ES2291696T3 - Proteina fluorescente aislada de clytia gregaria (cgfp), asi como su uso. - Google Patents
Proteina fluorescente aislada de clytia gregaria (cgfp), asi como su uso. Download PDFInfo
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Abstract
Molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo compuesto por: a) moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido dado a conocer por la ID SEC Nº 2; b) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la ID SEC Nº 1; c) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con una molécula de ácido nucleico de a) o b) en condiciones estrictas y que codifican proteínas fluorescentes; d) moléculas de ácido nucleico que se diferencias de las citadas en c) debido a la degeneración del código genético; e) moléculas de ácido nucleico que muestran una homología de secuencia de al menos 95% con la ID SEC Nº 1, y que codifican proteínas fluorescentes; f) moléculas de ácido nucleico que muestran una homología de secuencia de al menos 65% con la ID SEC Nº 1 y que codifican proteínas fluorescentes.
Description
Proteína fluorescente aislada de Clytia
gregaria (CGFP), así como su uso.
La invención se refiere a la secuencia de
nucleótidos y aminoácidos, así como a la actividad y uso, de la
proteína fluorescente CGFP (proteína fluorescente de Clytia
gregaria).
Una pluralidad de celentéreos son
bioluminiscentes (Morin y col., 1974) y emiten luz azul o verde. La
ecuorina de Aequoria victoria identificada en 1962 como la
primera proteína emisora de luz (Shimomura y col., 1962) emitía
como proteína aislada una luz azul en lugar de la luz verde
observada fenotípicamente en Aequoria victoria. Más tarde,
pudo aislarse la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequoria
victoria, que debido a la excitación por la ecuorina hace
parecer fenotípicamente verde la medusa (Johnson y col., 1962;
Hastings y col., 1969; Innouye y col., 1994).
Las proteínas fluorescentes verdes podían
aislarse de distintos organismos. Entre ellos se cuentan los
Hydozoa (Aequoris, Halistaura, Obelia) y antozoos
(Acanthotilum, cactus marino, Cavernularia, Renila,
Ptilosarcus, Stylatula) (Morin y col., 1971; Morin y col., 1971
II; Wampler y col., 1971; Wampler y col., 1973; Cormier y col.,
1973; Cormier y col., 1974; Levine y col., 1982).
Se encuentra un resumen de algunas proteínas
fluorescentes en la Tabla 1:
Las proteínas fluorescentes se diferencian no
sólo debido a su secuencia de nucleótidos y aminoácidos, sino
también debido a sus propiedades bioquímicas y físicas. Las
características espectrales de las proteínas fluorescentes pueden
diferenciarse tanto por el lado de excitación como por el de
emisión. Se encuentra una revisión de los espectros de
fluorescencia y de las longitudes de onda de excitación en la Tabla
2.
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\vskip1.000000\baselineskip
El uso de proteínas fluorescentes se ha descrito
ya anteriormente. Se encuentra una revisión en la Tabla 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ha podido mostrarse que, mediante la
modificación de la secuencia de aminoácidos de proteínas
fluorescentes, pueden modificarse las propiedades físicas y
bioquímicas. Se describen ejemplos de proteínas fluorescentes
mutagenizadas en la bibliografía (Delagrave y col., 1995; Ehrig y
col., 1995; Heim y col., 1996).
Las proteínas fluorescentes encuentran ya
aplicación en distintos campos. Se ha descrito ya en la bibliografía
el uso de proteínas fluorescentes en "transferencia de energía
por resonancia de fluorescencia" (FRET), "transferencia de
energía por resonancia de bioluminiscencia" (BRET) y otros
procedimientos de transferencia de energía (Mitra y col, 1996; Ward
y col., 1978; Cardullo y col., 1988; patente de EE.UU nº 4.777.128;
patente de EE.UU. nº 5.126.508; patente de EE.UU. nº 4.927.923;
patente de EE.UU. nº 5.279.943). Se han descrito ya igualmente
otros procedimientos no radiactivos para transferencia de energía
mediante GFP (sol. PCT WO 98/02571 y WO 97/28261).
Como gen informador o indicador, se designan en
general genes cuyos productos génicos pueden detectarse fácilmente
con la ayuda de procedimientos bioquímicos o histoquímicos
sencillos. Se diferencian al menos dos tipos de genes
informadores.
- 1.
