ES2292968T3 - Separacion integrada de sustancias organicas a partir de una mezcla acuosa de bioproceso. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la separación integrada a partir de un biorreactor de una o varias sustancias orgánicas presentes en una mezcla acuosa de bioproceso, que contiene por lo menos un grupo nitrogenado cargado positivamente y/o por lo menos un grupo nitrogenado que se puede cargar positivamente, en cuyo procedimiento se lleva a cabo una extracción reactiva, en por lo menos una etapa, con un agente de extracción, realizándose que a. se saca desde el biorreactor continuamente una mezcla acuosa de bioproceso, y b. se conduce a una centrífuga del tipo líquido-líquido con un agente de extracción que contiene compuestos orgánicos por lo menos parcialmente de cadena más larga y al menos un intercambiador líquido de cationes, c. se extrae mediante el agente de extracción, obteniéndose una fase orgánica que contiene la sustancia que se ha de extraer desde la mezcla de bioproceso, y d. el material retenido acuoso resultante se devuelve al biorreactor.
Description
Separación integrada de sustancias orgánicas a
partir de una mezcla acuosa de bioproceso.
El presente invento se refiere a un
procedimiento para la separación integrada a partir de un
biorreactor de una o varias sustancias orgánicas presentes en una
mezcla acuosa de bioproceso, que contiene por lo menos un grupo
nitrogenado cargado positivamente y/o por lo menos un grupo
nitrogenado que se puede cargar positivamente, en cuyo
procedimiento se lleva a cabo una extracción reactiva, en por lo
menos una etapa, con un agente de extracción. Como mezcla de
bioproceso se entiende, en el marco de esta solicitud de patente,
cualquier mezcla de proceso en la que se desarrolla una reacción
biocatalítica, p.ej. una fermentación con ayuda de una biomasa o un
proceso químico/enzimático, con ayuda de enzimas disueltas, o
fijadas a soportes o vehículos. Los mencionados procesos pueden
transcurrir de una manera ya sea aerobia o anaerobia y se pueden
realizar como procesos discontinuos (en inglés batch) o
(semi)continuos.
Las técnicas para la separación de compuestos
orgánicos a partir de soluciones acuosas (o respectivamente mezclas
de procesos) son conocidas en gran número. Entre ellas se cuentan
por ejemplo la separación a través de resinas intercambiadoras de
iones, procedimientos de cromatografía, adsorción, filtración,
evaporación, ósmosis inversa, electrodiálisis, etc. Una integración
de tales procesos de separación en bioprocesos, tales como
procedimientos de fermentación, se ha manifestado hasta ahora como
especialmente difícil.
En particular, la obtención de aminoácidos ha
aumentado en interés desde el punto de vista económico en los
últimos años, sobre todo prestando atención a la industria de los
alimentos y de las bebidas. La separación de los aminoácidos
deseados a partir de mezclas de bioprocesos se efectúa p.ej. sobre
todo a través de intercambiadores de iones o por ejemplo mediante
una extracción reactiva. Estos procedimientos se encontraban sin
embargo hasta hace poco tiempo, en el caso de la purificación, en
particular, de caldos de cultivo, con sus límites. Resultaba
desventajosa en el caso de un tratamiento de líquidos de cultivo a
través de intercambiadores de iones, p.ej., la necesidad de un
extenso tratamiento previo de la mezcla que se había de
purificar.
Es conocido además que, en el caso de la
producción por fermentación de L-fenilalanina según
el procedimiento Fed-Batch (alimentado
discontinuamente) se inhibe la formación de productos a partir de
una concentración de L-fenilalanina de
aproximadamente 30 g/l. Con el fin de impedir esta inhibición, es
necesario separar la L-fenilalanina durante el
proceso. Un procedimiento de este tipo se puede designar también
como la denominada "obtención in situ de un producto"
(conocida también en inglés como "in situ Product
Recovery" o "ISPR"). La aplicación de una ISPR se describe
p.ej. en las publicaciones de M. Gerigk y colaboradores, Bioprocess
Biosyst. Eng. 25 (2002) 43 - 52, y de D. Maass y
colaboradores, Bioprocess Biosyst. Eng. (en imprenta).
En el documento de solicitud de patente
internacional WO/66253 se describe un procedimiento para la
separación por extracción reactiva integrada de sustancias
orgánicas nitrogenadas presentes en una mezcla acuosa de bioproceso,
empleándose determinados agentes de extracción, que contienen
compuestos orgánicos por lo menos parcialmente de cadena más larga
y al menos un intercambiador líquido de cationes como vehículo
reactivo, y realizándose la extracción en aparatos de de puesta en
contacto (contactores) de fibras huecas a través de por lo menos
una membrana porosa, que puede ser mojada ya sea por la mezcla
acuosa o por el agente de extracción. La función de la membrana es
en este caso hacer posible un procedimiento de extracción exento de
dispersión, de manera tal que solo tenga lugar un intercambio de
materia entre las sustancias orgánicas nitrogenadas mediante
difusión (como máximo en el marco de la solubilidad de la fase
orgánica y del vehículo) a través de la superficie límite de fases,
estabilizada por la membrana. Al mismo tiempo, debería evitarse en
tal caso en principio la incorporación de la fase de la fase
orgánica en la mezcla acuosa de bioproceso, puesto que esto podría
conducir a una reducción de la actividad del biocatalizador (y/o
del microorganismo). En el caso de un sistema de extracción con
membranas no tiene lugar en principio ninguna mezcladura de las dos
fases (fase orgánica de extracción y mezcla acuosa de
bioproceso).
