ES2293663T3 - Procedimiento para la caracterizacion de celulas en suspension. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE DETECCION Y DETERMINACION DEL FENOTIPO DE CELULAS OBJETIVO EN SUSPENSIONES CELULARES MEDIANTE PARTICULAS ENVUELTAS DE ANTICUERPOS/LIGANDOS DIRIGIDOS CONTRA DETERMINANTES ANTIGENICOS/RECEPTORES EXPRESADOS SOBRE LAS CELULAS OBJETIVO, QUE SE CARACTERIZA POR EL HECHO DE QUE VARIOS TIPOS DE PARTICULAS, SIENDO CADA PARTICULA SEPARABLE VISUALMENTE O MEDIANTE INSTRUMENTOS POR FLUORESCENCIA, COLOR Y ESPESOR, Y CADA PARTICULA ENVUELTA DE UN ANTICUERPO O DE UN LIGANDO DIFERENTE, ESTAN SOMETIDAS A UNA INCUBACION SIMULTANEA O SUCESIVAMENTE CON SUSPENSIONES CELULARES QUE CONTIENEN LAS CELULAS OBJETIVO, EN RELACION O NO CON UN PROCEDIMIENTO DE ENRIQUECIMIENTO CONOCIDO POR SI MISMO, UN USO DEL PROCEDIMIENTO Y UN EQUIPO.

Description

Procedimiento para la caracterización de células en suspensión.

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La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la identificación y la caracterización de las células eucarióticas.

En diversas enfermedades tales como los tumores primarios y secundarios, los trastornos alérgicos, autoinmunes, inflamatorios, proliferativos, infecciosos, y destructivos, o en las enfermedades para las que los mecanismos subyacentes resultan poco claros, sería de gran importancia poder determinar el mayor número posible de características de las células implicadas en el proceso patológico. Una determinación exacta del número de una multiplicidad de diferentes marcadores en dichas células mejoraría significativamente el diagnóstico, la prognosis y la elección de la terapia subsiguiente. Si dicho procedimiento fuese simple y rápido, sería fácil diagnosticar los trastornos patológicos en una etapa temprana de la enfermedad, incrementando así las probabilidades de seleccionar las opciones terapéuticas en el momento en el que la terapia puede ser más efectiva. Además, en algunas circunstancias es de crucial importancia hacer un diagnóstico inmediato y correcto, con el fin de distinguir ente tumores malignos y benignos, para auxiliar al cirujano en la selección del procedimiento operatorio adecuado.

En la actualidad, se encuentran disponibles los siguientes procedimientos de diagnosis relacionados con los anteriores trastornos patológicos: examen morfológico convencional de secciones de tejido, frotis o citospin de células y procedimientos inmunológicos que comprenden inmunoquímica, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Además, en secciones congeladas de tejidos se realizan evaluaciones morfológicas preoperacionales de las biopsias de especímenes de tejidos.

Mediante los procedimientos no inmunológicos basados en criterios morfológicos, los diagnósticos sólo pueden distinguir entre células normales y patológicas.

Los procedimientos inmunológicos tales como la inmunocitoquímica y la citometría de flujo son herramientas diagnósticas valiosas, aunque sufren múltiples limitaciones importantes. En los dos procedimientos se exponen las poblaciones heterogéneas de células a anticuerpos u otros ligandos para que se unan a las células diana. En los estudios de citometría de flujo se pueden incubar células vivas o fijadas con el fin de permitir que los anticuerpos marcados con fluorescencia se unan a los antígenos de membrana o intracelulares relevantes, antes de que se analice la suspensión de células en el instrumento. Para la inmunocitoquímica es necesaria la preparación de las secciones de tejido, citospins o frotis, fijación e inmunotinción de las células antes de su evaluación al microscopio. La visualización de un anticuerpo unido se obtiene directamente mediante una o múltiples etapas que culminan con una reacción de color con un enzima/sustrato, que permite la observación al microscopio de las células teñidas. El procedimiento de múltiples etapas no se puede completar en el mismo día del muestreo de las células. Además, generalmente se necesita la concienzuda evaluación de un patólogo experto para obtener resultados fiables. Por ejemplo, si las células anormales se identifican en una población de células mezcladas y la proporción de células patológicas a normales es pequeña, tal como la de las células malignas en una muestra de médula ósea o sangre periférica, puede resultar necesaria una gran cantidad de trabajo de un patólogo experto para identificar las células. Otro problema está relacionado con la poca existencia de anticuerpos que reconocen antígenos expresados de modo selectivo y consistente en todas las células diana. Si el objetivo consiste en identificar células tumorales en la sangre o la médula ósea, se utilizan generalmente anticuerpos dirigidos contra marcadores "tejido específicos", tales como las citoqueratinas que se encuentran en las células epiteliales. Sin embargo, como es sabido que algunas células normales pueden expresar citoqueratinas y que no todas las células epiteliales malignas lo hacen, existe el riesgo de resultados falsos tanto positivos como negativos.

