ES2291407T3 - Metodos y aparatos para ensayos de luminiscencia mejorados. - Google Patents
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Abstract
Un aparato para realizar un ensayo de unión para un analito de interés en una muestra, basado en la medición de la electroquimioluminiscencia de una superficie de un electrodo, que comprende: a) una celda electroquímica que tiene un volumen para albergar muestras y medios de entrada y salida; b) un sistema de electrodo de trabajo para proporcionar energía electroquímica para provocar la electroquimioluminiscencia; c) un dispositivo de control del voltaje para suministrar señales de voltaje al sistema del electrodo de trabajo; d) un imán colocado en una orientación apropiada y en estrecha proximidad al electrodo de trabajo, de forma que las partículas magnéticamente sensibles se concentrarán en la superficie del electrodo de trabajo, en donde dicho imán está colocado por debajo de dicho electrodo y en donde dicho imán es capaz de ser retirado de la superficie del electrodo; e) un dispositivo de detección/medición de la luz para medir la electroquimioluminiscencia provocada en la superficie del electrodo; y f) una bomba para proporcionar el transporte de fluido hacia, a través y desde la celda electroquímica.
Description
Métodos y aparatos para ensayos de luminiscencia
mejorados.
Esta solicitud es una continuación en parte de
la solicitud de Massey et al. en trámite nº de serie
07/652.427, presentada el 6 de febrero de 1991, que a su vez es una
continuación en parte de la solicitud nº de serie 266.882,
presentada el 3 de noviembre de 1988, actualmente abandonada,
titulada "Ensayos electroquimioluminiscentes"; esta solicitud
es también una continuación en parte de la solicitud nº de serie
539.389, presentada el 18 de junio de 1990, que es una continuación
de la solicitud nº de serie 266.882. Se hace referencia también a
la solicitud presentada al mismo tiempo de Massey et al., nº
de serie 07/827.269, titulada "Método y aparato para un ensayo de
luminiscencia basado en micropartículas magnéticas que incluye una
pluralidad de imanes" (expediente CMS
370068-3401), que es también una continuación en
parte de la solicitud nº de serie 07/652.427.
Esta solicitud se refiere generalmente a métodos
y aparatos para realizar ensayos de unión, más particularmente a
los que miden la presencia de un analito de interés midiendo la
luminiscencia emitida por uno o más componentes marcados del
sistema de ensayo. Más específicamente, la invención se refiere a
ensayos de unión específicos homogéneos o heterogéneos exactos,
reproducibles y precisos de sensibilidad mejorada, en los que el
componente luminiscente es concentrado en la composición del ensayo
y recogido en el sistema de detección antes de que se provoque la
electroquimioluminiscencia.
Se han desarrollado numerosos métodos y sistemas
para la detección y cuantificación de analitos de interés en
sustancias bioquímicas y biológicas. Los métodos y sistemas que son
capaces de medir cantidades residuales de microorganismos,
productos farmacéuticos, hormonas, virus, anticuerpos y ácidos
nucleicos y otras proteínas son de gran utilidad para investigadores
y facultativos.
Se ha desarrollado una estructura muy sustancial
de la técnica basada en reacciones de unión bien conocidas, por
ejemplo, reacciones antígeno-anticuerpo, técnicas de
hibridación de ácidos nucleicos y sistemas de
proteínas-ligandos. El elevado grado de especifidad
en muchos sistemas de unión bioquímicos y biológicos ha conducido a
muchos métodos y sistemas de ensayo de utilidad en la investigación
y diagnósticos. Normalmente, la existencia de un analito de interés
está indicada por la presencia de o ausencia de un "marcador"
observable unido a uno o más de los materiales de unión. Son de
particular interés los marcadores que se pueden hacer entrar en
luminiscencia a través de medios fotoquímicos, químicos y
electroquímicos. La "fotoluminiscencia" es el procedimiento por
el que se induce que un material entre en luminiscencia cuando
absorbe una radiación electromagnética. La fluorescencia y
fosforescencia son tipos de fotoluminiscencia. Los procedimientos
"quimioluminiscentes" entrañan la creación de especies
luminiscentes por transferencia o energía química. La
"electroquimioluminiscencia" entraña la creación de especies
luminiscentes por vía electroquímica.
Se han desarrollado técnicas de ensayos
quimioluminiscentes en las que una muestra que contiene un analito
de interés se mezcla con un reactivo marcado con un marcador
quimioluminiscente. La mezcla de reacción se incuba y alguna parte
del reactante marcado se une al analito. Después de incubar, las
fracciones unidas y sin unir de la mezcla se separan y se puede
determinar la concentración del marcador en cualquiera o en las dos
fracciones por técnicas quimioluminiscentes. El nivel de
quimioluminiscencia determinado en una o en las dos fracciones
indica la cantidad de analito de interés de la muestra
biológica.
Las técnicas de ensayos
electroquimioluminiscentes (ECL) son una mejora de las técnicas
quimioluminiscentes. Proporcionan una medición sensible y precisa
de la presencia y concentración de un analito de interés. En tales
técnicas, la muestra incubada se expone a un de trabajo
voltamétrico con el fin de provocar la luminiscencia. En el entorno
químico apropiado, tal electroquimioluminiscencia es provocada por
un voltaje que se imprime sobre el electrodo de trabajo en un
tiempo particular y de una manera particular. La luz producida por
el marcador se mide e indica la presencia o cantidad del analito.
Para una descripción más detallada de tales técnicas de ECL, se
hace referencia a la solicitud PCT publicada US85/01253
(WO86/02734), solicitud PCT publicada número US87/00987 y solicitud
PCT publicada U.S. 88/03947.
Es deseable llevar a cabo ensayos
electroquimioluminiscentes sin necesidad de una etapa de separación
durante el procedimiento del ensayo y maximizar la modulación de la
señal a diferentes concentraciones de analito, de forma que se
puedan hacer mediciones precisas y sensibles. Entre los métodos de
la técnica anterior para ensayos que no son de separación están los
que emplean una materia en forma de micropartículas puesta en
suspensión en la muestra de ensayo para unirse a uno o más de los
componentes de unión del ensayo.
La patente de EE.UU. nº 4.305.925 se refiere a
la detección y determinación de proteínas y péptidos clínicamente
relevantes por medio de métodos nefelométricos y turbidimétricos.
Los métodos descritos incluyen la unión del antígeno o anticuerpo a
partículas de látex que realizan la función de dispersión o
adsorción de la luz.
La patente de EE.UU. nº 4.480.042 se refiere a
técnicas que emplean reactivos de partículas que consisten en
partículas de núcleo-corteza. La corteza contiene
grupos funcionales a los que se pueden unir covalentemente los
compuestos de interés biológico, y el elevado índice de refracción
del núcleo da lugar a una elevada sensibilidad a las mediciones de
dispersión de la luz. La técnica se basa en reacciones de
aglutinación que resultan de la reacción de anticuerpos divalentes
con antígenos multivalentes de interés para producir agregados que
pueden ser detectados y/o medidos de diversas formas.
La patente de EE.UU. nº 4.419.453 se refiere
análogamente al uso de métodos de ensayo de aglutinación en látex
coloreado útiles para detectar la presencia de productos
inmunoquímicos tales como anticuerpos e inmunogenes.
Basándose en esta técnica anterior, no habría
parecido posible usar una materia en forma de micropartículas en
ensayos en los que se mide un fenómeno luminiscente. Se podría
esperar que la luminiscencia de restos quimioluminiscentes o
electroquimioluminiscentes sería absorbida, dispersada o sufriría de
alguna otra forma la interferencia de la materia en forma de
micropartículas.
Contrariamente a lo esperado, a solicitud de
EE.UU. nº de serie 539,3898 (solicitud PCT publicada U.S. 89/04919)
expone métodos de ensayos de unión sensibles y específicos basados
en un fenómeno luminiscente en el que una materia en forma de
micropartículas inertes se une específicamente a uno de los
reactantes de unión del sistema de ensayo. Los ensayos se pueden
realizar en un formato de ensayo heterogéneo (una o más etapas de
separación) y pueden ser usados lo más ventajosamente en un formato
de ensayo homogéneo (sin separación).
El documento US 89/04919 se refiere a una
composición para un ensayo basado en una reacción de unión para la
medición de un fenómeno luminiscente, composición que incluye una
pluralidad de partículas en suspensión que tienen una superficie
capaz de unirse a un componente en la mezcla del ensayo. En otro
aspecto, se elige a un sistema para detectar o cuantificar un
analito de interés en una muestra, sistema que es capaz de realizar
los métodos del ensayo usando composiciones de ensayo de las
invenciones. El sistema incluye medios para inducir el compuesto
marcado en el medio del ensayo a entrar en luminiscencia, y medios
para medir la luminiscencia, para detectar la presencia del analito
de interés en la muestra.
Se encontró que la unión del componente del
sistema de ensayo al que se había enlazado un resto
electroquimioluminiscente, a la materia en forma de partículas en
suspensión, modulaba grandemente la intensidad de la señal
luminiscente generada por el resto electroquimioluminiscente
enlazado a este componente, proporcionando así un medio para
verificar la reacción de unión específica del sistema de ensayo.
Incluso más sorprendentemente, se encontró que las partículas en
suspensión tenían poco o ningún efecto sobre la intensidad de la
señal luminiscente generada por el resto electroquimioluminiscente
enlazado al componente del sistema que permanecía sin unirse a la
materia en forma de micropartículas en suspensión.
Por tanto, el documento U.S. 89/04919 se dirige
a métodos para la detección de un analito de interés en una
muestra, método que incluye las etapas de (1) formar una composición
que comprende (a) una muestra que se sospecha que contiene un
analito de interés, (b) una sustancia de realización del ensayo
seleccionada entre el grupo que consiste en (i) el analito de
interés o un análogo del analito de interés, (ii) un asociado de
unión al analito de interés o su dicho análogo, y (iii) un
componente reactivo capaz de unirse con (i) o (ii), en los que una
de dichas sustancias está enlazada a un compuesto marcador que tiene
un resto químico capaz de inducir luminiscencia, y (c) una
pluralidad de partículas en suspensión capaces de unirse
específicamente al analito y/o a una sustancia definida en (b) (i),
(ii) o (iii); (2) incubar la composición para formar un complejo
que incluye una partícula y dicho compuesto marcador; (3) inducir el
compuesto marcador a entrar en luminiscencia; y (4) medir la
luminiscencia emitida por la composición para detectar la presencia
de analito de interés en la muestra. Esos mismos métodos se pueden
usar para cuantificar la cantidad de analito en una muestra
comparando la luminiscencia de la composición del ensayo con la
luminiscencia de una composición que contenga una cantidad conocida
de analito.
Los análogos del analito de interés, que pueden
ser naturales o sintéticos, son compuestos que tienen propiedades
de unión comparables al analito, pero incluyen también compuestos de
capacidad de unión superior o inferior. Los asociados de unión
adecuados para ser usados en la presente invención son bien
conocidos. Son ejemplos los anticuerpos, enzimas, ácidos nucleicos,
lecitinas, cofactores y receptores. Los componentes reactivos
capaces de unirse con el analito o su análogo y/o con un asociado de
unión de los mismos pueden ser un segundo anticuerpo o proteína tal
como Proteína A o Proteína G o puede ser avidina o biotina u otro
componente que se conoce en la técnica que interviene en reacciones
de unión.
Ventajosamente, la luminiscencia surge de la
electroquimioluminiscencia (ECL) inducida por la exposición del
compuesto marcador, ya sea unido o sin unir a asociados de unión
específicos, a un electrodo de trabajo voltamétrico. Se provoca que
la mezcla reactiva ECL emita controladamente una luz por un voltaje
impreso sobre el electrodo de trabajo en un tiempo particular y de
una manera particular para generar luz. Aunque la emisión de luz
visible es una característica ventajosa, la composición o sistema
puede emitir otros tipos de radiación electromagnética, tal como
luz infrarrojos o ultravioleta, rayos X, microondas, etc. El uso de
los términos "electroquimioluminiscencia",
"electroquimioluminiscente", "luminiscencia",
"luminiscente" y "luminiscencia" incluye la emisión de luz
otras formas de radiación electromagnética.
\newpage
Los métodos expuestos en el documento WO
90/05301 permiten la detección y cuantificación de cantidades
extremadamente pequeñas de analitos en una diversidad de ensayos
realizados en establecimientos de investigación y clínicos. Las
exigencias de los investigadores y facultativos hace imperativo, sin
embargo, disminuir los límites de detección de los ensayos
realizados mediante estos métodos para aumentar las sensibilidades
de esos ensayos y aumentar la velocidad a que se pueden
realizar.
Se conocen diversos métodos en la técnica para
aumentar la señal de especies marcadas concentrándolas antes de
someterlas a una etapa de medición. En la patente de EE.UU. nº
4.652.333, por ejemplo, las partículas marcadas con marcadores
fluorescentes, fosforescentes o fluorescentes atómicos se concentran
por microfiltración antes de que se realice una etapa de
medición.
Es conocido también en la técnica concentrar
especies inmunoquímicas marcadas antes de una etapa de medición,
por ejemplo, atrayendo partículas marcadas magnéticamente sensibles
a la superficie de un recipiente de medición. En las patentes de
EE.UU. nº 4.731.337, 4.777.145 y 4.115.535, por ejemplo, tales
partículas son atraídas a la pared del recipiente y seguidamente son
irradiadas para excitar una emisión flourofórica de luz.
En la patente de EE.UU. nº 4.945.045, las
partículas son concentradas sobre un electrodo magnético. Tiene
lugar una reacción electroquímica en el electrodo facilitada por un
mediador químico marcado. La reacción de unión inmunoquímica altera
la eficacia del mediador, dando lugar a una señal modulada cuando
tiene lugar la unión.
Estos métodos de la técnica anterior no son
relevantes para los procedimientos de excitación selectiva
superficial de la invención. Aunque no hay vinculación alguna a
ninguna explicación mecanística particular de excitación
superficial, por ejemplo, electroquimioluminiscencia, se cree que el
marcador sobre el complejo de fase sólida debe ser oxidado en el
electrodo. Esto requiere que un electrón se traslade desde el
marcador al electrodo. Se cree que el electrón hace este
"salto" mediante un fenómeno conocido como tunelación, en el
que el electrón pasa a través del espacio (una zona en la que su
energía potencial es muy elevada, por ejemplo, la solución) sin
tener que ir "sobre" la barrera de energía potencial. Puede
tener un efecto de túnel a través de la barrera de energía y, por
tanto, trasladarse de una molécula a otra o de una molécula a un
electrodo sin ningún aporte adicional de energía. Sin embargo, este
fenómeno de túnel solamente puede funcionar para distancias muy
cortas. La probabilidad del fenómeno de túnel cae exponencialmente
a medida que aumenta la distancia entre las dos especies. La
probabilidad de que el fenómeno de túnel se produzca entre dos
especies es bastante elevada si la distancia es menor que 25
Angstoms (2,5 nm) pero es bastante baja si la distancia es mayor. La
distancia de 25 \ring{A} es una regla empírica usada por los
expertos en la técnica, pero no es una limitación absoluta.
Consecuentemente, solamente los marcadores de
ECL dentro de 25 \ring{A} de la superficie del electrodo se puede
esperar que participen en el procedimiento de ECL. El área de
partícula que está dentro de 25 \ring{A} de la superficie de un
electrodo es de forma típica extremadamente pequeña.
Consecuentemente, no sería de esperar que la ECL
de una superficie de una partícula fuera medible en ningún grado
significativo. Además de ello, la luz que es producida por el
procedimiento de ECL debe pasar a través de la partícula para
alcanzar el fotomultiplicador. Como las partículas son esencialmente
opacas (una suspensión concentrada de las mismas es negra) no sería
de esperar, incluso si se pudieran producir cantidades
significativas de luz por ECL, que la luz pudiera pasar a través de
la partícula y ser medida por el fotomultiplicador.
Por lo tanto, es un objeto principal de esta
invención proporcionar métodos homogéneos (sin separación) y
heterogéneos (separación), reactivos y aparatos para la realización
de ensayos de unión.
Es un objeto adicional de esta invención
proporcionar ensayos de unión específica sin separación, reactivos
y aparatos basados en la medición de electroquimioluminiscencia
emitida desde una composición de ensayo que contiene materia en
forma de micropartículas.
Es un objeto adicional y relacionado
proporcionar estos ensayos, reactivos y aparatos que tienen una
sensibilidad mejorada, tiempo de reacción más rápido, mayor
especifidad, límites de detección más bajos y mayor precisión de lo
que ha sido conseguido hasta ahora.
La expresión "resto ECL", "resto ECL que
contiene metales", "marcador", "compuesto marcado" y
"sustancia marcada" se usan de forma intercambiable. Está
dentro del alcance de la invención para las especies denominadas
"resto ECL", "resto ECL que contiene metales",
"organo-metálico", "quelato metálico",
"quelato de metal de transición", "quelato de metal de
tierras raras", "compuesto marcado", "sustancia
marcada" y "marcador" estén enlazados a moléculas tales
como un analito o análogo del mismo, un asociado de unión del
analito o un análogo del mismo y asociados de unión adicionales de
tal asociado de unión anteriormente mencionado, o un componente
reactivo de unión con el analito, o análogo del mismo, o un
asociado de unión como se mencionó anteriormente. Las especies
anteriormente mencionadas pueden estar también enlazadas a una
combinación de uno o más asociados de unión y/o uno o más
componentes reactivos. Adicionalmente, las especies anteriormente
mencionadas pueden estar enlazadas también a un analito o su
análogo unido a un asociado de unión, un componente reactivo o una
combinación de uno o más asociados de unión y/o uno o más
componentes reactivos. Está también dentro del alcance de la
invención para una pluralidad de las especies anteriormente
mencionadas que estén unidas directamente o a través de otras
moléculas, como se expuso anteriormente, a un analito o su análogo.