En el caso de la elección de los sistemas de
vehículos reactivos según el documento WO/66253, se plantean a
pesar de todo unas exigencias muy altas en cuanto a la
biocompatibilidad de los componentes. Se utilizaba preferentemente
el sistema de sustancias biocompatibles con queroseno como
disolvente y ácido
di-2-etil-hexil-fosfórico
(D2EHPA) como agente de extracción (vehículo). El vehículo D2EHPA
era regenerado en tal caso, en una segunda etapa de extracción, con
ácido sulfúrico como agente de extracción. La
L-fenilalanina se aumentaba de concentración en el
ácido sulfúrico. Esto limita las posibilidades de la elección del
sistema, en general, a combinaciones de queroseno y de D2EHPA o
respectivamente con ésteres de ácido
di-nonil-naftaleno-sulfónico
(DNNSE).
La manipulación del sistema de extracción
apoyado en membranas, se ha manifestado sin embargo, en la práctica
ya a la escala piloto (experimental), como costosa. Un aumento de la
escala (en inglés scale-up) en el caso de la
utilización de contactores de fibras huecas es realizable sólo de
una manera condicionada, lo cual p.ej. es debido a la fuerte
dependencia con respecto de la presión. Tan pronto como aparecen
fluctuaciones de la presión, las fases se pueden volver con
facilidad inestables, lo cual puede conducir a una ruptura de las
fases y a la formación de emulsiones, teniendo que terminarse el
proceso. Puesto que, además, la porosidad de las membranas siempre
determina la máxima superficie de intercambio, el transporte de
sustancia y el rendimiento de extracción están bastante limitados
en el caso de una extracción reactiva apoyada en membranas.
\newpage
\global\parskip0.990000\baselineskip
Es por lo tanto una misión del presente invento
poner a disposición un procedimiento para la separación integrada a
partir de un biorreactor de una o varias sustancias orgánicas
presentes en una mezcla acuosa de bioproceso, que contiene por lo
menos un grupo nitrogenado cargado positivamente y/o por lo menos un
grupo nitrogenado que se puede cargar positivamente, en cuyo
procedimiento se lleva a cabo una extracción reactiva, en por lo
menos una etapa, con un agente de extracción, que ya no presente las
desventajas arriba mencionadas.
El problema planteado por esta misión se
resuelve mediante el recurso de que
- a.
- se saca desde el biorreactor continuamente una mezcla acuosa de bioproceso, y
- b.
- se conduce a una centrífuga del tipo líquido-líquido con un agente de extracción, que contiene compuestos orgánicos por lo menos parcialmente de cadena más larga y al menos un intercambiador líquido de cationes,
- c.
- se extrae mediante el agente de extracción, obteniéndose una fase orgánica que contiene la sustancia que se ha de extraer desde la mezcla de bioproceso, y
- d.
- el material retenido acuoso resultante se devuelve al biorreactor.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de una centrifuga del tipo
líquido-líquido. Una fase ligera (orgánica) y una
fase pesada (acuosa) se introducen por separado en la centrífuga y
se mezclan intensamente con ayuda de un rotor en una zona de
mezcladura, después de lo cual se realiza una separación entre la
fase ligera y la fase pesada en una zona de separación. Las fases
ligera y pesada se sacan por separado, es decir que la fase pesada
fluye junto a la pared del rotor a través del disco de dique
exterior (que tiene un tamaño dependiente del sistema); la fase
ligera sale fluyendo por el interior a través de un dique fijo.
Centrífugas del tipo líquido-líquido, son unos
discos metálicos - en general desplazables o que se pueden escoger
con el tamaño del orificio central - que tienen un orificio en el
centro, por medio de cuyo tamaño se puede regular la salida de la
fase pesada.
En la Figura 1 son:
- 1
- por una parte, la entrada de la mezcla de bioproceso y, por otra parte, la del agente de extracción
- 2
- una zona de mezcladura y respectivamente una zona de extracción
- 3
- una zona de separación
- 4
- la salida de la fase pesada a través del disco de dique exterior (7)
- 5
- la salida de la fase ligera a través de un dique fijo (8)
- 6
- un cilindro rotatorio
- 7
- un disco de dique exterior
- 8
- un dique fijo
- 9
- un árbol de accionamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Las desventajas, arriba mencionadas, del estado
de la técnica se solventan en el caso de la realización conforme al
invento del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,
realizándose que las reivindicaciones subordinadas 2 a 21 mejoran
adicionalmente el procedimiento. Se ha puesto de manifiesto que, en
el caso del procedimiento conforme al invento, se consigue tanto un
rendimiento esencialmente más alto (transporte mejorado de
sustancia) como también una manipulación mejorada del proceso.
Además, se ha mostrado que los resultados conseguidos en una
magnitud limitada se pueden transferir de una manera sencilla a una
mayor escala, p.ej. a un plano de 300 l. Se prefieren sin embargo
solamente los disolventes que, al agitar con una fase acuosa en un
matraz con sistema de agitación, no forman emulsiones fuertes
(concentradas) de ningún tipo, puesto que en caso contrario se
perjudicaría el efecto de la(s)
centrífuga(s) del tipo líquido-líquido.
centrífuga(s) del tipo líquido-líquido.
En el sentido de este invento, con la expresión
"por lo menos una centrífuga del tipo
líquido-líquido" se entiende que para el
tratamiento ulterior de la mezcla de bioproceso no se han de
utilizar necesariamente otras centrífugas del tipo
líquido-líquido. Así, p.ej. la primera etapa de
extracción (la extracción de ida) se puede realizar en dos (o
incluso más) centrífugas del tipo líquido-líquido,
conectadas en paralelo. Esto se puede realizar de una manera
continua o semicontinua. También, como se señala en esta memoria
descriptiva se puede realizar la extracción de retorno con una o
varias centrífuga(s) del tipo
líquido-líquido. Así, se podría conectar
posteriormente una segunda centrífuga del tipo
líquido-líquido (u otras centrífugas del tipo
líquido-líquido en paralelo) (para la extracción de
retorno), tan pronto como - después de un período de tiempo
determinado - en la primera centrífuga de
líquido-líquido se haya ajustado un buen grado de
carga de la fase orgánica. La extracción de retorno se puede llevar
a cabo, sin embargo, también con otras técnicas, p.ej. apoyadas en
membranas, como en el documento WO/66253.