Se pueden utilizar anticuerpos marcados con fluorescencia con el fin de detectar células diana tanto mediante microscopía de fluorescencia como por citometría de flujo. El primer procedimiento se puede utilizar con éxito con el fin de demostrar la unión de un único anticuerpo, aunque la utilización de un solo criterio morfológico como procedimiento adicional, para distinguir entre células normales y patológicas, es muy limitado. Además, la fluorescencia generalmente se extingue y desaparece rápidamente durante la observación al microscopio. Por consiguiente, se necesita estudiar las células fluorescentes y evaluarlas microscópicamente en un corto período de tiempo después de la unión al anticuerpo. El análisis mediante citometría de flujo necesita la presencia de un número elevado de células diana para proporcionar resultados fiables. Además, el procedimiento no proporciona la posibilidad de análisis morfológico o de distinguir entre células fluorescentes diana o no diana. Además, muchos de los procedimientos mencionados tienen la desventaja de que durante las etapas del procedimiento se pierden las células.

Recientemente se han descrito mejores posibilidades para detectar células diana (WO94/07138, WO94/07139, WO95/24648). En tales procedimientos, se utilizan anticuerpos unidos a partículas superparamagnéticas con el fin de detectar y seleccionar las células que se deben identificar. Una limitación de este procedimiento consiste en que es difícil demostrar directamente la naturaleza patológica de las células unidas a la superficie de las partículas. Una ventaja en comparación con los demás procedimientos descritos es, sin embargo, la simplicidad del procedimiento y que los resultados se obtienen en un período de tiempo corto.

Con el fin de confirmar todavía más la naturaleza patológica de las células teñidas, fluorescentes o unidas a las inmunpartículas es importante caracterizar las células diana mediante más de un marcador. El objetivo consiste en obtener información biológica importante e información con significancia diagnóstica y pronóstica. Si el número de células diana es elevado, se puede utilizar citometría de flujo con el fin de estudiar en paralelo la unión de dos anticuerpos fluorescentes diferentes unidos a las células. Sin embargo, este procedimiento no permite examinar células individuales y su morfología, y de hecho identificar a las células fluorescentes como las verdaderas células diana. La inmunocitoquímica permite estudiar en paralelo un máximo de dos marcadores, uno mediante la visualización enzimática convencional del anticuerpo unido y el otro mediante un procedimiento de amplificación con oro/plata. Los dos procedimientos de múltiples etapas son relativamente complicados, largos y requieren de equipamiento costoso y/o un grado especial de experiencia en las respectivas áreas.

Mediante el procedimiento inmunomagnético, se puede lograr una caracterización adicional de las células enteras mediante la preparación de citospin de las células seleccionadas magnéticamente seguido de análisis por inmunotinción como en la inmunocitoquímica convencional. Por consiguiente, son pertinentes las mismas limitaciones que se describieron para la inmunocitoquímica, y además debido a que las células diana presentan cuentas unidas en su superficie, puede ser difícil hacer que se peguen a los portas utilizados en las preparaciones cistopin convencionales.

Los documentos US-A-5340719 & DE-A-3811566 dan a conocer procedimientos ópticos de selección en los que las células se combinan con uno o más conjuntos de diferentes microesferas que difieren en color o tamaño.

La patente WO 94/07142 da a conocer un ensayo de la presencia y abundancia relativa de subpoblaciones de linfocitos T utilizando diferentes anticuerpos unidos a diferentes partículas. Los dos procedimientos se utilizan con el fin de aislar células hematopoyéticas sin requerimientos de especificidad y utilizan etapas metodológicas que incrementan el riesgo de dañar las células diana.

En conclusión, los procedimientos existentes proporcionan la posibilidad de estudiar como máximo dos marcadores independientes, y presentan múltiples problemas importantes y limitaciones inherentes a los procedimientos descritos. Fue por consiguiente deseable desarrollar un procedimiento que de un modo más simple, rápido y fiable pudiese ayudar a identificar y caracterizar las células patológicas diana. La complejidad y heterogeneidad de la biología celular hace necesario poder examinar la expresión de múltiples marcadores biológicos independientes en las mismas células. Dicha información biológica podría ser de vital importancia diagnóstica y pronóstica y podría auxiliar en la elección de alternativas terapéuticas. Con el examen de múltiples marcadores en paralelo sería posible obtener una información más fiable sobre la naturaleza patológica de las células diana, mejorando de este modo la fiabilidad del diagnóstico y ayudando en la exclusión de falsos positivos y negativos. De manera importante, la caracterización de múltiples parámetros podría comprender marcadores de la proliferación celular, la muerte celular (tal como la apoptosis), adhesión, motilidad, invasión, antigenicidad, inflamación, destrucción celular, mecanismos autoinmunes, angiogénesis, agresividad de la enfermedad, metástasis de tumores, e inhibidores de tales funciones. Además, si se pueden examinar múltiples marcadores también al nivel de células individuales, sería posible estudiar la heterogeneidad celular e identificar subconjuntos de células con propiedades biológicas específicas. En algunas enfermedades también sería importante estudiar las células patológicas obtenidas de diferentes lugares en el mismo paciente con el fin de determinar si las características celulares pueden cambiar de un lugar a otro, proporcionando de este modo información adicional de importancia biológica y pronóstica. En conjunto, el impacto que puede tener la obtención de información del tipo que se describe en la presente memoria para la evaluación clínica y el tratamiento de los pacientes difícilmente se puede subestimar.

Estos objetivos se consiguen en la presente invención tal como resulta caracterizado mediante las reivindicaciones adjuntas.

