugación (2500 x g) a 4ºC. El plasma obtenido en el sacrificio fue dividido en 3 alícuotas de al menos 1 ml.

Las concentraciones de plasma de Antide fueron determinadas por un método HPLC con detección por espectrometría de masas (HPLC/MS/MS). Tales resultados del pK se muestran en la figura 10.

El marcador farmacodinámico de testosterona fue medido en todas las muestras de plasma tomadas en el
sacrificio.

Los niveles de testosterona fueron determinados usando un kit de RIA de Diagnostic Product Corporation
(DPC).

Los resultados obtenidos son expresados en la Tabla 4, que muestra que la producción de testosterona en realidad fue inhibida durante un período corto después de la administración, indicando una liberación sostenida de Antide. Además, el 0,0 \pm 0,0 de la concentración de testosterona en plasma obtenido un día después de la administración realmente indica una supresión total de los niveles de testosterona.

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TABLA 1 Carga máxima de Antide en los lípidos preseleccionados, y contenido de monoglicérido de los lípidos

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3

TABLA 2 Transiciones térmicas principales de mezclas lípido/lípido (los números entre paréntesis en la segunda columna se refieren a transiciones térmicas secundarias)

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4

TABLA 3 Caracterización fisicoquímica de lotes de nanopartículas lipídicas con diferentes composiciones

5

TABLA 4 Niveles de plasma de testosterona en los días t = 0, t = 1 y t = 8 días después de la administración s.c. en ratas (se muestran los valores promedio de la concentración de testosterona en plasma y la desviación típica correspondiente (SD) en ng/mL)

6

Claims

1. Nanopartículas lipídicas que comprenden un fármaco, una matriz lipídica y un tensioactivo, caracterizadas porque dicho fármaco es un péptido o una proteína y dicha matriz lipídica tiene un contenido de monoglicéridos que es al menos 70% p/p, estando el porcentaje basado en el peso de la matriz lipídica, en el que dichas nanopartículas están en el intervalo de 1 nm a 3.000 nm.

2. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque dicho contenido de monoglicérido está comprendido entre 75 y 99% p/p, estando basado el porcentaje en el peso de la matriz lipídica.

3. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizadas porque dichas nanopartículas lipídicas también comprenden un co-tensioactivo.

4. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque dicho fármaco es una proteína.

5. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque dicho fármaco es un péptido.

6. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque dicho fármaco es un péptido seleccionado a partir del grupo que consiste en análogos de LHRH.

7. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizadas porque dicho péptido es un decapéptido que actúa como antagonista de LHRH.

8. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, caracterizadas porque dicho decapéptido es N-Ac-D-2-Nal-D-pClPhe-D-3-Pal-Ser- NicLys-D-NicLys-Leu-llys-Pro-D-Ala-NH_{2}.

9. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, caracterizadas porque dicho decapéptido es cetrorelix.

10. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque dicho tensioactivo se selecciona a partir de fosfolípidos sintéticos, sus derivados hidrogenados y sus mezclas, esfingolípidos y glicoesfingolípidos, ácidos grasos saturados o insaturados, alcoholes grasos, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, ácidos grasos etoxilados así como sus ésteres o éteres, o una combinación de dos o más de los anteriores.

11. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizadas porque dicho tensioactivo es dimiristoil-fosfatidil-glicerol.

12. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque dicho co-tensioactivo se selecciona a partir del grupo que consiste en butanol, ácido butírico, ácido hexanoico, colato de sodio, taurocolato de sodio o glicocolato de sodio.

13. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizadas porque dichas nanopartículas también comprenden otros excipientes farmacéuticamente aceptables.

14. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizadas porque tales excipientes son polímeros con propiedades potenciadoras de la absorción o bioadhesivas seleccionadas a partir del grupo que consiste en polímeros acrílicos, ácidos grasos de cadena media y polietilenglicoles.

15. Nanopartículas lipídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso como un medicamento.

16. Una composición farmacéutica que contiene nanopartículas lipídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente.

17. El procedimiento para la producción de nanopartículas lipídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende o consiste en las etapas de:

\bullet: incorporar el fármaco en la fase lipídica y disolver el tensioactivo y opcionalmente el co-tensioactivo en la fase acuosa, en condiciones de calentamiento controladas

\bullet: mezclar la fase lipídica con la fase acuosa

\bullet: aplicar una homogeneización a alta presión a la preemulsión obtenida y

\bullet: enfriar la nano-emulsión en condiciones controladas de temperaturas.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque dichas etapas son llevadas a cabo a un pH comprendido entre 1 y 9.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque dicha etapa de mezcla entre la fase lipídica y acuosa es llevada a cabo a una temperatura comprendida entre 30ºC y 90ºC.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque dicha etapa de homogeneización a alta presión es llevada a cabo a una temperatura comprendida entre 30ºC y 90ºC.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque dicha etapa de homogeneización a alta presión es llevada a cabo a una presión comprendida entre 50 bares y 2000 bares.

22. Nanopartículas lipídicas obtenidas por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-21.