- Genes de resistencia. Como genes de resistencia se designan genes cuya expresión confiere a una célula resistencia contra antibióticos u otras sustancias cuya presencia en el medio de crecimiento conduce a la muerte celular si falta el gen de resistencia.
- 2.
- Genes informadores. Los productos de los genes informadores se usan en la ingeniería genética como indicadores fusionados o no fusionados. Pertenecen a los genes informadores más comunes los de beta-galactosidasa (Alam y col., 1990), fosfatasa alcalina (Yang y col., 1997; Cullen y col., 1992), luciferasas y otras fotoproteínas (Shinomura, 1985; Philips G.N., 1997; Snowdowne y col., 1984).
Se designa como luminiscencia la radiación de
fotones en el intervalo espectral visible, realizándose ésta
mediante moléculas emisoras excitadas. A diferencia de la
fluorescencia, en este momento la energía no se alimenta desde el
exterior en forma de radiación de menor longitud de onda.
Se diferencia entre quimioluminiscencia y
bioluminiscencia. Se designa como quimioluminiscencia una reacción
química que conduce a una molécula excitada que brilla por sí misma
cuando los electrones excitados regresan al estado fundamental. En
caso de estar catalizada esta reacción por una enzima, se habla de
bioluminiscencia. Las enzimas implicadas en la reacción se designan
generalmente como luciferasas.
Cnidaria\rightarrowLeptomedusae\rightarrowCampanulariidae\rightarrowClytia
gregaria.
La especie Clytia gregaria pertenece a
los Cnidaria, concretamente a las medusas. El fenotipo
bioluminiscente o fluorescente se ha descrito ya en 1998 (Ward y
col., 1998).
Para el estudio de la actividad fluorescente de
la especie Clytia gregaria, se han capturado ejemplares en
Friday Harbor en Washington State (EE.UU.), y se han almacenado en
nitrógeno líquido. Para la preparación de una biblioteca de ADNc,
se ha usado exclusivamente el anillo bioluminiscente de un ejemplar
de medusa. Para la generación de las bibliotecas de ADNc de
Clytia gregaria, se ha aislado el ARN según el procedimiento
de Krieg (Krieg y col., 1996) mediante isotiocianato.
Para la preparación del ADNc, se llevó a cabo
una PCR-FI. Para ello, se incubaron 10 \mug de ARN
como transcriptasa inversa (Superscribt Gold II) según el siguiente
esquema:
- PCR 1.
- 30 segundos 95ºC
- 2.
- 6 minutos 68ºC
- 3.
- 10 segundos 95ºC
- 4.
- 6 minutos 68ºC
17 ciclos de la etapa 4 después de la etapa
3.
Se incubaron los productos de reacción para la
inactivación de la polimerasa durante 30 min a 37ºC con proteinasa
K, y se precipitaron los ADNc con etanol. Se disolvieron los ADNc en
agua y se incubaron con SfiI durante 1 hora a 37ºC. Se filtraron
por exclusión los productos de reacción para la eliminación de los
fragmentos más pequeños. Se ligó el ADNc fraccionado a continuación
al vector \lambdaTriplEx2 cortado con SfiI y desfosforilado. Para
la preparación de un banco de expresión de fagos \lambda, se
empaquetaron a continuación fragmentos del ADNc clonado en fagos
\lambda mediante el sistema de empaquetado in vitro SMART
cDNA Library construction Kits (Clontech).
Para la identificación de los fagos
recombinantes que contenían una inserción de ADNc con expresión
potencial de proteína fluorescente, se llevó a cabo una
"evaluación de biblioteca".
Para ello, se sembraron céspedes bacterianos de
XL1-Blue de E. coli transformados en placas
de cultivo de 90 mm y se incubaron durante 12-15
horas a 31ºC. Se inició la inducción de la expresión de proteína
mediante la adición de 60 \mul de una disolución de IPTG
(isopropiltiogalactósido) 20 mM sobre las placas. Después de una
incubación de 24 horas a temperatura ambiente, se dispusieron las
placas durante 72 horas a 4ºC. A continuación, se realizó la medida
de fluorescencia.
Para ello, se irradiaron las bacterias con un
láser de argón (LGN502) con 100 mV a 488 nm o 366 nm (UVL12). Se
midió la fluorescencia usando un filtro ZSV de 510 nm.
