ES2292486T3 - Procedimiento para la caracterizacion y la separacion de asociaciones moleculares. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la caracterización de asociaciones moleculares formadas por subunidades, en el que: - se marcan subunidades no asociadas con al menos un colorante fluorescente, - las subunidades marcadas se ponen en contacto entre sí o con subunidades no marcadas o con asociaciones moleculares formadas por subunidades, con el fin de obtener una adición y/o enlace de las subunidades marcadas, entre sí o a subunidades no marcadas o a las asociaciones moleculares formadas por subunidades, para formar asociaciones moleculares marcadas, y - se caracterizan por medio de un FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter) las asociaciones moleculares marcadas, hallándose comprendidas las asociaciones moleculares que se han de caracterizar en un margen de tamaños de entre 1 y 1000 nm, y - las asociaciones moleculares son cápsides de virus o de fagos, proteasomas, complejos chaperón o ribosomas, o están compuestas por subunidades modificadas de ellos, o son asociaciones de péptidos o de proteínas formadas por las mismas subunidades, ADN monocatenario o bicatenario, ARN monocatenario o bicatenario, asociaciones de lípidos, asociaciones de fosfolípidos, asociaciones de hidratos de carbono, asociaciones de polisacáridos, asociaciones que contienen compuestos de hidrocarburos de carácter hidrófilo o hidrófobo, asociaciones de compuestos isoprenoides, o mezclas de ellos.
Description
Procedimiento para la caracterización y la
separación de asociaciones moleculares.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la caracterización, y opcionalmente para la
separación, de asociaciones moleculares, con un margen de tamaños
de entre 1 y 1000 nm, en particular también de partículas de ese
tipo con un tamaño inferior a los 300 nm, en el que se utilizan como
marcadores subunidades de las asociaciones moleculares marcadas con
colorantes fluorescentes, y la caracterización de las asociaciones o
agregados marcados tiene lugar por medio de un FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorter).
En una serie de enfermedades se produce la
formación de "asociaciones irregulares" morfológicas, esto es,
agregados. Los depósitos patológicos de ese tipo están formados con
frecuencia por proteínas, fragmentos de proteína o péptidos, que se
encuentran distribuidos por el cuerpo (sistémicas) o concentrados en
órganos determinados, como el páncreas, o en el sistema nervioso
central. Así, en el caso de la enfermedad de Alzheimer se encuentra
como depósito característico en el cerebro un péptido (péptido
\beta del Alzheimer, con una longitud en la mayoría de los casos
de 42 aminoácidos, como fragmento de una proteína precursora más
grande), que forma los llamados agregados amiloidogénicos
("placas seniles"). Además de eso, en la enfermedad de
Alzheimer aparece como segunda característica el desarrollo de
estructuras neurofibrilares ("tangles" o "paired helical
filaments"), formadas por la proteína Tau. Hasta la fecha no se
ha aclarado de forma concluyente en muchas enfermedades
amiloidogénicas hasta qué punto intervienen en el curso de la
enfermedad esos depósitos proteínicos, ni si esos depósitos son
causalmente responsables de la enfermedad o sólo representan
síntomas concomitantes.
Un cuadro similar presentan las encefalopatías
espongiformes transmisibles, inducidas por la proteína del prión.
La forma humana característica de éstas se encuentra en la
enfermedad de Creutzfeld-Jakob, en el reino animal
se conocen especialmente la enfermedad de las vacas (BSE) y de las
ovejas (Scrapie). No se excluye actualmente, además, una posible
conexión entre la aparición de la BSE en el ganado bovino y una
nueva forma de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob
(vCJD) (M.E. Bruce et al., Transmissions to mice indicate
that new variant' CJD is caused by the BSE agent, Nature 389, págs.
498-501, 1997). Para la enfermedad análoga en la
oveja (Scrapie) se ha observado que existe una conexión entre la
concentración de la proteína relevante para la enfermedad y la
infecciosidad. La siguiente tabla se ha tomado con modificaciones, y
se ha ampliado, de Kelly, J.W., Alternative conformations of
amyloidogenic proteins govern their behavior, Curr. Opin. Struct.
Biol. 6, págs. 11-17, 1996.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los agregados que aparecen en estas enfermedades
se forman principalmente a partir de las proteínas indicadas o de
fragmentos de esas proteínas, y son en cada caso muy característicos
de la existencia de la enfermedad. En consecuencia, los
procedimientos para el diagnóstico de esas enfermedades se pueden
basar en el hecho de que las proteínas o fragmentos de proteína,
esto es, las subunidades de las asociaciones moleculares, en
circunstancias apropiadas tienden incluso in vitro a una
agregación o condensación selectivas. Hasta la fecha, sin embargo,
en la mayoría de los casos de las mencionadas enfermedades resulta
difícil o todavía está técnicamente sin resolver la detección
diagnóstica. Hasta la fecha los procedimientos de prueba conocidos
para el diagnóstico del Alzheimer parten en su mayoría de una
detección inmunológica de las proteínas y péptidos participantes, y
por consiguiente no de una detección directa de las asociaciones o
de los depósitos de agregados o de sus subcomponentes. En esos
procedimientos se le extrae por regla general al paciente líquido
cefalorraquídeo (LCR, liquor) mediante una dolorosa punción lumbar.
En el LCR se contienen las sustancias que han de ser detectadas
para la enfermedad de Alzheimer. Se consigue en este caso hacer
precisa la detección por medio de la medición simultánea de las dos
sustancias solubles específicas del Alzheimer, la proteína Tau y el
péptido amiloide \beta (M. Shoji et al., Combinatiosn
assay of CSF tau, A\beta1-40 and
A\beta1-42(43) as a biochemical marker of
Alzheimer's disease, J. Neurol. Sci. 158, págs.
134-140, 1998; F. Hulstaert, K. Blennow, A. Ivanoiu,
H.C. Schoonderwaldt, M. Riemenschneider, P.P. De Deyn, C. Bancher,
P. Cras, J. Wiltfang, P.D. Metha, K. Iqbal, H. Pottel, E.
Vanmechelen, y H. Vanderstichele: Improved discrimination of AD
patients using beta-amyloid (1-42)
and tau levels in CSF, Neurology 52, pág. 1555-1562,
1999).
En la patente estadounidense 5,593,846 se
describe un procedimiento para determinar la concentración del
péptido amiloide \beta disuelto, pero en ese caso no se registra
el componente patológico (depósitos).
En la patente estadounidense 5,434,050 se
describe un procedimiento diagnóstico para el Alzheimer, en el que
el péptido se liga a estructuras sólidas (por ejemplo material de
biopsia cerebral). Un procedimiento de este tipo no puede tener
lugar sin una seria intervención médica, y actualmente no se
aplica.
En la patente WO 99/15903 se describe un
procedimiento para poder detectar depósitos patológicos con ayuda
del método de la FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy). El
método de la FCS, sin embargo, está controlado por difusión y no es
apropiado técnicamente para un elevado rendimiento, sólo se pueden
diferenciar unas pocas especies moleculares de diferente tamaño,
como máximo de 2 a 3, debiendo tener las especies masas que difieran
como mínimo en una potencia de diez, y la distribución según tamaño
solamente se puede estimar y en cada etapa del procedimiento se
utilizan solamente pocos tipos de colorante fluorescente (por regla
general uno). La autoagregación de la sonda supone en este caso un
importante problema del procedimiento. Por eso el método no es
apropiado para registrar de manera inequívoca un amplio espectro de
posibles señales y expresiones patológicas, en particular no se
consigue una determinación paralela del péptido \beta y la
proteína Tau. Asimismo, es considerable el tiempo que se necesita
por cada medición. En la patente WO 99/15903 se indica como
característica esencial la limitación de tiempo que supone el medir
la asociación de la sonda a la diana antes de que predomine una
autoagregación de la sonda.
