ES2291470T3 - Metodo y composicion para injertos de piel. - Google Patents

Abstract

Una piel quimérica que comprende células queratinocitos humanos inmortalizados en cocultivo con queratinocitos de donante en la que la piel comprende una arquitectura tisular normal y marcadores de diferenciación de epitelios escamosos estratificados y en la que la expresión y localización de los marcadores de diferenciación de la última etapa son típicas de piel humana intacta.

Description

Método y composición para injertos de piel.

Antecedentes de la invención

La piel es el mayor órgano en el cuerpo humano y funciona como barrera protectora contra los agentes, tales como agentes infecciosos en el medio externo y como una barrera impermeable que mantiene la homeostasis de fluidos y previene la evaporación de la humedad del tejido. La piel intacta previene la infección local de la dermis u otro tejido subyacente con microorganismos. Si no se controlan, tales infecciones locales pueden volverse invasivas y pueden dar como resultado sepsis o infección sistémica.

La pérdida temporal de piel a menudo da como resultado mortalidad o morbidez. La pérdida generalizada de la integridad de la piel está la mayoría de las veces asociada a quemaduras graves. La importancia de la función de barrera de la piel está demostrada por el hecho de que para una edad dada, la mortalidad está directamente relacionada con el tamaño de la quemadura. Los actuales estándares de atención recomiendan restaurar la piel del paciente tan pronto como sea posible para restaurar la homeostasis de fluidos y la función de barrera.

A los pacientes quemados se les restaura la piel la mayor parte de las veces con injertos de piel autóloga. Se usan generalmente injertos de piel autóloga, pero fallan frecuentemente. Por ejemplo un paciente con grandes quemaduras puede que no tenga suficiente piel donante disponible para cubrir el lugar receptor.

Están actualmente disponibles dos principales técnicas alternativas de recuperación del paciente. Una es extirpar completamente todo el tejido quemado y cubrir el paciente con una epidermis temporal. INTEGRA (Johnson and Johnson, New Brunswick, New Jersey) es una bicapa de neo-dermis que tiene una capa interna de colágeno de bovino y sulfato de condroitina-6 y una capa externa de silicona. Después de la angiogénesis neodérmica de 14 a 21 días después, se retira quirúrgicamente la capa externa de silicona y se restaura la piel del paciente con autoinjertos delgados ampliamente mallados. Los autoinjertos delgados ofrecen la distintiva ventaja de permitir que curen los sitios donantes limitados y que se recojan en serie. Aunque la comunidad de quemados ha adoptado INTEGRA, la susceptibilidad de infección ha limitado su uso en pacientes con heridas (1) por quemadura sucias o infectadas. El otro principal factor limitante ha sido la disponibilidad de sitios donantes. Los pacientes con heridas por quemadura catastróficas puede que no tengan suficientes sitios donantes disponibles a pesar de la ventaja obvia de requerir autoinjertos mucho más delgados.

La segunda técnica comúnmente empleada es extirpar la herida por quemadura y proporcionar una cubierta dérmica/epidérmica temporal de piel de cadáver para restaurar la función de barrera de la superficie. Se recogen y colocan en cultivo queratinocitos autólogos. EPICEL (Genzyme Corporation, Cambridge, Massachusetts), el único recambio de piel permanente comercialmente disponible, forma queratinocitos de capas de 2 a 6 células de grosor unidos a una gasa de malla fina. Estos autoinjertos están disponibles de 3 a 4 semanas después de la biopsia. En el caso de grandes quemaduras, este calendario a menudo coincide con el desarrollo de sepsis en la herida por quemadura. La contaminación bacteriana y otros factores provocan altos porcentajes de fallo de EPICEL que no se observan con los injertos (2) de piel de grosor dividido tradicionales.

Los avances adicionales en el cuidado de heridas por quemadura pueden venir del campo de la manipulación de tejidos. Una propuesta ha sido restaurar la función de barrera con cultivos quiméricos de queratinocitos autólogos mezclados con cultivos celulares alogénicos establecidos (3, 4). Esto podría permitir el cubrimiento más temprano de la herida disminuyendo significativamente el tiempo requerido para la formación del tejido definitivo. La más lenta restauración permanente de la piel ocurriría con queratinocitos autólogos ya que las células alogénicas son rechazadas. Un obstáculo principal es la necesidad de una línea de queratinocitos alogénicos establecidos cultivados y ensayados. Esto hasta ahora no ha sido viable dado que los queratinocitos envejecen en el cultivo y se tendrían que establecer y ensayar continuamente nuevas líneas de queratinocitos.

La piel está compuesta de dos capas, la dermis y la epidermis. La dermis es un tejido conjuntivo que contiene fibroblastos incrustados en una matriz de colágeno y fibras elásticas. La epidermis, en comparación, consiste principalmente en células con poco tejido conjuntivo.

Los queratinocitos son el principal componente celular de la epidermis y comprenden alrededor del 80% de las células en la piel del ser humano adulto. Son el componente epidérmico responsable de proporcionar las propiedades de barrera, reparadoras y regeneradoras de la piel. Su nombre deriva de su componente citoesquelético predominante, las queratinas. Las queratinas son las subunidades de filamentos de queratina y están divididas en dos tipos: queratinas de tipo I (ácidas) y queratinas de tipo II (básicas o neutras). Todos los epitelios expresan queratinas de tipo I y de tipo II, que varían en peso molecular de 40 kDa a 70 kDa. Diferentes tejidos epiteliales expresan pares específicos de queratinas. Los heterodímeros de las queratinas del tipo I y II forman filamentos intermedios que confieren resistencia a la tracción y soporte estructural a las células y dan como resultado el tejido epitelial.

La epidermis consiste en cuatro capas morfológica y bioquímicamente diferentes. La capa basal de queratinocitos está en contacto con la membrana base, que separa la epidermis de la dermis. Las células basales son los únicos queratinocitos en la piel intacta capaces de mitosis y, como tales, son la fuente de todos los demás queratinocitos en la epidermis. Se unen al substrato por medio de hemidesmosomas y a las células adyacentes por medio de desmosomas y uniones adherentes (revisado en Jensen and Wheelock, 1996). Las células de la capa basal son de forma columnar y producen las queratinas K5 y K14.

La primera capa de queratinocitos suprabasal es el estrato espinoso, llamado así por el aspecto "espinoso" de los muchos contactos desmosomales entre células adyacentes. Los queratinocitos en esta capa ya no producen K5 y K14 sino, que en su lugar, sintetizan las queratinas específicas de diferenciación K1 y K10. Las células comienzan a producir involucrina y transglutaminasas específicas de la epidermis en el estrato espinoso superior. Morfológicamente, las células espinosas son mayores y más aplanadas que las células basales (revisado en Holbrook, 1994).

La expresión de la involucrina está localizada en el citoplasma de las células suprabasales y granulares (Mansbridge and Knapp, 1987; Murphy et al., 1984) de piel normal. También se ha mostrado que la involucrina se localiza pericelularmente en estas capas, pero los tejidos usados para estos experimentos de imnunohistoquímica no se fijaron, y se supuso que la proteína se difundió hacia los bordes celulares durante o después del proceso de división (Smola et al., 1993; Watt, 1983).

Las transglutaminasas son una familia de enzimas dependientes de calcio que catalizan la reticulación covalente de proteínas entre sí o con poliaminas (revisado en Rice et al., 1994). La isozima transglutaminasa de queratinocito, TG_{K} está unida a la membrana en la epidermis suprabasal y cataliza la reticulación de involucrina y por lo menos otras seis proteínas membranosas para formar la envoltura cornificada (CE) (revisada en Rice et al., 1994). La CE es una estructura proteínica insoluble altamente estable formada debajo de la membrana plasmática que es resistente a detergentes y agentes reductores y confiere resistencia y rigidez a las células terminalmente diferenciadas de la capa epidérmica más alta. Muchos componentes de la CE, incluyendo TG_{K}, se sintetizan en el estrato espinoso aunque la envoltura no se forme hasta la transición de las células desde el estrato granuloso hasta el estrato córneo. También se encuentra TG_{K} en todas las capas subsecuentes de la epidermis (Michel et al., 1997; Mansbridge et al., 1987; Asselineau et al., 1989). La enzima está inactiva hasta que, en la etapa final de diferenciación, una pérdida de integridad de la membrana da como resultado un influjo de calcio dentro de la célula (Aeschlimann and Paulsson, 1994).

