ES2293923T3 - Vacuna intranasal contra el virus influenza. - Google Patents
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Abstract
El uso de una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado muerto en la fabricación de una formulación de vacuna para una vacunación intranasal de una dosis contra la gripe, en el que la vacunación de una dosis logra al menos dos de los siguientes criterios para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna: (i) una tasa de seroconversión superior o igual al 40% para una población adulta humana (18-60 años) o al 30% en una población anciana humana (> 60 años); (ii) una tasa de seroprotección superior o igual al 70% para una población adulta humana (18-60 años) o al 60% en una población anciana humana (> 60 años); y (iii) un factor de conversión superior o igual a 2, 5 para una población adulta humana (18-60 años) o a 2, 0 en una población anciana humana (> 60 años).
Description
Vacuna intranasal contra el virus influenza.
Esta invención se refiere a formulaciones
novedosas de vacuna contra el virus influenza fragmentado muerto,
procedimientos para prepararlas y su uso en la profilaxis o
tratamiento. En particular, la invención se refiere a vacunas para
la administración a la mucosa, más particularmente para la
administración nasal. Más particularmente, la invención se refiere
al uso de vacunas contra la gripe fragmentadas muertas que pueden
administrarse por vía intranasal en una única dosis para lograr una
respuesta inmunitaria suficiente para cumplir con los requisitos
normativos.
El virus influenza es uno de los virus más
ubicuos presentes en el mundo, que afecta tanto a seres humanos
como al ganado. El impacto económico de la gripe es
significativo.
El virus influenza es un virus con envuelta de
ARN con un tamaño de partícula de aproximadamente 125 nm de
diámetro. Está constituido básicamente por un núcleo o nucleocápside
interna de ácido ribonucleico (ARN) asociado con nucleoproteína,
rodeado por una envuelta viral con una estructura de bicapa lipídica
y glucoproteínas externas. La capa interna de la envuelta viral
está compuesta predominantemente por proteínas de la matriz y la
capa externa mayoritariamente por el material lipídico derivado del
huésped. Las glucoproteínas de superficie neuraminidasa (NA) y
hemaglutinina (HA) aparecen como espículas, de 10 a 12 nm de
longitud, en la superficie de las partículas. Son estas proteínas
de superficie, particularmente la hemaglutinina, las que determinan
la especificidad antigénica de los subtipos de la gripe.
Las epidemias de gripe típicas provocan aumentos
en la incidencia de neumonía y enfermedad de las vías respiratorias
bajas tal como se atestigua mediante un aumento de las tasas de
hospitalización o la mortalidad. Los ancianos o aquellas personas
con enfermedades crónicas subyacentes son los que más posibilidades
tienen de experimentar tales complicaciones, pero los lactantes de
corta edad también pueden padecer enfermedad grave. Por tanto,
estos grupos en particular necesitan protegerse.
Las vacunas contra la gripe disponibles
actualmente son vacunas contra la gripe inactivadas o bien atenuadas
vivas. Las vacunas contra la gripe inactivadas están compuestas por
tres tipos de preparación de antígeno: virus entero inactivado,
sub-viriones en los que partículas de virus
purificadas se rompen con detergentes u otros reactivos para
solubilizar la envuelta lipídica (denominadas vacuna
"fragmentada") o HA y NA purificadas (vacuna de subunidades).
Estas vacunas inactivadas se administran por vía intramuscular
(i.m.).
Las vacunas contra la gripe, de todas las
clases, son habitualmente vacunas trivalentes. Generalmente
contienen antígenos derivados de dos cepas de virus influenza A y
una cepa de virus influenza B. Una dosis inyectable convencional de
0,5 ml contiene en la mayoría de los casos 15 \mug de componente
de antígeno hemaglutinina de cada cepa, según se mide mediante
inmunodifusión radial simple (SRD) (J. M. Wood et al.: An
improved single radial immunodiffusion technique for the assay of
influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency
determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J.
Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et
al., International collaborative study of single radial
diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of
haemagglutinin antigen of virus influenza. J. Biol. Stand. 9 (1981)
317-330).
Las cepas del virus influenza que deben
incorporarse en una vacuna contra la gripe cada temporada se
determinan por la Organización Mundial de la Salud en colaboración
con las autoridades sanitarias nacionales y fabricantes de
vacunas.
Los esfuerzos actuales para controlar la
morbimortalidad asociada con las epidemias anuales de gripe se basan
en el uso de vacunas contra la gripe inactivadas administradas por
vía intramuscular. La eficacia de tales vacunas para prevenir
enfermedades respiratorias y complicaciones producidas por la gripe
oscila entre el 75% en adultos sanos y menos del 50% en los
ancianos.
Los virus influenza, al igual que muchos
patógenos, invaden las superficies mucosas, inicialmente en el
tracto respiratorio superior. La inmunidad mucosa constituye la
primera línea de defensa para el huésped y es un componente
principal de la respuesta inmunitaria en las fosas nasales y en las
vías respiratorias del tracto respiratorio inferior. Aunque las
vacunas contra la gripe inyectables actualmente usadas estimulan IgG
sérica específica de HA en la mayoría de los individuos sanos, sólo
se produce un aumento significativo de anticuerpo IgA nasal
específica de HA en una minoría de los sujetos vacunados. Las
vacunas contra la gripe mejoradas con una mejor inmunogenicidad y
eficacia clínica necesitan dirigirse a respuestas de anticuerpos
tanto locales como sistémicos.
La exposición experimental intranasal de seres
humanos a vacunas contra la gripe inactivadas se remontan a los
años 1940 (véase la revisión en Eyles et al. 2000 BioDrugs 13
(1): 35-59). Aunque hubo un resurgir del interés
sobre el uso de virus inactivados para la inmunización i.n. en los
años 1960 y 70, la mayor parte de la atención en el campo
intranasal se ha dirigido al enfoque atenuado vivo.
Administradas por vía intranasal, las vacunas
contra la gripe atenuadas vivas, por ejemplo vacunas adaptadas al
frío, ofrecen una inmunidad mucosa mejorada, con resultados
prometedores particularmente en los niños. Sin embargo, hasta ahora
este enfoque no ha conseguido una aceptación mundial.
Por tanto, la mayor parte de las vacunas contra
la gripe disponibles comercialmente son vacunas fragmentadas o bien
inyectables de subunidades. Estas vacunas se preparan rompiendo la
partícula viral, generalmente con un disolvente orgánico o un
detergente, y separando o purificando las proteínas virales en
diversos grados. Las vacunas fragmentadas se preparan mediante
fragmentación de virus influenza entero, infeccioso o bien
inactivado, con concentraciones solubilizantes de disolventes
orgánicos o detergentes y posterior eliminación del agente de
solubilización y cierta cantidad o la mayor parte del material
lipídico viral. Las vacunas fragmentadas contienen generalmente
proteína de la matriz y nucleoproteína y algunas veces lípidos
contaminantes, así como proteínas de envuelta de membrana. Las
vacunas fragmentadas contienen habitualmente la mayor parte de, o
todas, las proteínas estructurales virales aunque no necesariamente
en las mismas proporciones en las que se producen en el virus
entero. Por otra parte, las vacunas de subunidades están
constituidas esencialmente por las proteínas de la superficie viral
altamente purificadas, hemaglutinina y neuraminidasa, que son las
proteínas de superficie responsables de provocar los anticuerpos
neutralizantes frente al virus deseados al vacunarse.
Más recientemente, se han combinado vacunas
contra la gripe fragmentadas mejor caracterizadas, más altamente
purificadas, con adyuvantes en un intento por mejorar la
inmunogenicidad en adultos y personas ancianas. A pesar de los
aumentos significativos en las respuestas inmunitarias en ratones,
varios enfoques que usan adyuvantes de nueva generación no han
demostrado que sea posible confirmarlo en el hombre.
