ES2292564T3 - Diferenciacion de celulas de la medula osea en celulas neuronales y usos asociados. - Google Patents

Abstract

Un método para inducir la diferenciación de células estromales de la médula ósea en neuronas, comprendiendo dicho método transferir células estromales de la médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células estromales de la médula ósea aisladas en neuronas.

Description

Diferenciación de células de la médula ósea en células neuronales y usos asociados.

Antecedentes de la invención

Se han detectado células madre pluripotentes en múltiples tejidos en mamíferos adultos, que participan en el reemplazo normal y la reparación, que sufren la autorenovación (Hay, 1966, "Regeneration", Holt, Rinehart y Winston, New York; McKay, 1999, Nature Med. 5:261-262; Lemiscka, 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 872:274-288; Owens y Friedenstein, 1988, "Ciba Foundation Syp". 136, Chichester, U.K. págs. 42-60; Prockop, 1997, Science 276:71-74; Ferrari et al., 1998, Science 279:1528-1530; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9:641-650; Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857-4861; Kuznetsov et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97:561-570; Majumdar et al., 1998, J. Cell Physiol. 176:57-66; Pittenger et al., 1999, Science 284:143-147). Una subclase de células madre de la médula ósea es un prototipo, capaz de diferenciarse en linajes mesenquimales in vitro osteogénicos, condrogénicos, adipogénicos y otros (Owens y Friedenstein, 1988, "Ciba Foundation Symp. 136", Chichester, U.K. págs. 42-60; Prockop, 1997, Science 276; 71-74; Ferrari et al., 1998, Science 279:1528-1530; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9:641-650; Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857-4861; Kuznetsov et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97:561-570; Majumdar et al., 1998, J. Cell. Physiol. 176:57-66; Pittenger et al., 1999, Science 284:143-147). Estas células pluripotentes han sido denominadas células estromales de la médula ósea (CEM), y recientemente han sido usadas clínicamente para tratar la osteogenesis imperfecta (Horwitz et al., 1999, Nature Med. 5: 309-313).

El reciente descubrimiento de poblaciones de células madre en el sistema nervioso central (SNC) ha generado un intenso interés, ya que el cerebro ha sido considerado durante mucho tiempo como incapaz de la regeneración (Reynolds y Weiss, 1992, Science 255:1707-1710; Richards et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8591-8595; Morshead et al., 1994, Neuron 13:1071-1082). Las células madre neurales (SNC) son capaces de sufrir la ampliación y la diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro (Reynolds y Weiss, 1992, Science 255:1707-1710; Johansson et al., 1999, Cell 96:25-34; Gage et al., 1995, Annu. Rev. Neurosci. 18:159-192; Vescovi et al., 1993, Neuron 11:951-966). Las CMN re-trasplantadas en el cerebro de un roedor adulto sobreviven y se diferencian en neuronas y células de la glia, aumentando la posibilidad de su potencial terapéutico (Lundberg et al., 1997, Exp. Neurol. 145:342-360; Lundberg et al., 1996, Brain Res. 737:295-300; Renfranz et al., 1991, Cell 66:713-729; Flax et al., 1998, Nature Biotech. 16:1033-1039; Gage et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11879-11883; Svendsen et al., 1997, Exp. Neurol. 148:135-146). Sin embargo, la inaccesibilidad de las fuentes de CMN inmersas dentro del cerebro limitan drásticamente su utilidad clínica. Un informe reciente que demuestra que las CMN pueden generar células hematopoyéticas in vivo sugiere que las poblaciones de células madre pueden estar menos restringidas de lo que se piensa (Bjornson, 1999, Science 283:534-537).

En el documento WO99/56759, fueron inducidas células estromales de la médula ósea (CEM) a la diferenciación en fenotipos de neuronas in vitro e in vivo poniendo en contacto tales células con factores de crecimiento (tales como PDGF, GDNF, FGF2, NGF y BDNF) y ácido retinoico (ácido cis-9-retinoico, ácido todo-transretinoico o sus combinaciones).

Las pruebas de que las CEM inyectadas en los ventrículos laterales de ratones neonatales se pueden diferenciar en astrocitos y en células que contienen neurofilamentos dan soporte a este argumento (Kopen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 10711-10716).

Sin embargo, aunque la diferenciación de las CEM en astrocitos y células de la glia ha sido demostrada (documento WO 99/43286), hasta el momento, no ha habido ningún método para inducir la diferenciación de CEM en células neuronales. Así, a pesar de la necesidad crucial de obtener células neuronales para el tratamiento de enfermedades del SNC, trastornos, y condiciones, ningún método ha estado disponible para obtener grandes números de células neuronales sin encontrar las barreras técnicas y éticas implicadas en la obtención de CEM humanas o del tejido fetal. La presente invención supera esta necesidad.

Breve resumen de la invención

La presente invención incluye un método para inducir la diferenciación de células estromales de la médula ósea aisladas en neuronas. El método comprende transferir dichas células estromales de la médula ósea en un medio sin suero que contiene al menos un compuesto que induce la diferenciación neuronal. Éste induce la diferenciación de las células estromales de la médula ósea aisladas en neuronas.

En un aspecto, la célula estromal de la médula ósea aislada es una célula de rata. Preferiblemente, la célula estromal de la médula ósea aislada es una célula humana.

El compuesto que induce la diferenciación neuronal es un antioxidante. El antioxidante se selecciona a partir del grupo que consiste en \beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, ácido ascórbico, dimetilfumarato y n-acetilcisteína.

En otro aspecto, el antioxidante es el \beta-mercaptoetanol.

En otro aspecto, el antioxidante es el dimetilsulfóxido. En otro aspecto más el antioxidante es dimetilsulfóxido e hidroxianisol butilado.

La invención además incluye un método in vitro para producir células neuronales aisladas. El método comprende aislar células estromales de la médula ósea, transferir las células estromales de la médula ósea aisladas en un medio libre de células que contiene un antioxidante, en el que el compuesto induce a las células estromales de la médula ósea aisladas a diferenciarse en una células neuronales aisladas, produciéndose así células neuronales aisladas.

Además, la invención incluye el uso de una población aislada de células que comprende células neuronales obtenidas a partir de una muestra de médula ósea de un donante humano, después del aislamiento de células estromales a partir de dicha muestra de médula ósea y la inducción de dichas células estromales para que se diferencien en células neuronales aisladas, contrayendo dichas células estromales aisladas con al menos un antioxidante, para preparar un medicamento para efectuar el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central de un paciente humano. La presencia de las células neuronales aisladas en el sistema nervioso central del paciente humano efectúa el tratamiento de la enfermedad, trastorno o condición.

En un aspecto, la enfermedad, el trastorno o la condición del sistema nervioso central se seleccionan a partir del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, un tumor, un traumatismo, demencia senil, la enfermedad de Tay-Sach, la enfermedad de Sandhoffs, el síndrome de Hurler, la enfermedad de Krabbe, daño traumático del sistema nervioso central inducido en el nacimiento, epilepsia, esclerosis múltiple, traumatismo, tumor, apoplejía y daño de la médula espinal.

En otro aspecto, las células neuronales aisladas, habían sido transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica en el que, cuando la proteína se expresa en células, la proteína sirve para efectuar el tratamiento de la enfermedad, trastorno o condición.

En un aspecto alternativo, las células neuronales aisladas habían sido transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una citoquina, una quimiocina, una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo o una proteína tóxica del glioma.

La presente invención además incluye el uso de una población de células que comprende células neuronales obtenidas a partir de células estromales de la médula ósea de un paciente humano, después de la propagación de dichas células estromales de la médula ósea en un cultivo en condiciones que induzcan su diferenciación en células neuronales, inducida por la transferencia de dichas células estromales de la médula ósea en un medio sin suero que contiene un antioxidante para preparar un medicamento para el tratamiento de un paciente humano en necesidad de dichas células neuronales.

La invención también incluye una población aislada de células que comprenden células neuronales, hechas por el método de inducir la diferenciación de células de la médula ósea aisladas en células neuronales. El método comprende transferir dichas células estromales de la médula ósea en un medio sin suero que contiene un antidioxidante. El contacto entre la célula estromal de la médula ósea aislada y el antioxidante que induce a la diferenciación neuronal induce la diferenciación de la célula estromal de la médula ósea aislada en la célula neuronal de la invención.

En un aspecto, la población de células que comprenden células neuronales hechas por este método es una población de células de roedor. En otro aspecto, las células neuronales son células de rata. En un aspecto preferido, la célula neuronal hecha por este método es una población de células neuronales humanas.

