ES2292424T3

ES2292424T3 - Metodo para dioagnosticar endometricos.

Info

Publication number: ES2292424T3
Application number: ES00901009T
Authority: ES
Inventors: Daniele Gagne; Diane Gosselin; Patrice Hugo; Pierre Miron
Original assignee: Siemens Medical Solutions Diagnostics Inc USA
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2020-01-24
Also published as: JP2002535658A; DE60036536T2; EP1147421B1; BR0007702A; ATE374370T1; WO2000043789A1; EP1147421A1; CA2359200A1; AU2088800A; NZ513692A; DE60036536D1

Abstract

Método para determinar endometriosis en una muestra de tejidos de endometrio uterino eutópico o una muestra de sangre de una mujer, que comprende: a) medir en dicha muestra un nivel cuantitativo de al menos dos antígenos de superficie diferentes de leucocitos de la sangre y/o leucocitos del endometrio eutópico, seleccionándose dichos antígenos de superficie de leucocitos de la sangre y/o leucocitos del endometrio eutópico de las combinaciones de marcadores leucocitarios definidas en la siguiente tabla: Combinaciones de marcadores leucocitarios Marcadores leucocitarios del endometrio.

Description

Método para diagnosticar endometriosis.

Antecedentes de la invención (a) Campo de la invención

La invención se refiere a un método para el diagnóstico de endometriosis usando marcadores leucocitarios de la sangre y del endometrio.

(b) Descripción de la técnica anterior

La endometriosis es uno de los trastornos ginecológicos más comunes, que afecta hasta un 15% de las mujeres en edad de procrear. Está estrechamente asociada con dolor pélvico intenso, dismenorrea, dispareunia, esterilidad y otros síntomas diversos tales como hemorragia intraperitoneal, dolor de espalda, estreñimiento y/o diarrea. Constituye una amenaza principal para la integridad física, psicológica y social de las pacientes.

La endometriosis se caracteriza por la implantación y el crecimiento de las células de endometrio (que normalmente constituyen el revestimiento del útero) en sitios extrauterinos tales como la cavidad peritoneal. Aunque la etiología y la patogenia de la endometriosis siguen siendo principalmente poco claras, la teoría de la menstruación retrógrada es la más aceptada ampliamente para explicar la presencia de células de endometrio ectópicas en la cavidad peritoneal. Sin embargo, este fenómeno se produce en la mayoría de las mujeres y, por tanto, debe recurrirse a otros diversos factores para explicar la implantación de células de endometrio y el posterior desarrollo de lesiones endometriósicas. Generalmente se cree que el inicio de la endometriosis implica una compleja cascada de acontecimientos que requieren varias características esenciales. Las células de endometrio sembradas de manera retrógrada deben permanecer viables, ser capaces de adherirse al mesotelio y de proliferar. También se cree que la degradación local de la matriz extracelular, así como la amplia vascularización, desempeñan un papel esencial en potenciar la invasión de la cavidad peritoneal por parte de las células de endometrio. Además, una vez implantadas, las células de endometrio ectópicas deben tener la capacidad de contrarrestar la acción citolítica del sistema inmunitario. De hecho, esto está apoyado por la observación de varias anomalías inmunológicas en las pacientes con endometriosis.

En la actualidad, la visualización directa de las lesiones endometriósicas en procedimientos quirúrgicos (laparoscopia o laparotomía) es la regla de oro y el único método fidedigno disponible para diagnosticar la endometriosis. Sin embargo, este método es altamente invasivo (es decir, cirugía bajo anestesia general), costoso (es decir, coste directo y coste indirecto debido a la convalecencia) y requiere un cirujano bien entrenado que pueda identificar lesiones endometriósicas con una variedad de aspectos. El tipo de lesiones, su tamaño y su localización determinarán el estadio de la enfermedad (estadio I mínimo, estadio II leve, estadio III moderado, estadio IV grave). Sin embargo, todavía no hay un consenso claro sobre cómo se correlacionan estos parámetros con el estadio de la enfermedad y el pronóstico de endometriosis. Además, la endometriosis temprana o mínima (que puede suponer microlesiones) apenas puede diagnosticarse mediante métodos quirúrgicos, ya que es poco probable que se detecte mediante visualización directa. De hecho, varios estudios han informado de lesiones endometriósicas microscópicas que no se detectaron mediante laparoscopia. Dado que el diagnóstico de endometriosis mediante procedimientos quirúrgicos es difícil, costoso e invasivo, en algunos casos, varios médicos y pacientes intentan evitarlo o al menos retrasarlo mucho. Por tanto, la duración de tiempo entre el comienzo de los síntomas y el diagnóstico puede ser de hasta 8 a 12 años. La posibilidad de diagnosticar la endometriosis en un estadio temprano mejoraría ciertamente la eficacia de los tratamientos y reduciría espectacularmente el número de años durante los cuales las pacientes soportan dolor agudo o crónico.