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Conforme al invento, al realizar la extracción
de ida, el material de extracción (es decir la mezcla de bioproceso,
p.ej. un caldo de fermentación, o respectivamente el agente de
extracción, p.ej. D2EHPA en queroseno) se introduce en la
centrífuga (1) (véase la Figura 1). Junto al lado exterior del rotor
tiene la lugar la mezcladura de las dos fases, es decir la
extracción (2). En el espacio interior, las fases son separadas en
el campo centrífugo (3) + (6). La fase pesada abandona la
centrífuga por el exterior (4), y la fase ligera lo hace por el
interior (5). La separación óptima de las dos fases se puede
garantizar p.ej. por medio del tamaño del (de los) disco(s)
de dique (7) + (8) escogido(s).
También mediante una modificación del caudal
volumétrico se puede hacer variar el período de tiempo de
permanencia en la centrífuga, es decir el período de tiempo de
contacto de las fases. Además, mediante una modificación del número
de revoluciones, se influye sobre la superficie límite de fases, así
como también la intensidad del campo centrífugo puede modificar la
separación de las fases acuosas y orgánicas. El proceso conforme al
invento se puede regular de una manera sencilla por variación del
número de revoluciones y/o de los caudales volumétricos. Ambos
factores son parámetros sencillos de optimización, que se pueden
escoger libremente.
Además de esto, se pueden realizar también
modificaciones, condicionadas por el tipo constructivo, en las
centrífugas, los rotores, etc., "cizalladura" o de "alta
cizalladura" (del inglés "Low-Shear" o
"High-Shear"). También, de modo condicionado
por el tipo constructivo, se pueden emplear otros separadores, tales
como p.ej. separadores de platos, con unos platos que giran en
sentidos opuestos entre ellos, o con platos estáticos.
En una forma de realización preferida del
invento, la mezcla de bioproceso, conducida a la centrífuga del
tipo líquido-líquido de la etapa b., se puede hacer
exenta de células antes de que sea conducida dentro de esta
centrífuga. En otra forma preferida de realización del invento, la
mezcla de bioproceso, conducida a la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b., se puede hacer
además exenta de proteínas. En tal caso resulta una solución de
bioproceso exenta de células y exenta de biocatalizador. Como mezcla
acuosa de bioproceso se prefiere una mezcla de fermentación. Las
fermentaciones, dependiendo del tipo de la reacción, pueden
transcurrir de una manera aerobia o anaerobia y se pueden realizar
como un proceso discontinuo, semi-continuo o
continuo.
El principio conforme al invento de la
centrifugación del tipo líquido-líquido puede ser
aplicado tanto en el caso de la extracción de ida (a partir del
medio presente en el biorreactor) como también en el caso de la
extracción de retorno, siendo recogidas las sustancias que se han de
obtener, de nuevo en una fase acuosa, preferiblemente en una forma
aumentada de concentración.
En particular, se utiliza un procedimiento, en
el que, detrás de la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b., se dispone una
etapa de extracción adicional, donde la sustancia extraída de la
primera etapa de reacción, se extrae de retorno en una fase acuosa.
Se prefiere que la etapa adicional de extracción tenga lugar
también en una centrífuga del tipo
líquido-líquido.
En el caso de la extracción de retorno en una
centrífuga del tipo líquido-líquido, la fase
orgánica cargada en la extracción de ida (agente de extracción,
p.ej. D2EHPA en queroseno, con sustancias extraídas recogidas en
él), por una parte, y la fase acuosa llevada a un bajo pH, p.ej. con
ácido sulfúrico, por otra parte, se introducen en una centrífuga
del tipo líquido-líquido para la extracción de
retorno. Como ilustración se hará referencia aquí de nuevo a la
Figura 1. La introducción de la fase orgánica y de la fase acuosa se
realizan en (1). Junto al lado exterior del rotor tiene lugar de
nuevo la mezcladura de las dos fases, es decir la extracción de
retorno (2). También en el caso de la extracción de retorno, las
fases son separadas, a causa de la fuerza centrífuga, en el espacio
interior (3) + (6), después de lo cual la fase pesada abandona la
centrífuga por el exterior (4), y la fase ligera lo hace por el
interior (5). La separación óptima de las dos fases se garantiza
también en el caso de la extracción de retorno p.ej. a través del
tamaño del (o de los) disco(s) de dique (7) + (8) escogidos.
La extracción de retorno - tal como ya se ha mencionado más arriba -
se puede llevar a cabo sin embargo también con otras técnicas.
En el proceso conforme al invento, el
rendimiento de extracción en la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b. corresponde
preferiblemente por lo menos al caudal de producción en el
bioproceso. Por el rendimiento de extracción en una etapa de
extracción (o incluso en un proceso completo, cuando se señala el
proceso total de la separación como un proceso de extracción), se
entiende la separación por extracción de un componente por hora en
la etapa de extracción (o en el proceso total) - a partir de la
mezcla de bioproceso -. La cantidad sacada en total se puede
indicar en moles. Por el caudal de producción se entiende la
cantidad (en moles) producida biocatalíticamente por hora en el
bioproceso de aquel componente que se puede sacar en la etapa de
extracción (o en todo el proceso) por extracción a partir de la
mezcla de bioproceso.
Como agente de extracción para la extracción
integrada de sustancias orgánicas, que contienen por lo menos un
grupo nitrogenado cargado positivamente o por lo menos un grupo
nitrogenado que se puede cargar positivamente, a partir de una
mezcla de bioproceso, se emplean preferiblemente los mismos agentes
de extracción que en el documento WO/66253. Esto quiere decir que,
para la extracción en la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b., se emplea
preferiblemente un agente de extracción, que contiene compuestos
orgánicos por lo menos parcialmente de cadena más larga y al menos
un intercambiador líquido de cationes. Los compuestos orgánicos por
lo menos parcialmente de cadena más larga tienen, en el
procedimiento conforme al invento, la función de un disolvente. El
intercambiador líquido de cationes tiene la función de un
vehículo.