A medida que los queratinocitos se diferencian más, forman el estrato granuloso. Las células de esta capa están caracterizadas por gránulos de queratohialina de distinta densidad electrónica que contienen profilagrina, el precursor proteínico de filagrina (revisado en Dale et al., 1994). Las células granulares también contienen gránulos llenos de lípido que, durante la zona de transición entre el estrato granulo y el estrato córneo, se funden con la membrana plasmática y desprenden sus contenidos en el espacio extracelular, confiriendo hidrofobia a la superficie epidérmica.

A medida que los queratinocitos que se diferencian transitan desde la capa granular a la cornificada, la profilagrina se escinde para dar filagrina, que está implicada en la alineación y agregación vía enlaces disulfuro de los haces de queratina denominados macrofibrillas (revisado en Holbrook, 1994). Las macrofibrillas son la unidad estructural básica de la envoltura cornificada. En secciones de piel normal, la filagrina está localizada en la capa granular, con algo de tintura débil continua en las láminas cornificadas (Michel et al., 1997; Asselineau et al., 1989; Mansbridge et al., 1987). Se debe advertir que los anticuerpos contra la filagrina detectan profilagrina así como sus productos escindidos, lo que da cuenta del fuerte patrón de tinción punteada de los gránulos de queratohialina del estrato granuloso.

La capa epidérmica más alta es el estrato córneo. Las células de esta capa, habiendo completado el proceso de diferenciación, han perdido sus núcleos y toda la función metabólica. Consisten principalmente en filamentos de queratina envueltos por la CE ahora completa y la membrana plasmática que la recubre. La células córneas están unidas conjuntamente por desmosomas modificados y finalmente se mudan en láminas desde la superficie de la piel.

Los queratinocitos también producen moléculas de adhesión de caderina. Las caderinas clásicas, caderina N, E y P, son una subfamilia de caderinas que se localizan en las uniones adherentes y median en la adhesión célula-célula por medio de interacciones homotípicas. Estas glicoproteínas transmembrana dependientes de calcio juegan papeles reguladores principales en la formación de tejido y facilitan las interacciones intercelulares. También se cree que los complejos de caderina participan en la transducción de señales intracelulares por medio de su asociación con el citoesqueleto de actina (Knudsen et al., 1998). Los queratinocitos producen tanto la caderina E como la P. La caderina E se encuentra en todas las capas vivas de la epidermis (revisado en Jensen and Wheelock, 1996) mientras que la caderina P se encuentra en el estrato basal y células inmediatamente suprabasales.

La piel se regenera cada 28 días (revisado en Sams, 1996). A medida que los queratinocitos basales pierden contacto con la membrana base producen células hijas que se diferencian terminalmente cuando se mueven hacia arriba a través de las capas suprabasales hacia la superficie de la piel. La diferenciación terminal implica una serie de cambios bioquímicos y morfológicos que dan como resultado una capa de escamas aplanadas muertas que llevan a cabo las funciones protectora y de barrera de la piel. Estas células cornificadas se mudan rutinariamente y reemplazan con células recién diferenciadas, manteniendo el equilibrio controlado entre proliferación y diferenciación implicado en la homeostasis tisular.

Cultivo de queratinocitos

Las células cultivadas aisladas de piel humana disgregada se han usado durante alrededor de dos décadas para estudiar el crecimiento y diferenciación de queratinocitos (revisado en Leigh et al., 1994). Los queratinocitos de prepucio humano cultivados en presencia de una capa de alimentación de fibroblasto de embrión de ratón 3T3 o en formulaciones de medio libre de suero exhibían un crecimiento sostenido durante aproximadamente 80 duplicados de la población previamente a la senectud (revisado en Leigh and Watt, 1994). Los queratinocitos humanos cultivados en estas condiciones pueden expresar proteínas específicas de diferenciación, tales como involucrina y queratinas K1 y K10, de una manera específica de la posición (revisado en Fuchs and Weber, 1994).

Aunque se observan consistentemente características de diferenciación escamosa y estratificación limitada en monocapas de queratinocitos cultivados, no es evidente una arquitectura tisular normal. El descubrimiento de que las células epidérmicas en cultivo sumergido tradicional crecen óptimamente cuando se depositan encima de fibroblastos no proliferantes fue una contribución significativa al estudio de la biología celular de los queratinocitos (Rheinwald, 1980; revisado en Fuchs, 1993). El uso de este sistema de cultivo permitió a los investigadores cultivar en serie queratinocitos para una amplia variedad de propósitos. Desgraciadamente, el sistema de cultivo sumergido permite una estratificación aberrante limitada que consiste solo en unas pocas capas de queratinocitos, que carece de las características morfológicas y bioquímicas específicas de un verdadero epitelio estratificado. Por ejemplo, no se producen en el cultivo sumergido varios marcadores de diferenciación epidérmica normal, tales como queratinas 1 y 10 y el marcador de la última etapa, filagrina (revisado en Fuchs, 1993). Varios factores limitan este sistema in vitro. Primero, la epidermis in vivo se asienta encima de la dermis y recibe sus nutrientes y señales de crecimiento vía difusión desde la dermis a través de la membrana base hasta las células basales que la recubren. Esto imparte una polaridad al tejido que no se puede conseguir en cultivos de células sumergidas tradicionales que se alimentan a través de todas las superficies superiores del medio que las baña. Segundo, las células epiteliales cultivadas de esta manera no producen una membrana base y carecen de la exposición a sus estímulos mesenquimales para la diferenciación y crecimiento normal (revisado en Fusenig, 1994). Tercero, aunque la capa de fibroblasto "de alimentación" promueve la proliferación de queratinocitos, el cultivo de células de esta manera da como resultado las mismas características de diferenciación ausente o aberrante como se ve en los cultivos cultivados sobre un substrato de plástico. Esto indica que los queratinocitos requieren una mesénquima más compleja de fibroblastos y proteínas de la matriz extracelular para producir una epidermis funcional. Por consiguiente, el sistema de cultivo sumergido tradicional es apropiado solo para estudios relativamente simplistas.

Varios sistemas desarrollados y ensayados durante los últimos 20 años están diseñados para desarrollar más condiciones de cultivo de queratinocitos como in vivo. En 1979, se usaron primero geles de colágeno como "balsas" fisiológicas sobre las que cultivar queratinocitos en la interfase aire-medio (Bell et al., 1979; revisado en Fusenig, 1994; Parenteau et al., 1992). Esto permitió que los nutrientes y factores de crecimiento del medio se difundieran a través del colágeno hasta la capa basal de queratinocitos y expusieran las capas de queratinocitos superiores al aire. Estas condiciones como in vivo añadidas mejoraron la arquitectura histológica de la epidermis cultivada. Se puede conseguir la estratificación total y la diferenciación histológica usando estos métodos de cultivo "organotípicos" tridi-
mensionales, que han sido modificados continuamente para parecerse más de cerca al medio de crecimiento in vivo.

En posteriores sistemas organotípicos, se incorporaron fibroblastos vivos en geles de colágeno, los queratinocitos se colocaron encima de "balsas" de colágeno contraído, y se levantó toda la balsa hasta la interfase aire-medio (revisado en Fusenig, 1994) para emular la piel intacta, en la que las células dérmicas residentes tales como fibroblastos dérmicos están implicadas en señalar a los queratinocitos para producir una membrana base y un epitelio con un programa de diferenciación significativamente mejorado (revisado en Watt and Hertle, 1994). Los fibroblastos viables proporcionan señales valiosas y fomentaron la producción por queratinocitos cultivados de proteínas de la membrana base.

Diferenciación de queratinocitos

Tanto en la piel intacta como en el cultivo organotípico, los queratinocitos que se diferencian producen proteínas únicas para etapas de diferenciación particulares. La presencia y localización de estos marcadores proteínas se puede detectar usando métodos bioquímicos e inmunohistoquímicos y usar para determinar si un tejido epitelial se está diferenciando (estratificando) normalmente. Los perfiles de expresión de varias de tales proteínas se presentan a continuación.