Para fines de brevedad, estos ligandos se denominan una sustancia de
realización del ensayo.
Los términos detección y cuantificación se
denominan "medición", debiendo entenderse que la cuantificación
puede requerir la preparación de composiciones y calibraciones de
referencia.
Los términos "recogida y concentración de un
complejo" se pueden usar de forma intercambiable para describir
la concentración de un complejo dentro de la composición del ensayo
y la recogida del complejo, por ejemplo, en la superficie del
electrodo.
La Fig. 1 es un dibujo esquemático de una celda
para realizar los ensayos de la invención de no separación y de
separación basados en micropartículas.
La Fig. 2 es un diagrama simplificado de un
aparato de control del voltaje para ser usado con la celda de la
Fig. 1.
La Fig. 3 es una representación esquemática de
un formato de PCR de incorporación directa que usa oligonucleótidos
marcados electroquimioluminiscentes y oligonucleótidos marcados
electroquimioluminiscentes de biotina como cebadores.
La Fig. 4 es una representación esquemática de
un formato de PCR normal que usa un cebador biotinilado para
permitir la generación de PRODUCTO DE PCR biotinilado.
La Fig. 5 es una representación esquemática de
un formato de ensayo de PCR asimétrico que genera DNA biotinilado de
cadena única para la posterior hibridación a oligonucleótidos
marcados electroquimioluminiscentes.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra estudios de
especifidad de la incorporación directa de oligonucleótidos marcados
electroquimioluminiscentes en productos de PCR biotinilados.
La Fig. 7 es una curva estándar de marcador
electroquimioluminiscente y oligonucleótidos biotinilados
directamente incorporados en productos de PCR HPV16.
La Fig. 8 es un gráfico que muestra un ensayo de
mutación puntual para el oncogen Ha-ras.
La Fig. 9 es un gráfico que muestra una
evaluación de la especifidad de las sondas marcadas
electroquimioluminiscentes que usan sondas marcadas
electroquimioluminiscentes de P^{32} para el oncogen
Aa-ras.
La Fig. 10 es un gráfico que muestra la
determinación del valor relativo del marcador
electroquimioluminiscente en el marcador electroquimioluminiscente
de P^{32} para la determinación de mutaciones puntuales en el
oncogen Aa-ras.
La Fig. 11 es una curva estándar del ensayo de
hibridación "sin lavado" rápido para HPV18.
La Fig. 12 es una representación esquemática de
una celda de ensayo usada para realizar ensayos que se basan en la
fuerza de gravedad para causar que el complejo sedimente.
La Fig. 13 es un gráfico que muestra la
distancia en que sedimenta el complejo como una función del tiempo
bajo la influencia de la gravedad; a saber, una velocidad de
sedimentación de Partículas Dynal (Y=-0,28+0,48 x; velocidad = 0,5
mm por minuto).
La Fig. 14 es un gráfico que muestra la
intensidad de la electroquimioluminiscencia como una función del
tiempo en celdas de gravedad que tienen alturas diferentes de
composición del ensayo sobre el electrodo, es decir, una comparación
de la relación intensidad-tiempo para dos grosores
de las juntas, en el que los valores representados por los círculos
vacíos son para una junta de 0,038 centímetros y los valores
representados por los círculos oscuros son para una junta de 0,19
centímetros.
La Fig. 15 es un gráfico que muestra la
intensidad de la electroquimioluminiscencia en celdas de gravedad
que tienen diferentes alturas de composición del ensayo en la
superficie del electrodo, según se miden para la medición de
proteína fetal alfa, es decir, una comparación de celdas para un
ensayo AFP, en el que los valores representados por los círculos
vacíos son para una junta de 0,038 centímetros y los valores
representados por los círculos oscuros son para una junta de 0,29
centímetros.
La Fig. 16 es una representación esquemática de
una celda de ensayo de sedimentación que emplea un electroimán para
causar que el complejo sedimente en la superficie del electrodo.
La Fig. 17 es un gráfico que muestra las
velocidades relativas de asentamiento de un complejo en forma de
micropartículas bajo la influencia de un campo magnético y de la
gravedad, respectivamente, es decir, una comparación de los tiempos
de asentamiento de micropartículas entre un asentamiento inducido
por campo magnético y un asentamiento por gravedad, en el que los
valores para el asentamiento por campo magnético están representados
por círculos vacíos y los valores para el asentamiento por gravedad
están representados por círculos oscuros.
La Fig. 18 es una representación esquemática de
una celda de recogida que incluye un imán permanente.
La Fig. 19 es un gráfico que muestra el aumento
en la intensidad de ECL como una función del tiempo en ensayos
realizados con la celda de la Fig. 18, es decir, el efecto del
tiempo de recogida sobre la intensidad de la ECL.
La Fig. 20 es una representación esquemática de
las líneas de fuerza en las proximidades de la superficie del
electrodo como una función de la orientación del imán por debajo de
la superficie del electrodo.
La Fig. 21 es una representación esquemática de
una celda de flujo rotatorio en la que los complejos se depositan en
la superficie del electrodo por centrifugación; el método y aparato
de centrifugación de la invención para capturar partículas y la
celda de flujo centrífugo de la invención.
La Fig. 22 es una representación esquemática de
una detección de fluorescencia de ondas evanescentes.
Las Figs. 23 y 24 muestran una celda y una
pluralidad de imanes para realizar la separación basada en
micropartículas magnéticas o el método de ensayo de no separación de
la invención; la pluralidad de imanes o el sistema de imanes impone
las líneas de campo que son mayormente paralelas al plano de la
superficie del electrodo.
La Fig. 25 es un dibujo esquemático de una celda
para realizar los ensayos de no separación y de separación basados
en micropartículas de la invención; la celda emplea un electrodo de
trabajo y una pluralidad de imanes como en las Figs. 23 y 24.
En su realización más amplia, la invención es un
método para realizar un ensayo de unión para un analito de interés
presente en una muestra. Las etapas incluyen:
(a) formar una composición que contiene
- (i)
- dicha muestra
- (ii)
- una sustancia de rendimiento en el ensayo que contiene un componente unido a un compuesto marcador capaz de ser inducido a luminiscencia, y
- (iii)
- una pluralidad de partículas capaces de unirse específicamente al analito y/o dicha sustancia de rendimiento en el ensayo;
(b) incubar dicha composición para formar un
complejo que incluye una partícula y dicho compuesto marcador;
(c) recoger dicho complejo en una zona de
medición;
(d) inducir la luminiscencia de dicho compuesto
marcador por excitación superficial selectiva; y
(e) medir la luminiscencia emitida para medir la
presencia del analito de interés en la muestra.
El complejo puede ser recogido, por ejemplo, en
una superficie de un electrodo en la que es excitado e inducido a
una electroquimioluminiscencia, como imponiendo un voltaje sobre el
electrodo, o puede ser recogido en una superficie y posteriormente
inducido a fluorescer mediante excitación superficial, como se
describe con posterioridad. La fluorescencia de reflexión interna
total (TIRF) ha sido descrita como una técnica sensible en
superficies para excitar y detectar marcadores fluoróforos y la
reflexión interna total ha sido usada con RAMAN y absorción de
infrarrojos como otra técnica sensible en superficies para medir la
presencia de un marcador. La resonancia de plasmón superficial es
una técnica óptica que puede ser usada según los métodos de la
invención para medir marcadores en superficies. Por tanto, la
invención está dirigida a métodos para excitar luminiscencia
mediante técnicas de excitación de superficies.
Aunque la invención se lleva a cabo
preferentemente recogiendo el complejo en una zona de medición, es
decir, en una superficie en la que se puede provocar una
luminiscencia, la invención abarca también métodos en los que el
complejo se recoge fuera de una zona de medición y posteriormente se
llevan medios a esa zona o se pueden adoptar otras etapas para
inducir y medir la luminiscencia.
La recogida del complejo se puede llevar a cabo
mediante diversos métodos diferentes, incluidas la sedimentación
por gravedad, filtración, centrifugación y atracción magnética de
partículas con sensibilidad magnética que forman parte del complejo.
La diversas realizaciones se describen más en detalle con
posterioridad.
Los ensayos basados en la medición de la
electroquimioluminiscencia en una superficie del electrodo se llevan
a cabo ventajosamente usando las fuerzas de la gravedad por medio
de
(a) formar una composición que contiene
- (i)
- dicha muestra
- (ii)
- una sustancia de realización del ensayo que contiene un componente enlazado a un compuesto marcador capaz de ser inducido a entrar en electroquimioluminiscencia; y
- (iii)
- una pluralidad de partículas en suspensión que tienen una densidad mayor que el resto de dicha composición y que son capaces de unirse específicamente con el analito y/o dicha sustancia de realización del ensayo;
(b) incubar dicha composición para formar un
complejo que incluye una partícula y dicho compuesto marcador;
(c) introducir dicha composición en una celda de
ensayo;
(d) recoger dicho complejo en la superficie de
un electrodo colocado por debajo de al menos una parte sustancial
del volumen de dicha celda de ensayo, permitiendo que dicha
composición resida en dicha celda durante un tiempo suficiente para
permitir que las partículas sedimenten sobre dicha superficie de un
electrodo por la fuerza de la gravedad;
(e) inducir el compuesto marcador en dicho
complejo recogido a entrar en electroquimioluminiscencia imponiendo
un voltaje sobre dicho electrodo; y
(f) medir la luminiscencia emitida para medir la
cantidad de analito de interés en la muestra.
Aunque se pueden realizar ensayos discontinuos,
se pueden realizar ensayos continuos o semicontinuos en celdas de
flujo. En una celda de flujo, la fase sólida permanece en la celda
de medición, mientras que la solución fluye a su través y sale de
la celda. Si la fase sólida (por ejemplo, partículas) es más densa
que el agua, es decir, tiene una densidad mayor que la del agua
(más de 1,0 g/ml) la fuerza de gravedad sobre las partículas causa
que caigan al fondo de la celda. La celda se puede construir de
forma que las partículas sedimenten en el fondo a medida que el
fluido fluye a través de la celda, o la celda se puede construir de
forma que la mayoría de la muestra esté contenida en la celda en un
compartimento en columna por encima del electrodo de trabajo de un
sistema de ECL. Se debe proporcionar un tiempo de residencia
suficiente en la celda para permitir que las partículas sedimenten
en la superficie del electrodo antes de inducir la ECL.
En otra realización de la invención, la
composición del ensayo que contiene partículas en suspensión que
tienen una densidad mayor que el resto de la composición del ensayo
se puede someter a centrifugación con el fin de separar las
partículas a una zona de medición en la que se ponen posteriormente
en contacto, por ejemplo, con un electrodo, para inducir la
electroquimioluminiscencia, o se ponen directamente en contacto con
un electrodo en la etapa de centrifugación.
En esta realización, la celda de medición está
provista con medios para rotar rápidamente la muestra y el recinto
de la muestra. La fuerza centrífuga causa que las partículas en la
muestra se muevan hacia fuera del eje de rotación del recinto de la
muestra y se recojan en la superficie externa del recinto de la
muestra. Las superficies externas de tal recinto de la muestra
pueden constituir el electrodo de trabajo en sistema de medición de
ECL.
En una tercera realización, las partículas se
pueden separar por filtración de la composición del ensayo. En esta
realización, las partículas no necesitan tener una densidad mayor
que el resto de la composición del ensayo. Las partículas se
separan de la solución y se concentran haciendo pasar la solución a
través de un filtro, por ejemplo, bombeando y recogiendo las
partículas en la superficie del filtro. Esta superficie del filtro,
por ejemplo, está revestida con una película metálica delgada que
puede servir como el electrodo de trabajo en un sistema de detección
de ECL.
En una realización preferida, las partículas en
suspensión son magnéticamente sensibles, por ejemplo, pueden ser
paramagnéticas o ferromagnéticas, y se recogen en una zona de
medición o, preferentemente, directamente en la superficie de un
electrodo, mediante la imposición de un campo magnético sobre las
partículas. La celda de medición está equipado con un imán. El
campo magnético del imán aplica una fuerza sobre las partículas
mientras éstas residen en una celda discontinua o a medida que
fluyen a través de una celda de flujo, causando que se separen del
volumen de la solución en la superficie de la celda que está en una
mayor proximidad respecto al imán. Si el imán se coloca en una
orientación apropiada y en estrecha proximidad al electrodo de
trabajo de un sistema de detección de ECL, las partículas se
concentrarán en la superficie del electrodo de trabajo.
Se pueden poner en práctica diversos formatos
heterogéneos y homogéneos diferentes para ensayos de unión, usando
los métodos anteriormente descritos para recoger y concentrar el
complejo en la superficie de un electrodo. En un ensayo de unión
heterogéneo, el complejo se separa de la composición antes de medir
la luminiscencia del marcador. En ensayos homogéneos, no se hace
ninguna separación de los reactivos marcados unidos (a la fase
sólida) y sin unir.
En un ensayo heterogéneo, cuando el complejo se
concentra en la superficie del electrodo de trabajo, la señal
medida a partir del marcador es mucho mayor de lo que sería en
ausencia de una etapa de recogida. La señal de los reactivos
marcados sin complejar, por el contrario, no es alterada. Por tanto,
a pesar de la presencia de los reactivos marcados sin complejar en
la celda de medición, la señal del complejo recogido es más fuerte
que en un ensayo sin recogida de complejo. El límite de detección
para el ensayo de unión se mejora mucho como consecuencia del
procedimiento de recogida.
En una realización preferida de la invención, se
incluye una etapa de separación in situ en el procedimiento
de ensayo homogéneo de unión. Después de que se han bombeado la
composición del ensayo, es decir, la muestra, la sustancia de
realización del ensayo y las partículas en la celda de medición y se
captura el complejo sobre el electrodo de trabajo, se bombea un
segundo fluido a través de la celda que está exento de marcador o
reactivos marcados, realizando así un lavado o separación in
situ en el complejo de los componentes sin unir de la
composición del ensayo. Este procedimiento de ensayo es técnicamente
un ensayo de unión heterogéneo. Sin embargo, la capacidad para
realizar la separación en el interior de la celda de medición es
ventajosa en cuanto que no requiere ningún aparato adicional de
separación y el procedimiento es generalmente mucho más rápido que
los métodos se separación externos.
Los ensayos de unión heterogéneos se realizan
poniendo en práctica la invención mezclando los componentes de la
composición del ensayo y permitiendo que reaccionen durante un
período de tiempo predeterminado. La composición del ensayo se
somete seguidamente a una etapa de separación en la que se separa la
solución de las partículas. Seguidamente se mide la
electroquimioluminiscencia del complejo o bien de la solución. La
medición de la ECL del complejo después de una etapa de
concentración permite una medición del analito con mayor exactitud y
con un límite de detección inferior de lo que era posible sin la
concentración.
La invención, así como otros objetos y
características de la misma, se comprenderán de forma más clara y
completa a partir de la siguiente descripción de ciertas
realizaciones preferidas.
La invención es aplicable ampliamente a analitos
de interés que son capaces de intervenir en reacciones de unión.
Estas reacciones incluyen, por ejemplo, reacciones de
antígenos-anticuerpos, receptores de ligandos,
interacciones de DNA y RNA y otras conocidas. La invención se
refiere a diferentes métodos y ensayos para detectar cualitativa y
cuantitativamente la presencia de tales analitos de interés en una
muestra multicomponentes.
La muestra que puede contener el analito de
interés puede estar en forma sólida, de emulsión, suspensión,
líquida o gaseosa, se puede suministrar, por ejemplo, a partir de
células y productos de derivados de células, agua, alimentos,
sangre, suero, cabello, sudor, orina, heces, tejidos, saliva,
aceites, disolventes orgánicos o aire. La muestra puede comprender
adicionalmente, por ejemplo, agua, acetonitrilo,
dimetil-sulfóxido,
dimetil-formamida,
N-metil-pirrolidona o alcoholes o
sus mezclas.
Los analitos típicos de interés son una célula
completa o antígeno superficial, partícula subcelular, virus,
prión, viroide, anticuerpo, antígeno, hapteno, ácido graso, ácido
nucleico, proteína, lipoproteína, polisacárido, lipopolisacárido,
glicoproteína, péptido, polipéptido, metabolito celular, hormona,
agente farmacológico, molécula orgánica sintética, molécula
organometálica, tranquilizante, barbiturato, alcaloide, esteroide,
vitamina, aminoácido, azúcar, lecitina, proteína recombinante o
derivada, biotina, avidina, estreptavidina o molécula inorgánica
presente en la muestra. Normalmente, el analito de interés está
presente a una concentración de 10^{-3} o menos, por ejemplo, tan
baja como 10^{-12} molar o inferior.