\newpage
Como compuestos orgánicos de cadena más larga se
emplean preferiblemente aquellos compuestos que son miscibles con
agua sólo con dificultades o se pueden disolver en agua sólo con
dificultades, y que son líquidos a unas temperaturas comprendidas
entre 10 y 60ºC, preferiblemente entre 20 y 40ºC. Se pueden concebir
en este caso compuestos orgánicos ramificados, no ramificados,
saturados, insaturados o parcialmente aromáticos. Ejemplos de
compuestos orgánicos de cadena más larga, utilizables conforme al
invento, son alcanos, alquenos o ésteres de ácidos grasos, o
mezclas de varios de estos compuestos. En particular, se emplean en
este caso, como compuestos orgánicos de cadena más larga, alcanos,
alquenos o ésteres de ácidos grasos con 6 a 20 átomos de C,
preferiblemente con 12 a 18 átomos de C.
Como alcanos se pueden emplear, por ejemplo,
hexano, ciclohexano, decano, etil-decano, dodecano o
mezclas de ellos. Se prefiere especialmente el queroseno. Como
alquenos se pueden emplear p.ej. hexeno, noneno, deceno, dodeceno o
mezclas de ellos. Como ésteres de ácidos grasos se pueden emplear en
particular estearatos de alquilo con grupos alquilo que tienen más
de 2 átomos de C. Ejemplos de ésteres de ácidos grasos son estearato
de etilo, estearato de butilo, estearato de isopropilo, palmitato
de etilo o linoleato de butilo. Se prefiere especialmente el empleo
de queroseno o estearato de butilo. Dos o más de los compuestos
orgánicos mencionados pueden pasar a emplearse también en forma de
mezclas.
Como intercambiadores líquidos de cationes se
emplean en particular ésteres a base de ácidos inorgánicos y de
radicales orgánicos, que preferiblemente están ramificados. Entre
los ácidos inorgánicos se cuentan preferiblemente ácido fosfórico,
ácido fosforoso, ácido sulfúrico y ácido sulfuroso. Más
específicamente, se emplean como intercambiadores líquidos de
cationes, preferiblemente, ésteres de ácido fosfórico, de ácido
fosforoso, de ácido sulfúrico o de ácido sulfuroso. Son muy
especialmente preferidos los ésteres de ácido fosfórico. Los
radicales orgánicos, utilizados conforme al invento, son
preferiblemente grupos alquilo o alquenilo ramificados y/o sin
ramificar con por lo menos 4 átomos de C, preferiblemente con 4 a 20
átomos de C. Entre los preferidos intercambiadores líquidos de
cationes se cuentan el éster
di-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico, el éster
mono-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico, el éster di-nonílico de ácido
naftaleno-sulfónico o mezclas de ellos. Se
prefieren en sumo grado como intercambiadores líquidos de cationes
el éster
di-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico, el éster
mono-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico, el éster di-nonílico de ácido
naftaleno-sulfónico o mezclas de ellos. Se prefiere
en sumo grado conforme al invento la mezcla del éster
di-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico y del éster
mono-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico.
En la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b., la cantidad de
intercambiador líquido de cationes, referida a la cantidad de
compuestos orgánicos de cadena más larga, es en general de 2 a 25%
en peso, de manera preferida de 5 a 20% en peso, de manera
especialmente preferida de 8 a 15% en peso.
Entre las sustancias extraíbles se cuentan por
ejemplo L-aminoácidos, pero también se pueden
separar conforme al invento, en un procedimiento integrado,
D-aminoácidos. Fundamentalmente, se pueden extraer
aminoácidos tanto naturales como también no naturales. Se pueden
concebir todas las formas D y L de aminoácidos esenciales. Ejemplos
de aminoácidos extraíbles son L-fenilalanina,
D-fenilalanina, L-triptófano,
D-triptófano, L-tirosina,
D-tirosina,
D-p-hidroxi-fenilglicina,
D-fenilglicina,
di-hidroxi-fenilalanina. También se
pueden separar \beta-aminoácidos aromáticos,
tales como p.ej. \beta-fenilalanina o
\beta-tirosina. Además, con el procedimiento
conforme al invento se pueden extraer lactamas. Entre ellas se
cuentan, entre otras, también \beta-lactamas,
p.ej. caprolactama.
Además, se pueden extraer conforme al invento
también péptidos, pero en particular di- u
oligo-péptidos. Entre ellos se cuenta, por ejemplo,
la
L-aspartil-L-fenilalanina
como molécula precursora para la preparación de aspartama. Se
pueden extraer también aminoalcoholes, p.ej. el
1S,2R-cis-(-)-amino-indanol
y los (amino)ciclitoles. La extracción conforme al invento
se puede aplicar además para la obtención de aminas o amidas.
La mezcla de bioproceso contiene preferiblemente
sustancias orgánicas seleccionadas entre el conjunto formado por
aminoácidos y/o lactamas alifáticos/as y/o aromáticos/as, sus sales,
derivados o di- u oligo-péptidos o mezclas de estos
compuestos, que se extraen conforme al invento a partir de la mezcla
de bioproceso.
El agente de extracción puede contener conforme
al invento, junto a los compuestos mencionados, también otras
sustancias. Entre ellas se cuentan también agentes de extracción
conocidos según el estado de la técnica.