La patente estadounidense 5,486,460 describe un
procedimiento para el diagnóstico del Alzheimer, en el que se seca
líquido cefalorraquídeo concentrado y a continuación se colorea con
tioflavina S. Este procedimiento, sin embargo, es extremadamente
poco atractivo en cuanto a la manipulación práctica, y tampoco
resulta suficientemente específico para un diagnóstico clínico, por
lo que el procedimiento no recibe mayor atención.
La patente WO 9704311-A2
reivindica un procedimiento basado en el FACS para aislar células
vivas a partir de una mezcla de diferentes células vivas que se
diferencian en la existencia y distribución de los receptores que
se encuentran sobre su superficie. En ese procedimiento no se
utilizan, de forma ventajosa en comparación con el estado actual de
la técnica, anticuerpos marcados fluorescentemente, que exigen la
permeabilización y, en consecuencia, la muerte de las células, sino
péptidos marcados fluorescentemente, derivados de ligandos
naturales de receptores existentes en la superficie de las células.
Cuando tiene lugar una incubación de las células con péptidos de
ese tipo, éstos se adicionan a sus correspondientes receptores y de
esa manera marcan una determinada población celular, que puede ser
aislada con ayuda de un FACS. El procedimiento, así pues, se
refiere en último término a la aplicación, habitual en el estado
actual de la técnica, del procedimiento del FACS para el análisis y
clasificación de células.
En la patente US-PS 5540494 se
describe un método que permite, partiendo de datos que han sido
medidos con un citómetro de flujo convencional, calcular el radio
absoluto y la superficie absoluta de la partícula analizada. Como
margen de tamaños para las partículas se señala el de 0,33 a 8,98
\mum. No se encuentra descrita la caracterización de partículas
más pequeñas.
Palutke et al., Cytometry
8:494-499, 1987, describen el enlace de la
tioflavina T a la Amyloid Plaque Core Proteine (APCP), en cuyo
proceso se dio a conocer que la tioflavina T no se enlaza con la
lipofuscina. Puesto que las partículas de APCP están frecuentemente
contaminadas con partículas de lipofuscina, existía la necesidad de
separar las partículas de APCP de la lipofuscina contaminante.
Conforme a Palutke et al. se preparó una mezcla de APCP y
lipofuscina con tioflavina T y se pudo conseguir una purificación de
la lipofuscina por medio de un análisis por FACS.
Hercher et al., The Journal of
Histochemistry and Cytochemistry, tomo 27, núm. 1, págs.
350-352, 1979 describen la utilización de
procedimientos de citometría de flujo para la caracterización de
partículas individuales de virus. Las partículas de virus se marcan
con anticuerpos marcados fluorescentemente y se analizan con ayuda
de la citometría de flujo.
En todos los casos sería deseable desarrollar un
procedimiento altamente específico y sensible con el que se puedan
detectar los péptidos (fragmentos de proteína) vinculados con las
mencionadas enfermedades en forma soluble, o también en forma de
gérmenes de cristalización -que forman depósitos-, y, de esa manera,
se pueda conseguir un diagnóstico inequívoco y sensible de la
correspondiente enfermedad. Además de eso, sería enormemente
ventajoso poder llevar a cabo lo más precozmente posible un
diagnóstico (bioquímico, serológico) de la enfermedad, a fin de
comenzar los primeros pasos terapéuticos antes todavía de que se
declare la enfermedad. Los costes asistenciales para los enfermos
de Alzheimer son considerables. Un diagnóstico precoz, unido a una
subsiguiente terapia eficaz, tendría como consecuencia, por lo
tanto, considerables ahorros para la sanidad pública. Además de
eso, un diagnóstico de ese tipo se podría aplicar regularmente como
reconocimiento preventivo, también en el caso de personas de edad
avanzada sanas o no sospechosas a modo de medida preventiva.
Constituye el objetivo de la presente invención,
por consiguiente, proporcionar un procedimiento para la
caracterización de asociaciones moleculares que no presente los
mencionados inconvenientes del estado actual de la técnica.
Esto se consigue conforme a la invención por
medio de un procedimiento según la reivindicación 1 para la
caracterización de asociaciones moleculares formadas por
subunidades, en el que:
- se marcan subunidades no asociadas con al
menos un colorante fluorescente,
- las subunidades marcadas se ponen en contacto
entre sí o con subunidades no marcadas o con asociaciones
moleculares formadas por subunidades, con el fin de obtener una
adición y/o enlace de las subunidades marcadas, entre sí o a
subunidades no marcadas o a las asociaciones moleculares formadas
por subunidades, para formar asociaciones moleculares marcadas,
y
- se caracterizan por medio de un FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorter) las
asociaciones moleculares marcadas,
y
\global\parskip0.900000\baselineskip
- las asociaciones moleculares que se han de
caracterizar se hallan comprendidas en un margen de tamaños de
entre 1 y 1000 nm, y
- las asociaciones moleculares son cápsides de
virus o de fagos, proteasomas, complejos chaperón o ribosomas, o
están compuestas por subunidades modificadas de ellos, o
- son asociaciones de péptidos o de proteínas
formadas por las mismas subunidades, ADN monocatenario o
bicatenario, ARN monocatenario o bicatenario, asociaciones de
lípidos, asociaciones de fosfolípidos, asociaciones de hidratos de
carbono, asociaciones de polisacáridos, asociaciones que contienen
compuestos de hidrocarburos de carácter hidrófilo o hidrófobo,
asociaciones de compuestos isoprenoides, o mezclas de ellos.
De las reivindicaciones secundarias, así como de
la descripción, resultan formas ventajosas de realización de la
invención.
En el marco de las investigaciones sobre el
diagnóstico bioquímico, biotecnológico y médico se plantea
regularmente el problema de caracterizar asociaciones de sustancias
moleculares. Las subunidades de las asociaciones pueden pertenecer
en ese caso a diferentes clases bioquímicas, como por ejemplo
péptidos o proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y fosfolípidos,
hidratos de carbono y polisacáridos, así como sustancias derivadas
de ellos, o las asociaciones pueden contener también subunidades de
diferentes clases. Las caracterizaciones de este tipo son
relevantes para aplicaciones de diagnóstico médico o terapéuticas.
También en las investigaciones fundamentales biológicas y químicas,
así como en la investigación orientada a la aplicación, pueden
resultar necesarias las caracterizaciones de ese tipo.
En la presente invención se emplea un resultado
experimental inesperado para medir y caracterizar las asociaciones
moleculares de ese tipo, así como para separar un conjunto de tales
condensaciones en relación con propiedades seleccionadas, como el
tamaño o la composición.
