ES2293678T3

ES2293678T3 - Composiciones de agentes anticlamidias para el diagnostico y tratamiento de infeccion provocada por clamidias.

Info

Publication number: ES2293678T3
Application number: ES98920292T
Authority: ES
Inventors: William M. Mitchell; Charles W. Stratton
Original assignee: Vanderbilt University
Current assignee: Vanderbilt University
Priority date: 1997-05-06
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: DE69838214T2; EP0981372A2; AU746381B2; ATE369149T1; EP0981372B1; DE69838214D1; CA2289228A1; WO1998050074A3; AU7289998A; WO1998050074A2

Abstract

Composición farmacéutica que comprende al menos dos agentes, cada uno de los cuales es eficaz frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias, en la que uno de los agentes es una rifamicina y en la que los agentes se seleccionan del grupo que consiste en: a) agentes eficaces frente a la fase críptica del ciclo vital de las clamidias; b) agentes eficaces frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias; y c) agentes eficaces frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias.

Description

Composiciones de agentes anticlamidias para el diagnóstico y tratamiento de infección provocada por clamidias.

Antecedentes de la invención

Las clamidias son microorganismos intracelulares estrictos que parasitan células eucariotas y están omnipresentes en todo el reino animal. Los miembros del género de las clamidias se consideran bacterias con un único ciclo de desarrollo bifásico que tiene formas morfológicas y funcionales diferenciadas. Este ciclo de crecimiento de desarrollo alterna entre 1) formas de vida intracelular, de las cuales se reconocen dos actualmente, un microorganismo metabólicamente activo, de replicación conocido como el cuerpo reticulado (CR) y un microorganismo persistente, no replicante conocido como la fase críptica; y 2) una forma de vida extracelular que es una forma infecciosa, metabólicamente inactiva conocida como el cuerpo elemental (CE).

Los CE son formas pequeñas (300-400 nm) infecciosas, de tipo espora que son metabólicamente inactivas, no replicantes, y se encuentran lo más frecuentemente en el medio acelular. Los CE son resistentes frente a una variedad de ataques físicos tales como degradación enzimática, sonicación y presión osmótica. Se piensa que esta estabilidad física es el resultado de una amplia reticulación de disulfuro de la proteína mayor de la membrana externa (MOMP) rica en cisteína (Bavoil et al., Infection and Immunity, 44: 479-485 (1984); Hackstadt et al., Journal of Bacteriology, 161: 25-31 (1985); Hatch et al., Journal of Bacteriology, 165: 379-385 (1986); Peeling et al., Infection and Immunity, 57: 3338-3344 (1989); J.C.A. Bardwell, Molecular Microbiology, 14: 199-205 (1994) y T.P. Hatch, Journal of Bacteriology, 178: 1-5 (1993)). En condiciones de oxidación en el medio acelular del huésped, la membrana externa de los CE es relativamente impermeable así como resistente a la inactivación. Por tanto, se cree que los CE están bien adecuados para sobrevivir el tiempo suficiente fuera de sus huéspedes como para transmitirse a un nuevo huésped en forma de un núcleo goticular (Theunissen et al., Applied Environmental Microbiology, 59: 2589-2593 (1993)) o un fómite (Fasley et al., The Journal of Infectious Diseases, 168: 493-496 (1993)).

La infección por miembros del género Chlamydiae induce una respuesta inmunitaria significativa a nivel celular. Por ejemplo, las lesiones genitales producidas por Chlamydia trachomatis provocan con frecuencia un influjo vigoroso de linfocitos, macrófagos y células plasmáticas, lo que sugiere el desarrollo de inmunidad humoral y celular. Sin embargo, de manera clínica, los síntomas de la infección inicial varían con frecuencia y puede incluso ser asintomática. Una vez establecidas completamente, las clamidias son difíciles de erradicar, con recaídas frecuentes tras la terapia con antibióticos. La evidencia también indica que las clamidias pueden quedar latentes y entonces se liberan en cantidades demasiado bajas como para detectarse de manera fiable mediante cultivo.

Chlamydia pneumoniae (a continuación en el presente documento "C. pneumoniae") es la adición más frecuente al género Chlamydiae y se aísla a partir de seres humanos y actualmente se reconoce como causante de aproximadamente el 10 por ciento de los casos extrahospitalarios de neumonía (Grayston et al., J. Inf Dis. 161: 618-625 (1990)). Este patógeno recientemente reconocido infecta las vías respiratorias superiores e inferiores y ahora se reconoce como omnipresente en los seres humanos. C. pneumoniae está bien aceptado como patógeno de seres humanos que puede ser difícil de erradicar mediante terapia habitual con antibióticos (Hammerschlag et al., Clin. Infect. Dis. 14: 178-182 (1992)). Se sabe que C. pneumoniae persiste como patógeno asintomático o levemente sintomático, dando como resultado una infección crónica, persistente (J. Schacter, En: Baun AL, eg. Microbiology of Chlamydia, Boca Raton, FL, CRC Press, 1988, págs. 153-165).

La terapia actual para la infección sospechada/confirmada por C. pneumoniae es con un ciclo corto (por ejemplo, 2-3 semanas) de un único antibiótico. C. pneumoniae es sensible in vitro a tetraciclina, eritromicina, claritromicina y fluoroquinolonas tales como ofloxacino y esparfloxacino (Kuo et al., Antimicrob Agents Chemother 32: 257-258 (1988); Welsh et al., Antimicrob Agents Chemother 36: 291-294 (1992); Chirgwin et al., Antimicrob Agents Chemother 33: 1634-1635 (1989); Hammerschlag et al., Antimicrob Agents Chemother 36: 682-683 (1992); Hammerschlag et al., Antimicrob Agents Chemother 36: 1573-1574); M.R. Hammerschlag, Antimicrob Agents Chemother 38: 1873-1878 (1994); M.R. Hammerschlag, Infect. Med. págs. 64-71 (1994)). A pesar de esta demostración de sensibilidad in vitro, las infecciones por C. pneumoniae pueden reaparecer tras la terapia con antibióticos con estos agentes. Estudios in vitro sobre la persistencia de las clamidias a pesar de la terapia con antibióticos específicos y apropiados han sugerido que la presencia de antibióticos favorece la formación de un estado intracelular, no replicativo (Beatty et al., Microbiol. Rev. 58: 686-699 (1994)), denominado normalmente fase latente o críptica. Puede considerarse este cambio como una respuesta estricta y también se observa con agotamiento de nutrientes y exposición a \gamma-interferón. La eliminación de la influencia con estrés permite al microorganismo reanudar su replicación. Por tanto, de esta manera, el microorganismo puede escapar de la terapia actual con antibióticos usada en la práctica clínica.

En vistas de la naturaleza crónica y persistente de las infecciones por clamidias, existe una necesidad de métodos fiables, precisos para el diagnóstico de infección patógena así como enfoques terapéuticos para tratar la infección. Debido a la naturaleza sumamente infecciosa de los CE de clamidias y su capacidad para reinfectar células, también existe una necesidad de terapia anticlamidias que erradique totalmente este patógeno, evitando así las secuelas a largo plazo de tales infecciones crónicas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un enfoque único para el diagnóstico y tratamiento de la infección por especies de clamidias, particularmente C. pneumoniae. La invención se basa en el descubrimiento de que una combinación de agentes dirigidos frente a muchos de los diversos estadios del ciclo vital de las clamidias puede tratar satisfactoriamente la infección y finalmente evitar la reinfección/reactivación del patógeno. En consecuencia, una realización de la invención se refiere al uso de una combinación de agentes anticlamidias, que comprende al menos dos agentes, cada uno de los cuales se dirige frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias, en la que uno de los agentes es una rifamicina, en la fabricación de un medicamento para tratar la infección por una especie de clamidias. Por ejemplo, los agentes pueden seleccionarse de los siguientes grupos: a) al menos un agente dirigido frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias; b) al menos un agente dirigido frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias; y c) al menos un agente dirigido frente a una fase críptica del ciclo vital de las clamidias. El patógeno clamidia puede eliminarse más rápidamente cuando se administra una combinación que comprende agentes dirigidos frente a cada fase del ciclo vital de las clamidias.

La invención también se refiere a combinaciones novedosas de agentes anticlamidias y a composiciones farmacéuticas novedosas que incluyen al menos dos agentes anticlamidias, cada uno de los cuales se dirige frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias en las que uno de los agentes es una rifamicina y en las que los agentes se seleccionan del grupo que consiste en: a) agentes dirigidos frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias; b) agentes dirigidos frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias y c) agentes dirigidos frente a una fase críptica del ciclo vital de las clamidias. Estas composiciones y combinaciones de agentes pueden comprender además uno o una combinación de compuestos complementarios, incluyendo agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores y agentes antiporfiriales. También se describe el uso de la combinación de agentes anticlamidias o composiciones de los mismos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección por clamidias. En una realización particular, los agentes pueden ensamblarse individualmente, mezclarse o ensamblarse según las instrucciones.

La invención proporciona la base para una terapia novedosa que comprende un agente específico dirigido frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias que, si se usa durante un periodo de tiempo suficiente, permite completarse la infección activa sin la creación de CE infecciosos.

Con el fin de facilitar el cumplimiento del paciente durante un ciclo de tratamiento, la invención proporciona una base para empaquetar agentes terapéuticos, descritos en el presente documento, para el tratamiento de la infección por clamidias. Por ejemplo, un paquete puede comprender al menos dos agentes diferentes, cada uno de los cuales se dirige frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias, en el que uno de los agentes es una rifamicina. Estos agentes pueden seleccionarse del grupo que consiste en: a) al menos un agente dirigido frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias; b) al menos un agente dirigido frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias y c) al menos un agente dirigido frente a una fase críptica del ciclo vital de las clamidias. Igualmente puede haber compuestos complementarios opcionales, tal como se mencionó previamente, presentes en el paquete. Un paquete preferido comprenderá una pluralidad de agentes que se dirigen a dos, pero preferiblemente a todos, los estadios del ciclo vital de las clamidias. El paquete puede proporcionar una dosis unitaria de los agentes o puede comprender una pluralidad de dosis unitarias, y puede etiquetarse con información, tal como el modo y orden de administración (por ejemplo, por separado, simultánea o secuencialmente) de cada componente contenido en el mismo.

La invención también proporciona la base para un método para evaluar el estado de infección de un individuo y/o el avance de la terapia en un individuo que se somete a terapia para una infección provocada por clamidias. El método comprende cuantificar el título de anticuerpos u otra medida para el patógeno y comparar la medida con la medida de anticuerpos cuantificada en un momento anterior en la terapia, mediante lo cual la diferencia entre las medidas es indicativa del avance de la terapia. La invención también proporciona la base para un método para monitorizar el ciclo de tratamiento para tratar una infección por clamidias, que comprende determinar la presencia o ausencia de clamidias en un individuo infectado a intervalos de tiempo durante el ciclo de tratamiento. En una realización particular, esto se determina mediante ensayo de PCR para determinar ADN de patógeno o ensayo de captura de antígenos para patógeno.

La detección de la presencia de clamidias en una muestra de material biológico tomada de un individuo que se piensa que está infectado con las mismas es importante para determinar el ciclo de tratamiento y los agentes que deben usarse. Esto puede lograrse detectando la presencia de ADN que codifica para MOMP de clamidias u otros genes de clamidias en el individuo. Las enfermedades asociadas con la infección por clamidias, tales como enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades en las que el individuo está inmunocomprometido, pueden tratarse mediante tratamiento (es decir, reducción significativa de la infección o su erradicación) de la infección por clamidias usando el enfoque novedoso descrito en el presente documento. Se han demostrado mejoras/resoluciones tanto clínicas como serológicas en el estado de pacientes.

En el presente documento se describe una prueba de sensibilidad para identificar agente(s) que puede(n) reducir significativamente/eliminar la infección por clamidias para fines ilustrativos. El método comprende preparar un cultivo tisular de líneas celulares; inocular estas células con clamidias en ausencia de cicloheximida; permitir que las clamidias infecten estas células durante varios días; añadir el/los agente(s) que va(n) a someterse a prueba, agente(s) que se repone(n) si es necesario durante la duración de la incubación; aislar ácido nucleico de clamidias de las células; y evaluar la presencia o ausencia de ADN de clamidias usando un ensayo de amplificación de nucleótidos adecuado, tal como PCR. Preferiblemente, se determina la presencia o ausencia de señal para ADN amplificado que codifica para MOMP de clamidias u otra proteína de clamidias. La ausencia de una señal indica una reducción en el grado de infección por debajo del detectable mediante técnicas de amplificación de ácido nucleico y sugiere fuertemente la erradicación del microorganismo. Las pruebas de sensibilidad descritas en el presente documento son particularmente útiles como una herramienta de selección de fármacos para evaluar la actividad de agentes individuales o combinaciones de agentes frente a infección por clamidias.

El único y novedoso aspecto de la prueba de sensibilidad descrito en el presente documento es que mide la presencia o ausencia de ADN de clamidias y por tanto puede detectar formas crípticas y/o cuerpos elementales, ambas de las cuales son viables, aunque no replicantes.

En una realización, un ensayo de nucleótidos adecuado para identificar agentes eficaces frente a una forma críptica de clamidias comprende, en presencia de agente(s) que va(n) a someterse a prueba, someter células cultivadas a proteasa/agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol (DTT)) y digestión por proteasa o isotiocianato de guanidina (también conocido como tiocianato de guanidina) durante un periodo de tiempo prescrito; extraer ADN de la disolución tratada; exponer ADN a polimerasa, dNTP y cebadores apropiados para la amplificación del ADN de MOMP u otra proteína de la especie de Chlamydia; y determinar la presencia o ausencia de ADN amplificado visualizando el producto de ADN tratado con bromuro de etidio mediante electroforesis en gel, por ejemplo. En realizaciones particulares, la especie de Chlamydia es C. pneumoniae y los cebadores apropiados son CHLMOMPDB2 y CHLMOMPCB2.

En el presente documento se describe además un método de identificación de células que contienen una forma críptica de una especie de Chlamydia mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) que comprende someter células cultivadas a digestión por proteasa; detener la actividad proteasa, exponer las células a ADN polimerasa termoestable, dNTP y cebadores marcados apropiados (por ejemplo, marcados con 3'-biotina, marcados con 5'-biotina) para determinar la amplificación de ADN que codifica para MOMP de la especie de Chlamydia; lavar las células; exponer las células a una molécula indicadora (por ejemplo, enzima señal conjugada con estreptavidina); exponer las células a un sustrato apropiado para la molécula indicadora (por ejemplo, enzima conjugada); y visualizar el ADN amplificado que codifica para MOMP visualizando el producto de la reacción.

Un método de identificación de células que contienen una forma críptica de clamidias comprende tratar células cultivadas, que se piensa que están infectadas con clamidias, con un agente reductor de disulfuro; someter células cultivadas a digestión por proteasa; exponer las células a polimerasa, dNTP y cebadores apropiados para la amplificación de ADN del ácido nucleico que codifica para una proteína de clamidias; exponer las células a una enzima molécula indicadora; exponer las células a un sustrato apropiado para la enzima indicadora; y determinar la presencia de una forma críptica de clamidias visualizando el ADN amplificado que codifica para una proteína de clamidias. Preferiblemente, la técnica de amplificación es PCR y los cebadores son CHLMOMPDB2 y CHLMOMPCB2 de Chlamydia pneumoniae.

Puede usarse un método similar como un ensayo para identificar un agente que es eficaz frente a una forma críptica de clamidias. En consecuencia, el método comprende tratar células cultivadas que se hacen crecer en ausencia de cicloheximida, que se piensa que están infectadas con clamidias, con un agente reductor de disulfuro; permitir que las clamidias se repliquen; añadir un agente de prueba; someter las células cultivadas a digestión por proteasa; exponer las células a polimerasa, dNTP y cebadores apropiados para la amplificación de ADN de una proteína de clamidias; exponer las células a una enzima molécula indicadora; exponer las células a un sustrato apropiado para la enzima indicadora; y determinar la presencia de una forma críptica de clamidias visualizando el ADN amplificado que codifica para una proteína de clamidias, tal como MOMP.

También se describe un método de detección de cuerpos elementales de clamidias en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un agente reductor de disulfuro antes de usar una técnica de amplificación de ADN para detectar ADN de clamidias en la muestra.

La presente invención se refiere a métodos ex vivo para eliminar la infección por clamidias de material biológico. Según el método, se elimina la infección por clamidias de un material biológico poniendo en contacto el material biológico con al menos dos agentes pero preferiblemente tres agentes, cada uno de los cuales se dirige frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias, en el que uno de los agentes es una rifamicina, hasta que las pruebas del material biológico ya no dan positivo para clamidias. Los agentes pueden seleccionarse del grupo que consiste en a) agentes dirigidos frente a una fase críptica del ciclo vital de las clamidias; b) agentes dirigidos frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias y c) agentes dirigidos frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias. En una realización, el agente dirigido frente a la fase de cuerpo elemental es un agente reductor de disulfuro. En otra realización, el agente dirigido frente a una fase críptica es un compuesto nitroaromático, tal como nitroimidazoles, nitrofuranos, análogos, derivados y combinaciones de los mismos.

Para fines ilustrativos, el material biológico del que se ha eliminado la infección por clamidias puede ser una línea celular continua tal como HeLa-CF, HL-CF, H-292-CF, HuEVEC-CF y McCoy-CF; en las que "CF" es una anotación abreviada para "libre de clamidias - Chlamydia-free". Alternativamente, el material biológico puede ser un animal, tal como un ratón, conejo u otro modelo animal, que da negativo para clamidias.

La invención proporciona una base para métodos de mantenimiento del estado libre de clamidias en animales y líneas celulares en las que se ha eliminado la infección por clamidias mediante los métodos de esta invención, o nunca se han infectado, tales como su descendencia o progenie libre de clamidias. Las células o animales pueden mantenerse libres de clamidias manteniéndolos con antibióticos y/o tratando sus nutrientes y entorno para garantizar que están libres de clamidias. Particularmente, puede tratarse una fuente de nutrientes que va a administrarse a células o animales libres de clamidias para inactivar o eliminar cualquier cuerpo elemental de clamidias de la misma. Esto puede lograrse exponiendo los nutrientes a irradiación gamma durante un periodo de tiempo y nivel de exposición adecuados para inactivar los cuerpos elementales. Además, o de manera alternativa, puede hacerse pasar una fuente de nutrientes a través de un sistema de filtración para eliminar físicamente los cuerpos elementales de clamidias de la misma. Opcionalmente, puede tratarse en primer lugar la fuente de nutrientes con un agente reductor de disulfuro, tal como ditiotreitol, antes de realizar la etapa de filtración. El filtro debe ser de tamaño adecuado tal que se evita que los objetos superiores a 0,5 micrómetros pasen a través.

Para fines ilustrativos, en el presente documento se describe un método de detección de clamidias viables en un material biológico que se sospecha que está contaminado con las mismas, que comprende cultivar animales o células libres de clamidias en presencia de material biológico y entonces determinar la presencia o ausencia de clamidias viables en el cultivo.

Sólo para fines ilustrativos, en el presente documento se describe un método para diferenciar la porfiria provocada por la especie de Chlamydia de la porfiria provocada por un trastorno genético. El método comprende medir las enzimas de glóbulos rojos periféricos y/o realizar una detección de porfirina fecal y/o urinaria, en el que si las enzimas de glóbulos rojos periféricos son normales o elevadas y la detección fecal/urinaria es elevada en uno o más componentes de la ruta del hemo, la porfiria no está provocada por un trastorno genético y puede estar provocada por clamidias. Un método para diagnosticar porfiria secundaria provocada por clamidias en un individuo que tiene síntomas asociados con las mismas, comprende determinar la presencia o cantidad de enzimas obligatorias en la biosíntesis de hemo en glóbulos rojos del individuo y determinar la presencia de clamidias en el individuo. Además, un método para diferenciar la porfiria secundaria provocada por clamidias de la provocada por un trastorno genético en un individuo, comprende tratar la infección por clamidias en muchos estadios de su ciclo vital y después evaluar si se han reducido las porfirinas, en el que una reducción en los niveles de porfirina es indicativa de que de que la porfiria es secundaria y está provocada por clamidias.

Para fines ilustrativos, un método para tratar la porfiria provocada por clamidias en un individuo que lo necesita, comprende reducir los niveles del estadio activo, el estadio latente y los cuerpos elementales del patógeno del individuo y administrar uno o más compuestos que reducen los efectos adversos asociados con la porfiria secundaria. El método puede comprender adicionalmente administrar un compuesto que reduce los efectos adversos de porfirinas asociadas con la porfiria. El compuesto puede ser cimetidina. Este método también puede combinarse de manera valiosa con etapas adicionales, que incluyen al menos una de administrar antioxidantes; administrar por vía oral carbón vegetal activado; administrar un régimen dietético con alto contenido en hidratos de carbono; administrar hidroxicloroquina; administrar fármacos de benzodiazepina; realizar hemodiálisis; realizar plasmaféresis; administrar agentes quelantes y administrar hematina intravenosa.

Para fines ilustrativos, pueden detectarse niveles elevados de porfirina en un individuo sometiendo a prueba a ese individuo para detectar anticuerpos frente a porfirinas y puede diagnosticarse la deficiencia detectando anticuerpos frente a B-12. Pueden producirse anticuerpos monoclonales y policlonales frente a porfirinas y/o vitamina B 12.

Para fines ilustrativos, la invención proporciona una base para un método que puede automatizarse usando un sistema informático, por ejemplo, para formular una terapia farmacológica para el tratamiento de la infección provocada por clamidias. El método comprende determinar dianas dentro del ciclo vital de las clamidias, para cada diana determinada; identificar agentes que son activos frente a la diana; y combinar al menos un subconjunto de los agentes identificados para proporcionar una terapia de combinación para el tratamiento de la infección provocada por clamidias, siendo los agentes en dicho subconjunto activos individualmente frente a diferentes dianas en el ciclo vital de clamidias. Las dianas incluyen identificar fases del ciclo vital de las clamidias y para cada fase identificada del ciclo vital, determinar al menos un aspecto vulnerable del microorganismo durante esa fase del ciclo vital, definiendo cada uno de dichos aspectos vulnerables determinados una diana dentro del ciclo vital de las clamidias. Entonces se someten a prueba los agentes identificados mediante el método usando el procedimiento de pruebas de sensibilidad descrito en el presente documento y las dosificaciones iniciales para los agentes de combinación se establecen basándose en la farmacocinética y farmacodinamia para los agentes prescritos individualmente, incluyendo dicho establecimiento de la dosificación inicial modificar la dosificación de combinación según los resultados de las pruebas de sensibilidad y la eficacia in vivo.