Se aplican normas mundialmente para medir la
eficacia de las vacunas contra la gripe. Los criterios oficiales de
la Unión Europea para una vacuna contra la gripe eficaz se exponen
en la tabla siguiente. Teóricamente, para cumplir con los
requisitos de la Unión Europea, una vacuna contra la gripe sólo
tiene que cumplir uno de los criterios en la tabla, para todas las
cepas de virus influenza incluidas en la vacuna. Sin embargo, en la
práctica es necesario cumplir al menos dos o los tres criterios para
todas las cepas, particularmente para una nueva vacuna tal como una
nueva vacuna intranasal. En algunas circunstancias, dos criterios
pueden ser suficientes. Por ejemplo, puede ser aceptable cumplir
dos de los tres criterios por todas las cepas mientras que el
tercer criterio se cumple por algunas pero no todas las cepas (por
ejemplo dos de tres cepas). Los requisitos son diferentes para
poblaciones adultas (18-60 años) y poblaciones
ancianas (> 60 años).
\vskip1.000000\baselineskip
Para que la vacuna intranasal contra la gripe
sea comercialmente útil no sólo es necesario que cumpla estas
normas, sino que en la práctica también será necesario que sea al
menos tan eficaz como las vacunas inyectables disponibles
actualmente. También será necesario que sea comercialmente viable en
cuanto a la cantidad de antígeno y el número de administraciones
requeridas.
Las vacunas intranasales contra la gripe basadas
en virus inactivado que se han estudiado durante las últimas
décadas no han cumplido estos criterios.
Fulk et al. 1969 (J. Immunol. 102,
1102-5) compararon la administración intranasal
(gotas nasales más nebulización) de virus influenza muerto con la
administración subcutánea (s.c.) en pacientes ancianos. Mientras
que el 56% de los pacientes que recibieron la administración s.c.
mostraron un aumento de 4 veces en los títulos de anticuerpos (HI),
el aumento correspondiente sólo se observó en el 25% de aquéllos que
recibieron una administración intranasal. Dos administraciones
intranasales dieron como resultado una seroconversión del 75%.
Gluck et al. 1999 (J. Virol. 73,
7780-6) demostraron que se requirieron dos
inoculaciones intranasales consecutivas administradas mediante una
pulverización que contenía potentes adyuvantes mucosos (toxina
termolábil de E. Coli, HLT) para inducir la seroconversión
(aumento de 4 veces en la respuesta humoral de anticuerpos)
comparable a una administración intramuscular. Una única
administración intranasal de 15 \mug de HA por cepa en presencia
de adyuvante, o incluso dos administraciones en ausencia de
adyuvante no pudieron proporcionar una seroconversión equivalente.
El antígeno del virus influenza estaba en forma de virosomas,
bicapas lipídicas reconstituidas producidas usando fosfatidilcolina
y proteínas de superficie virales extraídas de virus influenza
derivado de huevos.
El concepto de usar dos o más administraciones
intranasales con el fin de intentar lograr niveles superiores de
seroconversión también se ha usado por otros investigadores.
Petrescu et al. (1979. Rev. Rom. Med-Virol.
30, 109-115) administraron virus inactivado (1000
unidades internacionales por dosis de vacunación) por vía
intranasal dos veces a lo largo de un periodo de dos semanas. Oh
et al. (1992 Vaccine 10, 506-11)
administraron una vacuna fragmentada en forma de pulverización
nasal cuatro veces a intervalos semanales, 15 \mug de HA por cepa
en cada administración (0,25 ml por orificio nasal en cada ocasión).
Kuno-Sakai et al. (1994. Vaccine
12,1303-1310) administraron, dos veces en un
intervalo de 1 semana, vacuna inactivada en aerosol con tres veces
la concentración de virus influenza fragmentado comercialmente
disponible.
Los documentos WO 96/33738 y RU 2 086 232 dan a
conocer composiciones de virus influenza inactivado que pueden ser
adecuadas para la administración intranasal.