De manera sorprendente se descubrió que se puede
encontrar solución a la caracterización de asociaciones moleculares
por medio de un método que fue desarrollado originalmente para la
caracterización y separación de células. Los aparatos utilizados
para ello se denominan a consecuencia de ello aparatos FACS
(Fluorescence-Activated
Cell Sorter). Un aparato FACS (aparato de clasificación de células, conocido también como citómetro de flujo en una versión más sencilla) es, expresado de forma simplificada, un sistema óptico de medida que en una gotita de líquido aislada analiza señales de luz difusa o fluorescentes de partículas individuales focalizadas en una corriente de líquido. Al contrario de lo que ocurre con un fluorímetro estático, los resultados se basan en una medición simultánea de varios parámetros físicos de cada partícula individual que en la corriente de líquido pasa por el sistema de detección. La excitación óptica tiene lugar aquí por medio de láser. Se realiza el análisis después de contar un número estadísticamente seguro de eventos individuales (partículas) en la corriente de líquido. Los aparatos de clasificación de células tienen con respecto a los citómetros de flujo la posibilidad adicional de proporcionar una carga eléctrica a cada gota individual de la corriente de líquido que contiene una partícula según sus propiedades medidas, tales como la intensidad de la fluorescencia o las propiedades de la luz difusa (tamaño y forma o granularidad de la partícula), carga eléctrica que a continuación se puede utilizar para la clasificación de la partícula en diferentes recipientes. En el proceso, la gotita cargada, con la partícula que contiene, es guiada a través de un campo eléctrico y desviada según su carga.
Cell Sorter). Un aparato FACS (aparato de clasificación de células, conocido también como citómetro de flujo en una versión más sencilla) es, expresado de forma simplificada, un sistema óptico de medida que en una gotita de líquido aislada analiza señales de luz difusa o fluorescentes de partículas individuales focalizadas en una corriente de líquido. Al contrario de lo que ocurre con un fluorímetro estático, los resultados se basan en una medición simultánea de varios parámetros físicos de cada partícula individual que en la corriente de líquido pasa por el sistema de detección. La excitación óptica tiene lugar aquí por medio de láser. Se realiza el análisis después de contar un número estadísticamente seguro de eventos individuales (partículas) en la corriente de líquido. Los aparatos de clasificación de células tienen con respecto a los citómetros de flujo la posibilidad adicional de proporcionar una carga eléctrica a cada gota individual de la corriente de líquido que contiene una partícula según sus propiedades medidas, tales como la intensidad de la fluorescencia o las propiedades de la luz difusa (tamaño y forma o granularidad de la partícula), carga eléctrica que a continuación se puede utilizar para la clasificación de la partícula en diferentes recipientes. En el proceso, la gotita cargada, con la partícula que contiene, es guiada a través de un campo eléctrico y desviada según su carga.
Los aparatos FACS permiten mediciones
cuantitativas en partículas individuales con una elevada precisión.
En especial los aparatos FACS ofrecen la posibilidad de analizar un
gran número de partículas en un tiempo muy breve. Además de eso,
resulta ventajoso el hecho de que se pueda efectuar una
caracterización de la partícula a escala preparativa, ya que es
posible una clasificación de las partículas según propiedades
predefinidas (por ejemplo tamaño o intensidad de fluorescencia). En
el aparato FACS tiene lugar el análisis de partículas que se
encuentran en una corriente de líquido de forma primaria en relación
con sus señales de luz difusa y fluorescentes.
En el estado actual de la técnica se han medido
hasta la fecha exclusivamente sistemas con células u orgánulos
celulares con ayuda de aparatos FACS. De manera sorprendente se pudo
comprobar que con los aparatos FACS, preferiblemente con los
aparatos FACS de última generación, se pueden también caracterizar
asociaciones y agregados moleculares individuales. Estas
asociaciones pueden ser conforme a la invención mucho más pequeñas
que lo que supone el límite de resolución de los aparatos de ese
tipo (aprox. 300 nm). Utilizando colorantes fluorescentes
apropiados se consiguen efectos en la disolución utilizada que
permiten una caracterización de las sustancias moleculares en
relación con el tamaño y la composición con una alta
reproducibilidad. Aquí se puede utilizar cualquier colorante
fluorescente que después de la formación de las asociaciones
moleculares irradie una señal fluorescente suficientemente intensa
para la detección de la asociación. Se prefieren en este caso los
colorantes con un alto rendimiento cuántico si la sensibilidad del
procedimiento ha de ser elevada. Al mismo tiempo, por medio del
procedimiento basado en láser se pueden obtener, en base a la
difusión lateral, informaciones sobre la forma y granularidad, y,
en base a la difusión hacia adelante, sobre el tamaño de las
asociaciones y agregados moleculares.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la caracterización de asociaciones moleculares.
Las asociaciones moleculares pueden estar aquí formadas por
subunidades químicamente diferentes o del mismo tipo, que se
encuentren condensadas de forma específica o no específica. En el
procedimiento conforme a la invención, a las subunidades no
ensambladas de las asociaciones moleculares se les proporciona como
mínimo una marca óptica, a saber, como mínimo una molécula
fluorescente. Estas subunidades marcadas se ponen a continuación en
contacto, como "marcadores", entre sí o con subunidades no
marcadas o con asociaciones moleculares formadas por subunidades,
con el fin de conseguir una adición y/o enlace de las subunidades
marcadas unas a otras o a subunidades no marcadas o a las
asociaciones moleculares formadas por subunidades. De esta manera se
forman asociaciones moleculares marcadas que a continuación pueden
ser caracterizadas con ayuda de un FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorter) en relación
con el tamaño, la forma y la composición. A continuación se puede
llevar a cabo opcionalmente una separación de las asociaciones
investigadas mediante procedimientos conocidos, por ejemplo una
separación de las asociaciones moleculares según su tamaño o según
la intensidad de su señal fluorescente. Para hacerlo por medio del
aparato FACS se les asigna una carga eléctrica a las asociaciones
que poseen una determinada propiedad previamente seleccionada
(tamaño, intensidad de señal). Por medio de la carga eléctrica de la
asociación tiene lugar entonces seguidamente una separación
(clasificación). Se pueden utilizar otros métodos de separación,
conocidos por el especialista, según la naturaleza química o física
de las asociaciones moleculares. Después de la separación puede
tener lugar otra caracterización de las asociaciones clasificadas,
por ejemplo por medio de procedimientos ópticos como son la
medición de la intensidad de la fluorescencia, la espectroscopía de
fluorescencia, la difusión de la luz, la espectroscopía de
absorción, y/o según las propiedades dicroicas circulares o
dicroicas lineales o la distribución de la luz difusa de las
asociaciones moleculares. Puesto que la caracterización por medio
de FACS tiene lugar en circulación, la separación de las
asociaciones moleculares se puede llevar a cabo inmediatamente a
continuación de la caracterización por FACS.
En la caracterización por medio de FACS se puede
registrar simultáneamente más de un colorante. Por este medo se
pueden diferenciar, utilizando diferentes colorantes fluorescentes
para la marcación de diferentes subunidades de las asociaciones
moleculares, varias subunidades diferentes de una asociación
molecular.
Por medio de la caracterización, por un lado, se
pueden encontrar conforme a la invención informaciones acerca de la
composición misma de las asociaciones y agregados (por ejemplo
mediante la marcación de diferentes subunidades de una asociación o
agregado con diferentes colorantes fluorescentes). Conforme a la
invención, utilizando diferentes colorantes fluorescentes para
diferentes subunidades se pueden diferenciar entre sí varias
subunidades diferentes de las asociaciones moleculares. En el
estado actual de la técnica de instrumentos es posible la
diferenciación de hasta cuatro subunidades diferentes de las
asociaciones moleculares. Por otro lado, también se pueden
encontrar informaciones sobre la distribución de la población de
mezclas de asociaciones o agregados, así pues, se puede llevar a
cabo una determinación de la distribución de tamaño y forma de los
agregados y asociaciones individuales en la suspensión o la
solución.