Sólo para fines ilustrativos, en el presente documento se describe un método de purificación de una muestra de sangre, que comprende someter la muestra de sangre a hemodiálisis o plasmaféresis; en particular, se lleva a cabo la plasmaféresis usando un aparato de plasmaféresis que utiliza un filtro que contiene sulfona o un filtro que contiene carbón vegetal. La muestra de sangre puede obtenerse de un depósito o banco de sangre.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran una alineación de secuencia de diversas MOMP de clamidias.

La figura 2 muestra la proteína de fusión de tiorredoxina expresada que contiene un sitio de cromatografía de afinidad de polihistidina, un sitio de escisión por enterocinasa y la proteína MOMP de longitud completa con una inserción de alanina tras aal. Para leer de amino a carboxilo se lee de izquierda a derecha. El contenido total en aminoácidos en la proteína expresada es de 530 residuos.

La figura 3 ilustra el dominio variable (VD) y constante de diversas especies de Chlamydia.

La figura 4 ilustra las secuencias de aminoácidos peptídicos empleadas para la construcción de ELISA basadas en péptidos con especificidad de especie por VD1.

La figura 5 ilustra los péptidos para VD2 que se usan de manera similar a las secuencias de VD1.

Descripción detallada de la invención

Esta invención describe agentes anticlamidias específicos que se usan en combinación para eliminar o interferir con más de una de las distintas fases del ciclo vital de la especie de Chlamydia. Estas fases de clamidias incluyen la fase intracelular metabolizante/de replicación; las fases intracelulares "crípticas" y la fase extracelular de CE. Los conceptos actuales de pruebas de sensibilidad para clamidias y terapia antimicrobiana para sus infecciones asociadas se dirigen únicamente a una fase, la fase de replicación. A menos que se traten múltiples fases del ciclo vital por la terapia anticlamidias, es posible que el patógeno escape a los efectos deseados del/de los agente(s) antimicrobiano(s) usados y provoque la infección recurrente tras la reactivación desde la latencia. Para los fines de esta invención, "fase críptica" abarca cualquier forma no replicante, intracelular, de la que hay varios estadios diferenciados, incluyendo, pero sin limitarse a, CE intracelulares, CE que se transforman en CR y viceversa, CR miniaturizados, CR no replicantes y similares.

Los métodos terapéuticos y de diagnóstico para el tratamiento de las infecciones por clamidias se describen en detalle a continuación. Para los fines de esta invención, el "tratamiento de la infección por clamidias" se define como una reducción sustancial de la presencia de todas las fases/formas de clamidias en el huésped infectado tratando al huésped de tal manera que se minimizan las secuelas de la infección. Por tanto, las infecciones por clamidias pueden tratarse mediante un único enfoque denominado en el presente documento como "terapia de combinación" que se define para el fin de esta solicitud como la administración de múltiples agentes que juntos se dirigen al menos a dos pero preferiblemente a muchas de las múltiples fases del ciclo vital de las clamidias, tomado cada agente por separado, de manera simultánea o secuencial durante el ciclo de tratamiento. Cuando se usan solos, estos agentes no pueden eliminar ni tratar la infección por clamidias. Los métodos de diagnóstico y terapias de combinación descritos a continuación pueden aplicarse de manera general para la infección provocada por cualquier especie de Chlamydia, incluyendo, pero sin limitarse a, C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci y C. pecorum. Se enfatizan las infecciones en las que el agente causante es C. pneumoniae.

Los agentes anticlamidias, que se han identificado como eficaces frente a las clamidias mediante los métodos de pruebas de sensibilidad descritos en el presente documento, pueden usarse individualmente para afectar a las clamidias en un único estadio de su ciclo vital o como parte de una terapia de combinación para tratar la infección por clamidias. Por ejemplo, pueden usarse compuestos identificados como fármacos frente a la fase críptica, fármacos frente a la fase de CE, fármacos frente a la ARN polimerasa dependiente de ADN y fármacos derivados del ácido nicotínico solos o en combinación para eliminar, reducir o evitar una o más de las distintas fases del ciclo vital de las clamidias. Algunos de estos compuestos no se ha mostrado hasta la fecha que tengan actividad anticlamidias.

Diagnóstico de infección por clamidias

La invención proporciona una base para métodos para diagnosticar la presencia de clamidias en un material biológico, así como para el uso de estos métodos para evaluar el estado serológico de un individuo que se somete a terapia de combinación anticlamidias. Para los fines de esta solicitud, "material biológico" incluye, pero no se limita a, secreciones corporales, líquidos corporales y muestras de tejidos. Ejemplos de secreciones corporales incluyen secreciones del cuello uterino, secreciones traqueo-bronquiales y secreciones faríngeas. Los líquidos corporales adecuados incluyen sangre, sudor, lágrimas, líquido del sistema cefalorraquídeo, suero, esputo, cerumen, orina, líquido sinovial y saliva. Este término abarca animales, células y muestras de tejidos tales como de una variedad de
biopsias.

Se describen ensayos basados en péptidos para la detección de una o más inmunoglobulinas, tales como IgG, IgM, IgA e IgE, frente a determinantes antigénicos dentro de las MOMP recombinantes de longitud completa de diversas especies de Chlamydia. Se prefiere la detección de IgG y/o IgM frente a determinantes antigénicos dentro de la MOMP recombinante de longitud completa de C. pneumoniae. Las determinaciones de IgA son útiles para el análisis de respuestas humerales frente a clamidias en secreciones de superficies mucosas (por ejemplo, pulmón, tracto GI, tracto genitourinario, etc.). De manera similar, las determinaciones de IgE son útiles para el análisis de manifestaciones alérgicas de la enfermedad. La tabla 1 a continuación proporciona los números de registro de GenBank de diversas MOMP para especies de Chlamydia.

TABLA 1

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Por ejemplo, puede obtenerse un material biológico, tal como una muestra de tejido y/o líquido, de un individuo y puede usarse un ensayo adecuado para evaluar la presencia o cantidad de ácidos nucleicos de clamidias o proteínas codificadas por los mismos. Los ensayos adecuados incluyen métodos inmunológicos tales como ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzimas (ELISA), incluyendo ensayos de luminiscencia (por ejemplo, fluorescencia y quimioluminiscencia), radioinmunoensayo e inmunohistología. Generalmente, se combinan una muestra y anticuerpo en condiciones adecuadas para la formación de un complejo anticuerpo-proteína y se evalúa la formación del complejo anticuerpo-proteína (directa o indirectamente). En todos los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento, los anticuerpos pueden marcarse directamente con una enzima, fluoróforo, radioisótopo o agente luminiscente. Alternativamente, pueden unirse anticuerpos de manera covalente con un eliminador específico tal como biotina. La detección posterior se realiza uniendo avidina o estreptavidina marcada con una enzima indicadora, fluoróforo, radioisótopo o agente luminiscente. Con respecto a esto, la etapa de detección sería mediante reacción enzimática, emisión de fluorescencia, radioactividad o luminiscencia, respectivamente.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, tal como anticuerpo anti-IgG monoclonal humana o anticuerpo anti-IgM monoclonal humana. Ejemplos de anticuerpos útiles incluyen anticuerpo de ratón anti-IgG monoclonal humana que no tiene reacción cruzada con otras inmunoglobulinas (Pharmagen; Clone G18-145, nº de catálogo 34162D); anticuerpo de ratón anti-IgM monoclonal humana sin reactividad cruzada con otras inmunoglobulinas (Pharmagen; Clone G20-127, nº de catálogo 34152D). Pueden desarrollarse inmunoensayos basados en péptidos que son específicos de clamidias o proporcionan especificidad de especie, pero no necesariamente especificidad de cepa dentro de una especie, usando anticuerpos monoclonales o policlonales que no tienen reactividad cruzada para determinantes antigénicos sobre MOMP de una especie de clamidias que no es de interés.

Se han desarrollado ensayos inmunológicos basados en recombinación para cuantificar la presencia de inmunoglobulinas frente a la especie de Chlamydia. Puede sintetizarse MOMP de clamidias recombinantes de longitud completa usando un sistema de expresión apropiado, tal como en E. coli o baculovirus. La proteína expresada sirve así como el antígeno para métodos inmunológicos adecuados, tal como se trató anteriormente. Pueden diseñarse técnicas inmunológicas basadas en proteínas que son específicas de especie y cepa para diversas clamidias.

El diagnóstico de la infección por clamidias puede hacerse ahora con un método de cuantificación mejorado de IgM/IgG frente a C. pneumoniae usando técnicas de ELISA, confirmación mediante inmunotransferencia de la especificidad de ELISA y la detección del gen de MOMP de C. pneumoniae en el suero usando cebadores de amplificación específicos que permiten el aislamiento de todo el gen para el análisis de las diferencias esperadas específicas de la especie.

Puede usarse cualquier técnica conocida para la amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, ADN y ARN) con los ensayos descritos en el presente documento. Las técnicas de amplificación preferidas son las metodologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprenden PCR en disolución y PCR in situ, para detectar la presencia o ausencia de genes únicos de clamidias. Pueden diseñarse ensayos específicos de especie para detectar clamidias basándose en los cebadores seleccionados. Ejemplos de cebadores de amplificación por PCR adecuados se ilustran a continuación en la tabla 2. Ejemplos de cebadores preferidos se ilustran en la tabla 3.

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TABLA 3

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También puede llevarse a cabo la reacción en cadena de la ligasa mediante los métodos de esta invención; los cebadores/sondas para la misma pueden construirse usando la práctica habitual. La amplificación de todo el gen de MOMP es útil para el análisis mutacional y la producción de MOMP recombinante. Pueden usarse cebadores más cortos para la amplificación específica de la mayor parte del genoma de MOMP con una modificación del protocolo de amplificación. Por ejemplo, puede usarse un cebador de cadena negativa de 22 pb de la secuencia 5'-CAGATACGTG AGCAGCTCTC TC-3' (CPNMOMPC; SEQ ID NO. 39) con una T_{m} calculada = 55º más un cebador de cadena positiva de 25 pb de la secuencia 5'-CTCTTAAAGT CGGCGTTATT ATCCG-3' (CPNMOMPD; SEQ ID NO. 40) con una T_{m} calculada = 53,9º como par de cebadores ajustando la etapa de hibridación en el protocolo de amplificación (tabla 2) desde 58ºC hasta 50ºC. De manera similar, pueden amplificarse regiones más pequeñas de MOMP mediante una gran variedad de pares de cebadores para fines de diagnóstico aunque la utilidad de la identificación de cadena es reducida y puede bloquearse la amplificación si uno o ambos pares de cebadores se hibridan con una región que se ha mutado. La amplia experiencia con la amplificación mediante PCR de MOMP de longitud completa indica que los acontecimientos mutacionales dentro de los sitios de hibridación CHLMOMPDB2 y CHLMOMPCB2 son poco comunes o inexistentes.

Las técnicas de amplificación de ácido nucleico descritas anteriormente pueden usarse para evaluar el ciclo de tratamiento anticlamidias. La ausencia continuada de ADN de clamidias detectable que codifica para MOMP como función de la terapia anticlamidias es indicativa del tratamiento clínico de la infección por clamidias. La mejora serológica puede basarse en los criterios serológicos actuales para la erradicación de clamidias crónicas notificados a continuación en la tabla 4.

TABLA 4

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A continuación se tratan en detalle técnicas de PCR preferidas en la sección de ejemplos. En general, se lleva a cabo la PCR en disolución en un material biológico incubando previamente en primer lugar el material en un agente reductor apropiado que puede reducir los enlaces disulfuro que mantienen la integridad de la MOMP y otras proteínas de superficie de los cuerpos elementales de clamidias, comprometiendo así la envuelta protectora externa de los CE y permitiendo la penetración de la proteasa. Los agentes reductores de disulfuro adecuados incluyen, pero no se limitan a, ditiotreitol, succímero, glutatión, DL-penicilamina, disulfuro de D-penicilamina, ácido 2,2'-dimercaptoadípico, ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico. Las concentraciones apropiadas de estos agentes reductores pueden determinarse fácilmente por el experto en la técnica sin experimentación excesiva usando una concentración de 10 \muM de ditiotreitol (el agente reductor preferido) como directriz. Si no se incluye un agente reductor en la etapa inicial, puede evitarse que se aísle el ADN de CE en la etapa posterior. Los datos presentados en el ejemplo 1 muestran los efectos de diversos agentes reductores sobre la sensibilidad de los CE a la digestión por proteinasa K. Los datos in vitro muestran que ditiotreitol es el más eficaz para abrir los CE para su digestión por proteasa.

Una vez liberada la envuelta externa de los CE, se somete el material previamente incubado a digestión de proteínas usando una proteasa (por ejemplo, proteinasa K), o una enzima funcionalmente equivalente. Se extrae el ADN y se somete a una técnica de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, PCR. Entonces puede amplificarse todo el gen o una parte del mismo que contiene el/los determinante(s) antigénico(s) único(s) que codifica(n) para MOMP u otro gen adecuado usando cebadores apropiados que flanquean al gen que va a amplificarse. Por ejemplo, el gen o parte del mismo puede ser el gen que codifica para MOMP, OMP-B, GRO-ES, GRO-EL, DNAK, ARN 16S, ARN 23S, el gen que codifica para ribonucleasa-P, una proteína de unión de 76 kd o un gen de KDO-transferasa. En un método alternativo, puede sustituirse con tiocianato de guanidina, preferiblemente a una concentración de 4 M, o desnaturalizante reductor funcionalmente equivalente para las etapas de reducción de disulfuro/proteasa.

Entonces se separa el ADN amplificado y se identifica mediante técnicas electroforéticas habituales. Se identifican bandas de ADN usando tinción con bromuro de etidio y detección con luz UV. Pueden diseñarse cebadores de PCR para amplificar selectivamente ADN que codifica para MOMP de una especie particular de Chlamydia, tal como la MOMP de C. pneumoniae, C. pecorum, C. trachomatis, C. psittaci (véase la figura 1). Pueden diseñarse para este fin cebadores que tienen desde aproximadamente 15 unidades monoméricas hasta aproximadamente 40 unidades monoméricas.

Para la PCR in situ, los cebadores de amplificación se diseñan con una molécula indicadora conjugada al extremo 5'-terminal. Las moléculas indicadoras adecuadas se conocen bien y pueden usarse en el presente documento. Sin embargo, se prefieren cebadores marcados con biotina. Para el gen de MOMP, se han diseñado mediante ingeniería los cebadores CHLMOMPDB2 y CHLMOMPCB2 con una biotina en el extremo 5'-terminal. Para la PCR in situ, usando marcadores de biotina incorporados en el extremo 5'-terminal de los cebadores de amplificación, la amplificación de cada cadena de ADN da como resultado un ADN de doble cadena que contiene 2 moléculas de biotina. Alternativamente, pueden usarse otras secuencias de ADN específicas, aunque la secuencia descrita anteriormente es la realización preferida ya que el producto grande producido (1,2 kb) evita la difusión que puede ocurrir con amplificaciones de ADN más pequeñas. De manera similar, pueden incorporarse otros marcadores de detección (es decir, fluoresceína, por ejemplo) en el extremo 5' o digoxigenina-dUTP (reemplazo para dTPP) dentro del ADN amplificado. Alternativamente al marcaje del producto, pueden usarse sondas de hibridación específicas para regiones constantes del ADN amplificado para identificar un producto amplificado. Este último método tiene una utilidad particular para la construcción de equipo de laboratorio automatizado para PCR basada en disolución. Por ejemplo, pueden usarse placas de ELISA recubiertas con estreptavidina para capturar una o ambas cadenas de un ADN marcado en 5' con biotina con detección mediante fluorescencia de una fluoresceína u otra sonda de detección fluorófora
incorporada.

Eliminación de clamidias y mantenimiento de organismos libres de clamidias

La presente invención proporciona una base para un enfoque único para crear y mantener animales y líneas celulares que están libres de infección por clamidias. También se describen en el presente documento métodos para crear nutrientes y medios de cultivo que son adecuados para su uso con animales y líneas celulares de los que se ha eliminado la infección por clamidias.

Los intentos de cultivar aislados de C. pneumoniae a partir de sangre y liquido cefalorraquídeo (LCR) han dado como resultado el descubrimiento de que las líneas celulares continuas usadas habitualmente para cultivar C. pneumoniae están crípticamente infectadas por C. pneumoniae. Esto incluye no sólo las reservas internas de células HeLa, HL, H-292, HuEVEC y McCoy, sino también reservas obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), la fundación de investigación de la Universidad de Washington para células HL, así como un proveedor comercial (Bartells) de células H-292 y McCoy para el cultivo clínico de clamidias. La presencia de una forma críptica de C. pneumoniae en estas células se ha demostrado repetidamente mediante amplificación por PCR en disolución de MOMP. La PCR in situ en células HeLa frente a MOMP demuestra que los genes de MOMP están presentes en el 100% de las células. No obstante, los AcM con agente fluorescente frente a LPS en células McCoy no dieron ninguna indicación de clamidias (es decir, son reactivos frente a todas las clamidias) mientras que los AcM con agente fluorescente frente a MOMP de C. pneumoniae dan una fluorescencia generalizada en todo el citoplasma que puede confundirse con autofluorescencia no específica. La infección con Chlamydia trachomatis (proporcionado por Bartells) da la tinción de cuerpo de inclusión típica con el AcM frente a LPS (es decir, reacción cruzada con todas las especies de Chlamydia) sin cambios en la señal citoplasmática con AcM anti-MOMP frente a C. pneumoniae. Estos hallazgos (PCR en disolución, PCR in situ, reactividad de AcM) se interpretaron como coherentes con la infección críptica (no replicante) por C. pneumoniae de células comúnmente usadas para cultivar el microorganismo. Además, casi todos los conejos y ratones no tratados sometidos a prueba hasta hoy tienen señales de PCR para el gen de MOMP de C. pneumoniae.

Esto crea un problema actualmente no reconocido de principal significación para los laboratorios clínicos que proporcionan servicios de cultivo de C. pneumoniae así como investigadores que no saben si sus resultados en animales o en cultivos celulares se verán afectados por la contaminación de clamidias crípticas. Los laboratorios clínicos y de investigación no tienen actualmente ningún modo de determinar si un organismo está realmente libre de clamidias.

Para fines ilustrativos, en el presente documento se describe un método para eliminar C. pneumoniae de células y animales y mantenerles limpios. La eliminación conlleva poner en contacto el organismo infectado con agentes usados individualmente o en combinación para eliminar o interferir con más de una de las distintas fases del ciclo vital de especies de Chlamydia. Mantenerles limpios conlleva o bien mantenerles con antibióticos y/o bien tratar sus nutrientes y entorno para garantizar que están libres de clamidias. Las condiciones de mantenimiento pueden comprender una combinación de isoniazida (INH) (1 \mug/ml), metronidazol (1 \mug/ml) y ditiotreitol (10 \muM) en el medio de cultivo. Los cambios de medio se realizan cada 3 días o dos veces por semana. Las células pueden retirarse de la disolución protectora entre 1 y 7 días antes de usarse para el cultivo u otros fines.

Estas técnicas han hecho ahora posible crear una variedad de organismos libres de clamidias (CF), incluyendo líneas celulares continuas denominadas HeLa-CF, HL-CF, H-292-CF, HuEVEC-CF, McCoy-CF, mono verde africano y otras líneas celulares que pueden soportar el crecimiento de clamidias. Pueden producirse diversas cepas CF de ratones, conejos y otros modelos animales para su uso en investigación.

Dado que las clamidias son sumamente infecciosas, los organismos de los que se han eliminado infecciones extracelulares, replicantes y crípticas deben protegerse de la exposición a CE viables si los organismos deben permanecer limpios. Los inventores han descubierto que muchos de los nutrientes y otros materiales usados para mantener líneas celulares continuas están contaminados con CE de clamidias viables. Por ejemplo, todos los lotes de suero de ternero fetal han dado positivo en pruebas para detectar el gen de MOMP de clamidias mediante PCR. Ya que se requiere amplia digestión para el aislamiento del ADN, se concluyó que está unido en CE. También puede cultivarse C. pneumoniae directamente a partir de suero de ternero fetal. Por tanto, es necesario inactivar los CE en estos materiales, tal como medios de cultivo y nutrientes, usados para mantener el estado libre de clamidias del organismo. De manera colectiva, a estos materiales se les denomina en el presente documento "materiales de mantenimiento". En una realización, se someten nutrientes y medios de cultivo a irradiación gamma para inactivar las clamidias en los mismos. Preferiblemente, el material debe irradiarse durante un periodo de tiempo suficiente para exponer el material a al menos 10.000 rads de radiación gamma. Es importante que se contenga el material en vasos que no absorben la radiación de alta energía. El vaso preferido es de plástico. En otra realización, los materiales de mantenimiento se tratan con un agente reductor de disulfuro (por ejemplo, ditiotreitol (10 \muM) durante aproximadamente 30 minutos) y entonces se hacen pasar los materiales de mantenimiento tratados a través de un sistema de filtración submicrométrico habitual (por ejemplo, aproximadamente 0,45 micrómetros). El agente reductor hace que todos los CE se expandan hasta el tamaño en el que un filtro de 0,45 micrómetros bloqueará su paso. Ejemplos de agentes reductores de disulfuro adecuados incluyen, pero no se limitan a, ditiotreitol, succímero, glutatión, DL-penicilamina, disulfuro de D-penicilamina, ácido 2,2'-dimercaptoadípico, ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico. Aún en otra realización, se tratan los materiales de mantenimiento con un agente reductor de disulfuro, preferiblemente ditiotreitol (por ejemplo, una concentración de aproximadamente 10 \muM), antes de hacer pasar los materiales a través de un sistema de filtración para eliminar las clamidias de los mismos.

Con el fin de garantizar que las herramientas de investigación, tales como líneas celulares y animales, permanecen libres de clamidias, se diseñó un ensayo para evaluar si un organismo está libre de clamidias. El método comprende obtener una muestra de células o cultivo de tejidos; cultivar opcionalmente las células en presencia o ausencia de cicloheximida; y determinar la presencia o ausencia de ácido nucleico de clamidias mediante una técnica de amplificación adecuada, tal como PCR. La ausencia de señal de amplificación de ácido nucleico es indicativa de que el estado del organismo es libre de clamidias.