El procedimiento conforme al invento para la
separación integrada a partir de un biorreactor de una o varias
sustancias orgánicas presentes en una mezcla acuosa de bioproceso,
que contienen por lo menos un grupo nitrogenado cargado
positivamente o por lo menos un grupo nitrogenado que se puede
cargar positivamente, en cuyo procedimiento una extracción reactiva
se lleva a cabo, en por lo menos una etapa, con un agente de
extracción, se realiza preferiblemente de una manera continua. En
esta preferida forma continua de realización
- (a)
- una mezcla acuosa de bioproceso se saca de manera continua desde el biorreactor y
- (b)
- se conduce con un agente de extracción, que contiene compuestos orgánicos por lo menos parcialmente de cadena más larga y por lo menos un intercambiador líquido de cationes, a una centrífuga del tipo líquido-líquido, y
- (c)
- allí se extrae mediante el agente de extracción, obteniéndose una fase orgánica, que contiene la sustancia que se ha de extraer a partir de la mezcla de bioproceso, y
- (d)
- el material retenido acuoso resultante se devuelve al biorreactor.
En la etapa (a), en vez de la mezcla acuosa de
bioproceso, se puede utilizar, desde luego, también cualquier otra
mezcla de reacción que resulte en un (bio)-reactor,
en el que están contenidas sustancias orgánicas con por lo menos un
grupo nitrogenado cargado positivamente o con por lo menos un grupo
nitrogenado que se puede cargar positivamente. Ejemplos de tales
sustancias ya se han señalado más arriba.
Un sector de empleo muy preferido del
procedimiento conforme al invento es la extracción a partir de
soluciones de fermentación, aguas residuales y/o mezclas acuosas de
procesos químicos de síntesis y/o de degradación. En particular, el
procedimiento conforme al invento se puede integrar en procesos de
fermentación. Los procesos de fermentación pueden transcurrir de
una manera aerobia o anaerobia y se pueden realizar como procesos
discontinuos, semi-continuos o continuos.
Las sustancias orgánicas se extraen de retorno
en tal caso, conforme al invento, preferiblemente a partir del
agente de extracción en una fase acuosa. En particular, para esto,
en una etapa (e) adicional del procedimiento, la fase orgánica
procedente de (c) se pone en contacto en un circuito cerrado con una
fase acuosa de un aceptor y se extrae de retorno.
Como fase acuosa de un aceptor entran en
cuestión generalmente, para la descarga de los vehículos, todos los
donantes de protones apropiados, p.ej. H^{+} procedente de ácido
sulfúrico. En la etapa (e), en vez de ácido sulfúrico, se puede
utilizar evidentemente cualquier otro ácido fuerte. Ejemplos de
ellos son además sulfato de amonio, ácido clorhídrico y ácido
fosfórico.
Preferiblemente, el contacto con la fase acuosa
de aceptor procedente de e., tiene lugar en una centrífuga del tipo
líquido-líquido, y la fase orgánica empobrecida, que
se ha obtenido en tal caso, se devuelve de manera continua o
semi-continua a la centrífuga de la etapa (b).
Todavía con más preferencia, la mezcla acuosa de bioproceso en la
etapa (a) se hace exenta de células en una etapa [a1] adicional, a
través de una derivación (en inglés bypass) con un módulo de
ultrafiltración (valor de separación, aproximadamente 500 kDa)
mediando devolución del material celular al biorreactor, y se
obtiene un material perneado exento de células, que es conducido a
la etapa (b).
En un proceso [a2] preferido adicional, el
material perneado exento de células se hace exento de proteínas, a
través de un casete de membrana, en la región de los nanómetros
(valor de separación aproximadamente desde 10 kDa hasta 50 kDa),
mediando devolución al biorreactor de la parte del material permeado
exento de células, que contiene proteínas, siendo conducido el
material permeado exento de células y exento de proteínas, que se
ha obtenido, junto con el agente de extracción, a la etapa (b) en la
primera centrífuga del tipo líquido-líquido.
Los mejores rendimientos del proceso conforme al
invento se obtienen, cuando en las etapas (d) y (e) se lleva a cabo
una devolución total del material acuoso retenido al biorreactor. En
conjunto, tiene lugar entonces una devolución total del material
retenido acuoso al biorreactor.
Una ventaja especial del procedimiento conforme
al invento consiste en que la extracción de retorno se efectúa
mediando simultáneo aumento de la concentración de las sustancias
orgánicas. De un modo preferido en sumo grado, el procedimiento
conforme al invento se lleva a cabo de una manera continua y
simultánea con respecto a una reacción que transcurre en el
biorreactor, realizándose que el rendimiento de extracción del
proceso total es igual por lo menos al caudal de producción en el
biorreactor. Se extrae preferiblemente a partir de soluciones de
fermentación.
El procedimiento conforme al invento para una
separación integrada de sustancias a partir de una mezcla de
bioproceso, se puede utilizar sin embargo en principio también para
una separación integrada de sustancias procedentes de otros
procesos, que son distintos de los procesos biocatalíticos. En ese
caso se habla, en vez de un biorreactor (o reactor de fermentación
o fermentador), mejor de un recipiente, en el que transcurre una
reacción a partir de la cual se quisiera separar de manera continua
una sustancia. Por lo general, un recipiente de este tipo se
designa sin embargo, en la mayor parte de los casos, como
biorreactor.
En comparación con el trabajo con contactores de
fibras huecas, la manipulación y el aumento de la escala se
simplifican en el caso de la utilización de centrífugas del tipo
líquido-líquido. Después de la puesta en marcha, el
sistema funciona de una manera estable, incluso aunque
provisionalmente no tenga lugar ninguna introducción de una fase
ligera o pesada. Por consiguiente, no constituye ningún problema una
inestabilidad de fases como consecuencia de diferencias de
presiones. La superficie límite de fases, y por consiguiente la
transferencia de sustancia, se aumentan asimismo en este
sistema.
Tal utilización integrada de centrífugas del
tipo líquido-líquido, en un proceso de fermentación
durante la fermentación, es nueva. Ciertamente, las centrífugas del
tipo líquido-líquido ya son conocidas desde hace
mucho tiempo y se pueden comprar comercialmente, p.ej. de la firma
CINC Deutschland GmbH, Brakel, Alemania. La CINC Deutschland es una
sociedad filial de Costner Industries Nevada Corporation, EE.UU.
