ES2292787T3 - Ensayo homogeneo basado en la polimerizacion de fluorescencia para las aflatoxinas. - Google Patents
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Abstract
Ensayo homogéneo para la determinación de las aflatoxinas en productos agrícolas, comprendiendo dicho ensayo homogéneo las etapas que consisten en: combinar un extracto de aflatoxina con un trazador y un anticuerpo para proporcionar una mezcla, siendo dicho anticuerpo específico para la aflatoxina, comprendiendo dicho trazador una oxima de aflatoxina conjugada a un fluoróforo seleccionado de entre el grupo constituido por fluoresceinamina, 5-aminoacetil-amidofluoresceína, y 5-(5-aminopentil)-tioureidil fluoresceína, pudiendo dicho trazador unirse a dicho anticuerpo para producir un cambio detectable en la polarización de fluorescencia; medir la polarización de fluorescencia de dicha mezcla para obtener una medida de la polarización de fluorescencia medida; y comparar dicha polarización de fluorescencia medida con un valor de la polarización de fluorescencia caracterizado, correspondiendo dicho valor de la polarización de fluorescencia caracterizado a una concentración de la aflatoxina conocida.
Description
Ensayo homogéneo basado en la polimerización de
fluorescencia para las aflatoxinas.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La presente invención se refiere al campo de los
ensayos de micotoxinas. Más particularmente, la presente invención
se refiere a un ensayo homogéneo que utiliza cambios en la
polarización de fluorescencia para detectar la presencia de
aflatoxinas en los productos agrícolas.
Las aflatoxinas son micotoxinas producidas por
los hongos Aspergillus flavus^{1}. Las aflatoxinas se han
conocido durante largo tiempo, pero su carcinogenicidad se detectó
inicialmente en los últimos años 60. Varias formas de aflatoxinas,
incluyendo B_{1}, B_{2}, G_{1} y G_{2} y muchas otras, se
han encontrado en muchas formas de alimentos humanos, tales como
cereales, granos y productos del cacahuete ^{9.11}. La aflatoxina
B_{1} es la más tóxica y abundante de todas. Una exposición a las
aflatoxinas se ha asociado con un aumento en la incidencia de
carcinoma hepatocelular primario ^{7}.
Debido a su toxicidad y carcinogénesis, se han
ideado varios procedimientos analíticos para determinar
cuantitativamente la cantidad de aflatoxinas en los productos
agrícolas ^{1-4, \ 6,8}. Una dificultad con dichos
ensayos es que las aflatoxinas son muy hidrófobas y por tanto, muy
insolubles en disolventes acuosos. Así, se han utilizado
generalmente mezclas de disolventes orgánicos con agua para extraer
las aflatoxinas de las muestras.
Otra dificultad es que la mayoría de los ensayos
habituales que incluyen TLC y HPLC^{10}, requieren etapas
duraderas de limpieza y de derivatización, para deshacerse de
sustancias que pudieran interferir. Los procedimientos ELISA son
relativamente más rápidos pero difíciles de cuantificar, debido a
varias etapas de lavado, transferencias de líquidos y tiempos de
incubación y etapas de limpieza (por ejemplo, Holladay et al,
Amer. J.V et Res., V52, p 222-223).
De acuerdo con esto, resulta necesario un ensayo
para determinar aflatoxinas que sea rápido, sencillo en su
aplicación y que pueda proporcionar resultados cuantitativos.
En un primer aspecto principal, la presente
invención proporciona un ensayo homogéneo para determinar
aflatoxinas en productos agrícolas. Un extracto de aflatoxina se
combina con un trazador y un anticuerpo para proporcionar una
mezcla. El anticuerpo es específico para la aflatoxina. El trazador
comprende una oxima aflatoxínica conjugada con un fluoróforo
seleccionado de entre el grupo constituido por fluoresceinamina,
5-aminoacetil amido fluoresceína y
5-(5-aminopentil)-tioureidil
fluoresceína. El trazador puede unirse al anticuerpo para producir
un cambio detectable en la polarización de la fluoresceína. La
polarización de fluorescencia de la mezcla se mide y compara con una
curva estándar.