Una autoasociación de la sustancia marcada con
colorante fluorescente, sin inclusión de la sustancia no marcada
existente en la solución testigo (por ejemplo, líquido
cefalorraquídeo del paciente), se puede distinguir por el
procedimiento descrito del caso en el que, tal como se desea, la
sustancia no marcada se incluye en las asociaciones en la solución
testigo. Esto se lleva a cabo por medio de la determinación
comparativa de la masa molecular y de la forma de los agregados
(por medio de las partes de luz difusa de la señal del FACS), así
como, en relación con ello, por la medición de la intensidad de la
fluorescencia de los agregados. A partir de la comparación de los
conjuntos de datos multiparamétricos con estándares de referencia
correspondientemente elegidos se puede diferenciar la
autoagregación de la sustancia marcada fluorescentemente, así pues
un artefacto de medida, de una medición correcta, determinando en
cada caso la porción de sustancia no marcada con colorante
fluorescente en el agregado medido. En conjunto, el procedimiento
desarrollado en la presente descripción no muestra ninguna
influencia sobre los resultados de la autoagregación de la sonda,
puesto que es posible diferenciar los autoagregados de este tipo,
con ayuda de las propiedades de difusión de la luz y de la
intensidad de la fluorescencia, de las asociaciones heterogéneas.
La tolerancia de una autoagregación de la sonda puede ser
beneficiosa para el presente procedimiento ya que en este caso se
puede conseguir una sensibilidad óptima. Por eso en la presente
invención no se da una limitación de tiempo. La detección o la
caracterización de las asociaciones se puede llevar a cabo en una
forma de realización de esta invención con éxito, incluso
ventajosamente, en un instante y en condiciones de autoagregación
de la sonda.
Conforme a la invención se diferencian dos
formas de asociaciones moleculares. Por un lado se consideran
condensaciones que conducen a la formación de estructuras
geométricamente regulares con una población en cada caso ampliamente
homogénea. Las condensaciones de este tipo se denominan en esta
invención asociaciones moleculares "regulares" o asociaciones
moleculares con estructura definida espacial y/o
estoquiométricamente; se consiguen por medio de procesos
específicos de asociación. Ejemplos de asociaciones moleculares de
este tipo son las cápsulas de virus o de fagos (cf. más abajo), que
ocasionalmente están formadas por sólo un tipo de subunidad y con
frecuencia poseen una simetría icosaédrica, o asociaciones
macromoleculares compuestas por subunidades heterogéneas, tales
como ribosomas, complejos chaperón o proteasomas. Por otro lado,
conforme a la invención se incluyen asociaciones moleculares que
pueden presentar una distribución estadística en cuanto a tamaño y
composición y que no están constituidas por condensaciones
regulares o, en todo caso, sólo en parte. Estas asociaciones
moleculares se denominan conforme a la invención "agregados" o
asociaciones moleculares que son heterogéneas en relación con su
estructura y/o condensación. Los agregados de este tipo aparecen,
por ejemplo, en la fabricación recombinante de proteínas en forma
de inclusion bodies, o son señales patológicas
características de enfermedades en forma de placas amiloidogénicas,
inclusion bodies u otras estructuras morfológicas. En la
mayoría de los casos son variables en cuanto a tamaño y
composición. Como término genérico general para las dos formas de
condensación se elige en esta invención en la mayoría de los casos
el término "asociaciones moleculares", no restringidas en
cuanto a su regularidad.
Conforme a la invención, las asociaciones que
han de ser caracterizadas abarcan un margen de tamaños de 1 a 1000
nm, que preferiblemente es un margen de tamaños de 10 a 300 nm, de
manera igualmente preferida de 10 a 100 nm, y más preferiblemente
de 1 a 100 nm.
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El procedimiento utilizado en la presente
invención permite, por ejemplo, caracterizar asociaciones
moleculares regulares. Las asociaciones de este tipo se encuentran,
por ejemplo, en estructuras capsulares de virus, que en muchos
casos tienen una forma icosaédrica. Otros virus o fagos presentan
una estructura no icosaédrica, son por ejemplo filamentosos,
helicoidales, o tienen otras formas estructurales morfológicas. Las
cápsulas de virus y fagos poseen por regla general una composición
definida, con subunidades orientadas unas con respecto a otras de
manera precisa, y representan en consecuencia buenos sistemas modelo
de asociaciones macromoleculares de composición y/o estructura
regulares. Una caracterización del tamaño y de la composición
molecular para cada cápsula viral individual puede suponer una
importante ayuda analítica en la investigación de estas cápsulas
virales, así como también en otras asociaciones moleculares (como
proteasomas celulares, complejos chaperón o ribosomas). Como
ejemplos de virus y fagos de este tipo -clasificados a continuación
según su morfología primaria- se pueden mencionar:
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\newpage
Un ejemplo de estructuras capsulares virales de
ese tipo se muestra a continuación con ayuda de la pseudocápside
del virus del polioma (cápsulas proteicas formadas por subunidades
VP1 del virus del polioma). Entre los ejemplos documentados en la
tabla precedente se puede destacar la partícula SSV1 (fusellovirus),
que infecta la arqueobacteria Sulfolobus shibatae. Este
representante de los fagos es, a causa de su especificidad de
huésped, hipertermófilo, por consiguiente estable incluso a altas
temperaturas, y por eso puede ser utilizado ventajosamente para gran
número de aplicaciones en el campo de la biotecnología y de la
medicina. Está en condiciones de formar una capsula proteica
estable. Se encuentran representantes similares, por ejemplo,
también en los lipothrixvirus. Todavía no se encuentran
clasificados más ampliamente los representantes termófilos e
hipertermófilos de los bacilovirus y de los guttavirus que se
pueden utilizar en procesos en los que resulta relevante la
estabilidad de una cápsula proteica (formada a partir de las
proteínas de los fagos).
Las marcaciones fluorescentes tienen lugar con
frecuencia con el acoplamiento de colorantes a grupos tiol en
proteínas (cisteína) y otras sustancias moleculares. Para ello se
utilizan con frecuencia derivados reactivos de maleimida o de
iodoacetamida de sustancias fluorescentes. Para el acoplamiento a
grupos amino se utilizan, por ejemplo, el succinimidil éster,
haluros de sulfonilo, isotiocianatos, y aldehídos como derivados de
marcadores fluorescentes. Existen otros agentes para el
acoplamiento específico a grupos OH (en proteínas y péptidos, por
ejemplo en la serina, la treonina o la tirosina), a aldehídos o
cetonas (por ejemplo para la marcación de polisacáridos), y grupos
carboxilo activados. Pueden darse aplicaciones específicas también
en el acoplamiento de moléculas efectoras tales como la biotina
marcada fluorescentemente (biotinilización).
También puede tener lugar una marcación
fluorescente específica de sustancias moleculares por medio de un
acoplamiento no covalente. Para ello se utilizan especialmente
anticuerpos marcados fluorescentemente, los cuales pueden ligarse a
los antígenos predeterminados de forma duradera y específica a causa
de sus propiedades de enlace. Para los receptores o enzimas es
especialmente apropiada la utilización de ligandos, cofactores,
sustratos o análogos de sustratos, marcados fluorescentemente. Otra
aplicación consiste en la utilización de sustancias intercalantes,
como por ejemplo la fenantridina (bromuro de etidio), o acridinas y
cianinas. Se puede detectar la formación de estructuras
amiloidogénicas por medio de la utilización del colorante rojo
Congo y la subsiguiente medición de la fluorescencia.