Una realización preferida de la invención incluye una población de células neuronales aislada transfectada con una proteína terapéutica. La población de células neuronales se aisla por el método de inducir la diferenciación de células de médula ósea aisladas en las células neuronales citadas anteriormente. La población de células neuronales es entonces adecuada para la transfección con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica que, cuando se exprese, efectuará el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central. En un aspecto de la invención, la proteína terapéutica codificada por el ácido nucleico aislado es una citoquina, una quimiocina,
una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo o una proteína tóxica del glioma.

La invención abarca enfermedades, trastornos o condiciones del sistema nervioso central incluyendo, pero no está limitada a, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, un tumor, un traumatismo, demencia senil, la enfermedad de Tay-Sach, la enfermedad de Sandhoff, el síndrome de Hurler, la enfermedad de Krabbe, daño traumático del sistema nervioso central inducido en el nacimiento, epilepsia, esclerosis múltiple, traumatismo, tumor, apoplejía y daño de la médula espinal.

En un aspecto, la población de células que comprenden la célula neuronal, hecha por el método de inducir la diferenciación de una célula estromal de la médula ósea anterior, son células de rata o células de roedor. Preferiblemente las células neuronales transfectadas son células humanas.

La invención también incluye una población aislada de células que comprenden las células neuronales producidas por un método in vitro que comprende aislar células estromales de la médula ósea y transferir dichas células estromales de la médula ósea en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante.

Esto induce que la célula estromal de la médula ósea aislada se diferencie en células neuronales aisladas.

Una población aisladas transfectada de células que comprenden células neuronales producidas aislando células estromales de la médula ósea y transfiriendo dichas células estromales de la médula ósea en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante también es incluida en la invención. La población aisladas de células, que comprenden células neuronales producidas por este método, entonces son transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, que, cuando se exprese en las células neuronales, efectuará el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central.

En un aspecto preferido, la proteína terapéutica codificada por el ácido nucleico aislado es una citoquina, una quimiocina, una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo o una proteína tóxica del glioma.

En un aspecto de la presente invención, la población transfectada de células que comprenden las células neuronales producidas poniendo en contacto un compuesto que induce la diferenciación neuronal con células estromales de la médula ósea son células de rata. En otro aspecto, las células neuronales transfectadas son células de roedor. En un aspecto preferido, las células neuronales transfectadas son células humanas.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

El sumario precedente, así como la siguiente descripción detallada de la invención, serán entendidos mejor cuando se lean junto con los dibujos añadidos. Con el objetivo de ilustrar la invención, se muestran la(s) realización(ones) de los dibujos que son preferidas en este caso. Debe entenderse, sin embargo, que la invención no está limitada con las disposiciones exactas y los procedimientos mostrados. En los dibujos:

La figura 1A es una gráfica que representa la clasificación de células fluorescentes de rCEM del paso 1 usando anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente al marcador de la superficie celular CD11b (CD11/integrina alpha_{M}/cadena alfa de Mac-1; Pharmingen, San Diego, CA) (picos no rellenos). El anticuerpo secundario usado era anticuerpo antiratón conjugado con isotiocianato de fluoresceina (FITC). Un control de isotipo es incluido en cada experimento para identificar la fluorescencia de fondo (picos rellenos). El número de células analizadas (Eventos) se representa sobre el eje de ordenadas, mientras que la intensidad de la tinción se representa en el eje de abcisas.

La figura 1B es una gráfica que representa la clasificación de células fluorescentes de rCEM del paso 1 usando anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente con el marcador de la superficie celular CD45/antígeno común de leucocitos (Pharmingen) (picos no rellenos). El anticuerpo secundario es un anticuerpo antiratón conjugado con isotiocianato de fluoresceina (FITC). Un control de isotipo es incluido en cada experimento para identificar la fluorescencia de fondo (picos rellenos). El número de células analizadas (Eventos) se representa sobre el eje de ordenadas, mientras que la intensidad de tinción se representa sobre el eje de abscisas.

La figura 1C es una gráfica que representa la clasificación de células fluorescentes de rCEM del paso 1 usando anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente al marcador de la superficie celular CD90/Thy-1/CD90.1/Thy1.1 (Pharmingen) (picos no rellenos). El anticuerpo secundario es anticuerpo antiratón conjugado con isotiocianato de fluoresceina (FITC). Un control de isotipo es incluido en cada experimento para identificar la fluorescencia de fondo (picos rellenos). El número de células analizadas (Eventos) se representa sobre el eje de ordenadas, mientras que la intensidad de tinción se representa sobre el eje de abscisas. Los datos descritos en este documento demuestran que la intensidad de fluorescencia es mayor (desplazada a la derecha) cuando se incuban rCEM con el anticuerpo CD90 (no relleno), según se compara con el anticuerpo control (relleno), indicando que una enorme mayoría de células en los cultivos de rCEM expresa CD90, lo que es compatible con su estado no diferenciado.

La figura 2, que comprende a las figuras 2A-2H, es una imagen que representa la diferenciación neuronal de las rCEM en varios puntos de tiempo después del tratamiento. Brevemente, el protocolo de diferenciación neuronal descrito en este documento fue iniciado a 0 minutos y fue seguido durante 210 minutos. La figura 2A representa 0 minutos, la figura 2B representa 30 minutos, la figura 2C representa 60 minutos, la figura 3D representa 90 minutos, la figura 2E representa 120 minutos, la figura 2F representa 150 minutos, la figura 2G representa 180 minutos, y la figura 2H representa 210 minutos. Las rCEM planas en la figura 2A se identifican (\ding{116}) antes de la diferenciación. La retracción del cuerpo celular y la elaboración de proyecciones son evidentes al aumentar el tiempo. La flecha en la figura 2E indica una segunda diferenciación celular. La retracción de las neuritas es indicada por (>). (Amplificación = 200X).

La figura 3A es una imagen que representa la expresión de enolasa neuroespecíficas (ENE) en neuronas que se diferencian usando un anticuerpo policlonal anti-ENE (Polisciences, Warrington, PA). Brevemente, las rCEM no diferenciadas (indicadas por un ">") conservaron la morfología aplanada y fueron teñidas sólo ligeramente para la expresión de ENE. Las neuronas derivadas de rCEM (flechas) se tiñeron de marrón oscuro para la expresión de ENE y mostraron cuerpos de células condensados y proyecciones altamente ramificadas. Las células de transición (\rightarrow) exhibieron morfologías neuronales intermedias, con cuerpos de células parcialmente retraídos y una tinción de ENE marrón clara.

La figura 3B es una imagen que representa que las morfologías de neuronas derivadas de rCEM incluyen células bipolares simples (\ding{116}) y multipolares complejas con proyecciones altamente ramificadas (flecha). Una tinción de ENE intensa es evidente en ambos tipos de neuronas.

La figura 3C es una imagen que representa que las neuronas reactivas con ENE que muestran morfologías piramidales a veces son generadas usando los protocolos descritos en otra parte en este documento. El contacto con una célula de transición (marrón claro) es mantenido vía una sola proyección no ramificada.

La figura 3D es una imagen que representa una neurona reactiva con ENE que elabora una larga proyección con evidentes varicosidades (flechas). Los datos descritos en este documento demuestran que el cuerpo neuronal está en contacto íntimo con una célula de transición.

La figura 3E es una imagen que representa que los grupos de neuronas derivadas de rCEM de morfologías variables forman redes complejas. Los datos descritos en este documento demuestran que las rCEM no diferenciadas (>) están incluidas dentro de esta malla de proyecciones. (Amplificación = 320X).

La figura 3F es una imagen de un análisis de inmunotransferencia que describe la expresión de niveles bajos de ENE en rCEM no inducidas (U). Los datos descritos en este documento demuestran que un aumento significativo de la expresión de ENE es evidente a las 5 horas después del tratamiento de BME (I). Niveles comparables de tubulina son detectados en cada separación, indicando una carga igual de las muestras.

La figura 4A es una imagen que representa la expresión de NeuN en neuronas derivadas de rCEM usando un anticuerpo monoclonal anti-NeuN (Chemicon, Temeeula, CA). Brevemente, los datos descritos en este documento demuestran que NeuN puede ser detectado en el núcleo y en el citoplasma circundante de neuronas derivadas de rCEM (flecha).