Se ha de señalar que Likidis y Schügerl
(Biotech. & Bioeng., volumen 30, páginas
1032-1040, 1987; documento de solicitud de patente
alemana DE-A 3729338) ya han empleado ciertamente
con éxito centrífugas del tipo líquido-líquido en
el caso del tratamiento de mezclas de bioproceso después de la
terminación de la fermentación, en particular para la obtención de
penicilina, pero en tales casos siempre se empleaban agentes tóxicos
de extracción y los biocatalizadores utilizados no entraban nunca
en contacto con los agentes de extracción utilizados durante la
extracción. Además, las sustancias extraídas por Likidis y Schügerl
siempre eran separadas desde el medio por reacción con un grupo
carboxilo. En las mencionadas publicaciones no hay ningún indicio de
que se pudieran utilizar centrífugas del tipo
líquido-líquido, también en un modo de procedimiento
integrado, en el caso de procesos de fermentación. Las extracciones
a través de diferentes membranas líquidas (membranas en forma de
emulsión líquida) se describen en el caso de la cita de Thien, M.P y
colaboradores (Biotechnol Bioeng. 1998, 32:
604-615), pero no se pueden emplear en condiciones
con un alto esfuerzo de cizalladura (en inglés
"shear-stress"); tal como en el caso de la
utilización de centrífugas.
Se ha comprobado, de modo sorprendente, que en
el procedimiento conforme al invento para la extracción reactiva
integrada en procesos de fermentación mediando utilización de por lo
menos una centrífuga del tipo líquido-líquido, son
posibles muy altos rendimientos de sustancias extraídas. Así, se ha
manifestado como posible obtener en la fase de aceptor
L-fenilalanina en unas concentraciones situadas en
la región hasta de aproximadamente 80 g/l, y probablemente se hacen
posibles incluso todavía concentraciones más altas.
En principio, el actual invento hace posible
también trabajar con unas cantidades de vehículo menores que las
que eran usuales anteriormente en el estado de la técnica.
A continuación, se explica con mayor detalle,
con ayuda de la Figura 2, la aplicación del procedimiento conforme
al invento a la vista de un proceso de fermentación integrada, p.ej.
para la producción de L-fenilalanina.
La Figura 2 muestra un biorreactor (3), en el
que se efectúa una producción por fermentación de
L-fenilalanina. A este biorreactor (fermentador)
está conectada una derivación con un módulo de ultrafiltración (UF
I, 500 kDa) (5), a través del cual se bombea el caldo de
fermentación durante el proceso, con el fin de obtener un material
permeado exento de células. El material permeado exento de células
se bombea en este caso a un recipiente de reserva. Desde allí, el
material permeado exento de células se transporta en circuito a
través de una segunda unidad de ultrafiltración (UF II; 10 kDa) (6)
con el fin de separar las proteínas presentes en el material
permeado. El material permeado exento de células y de proteínas,
obtenido de esta manera, se bombea a una primera centrífuga del
tipo líquido-líquido (1) para la extracción de la
L-fenilalanina con el agente de extracción, p.ej.
D2EHPA en queroseno. Después de una extracción y de una separación
de fases, el material refinado se devuelve al fermentador. La fase
orgánica (p.ej. D2EHPA en queroseno) se conduce en circuito (4), y
en la segunda centrífuga del tipo líquido-líquido
(2) tiene lugar la extracción de retorno p.ej. con ácido sulfúrico.
En este caso, la L-fenilalanina se aumenta de
concentración en la fase acuosa. El agente de extracción y/o el
donante de protones se pueden introducir a través de (7) (o
respectivamente el agente de extracción cargado, con la sustancia
extraída aumentada de concentración, se retira para la obtención de
la
sustancia).
sustancia).
En la Figura 2, formulado de una manera
distinta, son:
- 1
- una primera centrífuga del tipo líquido-líquido con introducción de la mezcla de bioproceso, exenta de células y de proteínas, y del agente de extracción, o respectivamente con retirada de la mezcla empobrecida de bioproceso, y del agente de extracción cargado,
- 2
- una segunda centrífuga del tipo líquido-líquido con introducción del agente de extracción cargado y adición dosificada del donante de protones procedente de (7), o respectivamente con retirada del agente de extracción que se ha de cargar adicionalmente hacia (1), o respectivamente del agente de extracción cargado para la obtención de la sustancia aumentada de concentración,
- 3
- un biorreactor,
- 4
- un circuito de la fase orgánica,
- 5
- un módulo de ultrafiltración (UF I; valor de separación aproximadamente 500 kDa);
- 6
- una unidad de ultrafiltración (UF II; 10 kDa; en la región de los nanómetros, valor de separación aproximadamente 10 kDa),
- 7
- introducción y retirada del agente de extracción y/o del donante de protones,
- M
- dispositivo de accionamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
El invento se explica ahora, con ayuda de un
Ejemplo y de algunos Ejemplos de comparación, de una manera más
detallada.
En el presente invento se trabajó en este caso
en una instalación de acuerdo con la Figura 2, con un biorreactor
que tiene un volumen de fermentación de 10 l (tanda, en inglés
batch), y con un volumen de derivación de aproximadamente 1,2 l. El
módulo de ultrafiltración I (de Schleicher und Schüll GmbH, Dassel,
Alemania; un módulo de filtración de fibras huecas) tenía un valor
de separación de 500 kDa. El módulo de ultrafiltración II (asimismo
de Schleicher und Schüll GmbH, Dassel, Alemania) tenía un valor de
separación de 10 kDa, y se componía de cinco módulos de casetes.
Como agente de extracción para la extracción de ida se utilizaba
D2EHPA (de Merck) en queroseno (de Fluka).