Como aplicación importante para la invención
descrita puede servir el diagnóstico de enfermedades
amiloidogénicas. En el proceso se mezcla material biológico del
paciente, por ejemplo tejidos disgregados, líquido cefalorraquídeo,
sangre, orina u otro fluido corporal, con una/o o varias/os
proteínas o péptidos diferentes marcadas/os fluorescentemente
(marcadores) y se incuba durante un tiempo determinado. En ese
tiempo, las sustancias moleculares potencialmente existentes en el
material del paciente, bien en forma de péptidos monómeros o de
proteínas solubles, bien ya en forma de gérmenes de cristalización
(primeras asociaciones) para el proceso de asociación, se agregan o
asocian específicamente con el marcador utilizado. Por medio de la
apropiada elección de los parámetros del proceso, como temperatura,
tiempo de incubación, aditivos disolventes, pH, etc., puede tener
lugar, según estrategias de optimización y de diferenciación que
lleva a cabo el especialista conforme a estrategias conocidas, una
diferenciación de formas monómeras, o también de asociaciones ya
formadas, o de gérmenes de cristalización para la formación de las
asociaciones. Aquí pueden también contribuir factores celulares o
catalizadores, asimismo presentes en la solución testigo del
paciente, a la formación específica sin que resulte afectada por
ellos la exactitud de la detección.
En una operación se puede llevar a cabo con el
procedimiento descrito una determinación cuantitativa para
diferentes sustancias moleculares; al hacerlo, la frecuencia
relativa de la aparición de asociaciones (en las que se pueden
diferenciar entre sí diferentes tipos por medio de una marcación
fluorescente diferente) en el curso del proceso de recuento en el
aparato FACS se valora como proporcional a la cantidad de
subestructuras que existe en la solución testigo (por ejemplo
líquido cefalorraquídeo del paciente). Mediante la utilización de
diferentes colorantes fluorescentes para diferentes marcadores se
pueden detectar de forma paralela, por ejemplo, la proteína Tau, el
péptido \beta del Alzheimer (1-42), y el péptido
\beta del Alzheimer (1-40). Al mismo tiempo se
puede detectar, utilizando el rojo Congo, el carácter amiloidogénico
de los agregados que se originan. Los aparatos FACS modernos
proporcionan apoyo para la detección paralela de cuatro
fluorescencias, y permiten de esa manera una precisión de la
información diagnóstica. Para el procedimiento se necesita un
material de muestra extraordinariamente escaso, puesto que se llevan
a cabo mediciones altamente sensibles de partículas individuales,
lo que supone una ventaja para el paciente. El gran número de
parámetros de medida anteriormente descritos puede permitir una
categorización de las propiedades de la muestra del paciente y, de
esa manera, desde el punto de vista diagnóstico una buena
determinación cuantitativa del cuadro de la enfermedad o del curso
y el progreso de la enfermedad según la correspondiente
estandarización.
Además de las aplicaciones diagnósticas en el
ámbito de las enfermedades amiloidogénicas, se puede concebir
también el screening (filtrado) con el procedimiento descrito de
sustancias terapéuticas potenciales. Sirve aquí de magnitud a medir
la formación de agregados amiloidogénicos en presencia de la
sustancia terapéutica; hay que valorar que las sustancias que
obstaculizan la formación de los agregados amiloidogénicos también
pueden ser valiosas desde el punto de vista terapéutico. Asimismo
pueden ser de utilidad terapéutica sustancias que pueden volver a
disolver los agregados amiloidogénicos mencionados.
Además de la utilización de marcadores que (con
excepción de la marcación fluorescente) son idénticos a la
sustancia que se ha de detectar, puede también resultar ventajosa la
utilización de marcadores que son sólo en parte idénticos a la
sustancia que se ha de detectar. Aquí se pueden utilizar en especial
proteínas, fragmentos de proteína o péptidos que sean en gran
medida homólogos a la sustancia diana pero que presenten en una o
en varias posiciones sustituciones en la secuencia de aminoácidos.
Las secuencias homólogas de este tipo pueden resultar ventajosas
para el procedimiento en la medida en que puedan presentar
propiedades de asociación y de adición distintas de las de las
secuencias naturales, y por ello a menudo más favorables. Por medio
de la apropiada utilización del procedimiento descrito en la
presente invención puede tener lugar de forma sencilla la
determinación de las secuencias homólogas de ese tipo. Además de
eso, con el procedimiento se puede averiguar de forma sencilla la
cinética de la formación de los agregados y asociaciones, y por este
medio se puede ampliar una vez más la información diagnóstica y
analítica del correspondiente procedimiento. Así, en particular en
el diagnóstico de enfermedades amiloidogénicas se pueden diferenciar
diferentes fases cinéticas. Una rápida condensación de otras
moléculas para formar agregados o asociaciones más grandes sólo
tiene lugar con frecuencia tras la formación inicial (y lenta) de
un germen de cristalización. El añadido de un germen artificial de
agregación puede acelerar en consecuencia los procesos de agregación
o asociación que han de ser observados.
Además de las posibilidades ópticas y
espectrocópicas existentes de manera estándar en los aparatos FACS,
las asociaciones moleculares pueden ser también separadas entre sí
conforme a otras propiedades, tras una mínima ampliación técnica de
los aparatos, según procedimientos de separación conocidos,
pudiéndose caracterizar las asociaciones moleculares separadas en
virtud de sus propiedades ópticas u otras, como por ejemplo
propiedades de absorción, propiedades dicroicas circulares o
dicroicas lineales, rendimiento cuántico, duración de estados de
excitación, transferencia energética, diferencias de intensidad o
radiactividad.
El procedimiento descrito en la presente
invención permite la caracterización de asociaciones moleculares
tal como se definen en la reivindicación 1 con cualesquiera
proporciones de mezcla con ayuda de marcaciones fluorescentes. La
caracterización tiene lugar en este caso por medio del análisis
estadístico de conjuntos de asociaciones o agregados, pudiendo ser
medida como particularidad cada asociación o agregado (partícula)
individual. Como otra particularidad, las partículas moleculares
pueden ser también clasificadas y contadas, paralelamente a la
caracterización, en relación con propiedades esenciales. Así, a
continuación del análisis por FACS es posible la investigación de
la especie agrupada con ayuda de otros métodos analíticos, como por
ejemplo la microscopía electrónica, la microscopía de fluorescencia,
la espectroscopía de correlación de fluorescencia, etc.
Las asociaciones moleculares caracterizadas y
clasificadas por medio del FACS, que presentan determinadas
propiedades, pueden encontrar posteriormente una aplicación en
experimentos subsiguientes (por ejemplo en cultivos celulares,
modelos animales, u otras investigaciones que requieran un material
de partida homogéneo y de gran valor cualitativo). Por este medio
es posible utilizar partículas moleculares de una población
homogénea exactamente definidas y caracterizadas con respecto a
propiedades deseadas. Esto puede resultar en muchos casos esencial
para el experimento.
Una ventaja esencial del procedimiento descrito
es la estandarización y la segunda ampliación del procedimiento del
FACS. Esta técnica se encuentra establecida en todos los centros de
diagnóstico; los procedimientos médicos de prueba que se basan en
ella presentan por ello una considerable ventaja infraestructural.