En un segundo aspecto principal, la presente
invención proporciona un kit de ensayo para la determinación de las
aflatoxinas. El kit de ensayo comprende un anticuerpo y un trazador,
cada uno en una cantidad apropiada para por lo menos, un ensayo, y
un embalaje apropiado. El anticuerpo es específico para la
aflatoxina. El trazador comprende una oxima aflatoxínica conjugada
con un fluoróforo seleccionado de entre el grupo formado por
fluoresceinamina, 5-aminoacetil amido fluoresceína y
5-(5-aminopentil)-tioureidil
fluoresceína. El trazador puede unirse al anticuerpo para producir
un cambio detectable en la polarización de fluorescencia.
La Figura 1 es un gráfico que muestra el cambio
en la polarización de fluorescencia con respecto al tiempo, para un
conjunto de concentraciones de aflatoxina, según una forma de
realización de la presente invención.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el cambio
en la polarización de fluorescencia con respecto al tiempo, para
una mezcla que no contenga aflatoxina y un conjunto de
concentraciones de metanol, utilizando los datos de la Tabla 1,
según una forma de realización de la presente invención.
La Figura 3 es una curva estándar para un ensayo
de polarización de fluorescencia para las aflatoxinas, utilizando
los datos de la Tabla 2, según una forma de realización de la
presente invención.
La Figura 4 es un gráfico que compara la
concentración de aflatoxinas de las muestras, tal como se evalúa
utilizando HPLC, con la concentración de aflatoxina calculada a
partir de la curva estándar de la Figura 3, según una forma de
realización de la presente invención.
La Figura 5 es un gráfico que compara la
concentración de aflatoxina de las muestras a las que se le añadió
la concentración de aflatoxina calculada a partir de las mediciones
de la polarización de fluorescencia, según una forma de realización
de la presente invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Figura 6 es una curva estándar para un ensayo
de polarización de la fluoresceína para aflatoxinas, que se utiliza
para obtener los datos en las Tablas 6 y 7, según una forma de
realización de la presente invención.
Las formas de realización preferidas de la
presente invención proporcionan un ensayo homogéneo relativamente
sencillo para la determinación de aflatoxinas en los productos
agrícolas, que se basa en mediciones de la polarización de
fluorescencia. La técnica de polarización de fluorescencia se ha
utilizado con éxito en varios ensayos, implicando a proteínas,
enzimas, medicamentos, ADN, hormonas, péptidos y anticuerpos.
El principio en el que se basa la técnica de
polarización de fluorescencia es el siguiente. Las sondas
fluorescentes que poseen un bajo peso molecular, presentan bajos
valores de polarización, debido a su rápida rotación, mientras que
las sondas fluorescentes con pesos moleculares mayores presentan una
polarización mayor, debido a su rotación más lenta. Así, el valor
de polarización de un fluoróforo aumenta después de su unión a una
molécula más grande. Se proporciona información adicional respecto
a la técnica de polarización de fluorescencia, en las patentes US
nº 5.427.960 y nº 5.976.820 y en Nasir, M.S. y Jolley, M.E.
"Fluorescence Polarization: An analytical tool for immunoassay and
Drug Discovery", Combinatorial Chemistry & High Throughput
Screening, 1999, 2, 177-190, cuyas referencias se
incorporan a la presente memoria como referencia.
En la presente invención, la aflatoxina extraída
de una muestra compite con un trazador fluorescente en presencia de
un anticuerpo monoclonal, dando lugar, de este modo, a un cambio en
la polarización fluorescente que depende de la concentración de
aflatoxina.
Las formas de realización preferidas de la
presente invención proporcionan un ensayo homogéneo para la
aflatoxina que es sensible, rápido, sencillo y barato. Asimismo,
puede resultar transportable en el campo y dar lugar a resultados
cuantitativos.