Pruebas de sensibilidad para evaluar agentes activos frente a diversas formas de clamidias

Esta invención proporciona una base para enfoques novedosos para las pruebas de sensibilidad de especies de Chlamydia que se necesitan por el complejo ciclo vital del patógeno de clamidias así como por su diversa, extensa y hasta el momento no apreciada capacidad para provocar infecciones sistémicas crónicas, crípticas y persistentes que no responden a la terapia de corta duración con agentes individuales convencionales. Los inventores han descubierto que el tratamiento o erradicación satisfactorios de infecciones por clamidias crónicas/sistémicas puede preverse usando los métodos únicos descritos para las pruebas de sensibilidad in vitro e in vivo.

La invención se basa en el descubrimiento de que los métodos de pruebas de sensibilidad actuales para clamidias no predicen con precisión la capacidad de los agentes antimicrobianos para erradicar de manera suficiente y total las infecciones crónicas por clamidias. Esto se debe a que los métodos de pruebas de sensibilidad actuales sólo miden la replicación de clamidias e ignoran la conocida "fase críptica" en la que las clamidias intracelulares no se replican activamente. Además, se ha descubierto ahora que la denominada "fase críptica" de las clamidias incluye múltiples subfases diferentes. Las siguientes son algunas de las fases del ciclo vital de las clamidias en las que las clamidias intracelulares no se replican: una fase intranuclear inicial en la que los cuerpos elementales (CE) se cambian a cuerpos reticulados (CR), una fase intracitoplásmica en la que hay una transición del fenotipo de CR al fenotipo de CE, una fase intracitoplásmica con un CR no replicante, sino metabolizante, y fases de CE intracelular/extracelular, incluyendo fases endocíticas y exocíticas, en las que no hay ni replicación ni metabolismo. Con el fin de evaluar el efecto acumulativo y a largo plazo de la terapia antimicrobiana sobre estas múltiples fases vitales, se han desarrollado métodos únicos de prueba de sensibilidad in vitro e in vivo y se describen en el presente documento.

Se pretende que el término "sensibilidad", tal como se usa en el presente documento se refiera a una respuesta fisiológica de un microorganismo frente a un estímulo del entorno o químico. La respuesta fisiológica deseada frente a los estímulos es una que afecta adversamente a la viabilidad del patógeno para replicarse o residir dentro de la célula huésped y, de manera ideal, daría como resultado la reducción o completa eliminación (es decir, muerte) de ese patógeno.

A. Metodología in vitro

En el presente documento se describen métodos para evaluar la sensibilidad de las distintas fases y estadios del ciclo vital de clamidias, particularmente la fase críptica frente a un(os) agente(s) particular(es), ya que las técnicas anteriores no han logrado, hasta ahora, apreciar la necesidad de fármacos que puedan eliminar clamidias crípticas de las células no infectadas. Un método de selección de fármacos que logró este objetivo utiliza células en cultivo tisular que se mantienen en ausencia de cicloheximida con el fin de favorecer la infección críptica. La infección críptica es poco común en células usadas en técnicas de sensibilidad en cultivos celulares habituales, dado que las clamidias en células paralizadas con cicloheximida no necesitan competir con la célula huésped por los metabolitos y por tanto, se favorece su replicación.

El método in vitro utiliza células en cultivo tisular habituales, pero sin la adición de cicloheximida. Además, se permite que las clamidias se repliquen durante varios días antes de la adición de uno o más agentes de prueba. Un "agente de prueba" puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que vayan a evaluarse como agente anticlamidias para determinar su capacidad para reducir significativamente la presencia de clamidias en células vivas. Por ejemplo, un agente de prueba puede incluir, pero no se limita a, antibióticos, agentes antimicrobianos, agentes antiparasitarios, agente antimalaria, agentes reductores de disulfuro y agentes antimicobacterianos. Entonces se aña-
de(n) el/los agente(s) antimicrobiano(s) (agente de prueba) a las células en replicación. Se reemplazan periódicamente los agentes antimicrobianos/medio de crecimiento durante la duración del tiempo de incubación, que es preferiblemente de semanas en vez de días. Se reemplaza(n) el/los agente(s) de prueba cuando es necesario durante la duración del tiempo de incubación (de días a semanas) para garantizar que el agente de prueba está presente y no se ha degradado de otro modo. Finalmente, el criterio de valoración tras el tiempo de incubación prolongado es la completa ausencia de ADN de clamidias, según se determina mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico, tal como la metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se usan técnicas habituales de amplificación de ácido nucleico (tales como PCR) para determinar la presencia o ausencia de señal para ADN de clamidias que codifica para MOMP u otro gen de clamidias único para determinar si el agente de prueba o combinación de agentes es/son eficaz/eficaces en la reducción de la infección por clamidias. La pérdida de señal (es decir, por debajo del nivel detectable de la técnica de amplificación de ácido nucleico) en células con antibiótico(s) frente a su presencia en los controles es una indicación de la eficacia del agente o combinación de agentes frente a clamidias.

En consecuencia, la prueba de sensibilidad j puede usarse para identificar un agente o agentes que se dirigen frente a cualquier especie particular de Chlamydia y puede usarse para identificar agente(s) que se dirige(n) frente a la forma críptica del patógeno, es decir, puede inhibir o eliminar la forma críptica del patógeno. Esto puede hacerse realizando la prueba de sensibilidad mientras se colocan las células en condiciones de entorno de rigurosidad que se saben que inducen que las clamidias entren en una fase críptica. Los agentes que son eficaces frente a las clamidias, tal como se determina mediante los protocolos de pruebas de sensibilidad descritos en el presente documento, pueden usarse como parte de una terapia para el tratamiento de infecciones por clamidias. A continuación se describen en detalle protocolos terapéuticos adecuados, centrándose particularmente en dirigir agentes frente a estadios específicos del ciclo vital de las clamidias.

Los métodos descritos en el presente documento son únicos porque evalúan la actividad de agentes antimicrobianos en ausencia de cicloheximida, lo que proporciona un medio intracelular clínicamente más relevante. Por ejemplo, todas las bombas de membrana de células huésped dependientes de energía, que funcionan normalmente que podrían mover agentes antimicrobianos dentro o fuera de la célula se inactivan mediante el uso de cicloheximida. Los métodos descritos en el presente documento son únicos porque utilizan un medio de cultivo que se ha inactivado previamente. Los métodos también son únicos porque miden el efecto de una duración prolongada de exposición al/a los agente(s)
antimicrobiano(s) tras establecerse la infección intracelular por clamidias. Finalmente, el método es único porque mide la presencia/ausencia de ADN de clamidias como el criterio de valoración, por ejemplo midiendo una señal de PCR. Usando la erradicación completa de ADN de clamidias como criterio de valoración, la prueba de sensibilidad confirma que todas las fases de clamidias se han erradicado en lugar de haber habido una simple detención temporal en su replicación.

Cuando se usa una metodología de amplificación de ácido nucleico, tal como PCR, para evaluar el criterio de valoración del ensayo, puede potenciarse el método de ensayo de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) mediante la aplicación única de un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT), con el fin de alterar el recubrimiento de la cubierta de CE de clamidias y así permitir la exposición del ADN mediante la acción de un compuesto de digestión de proteínas, tal como proteinasa K. En otras palabras, el agente reductor permite la ruptura de la cubierta del CE. Usando un ensayo para detectar ADN en el que los CE carecen específicamente de cubierta, el criterio de valoración de la prueba de sensibilidad evalúa la presencia o ausencia de CE, así como la presencia o ausencia de CR tanto replicantes como no replicantes. Por tanto, este enfoque de pruebas de sensibilidad de clamidias permite ensayos cuantitativos de sensibilidad antimicrobiana de agentes individuales y de combinación, en los que se mide el efecto acumulativo del/de los agente(s) sobre la erradicación completa de todas las fases vitales. A continuación se describen ejemplos de los resultados obtenidos con este método in vitro.

En una realización, un ensayo de ácido nucleico adecuado para identificar agentes eficaces frente a la forma críptica de clamidias comprende, en presencia del/de los agente(s) que va(n) a someterse a prueba, someter las células cultivadas a un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol) y digerir con proteasa o isotiocianato de guanidina (también conocido como tiocianato de guanidina) durante un periodo de tiempo prescrito; extraer ADN de la disolución tratada; exponer ADN a la polimerasa, dNTP y cebadores apropiados para la amplificación de ADN de MOMP u otra proteína de la especie de Chlamydia; y determinar la presencia o ausencia de ADN amplificado visualizando el producto de ADN tratado con bromuro de etidio mediante electroforesis en gel, por ejemplo, o alternativamente mediante transferencia de tipo Southern. En realizaciones particulares, la especie de Chlamydia es C. pneumoniae y los cebadores apropiados son CHLMOMPDB2 y CHLMOMPCB2.

En el presente documento se describe adicionalmente un método de identificación de células que contienen una forma críptica que no tiene CE de una especie de Chlamydia mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) que comprende someter las células cultivadas a digestión con proteasa; detener la actividad proteasa; exponer las células a ADN polimerasa termoestable, dNTP y cebadores apropiados marcados (por ejemplo, marcados con 3'-biotina, marcados con 5'-biotina) para la amplificación de ADN que codifica para MOMP de la especie de Chlamydia; lavar las células; exponer las células a una molécula indicadora (por ejemplo, enzima de señal conjugada con estreptavidina); exponer las células a un sustrato apropiado para la molécula indicadora (por ejemplo, enzima conjugada); y visualizar el ADN amplificado que codifica para MOMP visualizando el producto de la reacción.

En el presente documento se describe un método de identificación de células que contienen una forma críptica de clamidias. El método comprende tratar células cultivadas, que se piensa que están infectadas con clamidias, con un agente reductor de disulfuro; someter las células cultivadas a digestión con proteasa; exponer las células a polimerasa, dNTP y cebadores apropiados para la amplificación de ADN de ácido nucleico que codifica para una proteína de clamidias; exponer las células a una enzima de molécula indicadora; exponer las células a un sustrato apropiado para la enzima indicadora; y determinar la presencia de una forma críptica de clamidias visualizando el ADN amplificado que codifica para una proteína de clamidias. La técnica de amplificación puede ser PCR y los cebadores pueden ser CHLMOMPDB2 y CHLMOMPCB2 de Chlamydia pneumoniae.

Puede usarse un método similar como ensayo para identificar un agente que es eficaz frente a una forma críptica de clamidias. En consecuencia, el método comprende tratar células cultivadas que se hacen crecer en ausencia de cicloheximida, que se piensa que están infectadas con clamidias, con un agente reductor de disulfuro; permitir que las clamidias se repliquen; añadir un agente de prueba; someter las células cultivadas a digestión con proteasa; exponer las células a la polimerasa, dNTP y cebadores apropiados para la amplificación de ADN de un gen que codifica para una proteína de clamidias; exponer las células a una enzima de molécula indicadora; exponer las células a un sustrato apropiado para la enzima indicadora; y determinar la presencia de forma críptica de clamidias visualizando el ADN amplificado que codifica para una proteína de clamidias, tal como MOMP.

B. Metodología in vivo

Para fines ilustrativos, la prueba de sensibilidad descrita en el presente documento puede usarse para evaluar el estado de un ser humano o animal que se está sometiéndose a terapia para el tratamiento de infección por clamidias. Por ejemplo, se aísla un material biológico del ser humano o animal que va a someterse a terapia de combinación. Se trata el material biológico de tal manera que se aíslan las clamidias del mismo. Se permite que este aislado de clamidias infecte células libres de clamidias. Entonces se exponen estas células infectadas a la combinación de agentes que está usándose en el individuo que está sometiéndose a terapia de combinación. Alternativamente, puede añadirse el suero del individuo que contiene los agentes antimicrobianos a las células infectadas como "prueba bactericida en suero" para determinar la infección intracelular por clamidias. Entonces se mide la presencia de ADN de clamidias.

El método in vivo utiliza el modelo murino aunque pueden usarse otros animales tales como ratas o conejos. En este método, se inoculan los ratones (o cualquier otro animal) por vía intranasal con 2 X 10^{5} CE de clamidias por ml. Los inventores han confirmado el trabajo de Yang y colaboradores (J. Infect. Dis., 171: 736-738 (1995)) en el que la inoculación intranasal de CE de clamidias da como resultado la diseminación sistémica y, en particular, provoca la infección del bazo. Los inventores han descubierto que esta diseminación sistemática también da como resultado la presencia de CE en la sangre de los ratones. Por tanto, puede medirse la infectividad mediante cultivo en sangre o mediante PCR en suero/sangre completa para detectar el ADN de clamidias. La infección sistémica también se confirma y monitoriza mediante la presencia de títulos elevados de anticuerpos IgM e IgG. Tras haberse establecido la infección sistémica murina, se administran agentes antimicrobianos a los ratones. Esto se realiza de la manera más sencilla añadiendo los antibióticos al agua para beber. El efecto de la terapia anticlamidias se monitoriza mediante PCR en suero/sangre completa. Cuando el ensayo en suero/PCR sugiere la erradicación de las clamidias del torrente sanguíneo, se sacrifican los ratones y se realiza una PCR para detectar ADN de clamidias en homogenizados pulmón, corazón, hígado y bazo. Este método es único porque mide la erradicación completa de todas las formas de vida de clamidias en órganos diana murinos conocidos para la infección por clamidias. Este método de sensibilidad in vivo ha revelado, por ejemplo, que la terapia antimicrobiana con agentes triples, INH, metronidazol y penicilamina, puede erradicar completamente C. pneumoniae de ratones infectados en cuatro meses. Además, tras la completa erradicación de clamidias, los múltiples intentos de reinfectar estos ratones curados mediante inoculación intranasal han resultado ser insatisfactorios. Esto sugiere que el tratamiento eficaz y la erradicación completa dan como resultado el desarrollo de inmunidad protectora, y que el tratamiento eficaz es por tanto un modo de crear inmunidad eficaz.

Realizar una PCR para detectar ADN de clamidias en homogeneizados de otros sistemas de órganos puede usarse para determinar la eficacia de combinaciones de antibióticos particulares para erradicar la infección por clamidias en esos sistemas de órganos. El establecimiento de la infección anterior por clamidias de estos sistemas puede realizarse o bien mediante biopsia o bien mediante formación de imágenes radiológicas potenciada por anticuerpos. Alternativamente, puede determinarse la infección anterior de manera estadística realizando una PCR para detectar ADN de clamidias en homogeneizados de los mismos sistemas de órganos en una población control no tratada pero inoculada de manera similar. La sensibilidad específica de órgano se determina comparando las tasas de ensayos de PCR positivos en las poblaciones control y tratada.

Un método alternativo o complementario de determinar la presencia de infecciones por clamidias crípticas en animales o cultivos celulares es exponer el cultivo a compuestos estimulantes de clamidias. Tales compuestos incluyen (pero no se limitan a) cicloheximida, corticosteroides (tales como prednisona) y otros compuestos que se sabe que estimulan la reactivación de infecciones intracelulares crípticas, y agentes reductores de disulfuro (tales como ditiotreitol) y otros compuestos químicos que hacen que los CE se conviertan en CR. Una vez que las formas crípticas han entrado en una fase más activa, pueden detectarse usando técnicas de detección habituales tales como detección visual de cuerpos de inclusión, detección inmunoquímica de antígeno de clamidias, o PCR de transcriptasa inversa.

Terapia anticlamidias dirigida frente a el estadio inicial de la infección por clamidias

Se han identificado varios agentes eficaces que se dirigen específicamente frente a la fase inicial de la infección por clamidias (es decir, transición del CE de clamidias en un CR). Esta fase de crecimiento "críptica", a diferencia del microorganismo de clamidias replicante, que utiliza la energía de la célula huésped, implica electrones y proteínas de transferencia de electrones, así como nitrorreductasas. Basándose en esto, se ha descubierto que la fase inicial de la infección por clamidias es sensible a los efectos antimicrobianos de los nitroimidazoles, nitrofuranos y otros agentes dirigidos frente al metabolismo anaerobio en bacterias.

Los nitroimidazoles y nitrofuranos son agentes antimicrobianos sintéticos que se agrupan juntos porque ambos son estructuras de anillo que contienen nitro (NO_{2}-) y tienen efectos antimicrobianos similares. Estos efectos requieren la degradación del agente dentro de la célula microbiana de manera que se forman radicales electrófilos. Estos productos intermedios electrófilos reactivos dañan entonces sitios nucleófilos para proteínas incluyendo ribosomas, ADN y ARN. Actualmente no se considera que los nitroimidazoles y nitrofuranos tengan actividad antimicrobiana frente a miembros de la especie Chlamydia. Sin embargo, esta falta de actividad antimicrobiana se debe al hecho de que los métodos convencionales de pruebas de sensibilidad sólo son pruebas para detectar el efecto sobre la forma replicante de la especie Chlamydia.

Ejemplos de nitroimidazoles adecuados incluyen, pero no se limitan a, metronidazol, tinidazol, bamnidazol, benznidazol, flunidazol, ipronidazol, misonidazol, moxnidazol, ronidazol, sulnidazol, y sus metabolitos, análogos y derivados de los mismos. Metronidazol es el más preferido. Ejemplos de nitrofuranos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, nitrofurantoína, nitrofurazona, nifurtimox, nifuratel, nifuradeno, nifurdazilo, nifurpirinol, nifuratrona, furazolidona, y sus metabolitos, análogos y derivados de los mismos. Se prefiere la nitrofurantoína dentro de la clase de nitrofuranos.

A lo largo de esta solicitud y para los fines de esta invención, se pretende que "metabolitos" abarque productos de metabolismo celular de un fármaco en el huésped (por ejemplo, ser humano o animal) incluyendo, pero sin limitarse a, las formas activadas de profármacos. Se pretende que los términos "análogos" y "derivados" abarquen isómeros, compuestos ópticamente activos y cualquier modificación química o física de un agente, de manera que la modificación da como resultado un agente que tiene una eficacia similar o aumentada, pero no significativamente reducida, frente a clamidias, en comparación con la eficacia del agente original del que se obtiene el análogo o derivado. Esta comparación puede determinarse usando las pruebas de sensibilidad descritas en el presente documento.

Las células que van a tratarse pueden infectarse de manera críptica o pueden someterse a condiciones rigurosas metabólicas o de entorno que provocarán o inducirán que la fase de replicación entre en la fase críptica. Tales condiciones rigurosas pueden incluir cambiar las condiciones del entorno/cultivo en el caso en el que se exponen las células infectadas a \gamma-interferón; o exponer células a agentes antimicrobianos convencionales (tales como macrólidos y tetraciclinas) que inducen esta fase críptica de infección por clamidias en células huésped humanas.

Terapia anticlamidias novedosa dirigida frente a las fases estacionaria críptica y replicante de la infección por clamidias

Se ha identificado una clase única de agentes anticlamidias que es eficaz frente a las fases estacionaria críptica y replicante de las clamidias (y posiblemente frente a otros estadios de la fase críptica) usando las pruebas de sensibilidad descritas en el presente documento. Esta clase novedosa de agentes comprende etambutol y sustancias relacionadas con ácido isonicotínico que incluyen isoniazida (INH), ácido isonicotínico (también conocido como niacina), ácido nicotínico, pirazinamida, etionamida y aconiazida; en la que INH es el más preferido. Aunque actualmente sólo se consideran eficaces para infecciones micobacterianas, debido en parte a las metodologías de pruebas de sensibilidad actualmente disponibles, se ha descubierto que estos agentes, en combinación con otros antibióticos, son particularmente eficaces frente a clamidias. Se cree que las sustancias relacionadas con el ácido isonicotínico seleccionan como diana la producción constitutiva de catalasa y peroxidasa, que es una característica de microorganismos, tales como micobacterias, que infectan monocitos y macrófagos. Las clamidias también pueden infectar satisfactoriamente monocitos y macrófagos.

El uso de INH para erradicar las clamidias de macrófagos y monocitos ayuda posteriormente a estas células en su papel de lucha frente a la infección. Sin embargo, estos agentes parecen ser menos eficaces, in vitro, frente a la fase críptica. Por tanto, el etambutol, INH y otras sustancias relacionadas con el ácido isonicotínico deben usarse de manera ideal en combinación con agentes que seleccionan como diana otras fases del ciclo vital de las clamidias. No obstante, estas sustancias relacionadas con el ácido isonicotínico son generalmente agentes excelentes para la terapia a largo plazo de la infección crónica/sistémica por clamidias, y en particular frente a la infección por clamidias de células del endotelio y el músculo liso en vasos sanguíneos humanos.

Pueden usarse INH y sus sustancias relacionadas para eliminar la infección de monocitos y/o macrófagos. Cuando los monocitos y macrófagos están infectados por clamidias, se debilitan y no pueden luchar apropiada o eficazmente frente a la infección. Se cree que si se elimina la propia infección por clamidias de las células, entonces los monocitos y macrófagos pueden retomar sus papeles fundamentales para luchar frente a la(s) infección/infecciones por clamidias u otras. Por tanto, la respuesta del paciente a la terapia de combinación puede optimizarse mediante la inclusión de sustancias relacionadas con el ácido isonicotínico. En consecuencia, un aspecto de la invención proporciona un método específico para volver a facilitar el desarrollo de monocitos o macrófagos que se han visto comprometidos por una infección por clamidias y, a su vez, comprende tratar la infección en otros sitios. Tales macrófagos o monocitos comprometidos pueden activarse tratando la infección por clamidias poniendo en contacto los macrófagos y/o monocitos infectados con un agente anticlamidias.

Terapia dirigida frente a cuerpos elementales de clamidias

Tal como se trató anteriormente, se ha descubierto que las condiciones adversas, tales como nutrientes limitados, agentes antimicrobianos y la respuesta inmunitaria del huésped, producen una respuesta rigurosa en las clamidias. Se sabe que estas condiciones adversas inducen respuestas rigurosas en otros microorganismos (C. W. Stratton, En: Antibiotics in Laboratory Medicine, Cuarta edición. Lorian V (ed) Williams & Wilkins, Baltimore, págs. 579-603 (1996)) e inducen, no de manera sorprendente, una respuesta rigurosa en las clamidias. Esta respuesta rigurosa en las clamidias altera el estado morfológico del microorganismo intracelular y crea formas latentes, incluyendo el CE intracelular, que puede persistir entonces de manera críptica hasta que se reactive su ciclo de desarrollo. Al contrario, la célula huésped puede experimentar una lisis y permitir que los CE alcancen el medio extracelular. Por tanto, es necesario utilizar una combinación de agentes dirigidos frente a los diversos estadios vital de las clamidias y, en particular, frente al cuerpo elemental para un tratamiento satisfactorio de la infección.