El FACS se hace funcionar por lo general en circulación, esto es,
la muestra que ha de ser medida circula ininterrumpidamente a
través del aparato. Un sistema de circulación de este tipo es
especialmente apropiado para una automatización de cara también a
un procedimiento de elevado rendimiento
(high-throughput-screening). Después
de cada paso de la muestra se puede lavar el aparato
automáticamente en poco tiempo, por eso no son necesarias tareas
manuales ni la sustitución de material de un uso. Mediante la
utilización de un aparato automático de recarga de muestras se
puede conseguir, por lo tanto, un gran rendimiento de muestras en un
puesto de trabajo sin unos costes sustanciales en lo que respecta a
personal de servicio.
El procedimiento permite determinar, para cada
una de las partículas, la composición cuantitativa a partir de
diferentes subestructuras, siempre que estas diferentes
subestructuras puedan ser marcadas específicamente con diferentes
colorantes fluorescentes. Por este medio se puede llevar a cabo una
cuantificación muy exacta, la cual proporciona, además de los
valores medios de la composición, también informaciones precisas
sobre la distribución estadística de la composición en el interior
de la población. Además de eso, no es necesario marcar las
partículas de manera directa; en la medida en que se encuentren
disponibles, por ejemplo, ligandos o anticuerpos específicos para
las subestructuras que deben ser determinadas, puede tener lugar una
marcación indirecta con colorantes fluorescentes.
Finalmente, se puede analizar la composición
molecular de las partículas, por ejemplo en relación con la
eficiencia de empaquetado de cápsulas proteicas similares a virus
con vistas a sustancias terapéuticamente activas como el ADN, el
ARN, péptidos o proteínas. Las aplicaciones de este tipo son
importantes, por ejemplo, en el campo de la fabricación de sistemas
de vectores para terapia genética. Con ello se proporciona una
herramienta analítica precisa para caracterizar esos sistemas y a
continuación optimizarlos.
Se describen formas de realización de esta
invención en los siguientes ejemplos, los cuales no han de limitar,
sin embargo, el alcance de la invención. En los ejemplos y en la
descripción se hace referencia a las siguientes figuras.
La figura 1 muestra esquemáticamente un ejemplo
de caracterización de una muestra por medio de FACS. En este
ejemplo se condensan subunidades marcadas fluorescentemente con
subunidades y/o asociaciones de una determinada especie no
marcadas, para formar asociaciones moleculares marcadas. Después de
una excitación por medio de láser se miden las señales de tamaño y
de fluorescencia, después de lo cual son posibles una separación y
clasificación determinadas, previamente definidas, conforme al
principio funcional de los aparatos FACS (en este caso con respecto
al tamaño de los agregados o asociaciones).
La figura 2 muestra tomas efectuadas con
microscopio electrónico y análisis por filtración en gel de cápsides
similares a virus caracterizadas con ayuda de la tecnología FACS
(A), capsómeros no ensamblados, derivados del virus del polioma VP1
(B), partículas de 45 nm de cápsulas de virus del polioma similares
a virus tras diálisis con pH 7,2 (C), partículas de 30 nm tras
diálisis con pH 8,5 (D), análisis por filtración en gel sobre la
distribución de tamaños de las cápsulas de virus del polioma
similares a virus.
La figura 3 muestra los análisis por FACS
pertenecientes a la figura 2 de partículas de virus del polioma
similares a virus marcadas con Texas Red. A, análisis de las
partículas formadas por 24 capsómeros. B, análisis de la
condensación de cápsides de 72 pentámeros. C, variante
PyVP1-\DeltaCT63 con ensamblaje defectuoso. D,
capsómeros en condiciones de no ensamblaje (sin partículas de virus
del polioma similares a virus). E, dot-plot de los
capsómeros en condiciones de no ensamblaje. La difusión de la luz
hacia adelante es muy pequeña a causa del tamaño extremadamente
pequeño de las partículas (5 nm). F, representación histográmica
esquemática de las partículas similares a virus o pentámeros libres
fluorescentes de diferente tamaño.
La figura 4 muestra los resultados de un
análisis por FACS del péptido \beta del Alzheimer
(1-42) bajo diferentes condiciones de agregación.
A, agregados marcados fluorescentemente con 0,1% de contenido de SDS
en la solución. B, con un contenido de SDS de 2% en el disolvente,
en condiciones por lo demás idénticas, no aparecen los agregados;
C, una mezcla de péptidos fluorescentemente marcados y no marcados
forma en las condiciones de (A) agregados con una leve
fluorescencia; D, experimento de control con la utilización de
colorante fluorescente sin péptido (control negativo); E,
experimento de control en idénticas circunstancias, pero con la
utilización de péptido \beta del Alzheimer
(1-42), que anteriormente no había sido marcado
fluorescentemente (control negativo).
La figura 5 muestra un análisis por FACS de
variantes de PyVP1 marcadas de manera diferente. Se forman cápsides
de PyVP1-CallS-T249C, las cuales
están formadas por una especie marcada con fluoresceína y una
especie marcada con Texas Red. La población de cápsides muestra una
clara fluorescencia por fluoresceína (M1 en A), y también una
fluorescencia por Texas Red (M2 en B). De la representación gráfica
de la fluorescencia por fluoresceína (FL1) comparada con
fluorescencia por Texas Red se desprende que los dos colorantes se
encuentran localizados en una partícula (cuadrante superior derecho
en C). No se detectan las partículas que contienen sólo un
colorante.
Ejemplo
1
La proteína capsular viral utilizada en el
ejemplo dado es la proteína VP1 pentámera del virus del polioma en
solución, la cual se puede ensamblar de forma sencilla in
vitro conforme al estado actual de la técnica para formar una
cápsula. Para ello se fabrica en una primera etapa una variante del
virus del polioma que no presenta en su secuencia ninguna cisteína;
las seis cisteínas de la proteína wild-type
(cys-12, cys-16,
cys-20, cys-115,
cys-274 y cys-283) han sido
sustituidas por serinas con ayuda de procedimientos de
mutagenización conforme al estado actual de la técnica. Esto
presenta la ventaja, entre otras, de que las condiciones redox de
la solución no tienen ninguna influencia sobre el estado de la
proteína; como consecuencia se puede manipular de forma más
sencilla en muchas aplicaciones.
La mutagénesis se lleva a cabo con ayuda del
procedimiento QuickChange (empresa Stratagene) conforme a las
indicaciones del fabricante. Para la mutagénesis se utilizan los
siguientes oligonucleótidos: C12S, C16S, C20S:
5'-GTC TCT AAA AGC GAG ACA AAA AGC ACA AAG GCT AGC
CCA AGA CCC-3', y 5'-GGG TCT TGG GCT
AGC CTT TGT GCT TTT TGT CTC GCT TTT AGA GAC-3',
C115S: 5'-GAG GAC CTC ACG TCT GAC ACC CTA
C-3' y 5'-GTA GGG TGT CAG ACG TGA
GGT CCT C-3'; C274S, C283S: 5'-GGG
CCC CTC AGC AAA GGA GAA GGT CTA TAC CTC TCG AGC GTA GAT ATA
ATG-3' Y 5'-CAT TAT ATC TAC GCT CGA
GAG GTA TAG ACC TTC TCC TTT GCT GAG GGG CCC-3'.
Además se puede fabricar otra proteína que en el
extremo C-terminal se encuentra acortada en 63
aminoácidos. El extremo C-terminal es esencial para
el ensamblaje, la variante descrita de la proteína capsular es, por
consiguiente, defectuosa para el ensamblaje. La fabricación de la
variante acortada PyVP1-\DeltaCT63 tiene lugar
con ayuda del oligonucleótido 5'-ATT ACC CGG GAT AGG
GAT TTT TGA CCC ATC-3'.