Se introduce un nuevo concepto en la caracterización de células diana intactas en suspensiones celulares, haciendo posible una identificación microscópica directa de más de dos marcadores asociados a la membrana. Con el presente procedimiento se pueden estudiar en la misma operación múltiples marcadores de membrana celular del origen, la biología y el destino potencial de las células diana. El procedimiento es muy simple y se puede completar en un período de tiempo muy corto sin necesidad de instrumentación avanzada y cara. Con el presente procedimiento, se pueden estudiar microscópicamente las células diana, con un mínimo de manipulación, sin pérdida de células, para determinar la expresión de múltiples moléculas marcadoras independientes, incluso al nivel de células individuales. En consecuencia, además de obtener una imagen de los parámetros biológicos presentes en la población de células diana, dicho procedimiento también permite el examen de la variación intercelular en la expresión de moléculas marcadoras, proporcionando información de vital importancia biológica y médica.

En breve, el procedimiento se puede realizar tal como se describe en la presente memoria: microesferas teñidas o fluorescentes (cuentas, partículas) conjugadas a anticuerpos o ligandos que se pueden unir a los determinantes de las membranas celulares que se desea estudiar, se añaden a la suspensión de células y se incuban con una rotación suave. A continuación, se examinan muestras de la suspensión celular en un microscopio de fluorescencia para detectar células con microesferas de diferentes colores o fluorescencia. El grado y la variabilidad del enlace a las células de las diferentes microesferas se pueden determinar y cuantificar. La valoración de las partículas unidas a las células se puede determinar, si se desea, mediante un procedimiento automático.

A continuación se describe la presente invención con mayor detalle mediante los ejemplos no limitativos de la invención, y las figuras en las que:

La Figura 1 ilustra la unión de 4 tipos de microesferas a 4 determinantes antigénicos expresados en la membrana de una célula diana. La unión en este caso está mediada por 4 anticuerpos diferentes, que reconocen cada uno de ellos uno de dichos 4 antígenos, en la que los anticuerpos se conjugaron primero a las microesferas respectivas, directamente mediante un enlace químico (Figura 1, los tres ejemplos a la izquierda) o indirectamente, en la que las cuentas se revisten previamente con avidina antes de su conjugación a un anticuerpo biotinilado (Figura 1, ejemplo a la derecha) tal como se ilustra en la Figura 1, un anticuerpo se une a una microesfera teñida de azul, un anticuerpo a una pequeña y otro a una gran microesfera roja fluorescente, mientras que un cuarto anticuerpo ha sido conjugado con avidina-biotina a una microesfera verde fluorescente.

La Figura 2 ilustra como se puede utilizar la presente invención para caracterizar dos o más determinantes de la membrana celular en una situación en la que las células diana son raras en una suspensión de células mezcladas, necesitando así un procedimiento de enriquecimiento antes de la evaluación de la muestra. En el caso ilustrado, se unen a la membrana celular cuentas superparamagnéticas revestidas con anticuerpos junto con microesferas fluorescentes rojas y verdes conjugadas directamente o mediante una unión avidina-biotina a distintos anticuerpos. En tal situación, se puede obtener un enriquecimiento inmunomagnético mediante la utilización de un imán fuerte que atrae a las células unidas a cuentas magnéticas. La suspensión enriquecida en células se examina a continuación en un microscopio en el que se puede observar la unión de las microesferas fluorescentes a las células diana unidas a cuentas magnéticas.

Las partículas fluorescentes o teñidas distinguibles visual o instrumentalmente, que pueden ser del mismo o diferente tamaño, utilizadas en la presente invención están conjugadas a ligandos tales como anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, lectinas y factores de crecimiento que se pueden unir a moléculas específicas expresadas en la membrana de las células anormales, de modo que las partículas unidas se pueden identificar microscópicamente. Los ejemplos comprenden la utilización de microesferas fluorescentes de látex de poliestireno de múltiples colores que se pueden observar en un microscopio de fluorescencia y partículas no fluorescentes teñidas, rojas, amarillas, verdes, negras y azules, que se pueden detectar mediante microscopía de luz convencional. Los anticuerpos conjugados a las microesferas comprenden todos los que reconocen antígenos, receptores y otros determinantes expresados en la membrana de las células anormales y en las células normales, véase a continuación. Mediante la combinación de conjugados de anticuerpos y partículas relevantes a las células que se deberán estudiar, se puede obtener rápidamente y directamente una huella digital de las características celulares en la suspensión de células. Dichas huellas digitales antigénicas podrían ser muy valiosas en la evaluación de características biológicas importantes de las células, ver lo anteriormente descrito, poblaciones o subpoblaciones celulares. La simplicidad y velocidad con la que el procedimiento puede proporcionar dicha información es sorprendente y constituye un elemento clave de la presente invención.