Ejemplo
I
En el biorreactor (fermentador) se llevó a cabo
una fermentación con extracción integrada. La fermentación se
inició según el procedimiento discontinuo. Durante la fase de
crecimiento de las células (una cepa de E. coli auxótrofa
para tirosina, que produce L-fenilalanina), se
indujo, después de aproximadamente 6 horas, la producción, y se
comenzó la alimentación de amoníaco, glucosa y tirosina. La fase de
crecimiento se terminó después de aproximadamente 14 horas en total
mediante limitación de la cantidad de tirosina de las E.
coli. Después de aproximadamente 22 horas en total, estaban
presentes en el medio aproximadamente 15 g/l de
L-fenilalanina, es decir una importante
concentración de L-fenilalanina, junto con un buen
caudal de formación. En este momento se comenzó el proceso para la
obtención del material permeado exento de células y de proteínas, y
a continuación se comenzó la extracción.
Los parámetros de extracción, utilizados para el
proceso de fermentación Fed-Batch y para la
extracción reactiva integrada, de las centrífugas del tipo
líquido-líquido, eran los siguientes:
Primera centrífuga del tipo
líquido-líquido:
- -
- fase pesada: caldo de fermentación con L-fenilalanina, caudal volumétrico: 2,4 l/h
- -
- fase ligera: solución al 10% de D2EHPA en queroseno, caudal volumétrico: 3,36 l/h.
Segunda centrífuga del tipo
líquido-líquido:
- -
- fase pesada: ácido sulfúrico 1 M, caudal volumétrico: 1,5 l/h
- -
- fase ligera: solución al 10% de D2EHPA en queroseno, caudal volumétrico: 3,36 l/h.
\vskip1.000000\baselineskip
La extracción se efectuó durante aproximadamente
18 horas, es decir hasta la hora 40 del proceso, donde se
interrumpió el proceso. El sistema de extracción se manifestó como
estable al introducir el medio exento de proteínas. No se pudo
comprobar ningún efecto negativo de la extracción, por ejemplo
mediante la incorporación de queroseno o de D2EHPA, sobre el
proceso de fermentación.
La concentración de
L-fenilalanina en el biorreactor aumentó en este
Ejemplo I hasta que se hubo iniciado la extracción reactiva, y
permaneció constante ulteriormente, durante la extracción integrada,
en aproximadamente 12-15 g/l. La concentración de
L-fenilalanina a la salida de la primera centrífuga
después de la extracción, estaba situada siempre en aproximadamente
7 g/l. El contenido de L-fenilalanina en el ácido
sulfúrico aumentaba, entre las horas 22 y 40, casi de manera lineal
desde cero hasta aproximadamente 59 g/l, es decir después de una
duración de la extracción de 18 horas. Se pudo conseguir por lo
tanto un fuerte aumento de la concentración de
L-fenilalanina.
La concentración de
L-fenilalanina, conseguida teóricamente en este
Ejemplo, se puede calcular sumando las concentraciones de
L-fenilalanina en el biorreactor y en el ácido
sulfúrico acuoso, referidas al volumen real de fermentación. De
esta manera, en este Ejemplo se hubiera alcanzado una concentración
teórica final de L-fenilalanina de 52 g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
A
En el caso de una fermentación, realizada de una
manera comparativa como en el Ejemplo I, con unas condiciones de
fermentación por lo demás iguales (cantidad y actividad de las
células de E. coli, etc.), pero sin ninguna extracción
integrada, es decir se utilizó solamente un biorreactor y no se
utilizó ningún equipo de extracción, la concentración final teórica
de L-fenilalanina estaba situada en 31 g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
B
En el caso de otra fermentación adicional
realizada de una manera comparativa, con unas condiciones de
fermentación por lo demás iguales (cantidad y actividad de las
células de E. coli, etc.), pero con una extracción integrada
a través de contactores de fibras huecas con membranas de acuerdo
con el documento WO/66253, la concentración final teórica de
L-fenilalanina estaba situada en aproximadamente 30
g/l.
En el caso del procedimiento integrado conforme
al invento, con centrífugas del tipo
líquido-líquido, se pudo conseguir por lo tanto una
concentración final de L-fenilalanina muchísimo más
alta que en los Ejemplos comparativos.
En el caso del procedimiento integrado conforme
al invento, con centrífugas del tipo
líquido-líquido, se ha manifestado además como
posible conservar la producción de L-fenilalanina a
lo largo de un período de tiempo más largo, con una duración de la
fermentación de por lo menos 50 horas, sin que aparezca ninguna
inhibición en el biorreactor.
El caudal de producción de
L-fenilalanina está situado, hasta el final del
período de 50 horas, claramente por encima de 0,03 g/(g*h). Por el
contrario, el caudal comparable de formación de producto, en el caso
de una fermentación clásica sin separación integrada de
L-fenilalanina a través de centrífugas del tipo
líquido-líquido, disminuye hasta cero con una
duración del proceso de 36 horas, y en el caso de una fermentación
clásica con separación integrada de L-fenilalanina
por medio de una extracción apoyada en membranas según el documento
WO/66253, disminuye hasta 0,02 g/(g*h) con una duración del proceso
de 36 horas.
En el Ejemplo I de acuerdo con el proceso
conforme al invento, de la separación integrada de productos a
través de centrífugas del tipo líquido-líquido, el
caudal de formación de productos aumentó con la duración de la
fermentación, y alcanzó un máximo poco después del comienzo de la
extracción de la L-fenilalanina. Aproximadamente al
mismo tiempo, también el caudal de extracción alcanzó un máximo. El
caudal de extracción permaneció, en el transcurso ulterior hasta la
desconexión de la extracción, en un nivel comprendido entre 1,1
g/(l*h) y 1,7 g/(l*h). La formación volumétrica de producto se
comportó de una manera comparable y disminuyó sólo ligeramente
después de haber desconectado la fermentación. De una manera
sorprendente, mediante los caudales de producción y de extracción
aproximadamente de igual magnitud, se reprimió ampliamente una
fuerte acumulación de L-fenilalanina en el
biorreactor. En lo esencial, la concentración de
L-fenilalanina en el biorreactor permaneció
constante en el intervalo de 12 a 15 g/l.