La figura 4B es una imagen que representa la expresión de NeuN en neuronas derivadas de rCEM usando un anticuerpo monoclonal anti-NeuN (Chemicon). Brevemente, los datos descritos en este documento demuestran que NeuN puede ser detectado en el núcleo y en el citoplasma circundante de neuronas derivadas de rCEM (flecha). Además, los datos descritos en este documento demuestran que la tinción del anticuerpo anti-NeuN no se extiende en las proyecciones de células positivas. La imagen además representa que las células de transición (\rightarrow) y las rCEM no diferenciadas (<) no expresan NeuN.

La figura 5A es una imagen que representa la expresión de NFM y tau por diferenciación celular. Brevemente, las neuronas derivadas de rCEM fueron inmuno-teñidas para detectar la expresión de NF-M usando un anticuerpo policlonal anti-NF-M (Chemicon). Los datos descritos en este documento demuestran que las células que exhiben morfologías neuronales expresaban NF-M tanto en los cuerpos celulares (flecha) como en las proyecciones (*). Las rCEM planas no diferenciadas (>) no se tiñen por la expresión de NFM.

La figura 5B es una imagen que representa que la preadsorción del anticuerpo anti-NF-M (Chemicon) con 20 microgramos de proteína NF-M purificada de la noche a la mañana a 4ºC eliminaba la tinción de neuronas derivadas de rCEM, indicado la especificidad de la tinción de NF-M.

La figura 5C es una imagen que representa neuronas derivadas de rCEM teñidas para la expresión de tau usando el anticuerpo policlonal anti-tau (compañía química Sigma, San Louis, MO). Los datos descritos en este documento demuestran que las células que muestran morfologías neuronales (flechas) se tiñen de marrón oscura por la expresión de tau dentro del cuerpo celular y que se extiende en las proyecciones (*). Las rCEM planas no diferenciadas (>) no expresan tau y no se tiñen. (Amplificación = 320X).

La figura 5H es una imagen que representa neuronas derivadas de rCEM teñidas para la expresión de tau usando el anticuerpo policlonal anti-tau (compañía química Sigma, San Louis, MO). Los datos descritos en este documento demuestran que células que muestran morfologías neuronales (flechas) se tiñen de marrón oscuro para la expresión de tau dentro del cuerpo celular y que se extiende en las proyecciones (*). Las rCEM planas no diferenciadas (>) no expresan tau y no se tiñen. (Amplificación = 320X).

La figura 6A es una imagen que representa el marcaje de FM1-43 de neuronas derivadas de rCEM. Los datos descritos en este documento demuestran que las neuronas derivadas de rCEM despolarizadas usando KCl muestran un marcaje intenso de los conos de crecimiento supuestos terminales (indicado por el triángulo no relleno).

La figura 6B es una imagen que representa el marcaje de FM1-43 de neuronas derivadas de rCEM. Los datos descritos en este documento demuestran que las neuronas derivadas de rCEM despolarizadas usando KCl muestran un marcaje intenso de los conos de crecimiento supuestos terminales (indicado por el triángulo no relleno).

La figura 7A es una imagen que representa la diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del clon de rCEM individual Nº. 1 sometido al protocolo de diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE (marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición (\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación = 320X).

La figura 7B es una imagen que representa la diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del clon de rCEM Nº. 2 individual sometido al protocolo de diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE (marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición (\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación = 320X).

La figura 7C es una imagen que representa la diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del clon de rCEM individual Nº. 3 sometido al protocolo de diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE (marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición (\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación = 320X).

La figura 7D es una imagen que representa la diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del clon de rCEM individual Nº. 1 sometido al protocolo de diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE (marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición (\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación = 320X).

La figura 8A es una imagen que representa la diferenciación de CEM humanas. Los datos descritos en este documento demuestran que las CEM humanas se diferencian en neuronas y expresan altos niveles de ENE (marrón oscuro). Una célula de transición ligeramente teñida (indicada por \rightarrow) es representada en la parte inferior izquierda.

La figura 8B es una imagen que representa que una neurona derivada de hCEM reactiva con ENE elabora una proyección que exhibe una morfología en bulbo terminal tipo neuronal.

La figura 8C es una imagen que representa una imagen de contraste de fases de neuronas reactivas con ENE apareadas. Los datos descritos en este documento muestran morfologías de cono de crecimiento con extensiones filopodiales (doble flecha). La imagen está ampliada al 50% para mostrar los detalles.

La figura 8D es una imagen que representa que las neuronas derivadas de hCEM se tiñen positivamente para NF-M. (Amplificación = 320X).

La figura 9, que comprende las figuras 9A-9F, es una imagen que representa la expresión de nestina y trkA en la diferenciación de neuronas derivadas de rCEM. Las figuras 9A-9C muestran células teñidas para la expresión de nestina a las 5 horas, 1 día y 6 días, respectivamente. Las figuras 9D-9F representan células teñidas para la expresión de trkA a las 5 horas, 1 día y 6 días, respectivamente. (Amplificación = 320X).

Descripción detallada de la invención

La invención está basada en el descubrimiento de que poner en contacto células estromales de la médula ósea con un antioxidante, como se define en las reivindicaciones, media la diferenciación de las células en células tipo neuronales que expresan una variedad de marcadores neuroespecíficos (por ejemplo, NeuN, neurofilamento-M, enolasa neuroespecífica [ENE], tau, nestina, trkA y similares). Las células exhiben otras características fenotípicas del tipo neurona tales como, pero no limitadas a, cuerpos celulares esféricos y refráctiles que exhiben un aspecto neuronal pericarial típico, cuerpos celulares que extienden largas proyecciones que terminan en conos de crecimiento y la filopodia típica de las neuronas, y el marcaje de los conos de crecimiento por la tinción fluorescente con FM1-43, que típicamente marca la liberación del transmisor neuronal y el reciclado de las vesículas sinápticas. Así, los métodos descritos en este documento inducen la diferenciación de células estromales de la médula ósea en células neuronales. Tales métodos son cruciales en el desarrollo de terapias a base de células para el tratamiento de trastornos, enfermedades o condiciones del sistema nervioso central (SNC). En realidad, antes de la presente invención, la carencia de fuentes de células neuronales, que puedan ser introducidas al SNC de un paciente humano, han impedido severamente el desarrollo de terapias del SNC.

Descripción

La invención incluye un método para inducir que células estromales de la médula ósea se diferencien en una células neuronales aisladas (véase la reivindicación 1). Las realizaciones del método de la invención son definidas en las reivindicaciones y son descritas en la sección de los ejemplos en este documento. Generalmente, las células son aisladas a partir de un donante, las células estromales son obtenidas a partir de éste, por lo general, usando un método de clasificación célular, y las células estromales son posteriormente cultivadas in vitro. El donante puede ser una rata, por ejemplo, o el donante puede ser un ser humano. La invención es requerida para abarcar a un donante mamífero y no debería estar limitada a los donantes específicos descritos en este documento.

Para inducir el fenotipo neuronal, las células son pretratadas con una cantidad eficaz de un compuesto que induce la diferenciación neuronal que es introducido en un cultivo celular durante un periodo de tiempo. El tiempo puede variar de acuerdo con el método exacto que se contemple y no debe ser interpretado como una limitación de la invención de ningún modo. Después de la exposición de pretratamiento al compuesto que induce la diferenciación neuronal, las células son transferidas a un medio sin suero que contiene una cantidad del mismo compuesto que induce la diferenciación neuronal. La morfología neuronal es evidente aproximadamente en una hora, véase la figura 2, por ejemplo, y la morfología se hace más evidente regularmente con el tiempo. La expresión del marcador neuronal es también evidente aproximadamente a los 30 minutos después del tratamiento. Las células neuronales así diferenciadas también expresan eventualmente varios marcadores de proteicos, incluyendo, pero no limitados a, tirosina hidroxilasa, tubulina, colinacetiltransferasa, sinaptofisina y TOAD, que son todas las proteínas necesariamente asociadas con las células neuronales y los procesos neuronales.

Estas neuronas recién diferenciadas son útiles en el tratamiento de pacientes que padecen enfermedades de los sistemas colinérgicos y catecolaminérgicos, y más generalmente, los pacientes que padecen enfermedades del sistema nervioso central.

Los antioxidantes sirven como compuestos que inducen la diferenciación neuronal, incluyendo, pero no limitados a, \beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, ácido ascórbico, dimetilfumarato y n-acetilcisteina. Las realizaciones particularmente preferidas, como se muestra en la sección de los ejemplos descrita en este documento, incluyen \beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido y una combinación de dimetilsulfóxido e hidroxianisol butilado como los antioxidantes favoritos. Sin embargo, la invención no está limitada a los antioxidantes descritos en este documento y debe ser interpretada para que incluya todos los antioxidantes, así como otros compuestos que induzcan la diferenciación neuronal de células estromales de la médula ósea.