Las proteínas mejor estudiadas para determinar la diferenciación epidérmica son las queratinas, lo más notablemente K5/14 y K1/10, que conforman la red de filamentos intermedios en los queratinocitos epidérmicos. Esta red proporciona un marco celular que se extiende desde el núcleo hasta las uniones de adhesión específica denominadas desmosomas y hemidesmosomas (revisado en Fuchs and Cleveland, 1998). Estas interacciones célula-célula y célula-substrato, cuando se conectan a filamentos de queratina, son responsables de anclar los queratinocitos entre sí y con la membrana base subyacente. El par de filamentos de queratina K5/K14 se expresa en las células basales de epitelio escamoso estratificado (revisado en Fuchs, 1993). Como se esperaba, el mARN de K14 está presente solo en la capa basal de epidermis humana normal (Stoler et al., 1988). A medida que las células basales de la epidermis comienzan a diferenciarse, disminuyen su expresión de K5/14 y comienzan a producir queratinas específicas de diferenciación. El par de filamentos de queratina K1 y K10 se expresa en las capas suprabasales de la epidermis (revisado en Fuchs, 1993). K1 y K10 son marcadores tempranos de diferenciación terminal cuando son producidos por queratinocitos al dejar la capa basal. En muestras de piel humana intacta, K1 es de la primera capa suprabasal a través de la superficie del tejido (Stoler et al., 1988; Stark et al., 1999; Asselineau et al., 1989; Boukamp et al., 1990).

En cultivos organotípicos de queratinocitos humanos primarios, la iniciación de la síntesis de la proteína K1 está retrasada con respecto a la piel intacta. La localización de la proteína comienza 5-8 capas celulares encima de la membrana base al contrario de las capas 1-2 en las muestras de piel normal. La inducción de la producción de K1 se normaliza después del transplante de los cultivos organotípicos sobre ratones sin pelo (Smola et al., 1993; Stark et al., 1999). Estos estudios no examinaron la expresión de mARN de K1.

La involucrina está localizada en las membranas celulares suprabasales en cultivos organotípicos de queratinocitos primarios, incluso en tejido fijo (Boukamp et al., 1990; Smola et al., 1993; Stark et al., 1999; Watt et al., 1987), y varios grupos encontraron también que el patrón membranoso permanecía después del transplante a ratones sin pelo (Breitkreutz et al., 1997; Watt et al., 1987).

La expresión de TG_{K} parece variar en cultivos organotípicos de queratinocitos humanos normales, apareciendo primero en el estrato espinoso o en el estrato granuloso y continuando hacia arriba a través del estrato córneo (Michel et al., 1997; Stark et al., 1999).

Los cultivos organotípicos de queratinocitos humanos normales también muestran la localización de filagrina en los gránulos de los estratos superiores o el tejido epidérmico (Boukamp et al., 1990; Michel et al., 1997; Start et al., 1999).

Además de los marcadores de diferenciación, se puede evaluar también la integridad estructural y funcional de un tejido epitelial controlando la presencia y localización de las proteínas de adhesión.

Hasta la fecha, no se han examinado ni la caderina E ni la P en cultivo organotípico de queratinocitos primarios, aunque se ha detectado caderina E inmunohistoquímicamente en piel normal (Haftek et al., 1996).

Smola y colaboradores (Smola et al., 1998) han mostrado claramente que los cultivos organotípicos compuestos de fibroblastos y queratinocitos dérmicos normales desarrollan una zona de membrana base capaz de soportar estructuras de adhesión específica del tipo celular tales como hemidesmosomas.

El documento WO 99/43787 se refiere a un recambio de piel quimérica viva.

Breve sumario de la invención

La presente invención se resume en que se emplea ventajosamente un cocultivo de células queratinocitos humanos inmortalizados y células de donante humano como piel quimérica para su uso en injertos de piel y otros métodos de cirugía plástica.

Por consiguiente, la invención proporciona una piel quimérica que comprende una célula queratinocito humano inmortalizado en cocultivo con queratinocitos de donante en la que la piel comprende arquitectura tisular normal y marcadores de diferenciación de epitelios escamosos estratificados y en la que la expresión y localización de los marcadores de diferenciación de la última etapa son típicos de piel humana intacta.

La invención proporciona también un método para crear una piel quimérica, que comprende co-cultivar células queratinocitos humanos inmortalizados y queratinocitos obtenidos de un paciente, de modo que se forma una piel quimérica en la que la piel comprende arquitectura tisular normal y marcadores de diferenciación de epitelio escamoso estratificado y en la que la expresión y localización de los marcadores de diferenciación de la última etapa son típicos de la piel humana intacta.

La invención proporciona también un cocultivo organotípico que comprende queratinocitos humanos inmortalizados y queratinocitos de donante en la que la piel comprende arquitectura tisular normal y marcadores de diferenciación de epitelio escamoso estratificado y en la que la expresión y localización de marcadores de diferenciación de la última etapa son típicas de piel humana intacta.

La invención proporciona también el uso de una piel, monocapa, o un cocultivo organotípico de la invención para la fabricación de un medicamento para uso en un método para tratar un paciente por injerto de piel.

Los objetivos, características y ventajas de la invención serán evidentes con la consideración de la siguiente descripción tomada junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de las distintas vistas de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama de flujo de preparación de cultivo organotípico.

Las Fig 2A-H son un conjunto de cortes transversales del tejido cocultivado. Las Figs 2A y B son células NIKS^{GFP}. Las Figs. 2C y D son queratinocitos LAW-1. Las Figs 2E y F son una relación 1:1 de NIKS^{GFP} y queratinocitos LAW-1. Las Figs. 2G y H son una relación 3:1. Las Figs. 2A, C, E y G están tintadas con hematoxilina y eosina. Las Figs. 2B, D, F y H están tintadas con Hoescht para ver el núcleo celular.

La Fig. 3 es un gráfico de barras de una tasa de crecimiento de cultivo monocapa.

La Fig. 4 es un gráfico de barras de una tasa de crecimiento normalizada en un cultivo monocapa.

Las Figs. 5A-J son un conjunto de cortes transversales que describen análisis inmunohistoquímicos de marcadores de diferenciación y moléculas de adhesión. Las Figs. 5A y B indican queratina 1. Las Figs. 5C y D indican transglutaminasa 1. Las Figs. 5E y F indican filagrina. Las Figs 5G y H indican caderina E. Las Figs 5I y J indican caderina P. Las Figs. 5 A, C, E, G e I están tintadas con hematoxilina y eosina para ver la histología tisular. Las Figs. 5B, D, F, H y J se visualizan usando una técnica de inmunofluorescencia indirecta.

La Fig. 6 es un gráfico del área media de contracción de la herida.

La Fig. 7A-C es un conjunto de vistas de secciones de biopsia. La Fig. 7 A es el aspecto in vivo. La Fig. 7B es con hematoxilina y eosina para ver la histología. La Fig. 7C es la expresión de GFP.

La Fig. 8A y B es un conjunto de vistas de secciones de biopsia 28 días después del injerto. La Fig. 8A es histología. La Fig. 8B es la expresión de GFP.

La Fig. 9A, B y C es un conjunto de vistas que analizan el centrómero x/y. La Fig. 9A es el gráfico quimérico en el día 28. La Fig. 9B y C son análisis del centrómero x/y.

Descripción de la invención

La presente invención implica usar una combinación de queratinocitos de portador humano condicionalmente inmortales cultivados in vitro y queratinocitos derivados de paciente donante para formar injertos de piel. Describimos aquí que tales queratinocitos del portador derivados de fuentes de cultivo celular in vitro se pueden cocultivar con queratinocitos de paciente donante usando métodos de cultivo organotípico o monocapa para producir una piel quimérica manipulada apropiada para injerto. Unos queratinocitos condicionalmente inmortales son queratinocitos que son inmortales en condiciones de cultivo definidas. Un queratinocito se considera inmortal si se puede cultivar en las condiciones de cultivo definidas durante más de 20 pasos, preferentemente más de 30 pasos, aún más preferentemente más de 40 pasos y todavía más preferentemente durante más de 50 pasos. En esta solicitud, las expresiones "condicionalmente inmortal" e "inmortal" se usan intercambiablemente. Los queratinocitos de portador humano condicionalmente inmortales cultivados in vitro son alógenicos (no del receptor del injerto). Los queratinocitos de donante o derivados del paciente son preferentemente autólogos (del receptor del injerto).