En estos estudios, se utilizaron dos anticuerpos
monoclonales distintos de la aflatoxina. En un trabajo inicial de
desarrollo del ensayo, se utilizó un anticuerpo monoclonal de la
aflatoxina, obtenido de Sigma (nº catálogo A-9555),
pero se descubrió que mostraba sensibilidad al metanol. En un
trabajo posterior, se utilizó un anticuerpo monoclonal puesto a
disposición por el Dr. Chris Maragos de la Agricultural Research
Unit of the United States Department of Agriculture (Peoria,
Illinois), porque se encontró que era estable en metanol. La
utilización de este anticuerpo monoclonal descubrió en Chris M.
Maragos y Vicki S. Thompson, "Fiber-optic
Immunosensor for Mycotoxins", Natural Toxins
7:371-376 (1999). Además, se conocen muchos otros
anticuerpos monoclonales para las aflatoxinas Véase, por
ejemplo, la patente US nº 4.835 100.
Muestras de maíz que fueron contaminadas
naturalmente con aflatoxinas, y muestras de maíz sin aflatoxinas se
obtuvieron del Trilogy Analytical Laboratoy, Inc (Washington,
Missouri). Trilogy proporcionó también una mezcla de Aflatoxinas
B_{1}/B_{2}/G_{1}/G_{2} (7/1/3/1). La Aflatoxina B1 pura se
obtuvo a partir de Sigma.
Las mediciones de la polarización de
fluoresceína se llevaron a cabo a temperatura ambiente, utilizando
un instrumento tubular de polarización de fluorescencia
Sentry-FP (Diachemix Corp).
En un matraz de fondo redondeado de 10 ml,
provisto de un agitador magnético y un condensador, la Aflatoxina
B1 (5 mg, 0,016 mmol, Sigma), y el hemiclorhidrato de
O-carboximetil-hidroxilamina (41 mg,
0,19 mmol, Sigma), se mezclaron con 1,2 ml de etanol absoluto. A
esta solución se le añadieron con agitación 230 \mul de una
solución 2M NaOH (0,46 mmol), sometiéndose a reflujo durante 3
horas. La solución resultante se agitó durante la noche en un
evaporador rotatorio, y se diluyó a 1,5 ml con agua. Se añadieron
gotas de 1N NaOH para ajustar el pH hasta aproximadamente 9,
lavándose la solución con acetato de etilo (utilizando dos porciones
de aproximadamente 3 ml cada una). La capa acuosa se acidificó con
6M HCl a pH de aproximadamente 2, guardándose la mezcla resultante
a 0ºC en un refrigerador. Precipitó algún sólido, que se separó y
secó. La TLC en sílice utilizando acetato de etilo: MeOH:NH_{4}OH
(32:17:5), dio lugar a una mancha principal con un Rf de
aproximadamente 0,5, que corresponde al producto oxímico.
Se mezclaron 20 \mul de una solución THF de
(Aflatoxina B1)-O-carboximetiloxima,
preparada tal como se ha descrito anteriormente, con 20 \mul de
diciclohexilcarbodiimida (DCC) en cloruro de metileno (10 mg/ml) y
200 \mul cloruro de metileno. Después de 2-3
minutos, se añadieron 20 \mul de una solución THF de
fluoresceinamina (isómero 2,10 mg/ml). La reacción se llevó a cabo
durante la noche a temperatura ambiente. Como control, la misma
reacción se procesó asimismo sin la oxima aflatoxínica, La TLC de
los productos (utilizando CHCl_{3}:MeOH:CH_{3}CO_{2}H,
40:10:3), mostró muchas manchas. Una, con un Rf de aproximadamente
0,7, no se encontraba en la TLC del control. Este trazador se
recuperó, se disolvió en MeOH, y se diluyó entonces en tampón, de
forma que dio lugar a una intensidad de aproximadamente 400.000
unidades, de unidades relativas de fluorescencia, cuando 10 \mul
de esta solución trazadora se añadieron a 1 ml del tampón.
Se observó que este trazador dio lugar a una
polarización estable de aproximadamente 40 mP. Después de añadir 10
\mul de un anticuerpo diluido 1/50, (Sigma,
A-9555), para alcanzar una dilución final de
1/5.000, la polarización aumentó lentamente hasta aproximadamente
230 mP durante cinco minutos.