La invención también ilustra el uso de factores de crecimiento como los compuestos que inducen la diferenciación neuronal en el método para inducir la diferenciación de CEM en células neuronales. Tales factores de crecimiento incluyen, pero no están limitados al factor de crecimiento de fibroblastos 2, el factor de crecimiento derivado de plaquetas y el factor de crecimiento de los nervios, así como a los agentes relacionados.

Se puede confirmar la identidad neuronal tiñendo las células neuronales diferenciadas para la detección de marcadores neuroespecíficos. Los ejemplos de tales marcadores son el neurofilamento-M (NF-M), la proteína tau, Neu-N, enolasa neuroespecífica (ENE), nestina, y trkA. La diferenciación progresiva de la célula estromal de la médula ósea en una neurona está en correspondencia con un aumento de cada uno de estos marcadores, indicando que son producidas células neuronales. Otra caracterización puede ser lograda usando técnicas inmunocitoquímicas e inmunológicas conocidas. Por ejemplo, el análisis inmunocitoquímico de estas células neuronales revela que las células también expresan las proteínas que están asociadas a las neuronas naturalmente diferenciadas. Tales proteínas incluyen, pero no están limitadas a la tubulina, el TOAD y la sinaptofisina. La detección del anticuerpo de colinacetiltransferasa y tirosina hidroxilasa también puede ser evaluada.

Es evidente a partir de los datos descritos en este documento que es posible diferenciar una célula estromal de la médula ósea aislada en una célula neuronal in vitro. Las células neuronales así diferenciadas son útiles en el tratamiento de pacientes que padecen cualquiera de una amplia variedad de enfermedades, trastornos o condiciones del sistema nervioso central.

La invención también incluye un método para producir una célula neuronal aislada a partir de células estromales aisladas de la médula ósea como se expone en adelante en las reivindicaciones (véase la reivindicación 7). El método comprende diferenciar una célula estromal de la médula ósea de la misma manera general que se cita anteriormente, produciéndose así una célula neuronal aislada. Una población de células que comprenden es definida en las reivindicaciones 13-12.

La célula neuronal aislada citada en ambos de los métodos anteriores puede ser transfectada con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica. La proteína terapéutica, cuando se exprese, tratará a un paciente que tiene una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central.

Una amplia plétora de proteínas beneficiosas es muy conocida en la técnica y es expuesta en adelante en, por ejemplo, los documentos WO 96/30031 y WO 99/43286. Tales ejemplos incluyen, pero no están limitados a, citoquinas, quimiocinas, neurotrofinas, otras proteínas alimentarias, factores de crecimiento, anticuerpos y la proteína tóxica del glioma. Cuando las células neuronales transfectadas que codifican tales proteínas son administradas a un paciente, las células neuronales influirán beneficiosamente en células que están ya presentes en el sistema nervioso central. Por ejemplo, las células neuronales transfectadas que son introducidas en el sistema nervioso central pueden ser usadas para reparar cualquier daño del sistema nervioso central, y/o combatir a los tumores del sistema nervioso central.

Las solicitudes de patentes internacionales WO 96/30031 y WO 99/43286 también describen el uso de las CEM en terapias para una amplia variedad de enfermedades del SNC, trastornos, o condiciones, que incluyen, pero no están limitadas, a enfermedades genéticas del SNC (por ejemplo, la enfermedad de Tay-Sach's, Sandhoffs, el síndrome de Hurler, la enfermedad de Krabbe), daño traumático del SNC inducido por el nacimiento, enfermedades adultas del SNC, trastornos o condiciones (por ejemplo, las enfermedades de Parkinson, Alzheimer y Huntington, demencia senil, epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, traumatismo, tumores, apoplejía y similares) y enfermedades degenerativas y daño traumático de la médula espinal.

Entre los recién nacidos y los niños, pueden ser usadas células neuronales transfectadas para el tratamiento de un número de enfermedades genéticas del sistema nervioso central, incluyendo, pero no limitadas, a la enfermedad de Tay-Sachs y la enfermedad relacionada con Sandhoffs, el síndrome de Hurler y la enfermedad asociada a mucopolisacaridosas y de Krabbe. En grados variables, estas enfermedades también producen lesiones en la médula espinal y los nervios periféricos y también tienen efectos no neurológicos. Aunque los efectos no neurológicos de estas enfermedades pueden ser tratables por trasplantes de la médula ósea, los efectos del sistema nervioso central no se mejoran a pesar del trasplante de la médula ósea. El método de la presente invención es útil para tratar los efectos de sistema nervioso central de estos tipos de enfermedades. Además, en recién nacidos y niños, el traumatismo craneal durante el nacimiento o después del nacimiento es tratable introduciendo a estas células neuronales directamente en el sistema nervioso central de los niños. La formación de tumores del sistema nervioso central en niños es también tratable usando los métodos de la presente invención.

Las enfermedades del sistema nervioso central en adultos son también tratables administrando células neuronales aisladas al adulto. Tales enfermedades de adultos incluyen, pero no están limitadas a, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, el daño de médula espinal, apoplejía, traumatismo, tumores, enfermedades degenerativas de la médula espinal tales como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington y epilepsia. El tratamiento de la esclerosis múltiple también es contemplado.

El tratamiento de los daños de la médula espinal también se contempla según la presente invención. Los métodos de la técnica anterior para tratar los daños de la médula espinal implican usar fibroblastos para suministrar neurotrofinas al sitio de las lesiones de la médula espinal en animales. Las neurotrofinas, suministradas de esta manera, reducen la lesión o, por otra parte, tratan el daño. Sin embargo, los fibroblastos producen grandes cantidades de colágeno, causando fibrosis en el sitio de lesión, negando así los efectos beneficiosos del tratamiento. La administración de neurotrofinas a las lesiones de la médula espinal usando células neuronales transfectadas es ventajosa respecto a los métodos de la técnica anterior porque las células neuronales no producen grandes cantidades de colágeno y, por lo tanto, no causan la fibrosis.

La invención además contempla tratar a un paciente humano que tiene una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central administrando las células neuronales diferenciadas de la invención al sistema nervioso central del paciente como se define en las reivindicaciones (véanse las reivindicaciones 8-12). Los métodos para tratar a un paciente humano usando las CEM son descritos en los documentos WO 96/30031 y WO 99/43286, que se incorporan como referencia en su totalidad en este documento. Los métodos para administrar células neuronales diferenciadas a un paciente son idénticos a los usados para las CEM como se describe en los documentos WO 96/30031 y WO 99M3286. Los métodos abarcan introducir un ácido nucleico aislado que codifica una proteína beneficiosa en células neuronales diferenciadas y también abarcan a las propias células neuronales diferenciadas en terapias celulares en las que un paciente está en necesidad de la administración de tales células. Las células neuronales diferenciadas de la presente invención deben ser administradas preferiblemente a un ser humano, y además, las células neuronales deben ser administradas preferiblemente al sistema nervioso central del ser humano. En algunos casos, las células neuronales diferenciadas deben ser administradas a la parte del cuerpo estriado del cerebro humano. El sitio exacto de administración de las células neuronales dependerá de un diverso número de factores, incluyendo, pero no limitados a, el sitio de la lesión que se trate, el tipo de enfermedad que se trate, la edad del ser humano y la severidad de la enfermedad, y otros similares. La determinación del sitio de administración corresponde al experto en la técnica versado en la administración de células a mamíferos.

El modo de administración de las células neuronales diferenciadas al sistema nervioso central del ser humano puede variar dependiendo de diversos factores incluyendo, pero no limitados a, el tipo de enfermedad que se trate, la edad del ser humano, si las células neuronales tienen ADN aislado introducido dentro, y otros similares. Un ejemplo de administración de células neuronales directamente en el tejido cerebral es proporcionado en este documento en la sección de detalles experimentales. Generalmente, las células son introducidas en el cerebro de un mamífero mediante la creación primero de un orificio en el cráneo por el cual las células son pasadas dentro del tejido cerebral. Las células pueden ser introducidas por inyección directa, usando una anastomosis, o por cualquier otro medio usado en la técnica para la introducción de compuestos en el sistema nervioso central.

Definiciones

Los artículos "un" y "uno/una" se usan en este documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. De modo ilustrativo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Según se usa en este documento, el "sistema nervioso central" debe ser interpretado para que incluya el cerebro y/o la médula espinal de un mamífero. La expresión también puede incluir a los ojos y a los nervios ópticos en algunos casos.