Se han diseñado métodos de obtención de imágenes tales como ecografía transvaginal y resonancia magnética nuclear para el diagnóstico de endometriosis. Sin embargo, estas técnicas sólo pueden ser fidedignos para la detección de las lesiones de endometriomas grandes (> 1 cm de diámetro) detectadas entre una proporción muy pequeña de pacientes con endometriosis. Además, el alto coste de estas técnicas ha limitado su uso para el diagnóstico de la endometriosis.

Se han propuesto las proteínas séricas tales como CA-125 y la proteína-14 placentaria como marcadores de diagnóstico para la endometriosis. Se han observado niveles elevados de CA-125 en el suero, la descarga menstrual y el líquido peritoneal de las pacientes con endometriosis. Sin embargo, estos marcadores, cuando se usan solos, son de un valor muy limitado para una prueba diagnóstica. De hecho, estos marcadores no son adecuados para fines de detección o diagnóstico, porque proporcionan escasa sensibilidad. Además, los niveles de CA-125 y proteína-14 placentaria varían según diversos factores, tales como el ensayo, el estadio de la enfermedad y el ciclo menstrual. Finalmente, se sabe que estos marcadores están modulados por estados distintos a la endometriosis.

Se encontraron altas concentraciones de anticuerpos frente a antígenos de endometrio en el suero de pacientes con endometriosis y, por tanto, se propusieron como marcadores para una prueba diagnóstica (publicaciones de solicitud de patente internacional WO 94/28021 y WO 92/18535). Sin embargo, los niveles de especificidad y sensibilidad con estas pruebas siguen siendo bajos. En la mayoría de los casos, los antígenos reconocidos por estos anticuerpos aún están escasamente caracterizados o todavía se desconocen totalmente.

En la patente estadounidense número 5.478.725, bajos niveles de expresión de integrina \alphav\beta3 en muestras de endometrio durante la fase secretora del ciclo menstrual se describen como un factor de predicción de la endometriosis en pacientes estériles pero no en las fértiles con endometriosis. Esta observación estaba asociada con una forma más leve de endometriosis (estadios I y II) únicamente y, por tanto, no es útil para detectar estadios avanzados de la enfermedad. Además, este método dio una especificidad del 91%, pero una sensibilidad muy baja (38%).

Teniendo en cuenta que se ha informado de varias anomalías inmunológicas en pacientes con endometriosis, es concebible que la proporción de poblaciones de leucocitos y/o su estado de activación puede modularse durante el transcurso de la enfermedad y, por tanto, puede proporcionar cierto valor diagnóstico. Los estudios de citometría de flujo previos han demostrado que algunas subpoblaciones de linfocitos T (CD8+, CD45+/HLADR+, CD45+/CD3+/HLADR+ o CD3+/CD25+) pueden modularse ligeramente en el líquido peritoneal de pacientes con endometriosis con respecto a controles normales (Oosterlyncck D.J., et al., Am J reprod. Immunol., 31: 25-31, 1994; Becker J.L., et al., Am J Reprod. Immunol., 34: 179-187, 1995; Wu M.Y., et al., Am. j. Reprod. Immunol. 35: 510-516, 1996). Sin embargo, estas observaciones tienen un valor limitado para el diagnóstico de la endometriosis porque la recogida del líquido peritoneal es un procedimiento invasivo, no convencional. También se han estudiado las proporciones de poblaciones de leucocitos en la sangre periférica y el endometrio de pacientes con endometriosis. Wu et al., (citado anteriormente) han informado de una disminución pequeña pero significativa en la proporción de linfocitos T CD3+ que expresan o bien el marcador de activación CD69 o bien CD25 en la sangre de pacientes con endometriosis avanzada pero no en pacientes con un estadio leve de endometriosis o en controles normales. Esta diferencia se observó en casos avanzados de endometriosis únicamente y fue demasiado pequeña como para usarse como un marcador de diagnóstico. Por el contrario, Oosterlynck et al., (Oosterlyncck D.J., et al., Am J reprod. Immunol., 31: 25-31, 1994) y Ho et al. (Ho H.N., et al., Hum Reprod., 97: 2528-2533, 1997) informaron de ausencia de diferencia significativa en lo que se refiere a las subpoblaciones de linfocitos T cuando se comparan pacientes con endometriosis con controles normales. Estos resultados contradictorios pueden explicarse por el número muy bajo de muestras sometidas a prueba en estos estudios.