Con el fin de confirmar la reactividad, se tomó
1 ml del tampón y se mezcló con 10 \mul del anticuerpo y 10
\mul de Aflatoxina B_{1} (0,8 mg/ml). La mezcla se mantuvo a
temperatura ambiente durante cinco minutos y se blanqueó entonces
en el instrumento FP (es decir, se consideró entonces en éste la
matriz de la muestra). Después de que se añadieran 10 \mul del
trazador, la polarización de la fluoresceína disminuyó desde
aproximadamente 230 mP a aproximadamente 41 mP.
Se preparó un trazador distinto de la Aflatoxina
B_{1} utilizando una reacción similar pero con fluoresceinamina
(isómero 1) como fluoróforo. El trazador resultante mostró menos
sensibilidad que cuando se utilizó la fluoresceinamina (isómero 2)
como fluoróforo. Específicamente, la polarización inicial
(aproximadamente 32 mP) cambió sólo a aproximadamente 140 mP,
cuando se añadió el anticuerpo.
Los trazadores de la Aflatoxina B_{1} se
prepararon también utilizando otros derivados amina de fluoresceína,
como el fluoróforo. Los resultados se sumarizan de la forma
siguiente. Cuando se utilizó la 5-amino
acetil-amidofluoresceína (5AAF), el trazador
resultante tenía una polarización de fluorescencia de
aproximadamente 30 mP, que aumentó hasta aproximadamente 65 mP
cuando se añadió el anticuerpo. Cuando la
5-(5-aminopentil)-tioureidil
fluoresceína (5,5APTF) se ensayó como fluoróforo, el trazador tenía
una polarización de fluorescencia de aproximadamente 35 mP, que
aumentó hasta aproximadamente 102 mP después de añadir el
anticuerpo. También se ensayaron la fluoresceína tiosemicarbazida
(FTSC), la 4-aminometil fluoresceína y la
5-aminoemtilfluoresceína, pero estos fluoróforos no
dieron lugar a ningún producto activo, es decir, no mostraron ningún
cambio significativo en la polarización de fluorescencia después de
su unión al anticuerpo. Por tanto, se llegó a la conclusión, a
partir de estos estudios, de que el isómero 2 de la
fluoresceinamina dio los mejores resultados para este
anticuerpo.
El anticuerpo de la aflatoxina se obtuvo de
Sigma (A-9555) y se utilizó para un desarrollo
inicial del ensayo después de diluirlo (1/150.000)en
PBSA-BGG (pH de aproximadamente 7,5), que es una
solución tampón de fosfato que contiene 1 gramo por litro de azida
sódica y 9 gramos por litro de cloruro sódico, con una globulina
gamma bovina (BGG) presente a una concentración de 100 \mug/ml.
Se mezcló 1 ml de la solución del anticuerpo con 50 \mul de una
solución que tenía una concentración conocida de Aflatoxina B_{1}
libre en metanol/agua (70/30). Se utilizaron concentraciones de
Aflatoxina B_{1} comprendidas entre 0 y 40 ppb. Después de llevar
a cabo una medición en blanco, se añadieron 10 \mul del trazador
diluido, preparados tal como se ha descrito anteriormente,
utilizando fluoresceinamina (isómero 2) como fluoróforo,
controlándose durante 10 minutos el cambio en la polarización de
fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Ya que las aflatoxinas se extraen típicamente de
muestras agrarias utilizando una muestra de un disolvente orgánico y
agua, se estudió el efecto del metanol sobre el anticuerpo de la
Aflatoxina de Sigma (A-9555). Específicamente, se
mezcló 1 ml de la solución diluida del anticuerpo con una
concentración conocida de metanol. Después de medir un blanco, se
añadió el trazador (el trazador descrito anteriormente, la oxima de
la Aflatoxina B_{1}, oxima isómero 2 de la fluoresceinamina),
midiéndose la polarización de fluoresceína a lo largo del tiempo.
Los resultados se sumarizan en la Tabla 1 a continuación y en la
Figura 2.