Según se usa en este documento, "células estromales", "células estromales de la médula ósea aisladas" y las "CEM" son usados de manera intercambiable y se proponen para referirse a la pequeña fracción de células en la médula ósea que puede servir como precursores tipo de células madre de osteocitos, condrocitos y adipocitos y que se aislan a partir de la médula ósea por su capacidad de adherirse a placas de plástico. Las células estromales de la médula ósea pueden ser derivadas a partir de cualquier animal. En algunas realizaciones, las células estromales son derivadas a partir de primates, preferiblemente seres humanos.

Según se usa en este documento, el término "antioxidante" se propone para referirse a aquellas sustancias que inhiben la oxidación o las reacciones promovidas por oxígeno o peróxidos. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no están limitados a, \beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, ácido ascórbico, dimetilfumarato y n-acetilcisteína.

Según se usa en este documento, las expresiones "proteína beneficiosa" y "proteína terapéutica" son usados de manera intercambiable y se proponen para referirse a una proteína que puede compensar la proteína codificada por una expresión génica defectuosa y/o génica insuficiente que está vinculada causalmente a la enfermedad o a los síntomas de la enfermedad, trastorno o condición caracterizada por un defecto génico. La presencia de la proteína alivia, reduce, previene o causa que se alivien, reduzcan o prevengan las causas y/o los síntomas que caracterizan a la enfermedad, trastorno o condición.

Según se usa en este documento, una enfermedad, un trastorno o una condición que puede ser tratada con una proteína beneficiosa o terapéutica se proponen para referirse a una enfermedad, trastorno o condición que puede ser tratado o prevenido por la presencia de una proteína que alivia, reduce, previene o causa que se alivien, reduzcan o prevengan las causas y/o los síntomas que caracterizan a la enfermedad, el trastorno o la condición. Las enfermedades, trastornos y condiciones que pueden ser tratadas con una proteína beneficiosa incluyen las enfermedades, los trastornos y las condiciones caracterizadas por un defecto génico así como las que no están caracterizadas por un defecto génico, pero que, sin embargo, pueden ser tratadas o prevenidas por la presencia de una proteína que alivie, reduzca, prevenga o cause que se alivien, reduzcan o prevengan las causas y/o los síntomas que caracterizan a la enfermedad, el trastorno o la condición.

La expresión "ácido nucleico aislado" debe ser interpretado para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos o segmento o fragmento que ha sido purificado a partir de las secuencias que la flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que haya sido eliminado a partir de las secuencias que están normalmente adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que se da naturalmente. La expresión también se aplica a los ácidos nucleicos que han sido sustancialmente purificados a partir de otros componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico, por ejemplo, el ARN o el ADN o las proteínas que naturalmente lo acompañan en la célula.

Según se usa en este documento, "células transfectadas" se proponen para referirse a células a las cuales ha sido proporcionada una construcción génica usando cualquier tecnología usada para introducir moléculas de ácidos nucleicos en células tales como, pero no limitadas a, la transfección clásica (transfección mediada por fosfato de calcio o dextrano DEAE), electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por sustancias químicas, transferencia mediada por ligando o transferencia con un vector viral recombinante.

El término "diferenciación", según se usa en este documento, debe ser interpretado para que signifique la inducción de un fenotipo diferenciado en una célula no diferenciada cultivando conjuntamente la célula no diferenciada en presencia de una población sustancialmente homogénea de células diferenciadas, en presencia de productos de células diferenciadas o en presencia de un inductor de la diferenciación celular.

La expresión "célula neuronal", según se usa en este documento, debe ser interpretado para que signifique una CEM diferenciada tal que expresa al menos uno de los siguientes marcadores neuronales: enolasa neuroespecífica (ENE), NeuN, neurofilamento-M o la proteína tau.

El término "neurona", según se usa en este documento, debe ser interpretado para que signifique una célula nerviosa capaz de recibir y conducir impulsos eléctricos del sistema nervioso central. Una célula nerviosa o "neurona" típicamente comprenden un cuerpo celular, un axón, terminales de axón y dendritas.

La expresión "compuesto que induce la diferenciación neuronal" se propone para referirse a aquellos compuestos capaces de inducir la diferenciación de una célula estromal en una célula neuronal. Estos compuestos incluyen, pero no están limitados a, antioxidantes, factores tróficos y factores de crecimiento.

La invención además es descrita detalladamente en cuanto a los ejemplos experimentales siguientes. Estos ejemplos son proporcionados sólo con objetivos de ilustración, y no son requeridos para limitar, a no ser que se especifique de otra forma. Así, la invención de ninguna manera debe ser interpretada como que está limitada por los ejemplos siguientes, sino que más bien debería ser interpretada para abarcar a algunas y a todas las variaciones como se define en las reivindicaciones que se hacen evidentes como consecuencia de la enseñanza proporcionada en este
documento.

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Ejemplos

Los experimentos presentados en este ejemplo pueden ser resumidos en lo siguiente.

Las células estromales de la médula ósea exhiben múltiples rasgos de una población de células madre. Pueden ser incrementadas in vitro enormemente, y pueden ser inducidas a diferenciarse en múltiples tipos de células mesenquimales (véanse, por ejemplo, los documentos WO 96/30031 y WO 99/43286). Sin embargo, la diferenciación en destinos no mesenquimales no ha sido demostrada. En esta invención, las células estromales de rata adulta fueron cultivadas como células no diferenciadas en un cultivo en más de 14 pasos, indicando su gran capacidad proliferativa. Además, un nuevo protocolo de tratamiento indujo a las células estromales a exhibir un fenotipo neuronal, expresando varios marcadores neuroespecíficos, es decir, enolase neuroespecífica (ENE), NeuN, neurofilamento-M, tau, nestina, y trkA.

Además, los cuerpos celulares refractiles de las células tratadas extendieron largas proyecciones que terminaban en conos de crecimiento y filopodias típicas de las células neuronales. El tinte fluorescente, FM1-43, marcó los conos de crecimiento, lo que es compatible con la liberación del transmisor y el reciclado de vesículas sinápticas por las células tratadas. Las líneas celulares clonales, establecidas a partir de células solas, proliferaron, proporcionando tanto células no diferenciadas como células que exhibían un fenotipo neuronal.

Las células estromales de la médula ósea tratadas usando el nuevo protocolo descrito en este documento se diferenciaron en neuronas de modo similar a las rCEM lo que demostró que el protocolo no estaba limitado a las células estromales de roedores. Por consiguiente, los datos descritos en este documento demuestran, por primera vez, que se puede inducir a que las células estromales que la médula ósea de mamíferos superen su compromiso mesenquimal y puedan constituirse como un depósito celular abundante y accesible para el tratamiento de una variedad de enfermedades neurológicas, trastornos o condiciones.

Los materiales y los métodos usados en los experimentos presentados en este ejemplo se describen a continuación.

Cultivo celular

Fueron cultivadas CEM de rata inicialmente en medio Eagle \alpha-modificado (\alpha-MEM) suplementado con FBS del 20%, L-glutamina 2 mM, 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 miligramos por mililitro de estreptomicina y 25 nanogramos por mililitro de anfotericina B. Para cada paso, las células fueron puestas en placas con aproximadamente 8.000 células por centímetro cuadrado y fueron cultivadas hasta confluencia. En el paso 6, las células fueron transferidas a DMEM (pH 8,0)/FBS 20% sin ninguna suplementación adicional y fueron mantenidas hasta más allá del paso 14. Fueron obtenidas CEM de rata con un protocolo y con los procedimientos aprobados por el IACUC Institucional. Las muestras humanas fueron obtenidas a partir de voluntarios con su consentimiento informado y de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Examinador Institucional.

Inmunotransferencia

Treinta miligramos de extracto de proteína a partir de cultivos de rCEM no tratado (U) e inducido por BME (I) fueron separados en un gel de acrilamida con un gradiente del 4%-20% y fueron transferidos por electroforesis a una membrana de nilón. La inmunotransferencia fue sondada para la expresión de tubulina usando un anticuerpo monoclonal antitubulina (compañía química Sigma, San Louis, MO) seguido del anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). El desarrollo del color fue realizado usando un reactivo de quimioluminiscencia potenciado (Amersham, Piscataway, NJ). La tinción entonces fue segregada y sondada para la expresión de ENE usando el anticuerpo policlonal anti-ENE (ICN). De nuevo, los anticuerpos secundarios fueron conjugados con HRP, y el color fue desarrollado usando los reactivos ECL.