Varios estudios han investigado si los leucocitos también están modulados en el endometrio eutópico de las pacientes con endometriosis. Los resultados que surgen a partir de estos estudios son contradictorios, debido probablemente al hecho de que en la mayoría de los casos los métodos utilizados fueron únicamente semicuantitativos y que el número de muestras sometidas a prueba fue muy bajo. Por ejemplo, mediante la inmunohistoquímica, Ota et al. (Ota H., et al., Am J Reprod. Immunol., 35: 477-482, 1996) han informado de que el número de linfocitos T CD3+, CD4+, o CD8+, células que portan moléculas de adhesión (es decir, ICAM-1, LFA-1, CD2) o células CD68+, se regularon por incremento en el endometrio de pacientes con endometriosis en comparación con los controles estériles. Por el contrario, otros estudios diversos que utilizaron técnicas similares han informado de ausencia de diferencia en la proporción de subconjuntos de linfocitos T (Klentzeris L.D., et al., Eur. J Obstet gynecol Reprod Biol., 63:41-47, 1995; Jones R.K., et al., Fertil Steril, 66:81-89, 1996). Además, se ha demostrado una disminución en las células T CD3 positivas mediante análisis de citometría de flujo, pero ninguna diferencia en la proporción de leucocitos del estroma CD4+, CD8+ en el endometrio de pacientes con endometriosis, en comparación con los controles fértiles. Cuando se utilizan estas observaciones cautelosamente en una prueba diagnóstica, sólo dan bajos niveles de sensibilidad y especificidad debido a un significativo solapamiento entre los grupos.

Por tanto, los métodos diagnósticos presentados en la bibliografía hasta ahora no resuelven los problemas encontrados con el diagnóstico de la endometriosis mediante procedimientos quirúrgicos. Sigue siendo imprescindible estar dotados de un método menos invasivo, más económico y fidedigno que pueda permitir la detección de mujeres que padecen de endometriosis lo más pronto posible.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método menos invasivo, más económico y fidedigno que pueda permitir la detección de mujeres que padecen de endometriosis lo más pronto posible.

Según la presente invención se proporciona un método para determinar la posibilidad de endometriosis en una muestra de tejidos de endometrio uterino eutópico o una muestra de sangre de una mujer, caracterizado porque comprende las etapas de:

a): medir en dicha muestra un nivel cuantitativo de al menos dos antígenos de superficie diferentes seleccionados de leucocitos de la sangre y/o leucocitos del endometrio eutópico, tal como se define en la reivindicación 1;

b): establecer un valor límite para cada marcador leucocitario en la combinación;

c): comparar la proporción obtenida en la etapa b) para cada marcador leucocitario con un valor límite predeterminado, en el que un resultado positivo da una puntuación de 1, mientras que un resultado negativo da una puntuación de 0;

d): obtener un valor diagnóstico mediante la suma de las puntuaciones de todos los marcadores de la combinación y convertirlo en porcentaje; y

e): comparar el valor diagnóstico final con un valor umbral establecido en el que se da un diagnóstico positivo de endometriosis cuando el valor diagnóstico final supera el valor umbral establecido para la combinación de marcadores leucocitarios, mientras que se da un diagnóstico negativo de endometriosis cuando el valor diagnóstico final es inferior al valor umbral establecido para la combinación de marcadores leucocitarios.

Además, según la presente invención, también se proporciona un método para determinar endometriosis en una muestra de tejidos de endometrio uterino eutópico o una muestra de sangre de una mujer, que comprende:

a): medir en dicha muestra un nivel cuantitativo de al menos dos antígenos de superficie diferentes seleccionados de leucocitos de la sangre y/o leucocitos del endometrio eutópico, tal como se define en la reivindicación 3;

b): establecer un modelo de predicción para endometriosis mediante la inclusión de cada marcador de dicha combinación en una ecuación de regresión logística, tal como se define en la reivindicación 3;

c): comparar la probabilidad de tener endometriosis con un valor umbral, en el que se da un diagnóstico positivo de endometriosis cuando el valor de la probabilidad de tener endometriosis supera el valor umbral establecido para dicha combinación de marcadores, mientras que se da un diagnóstico negativo de endometriosis cuando el valor de la probabilidad de tener endometriosis es inferior al valor umbral establecido para dicha combinación de marcadores.