Estos resultados muestran que la polarización de
fluorescencia disminuye a medida que aumenta la concentración de
metanol y, para una concentración dada de metanol, la polarización
de fluorescencia aumenta a lo largo del tiempo. Así, aunque el
trazador en sí mismo es estable en metanol y en los disolventes
orgánicos relacionados durante un extenso período de tiempo, estos
resultados sugieren que este anticuerpo es sensible al metanol.
Como resultado, aunque este anticuerpo es sensible para utilizarlo
en un ensayo basado en la polarización de fluorescencia para las
aflatoxinas, resulta preferido utilizar un anticuerpo que sea más
estable en el metanol, para obtener resultados más fiables. Se
encontró que el anticuerpo monoclonal disponible a partir del Dr.
Chris Maragos (de la Agricultural Research Unit of the United States
Department of Agriculture (Peoria, Illinois), presentaba la
estabilidad deseada en metanol.
Muestras de maíz que estaban contaminadas de
forma natural con aflatoxinas, se obtuvieron de Trilogy Analytical
Laboratory, Inc. (Washington, Missouri). Se extrajo la Aflatoxina de
cada muestra de 20 g de los granos machacados, utilizando 100 ml de
una mezcla MeOH/agua (70/30) por duplicado, agitando cada muestra de
vez en cuando durante aproximadamente 30 minutos. Los extractos se
filtraron mediante un ligero papel de filtro y se guardaron para
análisis en recipientes precintados a temperatura ambiente.
Se prepararon estándares en MeOH/agua (70/30)
diluyendo un concentrado de Aflatoxina
B_{1}/B_{2}/G_{1}/G_{2} (7/1/3/1) proporcionado por Trilogy
a varias concentraciones. Se mezclaron 40 \mul de cada muestra o
estándar con una solución de 1 ml de anticuerpo (1/150.000 en
tampón PBSA-BGG) en un tubo de ensayo. El anticuerpo
que se utilizó fue el anticuerpo resistente al metanol
proporcionado por el Dr. Chris Maragos. Después de blanquear cada
muestra, se añadieron 10 \mul del trazador en cada tubo,
incubándose las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente,
midiéndose entonces la polarización de fluorescencia para cada tubo.
El trazador que se utilizó fue la oxima de la Aflatoxina B_{1},
oxima isómero 2 de la fluoresceinamina anteriormente descrita. Se
graficó una curva estándar utilizando valores duplicados. Los
valores de polarización de fluorescencia para los estándares, se
muestran en la Tabla 2 y en la Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de aflatoxina en cada muestra
de maíz se calculó entonces a partir de la curva estándar. Los
resultados se sumarizan en la Tabla 3 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Estas muestras se analizaron también utilizando
tanto el protocolo de polarización de fluorescencia descrito
anteriormente como las técnicas estándares de HPLC, comparándose las
concentraciones de aflatoxina que fueron determinadas utilizando
estas dos técnicas. Los resultados se sumarizan a continuación en la
Tabla 4 y en la Figura 4, excepto para los resultados de una
muestra que tuvieron un nivel muy alto de contaminación de
aflatoxina. Estos resultados muestran una buena correlación entre
HPLC y FP (r^{2} = 0,97).
20 g de muestras machacadas de maíz, libres de
aflatoxinas, se sometieron a una mezcla de Aflatoxina
B_{1/}B_{2}/G_{1}/G_{2} (7/1/3/1) hasta una concentración
conocida. Se llevó a cabo el análisis de polarización de
fluorescencia por duplicado en cada extracto, tal como se ha
expuesto anteriormente. La concentración de aflatoxina de cada
muestra se calculó a partir del promedio medido mediante la
polarización de fluorescencia, utilizando una curva de calibración,
y comparándola con la concentración conocida que se había añadido al
maíz. Los resultados se sumarizan en la Tabla 5 a continuación, y
en la Figura 5. En este estudio, la muestra a la que se le añadió
la aflatoxina hasta 320 ppb, se diluyó 1/10 para la medición de la
polarización de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran una buena correlación
entre los valores teóricos y los resultados obtenidos utilizando el
ensayo de polarización de fluorescencia de la presente invención
(r^{2} = 0,996). Sin embargo, los resultados de la polarización de
fluorescencia infravaloran consistentemente la actual concentración
de Aflatoxina. Una explicación es que las muestras contaminadas de
forma natural contenían principalmente B_{1} y algunas B_{2},
pero no G_{1} ni G_{2}, mientras que las muestras de maíz se
proporcionaron con una mezcla de Aflatoxina
B_{1}/B_{2}/G_{1}/G_{2} en una proporción (7/1/3/1).