Para la marcación específica de los capsómeros
se puede insertar una cisteína singular en una región especial de
la proteína. Ésta es, por ejemplo, la posición 249, en la que se
sustituye una treonina por una cisteína. La mutagénesis tiene lugar
con ayuda del procedimiento QuickChange (empresa Stratagene) según
las indicaciones del fabricante, utilizando los nucleótidos
5'-GGA CGG GTG GGG TGC ACG TGC GTG CAG
TG-3' y 5'-CAC TGG AGG CAC GTG CAC
CCC ACC CGT CC-3'.
El ensamblaje de la proteína
PyVP1-Calls-T249C, fabricada
conforme a procedimientos estándar, tiene lugar primeramente en
analogía con las condiciones ya anteriormente descritas según el
estado actual de la técnica (cf. Salunke, Gaspar & Garcea,
Biophys. año 56, págs. 887-900, 1989). Aquí se
utilizan dos variantes de ensamblaje. Las cápsides similares a
virus con diámetro de 45 nm (formadas por 72 capsómeros) se obtienen
tras diálisis de la proteína contra 10 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,5 mM
CaCl_{2}, glicerina al 5%, a un pH 7,2, a temperatura ambiente
durante 72 horas. Por el contrario se originan partículas mucho más
pequeñas (diámetro 30 nm), formadas por 24 capsómeros, por medio de
la diálisis contra 10 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,5 mM CaCl_{2},
glicerina al 5%, a un pH 8,5, a temperatura ambiente durante 72
horas.
La proteína
PyVP1-CallS-T249C se expresa en el
procedimiento como pentámero soluble, y es nativa, es decir,
competente para el ensamblaje. En la figura 2 se encuentra
representado un experimento de filtración en gel que muestra que la
proteína PyVP1-CallS-T249C se puede
ensamblar en circunstancias apropiadas para formar estructuras
similares a cápsides de diferentes tamaños. La figura 2 describe
asimismo con ayuda de tomas de microscopio electrónico las cápsides
que se originan.
El capsómero purificado puede ser marcado antes
del ensamblaje con los colorantes
fluoresceína-maleimida o Texas
Red-maleimida (empresa Molecular Probes) según las
indicaciones del fabricante. Al hacerlo tiene lugar un acoplamiento
específico en la posición de la cisteína singular 249.
La figura 3 representa el resultado de un
análisis por FACS de las partículas ensambladas. Las partículas se
pueden detectar sorprendentemente bien en el FACS, y también se
pueden diferenciar unas de otras, de manera que se puede llevar a
cabo un análisis del tamaño y de la distribución de la composición
para cada partícula individual.
Ejemplo
2
El péptido \beta del Alzheimer
(1-42) lo vende comercialmente en forma sintética la
empresa Sigma. El péptido se disuelve en tampón que contiene 10 mM
HEPES, 50 mM NaCl y 2% de SDS, con un pH 7,2. Se puede marcar
fluorescentemente el péptido a través de grupos amino con ayuda del
colorante Rodamina-X-succinimidil
éster (empresa Molecular Probes) según las indicaciones del
fabricante. A continuación se puede separar en gran medida del
péptido el colorante sobrante por medio de una columna de
filtración en gel. El péptido marcado de esta manera (de la
fracción 3 de la filtración en gel) se utiliza en tres experimentos
paralelos. Por una parte, es inducido a la agregación por medio de
su dilución (1:20) con tampón libre de SDS. Los agregados que se
originan pueden ser detectados con ayuda del procedimiento de FACS
(fig. 4A). Si para el control (experimento 2) se diluye con tampón
que contiene SDS (SDS al 2%, w/v), no se originan agregados, y no se
producen en esa posición las señales de FACS específicas (fig.
4B).
Si en el tercer experimento se añade tampón
libre de SDS que contiene adicionalmente péptido \beta del
Alzheimer no marcado, como es de esperar aparecen de nuevo
agregados, que sin embargo muestran una señal fluorescente más
débil: evidentemente a los agregados originados (que según las
curvas de difusión muestran una distribución de tamaños similar) se
les ha incorporado también péptido no marcado (fig. 4C).
Para el control se midió también (fig. 4D) el
colorante fluorescente disuelto (fracción 4 de la filtración en
gel), que no ofrece ninguna señal de FACS específica en la posición
de los agregados del péptido \beta del Alzheimer
(1-42). El péptido no marcado utilizado como control
(fig. 4E) tampoco muestra ninguna señal de FACS específica.
El ejemplo demuestra que con ayuda de la
tecnología del FACS se pueden caracterizar específicamente el
tamaño, el tipo y la composición de agregados formados, por
ejemplo, por el péptido \beta del Alzheimer. Se muestra al mismo
tiempo que puede también incorporarse a los agregados
amiloidogénicos péptido no marcado de la misma naturaleza química,
tal como puede aparecer, por ejemplo, en el líquido cefalorraquídeo
el paciente. Con este procedimiento se ha creado la posibilidad,
por lo tanto, de caracterizar de manera altamente sensible y
específica agregados y asociaciones moleculares que se corresponden
con depósitos patológicos.
Ejemplo
3
La caracterización de cápsulas proteicas mixtas
(cápsides), esto es, de partículas que están construidas a modo de
mosaico con varias sustancias moleculares diferentes, es una
posibilidad de detección especialmente elegante de la presente
invención. Para la detección de cápsides mixtas, construidas con
diferentes proteínas capsulares, se acopla a cisteína 249 singular
la variante PyVP1-CallS-T249C de la
proteína capsular (ver ejemplo 1), en una preparación con el
colorante fluorescente fluoesceína-maleimida, y en
una segunda preparación con Texas Red-maleimida.
Las diferentes cápsides marcadas se mezclan entre sí en una
proporción equimolar y se ensamblan. El análisis de la formación de
cápsides se realiza por medio de FACS. Esto permite la detección de
diferentes fluorescencias dentro de una partícula. La figura 5
muestra el análisis de cápsides ensambladas de manera equimolar. Se
muestra en cada caso una población de cápsides marcadas
fluorescentemente y de capsómeros libres no ensamblados (figuras
5A, 5B). Cuando se representa gráficamente la fluorescencia por
fluoresceína comparada con la fluorescencia por Texas Red (figura
5C) se observa una población de partículas que tienen
simultáneamente las dos fluorescencias. No existen, sin embargo,
partículas que se encuentren marcadas solamente con un
colorante.
Con este ejemplo se muestra que con el
procedimiento descrito se pueden caracterizar proteínas capsulares
VP1 del virus del polioma VP1 ensambladas a modo de mosaico, y que
se puede comprobar que cada partícula individual que se origina en
el curso del ensamblaje ha incorporado los dos tipos diferentes de
capsómeros marcados fluorescentemente. Al contrario que todos los
otros procedimientos espectroscópicos que miden una participación de
todas las fluorescencias que se encuentran en el rayo de luz, el
procedimiento permite determinar la distribución de la composición
de asociaciones y agregados moleculares sobre la base de muchas
partículas individuales. De esta manera, además de la
caracterización de partículas individuales también se puede
determinar la distribución estadística de las subestructuras
incorporadas a cada una de las partículas, siempre que éstas hayan
sido marcadas con diferentes colorantes fluorescentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo para conveniencia del lector. No forma parte
del documento de Patente Europea. Aunque se haya tenido un gran
cuidado en recoger las referencias, no puede excluirse la presencia
de errores u omisiones y por ello la EPO declina cualquier
responsabilidad a este respecto.