Para el aislamiento de los clones y los análisis
espectrales, se eliminó la biomasa de clones positivos de
fluorescencia de las placas de cultivo y se resuspendió en PBS
(disolución salina tamponada con fosfato). Se realizó la
desestabilización celular mediante ultrasonidos. Después de
clarificar el lisado mediante centrifugación, se determinó la
fluorescencia del residuo en un fluorómetro.
Se identificó una proteína fluorescente. Se
designó la proteína fluorescente como CGFP (proteína fluorescente
de Clytia gregaria). A continuación, se representa la
proteína fluorescente CGFP con detalle.
La proteína fluorescente CGFP muestra la mayor
homología a nivel de aminoácidos con GFP de Aequoria, con
una identidad del 44% (mostrado en el ejemplo 8; figura 5). A nivel
de ácidos nucleicos, la identidad se encuentra por debajo del 30%
(mostrado en el ejemplo 9, figura 6). Para comparación de secuencia,
se usó el procedimiento BLAST (Altschul y col., 1997).
La invención se refiere también a equivalentes
funcionales de CGFP. Los equivalentes funcionales son aquellas
proteínas que tienen propiedades fisicoquímicas comparables y son al
menos un 70% homólogas. Se prefiere una homología de 80% o 90%. Se
prefiere especialmente una homología de 95%.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
gen informador para sistemas celulares, especialmente para
receptores, para canales iónicos, para transportadores, para
factores de transcripción o para sistemas inducibles.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
gen informador en sistemas bacterianos y eucarióticos, especialmente
en células de mamífero, en bacterias, en levaduras, en baculovirus
o en plantas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
gen informador para sistemas celulares en combinación con sistemas
bioluminiscentes o quimioluminiscentes, especialmente sistemas con
luciferasas, oxigenasas o fosfatasas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
proteína marcadora, especialmente en la clasificación FACS
(clasificador celular activado por fluorescencia).
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
proteína de fusión, especialmente para receptores, canales iónicos,
transportadores, factores de transcripción, proteasas, cinasas,
fosfodiesterasas, hidrolasas, peptidasas, transferasas, proteínas
de membrana o glicoproteínas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada para
la inmovilización, especialmente mediante anticuerpos, biotina,
portadores magnéticos o magnetizables.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
proteína para sistemas de transferencia de energía, especialmente
sistemas FRET (transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia), BRET (transferencia de energía por resonancia de
bioluminiscencia), FET (transistores de efecto campo), FP
(polarización de fluorescencia) o HTRF (fluorescencia homogénea con
resolución temporal).
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
marcador de sustratos o ligandos, especialmente para proteasas,
cinasas o transferasas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada para
la expresión en sistemas bacterianos, especialmente para la
determinación de títulos, y como sustrato para sistemas bioquímicos,
especialmente para proteinasas y cinasas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
marcador, especialmente acoplada a anticuerpos, enzimas, receptores,
canales iónicos y otras proteínas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
gen informador en la búsqueda de principios activos farmacológicos,
especialmente en HTS (evaluación de alto rendimiento).
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
componente de sistemas de detección, especialmente para ELISA
(ensayo de inmunosorción ligado a enzima), inmunohistoquímica,
transferencia Western o microscopía confocal.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
marcador para el análisis de interacciones, especialmente
interacciones proteína-proteína, interacciones
ADN-proteína, interacciones ADN-ARN,
interacciones ARN-ARN o interacciones
ARN-proteína (ADN: ácido desoxirribonucleico; ARN:
ácido ribonucleico).
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
marcador o proteína de fusión para la expresión en organismos
transgénicos, especialmente en ratones, ratas, hámsteres y otros
mamíferos, en primates, peces, gusanos y plantas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
marcador o proteína de fusión para el análisis del desarrollo
embrionario.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
marcador para un mediador de acoplamiento, especialmente por
biotina, NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) o
CN-Br.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
informador acoplada a ácidos nucleicos, especialmente a ADN o
ARN.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada como
informador acoplada a proteínas o péptidos.
La proteína fluorescente CGFP acoplada a ácidos
nucleicos o péptidos es adecuada como sonda, especialmente para
transferencia Northern, transferencia Southern, transferencia
Western, ELISA, secuenciación de ácidos nucleicos, análisis de
proteínas o análisis de chip.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada para
marcar formulaciones farmacológicas, especialmente de agentes
infecciosos, anticuerpos o "moléculas pequeñas".