Para comprobar esta explicación, se investigó la
reactividad cruzada de estas aflatoxinas. Las Aflatoxinas B1, B2,
G1, G2 se obtuvieron a partir de Sigma y se diluyeron
individualmente en una mezcla de metanol/agua (70/30) para dar
lugar a un conjunto de concentraciones, principalmente de 10, 25,
40, 80 y 100 ppb. La curva estándar que se muestra en la Figura 6
se obtuvo llevando a cabo el ensayo de polarización de fluorescencia
que se describe en la presente Memoria en las soluciones de
Aflatoxina B1. Las Tablas 6 y 7 muestran los resultados para la
Aflatoxina G_{1} y G_{2} respectivamente, calculando las
concentraciones de Aflatoxina a partir de la curva de calibración
de la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que las
concentraciones de Aflatoxina G_{1} y G_{2} se evalúan a la baja
(se infravaloran) cuando se calculan a partir de una curva de
calibración obtenida a partir de sólo la Aflatoxina B_{1}. Más
particularmente, ambas Aflatoxinas G_{2} y G_{1} reaccionan
cruzadamente sólo en un 30-40% con la Aflatoxina
B_{1}. Esto puede explicar la infravaloración de la concentración
de aflatoxina que se observa en las muestras de maíz a las que se
añadió ésta.
Los materiales utilizados para llevar a cabo el
ensayo de la presente invención se disponen preferentemente en
forma de un kit. Este incluye preferentemente una cantidad de
solución extractora para obtener la aflatoxina a partir de las
muestras de granos u otros productos, trazadores y anticuerpos, en
una cantidad apropiada para, por lo menos, un ensayo, junto con un
embalaje apropiado e instrucciones para su utilización. El trazador
y el anticuerpo pueden proporcionarse en solución, como dispersión
líquida, o como un polvo substancialmente seco (por ejemplo, en
forma liofilizada).
El embalaje apropiado puede consistir en
cualquier matriz o material sólidos, tales como vidrio, plástico,
papel, espuma y similares, que pueden mantener separadamente, dentro
de límites fijos, el tampón, el trazador y el anticuerpo. Por
ejemplo, el disolvente extractor, el trazador y el anticuerpo
monoclonal pueden proporcionarse como soluciones en recipientes
separados marcados o en viales realizados en plástico o vidrio.
El anticuerpo es específico para las aflatoxinas
y es preferentemente un anticuerpo monoclonal. Muy preferentemente,
el anticuerpo monoclonal resulta estable en el disolvente
extractor.
El trazador comprende un fluoróforo conjugado a
una oxima aflatoxímica, preferentemente la (Aflatoxina
B_{1}-O-carboximetiloxima.
Fluoróforos apropiados son la fluoresceinamina (isómero 1), la
fluoresceinamina (isómero 2), la 5-amino
acetil-amidofluoresceina (5AAF) y la
5-(5-aminopentil)-tioureidil
fluoresceína (5,5APTF). Preferentemente, el fluoróforo es la
fluoresceinamina. Muy preferentemente, el fluoróforo es
fluoresceinamina (isómero 2).
El disolvente extractor es preferentemente una
mezcla de un disolvente orgánico, tal como metanol o acetonitrilo,
en agua. Muy preferentemente, el disolvente extractor es una mezcla
metanol/agua (70/30).