Durante el ciclo vital único de las clamidias, se sabe que se liberan CE de tipo esporas metabólicamente inactivos en el medio extracelular. Aunque estos CE liberados son infecciosos, pueden no infectar inmediatamente células huésped sensibles cercanas hasta que estén presentes las condiciones apropiadas para la infectividad del CE. El resultado de este retraso en la infección es la acumulación extracelular de CE metabólicamente inactivos, aunque infecciosos. Esto produce un segundo tipo de persistencia de clamidias denominado en el presente documento "carga en tejidos/sangre" de CE. Este término es un concepto similar al de carga de VIH y se define en el presente documento como el número de CE infecciosos que residen en el medio extracelular. Técnicas de visualización microscópica directa, cultivos de células tisulares y métodos de prueba de reacción en cadena de la polimerasa han demostrado que los CE infecciosos se encuentran frecuentemente en la sangre de animales y seres humanos aparentemente sanos. Este fenómeno es claramente de gran importancia clínica en las infecciones por clamidias ya que estos CE metabólicamente inactivos escapan a la acción de la terapia anticlamidias actual que se dirige únicamente frente a las formas intracelulares replicantes de las clamidias. Se ha demostrado que la presencia de CE extracelulares infecciosos tras completar la terapia a corto plazo frente a la fase de replicación para las infecciones por clamidias da como resultado una recaída de la infección intracelular. Por tanto, la duración y naturaleza de la terapia anticlamidias requerida para el tratamiento de infecciones por clamidias está dictada, en parte, por la carga extracelular de CE. Para los fines de esta invención, la terapia a corto plazo puede ser de aproximadamente dos a tres semanas; la terapia a largo plazo, en cambio, es de varios meses.

Tal como se describió en secciones anteriores, también se cree que la persistencia de infecciones por clamidias puede deberse, en parte, a la presencia de formas crípticas de clamidias dentro de las células. Esta forma de clamidias críptica intracelular puede activarse aparentemente por ciertos factores del huésped tales como cortisona (Yang et al., Infection and Inmunity, 39: 655-658 (1983); y Malinverni et al., The Journal of Infectious Diseases, 172: 593-594 (1995)). La terapia anticlamidias para infecciones por clamidias crónicas debe continuarse hasta que todos los CE intracelulares u otras formas crípticas intracelulares se hayan activado y los CE extracelulares hayan infectado células huésped. Esta reactivación/reinfección por CE de clamidias es claramente indeseable ya que prolonga la terapia de infecciones por clamidias, así como aumenta la oportunidad de que se produzca resistencia frente a agentes antimicrobianos.

Se han identificado agentes fisioquímicos que pueden inactivar CE de clamidias en sus respectivos huéspedes reduciendo los enlaces disulfuro que mantiene la integridad de las proteínas de la membrana exterior de los CE. Para las clamidias, la alteración de las proteínas de la membrana exterior de los CE inicia así la transición de la forma CE a la forma CR. Cuando esto se produce en el medio acelular en el que no hay una fuente de energía disponible, el CR naciente fallece o es víctima del sistema inmunitario. Por tanto, los agentes reductores de disulfuro que pueden interferir con este procedimiento son adecuados como compuestos para eliminar los CE.

Una de tales clases de agentes reductores de disulfuro son los agentes de intercambio de tiol-disulfuro. Ejemplos de éstos incluyen, pero no se limitan a, ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA; también denominado en el presente documento como "succímero"); D,L,-\beta,\beta-dimetilcisteína (también conocida como penicilamina); agentes de \beta-lactama (por ejemplo, penicilinas, penicilina G, ampicilina y amoxicilina, que produce penicilamina como producto de degradación), cicloserina, ditiotreitol, mercaptoetilamina (por ejemplo, mesna, cisteamina, dimercaptol), N-acetilcisteína, tiopronina y glutatión. Un agente anticlamidias extracelular particularmente eficaz dentro de esta clase es DMSA que es un agente quelante que tiene cuatro hidrógenos ionizables y dos grupos carboxilo sumamente cargados que evitan su paso relativo a través de membranas de células humanas. Por tanto, el DMSA permanece en el fluido extracelular en el que puede encontrar fácilmente CE extracelulares. Los dos grupos tiol (sulfhidrilo) en la molécula de succímero (DMSA) pueden reducir enlaces disulfuro en la MOMP de CE ubicados en el medio extracelular.

La penicilamina también puede usarse como agente reductor de disulfuro para eliminar CE de clamidias. Sin embargo, el uso de penicilamina puede provocar efectos secundarios indeseados. Por tanto, como alternativa, los agentes de \beta-lactama que se metabolizan o se convierten de otro modo en agentes de tipo penicilamina in vivo (es decir, estos agentes presentan un grupo reductor) pueden administrarse por vía oral al ser humano o animal como medio para proporcionar una liberación controlada de penicilamina derivada, mediante hidrólisis ácida no enzimática, de la penicilina, en condiciones fisiológica. No se requiere el ácido clavulánico para esta hidrólisis ni para usar agentes de \beta-lactama para crear penicilamina in vivo.

Agentes actualmente reconocidos activos frente a la replicación de clamidias

A medida que los CR de clamidias se transforman en CE, comienzan a utilizar la transcripción activa del ADN de clamidias y la traducción del ARNm resultante. Como tales, estas formas de clamidias son sensibles a los agentes antimicrobianos usados actualmente. La eficacia anticlamidias de estos agentes puede mejorarse significativamente usándolos en combinación con otros agentes dirigidos frente a diferentes estadios del ciclo vital de clamidias, tal como se trata en el presente documento.

Las clases de agentes antimicrobianos adecuados incluyen, pero no se limitan a, rifamicinas (también conocidas como ansamacrólidos), quinolonas, fluoroquinolonas, cloramfenicol, sulfonamidas/sulfuros, azálidos, cicloserina, macrólidos y tetraciclinas. En la tabla 5 a continuación se ilustran ejemplos de estos agentes que son miembros de estas clases, así como los que se prefieren.

TABLA 5

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Se considera que se inhiben todos los miembros de la especie Chlamydia, incluyendo C. pneumoniae, y algunos se destruyen, mediante el uso de un único agente seleccionado de los agentes antimicrobianos actualmente usados tales como los descritos anteriormente. Sin embargo, usando la nueva prueba de sensibilidad, los inventores han descubierto que no puede lograrse la erradicación completa de las clamidias mediante el uso de cualquiera de estos agentes solos dado que ninguno es eficaz frente a todas las fases del ciclo vital de las clamidias y parecen inducir una respuesta rigurosa en las clamidias que hace que la fase de replicación se transforme en formas crípticas. Esto da como resultado una infección persistente in vivo o in vitro que puede demostrarse mediante técnicas de PCR que evalúan la presencia o ausencia de ADN de clamidias. No obstante, uno o más de estos agentes actualmente usados, o un nuevo agente dirigido frente a la fase de replicación de las clamidias, debe incluirse como uno de los agentes de clamidias en una terapia de combinación con el fin de ralentizar o detener la transición del CE en el CR así como para inhibir la replicación de las clamidias.

Metodología para seleccionar posibles combinaciones de agentes

Para intentar tratar o erradicar una infección sistémica, es fundamental seleccionar como dianas múltiples fases en el ciclo vital de las clamidias, de otro modo las clamidias viables en las fases no seleccionadas como diana permanecerán tras la terapia y darán como resultado una infección continuada, crónica. Este conocimiento fundamental constituye la parte fundamental de esta invención.

Un método preferido para seleccionar una combinación apropiada de agentes que satisface los requisitos de esta estrategia comprende una pluralidad de etapas tal como sigue:

1. Identificar las fases del ciclo vital de las clamidias. Por ejemplo, actualmente se conocen las siguientes fases:

a.: Cuerpo elemental ("CE") - Extracelular o intracelular. Los CE intracelulares pueden representar un tipo de "fase críptica".

b.: Fase de transición de CE a cuerpo reticulado ("CR").

c.: Fase de CR estacionario. Esto es lo que tradicionalmente se considera la "fase críptica".

d.: Fase de CR de replicación.

e.: Fase de transición de CR a CE (también denominada "condensación").

2. Evaluar la importancia relativa de seleccionar como diana cada fase particular para erradicar las reservas de clamidias del organismo huésped. Por ejemplo, pueden priorizarse los estadios del ciclo vital enumerados en la etapa 1 basándose en las siguientes suposiciones:

a.: En el huésped, los CE extracelulares e intracelulares representan una reserva muy importante de agentes infecciosos que da como resultado infección crónica y persistente.

b.: La mayor parte de los CR intracelulares en las infecciones crónicas son no replicantes. El ciclo de reproducción de 3-4 días observado en células eucariotas tratadas con cicloheximida es un artefacto de un entorno de cultivo celular, atípico, diseñado principalmente para propagar clamidias.

c.: Las fases de transición sólo representan una pequeña parte de las clamidias en las infecciones crónicas.

3. Identificar "dianas" para cada fase de las fases de ciclo vital seleccionadas. Una diana es un atributo de clamidias que es vulnerable durante una fase de ciclo vital particular. Por ejemplo, los enlaces disulfuro en la MOMP son una diana durante la fase de CE.

4. Identificar agentes con mecanismo(s) conocido(s) o teórico(s) de acción frente esas dianas.

5. Estimar si esos agentes serían meramente inhibidores o, preferiblemente, letales, mediante un entendimiento de su mecanismo de acción.

6. Confirmar la estimación usando los siguientes enfoques:

a.: En el caso de agentes anti-CE, tratar los CE con el agente, después intentar infectar células con los CE tratados. Si las células no se infectan, el agente es letal para CE.

b.: En el caso de otros agentes, usar de las pruebas de sensibilidad descritas en otra parte en el presente documento, para determinar si el agente, ya sea solo o en combinación con otros agentes, es letal para clamidias.

7. Seleccionar una combinación de agentes que, mediante sus efectos individuales, proporcionan actividad contra dianas para las fases más importantes dentro del ciclo vital de las clamidias. Preferiblemente, una combinación debe seleccionar como diana tantas fases del ciclo vital como sea posible, buscando maximizar el total de las puntuaciones importantes relativas de las fases seleccionadas como diana al tiempo que se minimiza el número de fármacos implicados.

8. Someter la combinación a prueba usando los procedimientos de pruebas de sensibilidad descritos en otra parte. Esta etapa es necesaria porque la combinación seleccionada puede o no ser letal para clamidias por diversos motivos tales como salida y/o penetración intracelular.

9. Fijar las dosificaciones iniciales basándose en las normas clínicas que consideran la farmacocinética y farmacodinamia para los fármacos recetados individualmente; las modificaciones, si se necesitan, se basan en los resultados de pruebas de sensibilidad y eficacia in vivo.

La tabla 6 proporciona un ejemplo de cómo puede usarse la metodología anterior. La realización preferida incluye agentes que:

a) seleccionan como diana enlaces disulfuro en las fases de CE y de condensación;

b) seleccionan como diana el metabolismo no oxidativo en la fase estacionaria/críptica;

c) seleccionan como diana la producción constitutiva de peroxidasas y la catálisis en las fases estacionaria y de replicación;

d) en los dos últimos casos, trabajar mediante alteración físico-química del organismo mediante radicales libres, frente a los que es muy difícil que el organismo desarrolle resistencia; y

e) opcionalmente añadir un agente para seleccionar como diana la ARN polimerasa dependiente del ADN en la fase CE->CR.

La metodología anterior para seleccionar terapias de combinación puede automatizarse (por ejemplo, mediante un sistema informático) en una o una combinación de las etapas descritas anteriormente. Esta metodología es aplicable incluso después de que un mayor entendimiento del ciclo vital de las clamidias conduzca a una nueva priorización o incluso subdivisión de las fases del ciclo vital, de que se identifiquen nuevas dianas teóricas dentro de las clamidias o de que se desarrollen nuevos fármacos que ataquen dianas actualmente conocidas o nuevas dentro de las clamidias. Por ejemplo, las fases del ciclo vital pueden subclasificarse adicionalmente basándose en el tipo de célula huésped en el que está la fase. Por tanto, los CR en fase estacionaria en macrófagos pueden considerarse una fase separada de los CR en fase estacionaria en hepatocitos. Esto permite usar la metodología para diseñar una combinación de agentes específica para un único o múltiples tejidos.

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Enfermedades asociadas con la infección por clamidias

Se ha descubierto una asociación entre la infección crónica por clamidias de líquidos corporales y/o tejidos con diversos síndromes de enfermedades de etiología previamente desconocida en seres humanos que responden a regímenes anticlamidias únicos descritos en el presente documento. Hasta la fecha, estas enfermedades incluyen esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide (AR), enfermedad inflamatoria del intestino (EII), cistitis intersticial (CI), fibromialgia (FM), disfunción nerviosa autónoma (DNA, hipotensión mediada de manera neuronal); piodermia gangrenosa (PG), fatiga crónica (FC) y síndrome de fatiga crónica (SFC). Otras enfermedades están investigándose. La correlación entre la infección por clamidias y estas enfermedades sólo se ha establecido recientemente como resultado de las metodologías de diagnóstico y terapias de combinación descritas en el presente documento.

Basándose en estas evidencias, la evidencia publicada de una asociación entre la ateroesclerosis y las clamidias (Grupta et al., Circulation, 96: 404-407 (1997)), y un entendimiento del impacto que tienen las infecciones por clamidias sobre las células infectadas y los sistemas inmunitarios, los inventores han descubierto una conexión entre las clamidias y un amplio conjunto de enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias y de deficiencia inmunitaria. Por tanto, la invención describe métodos para diagnosticar y/o tratar enfermedades asociadas con la infección por clamidias, tales como enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y enfermedades que se producen en individuos inmunocomprometidos diagnosticando y/o tratando la infección por clamidias en un individuo que lo necesita, usando cualquiera de los ensayos o terapias descritas en el presente documento. El avance del tratamiento puede evaluarse serológicamente, para determinar la presencia o ausencia de clamidias usando, por ejemplo, los métodos de diagnóstico proporcionados en el presente documento, y este valor puede compararse con los valores serológicos tomados anteriormente en la terapia. También debe evaluarse la mejora física en los estados y síntomas normalmente asociados con la enfermedad que va a tratarse. Basándose en estos factores de evaluación, el médico puede mantener o modificar la terapia anticlamidias en consecuencia. Por ejemplo, el médico puede cambiar un agente debido a efectos secundarios adversos provocados por el agente, la ineficacia del agente o por otro motivo. Cuando los títulos de anticuerpos aumentan durante el tratamiento, entonces deben sustituirse compuestos alternativos con el fin de lograr los menores títulos de anticuerpos que demuestren sensibilidad específica de las clamidias al nuevo régimen. Es deseable un reemplazo o sustitución de un agente por otro agente que es eficaz frente al mismo estadio vital de las clamidias.

Las terapias descritas en el presente documento pueden usarse por tanto para el tratamiento de enfermedades inmunitarias y autoinmunitarias agudas y crónicas cuando se demuestra que los pacientes tienen una carga de clamidias mediante los procedimientos de diagnóstico descritos en el presente documento, enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, hepatitis crónica, lupus eritematoso sistémico, artritis, tiroiditis, esclerodermia, diabetes mellitus, enfermedad de Graves, enfermedad de Beschet y enfermedad de injerto contra huésped (rechazo de injerto). Las terapias descritas en el presente documento también pueden usarse para tratar cualquier trastorno en el que la especie de clamidias sea un factor o cofactor. Por tanto, las composiciones de la presente invención pueden usarse para tratar una variedad de trastornos además de las enfermedades inmunitarias y autoinmunitarias anteriores cuando se demuestra que están asociados con la infección por clamidias mediante los procedimientos de diagnóstico descritos en el presente documento; por ejemplo, pueden tratarse diversas infecciones, muchas de las cuales producen inflamación como síntomas primarios o secundarios, incluyendo, pero sin limitarse a, síndrome de septicemia, caquexia, colapso circulatorio y choque resultante de infección bacteriana aguda o crónica, enfermedades infecciosas y/o parasitarias agudas y crónicas de fuentes bacterianas, virales o fúngicas, tales como VIH, SIDA (incluyendo síntomas de caquexia, trastornos autoinmunitarios, complejo demencial asociado con SIDA e infecciones), así como granulomatosis de Wegner.

Entre las diversas enfermedades inflamatorias, hay algunos rasgos del proceso inflamatorio que se acepta generalmente que son característicos. Éstos incluyen la fenestración de la microvasculatura, la fuga de los elementos de la sangre dentro de los espacios intersticiales y la migración de leucocitos dentro del tejido inflamado. A nivel macroscópico, esto está habitualmente acompañado por los signos clínicos familiares de eritema, edema, sensibilidad a la presión (hiperalgesia) y dolor. Las enfermedades inflamatorias, tales como patologías inflamatorias crónicas y patologías inflamatorias vasculares, incluyendo patologías inflamatorias crónicas tales como aneurismas, hemorroides, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria del intestino crónica, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn y patologías inflamatorias vasculares, tales como, pero sin limitarse a, coagulación intravascular diseminada, aterosclerosis y patología de Kawasaki, también son adecuadas para su tratamiento mediante métodos descritos en el presente documento. La invención también puede usarse para tratar enfermedades inflamatorias tales como enfermedad de arterias coronarias, hipertensión, accidente cerebrovascular, asma, hepatitis crónica, esclerosis múltiple, neuropatía periférica, angina crónica o recurrente, laringitis, traqueobronquitis, cefaleas vasculares crónicas (incluyendo migrañas, cefaleas en brotes y cefaleas por tensión) y neumonía cuando se demuestra que están relacionadas de manera patógena con la infección por clamidias.

Los trastornos que pueden tratarse cuando están asociados con la infección por clamidias también incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transversal aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelosos, tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los núcleos basales o trastornos cerebelosos; trastornos de movimiento hipercinéticos tales como Corea de Huntington y enfermedad senil; trastornos del movimiento inducidos por fármacos, tales como los inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC; trastornos del movimiento hipocinéticos, tales como enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; trastornos cerebelosos y espinocerebelosos, tales como lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelosas (ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelosas, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager y Machado Joseph)); y trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, ataxia, telangiectasia y trastornos mitocondriales de múltiples sistemas); trastornos de núcleo desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple, mielitis transversal aguda; trastornos de la unidad motora, tales como atrofias musculares neurógenas (degeneración de la célula corneal anterior, tal como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia del músculo espinoso infantil y atrofia músculo espinoso juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down en mediana edad; enfermedad difusa de cuerpos de Lewy; demencia senil de tipo de cuerpos de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz; y demencia pugilística, o cualquier subconjunto de las mismas.

También se reconoce que pueden tratarse patologías malignas que implican tumores y otros cánceres, tales como, pero sin limitarse a leucemias (síndrome mielodisplásico y/o linfocítico crónico, mielocítico crónico, agudo); linfomas (linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, tales como linfomas malignos (linfoma de Burkitt o micosis fungoide)); carcinomas (tales como carcinoma de colon) y metástasis de los mismos; angiogénesis relacionada con el cáncer; hemangiomas infantiles; hepatitis inducida por alcohol, neovascularización ocular, psoriasis, úlceras duodenales, angiogénesis de las vías reproductoras femeninas, cuando se demuestra mediante los procedimientos de diagnóstico descritos en el presente documento que están asociadas con la infección por clamidias.

Un individuo inmunocomprometido se define generalmente como una persona que muestra una capacidad atenuada o reducida para preparar una defensa celular o humoral normal frente a la exposición a agentes infecciosos, por ejemplo, virus, bacterias, hongos y protozoos. Las personas que se considera que están inmunocomprometidas incluyen pacientes desnutridos, pacientes que se someten a cirugía y trasplantes de médula ósea, pacientes que se someten a quimioterapia o radioterapia, pacientes neutropénicos, pacientes infectados por VIH, pacientes con traumatismo, pacientes con quemaduras, pacientes con infecciones crónicas o resistentes tales como las que resultan del síndrome mielodisplásico y las personas ancianas, todos los cuales pueden tener sistemas inmunitarios debilitados. Un individuo desnutrido en cuanto a proteínas se define generalmente como una persona que tiene un nivel de albúmina sérica inferior a aproximadamente 3,2 gramos por decilitro (g/dl) y/o una pérdida de peso no intencionada superior al 10% del peso corporal habitual.

Se observaron el ciclo de tratamiento, los resultados serológicos y las mejoras clínicas de la terapia anticlamidias compasiva en pacientes a los que se diagnostican las enfermedades indicadas y se notifican en el ejemplo 5. Los datos proporcionan evidencias para establecer que el tratamiento de la infección por clamidias da como resultado la mejora serológica y física de un estado patológico en el paciente que se somete a terapia de combinación. Estas observaciones fueron constantes entre una variedad de enfermedades diferentes que pertenecen a una clase de enfermedades generalizada.

Otras enfermedades de etiología desconocida con nuevas evidencias de una etiología de Chlamydia pneumoniae

Tanto C. trachomatis como C. psittaci muestran un complejo de enfermedad proteica dependiente de diferentes serovariedades. Una base conocida para esta diversidad hasta la fecha es la secuencia de aminoácidos de MOMP. La figura 1 muestra una alineación de secuencia de diversas MOMP de clamidias. Obsérvese que el tamaño y secuencia son relativamente homólogos excepto para las cuatro regiones variables que son responsables de la base de serovariedad (serotipo) de clasificación. Además, se ha descubierto que C. pneumoniae infecta células endoteliales de vasos sanguíneos a partir de las cuales se liberan CE en el torrente sanguíneo. Además, los macrófagos son dianas conocidas para C. pneumoniae y pueden servir como depósitos y proporcionar un mecanismo adicional de transmisión. Por tanto, C. pneumoniae puede expandirse a través del cuerpo humano, estableciendo la infección en múltiples sitios y en múltiples sistemas de órganos. Los sitios infectados pueden existir durante un amplio periodo sin inducir síntomas que se constaten por el paciente o por un médico que le examine. La variabilidad de secuencia de las MOMP u otros antígenos de clamidias puede proporcionar una base para la especificidad de órgano mientras que otras proteínas de clamidias, tales como las proteínas de choque térmico de 60 K y 70 K o LPS, pueden influir sobre la respuesta inmunitaria.