La proteína fluorescente CGFP es adecuada para
estudios geológicos, especialmente para corrientes marinas, de
aguas subterráneas y de ríos.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada para
la expresión en sistemas de expresión, especialmente en sistemas de
traducción in vitro, sistemas bacterianos, sistemas de
levadura, sistemas de baculovirus, sistemas víricos y sistemas
eucarióticos.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada para
la visualización de tejidos o células en intervenciones quirúrgicas,
especialmente invasivas, no invasivas o mínimamente invasivas.
La proteína fluorescente CGFP es adecuada
también para marcar tejidos tumorales y otros tejidos modificados
fenotípicamente, especialmente en el estudio histológico o en
intervenciones quirúrgicas.
La invención se refiere también a la
purificación de la proteína fluorescente CGFP, especialmente como
proteína de tipo natural, como proteína de fusión o como proteína
mutagenizada.
La invención se refiere también al uso de la
proteína fluorescente CGFP en el campo de la cosmética,
especialmente de aditivos de baño, lociones, jabones, colorantes
corporales, pastas de dientes o polvos corporales.
La invención se refiere también al uso de la
proteína fluorescente CGFP para la coloración, especialmente de
alimentos, aditivos de baño, tintes, textiles o plásticos.
La invención se refiere también al uso de la
proteína fluorescente CGFP para la coloración de papel,
especialmente de cartas de felicitación, productos de papel,
papeles de pared o artículos de bricolaje.
La invención se refiere también al uso de la
proteína fluorescente CGFP para la coloración de líquidos,
especialmente pistolas de agua, fuentes, bebidas o helados.
La invención se refiere también al uso de la
proteína fluorescente CGFP para la preparación de juguetes,
especialmente de pintura de dedos o pintura de cara.
Se designa como expresión la producción de una
molécula que permite la transcripción y traducción del gen extraño
clonado en un vector de expresión después de la introducción del gen
en la célula huésped adecuada. Los vectores de expresión contienen
las señales de control necesarias para la
\hbox{expresión de
genes en células procarióticas o eucarióticas.}
Los vectores de expresión pueden construirse
principalmente de dos formas distintas. En las denominadas fusiones
de transcripción, se sintetiza la proteína codificada por el gen
extraño clonado en forma de una proteína auténtica biológicamente
activa. Para ello, el vector de expresión porta todas las señales de
control 5' y 3' necesarias para la expresión.
En las denominadas fusiones de traducción, se
expresa la proteína codificada por el gen extraño clonado en forma
de proteína híbrida junto con otra proteína que puede detectarse
fácilmente. Las señales de control 5' y 3' necesarias para la
expresión, incluyendo el codón de inicio y dado el caso una parte de
las secuencias que codifican las regiones
N-terminales de la proteína híbrida para formar,
proceden del vector. La parte de proteína adicional introducida no
sólo estabiliza en muchos casos la proteína codificada por el gen
extraño clonado ante la degradación por proteasas celulares, sino
que puede utilizarse también para la detección y el aislamiento de
la proteína híbrida formada. La expresión puede realizarse tanto
transitoria como establemente. Como organismos huésped son
adecuados tanto bacterias, levaduras o virus como también sistemas
eucarióticos.
El aislamiento de proteínas (también después de
sobreexpresión) se designa frecuentemente como purificación de
proteínas. Para la purificación de proteínas, se pone a disposición
una pluralidad de procedimientos establecidos.
La separación sólido-líquido es
una operación básica en los aislamientos de proteína. Tanto en la
separación de células del medio de cultivo como en la clarificación
del extracto bruto después de la desestabilización celular y la
eliminación del desecho celular, en la separación de precipitados
después de precipitaciones y demás, es necesaria esta etapa de
procedimiento. Se realiza mediante centrifugación y filtración.
Para la obtención de proteínas intracelulares,
debe destruirse o hacerse permeable la pared celular. Dependiendo
de la escala y del organismo, se utilizan para ello homogeneizadores
de alta presión o molinos de bolas agitadas o de perlas de vidrio.
A escala de laboratorio, se utilizan, entre otros, disgregaciones
celulares mecánicas y tratamiento con ultrasonidos.