Para el fin de la presente invención, se pretende que el siguiente símbolo "/" signifique una razón entre una expresión delante del símbolo y otra expresión detrás del símbolo.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 ilustra un algoritmo de predicción para el diagnóstico de endometriosis.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, se proporciona una prueba diagnóstica fidedigna para la endometriosis que es menos invasiva y menos costosa que el procedimiento quirúrgico real aceptado como regla de oro. Se llevó a cabo un amplio estudio mediante análisis de citometría de flujo, en el que se comparó la proporción de varios subconjuntos de leucocitos de la sangre y del endometrio en pacientes con endometriosis y controles normales.

La presente invención identifica una serie de subconjuntos de leucocitos que pueden usarse como marcadores en una prueba diagnóstica para endometriosis. Estos subconjuntos de leucocitos se definen según la expresión de antígenos de la superficie celular. Varios antígenos de la superficie celular pueden definir la misma población de células y, por tanto, se incluyen en la presente invención.

Cualquier otro anticuerpo o molécula que reconozca el mismo antígeno o un epítopo, isoforma, subunidad, cadena, forma de glucosilación o fosforilación diferente o en una variante alélica del mismo antígeno, un elemento del mismo complejo, o un antígeno con la misma distribución celular también se incluye en la presente invención.

Además, según la presente invención, se proporcionan ejemplos que muestran cómo pueden usarse al menos dos antígenos de superficie diferentes de leucocitos de la sangre y/o el endometrio en combinaciones en una prueba diagnóstica para endometriosis (tablas 1 y 2).

TABLA 1 Niveles de sensibilidad y especificidad proporcionados por varios ejemplos de combinaciones de marcadores del endometrio y/o de la sangre usados como un método diagnóstico para endometriosis

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TABLA 2 Ejemplos de modelos de regresión logística proporcionados por marcadores leucocitarios de la sangre o del endometrio para la identificación de pacientes con endometriosis

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Los modelos de predicción para la endometriosis se establecieron según la siguiente ecuación:

200

en la que:

P(r) = probabilidad de tener endometriosis;

c = constante establecida para una combinación particular;

B = coeficiente de regresión; y

n = número total de marcadores en la combinación.

En la presente invención, se ha identificado una serie de subpoblaciones de leucocitos en el endometrio y en la sangre periférica para las que se modularon las proporciones en pacientes con endometriosis (estadio I-IV; I-II o III-IV) en comparación con las de los controles normales. La novedad de la presente invención es utilizar estas subpoblaciones de leucocitos en combinación, como marcadores para el diagnóstico de la endometriosis. Además, se demostró que los factores de riesgo para endometriosis identificados entre la información personal y las características menstruales tienen un valor significativo cuando se usan en combinación con subconjuntos de leucocitos de la sangre o del endometrio en una prueba de predicción para endometriosis.

Se utilizaron dos métodos para la combinación de marcadores.

Método 1

Se establece un punto límite para la proporción de cada combinación de marcadores leucocitarios con el fin de obtener la mejor discriminación entre pacientes con endometriosis y controles. La proporción obtenida para cada marcador se compara con el punto límite. Un resultado de prueba positivo da una puntuación de 1, mientras que un resultado de prueba negativo da una puntuación de 0. El valor diagnóstico se obtiene mediante la suma de las puntuaciones de todos los marcadores de una combinación particular y convirtiéndolo en porcentaje. El valor diagnóstico final se compara entonces con un valor umbral que se estableció para proporcionar los mejores niveles de sensibilidad y especificidad. Se da un diagnóstico positivo de endometriosis cuando el valor diagnóstico final supera el valor umbral establecido para una combinación particular de marcadores. Por el contrario, se da un diagnóstico negativo de endometriosis cuando el valor diagnóstico final es inferior al valor umbral (véase la figura 1).

Por tanto, según una primera realización de la invención, se proporciona un método para determinar endometriosis en una muestra de tejidos de endometrio uterino eutópico o una muestra de sangre de una mujer, que comprende:

a): medir en dicha muestra un nivel cuantitativo de al menos dos antígenos de superficie diferentes de leucocitos de la sangre y/o leucocitos del endometrio eutópico, seleccionándose dichos antígenos de superficie de leucocitos de la sangre y/o leucocitos del endometrio eutópico de las combinaciones de marcadores leucocitarios definidas en la siguiente tabla:

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: estando asociada la medición del nivel cuantitativo de la combinación de marcadores leucocitarios del endometrio CD3+, CD13+CD20 con la duración de la menstruación (> 7 días) y el dolor pélvico en cualquier momento distinto a la menstruación y el coito; estando asociada la medición del nivel cuantitativo de la combinación de marcadores leucocitarios de la sangre CD14+, CD57+, CD3+HLADR-, CD3-CD45RA- con el dolor pélvico en cualquier momento distinto a la menstruación y el coito, y la duración de la menstruación (> 7 días); y estando asociada la medición del nivel cuantitativo de la combinación de marcadores leucocitarios de la sangre CD14+, CD57+, CD3+CD69+, CD3+HLADR-, CD3-CD45RA- con el dolor pélvico en cualquier momento distinto a la menstruación y el coito, y la edad > 40,

b): establecer un valor límite para la proporción de cada marcador leucocitario en la combinación,

c): comparar la proporción obtenida en la etapa (b) para cada marcador leucocitario con un valor límite predeterminado, en el que un resultado positivo da una puntuación de 1, mientras que un resultado negativo da una puntuación de 0,

d): obtener un valor diagnóstico mediante la suma de las puntuaciones de todos los marcadores de la combinación y convertirlo en porcentaje,

e): comparar el valor diagnóstico final con un valor umbral establecido, en el que se da un diagnóstico positivo de endometriosis cuando el valor diagnóstico final supera el valor umbral establecido para la combinación de marcadores leucocitarios, mientras que se da un diagnóstico negativo de endometriosis cuando el valor diagnóstico final es inferior al valor umbral establecido para la combinación de marcadores leucocitarios.

Método 2

Se establece un modelo de predicción para endometriosis mediante la inclusión de cada marcador de una combinación particular en la siguiente ecuación de regresión logística:

300

en la que:

P (r) = probabilidad de tener endometriosis;

c = constante establecida para una combinación particular;

B = coeficiente de regresión; y

n = número total de marcadores en la combinación.

La probabilidad de tener endometriosis (P(r)) se comparó entonces con un valor umbral que proporciona el mejor valor discriminatorio. Se da un diagnóstico positivo de endometriosis cuando el valor de P(r) supera el valor umbral establecido para una combinación particular de marcadores. Alternativamente, se da un diagnóstico negativo de endometriosis cuando el valor de P(r) es inferior al valor umbral.

Por tanto, según una segunda realización de la invención, se proporciona un método para determinar endometriosis en una muestra de tejidos de endometrio uterino eutópico o una muestra de sangre de una mujer, que comprende:

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b): establecer un modelo de predicción para endometriosis mediante la inclusión de cada marcador de dicha combinación en la siguiente ecuación de regresión logística:

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400

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: en la que:

: P (r) = probabilidad de tener endometriosis;

: c = constante establecida para una combinación particular;

: B = coeficiente de regresión;

: n = número total de marcadores en la combinación,

c): comparar la probabilidad de tener endometriosis (P (r)) con un valor umbral, en el que se da un diagnóstico positivo de endometriosis cuando el valor de P (r) supera el valor umbral establecido para dicha combinación de marcadores, mientras que se da un diagnóstico negativo de endometriosis cuando el valor de P (r) es inferior al valor umbral establecido para dicha combinación de marcadores.

En la presente invención, se informa de una serie de 101 poblaciones de leucocitos CD45+ del endometrio y 96 poblaciones de leucocitos CD45+ mononucleares de la sangre que se demostró mediante análisis de citometría de flujo que están modulados en pacientes con endometriosis (estadio I, II, III o IV) en comparación con los controles normales y, por tanto, son buenos marcadores candidatos para el diagnóstico de endometriosis (tablas 3, 4, 5, y 6). La característica innovadora de la presente invención es usar estos marcadores en combinación para aumentar su nivel de sensibilidad y especificidad en la prueba diagnóstica.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los puntos límites establecidos para cada marcador individual se presentan en las tablas 3, 4, 5, 6 y el valor umbral establecido para una combinación particular de marcadores se presenta en la tabla 1. En la presente solicitud se pretende incluir cualquier otro punto límite o valor umbral que proporcione una prueba diagnóstica valiosa para endometriosis.

Según la presente invención, se proporciona una serie de 34 combinaciones diferentes de marcadores leucocitarios del endometrio (tablas 1 y 2), 7 combinaciones de marcadores leucocitarios de la sangre (tabla 1) y 4 combinaciones de marcadores leucocitarios de la sangre y del endometrio que proporcionan una prueba diagnóstica con niveles de sensibilidad y especificidad de hasta el 89 y el 90%, respectivamente. Las diferentes combinaciones de marcadores de la presente invención pueden servir para diversas necesidades clínicas importantes. Por tanto, en la población general, estos marcadores podrían usarse para evaluar el factor de riesgo para desarrollar endometriosis o para identificar mujeres con alta posibilidad de padecer la enfermedad. Además, en las pacientes con endometriosis, estos marcadores podrían servir para monitorizar la enfermedad o para facilitar un pronóstico.