Se sabe que C. psittaci y C. pecorum provocan una gran cantidad de infecciones en animales económicamente significativos. Por tanto, las enseñanzas de esta invención son relevantes para los animales. A lo largo de esta solicitud y para los fines de esta invención, se pretende que "paciente" abarque tanto seres humanos como animales. Casi todos los conejos y ratones sometidos a prueba hasta la fecha tienen señales de PCR para C. pneumoniae. Pueden usarse como modelos animales apropiados para el tratamiento usando antibióticos de combinación específicos para mejorar la terapia. (Banks et al., Ameri. J. of Obstetrics and Gynecology 138 (7Pt2): 952-956 (1980)); (Moazed et al., Am. J. Pathol. 148 (2): 667-676 (1996)); (Masson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39 (9): 1959-1964 (1995)); (Patton et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37 (1): 8-13 (1993)); (Stephens et al., Infect. Inmun. 35 (2): 680-684 (1982)); y (Fong et al., J. Clin. Microbiol. 35 (1): 48-52 (1997)).

Junto con estos desarrollos están los modelos de conejo recién desarrollados de la enfermedad de arterias coronarias, en los que los conejos expuestos a C. pneumoniae desarrollan posteriormente placas arteriales similares a los seres humanos (Fong et al., J Clin. Microbiol. 35: 48-52 (1997)). Lo más recientemente, un estudio en el Hospital de St. George de Londres encontró que aproximadamente 3/4 de 213 víctimas de ataque al corazón tienen niveles significativos de anticuerpos frente a anticuerpo anti-C. pneumoniae y que aquéllos que tienen tales anticuerpos logran tasas significativamente menores de acontecimientos cardiacos adversos adicionales cuando se tratan con antibióticos (Gupta et al., Circulation 95: 404-407 (1997)). Tomadas en su conjunto, estas tres evidencias (las bacterias encontradas en el tejido enfermo, la inoculación con las bacterias provoca enfermedades, y el tratamiento para las bacterias mitiga la enfermedad) exponen los argumentos para una conexión causal.

Agentes complementarios usados junto con la terapia de combinación

Además de las terapias de combinación tratadas anteriormente, pueden administrarse conjuntamente otros compuestos a un individuo que se somete a terapia anticlamidias para el tratamiento de una infección crónica/sistémica. Por ejemplo, puede ser deseable incluir uno o una combinación de agentes anti-inflamatorios y/o agentes inmunosupresores para mejorar los efectos secundarios que pueden surgir en respuesta a un agente anticlamidias particular, por ejemplo, reacciones de Herxheimer. La carga inicial con un esteroide anti-inflamatorio puede introducirse para minimizar los efectos secundarios de la terapia anticlamidias en aquellos pacientes en los que el criterio clínico sugiere la posibilidad de secuelas inflamatorias graves.

Agentes antiinflamatorios adecuados (agentes esteroideos y no esteroideos) incluyen, pero no se limitan a, prednisona, cortisona, hidrocortisona y naproxeno. Preferiblemente el agente antiinflamatorio es un agente esteroideo, tal como prednisona. La cantidad y frecuencia de la administración de estos compuestos complementarios dependerá de la salud, edad, estado clínico y otros factores del paciente fácilmente evidentes para el profesional médico.

También se ha introducido vitamina C (2 g dos veces al día) basándose en la notificación de que la vitamina C (ácido ascórbico) a concentraciones intracelulares moderadas estimula la replicación de C. trachomatis (Wang et al., J. Clin. Micro. 30: 2551-2554 (1992)) así como su posible efecto sobre la carga de biopelícula e infectividad de la bacteria y específicamente el CE (Hancock, R.E.W., Annual Review in Microbiology, 38: 237-264 (1984)).

Adicionalmente, puede añadirse opcionalmente probenecid a la terapia como potenciador. Se sabe que probenecid aumenta los niveles en plasma de penicilinas bloqueando la secreción uricosúrica y tubular renal de estos fármacos.

Diagnóstico y tratamiento de porfiria secundaria

Las clamidias son un parásito de producción de energía normal en células eucariotas infectadas. Como resultado, las células huésped disponen de energía insuficiente para su funcionamiento normal. La reducción de energía también provoca que la mitocondria de la célula huésped intente sintetizar ciertas enzimas críticas implicadas en la producción de energía con el fin de aumentar la producción de energía. Dado que las clamidias también evitan que se complete esta síntesis, los precursores de esta enzima, denominados porfirinas, se acumulan en la célula y a menudo se escapan en el medio intracelular. Las porfirinas forman fácilmente radicales libres que, a su vez, dañan a las células. Por tanto, hay una porfiria secundaria estricta que acompaña a muchas infecciones por clamidias. La terapia para esta porfiria secundaria, que es complementaria a la terapia anticlamidias, implica al menos tres estrategias: a) completar el suministro de energía celular para mitigar el malfuncionamiento celular y la formación de porfirinas; b) reducir los niveles de porfirinas sistémicas; y c) mitigar los efectos dañinos de las porfirinas.

La patogénesis de la infección crónica/sistémica por clamidias es única en cuanto a que la infección intracelular por este parásito da como resultado varios trastornos metabólicos/autoinmunitarios concomitantes y estrictos no reconocidos hasta el momento incluyendo porfiria secundaria con autoanticuerpos asociados frente a las porfirinas. La reacción cruzada con vitamina B 12 puede dar como resultado una deficiencia de vitamina B 12 mediada de manera autoinmunitaria subclínica. Estos trastornos asociados a menudo requieren diagnóstico y terapia complementaria específica y/o preventiva.

El primero de estos trastornos concomitantes es una porfiria que es un resultado directo de la infección por clamidias de las células huésped. Esta forma de porfiria es una porfiria secundaria, ya que no es el resultado de una deficiencia genética de las enzimas implicadas en la biosíntesis de hemo. Basándose en el descubrimiento de esta forma secundaria de porfiria, se ha desarrollado un enfoque único para el diagnóstico y tratamiento de trastornos estrictos y secundarios provocados por infecciones por clamidias. La terapia complementaria descrita en el presente documento puede usarse en combinación con la terapia antimicrobiana apropiada requerida para la erradicación del patógeno. Esta terapia conjuntiva para la porfiria secundaria es particularmente importante para la terapia antimicrobiana a largo plazo de infecciones crónicas/sistémicas, ya que tal terapia a menudo provoca síntomas de porfiria secundaria.

La siguiente evaluación resalta el mecanismo supuesto mediante el cual las clamidias inducen estos trastornos metabólicos secundarios. La frase "porfiria inducida por clamidias" se define en el presente documento como un trastorno metabólico estricto y secundario que es el resultado directo de una infección por clamidias y que puede encontrar una expresión fenotípica clínicamente relevante que requiere terapia de intervención.

Las clamidias son procariocitos que se desarrollan en células eucariotas y utilizan parte del metabolismo de la célula huésped (Becker, Y., Microbiological Reviews, 42: 247-306 (1978); McClairty, G., Microbiology, 2: 157-164 (1994)). La transición de cuerpos elementales (CE) en cuerpos reticulados (CR) para la especie Chlamydia requiere la presencia de mitocondrias que funcionan en la célula infectada, así como la producción por la célula huésped de nucleósido trifosfatos que se necesitan para la biosíntesis de ácidos nucleicos de clamidias (Becker, Y., Microbiological Reviews, 42: 247-306 (1978); McClairty, G., Microbiology, 2: 157-164 (1994); Ormsbee, R.A. y Weiss, E., Science, 2: 1077 (1963); Weiss, E., Jour. of Bacteriology, 90: 243-253 (1965); Weiss, E. y Kiesow, L.A., Bacteriology Proceedings, 85 (1966); Weiss, E. y Wilson, N.N., Jour. of Bacteriology, 97: 719 (1969); Hatch et al., Jour. of Bacteriology, 150: 662-670 (1985)); se sabe que las clamidias presentan fragmentos de las rutas glicolítica, pentosa fosfato y ácido cítrico y parecen poder convertir glucosa-6-fosfato (pero no la glucosa) en piruvato y pentosa (Ormsbee, R.A. y Weiss, E., Science, 2: 1077 (1963); Weiss, E. y Kiesow, L.A., Bacteriology Proceedings, 85 (1966)). Sin embargo, las clamidias parecen carecer de enzimas necesarias para la generación neta de adenosina trifosfato (ATP) (Weiss, E., Jour. of Bacteriology, 90: 243-253 (1965)). Por tanto, el desarrollo de las clamidias depende de la función nuclear y mitocondrial activa de la célula huésped. Por este motivo, las clamidias se consideran parásitos intracelulares estrictos (McClairty, G., Microbiology, 2: 157-164 (1994)). La dependencia de las clamidias de la energía de la célula huésped debe agotar la producción de energía existente de la célula huésped a costa de privar de ella a las rutas biosintéticas de la célula huésped.

El requisito de una fuente exógena de ATP y la presencia de un sistema de transporte de ATP específico en las clamidias han proporcionado evidencias de apoyo para el concepto de parásito de energía (Hatch et al., Jour. of Bacteriology, 150: 662-670 (1985)). Este sistema de transporte de ATP es un mecanismo de intercambio de ATP-adenosina difosfato (ADP) (Peeling et al., Infect. and Inmun., 57: 3334-3344 (1989)) similar al encontrado en las mitocondrias (Penefsky, H.S. y Cross, R.L., Adv. Enzym. and Rel. Areas in Molec. Bio., 64: 173-214 (1991)). Además, estudios con microscopio electrónico han demostrado que las clamidias en replicación siempre se encuentran en la proximidad de la mitocondria. Por tanto, se ha sugerido que las clamidias se comportan de manera inversa a las mitocondrias en cuanto a que las mitocondrias importan ADP del citoplasma de la célula huésped y exportan ATP, mientras que las clamidias importan ATP y exportan ADP (Becker, Y., Microbiological Reviews, 42: 247-306 (1978)).

La producción de ATP dentro de la mitocondria está potenciada por un mecanismo denominado acoplamiento quimiosmótico (Kalckar, H.M., Annu. Review of Biochem., 60: 1-37 (1991); Lehninger, A.L., The Mitochondrion: Molecular Basis of Structure and Function, The Benjamin Company, Incorporated, Nueva York; Slater, E.C., Europ. Journ. of Biochem., 166: 489-504 (1987); Babcock, G.T. y Wickström, M., Nature, 356: 301-309 (1992); Senior, A.E., Physiology Review, 68: 177-231 (1988); Pedersen, P.I. y Carafoli, E., Trends in Biochem. Sci., 12: 145-150 (1987); Pedersen, P.I. y Carafoli, E., Trends in Biochem. Sci., 12: 145-150 (1987)). El ciclo del ácido cítrico impulsa la oxidación de NADH o FADH2, que, a su vez, libera un ión hidruro (H-), que se convierte rápidamente en un protón (H+) y dos electrones con mucha energía (2 e-). Ya que el par de electrones con mucha energía se transfiere a cada uno de estos complejos de múltiples proteínas, los protones producidos pasan libremente desde la matriz de la mitocondria hacia el espacio intermembrana a través de los canales en complejos I, III y IV. Por tanto, la transferencia de electrones desde NADH por la cadena de transporte de electrones hace que se bombeen protones al exterior de la matriz mitocondrial y en el espacio intermembrana. Estos protones vuelven a entrar entonces en la matriz a través de un canal específico en el complejo V. Este gradiente de protones a través de la membrana interior da como resultado la fuerza motriz de protones que impulsa la síntesis de ATP.

En esencia, la ATPasa de las clamidias compite por los protones con la ATPasa mitocondrial de la célula huésped. Por supuesto, eso reduce el ATP producido por la mitocondria. Una reducción neta de ATP en la mitocondria de la célula huésped da como resultado una reducción concomitante de la transferencia de electrones en la mitocondria de la célula huésped dado que la transferencia de electrones y la síntesis de ATP están obligatoriamente acopladas; ninguna de las reacciones se produce sin la otra. El establecimiento de un gran gradiente de protones electroquímicos a través de la membrana mitocondrial interna detiene el transporte normal de electrones y puede incluso invertir el flujo de electrones en algunas secciones de la cadena respiratoria de la célula huésped. La reducción de la transferencia de electrones en la mitocondria de la célula huésped reduce, a su vez, la translocación y reducción de hierro férrico mitocondrial fuera de la matriz en hiero ferroso dentro de la matriz. Este agotamiento de energía interfiere a su vez con la biosíntesis de hemo.

A. Biosíntesis de hemo

Hemo es un complejo de Fe2+ en el que el ion ferroso se porta dentro del ligando orgánico, macrociclo tetrapirrólico. Los pigmentos macrocíclicos tetrapirrólicos que contienen hemo se conocen como porfirinógenos y desempeñan un papel principal en la bioquímica celular. Varias funciones celulares críticas tales como el transporte de electrones, la reducción de oxígeno y la hidroxilación están mediadas por una familia de citocromos con base de hemo incluyendo la catalasa, peroxidasa y superóxido dismutasa. Además, las propiedades de transporte de oxígeno de la hemogobina y mioglobina se basan en el hemo. Muchas enzimas celulares tales como el citocromo P-450 y la triptófano pirrolasa contienen hemo.

La biosíntesis de hemo (Battersby et al., Nature, 285:17- (1980); Batterspy, A.R., Proceedings of the Royal Society of London, 225: 1-26 (1985)) es un proceso dependiente de energía que está afectado adversamente por el agotamiento de energía de la célula huésped. La consecuencia metabólica de la interrupción de la biosíntesis de hemo es la porfiria (Ellefson, R.D., Mayo Clinic Proceedings, 57: 454-458 (1982); Hindmarsh, J.T., Clin. Chem., 32: 1255-1263 (1986); Meola, T. y Lim, H.W., Bullous Diseases, 11: 583-596 (1993); Moore, M.R., Int'l. Journ. of Biochem., 10: 1353-1368 (1993)). La biosíntesis de hemo es una serie de reacciones bioquímicas irreversibles de las cuales algunas se producen en las mitocondrias celulares y algunas en el citoplasma. Las reacciones intramitocondriales son principalmente de oxidación-reducción mientras que las del citosol son de condensación y descarboxilación.

Los porfirinógenos, las porfirinas y la porfiria están relacionados todos con la síntesis de hemo. La biosíntesis de hemo se produce en todas las células humanas e implica un número relativamente pequeño de materiales de partida que se condensan para formar porfirinógenos; las porfirinas se forman a partir de los porfirinógenos mediante oxidación no enzimática. A medida que los porfirinógenos progresan a través de la ruta de biosíntesis de hemo, desciende el número de grupos carboxilo laterales en las porfirinas correspondientes, al igual que lo hace la solubilidad en agua de los compuestos.

Las porfirias son consecuencias de cualquier deterioro de la formación de porfirinógenos o de su transformación en hemo. Las porfirinas se forman a partir de porfirinógenos mediante oxidación no enzimática. Cada una de las diversas porfirias genéticas está ligada a una deficiencia enzimática en la ruta de biosíntesis de hemo. Como consecuencia de los defectos enzimáticos, hay un aumento de la actividad de la enzima inicial y que controla la velocidad de esta ruta de biosíntesis que da como resultado una sobreproducción y un aumento de la excreción de precursores de porfirinógeno y porfirinógenos. Las etapas de la biosíntesis de hemo se exponen en la tabla 7.

TABLA 7 Esquema simplificado de las enzimas y precursores en la biosíntesis de hemo

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Cuando se acumulan porfirinógenos debido a defectos enzimáticos en la ruta de biosíntesis de hemo, se oxidan para dar porfirinas fotosensibles. Las porfirinas se clasifican como agentes fotodinámicos debido a que generalmente requieren superóxido/oxígeno/electrones para ejercer sus efectos biológicos perjudiciales. Las porfirinas pueden convertirse en moléculas desde el estado basal hasta el estado excitado tras la absorción de radiación. Las porfirinas en estado excitado transfieren energía a moléculas de oxígeno y producen especies de oxígeno reactivo tales como oxígeno singlete, anión superóxido, radical superóxido, radical hidroxilo y peróxido de hidrógeno. Se ha observado que las especies de oxígeno reactivo alteran los lípidos de membrana, el citocromo P-450 y la estructura del ADN. Si estas especies de oxígeno reactivo se liberan en el espacio extracelular, tal como se observa en la porfiria aguda, puede producirse la autooxidación del tejido circundante. Por tanto, la acumulación de porfirinógenos/porfirinas en tejidos y fluidos corporales humanos produce un estado de sobrecarga crónica del sistema de estrés oxidativo con efectos a largo plazo observados particularmente para el tejido neural, hepático y renal.

B. Porfiria secundaria y clamidia

Tal como se mencionó, la translocación férrica/ferrosa es una etapa crítica en la biosíntesis de hemo dado que cataliza la entrada oxidativa de coproporfirinógeno en la matriz mitocondrial como protoporfirina; las clamidias interfieren con esta etapa reduciendo la transferencia de electrones en la célula huésped. Cuando el coproporfirinógeno no puede retornar a la matriz mitocondrial, se acumula en primer lugar en el citosol y después en el medio extracelular. Dentro de la matriz mitocondrial, las etapas finales en la biosíntesis de hemo se detienen. Debido a que la acumulación de hemo dentro de la matriz mitocondrial ejerce normalmente una retroalimentación negativa sobre la síntesis de hemo, la reducción de hemo provocada por la incapacidad del coproporfirinógeno de retornar a la matriz mitocondrial da como resultado un aumento de la producción de precursores de hemo tales como \Delta-ALA y PBG, el primer y segundo productos en la biosíntesis de hemo. Por tanto, los precursores de porfirina tales como \Delta-ALA y PBG comienzan a acumularse en la matriz mitocondrial, después en el citosol y después en el medio extracelular.

El agotamiento de energía de la célula huésped mediante la infección intracelular con especies de Chlamydia provoca complicaciones adicionales relacionadas con la energía. Dado que están disponibles menos electrones para moverse a través de la cadena transportadora de electrones de la membrana de la matriz mitocondrial de la célula huésped, el ciclo del ácido cítrico produce más succinil-CoA que, a su vez, estimula un aumento de la síntesis de \Delta-ALA. El resultado neto es un aumento en la cantidad de precursores de hemo que se convierten en porfirinas. La presencia de porfirinas en la matriz mitocondrial daña la célula dado que estas moléculas son inestables y forman radicales libres. Los electrones de alta energía generados por estos radicales libres son "capturados" por la ubiquinona y el citocromo c que están presentes en la membrana de la matriz mitocondrial. Esto, por supuesto, desacopla eficazmente el transporte de electrones de la síntesis de ATP y "provoca un cortocircuito" en la fuerza protón-motriz: se reduce entonces la síntesis de ATP. Menos ATP, a su vez, significa un aumento de porfirinas y comienza un ciclo
destructivo.

El resultado clínico de la acumulación intracelular y extracelular de porfirinas, si es extensa, es una porfiria específica de tejido/órgano que produce muchas de las manifestaciones clásicas de la porfiria hereditaria. Dado que las células huésped infectadas con clamidias se lisan, tal como sucede en el ciclo de vida normal de las clamidias, se liberan las porfirinas intracelulares y da como resultado una porfiria secundaria. Además, cuando la infección por clamidias implica a células hepáticas, el uso de cualquier agente farmacológico que se metaboliza mediante el citocromo P-450 en el hígado aumentará la necesidad de citocromo P-450, que es una enzima con base de hemo. Por tanto, la biosíntesis de hemo en el hígado aumenta. Cuando las células hepáticas están infectadas por especies de Chlamydia, el descenso de energía en la célula huésped no permite que la biosíntesis de hemo llegue hasta el final y aumentan las porfirinas en el hígado/circulación entero-hepática. También se ha observado que cualquier célula huésped infectada por especies de Chlamydia tiene un aumento en la cantidad de porfirinas intracelulares que se liberan cuando los agentes antimicrobianos destruyen el microorganismo.

Aunque varios investigadores han notificado porfiria enigmática en pacientes que no tenían evidencia de enzimas anómalas en la ruta de biosíntesis de hemo (Yeung Laiwah et al., Lancet, i: 790-792 (1983); Mustajoki, P. y Tenhunen, R., Europ. Journ. of Clin. Invest., 15:281-284 (1985)), la porfiria intrínseca secundaria, obligatoria provocada por la infección por clamidias dada a conocer en el presente documento no se ha descrito ni supuesto en la bibliografía médica. Esta porfiria secundaria obligatoria es claramente de importancia primordial para tratar infecciones por clamidias sistémicas crónicas tal como se observa con infecciones intravasculares provocadas por Chlamydia pneumoniae.

El diagnóstico de la porfiria secundaria asociada a clamidias es importante debido a las manifestaciones neuropsiquiátricas bien conocidas de las porfirias (Gibson et al., Journal of Pathology and Bacteriology, 71:495-509 (1956); Bonkowsky et al., Seminars in Liver Diseases, 2:108-124 (1982); Brennan et al., International Journal of Biochemistry, 833-835 (1980); Burgoyne et al., Psychotherapy and Psychosomatics, 64:121-131 (1995)). Además, se ha asociado la exposición crónicas a porfirinas en exceso con cáncer (Kordac V., Neoplasma, 19:135-139 (1972); Lithner et al. Acta Medica Scandanavia, 215:271-274 (1984)). De particular interés es que se ha asociado la infección por Chlamydia pneumoniae con el cáncer de pulmón (Cerutti PA., Science, 227:375-381 (1985)).

El diagnóstico de la porfiria genética en pacientes con infecciones por clamidias sistémicas es importante dado que estos pacientes pueden precipitarse en un ataque porfírico grave cuando reciben agentes antimicrobianos para tratar su infección. Por tanto, con el fin de controlar la porfiria grave, estos pacientes pueden requerir plasmaféresis y/o hematina intravenosa además de agentes antiporfíricos orales. En cambio, el diagnóstico de la porfiria secundaria asociada a clamidias puede ser difícil dado que la porfiria puede ser mínima y específica de tejido. La medición de las porfirinas en orina de 24 horas no es lo suficientemente sensible en todos los casos de infección por clamidias para detectar la porfiria secundaria provocada por infección por clamidias.