En algunas realizaciones preferidas, la línea celular NIKS (Near-Diploid Immortalized KeratinocyteS) espontáneamente inmortalizados se utiliza como fuente de queratinocitos del portador. Las células NIKS (ATCC CRL-12191) no han sido expuestas a agentes mutágenos, poseen genes p53 y Rb naturales, retienen los requerimientos de cultivo específico de tipo de célula y las propiedades de diferenciación, no son tumorígenas en ratones sin pelo y SCID, están libres de virus, y se parecen a la arquitectura total de la piel en cultivo organotípico y monocapa y responden a factores de crecimiento que regulan el crecimiento de queratinocitos, tales como EGF y TGF-\beta1. Esto es en contraste con las células HaCaT (Boelsma et al., 1999; Schoop et al., 1999) que en los últimos pasos exhiben crecimiento independiente del anclaje, tienen alta eficiencia de formación de colonias, alcanzan altas densidades de saturación, y no requieren condiciones de cultivo específicas del tipo de célula para el cultivo en serie (Fusenig and Boukamp, 1998).

A diferencia de otras líneas celulares de queratinocitos inmortalizados espontáneamente tales como HaCaT, los queratinocitos NIKS se diferencian hasta el mismo punto y a la misma velocidad que los queratinocitos BC-1Ep padre en cultivo organotípico con fibroblastos dérmicos para formar un epitelio estratificado que es histológicamente idéntico a las células BC-1-Ep padre y a otras cepas de queratinocito normal. El epitelio queratinizante multicapa está altamente organizado y exhibe características típicas de piel intacta tales como hemidesmosomas, desmosomas, tonofilamentos de queratina, y gránulos de queratohialina. Los queratinocitos tanto parentales como NIKS producen hemidesmosomas en cultivo organotípico sugiriendo que ha ocurrido la síntesis, deposición y ensamblaje de glicoproteínas de la matriz extracelular.

En el cocultivo organotípico o monocapa estándar, las células NIKS no crecen más que los queratinocitos humanos, no exhiben patrones aberrantes de expresión de proteínas de diferenciación (entre aquellas ensayadas), y obedecen a las fronteras de compartimento de tejido, ni cayendo por debajo de la membrana base ni actuando como una célula tumoral. Las células NIKS no provocan la replicación aberrante de fibroblastos dérmicos en el gel de colágeno.

Los NIKS se cultivaron originalmente de prepucio de neonato y subsecuentemente desarrollaron una adición genética estable espontánea del brazo largo del cromosoma 8 que permite que estas células tengan una ventaja de supervivencia significativa en el cultivo. Las patentes de EE.UU. 5.989.837 y 6.214.567 describen la creación y uso de células NIKS. Véase también, Allen-Hoffmann, B.L., et al., "Normal Growth and Differentiation in a Spontaneously Immortalized Near-Diploid Human Keratinocyte Cell Line, NIKS" J. Invest. Dermatol. 114: 444-455, 2000, que describe condiciones apropiadas de cultivo organotípico y monocapa para mantenimiento condicionalmente inmortal de las células NIKS.

Tales cultivos de células organotípicos y monocapa quiméricos manipulados y/o injertos de tejido equivalente de piel quimérica manipulada tendrían las características únicas de proporcionar recubrimiento inmediato de la herida y también proporcionar células autólogas para el cierre formal final de la herida. El nuevo tejido equivalente a la piel se puede usar, por ejemplo, como recambio de la piel usando un injerto autólogo (NIKS + células del paciente), alogénico (NIKS + células sin relacionar en un paciente), o xenogénico (NIKS + células de cerdo o células de primate) para, por ejemplo, cierre de heridas (úlceras diabéticas, quemaduras de la piel, enfermedad necrotizante de la piel, etc.) o propósitos cosméticos (estiramientos faciales, otros procedimientos de cirugía plástica). El tejido quimérico equivalente a la piel de la invención se puede proporcionar en tamaños y grosores apropiados para su uso en métodos de injerto y otros métodos de una manera en la que el profesional experto en tales métodos usaría los tejidos e injertos existentes.

La presente invención no está limitada, sin embargo, al uso de células NIKS en cocultivo quimérico. Ciertamente, la presente invención contempla el uso de una variedad de otras células portadoras no tumorígenas condicionalmente inmortalizadas y líneas celulares que forman envolturas cornificadas cuando se inducen a diferenciarse y que sufren diferenciación escamosa normal y mantienen requerimientos de crecimiento específico del tipo celular. Otras fuentes de tales células pueden incluir queratinocitos y fibroblastos dérmicos biopsiados de seres humanos y donantes cadáveres (Auger et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.- Aninal 36:96-103; patentes de EE.UU. Nos. 5.968.546 y 5.693.322, prepucios de neonato (Asbill et al., Pharm. Research 17(9): 1092-1097 (2000); Meana et al., Burns 24: 621-630 (1998); patentes de EE.UU. Nos. 4.485.096; 6.309.760; y 5.536.656, y líneas celulares de queratinocitos inmortalizados tales como células NM1 (Baden, In Vitro Cell. Dev. Biol. 23(3): 205-213 (1987) y células HaCaT (Boucamp et al., J. Cell. Biol. 106: 761-771 (1998)). Cada una de estas líneas celulares se puede cultivar o modificar genéticamente como se describe con más detalle a continuación. El alcance de la invención se extiende también al uso de células y líneas celulares derivadas directa o indirectamente de los tipos de células apropiadas anteriormente mencionadas, que incluyen derivados de células NIKS, en los que tales células y líneas celulares retienen la capacidad de funcionar en el método de la invención.

En general, el método de la presente invención está caracterizado por las siguientes etapas: Se obtendría un cultivo de queratinocitos de portador in vitro, preferentemente un cultivo organotípico de queratinocitos inmortalizados tales como células NIKS. Se puede desear manipular genéticamente los queratinocitos cultivados. Por ejemplo, las células se pueden manipular para expresar o mejorar la expresión de una proteína u otro producto génico, o para suprimir una proteína o producto génico. Otras manipulaciones pueden incluir la introducción o retirada (ablación) de un gen o la mutación de un gen o producto génico existente. Por ejemplo, en algunas realizaciones preferidas, las células queratinocitos de portador o células derivadas del paciente se transfectan o transforman con un gen de interés (por ejemplo, el gen que codifica el factor de tipo Kruppel humano (GKLF)4). En realizaciones preferidas adicionales, el gen de interés está operablemente unido al promotor en un vector apropiado. En algunas realizaciones preferidas, se utilizan promotores específicos de tejido tales como los promotores de involucrina o transglutaminasa 3. En otras realizaciones preferidas, la expresión de GKLF es conducida por el sistema de promotor inducible del plásmido pTetOn (Clontech, Palo Alto, CA). En otras realizaciones más, se puede usar un promotor constitutivo. Se contempla que otros vectores de expresión de mamíferos son apropiados para su uso en la presente invención, que incluyen, pero no están limitados a, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG (Stratagene)pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Se puede usar cualquier otro plásmido o vector con tal de que se pueda replicar y permanecer viable en el hospedante. En algunas realizaciones preferidas de la presente invención, los vectores de expresión de mamífero comprenden un origen de replicación, un promotor y mejorador apropiado, y cualquier sitio de unión de ribosomas necesario, sitios de poliadenilación, sitios de emplame de donante y aceptor, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas flanqueadoras 5'. En otras realizaciones, se pueden usar secuencias de ADN derivadas del empalme SV40, y sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. Adicionalmente, el gen KLF4 se puede insertar vía un vector retroviral. La transfección se puede conseguir por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a coprecipitación con calcio-fosfato, electroporación, bombardeo de micropartículas, transfección mediada por liposomas, o infección retroviral.