Las partículas fluorescentes y teñidas conjugadas a anticuerpos han sido utilizadas en múltiples tipos de inmunoensayos con el fin de determinar, p. ej., la presencia de antígenos libres, proteínas, virus y bacterias en fluidos biológicos. Con células eucarióticas intactas, las esferas fluorescentes conjugadas a anticuerpos han sido utilizadas para estudiar en cada caso una única proteína expresada en un tipo específico de células normales, tales como monocitos, linfocitos, hepatocitos y fibroblastos. El objetivo de tales estudios ha sido el examen de la motilidad de los marcadores de membrana en los macrófagos o parámetros metabólicos en los hepatocitos. No se han encontrado en la literatura reportajes sobre intentos de estudiar células anormales, tales como las células cancerosas y las células neoplásicas benigna y las células anormales que se encuentran en una multiplicidad de trastornos infecciosos, reactivos, autoinmunes, inflamatorios y proliferativos. Además, no se describe la combinación de múltiples anticuerpos conjugados a diferentes microesferas teñidas o fluorescentes en la misma población de células o en células individuales. Además, no se han utilizado dichos procedimientos en el estudio, con fines diagnósticos, de subpoblaciones de células diana en poblaciones mixtas de células.

Las partículas que se deben utilizar pueden ser microesferas de látex de poliestireno fluorescentes o partículas no fluorescentes de diferentes colores. El tamaño de las microesferas pueden estar comprendido entre 0,01 \mum y 6 \mum. Las partículas deben proporcionar la posibilidad de poder conjugar anticuerpos u otros ligandos en su superficie. Esto se puede lograr directamente, mediante grupos químicos tales como carboxilo, amino u otros grupos, o indirectamente mediante la unión de los anticuerpos a microesferas previamente revestidas con proteínas tales como la avidina, estreptavidina, proteína A, o con anticuerpos que se pueden hacer reaccionar con un segundo anticuerpo. El tamaño de las microesferas se pueden seleccionar para que se ajuste al tamaño de las células y el objetivo de la investigación, de tal modo que pueda facilitar la identificación de diferentes conjugados de anticuerpos-microesferas. Se considera que un tamaño de partícula de p. ej., 1 \mum facilita la identificación de un número relativamente pequeño de partículas unidas, mientras que un tamaño menor podría posiblemente ser ventajoso si se debe estudiar una proteína marcadora que se expresa a una densidad elevada. Otra característica importante de la presente invención es que se puede aplicar tanto cuando se deben examinar números muy pequeños o muy grandes de células. También es importante que las microesferas fluorescentes puedan retener su intensidad de fluorescencia durante un período de tiempo muy largo.

Los anticuerpos que reconocen los antígenos marcadores de membrana relevantes o receptores pueden ser IgG completas de un isotipo cualquiera, anticuerpos IgM o cualquier fragmento de dichos anticuerpos, lo que comprende asimismo anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpos. El nuevo procedimiento comprende unir dichas microesferas fluorescentes o teñidas a una célula diana en una suspensión con un pequeño número de células no diana, y en otros casos el número de células diana es bajo en comparación con el de las células no diana. La suspensión de células se incuba con entre 2 y 6 anticuerpos cada uno de ellos conjugado a diferentes microesferas, del mismo o de diferente tamaño, de un colorante específico o color fluorescente. La proporción entre el número de partículas y el número de células diana puede estar comprendida entre 5:1 y 0,5:1, preferentemente de 5:1, limitada por el tamaño de las partículas. La suspensión de células se debe incubar con las partículas revestidas con anticuerpo durante entre 5 a 10 minutos y 2 horas, preferentemente durante 30 minutos, a entre 0ºC y 37ºC, preferentemente a 4ºC con rotación suave. Después de la incubación, se toman muestras de la suspensión de células para evaluarlos en un microscopio de fluorescencia u otros dispositivos de visualización o imagen en los que se puedan observar las partículas fluorescentes y las partículas teñidas. Las microesferas que se unen a las células se pueden visualizar y el número de células con los diferentes tipos de partículas unidos a su superficie se puede determinar, con o sin la enumeración del número de cuentas unido a las células. Debido a que es posible utilizar una combinación de múltiples microesferas revestidas con anticuerpos, se pueden utilizar filtros de fluorescencia adecuados al estudio de diferentes espectros de emisión fluorescente. El procedimiento proporciona también la posibilidad de análisis de imagen semiautomático mediante vídeo y ordenador para determinar la presencia de partículas teñidas o fluorescentes unidas a las células.

Los anticuerpos pueden ser de origen murino, rata, conejo o humano y preferentemente pueden reconocer antígenos presentes en las células diana y no en las células normales en una suspensión de células mezcladas. Una lista de los anticuerpos/ligandos comprende, aunque sin resultar limitativa, los dirigidos contra grupos de determinantes antigénicos, por ejemplo el antígeno CD56/NCAM, antígeno panepitelial EGP2/grupo2, mucina de mama (MUC1) y otros epítopos de mucina, HMW y otros antígenos asociados a los melanomas tales como gp100, MAGE 1,2 y 3 y MUC18, antígeno 80kD asociado a sarcomas, erbB2, receptores de factores de crecimiento tales como EGF, TGF, PDGF, bFCF, VEGF, IGF1 y IGF2, laminina, lamin5, uPA, uPAr, PAI, TIMP1 y 2, estromelisina, y otras proteínas relacionadas a la invasividad, CEA, PSA, PSM, NSE, c-Met, CD44 y las variantes ICAM-1, integrinas, cadherinas, cateninas y otras moléculas asociadas a la adhesión celular, marcadores de resistencia a fármacos tales como MDR y MRP, moléculas relacionadas a la apoptosis tales como Fas y FasL, marcadores de la proliferación celular, motilidad, diferenciación, metástasis, angiogénesis, transducción de señal y moléculas de la membrana relacionadas a la inflamación, productos de oncogenes y receptores de s tales como CCR 1-5, CXCR 1-4 y antígeno Duffy y todo tipo de marcador de las células hematopoyéticas y linfáticas categorizado en el sistema CD. La Tabla 1 es una lista de los grupos de deter-
minantes de membrana a los que se puede dirigir y muestra asimismo un número de ejemplos en cada un de los grupos.