La sustancia de realización del ensayo que se
combina con la muestra que contiene el analito de interés contiene
al menos una sustancia seleccionada entre el grupo que consiste en
(i) un analito añadido de interés o su análogo, como se definió
anteriormente, (ii) un asociado de unión del analito de interés o su
dicho análogo, y (iii) un componente reactivo, como se definió
anteriormente, capaz de unirse con (i) o (ii), en donde una de
dichas sustancias está enlazada a un compuestos o resto, por
ejemplo, un resto de ECL capaz de ser inducido a entrar en
luminiscencia. La sustancia marcada puede ser una célula completa o
antígeno superficial, una partícula subcelular, virus, prión,
viroide, anticuerpo, hapteno, lípido ácido graso, ácido nucleico,
polisacárido, proteína, lipoproteína, lipopolisacárido,
glicoproteína, péptido, polipéptido, metabolito celular, hormona,
agente farmacológico, tranquilizante, barbiturato, alcaloide,
esteroide, vitamina, aminoácido, azúcar, polímero no biológico
(preferentemente soluble), lecitina, proteína recombinante o
derivada, molécula orgánica sintética, molécula organométalica,
molécula inorgánica, biotina, avidina o estreptavidina. En una
realización, el reactivo es un resto electroquimioluminiscente
conjugado a un anticuerpo, antígeno, ácido nucleico, hapteno,
secuencia pequeña de nucleótidos, oligómero, ligando, enzima o
biotina, avidina, estreptavidina, Proteína A, Proteína G o sus
complejos, u otro asociado de unión secundario capaz de unirse a un
asociado de unión primario a través de interacciones con
proteínas.
Los análogos del analito de interés, que pueden
ser naturales o sintéticos, son normalmente compuestos que tienen
propiedades de unión comparables al analito, pero pueden ser también
compuestos de capacidad de unión superior o inferior. El componente
reactivo capaz de unirse con el analito o su análogo, y/o con un
asociado del mismo, y a cuyo través se puede enlazar el resto de
ECL al analito, es adecuadamente un segundo anticuerpo o una
proteína tal como Proteína A o Proteína G, o avidina o biotina u
otro componente que se conoce en la técnica que interviene en
reacciones de unión.
Ventajosamente, los restos de ECL son quelatos
metálicos. El metal de ese quelato es adecuadamente cualquier
metal, de forma que el quelato metálico entre en luminiscencia bajo
las condiciones electroquímicas que se imponen sobre el sistema de
reacción en cuestión. El metal de tales quelatos metálicos es, por
ejemplo, un metal de transición (tal como un metal de transición
del bloque d) o un metal de tierras raras. El metal es
preferentemente rutenio, osmio, renio, iridio, rodio, platino,
indio, paladio molibdeno, tecnecio, cobre, cromo o wolframio. Son
especialmente preferidos el rutenio y el osmio.
Los ligandos que están enlazados al metal en
tales quelatos son habitualmente de naturaleza heterocíclica u
orgánica, y desempeñan una función para determinar si el quelato
metálico es soluble o no en un entorno acuoso o en un entorno
orgánico u otro no acuoso. Los ligandos pueden ser polidentados y
pueden estar sustituidos. Los ligandos polidentados incluyen
ligandos aromáticos y alifáticos. Los ligandos polidentados
aromáticos adecuados incluyen ligandos heterocíclicos aromáticos.
Los ligandos heterocíclicos aromáticos preferidos son los que
contienen nitrógeno tales como, por ejemplo, bipiridilo, bipirazilo,
terpiridilo y fenantrolilo. Los sustituyentes adecuados incluyen,
por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
aralquilo, aralquilo sustituido, carboxilato, carboxaldehído,
carboxamido, ciano, amino, hidroxi, imino, hidroxicarbonilo,
aminocarbonilo, amidino, guanidinio, ureído, grupos que contienen
azufre, grupos que contienen fósforo y el éster de carboxilato de
N-hidroxisuccinimida. El quelato puede tener uno o
más ligandos monodentados, de los que una amplia diversidad son
conocidos en la técnica. Los ligandos monodentados adecuados
incluyen, por ejemplo, monóxido de carbono, cianuros, isocianuros,
haluros y fosfolinas, aminas, estilbenos y arsinas alifáticas,
aromáticas y heterocíclicas.
Ejemplos de quelatos adecuados son
bis[(4,4'-carbometoxi)-2,2'-bipiridino]-2-[3-(4-metil-2,2'-bipiridino-4-il)propil]-1,3-dioxolano-rutenio
(II);
bis(2,2'-bipiridino)[4-(butan-1-al-4'-metil-2,2'-bipiridino]-rutenio
(II); bis(2,2'-bipiridino)[ácido
4-(4'-metil-2,2'-bipiridino-4'-il)-butírico]-rutenio
(II);
tris(2,2'-bipiridino)-rutenio
(II);
(2,2'-bipiridino)[bis-bis(1,2-difenilfosfino)etileno]-2-[3-(4-metil-2,2'-bipiridino-4'-il)propil]-1,3-dioxolano-osmio
(II);
bis(2,2'-
bipiridino)[4-(4'-metil-2,2'-bipiridino)-butilamino]-rutenio (II); bis-(2,2'-bipiridino)[1-bromo-4-(4'-metil-2,2'-bipiridino-4-il)butano]-rutenio (II); [4-metil-2,2'-bipiridino-4'-butilamida de ácido bis(2,2'-bipiridino)maleimidohexanoico]-rutenio (II). Otros restos de ECL se describen en la solicitud PCT publicada US87/00987 y en la solicitud PCT publicada 88/0394.
bipiridino)[4-(4'-metil-2,2'-bipiridino)-butilamino]-rutenio (II); bis-(2,2'-bipiridino)[1-bromo-4-(4'-metil-2,2'-bipiridino-4-il)butano]-rutenio (II); [4-metil-2,2'-bipiridino-4'-butilamida de ácido bis(2,2'-bipiridino)maleimidohexanoico]-rutenio (II). Otros restos de ECL se describen en la solicitud PCT publicada US87/00987 y en la solicitud PCT publicada 88/0394.
La función de los restos de ECL es emitir una
radiación electromagnética como consecuencia de la introducción en
el sistema de reacción de una energía electroquímica. Con el fin de
hacer estos, deben ser capaces de ser estimulados hasta un estado
de energía excitada y ser capaces también de emitir una radiación
electromagnética, tal como un fotón o luz, tras descender desde ese
estado excitado. Aunque no se desea ninguna vinculación a análisis
teóricos del mecanismo de la participación de los restos de ECL en
la reacción electroquimioluminiscente, se cree que son oxidados
mediante la introducción de energía electroquímica en el sistema de
reacción y, seguidamente, a través de una interacción con un
reductor presente en el sistema, se convierten en el estado
excitado. Este estado es relativamente inestable, y el quelato
metálico desciende rápidamente a un estado más estable. Al hacer
esto, el quelato desprende una radiación electromagnética, tal como
un fotón o luz, que es detectable.
La cantidad de quelato metálico u otro resto de
ECL que contiene metales incorporada de acuerdo con la invención
variará de un sistema a otro. Generalmente, la cantidad de tal resto
utilizada es la cantidad que sea eficaz para dar lugar a la emisión
de una energía electromagnética detectable y, si se desea,
cuantificable, a partir la composición o sistema anteriormente
mencionado. La detección y/o cuantificación de un analito de interés
se hace normalmente a partir de la comparación de la luminiscencia
de una muestra que contiene un analito de interés y un resto de ECL
con la luminiscencia emitida por un patrón de calibración
desarrollado con cantidades conocidas del analito de interés y el
resto de ECL. Esto adopta un formato homogéneo. En el modo
heterogéneo, se lleva a cabo una separación como se expuso
anteriormente antes del análisis de ECL.
Como se puede apreciar por un experto ordinario
en la técnica, la identidad y la cantidad del resto de ECL que
contiene metales variará de un sistema a otro, dependiendo de las
condiciones predominantes. El resto de ECL apropiado que contiene
metales, y su cantidad suficiente para obtener el resultado deseado,
se pueden determinar empíricamente por los expertos ordinarios en
la técnica, una vez instruidos con las exposiciones de la presente
memoria descriptiva, sin una excesiva experimentación.
Las partículas comprenden ventajosamente una
materia que tiene un diámetro de 0,001 a 200 \mum, tal como 0,05
\mum a 200 \mum, preferentemente 0,1 \mum a 100 \mum, lo más
preferentemente 0,5 \mum a 10 \mum, y un componente superficial
capaz de unirse al analito y/o una o más de otras sustancias
anteriormente descritas. Por ejemplo, la materia en forma de
micropartículas puede ser almidón reticulado, dextranos, celulosa,
proteínas, polímeros orgánicos, un copolímero de estireno tal como
copolímero de estireno/butadieno, copolímero de
acrilonitrilo/butadieno/estireno, copolímero de
vinilacetilo-acrilato o copolímero de cloruro de
vinilo/acrilato, partículas inorgánicas inertes, dióxido de cromo,
óxidos de hierro, sílice, mezclas de sílice y materia proteinácea o
sus mezclas. Deseablemente, las partículas están en suspensión en el
sistema de ECL. Las partículas pueden ser o pueden incluir
partículas magnéticamente sensibles.
Con el fin de hacer funcionar un sistema en el
que un electrodo introduce una energía electroquímica, es necesario
proporcionar un electrolito en el que el electrodo se sumerge y que
contiene el resto de ECL. El electrolito es una fase a cuyo través
se transporta una carga por iones. Generalmente, el electrolito está
en la fase líquida, y es una solución de una o más sales u otras
especies en agua, un líquido orgánico o mezcla de líquidos
orgánicos o una mezcla de agua y uno o más líquidos orgánicos. Sin
embargo, otras formas de electrolitos son también útiles en ciertas
realizaciones de la invención. Por ejemplo, el electrolito puede ser
una dispersión de una o más sustancias en un fluido, por ejemplo,
un líquido, un vapor o un fluido supercrítico, o puede ser una
solución de una o más sustancias en un sólido, un vapor o un fluido
supercrítico.
El electrolito es adecuadamente una solución de
una sal en agua. La sal puede ser una sal de sodio o una sal de
potasio preferentemente, pero la incorporación de otros cationes es
también adecuada en ciertas realizaciones, en la medida en que el
catión no interfiera con la secuencia de interacciones
electroquimioluminiscentes. El anión de la sal puede ser un
fosfato, por ejemplo, pero es permisible también el uso de otros
aniones en ciertas realizaciones de la invención, una vez más, en
la medida en que el anión seleccionado no interfiera con la
secuencia de interacciones electroquimioluminiscentes.
La composición puede ser también no acuosa.
Aunque en ciertos casos se pueden emplear ventajosamente fluidos
supercríticos, es más típico utilizar un electrolito que comprenda
un líquido orgánico en una composición no acuosa. Como un
electrolito acuoso, el electrolito no acuoso es también una fase a
cuyo través se transporta una carga por iones. Normalmente, esto
significa que una sal está disuelta en el medio líquido orgánico.
Ejemplos de líquidos orgánicos adecuados son acetonitrilo,
dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), metanol, etanol y
mezclas de dos o más de los anteriores. Ilustrativamente, las sales
de tetraalquilamonio, tal como tetrafluoroborato de
tetrabutilamonio, que son solubles en líquidos orgánicos, se pueden
usar con ellos para formar electrolitos no acuosos.
El electrolito es, en ciertas realizaciones de
la invención, un sistema tamponado. Los tampones de fosfato son a
menudo ventajosos. Ejemplos de ello son una solución acuosa de
fosfato de sodio/cloruro de sodio, y una solución acuosa de fosfato
de sodio/fluoruro de sodio.
Como se describe en la solicitud PCT publicada
US 89/04859, titulada "reacción electroquimioluminiscente que
utiliza un reductor derivado de amina", es deseable incluir un
reductor, normalmente una amina o resto de amina (de una molécula
mayor) que se puede oxidar y descomponer espontáneamente para
convertirse en especies altamente reductoras. Se cree que la amina
o resto de amina se oxida también por la energía electroquímica
introducida en el sistema de reacción. La amina o resto de amina
pierde un electrón, y seguidamente se desprotona, o se reagrupa en
sí mismo, en forma de un agente reductor fuerte. Este agente
interacciona con el resto de ECL que contiene metal oxidado y
provoca que este adopte el estado excitado anteriormente expuesto.
Con el fin de llevar a cabo esta función, la amina o resto de amina
tiene preferentemente un radical centrado en un átomo de carbono
con un electrón que puede ser donado desde tal átomo de carbono, y
un átomo de carbono alfa que actúa seguidamente como un donante de
protones durante la desprotonación con el fin de formar el
reductor. El reductor derivado de amina proporciona el estímulo
necesario para convertir el resto de ECL que contiene un metal a su
estado excitado, a partir del cual se emite una radiación
electromagnética detectable.
Se puede utilizar una amplia gama de aminas y
restos correspondientes de aminas para poner en práctica la
presente invención. Generalmente, la amina o resto de amina se
escoge para adecuar el pH del sistema que va a ser analizado por
electroquimioluminiscencia. Otro factor relevante es que la amina o
resto de amina debe ser compatible con el entorno en el que debe
funcionar durante el análisis, es decir, compatible con un entorno
acuoso o no acuoso, según sea el caso. Todavía, otra consideración
es que la amina o resto de amina seleccionado debe formar un
reductor derivado de amina bajo las condiciones predominantes que
sea suficientemente fuerte para reducir el resto de ECL que
contiene metal oxidado en el sistema.
Las aminas (y los correspondientes restos
derivados de las mismas) que se utilizan ventajosamente en la
presente invención son aminas alifáticas tales como
alquil-aminas primarias, secundarias y terciarias,
teniendo los grupos alquilo de cada una de uno a tres átomos de
carbono, así como aminas alifáticas sustituidas. La
tripropil-amina es una amina especialmente
preferida ya que conduce, comparativamente hablando, a una emisión
de radiación electromagnética particularmente elevada, que aumenta
la sensibilidad y exactitud de la detección y cuantificación en las
realizaciones en que se usa. También son adecuadas las diaminas
tales como hidrazina, y poliiminas tales como polietilenimina.
Ejemplos de otras aminas adecuadas para poner en práctica la
invención son trietanolamina, trietilamina,
1,4-diazabiciclo-(2.2.2)-octano,
1-piperidino-etanol,
1,4-piperazino-bis-(ácido
etanosulfónico), tri-isopropil-amina
y polietilenimina.
Normalmente, el resto de ECL que contiene metal
utilizado en la presente invención es el constituyente limitante de
la reacción. Consecuentemente, es también típico que la amina o
resto de amina se proporcione en un exceso estequiométrico con
respecto al mismo. Ilustrativamente, la amina o resto de amina se
emplea en una concentración de 50-150 mM. Para ser
utilizada a un pH de aproximadamente 7, es a menudo ventajosa una
concentración de 100 mM. En ciertas realizaciones, el límite
superior sobre la concentración de amina o resto de amina se
determina por la solubilidad máxima de la amina o resto de amina en
el entorno en que está siendo usada, por ejemplo en agua. En
general, la cantidad de amina o resto de amina empleada es la que
sea suficiente para efectuar la transformación del resto de ECL que
contiene metal oxidado en su estado excitado de forma que se
produzca la luminiscencia. Los expertos ordinarios en la técnica,
con el conocimiento de lo expuesto en la presente memoria
descriptiva, pueden determinar empíricamente la cantidad de amina o
resto de amina ventajosamente usada para el sistema particular que
se esté analizando, sin una experimentación excesiva.
Como se describe en la solicitud PCT publicada
US 89/04915, titulado "reacción electroquimioluminiscente
mejorada", los ensayos de la invención se llevan a cabo
deseablemente en presencia de un mejorador, normalmente un compuesto
de fórmula
en la que R es hidrógeno o
C_{n}H_{2n+1}, R' es C_{n}H_{2n}, x es 0 a 70 y n es de 1 a
20. Preferentemente, n puede ser de 1 a 4. Ejemplos específicos son
una sustancia disponible en el comercio bajo la denominación Triton
X-100 de
fórmula
en la que x es
9-10, y una sustancia disponible en el comercio bajo
la denominación Triton N-401
(NPE-40), de
fórmula
en la que x es 40. El mejorador se
utiliza generalmente en una cantidad suficiente de forma que en su
presencia se produzca el aumento deseado en la emisión de radiación
electromagnética. Normalmente, la cantidad es 0,01% a 5,0%, más
específicamente 0,1% a 1,0%,
v/v.
El resto de ECL usado de acuerdo con la presente
invención es inducido a emitir una radiación electromagnética
estimulándolo en un estado excitado. Esto se realiza exponiendo el
sistema en el que se ha incorporado el resto de ECL a una energía
electroquímica. El potencial al que se produce la oxidación del
resto de ECL y las especies que forman un reductor fuerte depende
de sus estructuras químicas exactas, así como de factores tales
como el pH del sistema y la naturaleza del electrodo usado para
inducir la energía electroquímica. Es bien conocido por los
expertos rutinarios en la técnica el modo de determinar el potencial
óptimo y la longitud de onda de emisión de un sistema
electroquimioluminiscente. Ciertos métodos preferidos de estimular
el sistema de ECL se describen en la solicitud publicada US
89/01814.
Un aparato para llevar a cabo los ensayos de la
invención se describe en las Figs. 1 y 2. La Fig. 1 describe un
aparato de ECL ventajoso, pero los métodos de la presente invención
no están limitados a una aplicación en el aparato 10, sino que en
vez de ello se pueden emplear en otros tipos de aparatos de ECL que
incluyen un electrodo de trabajo u otra superficie inductora para
proporcionar una energía electroquímica para provocar que el resto
de ECL sea electroquimioluminiscente. Aunque los métodos de la
invención se pueden llevar a cabo en un modo estático o a través de
un flujo, el aparato 10 incluye una celda a través de flujo, que
proporciona ventajas distintas para muchos tipos de muestras que
incluyen muestran de ensayos de unión. Detalles adicionales de
aparatos para llevar a cabo los ensayos de ECL de la invención se
describen en las solicitudes PCT publicadas US 98/04854 y US
90/01370.