En realizaciones aún más adicionales, el injerto se manipula para proporcionar un agente terapéutico a un sujeto. La presente invención no está limitada al suministro de cualquier agente terapéutico particular. Ciertamente, se contempla que se pueden suministrar varios agentes terapéuticos al sujeto, que incluyen, pero no están limitados a, enzimas, péptidos, hormonas de péptido, otras proteínas, ARN ribosómico, ribozimas y ARN antisentido. Estos agentes terapétuticos se pueden suministrar para varios propósitos, que incluyen pero no están limitados al propósito de corregir defectos genéticos. En algunas realizaciones preferidas particulares, el agente terapéutico se suministra para el propósito de desintoxicar un paciente con un error de metabolismo de nacimiento heredado (por ejemplo, aminoacidopatías) en el que el injerto sirve como tejido natural. Se contempla que el suministro del agente terapéutico corrige el defecto. En algunas realizaciones, los queratinocitos usados para formar el equivalente a la piel incluyen un polinucleótido que codifica un agente terapéutico (por ejemplo, insulina, factor de coagulación IX, eritropoyetina, etc.) y el equivalente de piel se injerta en el sujeto. El agente terapéutico se suministra a continuación a la corriente sanguínea del paciente u otros tejidos del injerto. En realizaciones preferidas, el polinucleótido que codifica el agente terapéutico está operablemente unido a un promotor apropiado. La presente invención no está limitada al uso de algún promotor particular. Ciertamente, se contemplan varios promotores, que incluyen, pero no están limitados a, promotores inducibles, constitutivos, específicos del tejido y específicos de queratinocitos. El algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el agente terapéutico se introduce directamente en los queratinocitos (es decir, por coprecipitación con fosfato de calcio o vía transfección de liposomas). En otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica el agente terapéutico se proporciona en forma de un vector y el vector se introduce en los queratinocitos por métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el vector es un vector episomal tal como un plásmido. En otras realizaciones, el vector se integra dentro del genoma de los queratinocitos. Los ejemplos de vectores integrantes incluyen, pero no están limitados a, vectores retrovirales, vectores de virus adenoasociados, y vectores transposón.

En otras realizaciones más, se pueden usar técnicas tales como recombinación homóloga para incrustar o retirar genes. En realizaciones particularmente preferidas, los genes para \alpha-2 macroglobulina, o los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) se suprimen o inactivan. Se describen técnicas y reactivos para recombinación homóloga en las patentes de EE.UU. Nos. 5.416.260; 5.965.977; y 5.981.214.

A continuación, se identificaría un paciente y se aislarían células para cocultivo. Para cultivar queratinocitos humanos en cultivo monocapa, se obtiene una muestra de tejido. Los queratinocitos se aíslan de piel humana u otros epitelios escamosos estratificados. Los cultivos de queratinocitos se establecen depositando alícuotas de una sola suspensión de células en presencia de fibroblastos 3T3 de ratón suizo tratados con mitomicina C como se describió previamente (Allen-Hoffmann and Rheinwald, 1984). El medio de cultivo de queratinocitos estándar está compuesto de una mezcla de medio F-12 de Ham: medio de Eagle modificado con Dulbecco (DME) (3:1, concentración final de calcio 0,66 mM) enriquecido con suero bovino fetal al 2,5% (FCS), 0,4 \mug/ml de hidrocortisona (HC), 8,4 ng/ml de toxina de cólera (CT), 5 \mug/ml de insulina (Ins), 24 \mug/ml de adenina (Ade), 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 unidades de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (P/S). Las células se subcultivan rutinariamente a intervalos semanales a 3 x10^{5} células por 100 mm de plato de cultivo de tejido (aproximadamente una división 1:25) con una capa de alimentación tratada con mitomicina C. El factor recombinante humano EGF y el factor transformador de crecimiento \beta1 (TGF-\beta1) se obtienen de R&D Systems (Minneapolis, MN).

Para producir un cultivo quimérico de queratinocitos de donante y queratinocitos del portador, preferentemente queratinocitos NIKS, se usa la relación deseada de queratinocitos de donante y queratinocitos de portador en el momento del subcultivo o en cualquier otro momento durante el procedimiento de cultivo. Por ejemplo, se pueden añadir células NIKS a un cultivo de queratinocitos de donante adherentes, se pueden añadir queratinocitos de donante a un cultivo monocapa de NIKS adherentes, o las células de portador y los queratinocitos de donante se pueden mezclar conjuntamente en el momento del subcultivo.

En algunas realizaciones preferidas para el cultivo de las células de queratinocito del portador (por ejemplo, células NIKS) y queratinocitos del paciente en cultivo organotípico, se forma una base de colágeno mezclando fibroblastos humanos normales con colágeno de tipo I en medio de Ham F-12 que contiene FCS al 10% y P/S. La base de colágeno se deja contraer durante 5 días para formar balsas de colágeno contraído. Los queratinocitos del paciente y los queratinocitos NIKS se depositan sobre balsas de colágeno contraído a 3,5 x 10^{5} células en 50 \mul de una mezcla de F-12 de Ham:DME (3:1, concentración de calcio final 1,88 mM) enriquecido con FCS al 2%, 0,4 \mug/ml de HC, 8,4 ng/ml de CT, 5 \mug/ml de Ins, 24 \mug/ml de Ade, y P/S. Se deja que las células se unan durante 2 horas antes de inundar la cámara de cultivo con medio (día 0). Los días 1 y 2 se realimentan las células. El día 4, las células se levantan a la interfase de aire con almohadillas de algodón y se cambian a medio de cornificación que contiene F-12 de Ham:DME, (3:1, concentración de calcio final 1,88 mM) enriquecido con FCS al 2%, 0,4 \mug/ml de HC, 8,4 ng/ml de CT, 5 \mug/ml de Ins, 24 \mug/ml de Ade, y P/S. A las células se les alimenta con medio de cornificación cada 3 días hasta que se consigue la estratificación completa (aproximadamente 15 días). Se puede identificar el cultivo monocapa con éxito por la presencia visual de queratinocitos en la placa de cultivo. El cultivo organotípico con éxito se identifica observando las relaciones de queratinocitos derivados del paciente a queratinocitos de portador.

Las relaciones de queratinocitos derivados del paciente a queratinocitos de portador ejemplificadas aquí no se pretende que sean limitantes. Ciertamente, basado en la orientación dada aquí, está claro que se pueden usar varias relaciones en la presente invención. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una relación apropiada de queratinocitos derivados del paciente a queratinocitos de portador varía de alrededor de 0,5%:99,5% a alrededor de 80%:20%, preferentemente de alrededor de 10%:90% a alrededor de 60%:40%; y lo más preferentemente una relación alrededor de 20%:80%.

Un injerto de piel de la presente invención tendrá la misma arquitectura tisular y marcadores de diferenciación y adhesión de la piel normal. Ventajosamente, un injerto de piel de la presente invención se puede hacer crecer más rápido que los injertos de piel hechos de piel derivada del paciente.

Los cocultivos quiméricos organotípicos de queratinocitos de donante y portador, y los injertos de piel resultante de la presente invención, muestran una arquitectura tisular que se parece mucho a la arquitectura de la piel normal y a los cultivos de queratinocitos humanos organotípicos sustancialmente como se describe en los Antecedentes de la Invención, supra y como se muestra en la Fig. 5, teniendo en cuenta las variaciones típicas observadas en cultivos organotípicos. Por ejemplo, los cocultivos quiméricos organotípicos de queratinocitos humanos primarios y células NIKS se incrustaron en parafina, seccionaron y tintaron con hematoxilina y eosina para el examen histológico. Los cocultivos exhiben un estrato basal discreto que consiste en células basales columnares. El estrato espinoso que lo recubre está compuesto de varias capas más grandes de células progresivamente aplanadas. Las capas superiores muestran una capa granular que tiene gránulos de queratohialina tintada con hematoxilina.

Los cultivos exhiben una distribución normal de proteínas específicas del tipo de célula asociada a varias etapas de diferenciación escamosa. La localización de marcadores de diferenciación se visualizó usando inmunofluorescencia indirecta. El marcador de la primera etapa de diferenciación queratina 1 aparece como tinción citoplasmática difusa en todos los cultivos, siendo iniciada la expresión en la primera o secunda capa de células suprabasales y continuando hacia arriba a través del estrato.

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La tinción inmunofluorescente muestra una localización difusa de proteína citoplasmática de involucrina comenzando en las primeras capas de varias células suprabasales. Los cultivos de NIKS exhiben idéntica localización espacial de involucrina a los 8, 11 y 13 días como a los 21 días (Loertscher et al., 2000). Los análisis previos de muestras de piel humana normal intacta han demostrado la localización citoplasmática esperada de la involucrina (Mansbridge and Knapp, 1987; Murphy et al., 1984). Nuestros datos muestran proteína involucrina localizada en el compartimento citoplasmático, como se esperaba. Este hallazgo apoya nuestra reivindicación de diferenciación normal como in vivo de cultivos organotípicos quiméricos de queratinocitos humanos y queratinocitos de NIKS.