El rendimiento integral de producto y substrato
en el Ejemplo I se calculó como de 24% al final de la fermentación.
Esto quiere decir que se encontró una mejoría en un 6,5% en
comparación con una fermentación sin extracción reactiva con
centrífugas del tipo líquido-líquido (con un
rendimiento de 17,5%). En el caso de una extracción reactiva
apoyada en membranas, se encontró por el contrario solamente una
mejoría en un 5% en comparación con una fermentación sin extracción
reactiva apoyada en membranas, con un rendimiento de 15,3%.
Claims (21)
1. Procedimiento para la separación integrada a
partir de un biorreactor de una o varias sustancias orgánicas
presentes en una mezcla acuosa de bioproceso, que contiene por lo
menos un grupo nitrogenado cargado positivamente y/o por lo menos
un grupo nitrogenado que se puede cargar positivamente, en cuyo
procedimiento se lleva a cabo una extracción reactiva, en por lo
menos una etapa, con un agente de extracción, realizándose que
- a.
- se saca desde el biorreactor continuamente una mezcla acuosa de bioproceso, y
- b.
- se conduce a una centrífuga del tipo líquido-líquido con un agente de extracción que contiene compuestos orgánicos por lo menos parcialmente de cadena más larga y al menos un intercambiador líquido de cationes,
- c.
- se extrae mediante el agente de extracción, obteniéndose una fase orgánica que contiene la sustancia que se ha de extraer desde la mezcla de bioproceso, y
- d.
- el material retenido acuoso resultante se devuelve al biorreactor.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la mezcla del bioproceso, conducida a la
centrífuga del tipo líquido-líquido de la etapa b.,
se hace exenta de células antes de que se le conduzca a la
centrífuga.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la mezcla del bioproceso, conducida a la
centrifuga del tipo líquido-líquido de la etapa b.,
se hace además también exenta de proteínas.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la mezcla acuosa del bioproceso
es una mezcla de fermentación.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que detrás de la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b. está conectada una
etapa de extracción adicional, en la que la sustancia extraída de
la primera etapa de extracción es extraída de retorno en una fase
acuosa.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la etapa de extracción adicional tiene
lugar también en una centrífuga del tipo
líquido-líquido.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el rendimiento de extracción en
la centrífuga del tipo líquido-líquido de la etapa
b. corresponde por lo menos al caudal de producción en el
bioproceso.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que como compuestos orgánicos de
cadena más larga en la etapa b., se emplean alcanos, alquenos o
ésteres de ácidos grasos con 6 a 20 átomos de C, preferiblemente
con 12 a 18 átomos de C.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que en la centrífuga del tipo
líquido-líquido en la etapa b., como
intercambiadores de líquidos están contenidos ésteres a base de
ácidos inorgánicos y de radicales orgánicos, que preferiblemente
están ramificados.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que como intercambiadores líquidos de
cationes se emplean ésteres de ácido fosfórico, ácido fosforoso,
ácido sulfúrico o ácido sulfuroso.
11. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 9 a 10, en el que en la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b., como
intercambiadores líquidos de cationes están contenidos el éster
di-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico, el éster
mono-2-etil-hexílico
de ácido fosfórico, el éster di-nonílico de ácido
naftaleno-sulfónico o mezclas de ellos.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que en la centrífuga del tipo
líquido-líquido de la etapa b., referido a la
cantidad de compuestos orgánicos de cadena más larga, está contenido
de 2 a 25% en peso, de manera preferida de 5 a 20% en peso, de
manera especialmente preferida de 8 a 15% en peso, de
intercambiadores líquidos de cationes.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que se extraen sustancias orgánicas
seleccionadas entre el conjunto formado por aminoácidos y/o lactamas
alifáticos/as y/o aromáticos/as, sus sales, derivados o di- u
oligo-péptidos, o mezclas de estos compuestos.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que en una etapa adicional del
procedimiento
- e.
- la fase orgánica, procedente de c., se pone en contacto en un circuito cerrado con una fase acuosa de aceptor y se extrae de retorno.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que el contacto con la fase acuosa de
aceptor procedente de e., se realiza en una centrífuga del tipo
líquido-líquido, y en el que la fase orgánica
empobrecida, que se obtiene en tal caso, se devuelve de una manera
continua o semi-continua a la centrífuga de la etapa
b.
16. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la mezcla del bioproceso en la
etapa a., se hace exenta de células en una etapa ulterior
- a1)
- a través de una derivación con un módulo de ultrafiltración (valor de separación aproximadamente 500 kDa) mediando devolución del material celular al biorreactor, y se obtiene un material permeado exento de células, que es conducido a la etapa b.
17. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el material permeado exento de células
se hace exento de proteínas en un proceso adicional
- a2)
- a través de un casete de membrana en la región de los nanómetros (valor de separación aproximadamente 10 kDa hasta 50 kDa) se hace exenta de proteínas, mediando devolución al biorreactor de la parte que contiene proteínas del material permeado exento de células, siendo conducido el material permeado exento de células y exento de proteínas, que se ha obtenido, junto con el agente de extracción, a la etapa b., en la primera centrífuga del tipo líquido-líquido.
18. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que en las etapas (d) y (e) se lleva
a cabo una devolución total del material acuoso retenido al
biorreactor.
19. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que la extracción de retorno se
efectúa mediando simultáneo aumento de la concentración de las
sustancias orgánicas.
20. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 19, en el que la extracción se efectúa de una
manera continua y simultánea con una reacción que transcurre en el
biorreactor, siendo el rendimiento de extracción igual por lo menos
al caudal de producción en el biorreactor.
21. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que se extrae a partir de soluciones
de fermentación.
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