Tanto para proteínas extracelulares como
intracelulares (después de desestabilización celular), los distintos
procedimientos de precipitación con sales (particularmente sulfato
de amonio) o disolventes orgánicos (alcoholes, acetona) son un
procedimiento rápido y eficaz para la concentración de proteínas. En
la purificación de proteínas intracelulares, es deseable la
eliminación de los ácidos nucleicos solubles (precipitación, por
ejemplo, con sulfato de estreptomicina o protamina). En la
obtención de proteínas extracelulares, se añaden a menudo portadores
(por ejemplo, almidón, tierra de diatomeas) antes de la adición del
agente de precipitación para obtener precipitados más
manejables.
Para la purificación fina, se ponen a
disposición numerosos procedimientos cromatográficos y de reparto
(cromatografía de absorción e intercambio iónico, exclusión
molecular, cromatografía de afinidad, electroforesis). Se emplea
también cromatografía en columna a escala industrial. Para escala de
laboratorio, es importante ante todo la cromatografía de afinidad,
que posibilita factores de purificación de hasta varios 100 por
etapa.
Las proteínas intracelulares precipitan en
disoluciones relativamente diluidas. Como las proteínas
extracelulares, deben concentrarse antes de su uso adicional.
Además de los procedimientos ya mencionados, se ha probado la
ultrafiltración, también a escala industrial.
Las sales inorgánicas como sustancias
acompañantes de proteínas son frecuentemente indeseadas para
aplicaciones específicas. Pueden eliminarse, entre otros, mediante
exclusión molecular, diálisis y diafiltración.
Numerosas proteínas se utilizan como preparados
secos. Son importantes como procedimientos de secado el secado a
vacío, por liofilización y pulverización.
La proteína fluorescente CGFP se codifica por la
siguiente secuencia de nucleótidos (ID SEC Nº 1):
De ella resulta una secuencia de aminoácidos (ID
SEC Nº 2):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estas secuencias se vuelven a encontrar en el
listado de secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra el mapa de plásmido del vector
pTriplEX2-CGFP.
La Fig. 2 muestra el mapa de plásmido del vector
pcDNA3-CGFP.
La Fig. 3 muestra la emisión transitoria de CGFP
en células CHO en el vector de expresión
pcDNA3-CGFP. La figura muestra la imagen
microscópica de las células transfectadas transitoriamente a una
excitación de 480 nm y una emisión de 520 nm.
La Fig. 4 muestra la excitación de la CGFP y el
lisado de control.
La Fig. 5 muestra la emisión de la CGFP y el
lisado de control.
La Fig. 6 muestra el alineamiento de CGFP, GFP
(Aquoria) y GFP (Renilla) a nivel de aminoácidos.
CGFP_Cly: CGFP de Clytia gregaria
CGF_Ren: GFP de Renilla
GFP_Aeq: GFP de Aequoria.
La Fig. 7 muestra el alineamiento de CGFP, GFP
(Aquoria) y GFP (Renilla) a nivel de ácidos
nucleicos.
CGFP_Cly: CGFP de Clytia gregaria
CGF_Ren: GFP de Renilla
GFP_Aeq: GFP de Aequoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Como vector para la preparación del constructo
representado a continuación, se usó el plásmido pTriplEx2 de la
compañía Clontech. Se designó el derivado del vector como
pTriplEx2-CGFP. Se usó el vector
pTriplEx2-CGFP para la expresión de CGFP en
sistemas bacterianos.
La Fig. 1 muestra el mapa de plásmido del vector
pTriplEX2-CGFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Como vector para la preparación del constructo
representado a continuación, se usó el plásmido pcDNA3.1(+) de la
compañía Clontech. Se designó el derivado del vector como
pcDNA3-CGFP. Se usó el vector
pcDNA3-CGFP para la expresión de CGFP en sistemas
eucarióticos.
La Fig. 2 muestra el mapa de plásmido del vector
pcDNA3-CGFP.
\newpage
Ejemplo
3
Se realizó la expresión bacteriana en E.
coli cepa BL21(DE3) mediante la transformación de
bacterias con los plásmidos de expresión
pTriplEX2-CGFP y pTriplEX2. Se incubaron las
bacterias transformadas en medio LB a 37ºC durante 3 horas y se
indujo la expresión durante 4 horas mediante la adición de IPTG
hasta una concentración final de 1 mM. Se recogieron las bacterias
inducidas mediante centrifugación, se resuspendieron en PBS y se
disgregaron mediante ultrasonidos. Se determinó la fluorescencia con
ayuda de un fluorómetro.