El marcador de diferenciación intermedia TG_{K} exhibe patrones e intensidad de localización idénticos en cultivos de queratinocitos humanos y NIKS organotípicos quiméricos (Figura 5). Su aspecto distinto como panel de abejas refleja la localización de la enzima TG_{K} unida a la membrana.

El marcador de diferenciación de última etapa filagrina está localizado en los gránulos de queratohialina en las células del estrato granuloso de NIKS y balsas de queratinocitos primarios, como se indica por su patrón de tinción punteada (Figura 5). Los cultivos organotípicos quiméricos de queratinocitos humanos y queratinocitos NIKS mostraron localización espacial normal de filagrina (Figura 5) a los 15 días.

Se usó también la inmunohistoquímica para determinar la presencia y localización de caderina E y P. En los cocultivos de la invención, la caderina E aparece en las regiones de contacto célula-célula en todos los cultivos, comenzando la expresión en la capa suprabasal inmediata y continuando hacia arriba a través de los estratos vivos (Figura 5). El patrón de expresión de caderina P es también similar en todos los cultivos, pero se inicia en el estrato basal y continua solo a través de las primeras varias capas suprabasales (Figura 5). Estos hallazgos reflejan los observados en piel intacta y demuestran que los cultivos de queratinocitos NIKS y queratinocitos humanos organotípicos quiméricos producen un patrón apropiado de moléculas de caderina comparados con los cultivos organotípicos de queratinocitos humanos solos y/o piel humana intacta.

La presente invención se entenderá más completamente por consideración de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos Métodos Métodos de cultivo celular

Se aislaron queratinocitos de donante (GS-1-EP, LAW-1-EP) de prepucios humanos de recién nacido. Se obtuvieron muestras después de la circuncisión con la aprobación del Human Subjects Committee and Institutional Biosafety Committee del hospital. Los cultivos de GS-1-EP, LAW-1-EP y queratinocitos NIKS se establecieron depositando alícuotas de una sola suspensión celular en presencia de fibroblastos 3T3 de ratón suizo tratados con mitomicina C (mito-3T3) como se describió previamente (6). El medio de cultivo de queratinocitos estándar estaba compuesto de una mezcla de medio F-12 de Ham:medio de Eagle modificado con Dulbecco (DME) (3:1, concentración de calcio final 0,66 mM) enriquecido con suero bovino fetal al 2,5% (FCS), 0,4 \mug/ml de hidrocortisona (HC), 8,4 ng/ml de toxina de cólera (CT), 5 \mug/ml de insulina (Ins), 24 \mug/ml de adenina (Ade), 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 unidades de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (P/S). Las células se subcultivaron a intervalos semanales a 3 x 10^{5} células por placa de cultivo de tejido de 100 mm (aproximadamente a una división de 1:25) con una capa de alimentación mito-3T3.

Generación de NIKS que expresan proteína fluorescente verde (NIKS^{GFP})

Se preparó ADN de plásmido usando el Kit Endotoxin Free Maxiprep (Qiagen, Valencia, CA). pGreenLantern (Gibco-BRL, Rockville, MD) y pcDNA3neo (Invitrogen, Carlsbad, CA) se linearizaron usando las enzimas de restricción XmnI y BglII (Promega, Madison, WI) respectivamente. Se usó un total de 20 \mug de ADN (15 \mug de pGreenLantern y 5 \mug de pcDNA3neo) para la transfección de células NIKS con una relación de 3:1 de pGreenLantern a pcDNA3neo. Los NIKS se depositaron a una densidad de 3 x 10^{5} células sobre una capa de alimentación de mito-3T3 en placas de 100 mm. A las células se les dieron 48 horas para adherirse, momento en el que se retiró la capa de mito-3T3 con EDTA 0,5 mM. Las células NIKS en el paso 30-40 se transfectaron usando el lípido policatiónico GeneFECTOR (VennNova, Miami, FL). La mezcla de transfección se hizo añadiendo ADN de plásmido linearizado y GeneFECTOR hasta un volumen final de 500 \mul con agua mili-Q estéril para cada placa de 100 mm. La mezcla de transfección se agitó girándola suavemente y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células NIKS se lavaron dos veces con DME y se realimentaron con 5 ml de DME. Se añadieron quinientos \mul de mezcla de transfección a cada placa de 100 mm de un modo gota a gota y las células se incubaron durante 5 horas a 37ºC con 5% de CO_{2}. Se retiró el medio y las células se lavaron dos veces con DME y se realimentaron con medio que contiene suero. Se observaron las células 24 horas después de la transfección con un microscopio de fluorescencia invertida IX-70 (Olympus, Melville, NY) equipado con un filtro de paso de banda corta de GFP para observar la expresión de GFP previamente al análisis por Flow-Activated Cell Sorting (FACS).

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Evaluación de cultivo quimérico en tasas de crecimiento de queratinocitos

Se depositaron separadamente y se mezclaron NIKS^{GFP}, LAW-1-EP, y GS-1-EP con una relación de mezcla de 1:1,1:10 y 1:100 (NIKS^{GFP}:GS-1-EP o LAW-1-EP). Las células se depositaron a una concentración final de 1 x 10^{5} células/placa de 60 mm sobre una capa de alimentación de 3T3 y se contaron cuatro días después. Los experimentos se repitieron dos veces con NIKS^{GFP} y GS-1-EP y una vez con LAW-1-EP. Los resultados se normalizaron también por las diferencias en eficiencia de deposición entre las diferentes cepas de queratinocitos.

Métodos de cultivo organotípico

Los cultivos organotípicos se cultivaron como se describe previamente (7) en cámaras de cultivo Transwell con los siguientes cambios: se formó una base de colágeno mezclando fibroblastos de neonato humano normales, cepa CI-1-F, con colágeno de tendón de cola de rata de tipo I en medio F-12 de Ham que contiene FCS al 10% y P/S. La base de colágeno se dejó contraer durante 4 a 7 días. Se depositaron separadamente LAW-1-EP, GS-1-EP y NIKS^{GFP} (paso 47) y con las siguientes relaciones: (90% NIKS^{GFP}, 10% LAW-1-EP), (87% NIKS^{GFP}, 12,5% LAW-1-EP), (75% NIKS^{GFP}, 25% LAW-1-EP), (50% NIKS^{GFP}, 50% LAW-1-EP). Se depositaron un total de 3,5 x 10^{5} células sobre la base de colágeno contraído en 50 \mul de una mezcla de F-12 de Ham:DME (3:1, concentración de calcio final 1,88 mM) enriquecida con 0,2% de FCS, 0,4 \mug/ml de HC, 8,4 ng/ml de CT, 5 \mug/ml de Ins, 24 \mug/ml de Ade, y P/S. Se dejó que se unieran las células durante 2 horas antes de que la cámara de cultivo fuera inundada con medio (día 0). El día 2 se realimentaron las células. El día 4, las células se levantaron hasta una interfase aire-medio con almohadillas de algodón y se cambiaron a medio de cornificación que contiene F-12 de Ham:DME, (3:1, concentración de calcio final 1,88 mM) enriquecido con FCS al 2%, 0,4 \mug/ml de HC, 8,4 ng/ml de CT, 5 \mug/ml de Ins, 24 \mug/ml de Ade, y P/S. A las células se les alimentó con medio de cornificación cada 3 días y se recogieron el día 16 (Figura 1).