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Muestras y pacientes del estudio

Se obtuvieron tejidos de endometrio uterino de 146 pacientes que se sometieron a laparoscopia o laparotomía. El grupo experimental estaba formado por 88 pacientes con estadio I-IV de endometriosis confirmado mediante laparoscopia o laparotomía y el grupo control consistió en 58 pacientes sanas que se sometieron a cirugía para ligadura de trompas (o reanastomosis) y que no tenían evidencia clínica ni historia familiar de endometriosis. La tabla 7 da detalles relativos a la edad, el ciclo menstrual y la indicación de laparoscopia o laparotomía para las pacientes incluidas en los grupos experimental y control.

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TABLA 7 Descripción de los grupos experimentales usados en el análisis de las poblaciones de leucocitos del endometrio

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Se obtuvieron biopsias de endometrio con una legra (Milex) (aproximadamente 0,5 g de tejido). Todas las muestras se recogieron en la fase de secreción (días 14-28) del ciclo menstrual, tal como se confirmó mediante la evaluación histológica. Las muestras se recogieron en medio RPMI-1640 estéril (Gibco) complementado con un 2% de suero bovino fetal inactivado con calor (Bio-Media) y un 1% de penicilina-estreptomicina y se mantuvo a 4ºC hasta el aislamiento celular.

Se obtuvieron muestras de sangre de 172 pacientes con endometriosis (estadio I-IV) confirmado mediante laparoscopia o laparotomía y de 132 pacientes sanas sin evidencia de endometriosis en la cirugía, y sin historia familiar de endometriosis. Las muestras de sangre (30 ml) se recogieron en tubos con heparina (Vacutainer^{TM}, Becton Dickinson) y se mantuvieron a 20ºC hasta la separación de las células mononucleares. En la tabla 8 se facilita la edad, las fechas menstruales y la indicación de laparoscopia para las pacientes incluidas en el estudio.

TABLA 8 Descripción de las pacientes incluidas en el estudio de leucocitos mononucleares de sangre periférica

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Preparación de células del estroma para muestras de endometrio

Las muestras de tejido de endometrio se alteraron mecánicamente con un triturador de tejido tipo Broeck de vidrio Pyrex^{TM} (Fisher) para obtener una única suspensión celular. Se aisló la fracción de células del estroma mediante filtración a través de un tamiz de acero inoxidable de 250 \mum (Millipore) para retener la fracción glandular y se lavó dos veces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma) que contenían un 1% de BSA (Boehringer Mannheim) y un 0,1% de azida sódica (Fisher) (denominada más adelante tampón de lavado PBS).

Aislamiento de células mononucleares procedentes de sangre periférica

Se diluyeron las muestras de sangre 1:1 con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (Gibco), estratificada sobre un volumen igual de Ficoll-Paque^{TM} (Pharmacia Biotech) y se centrifugaron a 1500 rpm durante 40 minutos a temperatura ambiente. Se aislaron los leucocitos en la superficie de contacto del Ficoll y HBSS y se lavaron en 50 ml de HBSS. Los glóbulos rojos contaminantes se lisaron con 6 ml de disolución de cloruro de amonio (0,15 M) (6 minutos a temperatura ambiente). Las células mononucleares de la sangre periférica se lavaron entonces dos veces en 10 ml de PBS y se resuspendieron en tampón de lavado PBS.

Tinción de antígenos de superficie de leucocitos de la sangre periférica y del endometrio

Se distribuyeron células del estroma del endometrio o células mononucleares de sangre periférica en tubos de 5 ml (de 1 a 1,5 x 10^{6} células/tubo) o en placas de 96 pocillos (5 x 10^{5} células/pocillo), respectivamente y se incubaron en presencia de 0,1 \mug de \gamma-globulina humana durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron entonces durante 30 minutes en la oscuridad (a temperatura ambiente para las células de endometrio y a 4ºC para las células mononucleares de sangre periférica) con un panel de 4 anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón diferentes en un volumen total de 100 \mul. Las muestras de células se tiñeron con AcM de ratón anti-CD45 humano conjugados con proteína clorofila - peridinina (PerCP) y con varios conjuntos de tres AcM de ratón diferentes marcados con distintos fluorocromos (isotiocianato de fluoresceína - FITC-, ficoeritrina-PE o con ficoeritrina-Texas red -ECD-) dirigidos hacia los marcadores de la superficie celular para poblaciones celulares específicas tales como linfocitos T, linfocitos B, células NK, macrófagos y/o marcadores de activación (tabla 9).

TABLA 9 Descripción de anticuerpos monoclonales de ratón usados para inmunofenotipado

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La tabla 10 a continuación enumera la distribución de los antígenos enumerados en la tabla 9.