En vista de la discusión precedente de la etiología de la porfiria, un aspecto de la invención se refiere a métodos para diferenciar la porfiria provocada por clamidias de la provocada por un trastorno genético latente en un individuo. El método comprende tratar una infección por clamidias en todas las fases de su ciclo de vida, usando las terapias descritas con detalle en otra parte en esta descripción, y valorando después si se han reducido los síntomas de la porfiria. Una reducción en los síntomas de la porfiria (por ejemplo, manifestación bioquímica, enzimática o física) es indicativa de que la porfiria es una porfiria secundaria provocada por clamidias.

El diagnóstico de la porfiria genética se realiza de la manera más fácil durante un ataque porfírico agudo dado que hay precursores de porfirinógeno y porfirinas en la sangre, orina y deposiciones (Kauppinen et al., British Journal of Cancer, 57:117-120 (1988)). El diagnóstico de la porfiria secundaria no es fácil de realizar dado que puede no haber una cantidad anómala de precursores de porfirinógeno y porfirinas en la sangre, orina o deposiciones. Sin embargo, varias enzimas tempranas en la ruta para la biosíntesis de hemo pueden medirse fácilmente en los glóbulos rojos periféricos (Percy et al., South African Forensic Medicine Journal, 52:219-222 (1977); Welland et al., Metabolism, 13:232-250 (1964); McColl et al., Journal of Medical Genetics, 19:271-276 (1982)). Las porfirias hereditarias específicas que pueden diagnosticarse con la medición de niveles bajos de enzimas de glóbulos rojos periféricos son la porfiria intermitente aguda, porfiria eritropoyética congénita, porfiria por deficiencia en ácido \Delta-aminolevulínico deshidratasa y porfiria cutánea tarda. Por tanto, niveles de porfirina elevados en pacientes que no tienen niveles bajos de estas enzimas sugieren una porfiria no genética, tal como porfiria secundaria inducida por clamidias. Por ejemplo, en una realización, la porfiria provocada por clamidias en un individuo que tiene síntomas asociados con la misma puede diagnosticarse determinando la presencia y/o cantidad de enzimas obligatorias en la biosíntesis de hemo en los glóbulos rojos del individuo. Se compara la presencia o cantidad de la enzima obligatoria con un paciente normal que no tiene porfiria o con un resultado de una prueba anterior en el paciente para determinar los síntomas de porfiria del paciente y/o si la terapia es eficaz. Por ejemplo, la presencia de ALA sintasa y/o PBF desaminasa o cualquiera de las otras enzimas conocidas implicadas en la biosíntesis de hemo (véase la tabla 7); en niveles anómalos (es decir, desviación significativa de los niveles normales en pacientes sanos que no tienen porfiria genética) es indicativa de porfiria secundaria.

El diagnóstico de la porfiria secundaria asociada a clamidias puede ser difícil dado que la porfiria puede ser mínima y específica de tejido. La medición de las porfirinas en orina o deposiciones de 24 horas puede no ser lo suficientemente sensible en muchos casos de infección por clamidias para detectar la porfiria secundaria. En este caso, el diagnóstico depende del hecho de que si las porfirinas en exceso están alcanzando la circulación, los glóbulos rojos precursores las absorberán y producirán hemo. Por tanto, las enzimas para la biosíntesis de hemo en los glóbulos rojos diferenciados se elevan y se mantienen elevadas durante la vida del glóbulo rojo. Esto permite el diagnóstico de la porfiria secundaria de nivel bajo episódica tal como se observa con infecciones por clamidias. Por tanto, pueden usarse los niveles de síntesis de hemo elevados para diagnosticar la porfiria intracelular. Véase el ejemplo 7.

Tal como se trató anteriormente, algunos pacientes que tienen una porfiria inducida por clamidias no tienen niveles anómalos de precursores de hemo. Para estos pacientes, puede ser apropiado determinar la presencia de clamidias así como de porfirinas en el individuo. La presencia tanto del patógeno como de las porfirinas (por ejemplo, determinada mediante un ensayo ELISA descrito más adelante) es indicativa de porfiria secundaria por clamidias, en lugar de una porfiria de base genética. Por tanto, un diagnóstico apropiado puede determinar el régimen terapéutico necesario para tratar la infección y los síntomas de la porfiria secundaria.

Los inventores han descubierto la existencia de anticuerpos frente a los diversos metabolitos de la biosíntesis de hemo, así como a la vitamina B12 (cobalamina), que es molecularmente similar a estos metabolitos, en pacientes con infección sistémica activa por C. pneumoniae. Los anticuerpos son principalmente IgM; esto es similar a las respuestas de anticuerpo frente a MOMP de C. pneumoniae en pacientes gravemente sintomáticos. El ejemplo 8 ilustra títulos en pacientes sintomáticos con infecciones por C. pneumoniae sistémicas. La presencia de anticuerpos frente a la vitamina B12 puede tener relevancia funcional disminuyendo la cantidad de vitamina B12 biodisponible. Por tanto, una infección por clamidias puede provocar una deficiencia de vitamina B12 secundaria no reconocida previamente. La administración (por ejemplo, intramuscular) de grandes cantidades de vitamina B12 (de 1000 a 5000 \mug) (por ejemplo, terapia con cobalamina parenteral) crea grandes cantidades de vitamina B12 disponible para unirse a los receptores nativos de anticuerpos con una afinidad por la vitamina B12, saturando así estos anticuerpos anti-vitamina B12 y aumentando la cantidad de vitamina B12 circulante biodisponible.

El hecho desconocido previamente de que el organismo produce anticuerpos frente a porfirinas hace posible diagnosticar la presencia de porfirinas en un paciente o animal determinando la presencia de anticuerpos anti-porfirina. Los inventores han desarrollado un método en el que pueden medirse anticuerpos IgM e IgG frente a porfirinas con un método ELISA. Éste ha mostrado ser un método mucho más preciso para determinar la presencia crónica de porfirinas.

También pueden usarse porfirinas para crear anticuerpos monoclonales y policlonales usando métodos convencionales conocidos por cualquier experto en el campo. Estos anticuerpos pueden usarse en una variedad de ensayos diagnósticos y estrategias terapéuticas anti-porfirina.

El tratamiento de la infección por clamidias puede exacerbar la porfiria secundaria aumentando el metabolismo de las clamidias crípticas o acelerando la muerte de las células infectadas con elevados niveles de porfirina intracelular.

Una vez que se ha diagnosticado la porfiria secundaria, puede tratarse la infección por clamidias y los síntomas asociados con la porfiria. El siguiente régimen terapéutico está dirigido a controlar la porfiria obligatoria/secundaria asociada a clamidias, cuyos síntomas pueden aumentar en realidad durante la terapia antimicrobiana de la infección por clamidias. Esta reacción porfírica a la terapia antimicrobiana debe reconocerse como tal y diferenciarse de la respuesta inmunitaria mediada por citocinas esperada precipitada por la descarga de antígeno durante la terapia anticlamidias. Estos trastornos metabólicos por clamidias obligatorios y secundarios se tratan mediante dietas específicas y una combinación de agentes farmacológicos, dirigidos cada uno a diferentes aspectos de los trastornos metabólicos. Por ejemplo, la porfiria inducida por clamidias puede tratarse con una dieta antiporfírica específica y una combinación de agentes antiporfíricos, dirigidos cada uno a diferentes aspectos de las porfirinas/porfiria. Para los fines de esta invención, el término "agente(s) antiporfírico(s)" pretende abarcar cualquiera de las terapias descritas en el presente documento para el tratamiento de la porfiria. Además de la dieta antiporfírica y los agentes antiporfíricos, el paciente puede requerir glucosa y hematina intravenosas, diálisis renal y/o plasmaféresis, particularmente para aquellos pacientes que tienen tanto porfiria genética como porfiria secundaria inducida por una infección por clamidias. Se describen con detalle a continuación agentes antiporfíricos y dietas adecuadas.

C. Terapias para potenciar la función celular

La glucosa es una fuente importante de energía celular. Los niveles de glucosa pueden potenciarse mediante la dieta y a través de complementos vitamínicos tal como describe a continuación.

Debe mantenerse una dieta rica en hidratos de carbono para estimular la producción de glucosa (Pierach et al., Journal of the American Medical Associación, 257:60-61 (1987)). Aproximadamente el 70% de la ingesta calórica debe ser en forma de hidratos de carbono complejos tales como pan, patata, arroz y pasta. El 30% restante de la dieta diaria debe comprender proteínas y grasas, que idealmente deben estar en forma de pescado o pollo. Las carnes rojas, incluyendo ternera, carne oscura del pavo, atún y salmón, contienen triptófano. El aumento de los niveles de triptófano en el hígado inhibe la actividad de la fosfoenol piruvato carboxicinasa con la consiguiente alteración de la gluconeogénesis. Esto explica la tolerancia anómala a la glucosa observada en la porfiria. El aumento de las concentraciones plasmáticas de triptófano también potencia el transporte de triptófano al cerebro. La concentración de triptófano en el cerebro es el factor limitante de la velocidad para la síntesis del neurotransmisor 5-hidroxitriptamina (5-HT, serotonina). La serotonina se sintetiza por el endotelio de los capilares del cerebro debido al triptófano circulante. Por tanto, se esperaría que el aumento de las concentraciones de triptófano en el cerebro potenciaría la producción de serotonina y su ácido 5-hidroxindol-acético, metabólico (5HIAA). A los aumentos agudos de la renovación de serotonina en el cerebro le siguen cambios vasculares y metabólicos que incluyen descensos en el consumo de glucosa, alteraciones en los seguimientos del EEG y descensos en la puntuación neurológica postisquémica. Además, aunque la serotonina aumenta la perfusión cerebral en una única inyección, la administración repetitiva abre inicialmente la barrera hematoencefálica e induce posteriormente la vasoconstricción. Es probable que cualquier apertura transitoria de la barrera hematoencefálica por la serotonina pudiera permitir a sustratos circulantes tales como ALA y PBG, si están presentes, entrar en el sistema nervioso central. Tal como se esperaría de la ubicación de los receptores de serotonina y de la función de barrera del endotelio de las arterias cerebrales, el efecto constrictor de la serotonina se amplifica en las arterias cerebrales cuando se daña o se elimina el endotelio. Las células endoteliales dañadas, tal como se esperaría con la infección por clamidias, ya no tendría procesos catabólicos funcionales para la serotonina. Esto sería particularmente cierto en el caso de ATP agotado tal como se produce mediante la infección por clamidias. Esto significa que el aumento de las concentraciones de serotonina alcanzará la capa de músculo liso de los vasos cerebrales y provocará más constricción. Finalmente, la serotonina también se almacena en las plaquetas sanguíneas. Debido a que las plaquetas sanguíneas no se adhieren y agregan en condiciones normales, no liberan serotonina cuando la luz del vaso está intacta. Sin embargo, si la luz del vaso está alterada por la infección por clamidias, puede producirse deposición de plaquetas y liberación de serotonina.

Se observa otro efecto adverso del aumento de los niveles de serotonina debido a la porfiria con los tejidos nerviosos. Las terminaciones nerviosas simpáticas almacenan la serotonina captada de la circulación. Estas neuronas serotonérgicas forman plexos alrededor de los vasos del cerebro en los que es probable que liberen sus contenidos en serotonina cuando se someten a lisis celular por cualquier causa incluyendo isquemia, daño ionizante por radicales libres a membranas celulares y/o infección por clamidias.

En ratas, un elevado triptófano circulante ha demostrado producir alteración estructural de los astrocitos, oligodendroglía y neuronas del cerebro, así como degeneración de las células de Purkinje y desgaste de los axones. Se han notificado alteraciones neurohistológicas similares en pacientes con porfiria aguda. Se han asociado los elevados niveles de triptófano en plasma y cerebro con la encefalopatía humana. Finalmente, se reconoce también la serotonina como un neurotransmisor activo en el tracto gastrointestinal. Los efectos farmacológicos de la serotonina en el sistema nervioso central y tracto gastrointestinal se asemejan a las manifestaciones neurológicas de los ataques porfíricos agudos. De hecho, se ha notificado que la administración de o bien triptófano o bien serotonina a seres humanos provoca dolor abdominal grave, alteraciones psicomotoras, naúseas y disuria; todos los cuales son síntomas de porfiria aguda.

Deben evitarse la sacarosa y la fructosa (Bottomly et al., American Journal of Clinical Pathology, 76:133-139 (1981)) porque la ingestión de grandes cantidades de fructosa desencadena la gluconeogénesis hepática que disminuye entonces la glucosa disponible que procede del glucógeno descompuesto en el hígado. Se recomienda consumir bebidas deportivas que contienen glucosa.

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Se recomienda que un paciente que padece porfiria evite los productos lácteos. Los productos lácteos contienen lactosa y lactoferrina, y se ha demostrado empíricamente que empeoran los síntomas de la porfiria.

Deben administrarse diariamente multivitaminas que contienen vitaminas del complejo B (por ejemplo una o múltiples veces), preferiblemente más que la CDR, para potenciar la disponibilidad de glucosa. Tomando estas multivitaminas que contienen las vitaminas del complejo B, se ayuda a la descomposición hepática del glucógeno con liberación de glucosa. La piridoxina minimiza la neuropatía porfírica relacionada con la porfirina. La vitaminas del complejo B incluyen ácido fólico (por ejemplo, 400 \mug por dosificación; máximo diario de 1200 \mug); vitamina B-1 (tiamina; por ejemplo, 10 mg por dosificación; máximo diario de 30 mg); B-2 (riboflavina; por ejemplo, 10 mg por dosificación; máximo diario de 30 mg), B-5 (pantotenato; por ejemplo, 100 mg por dosificación; máximo diario de 300 mg); B-6 (piridoxina; por ejemplo, 100 mg por dosificación, máximo diario de 300 mg) o piridoxal-5-fosfato (por ejemplo, 25 mg por dosificación; máximo diario de 100 mg) y B-12 (por ejemplo, 500 \mug por dosificación; máximo diario de 10.000 \mug). El método de administración preferido es oral para la mayoría de estas vitaminas (dos veces al día), excepto para B-12 para la que se prefiere administración sublingual (tres veces al día). Se ha descubierto que un efecto importante de esta porfiria secundaria en algunos pacientes es la producción de anticuerpos IgM e IgG frente al coproporfirinógeno-III. Estos anticuerpos reaccionan de manera cruzada con la vitamina B-12 (cobalamina) y por tanto pueden provocar una deficiencia. El aporte complementario de vitamina B12 (por ejemplo, terapia con cobalamina parenteral) puede remediar la deficiencia.

D. Reducción de los niveles de porfirina

Pueden usarse métodos dietéticos y farmacéuticos para reducir los niveles de porfirina sistémica (tanto soluble en agua como soluble en grasas).

Deben incorporarse al régimen muchos fluidos orales en forma de agua bicarbonatada o "bebidas deportivas" (es decir, agua con glucosa y sales). Esto lava las porfirinas solubles en agua del sistema del paciente. Beber agua de Seltz es la forma más fácil de lograr este fin. El color de la orina debe ser siempre casi transparente en lugar de amarillo. Se observa que la deshidratación concentra las porfirinas y hace a los pacientes más sintomáticos.

Puede administrarse diariamente carbón vegetal activado en una cantidad suficiente para absorber las porfirinas solubles en grasas de la circulación enterohepática. Se ha asociado el tratamiento con carbón vegetal activado oral, que no puede absorberse y se une a las porfirinas en el tracto gastrointestinal y por tanto interrumpe su circulación enterohepática, con un descenso de los niveles de porfirina cutáneos y plasmáticos. El carbón vegetal debe tomarse entre las comidas y sin ningún otro fármaco oral, o el carbón vegetal absorberá los alimentos o fármacos en lugar de las porfirinas. Para aquellos que tienen dificultad para tomar el carbón vegetal debido a otras medicaciones que están tomando durante el día, el carbón vegetal puede tomarse todo de una vez antes de acostarse. Se recomienda tomar entre 2 y 20 gramos, preferiblemente al menos 6 gramos (24 cápsulas de 250 mg) de carbón vegetal activado por día (Perlroth et al., Metabolism, 17:571-581 (1968)). Puede tomarse mucho más carbón vegetal de manera segura; se han tomado hasta 20 gramos seis veces al día durante nueve meses sin ningún efecto secundario.

Para la porfiria grave, pueden administrarse quelantes y otros agentes, de manera única o en combinación, para reducir los niveles de porfirinas en la sangre. Ejemplos de agentes quelantes incluyen, pero no se limitan, a Kemet (succímero; desde aproximadamente 10 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg); ácido etilendiaminotetracético (EDTA); BAL (dimercaprol; por ejemplo, dosificación tolerada máxima de 5 mg/kg cada cuatro horas), edetato cálcico de disodio (por ejemplo, desde aproximadamente 1000 mg/m^{2} hasta aproximadamente 5000 mg/m^{2} por día; puede usarse en combinación con BAL); mesilato de deferoxamina (por ejemplo, desde aproximadamente 500 mg hasta aproximadamente 6000 mg por día); clorhidrato de trientina (por ejemplo, desde aproximadamente 500 mg hasta aproximadamente 3 g por día); Panhematin (por ejemplo, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 6 mg/kg por día), penacilamina. También puede administrarse hematina intravenosa. Deben administrarse al paciente diariamente derivados de quinina, tales como, pero sin limitarse a, hidroxicloroquina, cloroquina y quinacrina a una dosificación de desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 400 mg por día, de manera preferible aproximadamente 200 mg una vez o dos veces al día con una dosis diaria máxima de 1 g. La hidrocloroquina es la más preferida. Se piensa que el mecanismo de acción de la hidroxicloroquina implica la formación de un complejo fármaco-porfiria soluble en agua que se elimina del hígado y se excreta en la orina (Tschudy et al., Metabolism, 13:396-406 (1964); Primstone et al., The New England Journal of Medicine, 316:390-393 (1987)).

Para reducir los ataques porfíricos graves durante la terapia para las infecciones por clamidias crónicas, puede necesitarse el uso de hemodiálisis, plasmaféresis, agentes quelantes y/o hematina intravenosa. Puede usarse cualquiera de éstos o una combinación de los mismos para tratar al paciente y está muy dentro del conocimiento del experto en la técnica cómo llevar a cabo estas terapias complementarias.

E. Mitigación de los efectos de las porfirinas

Los antioxidantes a dosificaciones altas (preferiblemente tomados dos veces al día) ayudan a mitigar los efectos de los radicales libres producidos por las porfirinas. Ejemplos de antioxidantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, vitamina C (por ejemplo, 1 gramo por dosificación; máximo diario de 10 g); vitamina E (por ejemplo, 400 unidades por dosificación; máximo diario de 3000); L-carnitina (por ejemplo, 500 mg por dosificación, máximo diario de 3 g); coenzima Q-10 (uniquinona (por ejemplo, 30 mg por dosificación; máximo diario de 200 mg); biotina (por ejemplo, 5 mg por dosificación; máximo diario de 20 mg); ácido lipoico (por ejemplo, 400 mg por dosificación; máximo diario de 1 g); selenio (por ejemplo, 100 \mug por dosificación; máximo diario de 300 \mug); glutamina (por ejemplo, desde 2 hasta aproximadamente 4 g por dosificación); glucosamina (por ejemplo, desde aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1000 mg por dosificación); y sulfato de condroitina (por ejemplo, desde aproximadamente 250 hasta aproximadamente 500 mg por dosificación).

Las dietas terapéuticas mencionadas anteriormente pueden combinarse con terapias farmacológicas reconocidas tradicional o actualmente para la porfiria. En una realización, pueden administrarse fármacos de benzodiazepina, tales como, pero sin limitarse a, valium, klonafin, clorhidrato de flurazepam (por ejemplo, Dalmanc^{TM}, Roche) y alprazolam (por ejemplo, Xanax). Preferiblemente, pueden prescribirse sedantes, tales como alprazolam (por ejemplo, Xanax; 0,5 mg por dosificación durante de 3 a 4 veces diariamente), para ataques de pánico y puede prescribirse clorhidrato de flurazepam (por ejemplo, Dalmane^{TM}, Roche o Restoril^{TM} (por ejemplo, 30 mg por dosificación) para dormir. El fundamento se basa en la presencia de receptores de benzodiazepina periféricos en altas cantidades en células fagocíticas que se sabe que producen altos niveles de especies de oxígeno reactivo. Se ha demostrado un papel protector frente al peróxido de hidrógeno para los receptores de benzodiazepina periféricos. Esto sugiere que estos receptores pueden evitar los daños radicales a las mitocondrias regulando así la apoptosis en el sistema hematopoyético. Se ha mostrado también que las benzodiazepinas interfieren con la circulación intracelular de hemo y porfirinógenos (Scholnick et al., Journal of Investigative Dermatology, 1973, 61:226-232). Es probable que esto disminuya las porfirinas y sus efectos adversos. La benzodiazepina específica dependerá de los síntomas relacionados con las porfirinas.

También puede administrarse cimetidina de manera separada o en combinación con fármacos de benzodiazepina. Se ha mostrado que la cimetidina elimina eficazmente radicales hidroxilo aunque es un eliminador ineficaz para el anión superóxido y el peróxido de hidrógeno. La cimetidina parece que puede unirse e inactivar el hierro, lo que enfatiza adicionalmente su capacidad antioxidante. La cimetidina es también un eliminador eficaz para el ácido hipocloroso y la monocloroamina, que son oxidantes citotóxicos que surgen de células inflamatorias, tales como neutrófilos. Se esperaría por tanto que la cimetidina fuese útil para la terapia del daño oxidativo mediado por radicales libres provocado por la porfiria por clamidias. Estudios recientes en Japón han hallado que la cimetidina es eficaz para tratar la porfiria. La cantidad recomendada de cimetidina es aproximadamente 400 mg una vez o dos veces al día.