El aparato 10 incluye una celda electroquímica
12, un dispositivo 14 de detección/medición de la luz, que puede
ser ventajosamente un tubo fotomultiplicador (PMT), un fotodiodo, un
dispositivo de acoplamiento de carga, una película o emulsión
fotográfica o similar y una bomba 16, que es ventajosamente una
bomba peristáltica, para proporcionar el transporte de un fluido
hacia, a través y desde la celda 12. Alternativamente, se puede
usar una boba de desplazamiento positivo. Se proporciona un
mecanismo de cierre 18 entre la celda 12 y el PMT 14 y se hace
funcionar de forma controlada para abrirse solamente en una medida
para exponer el PMT a la celda 12 durante los períodos de medición
de la ECL. El mecanismo de cierre puede estar cerrado, por ejemplo,
durante el mantenimiento. También está incluido en el aparato 10,
pero no se ilustra en la Fig. 1, un alojamiento a prueba de luz
destinado a tener dispuestos en su interior los diversos componentes
y proteger el PMT 14 de cualquier luz externa durante las mediciones
de ECL.
La celda 12 en sí incluye un primer bloque 20 de
montaje a cuyo través pasa un tubo 22 de entrada y un tubo 24 de
salida, que pueden estar ventajosamente construidos de acero
inoxidable. El bloque 20 de montaje tiene una primera superficie
externa 26 y una seguida superficie interna 28 que definen un lado
de un volumen 30 de mantenimiento de la muestra de la celda 12 en
el que la celda 12 mantiene las soluciones de limpieza y/o
acondicionamiento y/o medición durante las correspondientes
operaciones del aparato 10. Los tubos 22 y 24 de entrada y salida
pasan a través del bloque 20 de montaje desde la superficie exterior
26 hasta la superficie interior 28 y se abren en forma de un
volumen 30 de mantenimiento de la muestra. Un segundo bloque 32 de
montaje, construido ventajosamente de acero inoxidable, tienen
también una primera superficie externa 34 y una segunda superficie
interna 36. El segundo bloque de montaje 32 está separado del
primero bloque 20 de montaje por un separador anular 38, construido
ventajosamente de Teflon u otro material no contaminable. Por tanto,
la superficie externa 34 del bloque 32 de montaje define parte del
segundo lado del volumen 30 de mantenimiento de la muestra. El
separador 38 tiene una parte externa 40 y una abertura central 42
cuyo borde interno 44 define la pared lateral del volumen 30 de
mantenimiento de la muestra. La parte externa 40 sella la superficie
interna 28 del primero bloque 20 de montaje a la superficie externa
34 del segundo bloque 32 de montaje para evitar que cualquier
solución pase fuera del volumen 30 de mantenimiento de la muestra
entre las dos superficies 28 y 34. El bloque 32 de montaje tiene
adicionalmente una abertura central 46 en la que una ventana 48 está
fijada por sellado para definir el resto del segundo lado del
volumen 30 de mantenimiento de la muestra como una continuación de
la superficie externa 34. La ventana 48 está formada de un material
que sea sustancialmente transparente a la longitud de onda de la
luz electroquimioluminiscente emitida por el resto de ECL. La
ventana 48, por lo tanto, está formada ventajosamente de vidrio,
plástico, cuarzo o similar.
El tubo 22 de entrada intersecciona con el
volumen 30 de mantenimiento de la muestra en un primer externo 50
del mismo adyacente al separador 38 y el tubo 24 de salida
intersecciona con el volumen 30 de mantenimiento de la muestra en
un segundo extremo 52 del mismo, adyacente al separador 38. La
combinación del tubo 22 de entrada, volumen 30 de mantenimiento de
la muestra y tubo 24 de salida proporciona así una trayectoria de
flujo continuo para el flujo estrecho y sustancialmente laminar de
una solución hacia, a través y desde la celda 12. Las flechas A y B
representan el flujo adentro y afuera del tubo 22 de entrada y el
tubo 24 de salida, respectivamente.
Dispuesto en la superficie interna 28 del primer
bloque 20 de montaje está un sistema 54 de electrodos de trabajo
que, en la realización ilustrada, incluye unos primero y segundo
electrodos de trabajo 56 y 58. En otras realizaciones, se puede
proporcionar ventajosamente un único electrodo de trabajo, o
solamente el electrodo 56 puede ser un electrodo de trabajo. Los
electrodos de trabajo 56 y 58 están donde pueden tener lugar las
reacciones de interés electroquímicas y de ECL. Los electrodos de
trabajo 56 y 58 son electrodos voltamétricos sólidos y, por lo
tanto, pueden estar construidos ventajosamente de platino, oro,
carbonos u otros materiales que sean eficaces para esta finalidad.
Los conectores 60 y 62 de alambres, conectados a los electrodos de
trabajo 56 y 58, pasan por fuera a través del primero bloque 20 de
montaje.
Los conectores 60 y 62 están conectados ambos a
un primer terminal 64 de "electrodos de trabajo" de un control
66 del voltaje, ilustrado en la Fig. 2. El control 66 del voltaje
funciona ventajosamente a la manera de un potenciostato para
suministrar señales de voltaje a los electrodos de trabajo 56 y 58
y, opcionalmente, para medir la corriente que fluye desde los
mismos durante una medición de la ECL. Alternativamente, los
conectores 60 y 62 pueden estar conectados a terminales separados
de control 66 del voltaje para un funcionamiento individual.
El funcionamiento del potenciostato de control
66 del voltaje se efectúa adicionalmente a través de un
contra-electrodo 68 y, opcional pero
ventajosamente, un electrodo 70 de referencia. En la realización
ilustrada, el bloque 32 de montaje está hecho de acero inoxidable y
el contra-electrodo 68 consiste en las superficies
expuestas 72 y 74 del bloque 32 de montaje. Los
contra-electrodos 72 y 74 y los electrodos 56 y 58
de trabajo proporcionan la superficie interfacial para imprimir el
potencial a la solución dentro del volumen 30 de mantenimiento de
la muestra que aporta la energía para las reacciones químicas y
provoca la electroquimioluminiscencia en la muestra y/o proporciona
energía para limpiar y acondicionar las superficies de la celda 12.
Los contra-electrodos 72 y 74 están conectados por
un conector 76 de alambre a un segundo terminal 78 de
"contra-electrodos" de control 66 del
voltaje.
El electrodo 70 de referencia proporciona un
voltaje de referencia al que se refiere el voltaje aplicado por los
electrodos 56 y 58 de trabajo, por ejemplo, +1,2 voltios frente a la
referencia. El electrodo 70 de referencia se coloca ventajosamente
en el tubo 24 de salida en una posición 80 separada de la celda 12,
y está conectado a través de un conector 82 de alambre a un tercer
terminal 84 de "electrodos de referencia" de control 66 del
voltaje. En el modo de tres electrodos, la corriente no puede fluir
a través del electrodo 70 de referencia. El electrodo 70 de
referencia se puede usar en un modo de funcionamiento de tres
electrodos para proporciona un voltaje equilibrado, conocido y
estable y, por lo tanto, se construye ventajosamente de
plata/cloruro de plata (Ag/AgCl) o es un electrodo de calomelanos
saturado (SCE).El control 66 del voltaje se puede hacer funcionar
en un modo de funcionamiento de dos electrodos usando solamente el
electrodo 56 de referencia y el electrodo 58 como un electrodo
contrario/referencia. En este modo de funcionamiento de dos
electrodos, el electrodo 58 contrario/referencia está
eléctricamente conectado a los terminales 78 y 84 de control del
voltaje en el control 66 del voltaje. En este caso, el control 66
del voltaje funciona esencialmente como una batería. El control 66
del voltaje suministra señales de voltaje a los electrodos 56 y 58
de trabajo y contrario y, opcionalmente, mide la corriente que
fluye a través de los electrodos respectivos. El electrodo 70 de
referencia puede ser alternativamente un denominado electrodo de
"casi referencia" construido de platino, oro, acero inoxidable
u otro material, que proporcione un voltaje menos estable, y que sin
embargo sea medible con respecto a la solución en contacto. En el
modo tanto de dos como de tres electrodos, el electrodo 70 o 58 de
referencia sirve para la finalidad de proporcionar una referencia
frente a la cual se mide el voltaje aplicado a los electrodos 56 de
referencia. La referencia de voltaje equilibrado se considera
actualmente que es más ventajosa. El control 66 del voltaje en su
funcionamiento de potenciostato controla los diversos electrodos
proporcionando un voltaje conocido a los electrodos 56 y 58 de
trabajo con respecto al electrodo 70 de referencia, mientras mide
el flujo de corriente entre los electrodos 56 y 58 de trabajo y el
contraelectrodo 72 y 74. Los potenciostatos para esta finalidad son
bien conocidos, y la estructura interna del control 66 del voltaje
puede corresponder por lo tanto a cualquiera de los potenciostatos
convencionales disponibles en el comercio que produzcan las
funciones anteriormente citadas y, por tanto, no forman parte de la
presente invención per se. De hecho, el aparato 10 se puede
construir alternativamente sin un control 66 del voltaje interno, y
se puede adaptar para estar conectado a un potenciostato externo
que está separadamente controlado para proporcionar las señales de
voltaje requeridas a los electrodos 56, 58, 72, 74 y 70. Estas
señales de voltaje, aplicadas de una manera específica como se
describe con posterioridad, proporcionan condiciones repetibles para
las superficies de los electrodos 56 y 58 de trabajo y,
ventajosamente, para las superficies de la celda 12 en su conjunto,
una característica que contribuye significativamente a una precisión
mejorada en mediciones de ECL.
La bomba 16 se coloca ventajosamente en el tubo
24 de entrada para "propulsar" la solución desde un volumen de
muestras en la dirección de la flecha A al interior del tubo 22 de
entrada. La solución fluirá a través del tubo 22 de entrada, el
volumen 30 de mantenimiento de muestras y el tubo 24 de salida,
pasará por el electrodo 70 de referencia y hacia afuera en la
dirección de la flecha B. Alternativamente, la bomba 16 se puede
colocar en un tubo 22 de entrada para "propulsar" la solución
a través del aparato 10. Ventajosamente, esta misma trayectoria del
flujo transversal del tuvo 22, volumen 30 de mantenimiento de
muestras y tubo 24 de salida se usa para todas las soluciones y
fluidos que pasan a través de la celda 12, con lo que cada fluido
realiza una acción de limpieza hidrodinámica al forzar el fluido
previo fuera de la celda 12. La bomba 16 puede estar controlada
para suspender su funcionamiento para mantener una solución
particular en la celda 12 durante cualquier período de tiempo.
La construcción de flujo transversal del aparato
10 permite que a los electrodos de trabajo se les imprima un
voltaje variable o se mantengan continuamente a un potencial
preoperativo mientras están continuamente expuestos a una o más
soluciones, sin exponer los electrodos 56 y 58 de trabajo (o los
electrodos 72, 74 y 70 contrarios y de referencia) al aire. La
exposición al aire, que abre el circuito al electrodo 70 de
referencia, permite fluctuaciones de voltaje desconocidas y al azar
que destruyen el carácter reproducible en las condiciones
superficiales en los electrodos 56 y 58 de trabajo. La construcción
de flujo transversal permite la rápida alternancia entre las etapas
de inicio, en las que el sistema 54 de electrodos es limpiado y
acondicionado, y las etapas de medición, en las que una o más
formas de ondas o barridos de las mediciones provocan la ECL.
Las Figs. 23 y 24 muestran esquemáticamente una
celda e imanes 27/37 que están equipados con un sistema de imanes
que imponen ventajosamente líneas de campo que son principalmente
paralelas al plano de la superficie 56 y 58 del electrodo. El
sistema de imanes consiste en una pluralidad de electroimanes
individuales y permanentes que están apilados y orientados de forma
que los polos norte y sur de los imanes 27/37 se alternan en el
apilamiento. Los imanes individuales entre los imanes 27/37 están
separados por aire o cualquier material que no sea magnéticamente
sensible. La disposición que se muestra en las Figs. 23 y 24 aplica
ventajosamente líneas de fuerza magnéticas a la zona por encima del
electrodo de trabajo que son aproximadamente horizontales al plano
del electrodo. Esto induce una orientación de las partículas
magnéticamente sensibles en las que las partículas descansan en la
superficie del electrodo y son fácilmente accesibles para la energía
electroquímica suministrada por el electrodo; véase la Fig. 20.
El sistema de imanes 27/37 mostrado en las Figs.
23 y 24 es también ventajoso en cuanto que las líneas del campo
magnético no se extienden una distancia larga desde la estructura de
imanes; véase la Fig. 20. El campo magnético a partir de tal
sistema de imanes, por lo tanto, no es probable que induzca un
comportamiento magnético permanente para materiales ferromagnéticos
cerca del aparato de los electrodos, y no afectará gravemente al
funcionamiento del tubo fotomultiplicador cerca del aparato de la
celda de flujo. El aparato expuesto en la Fig. 21 es como el
mostrado en las Figs. 1 y 2, y es como se describió anteriormente
con respecto a las Figs. 1 y 2, con la excepción de que en la Fig.
25, colocados verticalmente por debajo del electrodo 56 o los
electrodos 56 y 58, está una pluralidad de imanes 27/37 en una
orientación norte-sur, como se muestra en las Figs.
23 y 24.
La invención se dirige también a composiciones
de reactivos. De forma amplia, las composiciones de reactivos
pueden estar en uno cualquiera de los componentes del sistema de
ensayo de la invención, es decir, (a) electrolito, (b) compuesto
marcador que contiene un resto de ECL, (c) partículas, incluidas
partículas magnéticamente sensibles, (d) analito de interés o un
análogo del analito de interés, (e) un asociado de unión del analito
de interés o de su análogo, (f) un componente reactivo capaz de
reaccionar con (d) o (e), (g) un reductor, o (h) un mejorador de la
reacción de electroquimioluminiscencia. Los reactivos pueden ser
combinados unos con otros por motivos de conveniencia de uso, es
decir, pueden ser preparadas mezclas de dos componentes, tres
componentes y más componentes múltiples, con la condición de que
los componentes no sean reactivos unos con otros durante el
almacenamiento, de forma que se obstaculice su función en el ensayo
previsto. Deseablemente, los reactivos son mezclas de dos
componentes o múltiples componentes que contienen partículas así
como uno o más de otros componentes.
La invención se dirige también a estuches de
ensayo. Los estuches de ensayo pueden incluir recipientes que
contengan uno o más de los componentes (a) a (h) anteriormente
citados, o los estuches de ensayo pueden contener recipientes que
contengan una o más composiciones de reactivos como se describieron
anteriormente, que comprendan mezclas de esos componentes, todo ello
para ser usado en los métodos y sistemas de ensayo de la
invención.
Aunque puede ser empleada una amplia diversidad
de partículas en los ensayos basados en partículas de la invención,
generalmente las partículas tienen una densidad de 1,0 a 5,0 g/ml y,
preferentemente, tienen una densidad de 1,1 a 2 g/ml. La elección
de la densidad óptima está dentro de los conocimientos de la
técnica, siendo la velocidad de sedimentación en ensayos movidos
por la gravedad un compromiso entre la velocidad del ensayo y el
deseo de crear una capa uniforme de complejo en la superficie de los
electrodos.
Pueden ser empleadas también partículas que
tengas un amplio intervalo de diámetros medios. Pueden ser usadas
partículas que tengan un diámetro medio de 0,001 a 200 \mum, como
0,05 a 200 \mum; y preferentemente las partículas tienen un
diámetro medio de 0,01 a 10 \mum.
Se pueden emplear también amplios intervalos de
concentración de partículas en la composición del ensayo, Por
ejemplo, la concentración puede variar en el intervalo de 1 a 10.000
\mug/ml a preferentemente de 5 a 1000 \mug/ml. Deseablemente,
la densidad de las partículas, su tamaño y su concentración se
seleccionan de forma que las partículas sedimenten a una velocidad
de al menos 0,5 mm/min y, preferentemente, a una velocidad
mayor.
En el modo de filtración de realizar la
invención, los medios de filtración tienen deseablemente un tamaño
de poros, medido como diámetro medio, desde ampliamente 0,01 a 90%
del diámetro medio de las partículas y, preferentemente, de 10% a
90% de ese diámetro.
En la técnica se ha descrito un cierto número de
partículas magnéticas que se pueden usar en los ensayos de la
invención. Por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.628.037,
4.695.392, 4.695,393, 4.698,302 y 4.554.088, la solicitud de
patente británica GB 2.005.019A y el documento EP 0.180.384
describen una diversidad de partículas magnéticas que se pueden
usar satisfactoriamente. Las partículas pueden ser paramagnéticas o
ferromagnéticas y pueden estar revestidas con diversos materiales a
los que son acoplados compuestos de unión, de forma que la
partícula magnética pueda ser usada en inmunoensayos. Deseablemente,
las partículas magnéticas usadas en la invención tienen una
susceptibilidad de al menos 0,001 unidades cgs y deseablemente la
susceptibilidad es de al menos 0,01 unidades cgs. Las partículas
magnéticas pueden tener una amplia gana de densidades, es decir,
desde sustancialmente menor que la del agua, 0,01, a 5 g/ml y,
preferentemente, de 0,5 a 2 g/ml. El tamaño de partículas puede
variar en el intervalo de 0,001 a 200, como 0,001 a 200 o 0,05 a 200
\mum; y preferentemente de 0,01 a 10 \mum. La concentración de
las partículas puede variar ampliamente en el intervalo de 1 a
10.000 \mug por ml y, preferentemente, es de
5 a 1000 \mug por ml.