Histología y métodos de inmunohistoquímica

Las muestras se fijaron durante 2 horas con paraformaldehído al 1%. En preparación para la congelación, los cultivos se sumergieron en 20% sacarosa/PBS durante la noche a 4ºC antes de ser congelados en OCT en un baño de isopentano enfriado sobre nitrógeno líquido. Los cultivos crioconservados y las biopsias de injerto se seccionaron en serie (5 \mum), se montaron sobre portaobjetos de vidrio, se tintaron con hematoxilina y eosina, y se observaron con un microscopio invertido Olympus IX-70. Las imágenes se adquirieron con una cámara DEI-750 (Optronics Engineering) y software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Para el análisis inmunohistoquímico de los marcadores de diferenciación, los tejidos crioconservados se seccionaron en serie (5 \mum), se montaron sobre portaobjetos de vidrio, y se fijaron brevemente en acetona a -20ºC. Las secciones se lavaron con PBS, se bloquearon con suero de cabra normal al 3% (Sigma, St. Louis, MO), y se incubaron con anticuerpo primario durante 1 hora. Los anticuerpos primarios incluyen: antiqueratinocito transglutaminasa (dilución 1:100) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA), antifilagrina (dilución 1:250) (Biiomedical Technologies Inc., Stoughton, MA), antiqueratina 1 (dilución 1:50) (Novo Castra, Newcastle upon Tyne, UK), anticaderina E (dilución 1:80) (Transduction Laboratoires, Lexington, KY), y antiinvolucrina (dilución 1:5000) (Sheibani, 1994). Las secciones se incubaron a continuación con inmunoglobulina-G conjugada con Alexa 594 (dilución 1:1000) (Molecular Probes, Eugene OR), y se contratiñeron con Hoechst 33258 (1 \mug/ml). Todas las incubaciones ocurrieron a temperatura ambiente excepto la incubación del anticuerpo primario de anticaderina P, que ocurrió a 37ºC. Las secciones se observaron con un microscopio invertido Olympus IX-70 equipado con filtros de paso de banda FITC y Hoechst. Las imágenes se adquirieron con una cámara DEI-750 (Optronics Engineering) y software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Injerto de cultivos organotípicos quiméricos

Se realizaron experimentos con animales usando ratones Nu/Nu atímicos (5 semanas de edad) obtenidos de Harlan Sprague Dawley según las regulaciones del Animal Research de la Universidad de Wisconsin y aprobadas por el Animal Care and Use Committee. Los ratones se anestesiaron usando isoflurano al 3% para la inducción de la anestesia y se mantuvieron a continuación con isoflurano al 1,5%-2,5% durante la duración del procedimiento. Se realizó una punción del dedo de los ratones para evaluar el nivel de anestesia previamente al comienzo del procedimiento de injerto. La gestión del dolor postoperatorio se alivió con buprenorfina (0,05 \mug/Kg subcutáneamente). Se colocaron antibióticos (sulfametoxazol y trimetoprim 200 mg/40 mg por 5 ml) en agua potable (10 ml/250 ml de H_{2}O) durante los tres primeros días del postoperatorio. Los ratones se limpiaron con gluconato de clorhexidina al 4% (Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE) y se lavaron con disolución salina estéril previamente a la incisión. Los defectos de la piel se hicieron sobre el dorso del ratón. Los injertos cultivados organotípicamente se colocaron con la parte dérmica hacia abajo y se aseguraron con sutura de nailon. Se grapó sobre los injertos gasa Aquaphor (Beiersdorf-Jobst Inc, Rutherford College NC) impregnada con bacitracina de cinc (500 unidades) y pomada de sulfato de polimixina b (10.000 unidades) (E. Fougera, Melville, NY). Se grapó sobre la parte superior del injerto gasa Xeroform (tribromofenato de bismuto al 3%) (Sherwood Medical, St Louis, MO). Se grapó en su lugar una capa adicional de tejido spandex para disuadir a los ratones de quitarse las vendas. Los ratones fueron observados diariamente durante una semana después de la operación momento en el que los ratones fueron anestesiados de nuevo como se describe previamente y se retiraron las vendas. Se obtuvieron biopsias del injerto a los 7, 14 y 28 días después de la eutanasia en una cámara de CO_{2}.

Resultados Generación de NIKS que expresan la proteína fluorescente verde (NIKS^{GFP})

Manipulamos genéticamente las células NIKS para expresar proteína fluorescente verde (GFP) de gen exógeno. Estas se colocaron en un subcultivo a intervalos semanales a 3 x 10^{5} células por placa de cultivo de tejido de 100 mm con una capa de alimentación de mito-3T3. Los NIKS^{GFP} fueron un importante reactivo celular para muchas facetas de este proyecto y permitieron su visualización en el microscopio de fluorescencia (Figura 2). Los NIKS^{GFP} tienen características de crecimiento y diferenciación idénticas a las de las células NIKS sin transfectar.

Evaluación del cultivo quimérico en tasas de crecimiento de queratinocitos

Las técnicas de cultivo monocapa documentaron la formación de láminas epiteliales quiméricas contiguas de células NIKS que expresan GFP y queratinocitos humanos de donante. El cocultivo de células NIKS^{GFP} con otras cepas de queratinocitos no afectó a la tasa de crecimiento de cualquier cepa de queratinocito en el cultivo monocapa. Los subcultivos de NIKS^{GFP} llegan al 90% de confluencia a una tasa más lenta que LAW-1-EP o GS-1-EP, es decir, tienen una tasa de crecimiento más lenta en cultivo monocapa (Figura 3). Los resultados normalizados no muestran efecto del cultivo quimérico a relaciones de 1:1 y 1:10, y 1:100 sobre las tasas de crecimiento en cultivo monocapa (Figura 4).

Histología y análisis inmunohistoquímico de cultivos organotípicos

Los cultivos organotípicos in vitro de NIKS^{GFP}/LAW-1-EP quiméricos demuestran crecimiento y arquitectura normal a relaciones 1:1 y 3:1 (Figura 2). Los cultivos organotípicos de NIKS^{GFP} y GS-1-EP también demostraron arquitectura normal por tinción de hematoxilina y eosina a relaciones de 1:1, 10:1 y 100:1. El análisis inmunohistoquímico de marcadores de diferenciación y moléculas de adhesión se muestra en la Figura 5. Se encontraron queratina 1 y el marcador de diferenciación asociado a la membrana, transglutinasa 1, en una posición suprabasal. La transglutaminasa 1 se ve claramente en anillos asociados a la membrana celular. La tinción de la filagrina está apropiadamente limitada a la capa granular. El análisis de moléculas de adhesión muestra que la expresión de la caderina P está apropiadamente limitada a la capa basal y la expresión de la caderina E está localizada por toda la epidermis.

Injerto de cultivos organotípicos quiméricos

La trabajabilidad de los injertos cultivados fue notable. Se manejaron con facilidad y transfirieron con facilidad al lecho de la herida. Los injertos no se rasgaron al suturar o grapar y se mallaron con éxito a relaciones 2:1 con un mallador no aplastante (Brennan Medical, St. Paul, MN). Apareció una contracción del injerto inicial significativa con la estabilización en tamaño del injerto el día 20 (Figura 6). Las biopsias del injerto demostraron arquitectura del tejido normal y expresión de GFP el 7 y 28 día (Figuras 7, 8). El análisis de centrómero X-Y confirmó la presencia de células humanas (Figura 9).

Discusión

Los pacientes con herida de quemadura catastrófica tienen insuficiente sitio donante disponible para cubrir el sitio receptor. Las técnicas actuales disponibles para la restauración de la piel pueden ser vitales para pacientes quemados, aunque quedan problemas significativos. El mayor impedimento para el uso de queratinocitos cultivados autólogos es el retraso requerido para la expansión clonal. A menudo los pacientes desarrollan sepsis incontrolada antes de que estén disponibles los injertos cultivados, de este modo una reducción del tiempo de cultivo requerido para la creación de injertos de piel autóloga sería una importante mejora en el cuidado del paciente.

Los inventores han demostrado que las células NIKS se pueden cocultivar con queratinocitos humanos de donantes en un cultivo organotípico y usar como un tejido manipulado apropiado para injerto de piel. El crecimiento organotípico rápido usando células 90% alogénicas entremezcladas con queratinocitos 10% autólogos permitiría el cubrimiento más temprano de la herida. La restauración permanente más lenta de la piel aparecería con los queratinocitos autólogos como rechazo de células alogénicas. Tales injertos tendrían las características únicas de proporcionar un inmediato cubrimiento de la herida y también proporcionar células autólogas para el cierre final formal de la herida.

La viabilidad de este planteamiento único ha sido previamente demostrada en modelos animales. Los queratinocitos cultivados quiméricamente de diferentes variedades de ratón (BALB/c y C3H/He) injertados en cualquier variedad de ratón experimental dio como resultado supervivencia de largo plazo de los queratinocitos singénicos y rechazo de los queratinocitos (3) alogénicos. Esto también ha sido mostrado usando cultivos de queratinocitos quiméricos que contienen 98% de células alogénicas y solo 2% de singénicas (8). Adicionalmente, los queratinocitos cultivados quiméricos singénicos-xenogénicos (ratón-ser humano) injertados en ratones dieron como resultado la restauración completa de la piel con células sintéticas a medida que las células xenogénicas fueron eliminadas (4).