Ejemplo
4
Se realizó la expresión eucariótica constitutiva
en células CHO mediante transfección de las células con los
plásmidos de expresión pcDNA3-CGFP y pcDNA3.1(+) en
experimentos transitorios. Para ello, se sembraron 10.000 células
por pocillo en medio DMEM-12 en placas de
microvaloración de 96 pocillos y se incubaron durante una noche a
37ºC. Se realizó la transfección con ayuda del kit Fugene 6 (Roche)
según las instrucciones del fabricante. Se incubaron las células
transfectadas durante una noche a 37ºC en medio
DMEM-F12. Se realizó la medida de la fluorescencia
en fluorómetro a temperatura ambiente.
La Figura 3 muestra la expresión de CGFP en
células CHO.
Ejemplo
5
Para la medida del espectro de emisión, se
transformaron E. coli BL21(DE3) con los plásmidos
pTriplEX-CGFP y pTriplEX2. Se realizó la inducción
mediante la adición de IPTG 1 mM y una incubación de 4 horas a 37ºC.
A continuación, se recogieron las bacterias y se resuspendieron en
PBS. Se realizó la lisis mediante ultrasonidos. A continuación, se
realizó la medida de la fluorescencia en fluorómetro.
La Figura 4 muestra la excitación de la CGFP y
del lisado de control.
La Figura 5 muestra la emisión de la CGFP y del
lisado de control.
Ejemplo
6
>AA2002:ABB06186 Abb06186 proteína
fluorescente verde GFPxm19 ID SEC Nº 15. 5/2002, longitud = 271,
puntuación = 219 bits (558), esperada = 3e-56,
identificaciones = 102/228 (44%), positivos = 151/228 (65%), huecos
= 3/228 (1%)
>gb|AAK02065.1| proteína fluorescente
verde mutante [constructo sintético], longitud = 238, puntuación =
219 bits (557), esperada = 4e-56, identificaciones =
102/227 (44%), positivos = 150/227 (65%), huecos = 3/227 (1%)
>gb|AAL33915.1|AF435430_1 proteína
fluorescente verde [Aequorea macrodactyla], longitud = 238,
puntuación = 218 bits (556), esperada = 5e-56,
identificaciones = 102/227 (44%), positivos = 150/227 (65%), huecos
= 3/227 (1%)
>gb|AAL33918.1|AF435433_1 proteína
fluorescente verde [Aequorea macrodactyla], longitud = 238,
puntuación = 218 bits (555), esperada = 7e-56,
identificaciones = 101/227 (44%), positivos = 149/227 (65%), huecos
= 3/227 (1%)
>gb|AAL33916.1|AF435431_1 proteína
fluorescente verde [Aequorea macrodactyla], longitud = 238,
puntuación = 218 bits (554), esperada = 9e-56
identificaciones = 102/227 (44%), positivos = 150/227 (65%), huecos
= 3/227 (1%)
>gb|AAL33917.1|AF435432_1 proteína
fluorescente naranja [Aequorea macrodactyla], longitud = 238,
puntuación = 218 bits (554), esperada = 9e-56,
identificaciones = 101/227 (44%), positivos = 149/227 (65%), huecos
= 3/227 (1%)
>AA2002:ABB06185 Abb06185 Proteína
fluorescente verde GFPxm18 ID SEC Nº 13. 5/2002, longitud = 271,
puntuación = 217 bits (552), esperada = 1e-55,
identificaciones = 101/228 (44%), positivos = 151/228 (65%), huecos
= 3/228 (1%)
>AA2002:ABB06184 Abb06184 Proteína
fluorescente verde GFPxm16 ID SEC Nº 11. 5/2002, longitud = 271,
puntuación = 216 bits (551), esperada = 2e-55,
identificaciones = 101/228 (44%), positivos = 150/228 (65%), huecos
= 3/228 (1%)
>AA2002:ABB06181 Abb06181 Proteína
fluorescente verde GFPxm SEC Nº ID 5. 5/2002, longitud = 271,
puntuación = 216 bits (551), esperada = 2e-55,
identificaciones = 101/228 (44%), positivos = 150/228 (65%), huecos
= 3/228 (1%)
>gb|AAL33912.1|AF435427_1 proteína
fluorescente verde [Aequorea macrodactyla], longitud = 238,
puntuación = 216 bits (551), esperada = 2e-55,
identificaciones = 101/227 (44%), positivos = 150/227 (65%), huecos
= 3/227 (1%)
>gb|AAK02064.1| proteína fluorescente
verde mutante [constructo sintético], longitud = 238, puntuación =
216 bits (551), esperada = 2e-55, identificaciones =
101/227 (44%), positivos = 150/227 (65%), huecos = 3/227 (1%).