TABLA 10 Principal distribución de los antígenos

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Las células de la sangre se lavaron dos veces con 0,15 ml de tampón de lavado PBS. Las muestras de células de endometrio se incubaron con una disolución de lisado de glóbulos rojos, (disolución de lisado FACS^{TM}, Becton Dickinson) durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y se incubaron con 3 ml de tampón de lavado PBS. Las células de la sangre y del endometrio se fijaron en paraformaldehído al 1% (diluido en PBS) a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml y se mantuvieron a 4ºC en la oscuridad hasta que se determinó la reactividad de inmunofluorescencia mediante citometría de flujo.

Análisis de citometría de flujo

La reactividad de inmunofluorescencia se llevó a cabo en un citómetro de flujo Coulter EPICS XL^{TM} (Coulter Corporation, Hialeah, FL) equipado con un láser de argón que funcionaba a 488 nm, 15 mW y detectores a 525, 575, 610 y 675 nm. La calibración de los parámetros del citómetro de flujo para la dispersión frontal, la dispersión lateral y la fluorescencia fue la misma para todas las muestras. Se dio entrada a las células que expresaban el pan-antígeno leucocitario (antígeno leucocitario común para todas las especies) CD45 utilizando el software Coulter system II. Se evaluó el porcentaje de células que portaban marcadores para linfocitos T, B, macrófagos o células NK y/o marcadores de activación únicamente dentro de las poblaciones de CD45 positivas. Se analizó un mínimo de 6000 células CD45+ para cada muestra.

Uso de marcadores leucocitarios en una prueba diagnóstica para endometriosis

Se estableció un punto límite para la proporción de las subpoblaciones de leucocitos de la sangre o del endometrio identificadas como marcadores de diagnóstico. El valor obtenido para cada marcador se compara con el punto límite (figura 1). Se dio un resultado positivo cuando la proporción de un subconjunto particular de leucocitos cumple la condición establecida por el punto límite (por ejemplo < 40% para las células CD3+). Cuando estos marcadores se usan en combinación, un resultado positivo para cada marcador da una puntuación de 1, mientras que un resultado negativo da una puntuación de 0. Se da un diagnóstico de endometriosis cuando la puntuación de diagnóstico final obtenida a partir de la suma de los resultados de todos los marcadores de una combinación particular es superior a un valor umbral predeterminado. Los niveles de sensibilidad y/o especificidad medidos para la combinación de marcadores representa el número de resultados de prueba positivos obtenidos entre las pacientes en las que ya se ha confirmado que tienen endometriosis y el número de resultados de prueba negativos entre las pacientes dentro del grupo control, respectivamente.

Los marcadores leucocitarios de la sangre y del endometrio pueden usarse en combinaciones en el modelo de regresión logística:

500

en la que:

P(r) = probabilidad de tener endometriosis

c = constante establecida para una combinación particular

B = coeficiente de regresión

n = número total de marcadores en la combinación

Resultados

En las tablas 3 y 4 se presentan los subconjuntos de leucocitos de la sangre y del endometrio definidos como buenos marcadores potenciales para el diagnóstico de endometriosis, respectivamente. La selección de estos marcadores se realizó partiendo de la base de una diferencia significativa en la proporción media de los subconjuntos de leucocitos entre las pacientes con endometriosis (estadio I-IV) y los grupos control. Además, también se seleccionaron varios marcadores de la sangre y del endometrio según el área bajo la curva ROC, una indicación del valor discriminatorio de los marcadores. La curva ROC permitió la determinación de una o más proporciones límite que mejor discriminan entre las pacientes con endometriosis (estadio I-IV) y los controles normales. En un intento por usar estas diferencias para identificar pacientes con endometriosis, se dio un resultado de prueba positivo cuando la proporción medida para un subconjunto particular de leucocitos cumple la condición establecida por el punto límite (por ejemplo < 40% para las células CD3+). Se calcularon los niveles de especificidad y sensibilidad para cada marcador usado solo para diagnosticar la endometriosis y se presentan en la tabla 3 (para los marcadores leucocitarios del endometrio) y en la tabla 4 (para los marcadores leucocitarios de la sangre). Además, un cociente de probabilidades significativo calculado con un punto límite particular dio una indicación adicional de que los marcadores leucocitarios seleccionados en las tablas 3 y 4 están asociados con un aumento del riesgo de desarrollar endometriosis y, por tanto, pueden usarse para identificar mujeres con alta posibilidad de padecer de endometriosis.