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TABLA 1 Antígenos/receptores y correspondientes anticuerpos/ligandos

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TABLA 1 (continuación)

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TABLA 1 (continuación)

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TABLA 1 (continuación)

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Los ejemplos descritos a continuación ilustran las formas de realización y reflejan el potencial del nuevo procedimiento para la detección y la caracterización de las células diana, desconocido anteriormente por los expertos en la materia. Resultó muy sorprendente que se pudiesen incubar simultáneamente, o en secuencia, poblaciones de células mezcladas con múltiples anticuerpos diferentes unidos a partículas, que para cada anticuerpo la unión del complejo anticuerpo-partícula a la célula diana fuese específico y que la unión de los diferentes complejos se pudiese visualizar fácilmente y distinguir en un microscopio de fluorescencia con filtros individuales y/o múltiples compatibles con el espectro de emisión fluorescente de las microesferas fluorescentes, o mediante el cambio a microscopía de luz convencional con el fin de identificar mejor la unión de las partículas teñidas no fluorescentes.

Cuando se incuban múltiples complejos partícula-anticuerpo simultáneamente con las células diana en una suspensión de células mezcladas, se esperaría que los complejos se apiñasen o reaccionasen entre sí, formando complejos que se uniesen no específicamente a las células, que por razones estéricas u otras podrían bloquear entre sí la unión a las células, o que la fluorescencia de las partículas podría ser enmascarada, dificultando la distinción entre los diferentes tipos de partículas. Sorprendentemente, sin embargo, siguiendo el procedimiento de acuerdo con la presente invención, no se aprecian dichos problemas. La especificidad de esta estrategia se demuestra además en experimentos que comprenden incubar las células diana con un conjugado de anticuerpo-partícula que produciría fluorescencia amarilla en el microscopio y a continuación con el mismo anticuerpo unido a partículas de fluorescencia roja. En este caso se observó la unión del conjugado anticuerpo-partícula amarillo, mientras que la unión del segundo complejo quedó completamente bloqueada debido a que se había utilizado el mismo anticuerpo para la conjugación a las partículas amarillas y rojas.

Cuando las células diana en una suspensión de células mezcladas son raras, tal como el de las células tumorales en la sangre periférica y la médula ósea, se puede introducir un procedimiento de enriquecimiento antes o en combinación con el procedimiento de las partículas de color/fluorescentes. El enriquecimiento se puede obtener mediante múltiples estrategias conocidas previamente, que comprenden procedimientos inmunológicos tales como el lavado, separación en columna, o la selección positiva o negativa mediante inmunopartículas. Si se prefiere la inmunoselección, la misma etapa de incubación puede comprender tanto las cuentas magnetizables como las que no contienen hierro con los anticuerpos de unión a las células. Después de la etapa de enriquecimiento, la suspensión de células que contiene las células diana se puede examinar y valorar al microscopio para determinar su unión a partículas fluorescentes o teñidas. Además, si se utilizan partículas inmunomagnéticas de, por ejemplo, 1 \mum para el enriquecimiento, también se pueden observar dichas partículas unidas a las células y utilizar como marcador celular adicional (Fig. 2).

La posibilidad de disponer de manera rápida, simple y fiable de mapear simultáneamente los patrones de expresión de varios marcadores relevantes en poblaciones celulares, o al nivel de células individuales, abre nuevas vías para la investigación en biología celular y el diagnótico de rutina, la evaluación de prognosis y del estado de una amplia gama de enfermedades, que se originan en todo tipo de tejidos humanos y animales. En muchas circunstancias el diagnóstico rápido es de gran importancia en la selección de la opción terapéutica. Los ejemplos de esto comprenden los procedimientos quirúrgicos que se deben seleccionar dependiendo de si, por ejemplo, un tumor mamario, de próstata o cerebro, es maligno o no, si el agrandamiento de un nódulo linfáticos es debido a la infiltración de células tumorales o a una reacción inflamatoria, o qué tipo de células constituyen el engrosamiento de las membranas sinoviales de las articulaciones, qué tipo de células se encuentran en las agujas quirúrgicas o biopsias fibroópticas de lesiones de la piel, pulmones, hígado, hueso, ovario o en el intestino y otros tejidos, y qué tipo de células se puede encontrar en las efusiones de pleura o ascites, en CSF, linfa, sangre periférica y médula ósea. Actualmente, el diagnóstico de tales células se basa principalmente en la evaluación morfológica y también en la inmunocitoquímica realizada después de la preparación de secciones de tejidos, citospin o frotis. Morfológicamente puede ser difícil determinar la naturaleza de las células y tal como se mencionó anteriormente, la inmunocitoquímica puede detectar como máximo la presencia de dos marcadores. Con el nuevo procedimiento, las células de las muestras se dispersan, por ejemplo, en disolución salina o medio, se incuban con la combinación relevante de anticuerpos-microesferas durante el tiempo necesario, generalmente 30 minutos, y a continuación se examinan al microscopio. En las suspensiones de células, las partículas unidas se pueden reconocer fácilmente, permitiendo determinar la caracterización inmunológica o el perfil de las células diana de un modo sorprendentemente rápido y simple. Debido a dicha simplicidad, la caracterización de una multiplicidad de parámetros, el corto período de tiempo necesario para completar tanto el proceso como la evaluación, el procedimiento representa una contribución fundamental a los esfuerzos para lograr un diagnóstico rápido y fiable de las enfermedades y obtener información de importancia crucial en la gestión posterior de los pacientes.