5 a 1000 \mug por ml.
Deseablemente, las partículas magnéticas que se
usan tienen una baja resonancia magnética, como se describe, por
ejemplo, en el documento EP 0.180.384, de forma que después de que
se retira el campo magnético de la superficie del electrodo, las
partículas se desmagnetizan y pueden ser barridas fuera de la celda
de ensayo. Deseablemente la densidad, concentración y tamaño de
partículas de las partículas magnéticas se escogen de forma que el
tiempo de sedimentación sea al menos 0,5 mm/min y, deseablemente,
está por encima de esa velocidad. En el funcionamiento de la celda
magnética, es a menudo deseable retirar los medios de imanes de la
superficie del electrodo antes de introducir la
electroluminiscencia con el fin de no interferir con el
funcionamiento del tubo fotomultiplicador.
Se puede realizar una variedad de ensayos usando
los métodos de la invención.
Se realizó un ensayo como se muestra en la Fig.
3. Los productos de PCR que resultaban de la reacción se marcaron
con biotina y un marcador de ECL
(tri-2,2'-bipiridino)Ru II,
Ru(bpy)_{3}^{2+}). Los gránulos de estreptavidina
capturaban el DNA bifuncionalizado a través de la unión de
biotina-estreptavidina y esto estuvo seguido de un
lavado. El producto unido a los gránulos se sometió seguidamente a
un análisis de detección del marcador de ECL.
Se realizó un ensayo como se muestra en la Fig.
4. El producto de PCR biotinilado se capturó sobre gránulos de
estreptavidina y la cadena no biotinilada se separó. El producto de
PCR unido a los gránulos fue seguidamente hibridado con un
oligonucleótido de ECL marcado (Ru(bpy)_{3}^{2+}).
Esto estuvo seguido de un análisis de ECL para detectar el
marcador.
Se realizó un ensayo como se muestra en la Fig.
5. Los híbridos se capturaron sobre gránulos de estreptavidina. Esto
estuvo seguido de un análisis de ECL sin lavado.
Se realizó un ensayo y los resultados se
muestran en la Fig. 6. El ensayo fue para la presencia de HPV 16 y
18 usando muestras de DNA aisladas a partir de las de líneas
celulares SiHa y HeLa positivas para ambos tipos de virus y
oligonucleótidos específicos para cada tipo de virus. Los cebadores
2PV16, 2PV18 se biotinilaron y 3PV16, 3PV18 eran oligonucleótidos
marcados de ECL. Los oligonucléotidos 2/3PV16 y 2/3PV18 eran
específicos para HPV 16 y 18, respectivamente. El marcador de ECL
resultante capturados en los gránulos se analizó en cuanto a ECL
usando un analizador como se describió en la Fig. 1. Los resultados
se representaron gráficamente como recuentos de ECL para cada
combinación de sondas de muestras.
Se realizó un ensayo y los resultados se
muestran en la Fig. 7. El marcador de ECL unido a los gránulos
resultante se analizó en cuanto a ECL usando un analizador como se
describe en la Fig. 1. Los recuentos de fotones picos de ECL se
representaron gráficamente frente a concentraciones crecientes de
HPV 16 DNA, expresadas como una relación de copias virales respecto
a copias totales de DNA celular. Los cebadores usados en este
análisis para HPV16 fueron 1PV16 (marcador de biotina) y 2PV16
(marcador de ECL). El DNA usado para cada PCR se mantuvo a 1 \mug
constante usando DNA de timo de ternera.
Se realizó un ensayo y los resultados se
muestran en la Fig. 8. El PCR se realizó usando HRP2 biotinilado
con HRP1 sin marcar (para las sondas 1T24 y 1CHR) y HRP1 biotinilado
con HRP2 sin marcar (para las sondas 2T24 y 2CHR), generando dianas
de cadena única unidas a gránulos para la hibridación. Las muestras
de DNA eran la normal Gen Ha-ras (Placenta) y la
mutante Gen Ha-ras (NIH3T3-T24). La
hibridación del DNA unido a los gránulos con marcador de
ECL-1T24 (1T24), marcador de
ECL-2T24 (2T24), marcador de
ECL-1CHR y marcador de ECL-2CHR
(2CHR) estuvo seguida de lavados con TEMAC. El marcador de ECL
unidos a los gránulos resultante se analizó en cuanto a ECL usando
un analizador como se describe en la Fig. 1. Los resultados se
representaron gráficamente como recuentos de ECL para cada
combinación de sondas de muestras.
Se realizó un ensayo y los resultados se
muestran en la Fig. 9. El PCR se realizó como se describió en la
Fig. 8 usando solamente HRP2 biotinilado con HRP1 sin marcar (para
las sondas 1T24 y 1CHR). Las sondas usadas fueron: 1T24 y 1CHR que
contenían P^{32} (1-T24-P,
1-CHR-P) como testigos. Con la 1T24
y 1CHR que contenían ambas P^{32} y marcador de ECL se
determinaron los efectos del marcador de ECL. Las muestras se
lavaron como anteriormente con TEMAC. El P^{32} unido a los
gránulos resultante se analizó por adición a una combinación de
escintilación en un contador de escintilación. Los resultados se
representaron gráficamente como recuentos de P^{32} por segundo
para cada combinación de muestra-sonda.
Se realizó un ensayo y los resultados se
muestran en la Fig. 10. El ensayo se realizó como se describe en la
Fig. 4. La muestra era DNA placental y la amplificación se realizó
usando HRP2 biotinilada con HRP1 sin marcar (para las sondas 1T24 y
1CHR). Seguidamente se tomaron muestras del producto de PCR
resultante para proporcionar un conjunto de muestras que contenían
cantidades diferentes de producto. Estos conjuntos de muestras
fueron seguidamente hibridados con sondas marcadas con P^{32}
(1T24-P32 y 1CHR-P32) o marcador de
ECL (1T24-ECL y 1CHR-ECL). Los
resultados de cada uno de los estudios se normalizaron seguidamente
usando el valor medio de los picos de cada marcador para la muestra
de 90 \mul. Estas cifras normalizadas permiten una comparación
más eficaz de la señal respecto al fondo y la respuesta comparativa
de los dos métodos. La cifra en recuadro ilustra la respuesta al
nivel inferior de la curva de dilución. Las muestras fueron
manejadas como se describió anteriormente (Fig. 6 y Fig. 8).
Se realizó un ensayo y los resultados se
muestran en la Fig. 11. El PCR se realizó usando 2PV18 biotinilado
y 1PV18 sin marcar usando HeLa DNA (400 copias por celda) usando el
formado de PCR ilustrado en la Fig. 3. La reacción de PCR
resultante fue seguidamente hibridada con el marcador de ECL de
sonda específica 3PV18. La mezcla de hibridación se añadió
seguidamente a gránulos revestidos con estreptavidina y el marcador
de ECL resultante unido a los gránulos fue seguidamente analizado
en cuanto a ECL usando un analizador de ECL como se describió en la
Fig. 1. Los resultados se representaron gráficamente como recuentos
de ECL frente a copias de HPV18 añadidas al PCR.
Los siguientes Ejemplos no limitativos se
proporcionan a modo de ilustración y no se han de considerar como
una limitación de esta invención, muchas variaciones evidentes de la
cual son posibles sin apartarse de su alcance y características
generales.
- \quad
- Se usó un aparato de flujo transversal, que empleaba tres electrodos, como se describe en las Figs. 1 y 2.
- \quad
- Electrodo de trabajo - - disco de Au, 3 mm de diámetro
- \quad
- Contra-electrodo - - disco de Au, 3 mm de diámetro
- \quad
- Electrodo de referencia - - Ag/AgCl
- \quad
- Junta de Teflon (0,38 cm de grosor)
- \quad
- Cara frontal de plexiglás
- \quad
- Tubo de entrada = 0,106 cm diámetro interno de polipropileno
- \quad
- Velocidades de aspiración: variables desde 0,01 a 5 ml/minuto.
- \quad
- Potenciostato: controlado por microprocesador.
- \quad
- Luminómetro usando Hamamatsu R374 PMT (tubo sensible al rojo de aumento bajo); voltaje de PMT variable 0-1400 V.
\vskip1.000000\baselineskip
- (a) Marcador de ECL:
- Ru(bpy)_{3}^{2+}
- (b) Tampón ECL:
- KH_{2}PO_{4} 112 mM, K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 88 mM, NaCl 50 \muM, NaN_{3} 6,5 mM, Triton X-100 0,8 \muM, Tween 20 0,4 mM, tripropilamina 10 mM en H_{2}O
- (c) Diluyente de ECL:
- KH_{2}PO_{4} 37,5 mM, K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 198,2 mM, NaCl 151,7 mM, NaN_{3} 0,65 mM, albúmina de suero bovino 0,43 mM en H_{2}O
- (d) Ru(bpy)_{3}^{2+}-NHS:
- Ru(2,2'-bipiridil)-2-(4-[3-81,3-dioxolan-2-il)propil]-4'-metil-2,2'-bipiridina)^{2+}
- (e) Partículas Dynal:
- (i) Dynal M-450 Dynabeads, partículas supermagnéticas de 4,5 \mum de diámetro, 30 {}\hskip0.4cm mg/ml, obtenidas de la empresa Dynal, 45 North Station Paza, Great Neck, NY {}\hskip0.4cm 11021
- \quad
- (ii) Dynal M-280 Dynabeads, partículas supermagnéticas de 2,8 \mum de diámetro, 10 {}\hskip0.4cm mg/ml, obtenidas de la empresa Dynal, 45 North Station Paza, Great Neck, NY {}\hskip0.4cm 11021
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo de medición de la ECL consiste en tres
etapas: (1) preacondicionamiento, (2) medición y (3) limpieza. La
etapa de preacondicionamiento incluye la aplicación de una onda de
voltaje triangular de 0,0 V a +2,2 V a -1,0 V a +0,6 V para 2,0
V/s. La etapa de medición incluye la aplicación de una forma de onda
triangular de +0,6 V a +2,8 V a +2,0 V a 1,0 V/s. La etapa de
limpieza incluye la aplicación de una onda de voltaje cuadrada de
+0,0 V a +3,0 V a -0,5 V a 0,0 V. Todos los voltajes son con
relación al electrodo de referencia de Ag/AgCl.
\vskip1.000000\baselineskip
La medición se realiza en una celda como se
muestra en la Fig. 12. Las referencias se hacen a la Fig. 12 que
expone un aparato para realizar un ensayo usando la fuerza de la
gravedad. Los componentes del aparato incluyen una ventana
transparente identificada por el número de referencia 48, una junta
identificada por el número de referencia 222, un bloque 20 que
incluye una entrada 22, un electrodo de trabajo 56/58, un
contra-electrodo 72/74 y un orificio 24 de salida.
El plano del bloque de la celda es horizontal, es decir,
perpendicular a la dirección del campo gravitacional de la tierra.
Se impulsan micropartículas marcadas (Dynal) en un tampón de ECL
por medio de una bomba peristáltica. La bomba se apaga después de
que las partículas alcanzan la celda. Las micropartículas en la
cámara de la celda caen en la superficie del electrodo de trabajo.
La velocidad de caída de las micropartículas se determina para que
sea aproximadamente constante a 0,5 mm/min sobre una distancia de
10 mm, como se muestra en la Fig. 13. El número de partículas que
sedimentan es una función del tiempo y de la velocidad de caída. La
intensidad de la ECL es proporcional al número de partículas que
sedimentan sobre el electrodo de trabajo. El número de partículas
que alcanzan la superficie y, por lo tanto, la intensidad de la ECL
están limitados por la altura de muestra de fluido sobre el
electrodo de trabajo. La Fig. 14 muestra la intensidad de la ECL
como una función del tiempo de depósito para dos celdas de
diferentes grosores de las juntas, 0,038 mm y 0,19 mm,
respectivamente. Ambas celdas tienen similares velocidades de
depósito de micropartículas, pero la celda con una junta más gruesa
proporciona una lectura máxima que es cinco veces mayor. Los
resultados de un ensayo de AFP (proteína fetal alfa) se muestran en
la Fig. 15, que compara dos celdas. Nuevamente, la celda con la
junta más gruesa proporciona cinco veces la intensidad de la señal
de ECL.
Recogida magnética usando una celda de
sedimentación.
Una celda para realizar un ensayo que usa una
fuerza magnética para causar que la micropartícula sedimente se
muestra en la Fig. 16. La referencia numérica 48 se refiere a una
ventana transparente, el número de referencia 122 a una junta, el
número de referencia 22 a la entrada en el bloque de la celda, los
números de referencia 56/58 al electrodo de trabajo, el número de
referencia 24 a la salida de la muestra, el número de referencia 20
al bloque de la celda en sí y la referencia 27 a un
electroimán.
El plano del bloque de la celda está orientado
horizontalmente. Se propulsan micropartículas marcadas (Dynal) en
tampón ECL a la celda por medio de una bomba peristáltica. La bomba
se apaga después de que las micropartículas alcanzan la celda. Las
micropartículas en la cámara de la celda son propulsadas al
electrodo de trabajo por medio de un campo magnético generado
usando el electroimán 27 que funciona a 12 voltios y 1,5 amperios.
Mediante la aplicación del electroimán, la velocidad de depósito de
micropartículas se aumenta grandemente con respecto a la observada
cuando las micropartículas sedimentan solamente debido a la fuerza
de la gravedad. Esto se muestra en la Fig. 17.
\vskip1.000000\baselineskip
Recogida magnética usando una celda de
recogida.
Se lleva a cabo un ensayo en una celda como se
describe en la Fig. 18. Con respecto a la Fig. 18, la referencia
numérica 48 se refiere a una ventana transparente, el número de
referencia 132 a una junta, el número de referencia 22 a una
entrada en el bloque de la celda, los números de referencia 56/58 a
un electrodo de trabajo, el número de referencia 20 al bloque de la
celda en sí, el número de referencia 24 a la salida de la muestra y
el número de referencia 37 a un imán permanente.
El plano del bloque de la celda está orientado
horizontalmente. Se propulsan micropartículas marcadas (Dynal) en
tampón ECL a la celda electroquímica por medio de una bomba
peristáltica. Antes de la introducción de la muestra, el imán
permanente 37 se coloca inmediatamente por debajo del electrodo de
trabajo/superficie interfacial de la solución a una distancia de
0,9 mm. A medida que la muestra está siendo propulsada en la celda,
las micropartículas se depositan sobre un área sobre el electrodo
de trabajo, definida por el área del imán. La bomba se apaga y el
imán se retira después de que se haya depositado la totalidad de la
muestra. Cuanto más largo sea el tiempo de recogida, más partículas
se depositan. El aumento de la concentración de partículas sobre el
electrodo de trabajo da lugar a una intensidad aumentada de ECL,
como se muestra en la Fig. 19.
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Orientación del campo magnético.
Las micropartículas 96, 96' que son atraídas a
un imán 27/37, tanto si es un imán permanente como si es un
electroimán, se alinean con la orientación del campo magnético 98,
98', tal como en la Fig. 20, que expone los campos magnéticos 98 y
98', y las ordenaciones 96 y 96' de las partículas resultantes que
son paralelas (A) y perpendiculares (B) a la superficie del
electrodo de trabajo 56/58, en las proximidades de esa
superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
Las micropartículas que son magnéticamente
sensibles, no sensibles magnéticamente y de una amplia gama de
densidades, se pueden recoger ventajosamente por filtración en la
superficie de un filtro de membrana. En una realización de la
invención, las partículas son bombeadas a través de una parte de una
membrana del filtro que tiene tamaños de poros que son más pequeños
que el diámetro de las partículas, pero preferentemente son
sustancialmente más pequeños que el diámetro de las partículas y a
una densidad superficial suficientemente elevada, de forma que la
recogida de partículas no cause un bloqueo de los poros.
Ventajosamente, el filtro es mayormente transparente de forma que
el filtro, después de la recogida de las partículas, se puede
colocar en la superficie de un electrodo de trabajo con la
finalidad de inducir una ECL a partir de las partículas y medir la
luminiscencia para medir la cantidad de marcador de ECL en las
partículas.
En otra realización, el filtro de membrana que
tiene tamaños de poros como se describió anteriormente está unido o
colocado en la superficie de un material absorbente de forma que la
capilaridad o "succión" impulsará espontáneamente los fluidos
que contienen micropartículas a través del filtro de membrana sin
requerir ningún aparato para inducir el fluido de flujo transversal
del filtro.
En la realización preferida, el filtro de
membrana, que tiene un tamaño de poros como se describió
anteriormente, está revestido con una película delgada de metal u
otro material conductor de la electricidad, de forma que la
superficie de la membrana puede servir como un electrodo de trabajo
en un aparato de ECL. Las películas conductoras se aplican
fácilmente a la superficie de una membrana mediante métodos
comúnmente usados en la fabricación de dispositivos
microelectrónicos, por ejemplo, evaporación térmica o pulverización
iónica. Tal filtro-electrodo se dispone fácilmente
en una celda de flujo, de forma que la trayectoria del flujo para el
fluido sea a través del filtro-electrodo. Las
partículas en la corriente son atrapadas por el
filtro-electrodo y son fácilmente lavadas in
situ, proporcionando un medio rápido y sencillo para realizar
ensayos heterogéneos sin ningún aparato de lavado externo.