Un impedimento principal para el avance clínico de esta técnica ha sido la no disponibilidad de una línea de queratinocitos alogénicos establecida. La ventaja de la supervivencia significativa asociada a la línea celular NIKS le hace una línea celular alogénica bien apropiada para cultivo quimérico con queratinocitos autólogos de un paciente. Los queratinocitos autólogos pasados a una confluencia más baja y añadidos a NIKS en cultivo permitirían que ocurriera un ahorro de tiempo significativo. El cultivo quimérico de NIKS con queratinocitos autólogos de un paciente conduciría al cubrimiento más temprano de la herida con un tejido manipulado que proporciona células autólogas para el cubrimiento final formal de la herida.

Hemos demostrado que cuando se cocultivan con queratinocitos de donante de un modo quimérico no hay más crecimiento de un tipo de célula que de la otra. Hemos demostrado adicionalmente que la expresión y localización de los marcadores de diferenciación de la última etapa queratina 1, transglutaminasa 1, y filagrina y las moléculas de adhesión caderina E y caderina P son idénticas a las de la piel intacta. La NIKS es una línea celular preferida para ser usada como línea de queratinocitos de donante alogénicos permanentes.

Hasta la fecha la línea celular de NIKS no ha estado caracterizada por la expresión de antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), y sus características de rechazo son conocidas. Al contrario que los injertos de piel, los cultivos organotípicos no contienen elementos epiteliales o vascular-endoteliales altamente antigénicos tales como células de Langerhans y vasos capilares. Es posible que los NIKS no serian rechazados cuando se coloquen en seres humanos. Los injertos de piel cultivada quimérica en un modelo animal inmunocompetente se tratarían del rechazo del xeno-transplante, pero no definirían definitivamente si las células NIKS serían rechazadas en un establecimiento clínico. Si los NIKS se eliminaran pasivamente por rechazo, ocurriría la restauración de la piel con células autólogas. Si los NIKS no fueran rechazados, la línea celular podría potencialmente funcionar como piel de donante universal. Como mínimo, los NIKS quiméricamente cultivados actuarían como cubierta biológica temporal y vehículo de suministro para queratinocitos autólogos.

La falta de un plexo capilar también es significativa, dado que la revascularización de la piel cultivada no se consigue por inosculación a los capilares preexistentes, sino por angiogénesis. El retraso en la revascularización puede ser responsable de la rápida reducción temprana del tamaño del injerto observada en este estudio, aunque una explicación alternativa sería que la rápida contracción de la herida es característica de ratones atímicos. Las técnicas de ingeniería genética se han usado para tratar el retraso en la revascularización inherente en la piel cultivada.

Los NIKS son fácilmente susceptibles a las técnicas genéticas moleculares para la creación de líneas celulares estables como se evidencia por la creación con éxito de NIKS^{GFP}. Dado que las células NIKS se pueden manipular genéticamente, es factible incorporar queratinocitos NIKS géneticamente manipulados en cultivos quiméricos para promover las características de curación de heridas de los injertos quiméricos. Además, las líneas celulares de NIKS se pueden crear con perfiles genéticos específicos tales como la expresión de factores de crecimiento. Como resultado, se podrían generar una amplia variedad de productos tisulares basados en NIKS a gusto del cliente.

La presente invención no se desea que esté limitada a la descripción precedente sino que incluya todas las modificaciones y variaciones tal como vienen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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Referencias

1. Boyce, S. T., et al., Cultured skin substitutes combined with Integra Artificial Skin® to replace native skin autograft and allograft for the closure of excised full-thickness burns, J. Burn Care Rehabil. 20:453-461, 1999.

2. Cairns, B. A., et al., The biotechnological quest for optimal wound closure, Arch. Surg. 128:1246-1252, 1993.

3. Suzuki, T., Ui, K., Shioya, N. and Ihara, S., Mixed cultures compromising syngeneic and allogeneic mouse keratinocytes as a graftable skin substitute, Transplantation 59:1236-1241, 1995.

4. Rouabhia, M., Permanent skin replacement using chimeric epithelial cultured sheets comprising xenogeneic and syngeneic keratinocytes, Transplantation 61:1290-1300, 1996.

5. Allen-Hoffmann, B. L., et al., Normal growth and differentiation in a spontaneously immortalized near-diploid human keratinocyte cell line, NIKS, J. Invest. Dermatol. 114:444-455, 2000.

6. Allen-Hoffmann, B. L. and Rheinwald, J. G., Polycyclic aromatic hydrocarbon mutagenesis of human epidermal keratinocytes in culture, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7802-7806, 1984.

7. Parenteau, N. L., et al., The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function, Cytotechnology 9:163-171, 1992.

8. Larochelle, F., Ross, G. and Rouabhia, M., Permanent skin replacement using engineered epidermis containing fewer than 5% syngeneic keratinocytes, Lab. Invest. 78:1089-1099, 1998.

9. Vogt, P. M., et al., Genetically modified keratinocytes transplanted to wounds reconstitute the epidermis, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:9307-9311, 1994.

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10. Supp, D. M., Supp, A. P., Bell, S. M. and Boyce, S. T., Enhanced vascularization of cultured skin substitutes genetically modified to overexpress vascular endothelial growth factor, J. Invest. Dermatol. 114:5-13, 2000.

11. Supp, D. M. and Boyce, S. T., Overexpression of vascular endothelial growth factor accelerates early vascularization and improves healing of genetically modified cultured skin substitutes, J. Burn Care Rehabil. 23:10-20, 2002.

Claims (14)

1. Una piel quimérica que comprende células queratinocitos humanos inmortalizados en cocultivo con queratinocitos de donante en la que la piel comprende una arquitectura tisular normal y marcadores de diferenciación de epitelios escamosos estratificados y en la que la expresión y localización de los marcadores de diferenciación de la última etapa son típicas de piel humana intacta.

2. La piel de la reivindicación 1, en la que los queratinocitos inmortalizados están genéticamente modificados.

3. Un método para crear una piel quimérica, que comprende co-cultivar células queratinocitos humanos inmortalizados y queratinocitos obtenidos de un paciente, de tal modo que se forma una piel quimérica en el que la piel comprende una arquitectura tisular normal y marcadores de diferenciación de epitelios escamosos estratificados y en el que la expresión y localización de los marcadores de diferenciación de la última etapa son típicas de piel humana intacta.

4. El método de la reivindicación 3, que comprende la etapa de modificar genéticamente por lo menos uno de los queratinocitos inmortalizados y los queratinocitos de donante.

5. Un cocultivo organotípico que comprende queratinocitos humanos inmortalizados y queratinocitos de donante en el que la piel comprende una arquitectura tisular normal y marcadores de diferenciación de epitelios escamosos estratificados y en el que la expresión y localización de los marcadores de diferenciación de la última etapa son típicas de piel humana intacta.

6. La piel de la reivindicación 1 o 2, un método de la reivindicación 3 o 4, o un cocultivo organotípico de la reivindicación 5 en la que los queratinocitos de donante son de origen humano.

7. La piel de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 6, un método de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, o un cocultivo organotípico de la reivindicación 5 o 6, en la que los queratinocitos inmortalizados son queratinocitos espontáneamente inmortalizados.

8. La piel de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6 y 7, un método de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6 y 7, o un cocultivo organotípico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que los queratinocitos inmortalizados son ATCC CRL-12191.

9. La piel de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y de 6 a 8, un método de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, y de 6 a 8, o un cocultivo organotípico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que los queratinocitos inmortalizados están genéticamente modificados.

10. La piel, método, o cocultivo organotípico de la reivindicación 9 en la que por lo menos un gen o producto génico está expresado o cuya expresión está mejorada como resultado de la modificación genética.

11. La piel, método, o cocultivo organotípico de la reivindicación 9 o 10 en la que la expresión de por lo menos un gen o producto génico está suprimida como resultado de la modificación genética.

12. El uso de una piel de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o de 6 a 11, o un cocultivo organotípico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 en la fabricación de un medicamento para uso en un método para tratar un paciente por medio de un injerto de piel.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que el injerto de piel es para el cierre de heridas.

14. El uso según la reivindicación 13, en el que el cierre de heridas es para tratar úlceras diabéticas, quemaduras de la piel y/o enfermedad necrotizante de la piel.