Con el fin de ilustrar las situaciones en las que dicha caracterización es importante, se incluyen los siguientes ejemplos teóricos:

En el cáncer de mama es sabido que la expresión en las células tumorales de marcadores tales como erbB2, receptor EGF e IGF2 se puede asociar a un incremento de la proliferación y la agresividad de la enfermedad. Además, la expresión de otros determinantes tales como EGP2, uPAr, VEGF, MUC1, MDR, Fas y FasL puede reflejar características importantes que determinan la capacidad de las células para la metástasis, la inducción de agiogénesis, la resistencia a la quimioterapia, así como también para la apoptosis de las células tumorales o las células T del huésped. Mediante la utilización de una combinación de microesferas se pueden registrar varios de estos parámetros simultáneamente en una sola operación. Dichos estudios se pueden realizar en biopsias de tumores primarios, o biopsias de aguja de metástasis sólidas y en muestras de fluidos pleurales o ascíticos, sangre y médula ósea.

En los pacientes infectados por VIH, la caracterización de los diferentes subconjuntos de linfocitos T es de importancia vital. Los ejemplos de determinantes que se pueden estudiar con el nuevo procedimiento además de los marcadores más comunes de las células T son los receptores de las quimioquinas y las moléculas relacionadas a la apoptosis tales como Fas y FasL.

En los melanomas malignos el grado o la falta de diferenciación de las células tumorales puede reflejar el potencial agresivo de la enfermedad en el sentido de que menos diferenciación está relacionada con una mayor malignidad. Además, en la respuesta inmune son importantes múltiples moléculas, que comprenden marcadores tales como gp 100, MAGE1, 2, 3, B7, Fas y FasL. Debido a que dichos marcadores son importantes para la efectividad de la imunoterapia y la vacunación, la caracterización de éstos así como también de otros antígenos asociados a los melanomas es de gran importancia en la gestión clínica de los pacientes. Dichas caracterizaciones se pueden realizar fácilmente mediante el nuevo procedimiento.

El agrandamiento de los ganglios linfáticos puede reflejar diferentes tipos de trastornos reactivos, infecciosos o malignos. Por consiguiente, puede ser importante determinar si dichos ganglios linfáticos contienen células tumorales o no. Si se encuentran células tumorales, la determinación del tipo de células malignas puede influenciar decisivamente la selección de la terapia. Un ejemplo es la metástasis a los ganglios linfáticos que puede resultar de cáncer de pulmón de célula pequeña (EGP2) o melanoma maligno (HMW250000). Con la selección adecuada del conjugado de anticuerpo-microesfera esta distinción se puede realizar en menos de una hora con el nuevo procedimiento.

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Ejemplos de utilización del nuevo procedimiento 1. Ensayo de especificidad de las partículas fluorescentes conjugadas a anticuerpos en células de cáncer de mama humano

Se incubaron células de cáncer de mama humano MCF-7 con microesferas fluorescentes rosa brillante de 1 \mum revestidas con avidina, con o sin anticuerpo MOC31 anti-EGP2 (anti-marcador de célula epitelial) conjugado a biotina, y/o con cuentas inmunomagnéticas (4,5 \mum) revestidas con un anticuerpo contra mucina de mama (MUC1) (BM7).

Se examinó al microscopio una suspensión de células MCF-7 incubada con partículas fluorescentes sin anticuerpo MOC31. No se detectaron cuentas fluorescentes unidas a las células tumorales. Experimentos semejantes con partículas fluorescentes conjugadas a MOC31 biotina-avidina mostraron entre 5 y 10 partículas fluorescentes unidas a la superficie de las células tumorales. En otro experimento, se incubaron células MCF-7 con partículas inmunomagnéticas revestidas con el anticuerpo BM7 que se une a las células tumorales, seguido de una incubación con partículas fluorescentes con y sin el anticuerpo MOC31. Se descubrió que las células tumorales con cuentas inmunomagnéticas unidas en la superficie también mostraron unión, y solamente, a las partículas fluorescentes conjugadas a MOC31. Los dos tipos de partículas se pueden utilizar fácilmente en paralelo, y los resultados demuestran que no se produce unión no-específica a las partículas que no tienen anticuerpo director.