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Variante de VP1 del virus del polioma con todas las
cisteínas naturales sustituidas por serina, e inserción de una
nueva cisteína en lugar de la Thr-249
(PyVP1-CallS-T249C)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)...(1152)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: variante de VP1 del virus del polioma con todas las
cisteínas naturales sustituidas por serina, e inserción de una
nueva cisteína en lugar de la Thr-249
(PyVP1-Calls-T249C)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 963
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: proteína VP1 del virus del polioma acortada en 63
aminoácidos en el extremo C-terminal, sustitución
de todas las cisteínas por serina y reemplazo de
Thr-249 por Cys (PyVP1-DCT63)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)...(963)
\newpage
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 321
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: proteína VP1 del virus del polioma acortada en 63
aminoácidos en el extremo C-terminal, sustitución
de todas las cisteínas por serina y reemplazo de
Thr-249 por Cys (PyVP1-DCT63)
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 42
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> PÉPTIDOS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción: Péptido beta del
Alzheimer (1-42)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (11)
1. Procedimiento para la caracterización de
asociaciones moleculares formadas por subunidades, en el que:
- se marcan subunidades no asociadas con al
menos un colorante fluorescente,
- las subunidades marcadas se ponen en contacto
entre sí o con subunidades no marcadas o con asociaciones
moleculares formadas por subunidades, con el fin de obtener una
adición y/o enlace de las subunidades marcadas, entre sí o a
subunidades no marcadas o a las asociaciones moleculares formadas
por subunidades, para formar asociaciones moleculares marcadas,
y
- se caracterizan por medio de un FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorter) las
asociaciones moleculares marcadas, hallándose comprendidas las
asociaciones moleculares que se han de caracterizar en un
margen de tamaños de entre 1 y 1000 nm, y
- las asociaciones moleculares son cápsides de
virus o de fagos, proteasomas, complejos chaperón o ribosomas, o
están compuestas por subunidades modificadas de ellos, o son
asociaciones de péptidos o de proteínas formadas por las mismas
subunidades, ADN monocatenario o bicatenario, ARN monocatenario o
bicatenario, asociaciones de lípidos, asociaciones de fosfolípidos,
asociaciones de hidratos de carbono, asociaciones de polisacáridos,
asociaciones que contienen compuestos de hidrocarburos de carácter
hidrófilo o hidrófobo, asociaciones de compuestos isoprenoides, o
mezclas de ellos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que las subunidades pueden ser
monómeros, dímeros y/o oligómeros.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2, caracterizado por el hecho de que las subunidades de las
asociaciones moleculares pueden ser iguales o diferentes unas de
otras.
4. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que las asociaciones moleculares se separan por procedimientos
conocidos.
5. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que las asociaciones moleculares son cápsides de virus o de fagos
de los grupos de los adenovirus, arenavirus, arterivirus,
astrovirus, bacilovirus, baculovirus, badnavirus, barnavirus,
birnavirus, bromovirus, bunyavirus, calicivirus, capillovirus,
carlavirus, caulimovirus, circovirus, closterovirus, comovirus,
coronavirus, corticovirus, cistovirus, dianthovirus, enamovirus,
filovirus, flavivirus, furovirus, fusellovirus, geminivirus,
guttavirus, hepadnavirus, herpesvirus, hordeivirus, hipovirus,
ideovirus, inovirus, iridovirus, levivirus, lipothrixvirus,
luteovirus, machlomovirus, marafivirus, microvirus, miovirus,
necrovirus, nodavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus,
partitivirus, parvovirus, phycodnavirus, picornavirus, plasmavirus,
podovirus, polidnavirus, potexvirus, potyvirus, poxvirus, reovirus,
retrovirus, rabdovirus, rhizidiovirus, sequivirus, sifovirus,
sobemovirus, tectivirus, tenuivirus, tetravirus, tobamovirus,
tobravirus, togavirus, tombusvirus, totivirus, trichovirus,
tymovirus, umbravirus, o son derivados de ellos o derivados de una o
varias subunidades modificadas de los mencionados virus o
fagos.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que las
subunidades de las asociaciones moleculares son péptidos \beta
del Alzheimer, proteínas Tau, proteínas del prión, huntingtina,
sinucleína, SCA1/ataxina-1, cistatina C,
inmunoglobulinas, lipoproteínas, transtiretina, apolipoproteína
A-1, amiloide-A sérica, polipéptido
amiloide de los islotes, insulina, calcitonina,
\beta-2 microglobulina, lisozima, fibrinógeno,
gelsolina, factor natriurético auricular, producto de gen HoxD13,
factor de transcripción CBFA 1, proteína de enlace poli(A)
II, o formas modificadas o fragmentos ellos.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que se caracterizan
asociaciones moleculares que se originan en las enfermedades
neurodegenerativas enfermedad de Alzheimer, encefalopatía
espongiforme transmisible, Corea Huntington, enfermedad de
Parkinson, ataxia espinocerebelar de tipo I, y angiopatía amiloide
cerebral hereditaria, o en las enfermedades amiloidosis asistémica
primaria o reactiva, amiloidosis sistémica secundaria,
polineuropatía amiloide familiar I y III, diabetes mellitus tipo II,
amiloidosis localizada en la zona de inyección y asociada a la
diálisis, carcinoma medular de la glándula tiroides, amiloidosis
\beta-2 microglobulina, amiloidosis no
neuropática, amiloidosis renal hereditaria, amiloidosis sistémica
hereditaria finlandesa, amiloidosis auricular, sindactilia de tipo
II, enfermedad de Machado-Joseph, displasia
cleidocraneal y distrofia muscular oculofaríngea.
8. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que las asociaciones que han de ser caracterizadas se hallan
comprendidas en un margen de tamaños de entre 10 y 300 nm,
preferiblemente de entre 10 y 100 nm, y más preferiblemente de entre
1 y 100 nm.
9. Utilización del procedimiento del FACS para
la caracterización de asociaciones moleculares formadas por
subunidades con respecto a tamaño y composición, hallándose marcada
como mínimo una de las subunidades de una asociación con como
mínimo un colorante fluorescente, y habiendo sido obtenidas las
asociaciones moleculares por medio de un procedimiento según una de
las reivindicaciones 1 a 8.
10. Utilización según la reivindicación 9 para
la caracterización de asociaciones moleculares formadas por
subunidades que van acompañadas por las enfermedades
neurodegenerativas enfermedad de Alzheimer, encefalopatía
espongiforme transmisible, Corea Huntington, enfermedad de
Parkinson, ataxia espinocerebelar de tipo I, y angiopatía amiloide
cerebral hereditaria, o por las enfermedades amiloidosis asistémica
primaria o reactiva, amiloidosis sistémica secundaria,
polineuropatía amiloide familiar I y III, diabetes mellitus tipo II,
amiloidosis localizada en la zona de inyección y asociada a la
diálisis, carcinoma medular de la glándula tiroides, amiloidosis
\beta-2 microglobulina, amiloidosis no
neuropática, amiloidosis renal hereditaria, amiloidosis sistémica
hereditaria finlandesa, amiloidosis auricular, sindactilia de tipo
II, enfermedad de Machado-Joseph, displasia
cleidocraneal y distrofia muscular oculofaríngea.
11. Utilización según la reivindicación 9,
caracterizada por el hecho de que las asociaciones que han de
ser caracterizadas se hallan comprendidas en un margen de tamaños
de entre 10 y 300 nm, preferiblemente de entre 10 y 100 nm, y más
preferiblemente de entre 1 y 100 nm.
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