\vskip1.000000\baselineskip
La celda de flujo rotatorio mostrada en la Fig.
21 proporciona otro medio para capturar el complejo en la
superficie del electrodo de trabajo con el fin de medir la
luminiscencia. La solución del ensayo entra en el aparato a través
de la entrada 261 y es bombeada en la celda 262 a través del sello
rotatorio 263 mientras que se confiere un movimiento rotatorio a la
celda, como se indica mediante la flecha R. Las partículas más
densas del complejo se concentran en la superficie del electrodo de
trabajo 264. Aunque la celda esté todavía rotando, la solución sale
de la celda a través de la salida 268. La luz producida que pasa a
través de la ventana 267 de la celda se mide mediante el tubo
fotomultiplicador 265. La luz producida se dirige desde la(s)
superficie(s) vertical(es) 264 de los electrodos de
trabajo, reflejándose en la(s)
superficie(s) curvada(s) 266 de espejos colocados en el centro de la celda; se muestran también contra-electrodo(s)
269. La celda se inunda seguidamente y se limpia para el siguiente ciclo. Esto se puede realizar con la celda tapada o en rotación. Por tanto, la Fig. 21 muestra un método y aparato centrífugos de la invención para capturar partículas, así como una celda de flujo centrífugo de la invención.
superficie(s) curvada(s) 266 de espejos colocados en el centro de la celda; se muestran también contra-electrodo(s)
269. La celda se inunda seguidamente y se limpia para el siguiente ciclo. Esto se puede realizar con la celda tapada o en rotación. Por tanto, la Fig. 21 muestra un método y aparato centrífugos de la invención para capturar partículas, así como una celda de flujo centrífugo de la invención.
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Se lavaron 30 mg (1 ml) de gránulos
M-450 DYNABEADS (DYNAL, Oslo, Noruega) de
poliestireno magnéticamente sensibles y sin revestir, de 4,5
\mum, mediante separación magnética con una solución a pH 7,5 de
tampón de fosfato 150 mM usando 2 ml/lavado. Se añadieron a las
partículas 150 \mug de IgG de ratón marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2+} (Jackson Immunochemicals) en 1 ml
de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,05% de
timerasol. Esta mezcla se dejó incubar durante una noche a
temperatura ambiente con rotación. Seguidamente, la solución fue
magnéticamente separada de las partículas y fue retirada. A los
sitios sin reaccionar del bloque, se añadieron a las partículas 1
ml de 3% de BSA/PBS con 0,05% de azida de sodio, y la solución
resultante se dejó incubar 2 horas a temperatura ambiente. Las
partículas se lavaron 5 veces (2 ml/lavado), y finalmente se
volvieron a poner en suspensión en 6 ml del mismo tampón para ser
almacenadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Partículas magnéticamente sensibles, polímeras y
no polímeras, uniformes y no uniformes (Dynal, Oslo, Noruega;
Polysciences, Warrington, PA 18976; Cortex Biochem, San Leandro, CA
94577; Aldrich, Milwaukee, WI 53201) fueron revestidas con
proteínas marcadas como se describió en el Ejemplo 7. Las partículas
revestidas se lavaron con tampón ECL tres veces antes de constituir
2 ml de una suspensión de 300 \mug/ml. Usando una bomba
peristáltica, se propulsaron 500 \mul de la suspensión de
partículas en la celda de flujo (Ejemplo 3). A medida que las
partículas fluían hacia el electrodo de trabajo, fueron atraídas y
concentradas en la superficie del electrodo de trabajo mediante un
imán. La electroquimioluminiscencia usando las partículas magnéticas
se midió usando un tubo fotomultiplicador Hamamatsu R374 centrado
por encima de la celda de flujo, en el que las partículas se habían
concentrado en la superficie del electrodo de trabajo. La Tabla I
muestra los niveles de fotoemisión ECL obtenidos a partir de las
partículas magnéticamente sensibles revestidas con proteínas
marcadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Partículas que no eran magnéticamente sensibles,
polímeras y no polímeras, uniformes y no uniformes (Aldrich,
Milwaukee, WI 53201; Duke Scientific, Palo Alto, CA 94303) fueron
revestidas con proteínas marcadas como se describió en el Ejemplo
7. Las partículas revestidas fueron lavadas con tampón ECL tres
veces antes de constituir 2 ml de una suspensión de 300 \mug/ml.
Usando una bomba peristáltica, se propulsaron 500 \mul de la
suspensión de partículas en la celda de flujo. Las partículas
revestidas fueron seguidamente concentradas sobre el electrodo de
trabajo por medios gravitacionales, como se describió en el Ejemplo
1. La electroquimioluminiscencia usando las partículas no
magnéticas se midió con un tubo fotomultiplicador Hamamatsu R374
centrado por encima de la celda de flujo, en el que las partículas
se habían concentrado en la superficie del electrodo de trabajo. La
Tabla II muestra los niveles de fotoemisión de ECL obtenidos a
partir de las partículas no magnéticas revestidas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Reactivo
I
Se lavó 1 ml de partículas de poliestireno
magnéticas, sin revestir, de 4,5 \mum, con residuos -OH en su
superficie (DYNAL, DYNABEADS M-450, DYNAL A.S. Oslo,
Noruega) mediante separación magnética con una solución a pH 9,6 de
carbonato/bicarbonato de sodio 150 mM usando 2 ml /lavado. Se
añadieron a las partículas 0,5 mg de anticuerpo lavado con HCG
(CIBA), anti-TSH de oveja purificado por afinidad en
1 ml de la solución de carbonato/bicarbonato. Esta mezcla se incubó
durante una noche a temperatura ambiente con mezcladura.
Seguidamente, la solución fue magnéticamente separada de las
partículas y se retiró. Se añadió 1 ml de 3% de BSA/PBS con 0,05% de
azida de sodio y se incubó 2 horas a temperatura ambiente con
agitación para bloquear los sitios sin reaccionar. Las partículas
se lavaron 5 veces (2 ml/lavado) y a continuación se volvieron a
poner finalmente en suspensión en 1 ml del mismo tampón para ser
almacenadas. La concentración final del Reactivo I de gránulos era
3% en peso.
\newpage
Reactivo
II
Se mezclaron 60,4 mg de octahidrato de ouabaína
(Aldrich Cat nº 14, 193-3) en 6 ml de
di-H_{2}O desionizada (envueltos en una hoja) con
87 mg de metaperyodato de sodio (Mallinckrodt Cat nº 1139) y la
mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas con
rotación. La reacción se terminó haciendo pasar la mezcla de
reacción a través de una resina de intercambio iónico Dowex 1 x
8-50 (Aldrich Cat nº 21, 740-9) con
di-H_{2}O. Se añadieron 200 \mul de fosfato de
sodio a pH 7,2 para ajustar el pH de la solución a 7,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Seguidamente se añadieron gota a gota 50 mg de
Ouabaina activada (4,6 ml) a 108 mg de BSA de albúmina de suero
bovino (Miles Fraction V) en 5 ml de PBS 0,15 M a pH 7,8. Esto es
una relación 40:1 (OUABAINA:BSA). La reacción se incubó a
temperatura ambiente durante 2 horas, con mezcladura, y seguidamente
se añadieron rápidamente 30 mg de cianoborohidruro de sodio
mientras se mezclaba. La ouabaína libre y el cianoborohidruro de
sodio en exceso se separaron por diálisis a 4ºC en PBS 0,15 M con
0,05% de azida de sodio a pH 7,8. El Reactivo II de conjugado de
Ouabaina-BSA se almacenó a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo
III
Se lavaron 5 mg de partículas de poliestireno
magnéticas sin revestir de 4,5 \mum con residuos -OH sobre su
superficie (DYNAL, DYNABEADS M-450, DYNAL A.S. Oslo,
Noruega) por separación magnética con una solución a pH 9,6 de
carbonato/bicarbonato de sodio 150 mM usando 10 ml/lavado. Se
añadieron a las partículas 3 mg de conjugado de
Ouabaina-BSA (Reactivo conjugado II) en 5 ml de la
solución de carbonato/bicarbonato. La mezcla se incubó durante una
noche a temperatura ambiente mientras se hacía rotar. Seguidamente,
la solución fue magnéticamente separada de las partículas y se
retiró. Se añadieron 5 ml de 3% de BSA/PBS con 0,05% de azida de
sodio y se incubó 2 horas a temperatura ambiente, haciendo rotar
para bloquear los sitios sin reaccionar. Las partículas se lavaron
5 veces (10 ml/lavado) y seguidamente se volvieron a poner
finalmente en suspensión en 1 ml del mismo tampón para almacenar.
La concentración final de Reactivo III de partículas fue 3% en
peso.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo
IV
Se marcó 1 mg de anti-digoxina
de ratón (Cambridge Medical Technologies Cat nº
200-014 Lote A3575) con
Ru(bpy)_{3}^{2+}. El anticuerpo monoclonal (MAb)
anticuerpo anti-digoxina fue intercambiado en tampón
usando microconcentradores Centricon 30 (Amicon) en tampón de
fosfato de potasio 0,15 M, NaCl 0,15 M a pH 7,8, siendo 0,5 ml el
volumen final. Inmediatamente antes de ser usados, se disolvieron
0,5 mg de Ru(bpy)_{3}^{2+}-NHS con
125 \mul de dimetil-sulfóxido anhidro (Aldrich).
Para conseguir una relación en moles 25:1 de
Ru(bpy)_{3}^{2+} a proteína basada en los pesos
moleculares de 1057 y 150.000, respectivamente, se añadieron 0,18 mg
de Ru(bpy)_{3}^{2+}-NHS (45
\mul) a la solución de proteína mientras se agitaba. La reacción
se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente 30 minutos
mientras se agitaba. La reacción se terminó mediante la adición de
25 \mul de glicina 1 M y se incubó durante 10 minutos. La mezcla
de reacción se purificó mediante paso a través de una columna
Sephadex G-25 (1 x 20 cm en fosfato de potasio 0,15
M, NaCl 0,15 M con 0,05% de azida de sodio, pH 7,2). Las fracciones
de anti-digoxina de ratón marcada con
Ru(bpy)_{3}^{2+} se recogieron y se reunieron. La
proteína marcada (Reactivo IV) se determinó que tenía 12 marcadores
por moléculas de proteína.
\newpage
Reactivo
V
Se marcaron 0,5 mg de anti-TSH
de ratón (CIBA) con Ru(bpy)_{3}^{2+}. El
anticuerpo anti-TSH MAb fue intercambiado en tampón
usando microconcentradores Centricon 30 (Amicon) en tampón de
fosfato de potasio 0,15 M, NaCl 0,15 M, pH 7,8, siendo 0,35 ml el
volumen final. Inmediatamente antes de ser usado, se disolvieron 0,5
mg de Ru(bpy)_{3}^{2+}-NHS en 75
\mul de dimetil-sulfóxido anhidro (Aldrich). Para
conseguir una relación en moles 50:1 de marcador de
Ru(bpy)_{3}^{2+} a proteína basada en los pesos
moleculares de 1057 y 150.000 respectivamente, se añadieron 0,176
mg de Ru(bpy)_{3}^{2+}-NHS (26,4
\mul) a la solución de proteína mientras se agitaba. El tubo de
reacción se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente, 30
minutos, mientras se agitaba. La reacción se terminó mediante la
adición de 25 \mul de glicina 1 M y se incubó durante 10 minutos.
La mezcla de reacción se purificó mediante su paso a través de una
columna Sephadex G-25 25 (1 x 20 cm en fosfato de
potasio 0,15 M, NaCl 0,15 M con 0,05% de azida de sodio, pH 7,2).
Las fracciones de anti-TSH de ratón marcadas con
Ru(bpy)_{3}^{2+} se recogieron y se reunieron. La
proteína marcada (Reactivo V) se determinó que tenía 14 marcadores
por proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron 100 \mul de calibradores de
suero (estuche de ensayo de London Diagnostics TSH LumiTAG), 25
\mul de anti-TSH de ratón marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2+} (Reactivo V) en tampón ECL y 25
\mul de partículas de
anti-TSH-DYNAL de oveja (Reactivo I)
en tampón ECL y se incubaron en tubos de polipropileno durante 15
minutos, a temperatura ambiente, con mezcladura. Las partículas se
lavaron seguidamente por separación magnética y seguidamente se
volvieron a poner las suspensión las partículas en 500 \mul de
tampón ECL. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces
adicionales. Finalmente, las partículas se volvieron a poner en
suspensión en 1 ml de tampón ECL. La electroquimioluminiscencia
(ECL) para cada muestra se leyó como se describió en el Ejemplo 3.
Los recuentos de ECL son directamente proporcionales a la
concentración de analito presente en la muestra (recuentos
crecientes a medida que aumenta la concentración de analito). La
Tabla III muestra una curva de ensayo representativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron 100 \mul de calibradores
(estuche de ensayo London Diagnostics THS LumiTAG), 25 \mul de
anti-TSH de ratón marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2+} (Reactivo V) en tampón ECL y se
incubaron en tubos de polipropileno durante 15 minutos a
temperatura ambiente con agitación. Antes de la lectura de
resultados, se añadió 1 ml de tampón ECL. La
electroquimioluminiscencia (ECL) para cada muestra se leyó como se
describió en el Ejemplo 3. Los recuentos de ECL son directamente
proporcionales a la concentración de analito presente en la muestra
(recuentos crecientes a medida que aumenta la concentración de
analito). La Tabla IV muestra una curva de ensayo
representativa.
Se combinaron 50 \mul de calibrador de suero
(Ensayo TDx, Abbott Labs, Chicago, IL) y 25 \mul de
anti-digoxina de ratón marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2+} (Reactivo IV) en tampón ECL y se
incubaron 20 minutos a temperatura ambiente con mezcladura. Se
añadieron 25 \mul de partículas de
Oubaína-BSA-DYNAL (Reactivo III) en
tampón ECL y se incubaron 20 minutos adicionales, a temperatura
ambiente, con mezcladura. Las partículas se lavaron seguidamente
por separación magnética y seguidamente se volvieron a poner en
suspensión las partículas en 500 \mul de tampón ECL. Este
procedimiento de lavado se repitió dos veces adicionales.
finalmente, las partículas se volvieron a poner en suspensión en 1
ml de tampón ECL. La electroquimioluminiscencia (ECL) para cada
muestra se leyó como se describió en el Ejemplo 3. Los recuentos de
ECL son inversamente proporcionales a la concentración de analito
presente en la muestra (recuentos decrecientes a medida que aumenta
la concentración de analito). La Tabla V muestra una curva de ensayo
representativa.
Se combinaron 50 \mul de calibrador de suero
(ensayo TDx, Abbott Labs., Chicago, IL) y 25 \mul de
anti-digoxina de ratón marcada con
Ru(bpy)_{3}^{2+} (Reactivo IV) en tapón ECL y se
incubaron 20 minutos a temperatura ambiente con mezcladura. Antes
de la lectura, las partículas se volvieron a poner en suspensión en
1 ml de tampón ECL. La electroquimioluminiscencia (ECL) para cada
muestra le leyó como se describió en el Ejemplo 3. Los recuentos de
ECL son inversamente proporcionales a la concentración de analito
presente en la muestra (recuentos decrecientes a medida que aumenta
la concentración de analito). La Tabla IV muestra una curva de
ensayo representativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron 50 \mul de calibrador de suero
(ensayo TDx, Abbott Labs., Chicago, IL) y
anti-digoxina de ratón marcada con
Ru(bpy)_{3}^{2+} (Reactivo IV) en tampón ECL y se
incubaron 20 minutos a temperatura ambiente con mezcladura. Se
añadieron 25 \mul de partículas de
oubaína-BSA-DYNAL (Reactivo III) en
tampón ECL y se incubaron 20 minutos adicionales, a temperatura
ambiente, con mezcladura. Antes de la lectura, las partículas se
volvieron a poner en suspensión en 1 ml de tampón ECL. La
electroquimioluminiscencia (ECL) para cada muestra se leyó como se
describió en el Ejemplo 3. Los recuentos de ECL eran inversamente
proporcionales ala concentración de analito presente en la muestra
(recuentos decrecientes a medida que aumenta la concentración de
analito). La Tabla VII muestra una curva de ensayo
representativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos se prepararon en un
sintetizador de oligonucleótidos automatizado Applied Biosystemas
usando la
\beta-cianoetil-fosforamidita (1).
Las modificaciones de amino en los oligonucleótidos en el extremo
5' se produjeron en la última etapa de acoplamiento, y en el extremo
3' usando una fase sólida modificada (vidrio de porosidad
controlada). La empresa Clotech (San Diego, CA) suministró los
modificadores de amino. Los oligonucleótidos modificados en 5'
resultantes contenían todos un separador de seis átomos de carbono
para el grupo amino denominado (C6, NH2). Los oligonucleótidos
modificados en 3% contienen todos un separador de tres átomos de
carbono para el grupo amino. Los oligonucleótidos construidos, sus
modificaciones y utilidad se describen con posterioridad.