2. Efecto de la incubación simultánea o en secuencia con partículas revestidas con anticuerpos

Se incubaron células de cáncer de mama humano SKBr3 con múltiples combinaciones de microesferas de látex provistas de fluorescencia rosa brillante conjugadas al anticuerpo MOC31 con o sin incubación simultánea o en secuencia, con cuentas inmunomagnéticas revestidas con los anticuerpos MOC31 o BM7. Los tamaños de partícula fueron como en el Ejemplo 1 anterior. Si tanto las cuentas inmunomagnéticas como las fluorescentes tenían el mismo anticuerpo director y se habían incubado a la vez, se observaron los dos tipos de cuentas unidas a las células tumorales. Si cualquiera de estas microesferas/partículas se incubó primero durante 30 minutos y a continuación durante otros 30 minutos se incubó con las otras partículas conjugadas a anticuerpo, se bloqueó por completo la unión del segundo complejo de anticuerpo-partícula. La unión de cada tipo de partícula conjugada a un anticuerpo diferente e incubada simultáneamente mostró el mismo patrón de unión al observado si cada uno de ellos se estudia en experimentos separados.

3. Unión simultánea de múltiples tipos de microesferas/partículas a las mismas células diana

Se incubaron células de cáncer de mama, que es sabido que expresan múltiples antígenos diferentes en su superficie, simultáneamente con anticuerpos que reconocen 4 de estos antígenos diferentes. Cada uno de los anticuerpos había sido conjugado independientemente a cuatro tipos de microesferas/cuentas: 1) microesferas de látex teñidas de azul (0,5 \mum), 2) microesferas de látex de fluorescencia rosa brillante (1 \mum), 3) microesferas de fluorescencia amarilla (1 \mum) y 4) partículas inmunomagnéticas superparamagnéticas (4,5 \mum). El procedimiento según la presente invención demostró que las células tumorales se unieron a los 4 tipos diferentes de cuentas que se pudieron reconocer claramente mediante la utilización de una combinación de microscopía convencional y de fluorescencia. El número de partículas unido a cada uno de las células osciló para cada complejo de anticuerpo-partícula de acuerdo con el patrón de expresión conocido del antígeno correspondiente. Los anticuerpos reconocieron los antígenos siguientes: EGP2, MUC1, receptor EGF y un marcador epitelial independiente reconocido por el anticuerpo 595.

4. Unión de microesferas fluorescentes a células diana después de un enriquecimiento inmunomagnético

Se añadieron células tumorales humanas NICF7 a células mononucleares de sangre periférica de voluntarios saludables en una proporción de células tumorales por célula mononuclear de 1/1000. La suspensión de células se incubó con anticuerpo MOC31 anti-epitelial unido a microesferas de fluorescencia rosa brillante (1 \mum) mediante un enlace avidina/estreptavidina y simultáneamente a inmunocuentas superparamagnéticas (4,5 \mum) revestidas con los anticuerpos BM7 y anti-MUC1. Después de una incubación de 30 minutos se realizó la inmunoselección de las células tumorales mediante las cuentas inmunomagnéticas unidas a su superficie, y se examinaron al microscopio muestras de la suspensión. Se encontró que las células tumorales restantes con rosetas de cuentas en su superficie tenían también entre 5 y 10 partículas fluorescentes en la membrana, mientras que una célula normal contaminante no mostró unión a ninguna de las partículas/cuentas.

5. Unión de células fluorescentes a células ascíticas malignas

Se llevó al laboratorio una suspensión de células ascíticas extraída de un paciente sin información del origen de las células. La suspensión de células se incubó con diferentes partículas fluorescentes revestidas con anticuerpos e inmunocuentas paramagnéticas según la presente invención. Las partículas revestidas con anticuerpos que reconocen diferentes antígenos marcadores unidos a las células en suspensión, demostraron el epítopo maligno y la naturaleza epitelial de las células, confirmando así el diagnóstico de cáncer de ovario. En otro caso con fluido ascítico no se encontraron células con partículas revestidas con anticuerpos, de acuerdo con la conclusión del patólogo. En los dos casos, el procedimiento descrito en la presente invención proporcionó los resultados de los diferentes marcadores en 45 minutos, mientras que el examen morfológico e inmunocitoquímico en paralelo de un solo marcador se completó por primera vez más de 24 horas después.

6. Detección de células en fluidos pleurales

Sin conocimiento previo de la enfermedad subyacente, la incubación de la suspensión de células con diferentes anticuerpos antitumorales revestidos con partículas fluorescentes e inmunomagnéticas demostró una fuerte unión de todas las microesferas e inmunocuentas con anticuerpos anticarcinoma y mucina de mama (MUC1). El diagnóstico del paciente fue de cáncer de mama con efusión pleural. Las microesferas conjugadas a anticuerpo anti-melanoma no se unieron. En conclusión, en este caso se identificaron asimismo con éxito las células en la muestra clínica.

7. Aspirado por aguja de tumor tiroideo

La suspensión de células obtenida de un aspirado por aguja se incubó con microesferas fluorescentes con un anticuerpo que es conocido que reacciona con células de cáncer colorrectal, y simultáneamente con cuentas inmunomagnéticas revestidas con el anticuerpo anti-epitelial MOC31. Las microesferas fluorescentes no se unieron a ninguno de los tipos de células en la suspensión, mientras que las inmunocuentas MOC31 se unieron fuertemente a las células epiteliales de tiroides pero no se unieron al gran número de macrófagos presentes en la suspensión.