Inmunocitoquímica

Las rCEM cultivadas fueron fijadas con paraformaldehído del 4%, fueron incubadas con el anticuerpo primario de la noche a la mañana a 4ºC, fueron incubadas con el anticuerpo secundario durante una hora, seguido por la exposición al complejo de avidina-biotina durante una hora a 25ºC. El diaminobencideno (DAB) sirvió como sustrato cromogénico para la HRP.

Marcaje con FM1-43

Fueron tratados cultivos con DMSO/BHA en medio sin suero (SFM) durante aproximadamente 4 horas. Las células fueron mantenidas durante 30 minutos adicionales en fluido cerebroespinal artificial (aCSF)/BHA. Las células fueron marcadas en aCSF que contenía FM1-43 1 milimolar y KCl 75 mM durante 60 segundos. La mezcla de marcaje fue retirada, los cultivos fueron lavados dos veces con aCSF, y las células fueron incubadas en aCSF durante 60 minutos para reducir la tinción de fondo. Los cultivos fueron fijados con paraformaldehído del 4% y fueron empapados durante 24 horas en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes del análisis.

Los Resultados de los experimentos presentados en este ejemplo se describen a continuación.

Caracterización de células estromales

Fueron aisladas células estromales mesenquimales de rata (rCEM) a partir de fémures de ratas adultas y fueron propagadas in vitro (Azizi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3908-3913). Los datos descritos en la figura 1A demuestran que la distribución de células teñidas con el anticuerpo frente a CD 11b (no relleno) no se diferencia de él del control del isotipo (relleno), indicando que los cultivos de rCEM no contienen números significativos de células que expresen CD11b contaminates. Además, los datos descritos en la figura 1B también demuestran que la intensidad de tinción no se diferencia entre los perfiles del anticuerpo CD45 (no relleno) y control (llenos), indicando que las rCEM cultivadas no están contaminadas por las células que expresan CD45. La clasificación de células fluorescentes en el paso uno también demostró que las células eran negativas para CD11b (figura 1A), y CD45 (figura 1B), que son marcadores de la superficie celular asociados a las células linfohematopoyéticas. Por lo tanto, no hubo ninguna prueba de precursores hematopoyéticos en los cultivos.

Por el contrario, los datos descritos en este documento demuestran que las rCEM expresaban CD90 (figura 1C), lo que es compatible con su estado no diferenciado. Con una densidad de revestimiento baja, las rCEM crecieron como una monocapa de células grandes y planas. Según las células se acercaban a la confluencia, éstas asumieran una morfología fibroblástica más larga y delgada. En los comienzos de los estudios de diferenciación neuronal descritos en otra parte en este documento, las rCEM no tratadas además fueron caracterizadas mediante tinción para los marcadores de la superficie celular CD44 y CD71. Las células fueron reactivas para la expresión de CD44 y CD71, lo que es compatible con publicaciones anteriores (Pittenger et al., 1999, Science 284:143-147; Bruder et al., 1998, Clin. Orthop. Relat. Res. 355S:S247-5256).

Diferenciación Neuronal

Para inducir el fenotipo neuronal, las rCEM fueron mantenidas inicialmente en cultivos sub-confluentes en medio suplementado con \beta-mercaptoetanol 1 mM (BME) durante 24 horas. En estas condiciones, no fue evidente ningún cambio en la morfología. Para efectuar la diferenciación neuronal, las células fueron transferidas a medio sin suero que contenía BME 1-10 milimolar (SFM/BME). El porcentaje de células que adoptaban una morfología neuronal aumentó a concentraciones de BME más altas, y fue realzado por el pretratamiento con BME. A los 60 minutos antes de la exposición a SFM/BME, fueron evidentes cambios en la morfología de algunas de las rCEM (figura 2C). Las células sensibles asumieron cada vez más características morfológicas neuronales en las 3 primeras horas. Al principio, el citoplasma en las rCEM planas se retiró hacia el núcleo, formando un cuerpo celular contraído multipolar, abandonando las extensiones tipo proyección de membrana periféricamente (0-90 minutos).

Las células tratadas exhibieron una mayor expresión del marcador neuronal ENE 30 minutos antes del tratamiento. Sobre las 2 horas subsecuentes, los cuerpos celulares se hicieron cada vez más esféricos y refráctiles, exhibiendo un aspecto neuronal pericarial típico. Las proyecciones se continuaron elaborando, desarrollando expansiones terminales del tipo cono de crecimiento y extensiones filopodiales (véanse, por ejemplo, figuras 2G y 2H). Las proyecciones celulares exhibieron ramificaciones primarias y secundarias, y sufrieron un crecimiento dinámico. La retractación, así como la extensión, era evidente como se demuestra por el hecho de que la célula marcada por una flecha a los 120 minutos (figura 2E) se puso en contacto una proyección vecina inicalmente (marcado por ">"), que se retrajo a los 180 minutos (figura 2G), con la pérdida del contacto.

Para caracterizar además la diferenciación neuronal potencial, fueron teñidos cultivos tratados con BME para detectar la expresión del marcador neuronal enolasa neuroespecífico (ENE). Las rCEM insensibles planas expresaron niveles de la proteína ENE muy bajos, pero detectables, lo que es compatible con la detección anterior de cantidades minutas de proteína y/o mensaje en células de origen de la médula ósea (Pechumer et al., 1993, Lab. Invest. 89:743-749; Reid et al., 1991, Clin. Pathol. 44:483-486; vanObberghen et al., 1988, J. Neurosci. Res. 19:450-456).

La transición progresiva de las rCEM a un fenotipo neuronal coincidió con una mayor expresión de ENE (figura 3A). Las células que exhibieron cuerpos celulares contraídos y proyecciones se tiñeron de marrón oscuro para la expresión de ENE (flechas), mientras que las rCEM planas e insensibles (>), mostraron una tinción de ENE mínima. Las células en etapas intermedias en la secuencia de diferenciación (\rightarrow) exhibieron morfologías de transición y una tinción marrón claro, indicando una sincronía de diferenciación morfológica y molecular. Las neuronas derivadas de rCEM mostraron morfologías neuronales distintas (figura 3B), desde células bipolares simples (\ding{116}) a multipolares grandes y ampliamente ramificadas (flecha). Pocas neuronas reactivas con ENE exhibieron morfologías de células piramidales (figura 3C), mientras que las neuronas que elaboraban largas proyecciones con evidentes varicosidades (flechas) fueron más comunes (figura 3D). Los grupos de células diferenciadas exhibieron reactividad con ENE intensa, y las proyecciones formaron redes extensas (figura 3E). Incluso dentro de estos grupos, las rCEM típicas planas (>) sólo fueron teñidas ligeramente, lo que es compatible con su estado de no diferenciadas.

El análisis de inmunotransferencia (figura 3F) confirmó la expresión de bajos niveles de proteína ENE en las rCEM no inducidas. La inducción del fenotipo neuronal causó un aumento drástico de la expresión de ENE, lo que es compatible con los datos inmunocitoquímicos.

Para investigar además las características neuronales, los cultivos diferenciados fueron teñidos para NeuN, un marcador neuroespecífico expresado en células postmitóticas (Sarnat et al., 1998, Brain Res. 20:88-94). Un subconjunto de células que exhibían cuerpos celulares redondeados y proyecciones (flecha) se tiñeron por la expresión de NeuN, mientras que las células no diferenciadas (<) permanecieron negativas respecto a NeuN (figura 4A). Compatible con las publicaciones anteriores que describen la tinción con NeuN en células neuronales (Sarnat et al., 1998, Brain Res. 20:88-94), la tinción con NeuN fue limitada al núcleo y al citoplasma circundante de las células reactivas, y no se extendió a las proyecciones. Algunas células que exhibían distintas morfologías neuronales no expresaron NeuN (\rightarrow), mientras que células vecinas fueron altamente positivas (flecha) (figura 4B). Este modelo contrasta con el establecido para la tinción de ENE, en la que cada célula que exhibe una morfología neuronal demostró una mayor expresión de ENE. Sin desear vincularse a ninguna teoría particular, estos datos sugieren que un subconjunto de células reactivas de ENE son neuronas postmitóticas. También sin desear vincularse a ninguna teoría particular, puede ser que las propiedades antioxidantes de BME, que realzan la supervivencia neuronal in vitro (Ishii et al., 1993, Neurosci. Lett. 163:159-162), puedan mediar, en parte, la inducción de la diferenciación neuronal en las CEM, aunque este resultado sorprendente fuera inesperado basado en estudios anteriores.