Ejemplo
7
>gb|AF468563.1| secuencia microsatélite
de Crassostrea gigas clon c077, longitud = 415, puntuación =
41,1 bits (21), esperada = 1,4, identificaciones = 25/27 (92%)
>gb|AC079685.2| clon OSJNBb0012A20 del
cromosoma 10 de Oryza sativa, secuencia completa, longitud =
131599, puntuación = 41,1 bits (21), esperada = 1,4,
identificaciones = 27/30 (90%)
>gb|AF427906.1|AF427906 gen
(Gp-9) precursor de la supuesta proteína de unión a
olores de Solenopsis globularia littoralis, cds completos,
longitud = 1767, puntuación = 41,1 bits (21), esperada = 1,4,
identificaciones = 23/24 (95%)
>gb|AF297617.1|AF297617 genoma completo
mitocondrial de genotipo 1 de Echinococcus granulosus,
longitud= 13588, puntuación = 41,1 bits (21), esperada = 1,4,
identificaciones= 23/24 (95%).
Ejemplo
8
La Figura 6 muestra el alineamiento de CGFP, GFP
(Aquoria) y GFP (Renilla) a nivel de nucleótidos.
Ejemplo
9
La Figura 7 muestra el alineamiento de CGFP, GFP
(Aquoria) y GFP (Renilla) a nivel de ácidos nucleicos.
Patente de EE.UU. nº 4.777.128
Patente de EE.UU. nº 4.927.923
Patente de EE.UU. nº 5.162.508
Patente de EE.UU. nº 5.729.943
Patente de EE.UU. nº 5.958.713
Patente de EE.UU. nº 6.172.188
Patente de EE.UU. nº 6.232.107
Patente de EE.UU. nº 6.436.682
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WO199728261
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WO199949019
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<110> Bayer AG, BHC
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína CGFP fluorescente aislada,
así como su uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Le A 36 493
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 708
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clytia gregaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clytia gregaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Molécula de ácido nucleico seleccionada del
grupo compuesto por:
- a)
- moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido dado a conocer por la ID SEC Nº 2;
- b)
- moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la ID SEC Nº 1;
- c)
- moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con una molécula de ácido nucleico de a) o b) en condiciones estrictas y que codifican proteínas fluorescentes;
- d)
- moléculas de ácido nucleico que se diferencias de las citadas en c) debido a la degeneración del código genético;
- e)
- moléculas de ácido nucleico que muestran una homología de secuencia de al menos 95% con la ID SEC Nº 1, y que codifican proteínas fluorescentes;
- f)
- moléculas de ácido nucleico que muestran una homología de secuencia de al menos 65% con la ID SEC Nº 1 y que codifican proteínas fluorescentes.
2. Moléculas según la reivindicación 1, en las
que la secuencia contiene un promotor funcional 5' de la
secuencia.
3. Moléculas según la reivindicación 2, que son
componentes de vectores recombinantes de ADN o ARN.
4. Organismos que contienen un vector descrito
según la reivindicación 3.
5. Oligonucleótidos con más de 10 nucleótidos
consecutivos que son idénticos o complementarios de las secuencias
de ADN o ARN según la reivindicación 1.
6. Péptidos que están codificados por secuencias
de nucleótidos según la reivindicación 1.
7. Procedimiento para la expresión del
polipéptido proteína fluorescente verde de Clytia (CGFP)
según la reivindicación 6 en bacterias, células eucarióticas o en
sistemas de expresión in vitro.
8. Procedimiento para la
purificación/aislamiento de un polipéptido CGFP según la
reivindicación 6.
9. Péptidos con más de 5 aminoácidos
consecutivos que son reconocidos inmunológicamente por anticuerpos
contra la proteína fluorescente CGFP.
10. Uso de la proteína fluorescente CGFP según
las reivindicaciones 1 a 7 como gen marcador e informador.
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