La complejidad del ciclo de vida de las clamidias, la respuesta del huésped a la infección así como a la terapia, la alta frecuencia de efectos secundarios desfavorables de la terapia antimicrobiana, los trastornos metabólicos obligatorios y la necesidad de una terapia prolongada hacen de la educación, monitorización y apoyo del paciente un factor necesario y clave para la erradicación exitosa de las infecciones por clamidias crónicas/sistémicas. Cuando se detecta la presencia de clamidias en la sangre mediante cultivo y/o PCR y los títulos de anticuerpos IgM e IgG son elevados, se hace un diagnóstico presunto de la infección por clamidias crónica/sistémica. Deben entonces investigarse los posibles efectos secundarios tales como la porfiria. Por ejemplo, puede evaluarse esto realizando una o una combinación de las siguientes pruebas: 1) hemograma completo (HC); 2) pruebas de la función hepática; 3) ácido úrico; 4) estudios del hierro sérico; 5) anticuerpos IgM e IgG frente a coproporfirinógeno-III y vitamina B12; y 6) ALA deshidratasa y PBG desaminasa. También deben someterse a prueba las muestras de orina y deposiciones para detectar la presencia de porfirinas, preferiblemente usando muestras de 24 horas. En una realización preferida del régimen terapéutico, se pone al paciente en el régimen antiporfírico, preferiblemente durante al menos dos semanas antes de se inicie cualquier tratamiento con antibióticos. Tras esto, se inicia un tratamiento con un agente reductor. Éstos incluyen amoxicilina (500 mg cada 12 horas), penicilamina (250 mg cada 12 horas) y cicloserina (250 mg cada 12 horas). El paciente se monitoriza estrechamente durante al menos dos semanas en este régimen para deterinar si se produce cualquier efecto secundario. Se continúa este régimen durante el ciclo de tratamiento completo y es crítico dado que disminuye la carga de CE. Después de que el paciente se haya ajustado a la amoxicilina o penicilamina, se añade una combinación de agentes antimicrobianos. El paciente se monitoriza estrechamente para determinar la tolerancia a los agentes antimicrobianos.

Pueden incorporarse vitaminas, antioxidantes y otros agentes antiporfíricos, en las cantidades descritas en el presente documento, en nutracéuticos, alimentos médicos, complementos dietéticos y formulaciones nutricionales dietéticas incluyendo bebidas y alimentos tales como barras nutricionales, para el tratamiento de la porfiria secundaria, no genética provocada por una infección por clamidias. Alternativamente, puede envasarse conjuntamente una combinación de vitaminas y antioxidantes en un envase o kit tal como se describe en otra parte en el presente documento y/o formularse conjuntamente en una composición en cantidades adecuadas para su administración a un individuo que tiene porfiria secundaria, no genética.

Modos de administración

Basándose en la capacidad de la terapia de combinación de esta invención para mejorar tanto el estado serológico como físico de un paciente que experimenta tratamiento, pueden prepararse composiciones o preparaciones farmacéuticas que comprenden al menos dos agentes diferentes elegidos de los siguientes grupos: a) al menos un agente dirigido frente a la fase corporal elemental del ciclo de vida de las clamidias (por ejemplo, agentes reductores de disulfuro); b) al menos un agente dirigido frente a la fase de replicación del ciclo de vida de las clamidias (por ejemplo, agentes antimicobacterianos); y c) al menos un agente dirigido frente a la fase críptica del ciclo de vida de las clamidias (por ejemplo, agentes bactericidas anaerobios). Tal como se trata con más detalle más adelante, los agentes pueden formularse en un vehículo fisiológicamente aceptable en una forma que dependerá del método en que se administre.

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En otro aspecto, la invención se refiere a una combinación de agentes que comprenden al menos dos agentes, cada uno de los cuales se dirige frente a una fase diferente del ciclo de vida de las clamidias, tal como se trató previamente. La combinación de los agentes anticlamidias puede usarse en el tratamiento de la infección por clamidias o profilaxis de la misma para evitar la infección recurrente. La combinación de agentes puede estar en forma de una mezcla, como un envase (tratado con detalle más adelante) o individualmente y/o en virtud de las instrucciones para producir tal combinación. Debe entenderse que la terapia de combinación puede comprender múltiples agentes que son eficaces dentro de una fase particular del ciclo de vida de las clamidias. La combinación de agentes anticlamidias puede comprender además inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, vitamina C y combinaciones de los
mismos.

En una realización preferida, si se elige sólo un agente anticlamidias para usarse en un paciente asintomático para reducir/evitar la infección crónica, este agente es un agente reductor, tal como la penicilamina.

Los métodos terapéuticos novedosos descritos en el presente documento pueden usarse para mejorar los estados/síntomas asociados con los estados de enfermedad descritos anteriormente, cuando la enfermedad aparece o se agrava mediante la infección por clamidias. Los agentes de esta invención pueden administrarse a animales incluyendo, pero sin limitarse a, peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los compuestos y agentes descritos en el presente documento pueden administrarse a un individuo usando métodos y modos convencionales que son normalmente de rutina para el estado de la enfermedad.

La(s) combinación/combinaciones de agentes anticlamidias de esta invención puede(n) usarse para la fabricación de un medicamento para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de la infección por clamidias o profilaxis de la misma. Los agentes pueden usarse también para la fabricación de un medicamento para la terapia de una enfermedad asociada con la infección por clamidias, tal como enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria, enfermedad inmunodeficiente.

Los agentes pueden administrarse por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía parenteral, por vía intraperitoneal, por vía intradérmica, por vía intramuscular, por vía tópica, por vía enteral (por ejemplo, por vía oral), por vía sublingual, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal, mediante pulverizador de inhalación, mediante bomba de fármaco o mediante un depósito implantado en formulaciones de dosificación que contienen vehículos no tóxicos, fisiológicamente aceptables. El método preferido de administración es mediante administración oral. La forma en la que se administra (por ejemplo, jarabe, elixir, cápsula, comprimido, disolución, espumas, emulsión, gel, sol) dependerá en parte de la vía mediante la cual se administre. Por ejemplo, para la administración mucosa (por ejemplo, mucosa oral, rectal, mucosa intestinal, mucosa bronquial), pueden usarse gotas nasales, aerosoles, inhalantes, nebulizadores, gotas oculares o supositorios. Los compuestos y agentes de esta invención pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos.

En una realización específica, puede ser deseable administrar los agentes de la invención localmente en una zona localizada que necesita el tratamiento; esto puede lograrse mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica (por ejemplo, para estados de la piel tales como la psoriasis), parches transdérmicos, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como fibras o membranas sialásticas. Por ejemplo, el agente puede inyectarse en las articulaciones.

En una realización específica, cuando es deseable dirigir el fármaco al sistema nervioso central, pueden usarse técnicas que pueden abrir de manera oportuna la barrera hematoencefálica durante un tiempo adecuado para administrar el fármaco a través de la misma. Por ejemplo, puede usarse una composición de manitosa al 5% y agua. En otra realización, los agentes pueden administrarse a un feto a través de la placenta dado que muchos de los agentes son lo suficientemente pequeños para pasar a través de la barrera placentaria.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Tales composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéutica (o profilácticamente) eficaz del agente, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. El vehículo y la composición pueden ser estériles. La formulación debe ajustarse al modo de administración.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones de sal (por ejemplo, NaCl), alcoholes, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, hidratos de carbono tales como lactosa, amilosa o almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, ésteres de ácido graso, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse y si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, sustancias colorantes, de sabor y/o aromáticas y similares que no reaccionan de manera nociva con los compuestos activos.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. La composición puede ser una disolución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

La composición puede formularse según los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición puede incluir también un agente de solubilización y un anestésico local para calmar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los componentes se suministran o bien de manera separada o bien mezclados juntos en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o sobre que indican la cantidad de principio activo. Cuando la composición va a administrarse mediante infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua estéril de calidad farmacéutica, solución salina o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los componentes se mezclen antes de la administración.

Para la aplicación tópica, se emplean como formas no pulverizables, formas de viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo compatible con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, enemas, lociones, soles, linimentos, bálsamos, aerosoles, etc, que, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares, por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales para influir en la presión osmótica, etc. El fármaco puede incorporarse en una formulación cosmética. Para la aplicación tópica, también son adecuadas preparaciones de aerosol pulverizables en las que el principio activo, preferiblemente en combinación con un material de vehículo inerte sólido o líquido, está envasado en una botella a presión o en una mezcla con un propelente volátil comprimido, normalmente gaseoso, por ejemplo, aire comprimido.

Los agentes descritos en el presente documento pueden formularse como formas salinas o neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

La cantidad de los agentes que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o estado particular dependerá de la naturaleza del trastorno o estado, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que va a emplearse en la formulación dependerá también de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse según el juicio del médico y de las circunstancias de cada paciente. Pueden extrapolarse las dosis eficaces a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelo animal o in vitro.

La invención también proporciona una base para un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes cargados con uno o más de los componentes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociada opcionalmente con tal(es) recipiente(s) puede estar una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de los productos farmacéuticos o biológicos, notificación que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración a seres humanos. El envase o kit puede estar marcado con información referente al modo de administración, secuencia de administración del fármaco (por ejemplo, separada, secuencial o simultáneamente), o similares. El envase o kit también puede incluir medios para recordar al paciente que tome la terapia. El envase o kit puede ser una única dosificación unitaria de la terapia de combinación o puede ser una pluralidad de dosificaciones unitarias. En particular, los agentes pueden estar separados, mezclados juntos en cualquier combinación, presentes en un único vial o comprimido. Se prefieren agentes montados en un envase blíster u otro medio de dispensación. Para el fin de esta invención, dosificación unitaria pretende significar una dosificación que depende de la farmacodinamia individual de cada agente y que se administra en dosificaciones aprobadas por la FDA en ciclos temporales convencionales.

Reactivos de diagnóstico

La invención también proporciona una base para un envase o kit de reactivo de diagnóstico que comprende uno o más recipientes cargados con uno o más de los componentes usados en los ensayos descritos en el presente documento. Asociada opcionalmente con tal(es) recipiente(s) puede estar una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de los productos de diagnóstico, notificación que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración a seres humanos. El envase o kit puede estar marcado con información referente al modo de administración, secuencia de ejecución (por ejemplo, separada, secuencial o simultáneamente), o similares. El envase o kit puede ser un único ensayo unitario o puede ser una pluralidad de ensayos unitarios. En particular, los agentes pueden estar separados, mezclados juntos en cualquier combinación, presentes en un único vial o comprimido. Para el fin de esta invención, ensayos unitarios pretenden significar materiales suficientes para realizar sólo un único ensayo.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos de diagnóstico y métodos terapéuticos no limitantes. Todos los porcentajes son en peso a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplos

Ejemplo I

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el gen de momp de longitud completa de C pneumoniae y otras especies de Chlamydia (diagnóstico) a. PCR en disolución

Se preincubaron muestras tisulares, en sangre y en suero en presencia de ditiotreitol 10 \muM a temperatura ambiente durante 2 horas para reducir los enlaces disulfuro y facilitar la liberación de la envuelta exterior de los cuerpos elementales. El LCR y otros líquidos corporales también son adecuados para utilizarlos tal como se describe. Otros agentes reductores adecuados para su uso en esta etapa incluyen, pero no se limitan a, succímero y glutatión (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, ésteres de glutatión, otros análogos y derivados). La no inclusión de un agente reductor puede dar como resultado inicialmente una señal de PCR negativa tras la etapa de digestión con proteasa. Las concentraciones apropiadas de estos agentes reductores pueden determinarse fácilmente por el experto en la técnica sin experimentación excesiva usando la concentración de 10 \muM de ditiotreitol como directriz. Alternativamente, el isotiocianato de guanidina puede sustituirse por la etapa de proteasa/reducción de disulfuro. La tabla 8 muestra el efecto de diversos agentes reductores sobre la sensibilidad de los CE a la digestión con proteinasa K con el fin de permitir la extracción del ADN para la amplificación por PCR.

TABLA 8

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13

Las muestras tisulares, en sangre o en suero se lisaron durante la noche 37ºC en presencia de SDS que inhibe las ADNasas y la proteinasa K que digiere la proteína (es decir, 2 x tampón de lisis celular: SDS al 1%, NaCl 0,2 M, EDTA 10 mM, Tris-KCl 20 mM, pH 7,5 más proteinasa K hasta una concentración final de 20 mg/ml). Tras la digestión, el lisado se extrajo x 1 con fenol, seguido por extracción con cloroformo x 2. El ADN se precipita a partir de la fase acuosa final mediante la adición de 1/10 volúmenes de acetato de Na (3 M) y 2 - 2,5 volúmenes de etanol frío. El ADN se sedimenta mediante centrifugación y el ADN se resuspende en 10-20 \mul de agua realizándose la amplificación por PCR en el mismo microtubo. El gen completo de MOMP (1,2 kb) se amplifica usando el cebador de la cadena codificante CHLMOMPDB2 (5'- ATGAAAAAAC TCTTAAAGTC GGCGTTATTA TCCGCCGC; SEQ ID NO. 41) y el cebador de la cadena complementaria CHLMOMPCB2 (5'- TTAGAATCTG AACTGACCAG ATACGTGAGC AGCTCTCTCG; SEQ ID NO. 42). Alternativamente, pueden utilizarse cebadores acortados realizando modificaciones adecuadas en el cebador: temperatura de hibridación del ADN para la detección por PCR únicamente. Sin embargo, la selección del cebador apropiado puede dar como resultado la ausencia de señal si está presente una cepa desconocida con mutaciones en una o ambas regiones de unión al cebador. La frecuencia de señales positivas usando los cebadores preferidos que amplifican el gen de MOMP de longitud completa sugiere que las mutaciones en estas regiones de C. pneumoniae son poco frecuentes. Las condiciones normales para este producto génico en un volumen de 50 \mul son de 35 ciclos con tiempos de aumento de 1 segundo entre las etapas de 94ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 2 minutos y 74ºC durante 3 minutos. La reacción de PCR utilizó 0,1 mM de cada cebador en tampón Deep Vent con 200 mM de cada dNTP, y 1,0 U de ADN polimerasa Deep Vent. El ADN amplificado se separa y se identifica mediante electroforesis en genes de poliacrilamida al 6% o agarosa al 1,2% que se corren en el tampón TBE (Tris-borato 88 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM) a 120 voltios durante 1 hora. Las bandas de ADN se identifican mediante tinción con bromuro de etidio y detección con luz UV. La especificidad del producto se ha verificado mediante el análisis con enzimas de restricción de los productos de escisión, así como análisis de la secuencia de ADN. Los controles negativos consisten en la amplificación de los extractos de tampón de lisis. Debe tenerse un cuidado extremado para seleccionar todos los componentes de la lisis celular y los componentes del tampón de amplificación para excluir el ADN de MOMP contaminante que son los contaminantes comunes en tales productos químicos de calidad para biología molecular y laboratorio.

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b. PCR in situ

Este procedimiento identifica las células individuales que contienen CR y formas crípticas de C. pneumoniae. Las células cultivadas se adhieren a portaobjetos de vidrio con formalina, o secciones tisulares fijadas con formalina incluidas en parafina se adhieren a portaobjetos de vidrio y se someten a digestión con proteasa (es decir, pepsina, tripsina, quimotripsina u otras proteasas específicas). Para cada tipo de tejido para los tiempos de digestión óptimos debe evaluarse cada pH y tiempo de digestión (es decir, pepsina a pH 2,5 o tripsina a pH 7-8, etc.) con una concentración patrón de cada proteasa. La actividad proteasa se detiene mediante lavado y/o cambio de pH y las células diana expuestas a Taq polimerasa, dNTP y cebadores. Para el gen de MOMP, se han obtenido por ingeniería genética los cebadores CHLMOMPDB2 y CHLMOMPCB2 con una biotina en extremo 5'-terminal. Para la PCR in situ, que utiliza marcadores de biotina incorporados en el extremo 5'-terminal de los cebadores de amplificación, cada amplificación de la cadena de ADN da como resultado cada ADN bicatenario que contiene 2 moléculas de biotina. Las condiciones normales de amplificación son idénticas a las de la PCR en disolución descrita anteriormente. Tras el final del ciclo de PCR, los portaobjetos se lavan y se exponen a estreptavidina-\beta-galactosidasa (u otra enzima señal conjugada con estreptavidina). La visualización del gen de MOMP amplificado se lleva a cabo mediante la hidrólisis de la enzima unida del sustrato soluble, lo que da un producto insoluble que puede visualizarse entonces mediante microscopía óptica convencional.

Alternativamente, pueden usarse otras secuencias de ADN específicas, incluyendo subsecciones del gen de MOMP completo (por ejemplo, subsecciones que incluyen secuencias de genes para los péptidos en la figura 4), aunque la secuencia descrita anteriormente es la realización preferida, puesto que el gran producto producido (1,2 kb) evita la difusión que puede encontrarse con las amplificaciones de ADN más pequeñas. De manera similar, pueden incorporarse otros marcadores de detección (es decir, fluoresceína, por ejemplo) en el extremo 5' o pueden incorporarse dixoxigenina y UTP dentro del ADN amplificado. Alternativamente al marcaje del producto, pueden usarse sondas de hibridación específicas para regiones constantes del ADN amplificado para identificar un producto amplificado. Este último método tiene utilidad particular para la construcción de un equipo de laboratorio automatizado para la PCR basada en disolución. Por ejemplo, pueden usarse placas de ELISA recubiertas con estreptavidina para capturar una o ambas cadenas de un ADN marcado en 5' con biotina con detección mediante fluorescencia de un agente fluorescente u otra sonda de detección de fluoróforo incorporado.

Ejemplo 2

Ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (elisa; diagnóstico) a. ELISA a base de MOMP recombinante

El gen MOMP de longitud completa de C. pneumoniae se clonó direccionalmente en el plásmido de expresión pET en los sitios de restricción NCOI y NOTI usando cebadores para introducir estos sitios de restricción únicos en los extremos de MOMP. Las secuencias del cebador son las siguientes:

CPOMPDNCO (Cadena codificante): 5'- AGCTTACCAT GGCTAAAAA CTCTTAAAGT CGGCGTTATT
ATCCG- 3' (SEQ ID NO. 43)

CPOMP_CNOT (cadena complementaria): 5'- ATATGCGGCC GCTCATAGAA TCTGAACTGA CCAGATACG- 3' (SEQ ID NO. 43)

La construcción del inserto de MOMP en el vector de expresión pET (Novagen, Inc.) da, en la transformación de E. coli permisiva, un dominio de fusión a tiorredoxina en el extremo amino terminal, una polihistidina para la cromatografía de afinidad a Ni^{+}, una secuencia de solubilidad de aproximadamente 5 kD y un sitio de escisión de endopeptidasa que da una MOMP de longitud completa con un extremo amino terminal modificado (tal como se ilustra en la figura 2) que contiene un inserto de alanina entre la metionina amino terminal y la lisina adyacente. Cualquiera de la proteína de fusión recombinante expresada de longitud completa o la MOMP modificada tras la escisión por endopeptidasa puede utilizarse como el antígeno para un ELISA de la especie Chlamydia. Pueden utilizarse otros sistemas de expresión en E. coli o Baculovirus para la síntesis de la proteína MOMP como el antígeno en ELISA. El procedimiento se lleva a cabo mediante la unión no covalente de 50 ng de MOMP recombinante en cada pocillo (filas 1-11) de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Immulon 4) en tampón carbonato a pH 9,5 con una incubación durante la noche a 4ºC. La placa se lava con PBS, Tween20 al 0,15% x 3 y entonces se bloquea con PBS, BSA al 1%, Tween20 a 300 ml por pocillo durante 1 hora a TA y después se lavó x 3 con PBS, Tween20 al 0,15%. El suero se diluye seriadamente en PBS por triplicado en una placa separada y se transfieren 50 \mul de cada pocillo a pocillos correspondientes de una placa de ligando de MOMP, y se sigue la secuencia siguiente: incubar a 37ºC durante 1 hora utilizando un Parafilm u otra cubierta adecuada para evitar la evaporación no uniforme. Lavar con PBS, FCS al 1%, NaN_{3} al 0,05% x 5. Incubar cada pocillo con una dilución predeterminada de anticuerpos anti-IgM monoclonal o IgG monoclonal humanas conjugados con biotina. Incubar a 37ºC durante 1 hora con la cubierta. Lavar (x 3) con PBS, FCS al 1%, NaN_{3} al 0,05%. Seguir con 50 \mul de conjugado de estreptavidina - fosfatasa alcalina (1:200 en PBS, BSA al 1%, Tween20 al 0,15%) durante 1 hora a 37ºC con la cubierta. Lavar x 3 con PBS, CS al 1% (suero bovino), NaN_{3} al 0,05%. Se desarrolla color con fosfato de p-nitrofenilo en tampón glicina a pH 9,6. El rendimiento de color se mide en un colorímetro de microtitulación utilizando un filtro a 405 nm. El título del criterio de valoración es la dilución más alta de suero o secreción que da un rendimiento de color > 3 DE con respecto al fondo (n = 8). El análisis se simplifica por un título de anticuerpos de criterio de valoración generado por ordenador u otra identificación de la medida del nivel de anticuerpos y/o cantidad de anticuerpo específico (IgG, IgM o Ig total) en la muestra de prueba utilizando los controles apropiados. Pueden sustituirse otros conjugados enzimáticos de estreptavidina o avidina, tal como estreptavidina-peroxidasa o estreptavidina-galactosidasa con un sustituto aproximado que da un color detectable para la cuantificación.

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b. ELISA basado en péptidos

El ELISA basado en MOMP recombinante descrito anteriormente proporciona un método sensible para la cuantificación de las inmunoglobulinas contra el género Chlamydia en suero, plasma, LCR y otros líquidos corporales. Con el fin de proporcionar ensayos de ELISA que son específicos de especie y potencialmente específicos de la cepa para la diversas Chlamydia, se han identificado dos regiones en MOMP que muestran homologías mínimas en la secuencia de aminoácidos y que se prevé mediante análisis por ordenador (Intelligenetics) que serán dominios antigénicos excelentes en virtud de la hidrofilicidad y la movilidad sobre la superficie accesible al disolvente de MOMP. La figura 3 ilustra el dominio constante y variable (DV) de las diversas especies de clamidias. Los dominios antigénicos específicos de las especies identificadas se sitúan en DV1 y DV2. La figura 4 ilustra las secuencias de aminoácidos del péptido empleadas para la construcción de ELISA basados en péptidos con especificidad de especie para DV 1. La figura 5 ilustra los péptidos para DV2 que se utilizan de manera similar a las secuencias DV1. La metodología de ELISA es paralela a la que se describió anteriormente para el ELISA basado en MOMP recombinante. Además, se ha identificado un dominio sumamente antigénico (figura 6) común para todas las clamidias y se ha desarrollado como un ELISA específico de género alternativo para Chlamydia. La inmunización de conejos ha verificado la antigenicidad de cada péptido para cada péptido (tabla 9). Los anticuerpos monoclonales han verificado además las especificidades y la antigenicidad de cada péptido (tabla 8) tal como se predice mediante el análisis por ordenador de la secuencia de aminoácidos generada por nucleótidos de cada MOMP específico de especie.

TABLA 9

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La tabla 10 ilustra los títulos recíprocos de un anticuerpo policlonal y uno monoclonal frente a C. trachomatis con reacción cruzada frente al péptido de C. pneumoniae que engloba los aminoácidos 342-354 y una MOMP recombinante de longitud completa de C. pneumoniae.