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La nestina, una proteína filamentosa intermedia, se expresa en células madre precursoras neuronales neuroepiteliales, con una expresión decreciente según la neurona madura. Los datos experimentales muestran que cuando las células neuronales diferenciadas por CEM son teñidas para detectar nestina, la expresión de nestina disminuye con el tiempo (figuras 9A-9C). Además, la tinción para trkA, un receptor del factor de crecimiento nervioso de alta afinidad que está presente en neuronas, demuestra que los niveles de trkA permanecen inalterados en todas las partes del proceso de maduración de la célula neuronal diferenciada por CEM (figuras 9D-9F).

Para comenzar a examinar la hipótesis de las propiedades antioxidantes de la inducción mediada por BME de la diferenciación neuronal en CEM, fueron tratadas rCEM con otros antioxidantes, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), hidroxianisol butilado (BHA) o hidroxitolueno butilado (BHT), ácido ascórbico, fumarato de dimetilo, n-acetilcisteina y similares, tanto solos como en combinación entre ellos. Además, el tratamiento con el antioxidante ditiotreitol (DTT) en combinación con BHA también indujo la diferenciación neuronal por CEM sugiriendo que el DTT solo puede también obtener una diferenciación neuronal.

Cada tratamiento con antioxidante (por ejemplo, DMSO, BHA, BHT, ácido ascórbico, dimetilfumarato, n-acetilcisteina y similares, tanto solos como en combinación) produjeron morfologías neuronales con un curso de tiempo similar a los efectos de BME. Además, los datos preliminares sugirieron que el tratamiento usando aproximadamente 2% (v/v) de DMSO y aproximadamente BHA 200 milimolar (DMSO/BHA) era preferido aunque un amplio intervalo de concentraciones produjeran la diferenciación neuronal.

Para caracterizar además la identidad neuronal, las CEM tratadas con DMSO/BHA fueron teñidas con neurofilamento-M (NF-M), un filamento intermedio neuroespecífico que ayuda a iniciar la elongación de neuritas (Carden et al., 1987, Neurosci. 7:3489-3504). Los datos descritos antes en otra parte en este documento demostraron que el tratamiento de CEM con BME causaba una mayor expresión de NF-M en células que exhibían morfologías neuronales. La mayor parte de las células que mostraban cuerpos celulares redondeados con proyecciones (flecha) después de la exposición a DMSO/BHA expresaban niveles altos de NF-M, mientras que las células planas no diferenciadas (>) no lo hicieron (figura 5A). La preadsorción del anticuerpo de NF-M con la proteína NF-M purificada suprimió la tinción (figura 5B), estableciendo la especificidad.

Los cultivos tratados con DMSO/BHA fueron entonces examinados por la presencia de tau, una proteína neuroespecífica asociada a los microtubulos expresada por la diferenciación de neuronas (Kosik y Finch, 1987, J. Neurosci. 7:3142-3153). Las células que exhibían una morfología neuronal (flecha) expresaban la proteína tau en el cuerpo celular así como en las proyecciones (*), mientras que las células planas no diferenciadas fueron negativas para tau (<) (figuras 5C y 5D). Los datos descritos en este documento indican que el método descrito en este documento induce la diferenciación neuronal de células estromales de la médula ósea.

Reciclaje de vesículas sinápticas dependientes de la actividad

Para caracterizar además las propiedades neuronales, fueron tratados cultivos con el tinte de estirilo FM1-43, que marca la dispersión exterior de las vesículas sinápticas en la liberación del transmisor dependiente de la actividad (Betz y Bewick, 1992, Science 255:200-203; Betz et al., 1992, J. Neurosci. 12: 363-375; Diefenbach et al., 1999, J. Neurosci. 19: 9436-9444). La exposición frente a las concentraciones despolarizantes de K^{+} causó el marcaje fluorescente de los conos de crecimiento (\rightarrow), sugiriendo que las células estaban reciclando las vesículas sinápticas consiguientes a la liberación del transmisor dependiente de la actividad.

Análisis clonal

Para determinar si las rCEM individuales exhibían características propias de las células madre de autorenovación y pluripotencialidad, fueron analizados clones individuales. Para establecer los clones, las rCEM fueron puestas en placas con aproximadamente 10 células por centímetros cuadrado, fueron cultivadas en 50-150 células por colonia, fueron aisladas con cilindros clonantes, fueron transferidas para separar pocillos y en frascos individuales eventualmente. Las células solas se replicaron como rCEM típicas y se diferenciaron en neuronas reactivas con ENE después del tratamiento con BME.

El análisis de cuatro líneas clonales distintas se muestra en la figura 7A-7D. Cada clon individual generó células refractiles, que tenían proyecciones, reactivas con ENE después del tratamiento con BME. Las rCEM no diferenciadas (>) y las células de transición (\rightarrow) fueron evidentes en cada línea clonal. Por lo tanto, los clones derivados a partir de una célula sola pueden dar lugar tanto a rCEM como a neuronas, indicando las características de la célula madre.

Las células estromales humanas se diferencian en neuronas

El potencial neuronal de las CEM no era único en roedores como se demuestra en los experimentos siguientes usando las CEM obtenidas a partir de seres humanos (hCEM). Las hCEM fueron aisladas a partir de un donante adulto sano y fueron cultivadas in vitro (Bjornson et al., 1999, Science 283:534-537). Las hCEM imitaban a sus homólogas de roedor, creciendo como grandes células planas en estado no diferenciado.

Las células del paso dos fueron sometidas al protocolo de diferenciación neuronal y fueron teñidas para la expresión con ENE o NF-M. Después del tratamiento con BME, las hCEM lograron características neuronales y aumentaron la expresión de ENE en un plazo de tiempo similar al observado para las rCEM. Los cuerpos celulares contraídos elaboraron proyecciones y se tiñeron fuertemente para la expresión de ENE a las 3 horas (figuras 8A y 8B). También fueron evidentes células de transición (\rightarrow). Muchas proyecciones elaboradas por neuronas derivadas de hCEM exhibieron bulbos terminales (flecha en 8B), que pueden representar conos de crecimiento. Las morfologías del cono de crecimiento con extensiones filopodiales (\leftrightarrow) eran claramente evidentes en las proyecciones elaboradas por neuronas apareadas representadas en la imagen en la figura 8C. Estas células también expresaron NF-M, lo que es compatible con su diferenciación neuronal (figura 8D).

Los datos descritos en este documento demuestran que las CEM de rata y ser humano conservan la capacidad de diferenciarse en derivados no mesenquimales, específicamente en neuronas, sugiriendo que los mecanismos genómicos intrínsecos de compromiso, la restricción del linaje y el destino de la célula son mutables. Las señales ambientales al parecer pueden producir la expresión de la pluripotencialidad que se extiende bien más allá de las restricciones del destino aceptadas de células que provienen de capas germinales embrionarias clásicas. Estas células adultas son ambas autorenovadoras y multipotenciales (Owens y Friedenstein, 1988, "Ciba Foundation Symp. 136", Chichester, U.K. págs. 42-60; Prockop, 1997, Science 276; 71-74; Ferrari et al., 1998, Science 279:1528-1530; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9:641-650; Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857-4861; Kuznetsov et al.,1997, Brit. J. Haemotology 97:561-570; Majumdar et al., 1998, J. Cell. Physiol. 176:57-66; Pittenger et al., 1999, Science 284: 143-147), satisfaciéndose así muchos de los criterios de una población de células madre.

En el mejor de los conocimientos de los solicitantes, ésta es la primera publicación de que células mesenquimales periféricas puedan diferenciarse en neuronas in vitro. Además, la presente invención proporciona, por primera vez, los métodos para dirigir la diferenciación de CEM en neuronas in vitro. Las CEM son útiles en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades neurológicas, trastornos y condiciones, y estas células ofrecen ventajas significativas respecto a otras células denominadas "madre". Es decir, las células de la médula ósea son fácilmente obtenibles, evitando los riesgos de obtener células madre neurales a partir del cerebro, y proporcionar una población reanudable que puede ser ampliada in vitro, permitiendo así complejas manipulaciones génicas que se realizan para terapias génicas ex vivo y/o para terapias celulares para las enfermedades del SNC, trastornos o condiciones que requieren administrar células a un sitio del SNC. Además, el trasplante autólogo supera las preocupaciones éticas e inmunológicas asociadas al uso del tejido fetal. Además, las CEM crecen rápidamente en cultivos, excluyendo la necesidad de la inmortalización, y se diferencian en neuronas exclusivamente usando los protocolos descritos en este documento.