Los oligonucleótidos para el estudio de HPV se
dirigieron a la región E6 como se describió anteriormente (2).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de oligonucleótidos fueron como
sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos oligonucleótidos hacen posible la
generación de PCR de diversos fragmentos; 3PV18 con 2PV16 o 2PV18
respectivamente forman un fragmento de 62 bp; 1PV16 con 2PV16 forma
un fragmento de 103 bp. Debe apreciarse que los oligonucleótidos
3PV16 y 3PV18 se pueden usar también como sondas que se hibridan a
los productos de la reacción PCR de 1PV16 con 2PV16 y 1PV18 con
2PV18, así como se hibridan a la cadena producida por los
oligonucleótidos 2PV16 y 2PV18 con el PCR. Los oligonucleótidos para
los ensayos de mutación puntuales de Ha-ras eran
como sigue:
\newpage
Estos dos cebadores de oligonucleótidos dirigen
la síntesis PCR de un fragmento de 80 bp. Las secuencias de sondas
usadas para este estudio de mutación puntual fueron como sigue:
Aparte de estas secuencias, se sintetizaron
también las secuencias anteriores 1CHR y 2T24 sin la modificación
en 5' pero con un grupo amino en 3'. Estos oligonucleótidos
modificados con amino en 3' fueron marcados con el marcador ECL y
se usaron in hibridaciones. El sitio de mutación/desapareamiento se
indica mediante el nucleótido en negrita. Las sondas 1T24 y 1CHR se
hibridan a la cadena producida por el oligonucleótido HRP2 en la
PCR. Las sondas 2T24 y 2CHR se hibridan a la cadena producida por
el oligonucleótido HRP1 en la PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos JK8 y JK8C para acoplamiento a
partículas:
\vskip1.000000\baselineskip
Estas dos secuencias derivan de secuencias de
aecuorina y son complementarias una de otra.
Este oligonucleótido fue modificado con amino
usando un modificador de amino de la empresa Clontech (San Diego,
CA) que permite modificaciones con amino en la secuencia. JK7 fue
marcado usando el marcador Ru(bpy)_{3}^{2+}.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda de oligonucleótidos para
aecuorina-RNA generado por transcripción in
vitro:
este oligo fue marcado con marcador
tanto de biotina como de Ru(bpy)_{3}^{2+}. Para la
detección de DNA de Escherichia coli se sintetizaron
oligonucleótidos específicos para la regio Trp E/D del genoma
(3) como
sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los oligonucleótidos sintéticos se
purificaron para separar cualesquiera grupos amino contaminantes
por filtración sobre gel en una columna Biogel P6 (BioRad Labs). Se
introdujo biotina a través del grupo amino en 5' de los cebadores
de PCR usando NHS-Biotina (Clontech, San Diego CA)
(4). Se introdujo
Ru(bpy)_{3}^{2+}-NHS a través del
grupo amino de los oligonucleótidos modificados como sigue. Los
oligonucleótidos (0,1 \mumoles) en 100 \mul de PBS (pH 7,4) se
hicieron reaccionar con 5 \mumoles de marcador
Ru(bpy)_{3}^{2+} disuelto en DMSO durante una
noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Los oligonucleótidos
se recuperaron de estas reacciones de marcado por precipitación en
etanol. Estudios recientes han demostrado la capacidad de marcar
eficazmente (>80%) usando 0,5 \mumoles de marcador de
Ru(bpy)_{3}^{2+} (datos no mostrados).
Los oligonucleótidos marcados se purificaron
adicionalmente por HPLC en una columna de semipreparación Vydac
C-18 de fase invertida con fases móviles de A)
acetato de tetraetilamonio 100 mM, pH 7,0 y B) 50% de A) y 50% de
acetonitrilo, llevando el gradiente de 20% a 40% de B.
Las sondas 1CHR y 1T24 se marcaron también con
P^{32} usando métodos establecidos que usan polinucleótidos
T4-quinasa que generan sondas con una actividad
específica de 77.000 cpm/ng (5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se activaron partículas Dynal M 450 activadas
con tolueno-4-sulfonato de
2-fluoro-1-metilpiridinio
usando procedimientos estándar (6). Estas partículas activadas se
hicieron reaccionar seguidamente con los oligonucleótidos JK8 y
JK8C. A 100 mg de partículas Dynal activadas se añadieron 33 mmoles
de oligonucleótido en 650 \mul de NaHCO_{3} 0,1 M y
seguidamente se incubó durante 3 horas con mezcladura. Las
partículas se bloquearon mediante la adición de etanolamina (4 ml,
0,1 M). Las partículas acopladas se mezclaron con 0,5 mg/ml de DNA
de esperma de salmón de cadena única en tampón ECL, lavado
4-5 veces en tampón ECL y vuelto a poner en
suspensión a 10 mg/ml en tampón ECL que contiene 100 \mug/ml de
DNA de esperma de salmón de cadena única.
\vskip1.000000\baselineskip
Se activaron partículas Dynal M 450 con
tolueno-4-sulfonato de
2-fluoro-1-metilpiridinio
usando procedimientos estándar (6). Las partículas activadas se
hicieron reaccionar seguidamente con estreptavidina (Sigma Ltd).
Las partículas activadas (50 mg) se lavaron con NaHCO_{3} 0,1 M y
seguidamente se añadió estreptavidina (1,5 mg) y se hicieron
reaccionar durante una noche. Las partículas se bloquearon mediante
la adición de etanolamina (4 ml, 0,1 M). Las partículas acopladas
se mezclaron con 0,5 mg/ml de DNA de esperma de salmón de cadena
única en tampón ECL, se lavaron 4-5 veces en tampón
ECL y se volvieron a poner en suspensión a 10 mg/ml en tampón ECL
que contenía 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón de cadena
única. Las partículas de estreptavidina de Dynal
M-280 de mostraron también ser útiles, pero
proporcionaron señales inferiores con la presente secuencia de
ensayos. Para aplicaciones en inmunoensayos, las partículas se
bloquearon con BSA después de un acoplamiento con antígenos so
antígenos o anticuerpos, usando los tampones usados para un
revestimiento pasivo.
\vskip1.000000\baselineskip
A 15 mg de BSA (en 2-3 ml de
PBS), se añadieron 105 \mul de dimetilsulfóxido que contenía 50
mg/ml de biotina-x-NHS (Clontech,
San Diego CA. 5002-1) y seguidamente se mezcló y se
incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se
interrumpió añadiendo 30 \mul de glicina 1 M y se incubó a
temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se
purificó por cromatografía de filtración sobre gel (Biorad,
Bio-Gel P6). Esta biotina-BSA se
filtró usando una jeringa de 0,2 \mum. Se añadieron 5 mg de
biotina-BSA en 10 ml de tampón de
carbonato/bicarbonato de sodio 0,2 M, tampón (carbonato/bicarbonato)
a pH 9,6), a 300 mg de gránulos Dynal con carbonato/bicarbonato
(Dynal 14002). Esta mezcla se centrifugó y se incubó durante una
noche a temperatura ambiente con mezcladura. Estas partículas
fueron magnéticamente separadas tras la adición de 10 ml de
diluyente ECL y 100 \mul de tRNA (10 mg/ml). Esta mezcla se
incubó durante 3-4 horas a temperatura ambiente con
mezcladura. Estas partículas se lavaron una vez con 10 ml de
diluyente ECL y volvieron a poner en suspensión en 10 ml de
diluyente ECL y 100 \mul de tRNA (10 mg/ml). Esta mezcla se mezcló
y se incubó a 2-6ºC durante una noche para
estabilizar las proteínas sobre las partículas. Las partículas
fueron magnéticamente separadas y se pusieron en suspensión en 10
ml de PBS que contenía 15 mg de estreptavidina (Scripps S 1214) y
seguidamente se mezcló durante una hora. Las partículas se lavaron
4 veces en 10 ml de diluyente ECL, con 5 minutos de mezcladura para
cada lavado. Las partículas se volvieron a poner finamente en
suspensión en 29,7 ml de diluyente ECL y 300 \mul de tRNA (10
mg/ml) hasta una concentración final de 10 mg/ml de partículas + 100
\mug/ml de tRNA.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad para detectar ECL después de una
hibridación para partículas se demostró mediante la hibridación de
partículas acopladas a JK8 y JK8C (Ejemplo 22) con oligonucleótido
JK7 marcado con Ru(bpy)_{3}^{2+}. Se mezclaron
lotes individuales de partículas (300 \mug) en tampón ECL con 50
\mul de tampón ECL que contenía 12,5, 6,3, 3,01 y 1,5 fmoles de
JK7 marcado. Estas mezclas se hibridaron durante 4 horas a 52ºC y
seguidamente se lavaron con 1 ml de tampón ECL y se volvieron a
poner en suspensión en 830 \mul de tampón ECL. Estas mezclas se
analizaron como se describió en el Ejemplo 1. La sonda JK7 es
complementaria a la secuencia JK8 y no es complementaria a la
secuencia JK8C.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados mostrados en la Tabla VIII
demuestran la capacidad para detectar, por hibridación específica,
la presencia de secuencias específicas directamente inmovilizadas en
la superficie de partículas por ECL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se revistieron partículas de Dynal M 450 con
anticuerpo específico para anticuerpos de RNA/DNA (7) siguiendo
procedimientos estándar (Ejemplo 10). Las especies específicas de
RNA se generaron usando plásmidos derivados de gen de aecuorina
clonada (8) del solicitante. Brevemente, el plásmido pA5' fue
cortado con EcoRI purificado y sometido a transcripción
in vitro usando polimerasa T3 RNA que generaba
T3-RI RNA (RNA negativo). También se cortó plásmido
pA5' con BamHI purificado y sometido a transcripción in
vitro usando polimerasa T7 RNA que generaba
T7-Bam RNA (RNA positivo). Estas dos especies de RNA
representan por tanto dos especies complementarias de RNA. Estas
especies de RNA se purificaron por extracción con un volumen igual
de fenol:cloroformo (50:50) seguida de extracción con cloroformo y
precipitación de la materia sobrenadante usando 2,5 volúmenes de
etanol. La cantidad de RNA se determinó usando electroforesis de
gel y espectrofotometría. Estos métodos están bien establecidos y
son conocidos por los expertos en la técnica (9). Se marcó
estreptavidina con marcador de Ru(bpy)_{3}^{2+}
usando métodos establecidos, usando un exceso en moles de 25:1 de
marcador de Ru(bpy)_{3}^{2+} sobre estreptavidina
(Ejemplo 13). Esta estreptavidina marcada se purificó usando una
columna de iminobiotina siguiendo métodos establecidos (10). La
estreptavidina se estimó que contenía 10 marcadores de
Ru(bpy)_{3}^{2+} por tetrámero de estreptavidina.
Esta estreptavidina marcada se complejó seguidamente con T35
biotinilado, esto se consiguió usando una mezcla uno a uno de
oligonucleótido a estreptavidina marcada. Específicamente, 20 pmoles
de cada uno se mezclaron en un volumen final de 15 \mul de tampón
ECL y se incubaron durante una noche a 4ºC para formar el complejo
marcado de estreptavidina-oligonucleótido
(SA-T35). Las muestras de RNA positivo y negativo
(10 mg) se hibridaron a 2 \mul del complejo SA-T35
(ensayo de una etapa) o 25 mg del T35 biotinilado (ensayo de dos
etapas). Las muestras se llevaron hasta 50 \mul y se hibridaron
durante 3 horas a 50ºC tras la adición de 200 \mug de partículas
revestidas con anticuerpos anti-DNA/RNA en 20 \mul
de PBS-0,1 BSA. La mezcla se mezcló a temperatura
ambiente durante 1 hora y seguidamente se sometió a dos lavados en
tampón ECL. Las muestras de la hibridación con el complejo
SA-T35 se volvieron a poner en suspensión en 530
\mul de tampón ECL y se analizaron como se describió en el
Ejemplo 1. Las muestras de la hibridación con T35 solo biotinilado
se incubaron seguidamente con 50 pmoles de estreptoavidina marcada y
se incubaron durante 1 h con mezcladura tras dos lavados con tampón
ECL. Las muestras de la hibridación se volvieron a poner en
suspensión en 530 \mul de tampón ECL y se analizaron como se
describió en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la
Tabla IX.
Tabla IX.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron reacciones de cadenas de
polimerasa esencialmente como se describió (11, 12 y 13). Las
reacciones fueron normalmente de 100 \mul salvo que se establezca
otra cosa. Las PCR se llevaron a cabo en el modo asimétrico
dirigido a la incorporación del marcador de
Ru(bpy)_{3}^{2+}, usando 5 pmoles del
oligonucleótido biotinilado y 50 pmoles de oligonucleótido marcado
con Ru(bpy)_{3}^{2+}. Se realizó el ensayo para
la mutación puntual de Ha-ras bajo condiciones
idénticas, pero sin el oligonucleótido marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2+}. También, se realizó el ensayo
HPV de no separación asimétricamente, pero haciendo uso de un exceso
de diez veces del oligonucleótido biotinilado, normalmente 40
pmoles. Las condiciones del ciclo térmico fueron como sigue, para
el ensayo de HPV 18 y 16 de incorporación directa, el perfil fue
93ºC 1 segundo, 50ºC 1 segundo, 60ºC 2 minutos; para el ensayo de
mutación puntual de Ha-ras 93ºC 1 segundo, 69ºC 2
minutos; para el ensayo de HPV de no separación 93ºC 10 segundos,
50ºC 30 segundos, 60ºC 2 minutos. El número de ciclos para estos
experimentos de PCR fue de 30 a 40, dependiendo del ensayo y del
grado de sensibilidad requerido.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación de una PCR usando la
incorporación directa del oligonucleótido marcado con
Ru(bpy)_{3}^{3+}, la mezcla de reacción completa
(90-100 \mul) se añadió a 600 \mug de partículas
magnéticas I acopladas a estreptavidina, y seguidamente se incubó
durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación. La fase
sólida en estas muestras se separó usando dispositivos magnéticos,
se lavó dos veces con tampón ECL, se volvió a poner en suspensión
en 530 \mul de tampón ECL y seguidamente se analizó por
electroquimioluminiscencia como se describió en el Ejemplo 1. La
Fig. 3 ilustra este formato de ensayo. Los resultados para este
formato de ensayo se demostraron con muestras (2, 14) de virus de
papiloma humano. Específicamente, estudios de la incorporación
directa de oligonucleótidos marcados con
Ru(bpy)_{3}^{3+} en productos de PCR biotinilados
hicieron uso de tipos de virus estrechamente relacionados HPV16 y
HPV18. Se hizo un ensayo en cuanto a la presencia de HPV1 16 y 18
usando muestras de DNA positivas para ambos tipos de virus y
oligonucleótidos específicos para cada tipo de virus. Los cebadores
fueron como sigue: 2PV16 2PV18 fueron biotinilados y 3PV16, 3PV18
eran oligonucleótidos marcados con
Ru(bpy)_{3}^{3+}. Los oligonucleótidos 2/3PV16 y
2/3PV18 eran específicos para HPV 16 y 18, respectivamente. El
marcador de Ru(bpy)_{3}^{3+} capturado en gránulos
resultante fue analizado en cuanto a ECL como se describió en el
Ejemplo 1. Los resultados se representaron gráficamente como
recuentos de ECL para la combinación de cebadores de cada muestra;
véase la Fig. 6.
Para demostrar la naturaleza cuantitativa del
formato de ensayo de la presente invención, se generaron una curva
estándar de marcador de Ru(bpy)_{3}^{3+}
directamente incorporado y oligonucleótidos biotinilados en
productos de PCR HPV16. El marcador de
Ru(bpy)_{3}^{3+} unido a gránulos resultante se
analizó en cuanto a ECL como se describió en el Ejemplo 1. Los
recuentos de fotones picos de ECL se representaron gráficamente
frente a concentraciones crecientes de DNA de HPV 16, expresadas
como relación de copias virales a copias totales de DNA celular.
Los cebadores usados en este análisis de HPV16 fueron 1PV16
(marcador de biotina) y marcador de
Ru(bpy)_{3}^{3+} de 2PV16. El DNA usado para cada
PCR se mantuvo a una constante de 1 \mug usando DNA de timo de
ternera. Los resultados para esta curva estándar se muestran en la
Figura 7. Estos resultados de especifidad y cuantificación para
este formato demuestran la capacidad de estos marcadores de ECL para
producir ensayos sencillos y rápidos basados en DNA. Esto demuestra
también la capacidad del marcador para ejercer una acción
interfacial en reacciones enzimáticas sin interferir en el
procedimiento enzimático.
Se llevaron a cabo reacciones PCR de genes
Ha-ras usando HRP1 y HRP2 oligómeros. Usando HRP1
biotinilado con HRP2 sin marcar, el producto de PCR resultante se
puede hibridar a sondas de marcador de
Ru(bpy)_{3}^{3+}, 2CHR y 2T24. Inversamente,
usando HRP2 biotinilado con HRP1 sin marcar, el producto de PCR
resultante se puede hibridar a sondas de marcadores de
Ru(bpy)_{3}^{3+}, 1CHR y 1T24. El DNA usado era
DNA placental humano (normal) y de células NIH353 de ratón,
transfectado con el gen mutante Ha-ras del carcinoma
de vejiga T24 (15).
El protocolo del ensayo fue como sigue: se
añadieron 90 \mul de mezcla de reacción PCR a 600 \mug de
estreptavidina acoplada a partículas magnéticas I, y seguidamente
se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La fase sólida
en estas muestras se separó usando dispositivos magnéticos, se lavó
con NaOH 50 mM, se lavó con tampón de hibridación (NaCl 0,9 M,
NaPO_{4}, pH 7,7, EDTA 5 mM, 0,1% p/v de ficoll, 0,1% p/v de
polivinilpirrolidona, 0,1% p/v de albúmina de suero bovino) y se
volvió a poner en suspensión en tampón de hibridación que contenía
10 \mug/ml del oligonucleótido marcado con
Ru(bpy)_{3}^{3+}. Estas muestras se hibridaron
durante 15 minutos a 66ºC.