Se encontró que la proporción media de algunos subconjuntos de leucocitos del endometrio (tabla 5) y de la sangre (tabla 6) estaba modulada significativamente sólo en las pacientes con endometriosis de estadio I-II o con endometriosis de estadio III-IV cuando se comparaba con los controles normales. No obstante, estos marcadores siguen siendo buenos candidatos para una prueba diagnóstica para endometriosis, pero su uso puede limitarse a un estadio de la enfermedad específico.

Se encontró que varios de los marcadores leucocitarios de la sangre y del endometrio eran incluso más fidedignos como marcadores de diagnóstico cuando se analizan en combinación con otros marcadores. La tabla 1 da una serie de 33 combinaciones en las que los marcadores leucocitarios de la sangre o del endometrio se usan en una prueba diagnóstica para endometriosis. Para cada marcador, un resultado de prueba positivo (tal como se describió anteriormente) da una puntuación de 1, mientras que un resultado de prueba negativo da una puntuación de 0. El valor diagnóstico final obtenido a partir de la suma de las puntuaciones de todos los marcadores de una combinación particular se comparó entonces con un valor umbral, que se indica en la tabla 1.

Se da un diagnóstico de endometriosis cuando el valor diagnóstico supera el valor umbral establecido para cada conjunto de marcadores de la combinación. El uso de subconjuntos de marcadores leucocitarios en combinación en este nuevo método mejora claramente los niveles de sensibilidad y/o especificidad para diagnosticar endometriosis. La tabla 1 también proporciona 4 ejemplos que muestran que los marcadores leucocitarios de la sangre, cuando se usan en combinación con los marcadores del endometrio, también pueden aumentar el valor de predicción de la prueba diagnóstica.

La presente invención también demuestra que los modelos de regresión logística también pueden usarse para combinar los marcadores leucocitarios del endometrio, así como los de la sangre, para el desarrollo de un modelo de predicción de endometriosis (tabla 2). En algunos casos, es necesario que estos modelos se ajusten con los factores de riesgo asociados con la endometriosis, tales como la duración del ciclo menstrual, la duración de la menstruación, el dolor durante el coito y la edad. En algunos casos, se demostró que estos factores aumentan el valor de predicción del modelo.

La presente invención identifica varios ejemplos de combinaciones de marcadores, que dan lugar a métodos diagnósticos que producen niveles de sensibilidad y especificidad mejorados. De hecho, las diferentes combinaciones de marcadores de la presente invención pueden servir para diferentes aplicaciones clínicas, incluyendo la detección, diagnóstico, monitorización y pronóstico de la endometriosis.

Claims

1. Método para determinar endometriosis en una muestra de tejidos de endometrio uterino eutópico o una muestra de sangre de una mujer, que comprende:

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2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha proporción de marcadores leucocitarios se determina mediante el uso de al menos un anticuerpo específico para dicha al menos una población específica de leucocitos.

3. Método para determinar endometriosis en una muestra de tejidos de endometrio uterino eutópico o una muestra de sangre de una mujer, que comprende:

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: estando asociada la medición del nivel cuantitativo de la combinación de marcadores leucocitarios del endometrio CD3+, CD13+CD20 con la duración de la menstruación (> 7 días) y el dolor pélvico en cualquier momento distinto a la menstruación y el coito; estando asociada la medición del nivel cuantitativo de la combinación de marcadores leucocitarios de la sangre CD14+, CD57+, CD3+HLADR-, CD3-CD45RA- con el dolor pélvico en cualquier momento distinto a la menstruación y el coito, y la duración de la menstruación (> 7 días); y estando asociada la medición del nivel cuantitativo de la combinación de marcadores leucocitarios de la sangre CD14+, CD57+, CD3+CD69+, CD3+HLADR-, CD3-CD45RA- con el dolor pélvico en cualquier momento distinto a la menstruación y el coito, y la edad > 40, estableciendo un modelo de predicción para endometriosis mediante la inclusión de cada marcador de dicha combinación en la siguiente ecuación de regresión logística:

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: en la que:

: P (r) = probabilidad de tener endometriosis;

: c = constante establecida para una combinación particular;

: B = coeficiente de regresión;

: n = número total de marcadores en la combinación,

: comparándose la probabilidad de tener endometriosis (P (r)) con un valor umbral, en el que se da un diagnóstico positivo de endometriosis cuando el valor de P (r) supera el valor umbral establecido para dicha combinación de marcadores, mientras que se da un diagnóstico negativo de endometriosis cuando el valor de P (r) es inferior al valor umbral establecido para dicha combinación de marcadores.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho nivel cuantitativo se mide mediante el uso de al menos un anticuerpo dirigido frente a dichas poblaciones específicas de leucocitos.