Los ejemplos anteriores demuestran que el nuevo procedimiento según la presente invención demuestra un considerable incremento en la potencia diagnóstica y fiabilidad ya que se puede detectar un número superior de determinantes antigénicos en las células diana en una operación, en un período de tiempo muy corto en comparación con los procedimientos conocidos anteriormente.

Claims (13)

1. Procedimiento para el fenotipado de células diana, tales como células animales y humanas, suspendidas en disolución salina fisiológica o en medio, mediante la utilización de partículas revestidas con anticuerpos/ligandos dirigidos contra determinantes antigénicos/receptores expresados en las células diana, en el que

2 a 6 anticuerpos o ligandos, en el que cada anticuerpo está conjugado a una partícula específica instrumental o visualmente separable mediante fluorescencia, color y tamaño, con tamaños en el intervalo comprendido entre 0,01 \mum
y 6 \mum, en el que la proporción entre el número de partículas y el número de células diana está en el intervalo comprendido entre 5:1 y 0,5:1, se incuban bajo rotación durante 5 a 10 minutos a 2 horas con suspensiones celulares que contienen las células diana a entre 0ºC y 37ºC, preferentemente a 4ºC, en el que las suspensiones celulares se preparan y estudian sin ninguna pérdida de células.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, seguido de un procedimiento de enriquecimiento conocido de por sí, y evaluación del rango de rosetas de células diana microscópicamente en las suspensiones de células y/o por dispositivos adecuados de visualización.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el procedimiento de enriquecimiento se realiza con cuentas inmuno-magnéticas de un tamaño de por lo menos 1 \mum.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho tamaño de partícula está en el intervalo comprendido entre 0,5 \mum y 4,5 \mum, dicha proporción es 5:1 (número de partículas/número de células), dicho tiempo de incubación es de 30 minutos y dicha temperatura de incubación es de 4ºC.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las partículas utilizadas en el procedimiento son separables mediante una combinación de fluorescencia y/o tamaño o una combinación de espectros de emisión fluorescente, diferentes colores o diferentes tamaños.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque las partículas utilizadas son separables mediante una combinación de los espectros de emisión fluorescente y/o el tamaño.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las partículas utilizadas en el procedimiento están revestidas con ligandos/anticuerpos dirigidos contra moléculas de adhesión, antígenos carbohidratos, glicolípidos, receptores de factores de crecimiento, antígenos de melanoma, antígenos de sarcoma, marcadores de carcinoma, antígenos de neuroblastoma, antígenos de glioma, antígenos de cáncer de cabeza y cuello, moléculas asociadas a la apoptosis, antígenos relacionados con la motilidad, antígenos asociados a la proliferación, antígenos asociados a la diferenciación, antígenos relacionados con la resistencia a fármacos, antígenos asociados a la angiogénesis, receptores de quimioquinas, antígenos relacionados con la invasión, catepsina D, antígeno neuroglandular y antígeno pan-humano.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque las partículas utilizadas en el procedimiento están revestidas con ligandos/anticuerpos dirigidos contra los receptores/antígenos que aparecen en la Tabla 1.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque las partículas utilizadas en el procedimiento están revestidas con anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados a tumores.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque los antígenos asociados a tumores son, anticuerpo MOC31 anti-EGP2 (antimarcador de células epiteliales), anticuerpo BM7 anti-mucina de mama (MUC1), 595, anti-receptor EGF (425.3), anti-erbB2 y anti-antígeno de melanoma HMW (9.2.27).

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las células diana son células malignas.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la célula diana está caracterizada porque presenta moléculas de adhesión, receptores de factores de crecimiento, marcadores de carcinoma, antígenos carbohidratos, antígenos de melanoma, antígenos de sarcoma, antígenos de glioma, marcadores asociados a la apoptosis, marcadores relacionados con la motilidad, antígenos asociados a la proliferación, marcadores asociados a la diferenciación, marcadores de la resistencia a fármacos, marcadores asociados a la angiogénesis, receptores de quimioquina, marcadores relacionados con la invasión u otros antígenos.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que las moléculas de adhesión son cadherina-E, los receptores de factores de crecimiento son EGFr, c-erbB2, receptor IL-2, receptor TNF, los marcadores de carcinoma son EGP2, MUC1, MUC2 & 3, PSA, PSM, GA733.2, TAG72, epítopo 15-3, epítopo de carcinoma de ovario CA-125, los antígenos carbohidratos son LeY, CEA, epítopo 15-3, los antígenos de melanoma son HMW 250000, gp 75/TRP-1, p95, MAG 1, 2, 3, los antígenos de sarcoma son los epítopos TP 1 y TP 3, los antígenos de glioma tales como el epítopo Mel-14, los marcadores asociados a la apoptosis son Fas, FasL, p75, los marcadores relacionados con la motilidad son KAT-I, AMF, los antígenos asociados a la proliferación son gp 120, los marcadores asociados a la diferenciación son MUC 18, TA99, los marcadores de resistencia a fármacos son MDR, MRP, los antígenos asociados a la angiogénesis son VEGFr, bFGF, los receptores de quimioquinas son CCR, CXCR, los marcadores relacionados con la invasión son uPAR, uPA, PAT-1, TIMP1 & 2, MMP9, estromelisinas y los otros antígenos son la catepsina D y el epítopo
pan-humano.