TABLA 10

16

Ejemplo 3

Métodos de ensayo de detección (diagnóstico) a. Ensayo de inmunoglobulina (Ig)

Se hicieron crecer los CE de C. pneumoniae en células endoteliales de vena umbilical humanas primarias (HuEVEC; pase inicial), HeLa 199, o una alternativa adecuada en presencia de cicloheximida 1 \mug/ml a 35ºC bajo CO_{2} al 5%. Las células permisivas se lisaron mediante sonicación a los 3 días, liberando de esta manera los CE. Estos últimos se recogieron de matraces de infección, se sonicaron y se eliminaron los desechos celulares tras la sonicación mediante una centrifugación a velocidad lenta (\sim600 x g) durante 5 minutos. Los CE se sedimentaron mediante centrifugación a velocidad rápida (30.000 x g) durante 30 minutos a 4ºC. El sedimento de CE se lavó con PBS x1 y se reconstituyó en 2 ml de PBS por cuatro matraces de cultivo de 25 cm^{2} y se sonicó a una potencia máxima durante 20 segundos y un tiempo de 0,5 ciclos usando un baño de ultrasonidos Braun-Sonic U. Se determinó la concentración de proteínas de CE mediante el método de Bradford y se convirtió la suspensión de CE infecciosa sonicada en no infecciosa mediante la adición de formaldehído al 37% hasta una concentración final de formaldehído del 10% con agitación constante durante la adición. Los CE tratados con formalina se añadieron a placas de 96 pocillos a 50 \mul por pocillo que contenían 50 ng de CE (total de 5 \mug/placa) y se secaron al aire. La placa se lavó con PBS - Tween20 al 0,15% x3 y se bloquearon entonces con PBS - BSA al 1%, Tween20 al 0,15% a 300 \mul por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron x3 con PBS - Tween20 al 1,15%. Se diluyó seriadamente el suero en PBS por duplicado en una placa separada y se transfirieron 50 \mul de cada pocillo a pocillos correspondientes de una placa de ligando de MOMP y se siguió la secuencia siguiente: incubar a 37ºC durante 1 hora usando una cubierta de Parafilm; lavar con PBS - FCS al 1%, NaN_{3} al 0,05% x5; incubar cada pocillo con una dilución predeterminada de anticuerpos anti-IgM monoclonal o IgG monoclonal humanas conjugados con biotina; incubar a 37ºC durante 1 hora con la cubierta; lavar (x3) con PBS, FCS al 1%, NaN_{3} al 0,05%; seguido por 50 \mul de conjugado de estreptavidina - fosfatasa alcalina (1:200 en PBS - BSA al 1%, Tween20 al 0,15%) durante 1 hora a 37ºC con la cubierta; y lavar x3 con PBS, CS al 1%, NaN_{3} al 0,05%. Se desarrolló color con fosfato de p-nitrofenilo en tampón glicina a pH 9,6. Se midió el rendimiento de color en un colorímetro de microtitulación de flujo usando un filtro a 405 nm. El título del criterio de valoración fue la dilución más alta de suero o secreción que daba un rendimiento de color > 3 DE con respecto al fondo
(n = 8).

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b. Inmunotransferencia de tipo Western

Se prepararon inmunotransferencias de tipo Western mediante SDS-PAGE de CE de C. pneumoniae (no fijados con formalina) recogidos de lisados de células HuEVEC o HeLa infectadas, se sometieron a electroforesis en condiciones de SDS-PAGE convencionales y se transfirieron a nitrocelulosa lograda con una transferencia de difusión activa. Se prepararon bandas bloqueadas con albúmina a partir de las láminas de nitrocelulosa y se incubaron durante 1 hora con 1,2 ml de una dilución 1:40 del suero de prueba. Se logró la detección con anticuerpo de ratón anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina, y se desarrolló con p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3'-indolilfosfato/cloruro de azul de nitrotetrazolio (BCIP/NBT, Pierce Chemical Company). Alternativamente, pueden usarse anticuerpos de animales anti-humanos.

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c. Ensayo de captura de antígenos para MOMP de clamidias

Se conjugaron los péptidos descritos en las figuras 3-5 mediante enlaces disulfuro con hemocianina de lapa californiana (KLH) mediante métodos convencionales (Bernatowicz et al., Anal. Biochem. 155 (1): 95-102 (1986)). Se utilizaron los conjugados peptídicos en alumbre para generar anticuerpos policlonales y/o monoclonales frente a dominios específicos de especie de MOMP que se usan como un anticuerpo de captura en placas de microtitulación de 96 pocillos. La configuración final puede seguir varias vías alternativas para dar la cuantificación de MOMP en los líquidos corporales. La configuración favorecida utiliza MOMP recombinante marcada con biotina en un ensayo de competencia con desarrollo de color generado por estreptavidina/fosfatasa alcalina basado en la cantidad de MOMP recombinante biotinilada desplazada por MOMP no marcada en los líquidos corporales.

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Ejemplo 4

Pruebas de sensibilidad a agentes antimicrobianos in vitro para C. pneumoniae

Se siembran en placa células de cultivo tisular que contienen C. pneumoniae en fase críptica (H- 292, HeLa, HEL, HuEVEC, McCoy, etc.) en subconfluencia en una placa de microtitulación de 96 pocillos (alternativamente pueden usarse matraces o placas u otras configuraciones) y se cultivan en presencia de diversos antibióticos (individualmente y en combinación) cambiándose el medio diariamente. Se lleva a cabo el análisis de la actividad letal para clamidias mediante la evaluación de la pérdida de señal de PCR en disolución, o puede cuantificarse la actividad relativa mediante el título en dilución del material de partida usando la ausencia de señal de PCR como el título del criterio de valoración (es decir, última dilución que da una señal de PCR específica).

La exposición de dos semanas de agentes individuales incluyendo la fluoroquinolona, ofloxacino, y el macrólido, claritromicina, a 1 \mug/ml, no eliminó una señal de PCR detectable para el gen de MOMP de Chlamydia pneumoniae en las células HeLa en cultivo. Por el contrario, agentes triples que consistían en isoniazida (INH), metronidazol y penicilamina (1 \mug/ml cada uno) dieron como resultado una señal de PCR no detectable (tabla 11). En la actualidad no se reconoce que ninguno de estos agentes, eficaces en la combinación triple, sea un agente anti-
clamidias.

La tabla 12 proporciona los resultados de un estudio ampliado de sensibilidades a agentes antimicrobianos a dos concentraciones diferentes de agentes antimicrobianos, usados solos y en combinación, cuando se exponen a los agentes antimicrobianos durante dos semanas. Además de los agentes ya mencionados, minociclina, doxiciclina, rifampina y sulfametoxazol/trimetoprim, a todas las concentraciones sometidas a prueba, no eliminaron la señal de PCR para MOMP de clamidias. Sólo la combinación triple de isoniazida, metronidazol y penicilamina eliminó la señal de PCR en dos semanas. La combinación triple fue eficaz tanto a concentraciones bajas como altas. La tabla 12 también demuestra el efecto de una exposición de 4 semanas con la misma serie ampliada de agentes antimicrobianos solos y en combinación. Varias combinaciones triples de agentes antimicrobianos dieron como resultado cultivos celulares en los que la señal de PCR para el gen de MOMP de clamidias no pudo detectarse en cuatro semanas. Las combinaciones más eficaces para tener el mayor impacto sobre las fases del ciclo vital importantes son las que se prevén según la metodología descrita en la sección anterior titulada "Metodología para seleccionar posibles combinaciones de agentes".

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TABLA 11

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17

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Ejemplo 5

Respuesta a terapia con antibióticos

La tabla 13(a) ilustra las respuestas típicas a una terapia con antibióticos de combinación en una variedad de pacientes con prueba mediante diagnóstico de una infección activa por C. pneumoniae. Al contrario que las típicas respuestas inmunitarias frente a la infección con agentes infecciosos, la mayoría de los pacientes incluidos tienen no sólo títulos de IgM detectables frente al género de clamidias sino, en muchos casos, títulos de IgM muy altos. Con terapia específica a lo largo del tiempo, los títulos de IgM generalmente disminuyen, con un aumento en el título de IgG (tal como se esperaba). Los métodos actuales de detección de anticuerpos frente a C. pneumoniae (inmunofluorescencia indirecta, MIF) no pueden identificar de manera precisa títulos de IgM altos frente a C. pneumoniae. Es más, los procedimientos actuales son específicos del género y no específicos de la especie tal como los ensayos ELISA basados en péptido. Con la eliminación del patógeno, los títulos de IgG disminuyen. De manera concomitante con la terapia con antibióticos de combinación, generalmente existe una mejora de los síntomas del paciente asociados con el diagnóstico específico indicativo de prueba de una infección activa por clamidias.

La tabla 13(b) describe el ciclo de tratamiento para varios individuos tratados con una combinación de agentes y sus desenlaces clínicos.

La tabla 13(c) describe las historias clínicas detalladas de los pacientes que se someten a terapia de combinación, tal como se notifica en la tabla 13(b).

La tabla 13(d) proporciona un listado de fármacos y dosificaciones convencionales para los usados en el presente documento.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 13a Respuestas serológicas y de PCR frente a la terapia con antibióticos de combinación

21

22

23

24

25

26

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28

TABLA 13c Historias clínicas detalladas

29

30

31

32

33

34

TABLA 13d Fármacos y dosificaciones convencionales

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Ejemplo 6

Ejemplo de eliminación en ratones

Se sometió a prueba un conjunto de ratones para determinar la infección con C. pneumoniae. De los 10 ratones sometidos a prueba, 8 (el 80%) fueron positivos mediante PCR para C. pneumoniae. Luego se sometió a los ratones a una terapia de tres antibióticos: amoxicilina, metronidazol e INH a 50 \mug/ml cada uno en su agua. Basándose en su consumo de agua de 6,8 a 7 ml al día, los ratones estaban recibiendo de manera efectiva aproximadamente 350 \mug de cada fármaco cada día.

Se sometió a prueba a los ratones de nuevo, mediante PCR, en la primera generación de crías una vez que eran suficientemente mayores. Las pruebas todavía eran positivas mediante PCR. Entonces se mantuvo la colonia de ratones con la terapia de combinación en agua durante varios meses. Aproximadamente siete meses después del comienzo de este estudio, se añadió también probenecid al agua. Aproximadamente de 2 a 3 semanas tras añadirse el probenecid, se sometió a prueba la entonces tercera o cuarta generación de ratones. Los 22 ratones sometidos a prueba fueron entonces negativos mediante PCR.

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Ejemplo 7

Determinación de porfiria secundaria

Se evaluaron pacientes con infecciones sistémicas producidas por C. pneumoniae para determinar la porfiria secundaria. Se determinó la presencia de enzimas (es decir, \Delta-ALA sintasa y PBG desaminasa) para la biosíntesis de hemo usando métodos conocidos. Se midieron porfirinas en orina y en heces elevadas a las 24 horas. Los resultados se recogen en la tabla 14.

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Ejemplo 8

Presencia de autoanticuerpos frente a estructuras de anillo de porfirina

Se sometieron a prueba pacientes con infecciones sistémicas provocadas por C. pneumoniae para determinar la presencia de anticuerpos frente a estructuras de anillo de porfirina (es decir, vitamina B 12, coproporfirinógeno-III, protoporfirina, porfobilinógeno y \Delta-ALA). Se determinaron los títulos de anticuerpos IgM e IgG usando un ensayo ELISA, para el cual se describe el protocolo a continuación.

Protocolo de ensayo ELISA

1. Preparación de placas: se usa coproporfirina III como ejemplo, pero el procedimiento también se realiza recubriendo placas con una de las siguientes otras estructuras de anillo con la misma concentración: vitamina B12, protoporfirina IX, porfobilinógeno y ácido \Delta-aminolevulínico. Se añaden 50 ng de coproporfirina III en 50 \mul de tampón de recubrimiento de carbonato a cada pocillo en las columnas 1-1 de una placa de microtitulación de 96 pocillos Immulon 4. Se cubre con una película de plástico y se incuba durante la noche a 4ºC.

2. Etapa de bloqueo: se lavan las placas tres veces con tampón de lavado Tween 20. (Tris 0,1 M; Tween 20 al 0,15%; NaN_{3} al 0,05%). Se bloquean las placas añadiendo 200 \mul de tampón de bloqueo Tris (Tris 0,1 M; albúmina sérica bovina al 1%; Tween 20 al 0,15%) a cada pocillo de las columnas 1-11. Se dejan los pocillos en la columna 12 secos. Se envuelven las placas con película de plástico y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.

3. Preparación de la muestra: mientras las placas están bloqueadas se preparan muestras y controles. Se diluyen sueros de pacientes 1: 10 en pocillo de bloqueo y de vórtice.

4. Preparación de la placa: se lavan las placas con tampón de lavado Tween 20 tres veces y se añaden 50 \mul de bloqueo en cada pocillo en cada fila excepto en la fila A y en cada columna excepto la columna 12. Se dejan la fila A y la columna 12 vacías.

5. Configuración de placas: se colocan 100 \mul de diluciones de pacientes por duplicado en la fila A. Se preparan placas por duplicado y se etiqueta una placa para la detección IgG y una para la de IgM. Se usa el aparato Cetus Propet para diluir en serie dos veces (de 1:10 a 1:1280) las muestras en las columnas 1-10. Se usa la siguiente configuración de carga para las muestras de pacientes y los controles:

Muestra 1 - columnas 1 y 2

Muestra 2 - columnas 3 y 4

Muestra 3 - columnas 5 y 6

Muestra 4 - columnas 7 y 8

Control positivo alto - columna 9

Control positivo bajo o negativo - columna 10

Sólo bloqueo - columna 11

Columna 12 seca - blanco con aire

Se envuelven con película de plástico y se incuban a 37ºC durante 1 hora.

6. Anticuerpos de detección: se preparan cinco minutos antes de que la incubación esté lista diluciones 1:2000 separadas en tampón de bloqueo Tris de anticuerpo monoclonal de ratón marcado con biotina anti-IgG e IgM humanas. Se lavan las placas en lavado de FCS (Tris 0,1 M; NaN_{3} al 0,05%; Tween 20 al 0,15%; FCS al 1%) cuatro veces y se colocan 50 \mul de la dilución de anticuerpo anti-IgG humana en cada pocillo de las columnas 1-11 de las placas marcadas como IgG. Se repite usando anticuerpo anti-IgM humana en placas marcadas como IgM. Se envuelve con película de plástico y se incuba durante una hora a 37ºC.

7. Ligando: se prepara cinco minutos antes de que la incubación esté lista una dilución 1:1000 de estreptavidina-fosfatasa alcalina conjugada en tampón de bloqueo Tris. Se lavan las placas con lavado de FCS cuatro veces y se colocan 50 \mul de la dilución de estreptavidina en cada pocillo de las columnas 1-11. Se envuelve con una película de plástico y se incuba una hora a 37ºC.

8. Se prepara p-nitrofenilfosfato (PNPP) 30 minutos antes de que la incubación se complete disolviendo comprimidos de PNPP de Inmunopure en tampón de sustrato de dietanolamina. Se prepara un comprimido en cinco ml 1 x tampón de sustrato de DEA para cada placa.

9. Cuando la incubación se completa, se lavan las placas en lavado de FCS cuatro veces y se añaden 50 \mul de PNPP a cada pocillo de las columnas 1-11. Se envuelve con película de plástico y se deja desarrollar el color incubando una hora a temperatura ambiente. Lo mejor es proteger de la luz durante el periodo de incubación. Al final del periodo de incubación se detiene el desarrollo del color añadiendo 50 \mul de NaOH 3 N a cada pocillo de las columnas 1-11.

10. Se leen las placas a una longitud de onda de 404 nM usando un lector de placas Titertek.

Los resultados se notifican a continuación en la tabla 15.

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39

Claims

```
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```
1. Composición farmacéutica que comprende al menos dos agentes, cada uno de los cuales es eficaz frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias, en la que uno de los agentes es una rifamicina y en la que los agentes se seleccionan del grupo que consiste en:

a)

agentes eficaces frente a la fase críptica del ciclo vital de las clamidias;

b)

agentes eficaces frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias; y

c)

agentes eficaces frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que uno de los agentes se selecciona del grupo que consiste en antibióticos de macrólido y antibióticos de azálido.
3. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente eficaz frente a la fase de cuerpo elemental es un agente reductor de disulfuro.
4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicho agente reductor de disulfuro se selecciona del grupo que consiste en ácido 2,3-dimercaptosuccínico, penicilamina, \beta-lactamas, ditiotreitol, mercaptoetilamina, y N-acetilcisteína.
5. Composición según la reivindicación 4, en la que dicho agente reductor de disulfuro es penicilamina.
6. Composición según la reivindicación 4, en la que la \beta-lactama es amoxicilina.
7. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente eficaz frente a la fase críptica es un compuesto nitroaromático.
8. Composición según la reivindicación 7, en la que el compuesto nitroaromático se selecciona del grupo que consiste en nitroimidazoles, nitrofuranos, análogos, derivados y combinaciones de los mismos.
9. Uso de una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por clamidias.
10. Método ex vivo para eliminar clamidias de material biológico, que comprende la etapa de poner en contacto el material biológico con al menos dos agentes, cada uno de los cuales es eficaz frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias, en el que uno de los agentes es una rifamicina hasta que el material biológico es negativo para clamidias según una prueba que detecta clamidias en fase de cuerpo elemental, clamidias en fase de replicación y clamidias en fase críptica.
11. Método ex vivo según la reivindicación 10, en el que los agentes se seleccionan del grupo que consiste en:

a)

agentes eficaces frente a la fase críptica del ciclo vital de las clamidias;

b)

agentes eficaces frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias; y

c)

agentes eficaces frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias.
12. Método ex vivo según la reivindicación 11, en el que el agente eficaz frente a la fase de cuerpo elemental es un agente reductor de disulfuro.
13. Método ex vivo según la reivindicación 12, en el que dicho agente reductor de disulfuro se selecciona del grupo que consiste en ácido 2,3-dimercaptosuccínico, penicilamina, \beta-lactamas, ditiotreitol, mercaptoetilamina y N-acetilcisteína.
14. Método ex vivo según la reivindicación 13, en el que dicho agente reductor de disulfuro es penicilamina.
15. Método ex vivo según la reivindicación 13, en el que la \beta-lactama es amoxicilina.
16. Método ex vivo según la reivindicación 10, en el que el agente eficaz frente a la fase críptica es un compuesto nitroaromático.
17. Método ex vivo según la reivindicación 16, en el que el compuesto nitroaromático se selecciona del grupo que consiste en nitroimidazoles, nitrofuranos, análogos, derivados y combinaciones de los mismos.
18. Método ex vivo según la reivindicación 10, en el que uno de los agentes se selecciona del grupo que consiste en antibióticos de macrólido y antibióticos de azálido.
19. Método ex vivo según la reivindicación 10, en el que la prueba que detecta clamidias en fase de cuerpo elemental, clamidias en fase de replicación y clamidias en fase críptica comprende una etapa de amplificación de ácido nucleico.
20. Método ex vivo según la reivindicación 19, en el que dicha prueba comprende las etapas de:

a)

proporcionar una muestra de dicho material biológico en contacto con dichos agentes;

b)

poner en contacto dicha muestra con un agente reductor de disulfuro;

c)

poner en contacto dicha muestra en contacto con dicho agente reductor de disulfuro con una proteasa;

d)

extraer ADN de dicha muestra en contacto con proteasa;

e)

amplificar a partir de dicho ADN extraído un gen de clamidias o parte del mismo, si está presente, mediante reacción en cadena de la polimerasa; y

f)

determinar la presencia o ausencia de dicho gen de clamidias amplificado o parte del mismo.
21. Uso de al menos dos agentes, cada uno de los cuales es eficaz frente a una fase diferente del ciclo vital de las clamidias, en el que uno de los agentes es una rifamicina en la fabricación de un medicamento o medicamentos para la administración conjunta para la eliminación de clamidias del material biológico de clamidias hasta que el material biológico es negativo para clamidias según una prueba que detecta clamidias en fase de cuerpo elemental, clamidias en fase de replicación y clamidias en fase críptica.
22. Uso según la reivindicación 21, en el que los agentes se seleccionan del grupo que consiste en:

a)

agentes eficaces frente a la fase críptica del ciclo vital de las clamidias;

b)

agentes eficaces frente a la fase de cuerpo elemental del ciclo vital de las clamidias; y

c)

agentes eficaces frente a la fase de replicación del ciclo vital de las clamidias.
23. Uso según la reivindicación 22, en el que el agente eficaz frente a la fase de cuerpo elemental es un agente reductor de disulfuro.
24. Uso según la reivindicación 23, en el que dicho agente reductor de disulfuro se selecciona del grupo que consiste en ácido 2,3-dimercaptosuccínico, penicilamina, \beta-lactamas, ditiotreitol, mercaptoetilamina y N-acetilcisteína.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que dicho agente reductor de disulfuro es penicilamina.
26. Uso según la reivindicación 24, en el que la \beta-lactama es amoxicilina.
27. Uso según la reivindicación 21, en el que agente eficaz frente a la fase críptica es un compuesto nitroaromático.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que el compuesto nitroaromático se selecciona del grupo que consiste en nitroimidazoles, nitrofuranos, análogos, derivados y combinaciones de los mismos.
29. Uso según la reivindicación 21, en el que uno de los agentes se selecciona del grupo que consiste en antibióticos de macrólido y antibióticos azálido.
30. Uso según la reivindicación 21, en el que la prueba que detecta clamidias en fase de cuerpo elemental, clamidias en fase de replicación y clamidias en fase críptica comprende una etapa de amplificación de ácido nucleico.
31. Uso según la reivindicación 30, en el que dicha prueba comprende las etapas de:

a)

proporcionar una muestra de dicho material biológico en contacto con dichos agentes;

b)

poner en contacto dicha muestra con un agente reductor de disulfuro;

c)

poner en contacto dicha muestra en contacto con agente reductor de disulfuro con una proteasa;

d)

extraer ADN de dicha muestra en contacto con proteasa;

e)

amplificar a partir de dicho ADN extraído un gen de clamidias o parte del mismo, si está presente, mediante reacción en cadena de la polimerasa; y

f)

determinar la presencia o ausencia de dicho gen de clamidias amplificado o parte del mismo.