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Aflatoxins B and G1". J. Am. Chem. Soc. 1965, 87,
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Claims (16)
1. Ensayo homogéneo para la determinación de las
aflatoxinas en productos agrícolas, comprendiendo dicho ensayo
homogéneo las etapas que consisten en:
combinar un extracto de aflatoxina con un
trazador y un anticuerpo para proporcionar una mezcla, siendo dicho
anticuerpo específico para la aflatoxina, comprendiendo dicho
trazador una oxima de aflatoxina conjugada a un fluoróforo
seleccionado de entre el grupo constituido por fluoresceinamina,
5-aminoacetil-amidofluoresceína, y
5-(5-aminopentil)-tioureidil
fluoresceína, pudiendo dicho trazador unirse a dicho anticuerpo para
producir un cambio detectable en la polarización de
fluorescencia;
medir la polarización de fluorescencia de dicha
mezcla para obtener una medida de la polarización de fluorescencia
medida; y
comparar dicha polarización de fluorescencia
medida con un valor de la polarización de fluorescencia
caracterizado, correspondiendo dicho valor de la
polarización de fluorescencia caracterizado a una
concentración de la aflatoxina conocida.
2. Ensayo según la reivindicación 1, en el que
dicho fluoróforo es un isómero de la fluoresceinamina.
3. Ensayo según la reivindicación 2, en el que
dicho fluoróforo es el isómero 2 de la fluoresceinamina.
4. Ensayo según la reivindicación 1, en el que
dicha oxima de aflatoxina es la (Aflatoxina
B_{1})-O-carboximetiloxima.
5. Ensayo según la reivindicación 1, que
comprende además las etapas que consisten en:
proporcionar una pluralidad de soluciones
estándares de aflatoxina, presentando cada una de dichas soluciones
estándares de aflatoxina una concentración conocida distinta de
aflatoxina;
añadir dicho trazador y dicho anticuerpo a cada
una de dicha pluralidad de las soluciones estándares de aflatoxina,
de manera que se proporcione una pluralidad de mezclas estándares,
y
medir la polarización de fluorescencia de cada
una de dicha pluralidad de dichas mezclas estándares, para
proporcionar una pluralidad de valores de polarización de
fluorescencia estándares, que corresponden a las concentraciones de
aflatoxina conocidas.
6. Kit según la reivindicación 5, en el que
dicho valor caracterizado de polarización de fluorescencia es
uno de dichos valores de polarización de la fluorescencia
estándares.
7. Kit de ensayo para la determinación de las
aflatoxinas en productos agrícolas, comprendiendo dicho kit de
ensayo:
un anticuerpo y un trazador, cada uno en una
cantidad apropiada para por lo menos un ensayo, y un embalaje
apropiado, siendo específico dicho anticuerpo para la aflatoxina,
comprendiendo dicho trazador una oxima de aflatoxina conjugada a un
fluoróforo seleccionado de entre el grupo constituido por
fluoresceinamina,
5-aminoacetil-amidofluoresceína, y
5-(5-aminopentil)-tioureidil
fluoresceína.
8. Kit de ensayo según la reivindicación 7, en
el que dicho fluoróforo es la fluoresceinamina.
9. Kit de ensayo según la reivindicación 8, en
el que dicho fluoróforo es el isómero 2 de la fluoresceinamina.
10. Kit de ensayo según la reivindicación 7, en
el que dicha oxima de aflatoxina es la (Aflatoxina
B_{1})-O-carboximetiloxima.
11. Oxima de aflatoxina conjugada a un
fluoróforo seleccionado de entre el grupo constituido por
fluoresceinamina,
5-aminoacetil-amidofluoresceína y
5-(5-aminopentil)-tioureidil
fluoresceína para llevar a cabo el ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
12. Oxima de aflatoxina según la reivindicación
11, en la que dicho fluoróforo es un isómero de la
fluoresceinamina.
13. Oxima de aflatoxina según la reivindicación
12, en la que dicho fluoróforo es un isómero 2 de la
fluoresceinamina.
14. Oxima de aflatoxina según la reivindicación
11, en la que dicha oxima aflatoxínica es la (Aflatoxina
B_{1})-O-carboximetiloxina.
15. Utilización de la oxima aflatoxínica según
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para la preparación de
un kit de ensayo para la determinación de las aflatoxinas mediante
la polarización de fluorescencia.
16. Utilización según la reivindicación 15, en
la que la preparación comprende además un anticuerpo específico para
la aflatoxina.
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