Expresión de proteínas neuronales en células neuronales diferenciadas de CEM

Los datos descritos en este documento demuestran que las células neuronales diferenciadas a partir de CEM, según se describe en este documento, expresan varias proteínas relacionadas con las neuronas. Por ejemplo, el análisis inmunocitoquímico de estas neuronas diferenciadas reveló la expresión de \beta-3 tubulina. Además, TOAD 64, una proteína neuronal de función desconocida, es también detectable usando técnicas inmunocitoquímicas, así como la sinaptofisina, que está relacionada con la sinápsis y las vesículas sinápticas. Usando los procesos policlonales y monoclonales basados en anticuerpos, se ha demostrado que estas células expresan la colinacetiltransferasa, una enzima responsable de la síntesis del neurotransmisor acetilcolina. Finalmente, la tirosina hidroxilasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de catecolaminas, también fue detectada inmunocitoquímicamente en una población de estas neuronas diferenciadas.

Es evidente que debido a la presencia de estos productos génicos neuronales, las neuronas diferenciadas pueden ser terapéuticamente beneficiosas en el tratamiento de aquellas enfermedades que afecten a los sistemas colinérgicos y catecolaminérgicos, tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la esquizofrenia.

Trasplante de las neuronas diferenciadas en animales experimentales

Las neuronas diferenciadas generadas, según se describe en este documento, fueron además analizadas para determinar su viabilidad in vivo. Las neuronas fueron trasplantadas, usando una técnica estéril y procesos neuroqurúrgicos conocidos y aceptados (1997, Grill et al.; 1995, Gage et al.; 1994, Dunnett et al.), en el hipocampo o estriado del cerebro o el asta dorsal de la médula espinal de ratas individuales. Cada rata recibió un trasplante en una de las zonas anteriormente mencionadas. Las ratas fueron devueltas a sus jaulas y se les proporcionó un cuidado postoperatorio estándar con acceso a alimentos y agua ad libitum.

Para determinar si la viabilidad de las neuronas era mantenida in vivo, fue llevado a cabo un estudio postoperatorio de las ratas que recibían el trasplante. Las ratas que recibieron el trasplante neuronal fueron examinadas 42 días después de la operación del trasplante. Usando microscopía de fluorescencia para detectar las células trasplantadas reactivas respecto a bisbencimida, los estudios histológicos del hipocampo y de las regiones estriales del cerebro revelaron que las neuronas trasplantadas sobrevivían en el hipocampo. Este resultado indica que la supervivencia a largo plazo de las neuronas trasplantadas y diferenciadas es posible. Un examen de las ratas que recibieron las neuronas trasplantadas en el asta dorsal de la médula espinal demostró un período de supervivencia de al menos tres días. Además, las proyecciones de las neuronas trasplantadas en esta zona crecieron al menos de dos a tres veces más en longitud que el diámetro del cuerpo celular.

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Como es evidente a partir de estos resultados, las neuronas trasplantadas y diferenciadas expresan muchas proteínas neuronales, conservan la viabilidad in vivo, y evidentemente no ejercen ningún efecto deletéreo detectable sobre el animal vivo. Por consiguiente, estas neuronas crean un potencial tratamiento terapéutico para una variedad de enfermedades del cerebro y de la médula espinal, incluyendo, pero no limitadas a, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y el daño de médula espinal como consecuencia de un traumatismo o una degeneración.

Aunque la invención ha sido descrita con referencia a realizaciones específicas es evidente que otras realizaciones y variaciones de esta invención, según se define en las reivindicaciones, pueden ser inventadas por otros expertos en la técnica sin abandonar el verdadero espíritu y el alcance de la invención. Las reivindicaciones añadidas son requeridas para que se interprete que incluyen todas tales realizaciones y variaciones equivalentes.

Claims (22)

1. Un método para inducir la diferenciación de células estromales de la médula ósea en neuronas, comprendiendo dicho método transferir células estromales de la médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células estromales de la médula ósea aisladas en neuronas.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales de la médula ósea aisladas son células humanas.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho antioxidante se selecciona a partir del grupo que consiste en \beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, ácido ascórbico, dimetilfumarato y n-acetilcisteína.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicho antioxidante es \beta-mercaptoethanol.

5. El método de la reivindicación 3, en el que dicho antioxidante es dimetilsulfóxido.

6. El método de la reivindicación 3, en el que dicho antioxidante es dimetilsulfóxido e hidroxianisol butilado.

7. Un método in vitro para producir células neuronales aisladas, comprendiendo dicho método aislar células estromales de la médula ósea, transferir las células estromales de la médula ósea aisladas a un medio sin suero que contiene un antioxidante, en el que dicho antioxidante induce a dichas células estromales de la médula ósea aisladas a diferenciarse en células neuronales aisladas, produciéndose así dichas células neuronales aisladas.

8. El uso de una población aislada de células que comprenden células neuronales obtenidas a partir de una muestra de médula ósea a partir de un donante humano, después del aislamiento de las células estromales a partir de dicha muestra de médula ósea y la inducción de dichas células estromales para diferenciarse en células neuronales aisladas transfiriendo las células estromales aisladas de la médula ósea en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante, para preparar un medicamento para efectuar el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central de un paciente humano.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que dicha enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central se selecciona a partir del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, un tumor, un traumatismo, demencia senil, la enfermedad de Tay-Sach, la enfermedad de Sandhoffs, el síndrome de Hurler, la enfermedad de Krabbe, daño traumático del sistema nervioso central inducido en el nacimiento, epilepsia, esclerosis múltiple, traumatismo, tumor, apoplejía y daño de la médula espinal.

10. El uso de la reivindicación 8, en el que dichas células neuronales aisladas habían sido transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, en el que dicha proteína es expresada en dichas células, lo que sirve para efectuar el tratamiento de dicha enfermedad, trastorno o condición.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que dicho ácido nucleico aislado codifica una proteína terapéutica seleccionada a partir del grupo de una citoquina, una quimiocina, una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo y una proteína tóxica de glioma.

12. El uso de una población de células que comprenden células neuronales obtenidas a partir de células estromales de la médula ósea de un paciente humano, después de la propagación de dichas células estromales de la médula ósea en un cultivo en condiciones que inducen a su diferenciación en células neuronales, inducidas transfiriendo células estromales aisladas de la médula ósea en un medio sin suero que contiene un antioxidante, para preparar un medicamento para el tratamiento de un paciente humano en necesidad de dichas células neuronales.

13. Una población aislada de células que comprenden neuronas hechas por un método para inducir la diferenciación de células estromales de la médula ósea aisladas, comprendiendo dicho método transferir células estromales de la médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células estromales de la médula ósea aisladas en dichas células neuronales.

14. La población de la reivindicación 13, en el que dichas células son células humanas.

15. Una población aislada de células que comprenden células neuronales hechas por un método para inducir la diferenciación de células estromales de la médula ósea aisladas, comprendiendo dicho método transferir células estromales de la médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células estromales de la médula ósea aisladas en dichas células neuronales, en el que dichas células neuronales además son transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica y, además, en el que, cuando dicha proteína es expresada en células, dicha proteína sirve para efectuar el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central.

16. La población de la reivindicación 15, en el que dicho ácido nucleico aislado codifica una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en una citoquina, una quimiocina, una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo y una proteína tóxica de glioma.

17. La población de la reivindicación 15, en el que dichas células son células humanas.

18. Una población aislada de células que comprenden células neuronales hechas por un método in vitro para producir células neuronales aisladas, comprendiendo dicho método aislar células estromales de la médula ósea, transferir las células estromales de la médula ósea aisladas a un medio sin suero que contiene un antioxidante, en el que dicho antioxidante induce a que dichas células estromales de la médula ósea aisladas se diferencien en dichas células neuronales aisladas, produciéndose así dicha población aislada que comprende células neuronales.

19. La población de la reivindicación 18, en el que dichas células son células humanas.

20. Una población aislada de células que comprenden células neuronales hechas por un método in vitro para producir células neuronales aisladas, comprendiendo dicho método aislar células estromales de la médula ósea, transferir las células estromales de la médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene un antioxidante, en el que dicho antioxidante induce a que dichas células estromales de la médula ósea aisladas se diferencien en dichas células neuronales aisladas, produciéndose así dichas células neuronales aisladas, en el que dichas células neuronales además son transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, y además en el que cuando dicha proteína es expresada en dichas células, dicha proteína sirve para efectuar el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central.

21. La población de la reivindicación 20, en el que dicho ácido nucleico aislado codifica una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en una citoquina, una quimiocina, una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo y una proteína tóxica de glioma.

22. La población de la reivindicación 21, en el que dichas células son células humanas.