La fase sólida se separó usando dispositivos
magnéticos, se lavó dos veces con NaCl 0,1 M, NaPO_{4} 50 mM, pH
7,7, EDTA 5 mM, se lavó con cloruro de tetrametilamonio 3 M,
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, triton
X-100 al 0,025% a temperatura ambiente una vez y a
66ºC dos veces durante 20 minutos cada vez. La fase sólida se lavó
con tampón ECL tres veces, se volvió a poner en suspensión en 530
\mul de tampón ECL y se detectó por electroquimioluminiscencia
como se describió en el Ejemplo 1. La Fig. 4 ilustra este formato de
ensayo.
Los ensayos para productos de PCR de
Ha-ras usando sondas marcadas con P^{32} fueron
similares a los que usaban marcador de
Ru(bpy)_{3}^{3+} con la excepción de que la fase
sólida se volvió a poner finalmente en suspensión en 250 \mul de
tampón ECL. Estas muestras en suspensión se transfirieron
seguidamente a 5 ml de fluido de escintilación en un contador de
escintilación líquida Beckman LS-100C.
En la Fig. 8 se muestran datos de un ensayo de
mutación puntual para el oncogen Ha-ras. La PCR se
realizó como se ilustra en la Fig. 4 usando HRP2 biotinilado con
HRP1 sin marcar (para las sondas 1T24 y 1CHR) y HRP1 biotinilado
con HRP2 sin marcar (para sondas 2T24 y 2CHR), generando dianas de
cadena única unidas a gránulos para la hibridación. Las muestras
de DNA eran el gen normal Ha-ras (placenta) y el gen
mutante (NIH3T3-T24) Ha-ras. La
hibridación del DNA unido a gránulos con
Ru(bpy)_{3}^{3+}-marcador-1T24
(1T24),
Ru(bpy)_{3}^{3+}-marcador-2T24
(2T24),
Ru(bpy)_{3}^{3+}-marcador-1CHR
(1CHR) y Ru(bpy)_{3}^{3+}-2CHR
(2CHR) estuvo seguida de lavados con TEMAC. El
Ru(bpy)_{3}^{3+}-marcador unido a
gránulos resultante fue analizado en cuanto a ECL como se describió
en el Ejemplo 1. Los resultados se representaron gráficamente como
recuentos de ECL para cada combinación de sondas de muestras. Los
resultados (Fig. 8) fueron como era de esperar, hibridándose bien
las sondas normales al DNA normal (véanse las sondas CHR) e
hibridándose las sondas mutantes al gen mutante (véanse las sondas
T24). Fue de interés que estas sondas no rindieron todas de forma
equivalente. Para investigar esta anomalía aparente, se estudiaron
adicionalmente estas sondas usando sondas marcadas con P^{32} con
y sin marcador de Ru(bpy)_{3}^{3+}. Esta
evaluación de la especifidad de las sondas marcadas con
Ru(bpy)_{3}^{3+} usando sondas marcadas con
P^{32} para el oncogen Ha-ras se llevó a cabo como
sigue. La PCR se realizó como se describió en la Fig. 8 usando
solamente HRP2 biotinilado con HRP1 sin marcar (para sondas 1T24 y
1CHR). Las sondas usadas fueron: 1T24 y 1CHR que contenían P^{32}
(1T24-P, 1CHR-P) como testigos;
conteniendo 1T24 y 1CHR tanto P^{32} como marcador de
Ru(bpy)_{3}^{3+} para determinar los efectos del
marcador de Ru(bpy)_{3}^{3+}. Las muestras se
lavaron como anteriormente con TEMAC. El P^{32} unido a gránulos
resultante, además de en una combinación de escintilación, se
analizó en un contador de escintilación. Los resultados se
representaron gráficamente como recuentos de P^{32} por segundo
para cada combinación de sondas de muestras (véase la Fig. 9). Este
resultado demostró que las sondas de P^{32} y las sondas marcadas
con Ru(bpy)_{3}^{3+} funcionan de forma
equivalente y que los problemas con la especifidad de las sonsas son
debidos a las secuencias de sondas específicas usadas. Para
demostrar adicionalmente esta equivalencia del marcador de
Ru(bpy)_{3}^{3+} de la invención y P^{32}, se
realizó una comparación entre estas sondas marcadoras. La
amplificación se realizó como se describió anteriormente usando DNA
placental, usando HRP1 biotinilado con HRP1 sin marcar (para sondas
1T24 y 1CHR). Seguidamente se tomaron muestras del producto de PCR
resultante para proporcionar un conjunto de muestras que contenían
cantidades diferentes de producto. Estos conjuntos de muestras se
hibridaron seguidamente con sondas marcadas con P^{32}
(1T24-P32 y 1CHR-P32) o bien con
marcador de Ru(bpy)_{3}^{3+}
(1T24-Ru(bpy)_{3}^{3+} y
1CHR-Ru(bpy)_{3}^{3+}). Los
resultados de cada estudio se normalizaron seguidamente usando el
valor medio de cada marcador para los 90 \mul de la muestra. Estas
cifras normalizadas permiten una comparación más eficaz de la señal
de fondo y la respuesta comparativa de los dos métodos. El recuadro
en la Fig. 10 ilustra la respuesta al nivel inferior de la curva de
dilución. Las muestras se manejaron como se describió anteriormente
(Fig. 8 y Fig. 9). Los resultados en la Fig. 10 demostraron la
equivalencia de los dos marcadores con indicaciones de una mejor
respuesta de la sonda marcada con Ru(bpy)_{3}^{3+}
de los presente inventores. Estos estudios demostraron la capacidad
de las sondas marcadas con Ru(bpy)_{3}^{3+} para
funcional tan bien como las sondas marcadas con P^{32} en su
capacidad para discriminar cambios de base únicos en DNA de las
muestras. Esta evidencia indica que el marcador de
Ru(bpy)_{3}^{3+} hace poco para afectar a las
propiedades de la sonda marcada en reacciones de hibridación.
Para el ensayo de no separación sobre HPV 18, se
realizó una reacción PCR simétrica con un exceso del cebador
biotinilado. Esta reacción PCR genera un exceso de DNAs de cadena
única biotinilados disponibles entonces para una hibridación
directa mediante las sondas marcadas con de
Ru(bpy)_{3}^{3+}. Para la hibridación, se
añadieron 1000 recuentos de ECL de oligonucleótido marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2+} (^{-}2ng) específico para el
gen HPV amplificado a 50 \mul de la PCR después de la compleción
de la amplificación, y seguidamente se incubó durante 15 minutos a
50ºC. A esta mezcla de hibridación se añadieron 60 \mul de tampón
ECL que contenía 600 \mug de partículas magnéticas I acopladas a
estreptavidina y se incubó con agitación a temperatura ambiente
durante 15 minutos. El volumen de la muestra se aumentó a 530 \mul
mediante la adición de tampón ECL y seguidamente se detectó la
electroquimioluminiscencia como se describió en el Ejemplo 1. La
Fig. 5 ilustra este formato de ensayo. Para demostrar este ensayo
de no separación, se realizó una curva estándar de HPV18 DNA. La
PCR se realizó usando 2VP18 y 1PV18 sin marcar usando HeLa DNA (14).
La reacción PCR resultante se hidridó seguidamente con la sonda
específica
Ru(bpy)_{3}^{2+}-marcador-3PV18.
La mezcla de hibridación se añadió seguidamente a partículas
revestidas con estreptavidina y el marcador de
Ru(bpy)_{3}^{2+} unido a gránulos resultante se
analizó directamente en cuanto a ECL como se describió en el Ejemplo
1. Los resultados se representaron gráficamente como recuentos de
ECL frente a copias de HPV18 añadidas a la PCR con un testigo de la
sonda del oligonucleótido ras (véase la Fig. 11). Estos resultados
demuestran la capacidad de generar ensayos rápidos
de no separación para secuencias de ácidos nucleicos basados en las propiedades del sistema de ensayo de ECL.
de no separación para secuencias de ácidos nucleicos basados en las propiedades del sistema de ensayo de ECL.
\vskip1.000000\baselineskip
El formato de ensayo descrito a continuación
hace uso de dos oligonucleótidos, los cuales se hibridan ambos a la
misma cadena de DNA uno a continuación de otro, una sonda permite la
captura; la otra marca el complejo (hibridación en emparedado).
Este ensayo se demostró usando DNA de E. coli y sondas
específicas para la región genética trp E/D. El DNA de E.
coli se preparó siguiendo protocolos estándar (16). El DNA
testigo de esperma de salmón se adquirió de la empresa Sigma Ltd. A
las muestras de DNA se añadieron 14 \mul de tampón de hibridación
(10X PBS, EDTA 10 mM 6 0,7% de SDS), 2 ng de TRP.CO4 marcado con
biotina y 5 ng de TRP.CO3 marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2+}. Estas muestras se llevaron
hasta 100 \mul con agua. Las muestras se calentaron a 97ºC y se
incubaron a 97ºC durante 10 minutos, se enfriaron a 50ºC y se
hibridaron durante 2 horas. A estas muestras se añadieron 20 \mul
de partículas magnéticas II revestidas con estreptavidina y se
mezclaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las partículas se
lavaron seguidamente 4 veces en tampón ECL, se volvieron a poner en
suspensión en suspensión en 500 \mul de tampón ECL y se
analizaron como se describió en el Ejemplo 3. El DNA positivo es
E. coli y el DNA negativo es esperma de salmón. Los
resultados se muestran en la Tabla X.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demostraron la capacidad del
sistema de ensayo ECL para funcionar en la detección de un gen
genómico en E. coli usando un formato de ensayo de
hibridación en emparedado sobre DNA no amplificado. Las partículas
magnéticas I revestidas con estreptavidina se pueden usar
análogamente en la forma en que se usan en este ejemplo las
partículas magnéticas II revestidas con estreptavidina.
Se puede usar la concentración de complejo
marcado en una superficie de detección para aumentar la sensibilidad
de ensayos que usan detectores de ondas evanescentes. Tales
detectores pueden usar fibras(s) óptica(s) o bien
guía(s) de ondas ópticas planas 300 para llevar la luz 310
desde una fuente de luz al entorno del fluido. La luz se refleja a
través de la guía de ondas o fibra óptica por reflexión interna
total (TIR) 310' que se produce cuando un haz de luz incidente
choca con una superficie interfacial entre un medio dieléctrico de
elevado índice de refracción (n_{1}) y uno de índice de
refracción inferior (n_{2}). Cuando en ángulo de
incidencia del haz de luz es mayor que el ángulo crítico 315 que es
\theta_{0} (el ángulo mostrado ente la línea perpendicular 300
y la trayectoria de la luz 310'), \theta_{0} =
sen^{-1}(n_{2}/n_{1}), entonces la luz se refleja
internamente en 100% en la superficie interfacial. En guías de ondas
ópticas y fibras ópticas, la luz se desplaza con un ángulo de
incidencia mayor que este ángulo crítico, y se propaga a través del
medio por reflectancia interna total. La Fig. 22 expone la
propagación de TIR en una guía de ondas o fibra óptica.
Aunque el rayo de luz se refleja totalmente en
cada interacción con la superficie interfacial, el campo
electromagnético no es cero fuera del medio. Los requisitos físicos
de continuidad a través de la superficie interfacial requieren que
el campo electromagnético disminuya exponencialmente a medida que
penetra fuera de la fibra o guía de ondas en el entorno externo.
Este campo se denomina el campo evanescente 320 y es capaz de
excitar fluorescencia en los fluoróforos. La velocidad de
disminución del campo evanescente depende de la longitud de onda
incidente, de los índices de refracción n_{1} y
n_{2} y del ángulo de incidencia. Usando una guía de ondas
de cuarzo y luz visible en un entorno acuoso, el campo evanescente
320 disminuye en aproximadamente 90% en una distancia de 10 nm
desde la superficie interfacial de la guía de ondas/solución. En la
Fig. 22 el medio circundante 330 tiene un índice de refracción
n_{2} y la(s) fibra(s) óptica(s) o
guía(s) de ondas 300, un índice de refracción
n_{1}.
Los mismos principios que crean el campo
evanescente para que la luz se propague en la guía de ondas o fibra
óptica permiten que la luz que se genera con la luminiscencia de los
fluoróforos sea nuevamente capturada en el elemento óptico de forma
eficaz. Adicionalmente, cualquier luz producida fuera de la zona
evanescente (320) es eficazmente rechazada de la entrada al
elemento óptico. La combinación de estos efectos permite que las
fibras ópticas o guías de ondas se usen como elementos ópticos
eficaces para medir la presencia y concentración de marcadores
fluoróforos en sus superficies o sus proximidades en un entorno
acuoso. La patente de EE.UU. nº 4.447.546 describe un método y
aparato adecuados para realizar inmunoensayos de fluorescencia que
emplean una fibra óptica para excitar y medir la fluorescencia en
la zona evanescente a partir de un inmuno-reactivo
marcado.
La invención se puede aplicar para mejorar la
sensibilidad de ensayos de unión fluorescentes que usan fibras
ópticas o guías de ondas. El ensayo se realiza usando reactivos
marcados con restos fluorescentes. Después de incubar las
partículas, la muestra y los reactivos, las partículas se concentran
en la superficie de la guía de ondas o fibra óptica. Como el área
superficial de las partículas es mayor que el área geométrica de la
guía de ondas o fibra óptica, se pueden recoger más fluoróforos en
la zona evanescente que rodea al elemento óptico. Por tanto, la
señal luminiscente de las partículas puede ser mayor y la
cuantificación del analito será más sensible, dando lugar a límites
de detección mejorados.
Por tanto, tras haber descrito en detalle las
realizaciones preferidas de la presente invención, debe entenderse
que son posibles muchas variaciones evidentes de la misma dentro del
alcance de la presente invención, tal como se define en las
reivindicaciones anejas.
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Claims (19)
1. Un aparato para realizar un ensayo de unión
para un analito de interés en una muestra, basado en la medición de
la electroquimioluminiscencia de una superficie de un electrodo, que
comprende:
a) una celda electroquímica que tiene un volumen
para albergar muestras y medios de entrada y salida;
b) un sistema de electrodo de trabajo para
proporcionar energía electroquímica para provocar la
electroquimioluminiscencia;
c) un dispositivo de control del voltaje para
suministrar señales de voltaje al sistema del electrodo de
trabajo;
d) un imán colocado en una orientación apropiada
y en estrecha proximidad al electrodo de trabajo, de forma que las
partículas magnéticamente sensibles se concentrarán en la superficie
del electrodo de trabajo, en donde dicho imán está colocado por
debajo de dicho electrodo y en donde dicho imán es capaz de ser
retirado de la superficie del electrodo;
e) un dispositivo de detección/medición de la
luz para medir la electroquimioluminiscencia provocada en la
superficie del electrodo; y
f) una bomba para proporcionar el transporte de
fluido hacia, a través y desde la celda electroquímica.
2. El aparato definido en la reivindicación 1,
en el que dicho imán es capaz de ser retirado durante la medición
de la electroquimioluminiscencia.
3. El aparato definido en la reivindicación 1 ó
2, en el que dicho imán comprende al menos un imán en orientación
norte-sur colocado perpendicular a dicho
electrodo.
4. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho imán comprende
al menos un par de imanes que consisten en un primer imán y un
segundo imán que están separados por un material que no es
magnéticamente sensible.
5. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicho imán es un
imán permanente.
6. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicho imán es un
electroimán.
7. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que dicho volumen que
contiene muestra atraviesa una entrada y una salida a dicha
celda.
8. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en el que dicha celda es una
celda de flujo transversal.
9. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que dicho dispositivo de
detección/medi-
ción de la luz comprende un dispositivo acoplado de carga o una película fotográfica.
ción de la luz comprende un dispositivo acoplado de carga o una película fotográfica.
10. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que dicho dispositivo de
detección/medición de la luz comprende un tubo
fotomultiplicador.
11. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que dicho dispositivo de
detección/medición de la luz comprende un fotodiodo.
12. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en el que dicho electrodo
comprende oro o carbono.
13. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en el que dicho electrodo
comprende platino.
14. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, que comprende adicionalmente
al menos un contraelectrodo.
15. El aparato definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, que comprende adicionalmente
al menos un contraelectrodo y un electrodo de referencia y dicho
dispositivo de control del voltaje es un potenciostato.
16. Uso del aparato de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-15 en un ensayo de
electroquimioluminiscencia para un analito de interés, en el que las
partículas magnéticamente sensibles son magnéticamente recogidas en
dicha superficie del electrodo y la electroquimioluminiscencia
emitida es medida usando dicho detector de la luz.
\newpage
17. Un método para usar el aparato de una
cualquiera de las reivindicaciones 1-16 en un ensayo
de electroquimioluminiscencia para un analito de interés, que
comprende recoger magnéticamente dichas partículas magnéticamente
sensibles sobre dicha superficie del electrodo y medir la
electroquimioluminiscencia emitida.
18. El método definido en la reivindicación 17,
en el que dicho imán es retirado durante la medición de la
electroquimioluminiscencia.
19. El aparato definido en la reivindicación 1,
en el que dicho electrodo es sustancialmente horizontal.
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