Recientemente, Muszkat et al. (2000
Vaccine 18, 1696-9) administraron dos inmunizaciones
intranasales con virus de la gripe inactivado entero (20 \mug de
una cepa A y una B cepa y 40 \mug de otra cepa A, por dosis)
pacientes ancianos y observaron la menor seroconversión sistémica
para la administración intranasal que para la inyección
intramuscular de una dosis convencional de una vacuna contra la
gripe fragmentada inactivada dividida.
Por tanto, la bibliografía que abarca de 1969 a
2000 muestra que aunque la vacunación intranasal con vacuna contra
la gripe inactivada se ha investigado ampliamente, ningún grupo ha
podido lograr una seroconversión sistémica equivalente a la
inyección intramuscular o subcutánea administrando una única dosis
de vacuna por vía nasal. Además, con el fin de lograr un efecto con
múltiples administraciones de vacuna a lo largo del tiempo, las
dosis de antígeno usadas han sido considerablemente superiores a la
dosis convencional habitual de 15 \mug de HA por cepa para cada
persona vacunada. De hecho los datos apuntan hacia una necesidad de
múltiples administraciones, y preferiblemente en presencia de
fuertes inmunoestimulantes tales como HLT de E. coli.
Kimura et al. (1988. Acta Paediatr Jpn.
30, 601-3) demostraron que la administración de dos
dosis de virus influenza inactivado mediante un nebulizador era
eficaz como administración s.c. única, pero la administración de
las dos dosis mediante pulverización intranasal era mucho menos
eficaz. La nebulización genera una pulverización muy fina que
alcanza los pulmones. Por tanto, también hay una indicación en los
ensayos clínicos publicados de que una pulverización nasal puede no
ser eficaz, y que la nebulización puede ser mejor.
La bibliografía indica además la necesidad de
adyuvantes potentes, más específicamente inmunoestimulantes
potentes en vacunas intranasales.
Por ejemplo, Gluck et al. (citado
anteriormente) demostraron que la administración intranasal de
vacuna contra la gripe en ausencia de un inmunoestimulante es
significativamente menos eficaz que en presencia de un
inmunoestimulante. Los autores muestran que incluso dos
administraciones intranasales de vacuna que carece de
inmunoestimulante no pueden inducir la misma seroconversión lograda
por la administración subcutánea.
Hashigucci et al. 1996 (Vaccine 14,
113-9) demostraron que dos administraciones
intranasales, separadas cuatro semanas, de una vacuna contra la
gripe fragmentada con una mezcla de toxina termolábil de E.
coli y su subunidad B (LTB) como adyuvante dio como resultado
una tasa de seroconversión del 50%. En ausencia de adyuvante sólo
se obtuvo una seroconversión del 31%. Normalmente la administración
s.c. da como resultado una seroconversión del
75-90%.
Por tanto, la bibliografía indica claramente que
con el fin de lograr una seroconversión sistémica equivalente a la
obtenida con las vacunas contra la gripe convencionales, se requiere
más de una administración, y además la vacuna debe tener como
adyuvante una toxina.
Ahora se ha descubierto que puede usarse
antígeno del virus influenza fragmentado muerto en una vacuna
intranasal contra la gripe comercialmente viable. En particular,
una única administración de una preparación de vacuna contra el
virus influenza estimula la inmunidad sistémica a un nivel de
protección. Además, esto cumple los criterios internacionales para
una vacuna contra la gripe eficaz. Más específicamente, la
administración intranasal de una preparación de antígeno del virus
influenza muerto puede producir una seroconversión sistémica
(aumento de 4 veces de los títulos anti-HA)
equivalente a la obtenida mediante la administración s.c. de la
misma vacuna. Sorprendentemente, el antígeno del virus influenza
puede proporcionarse en una dosis significativamente inferior por
persona vacunada de lo indicado en la técnica anterior.
Anteriormente, no se ha notificado una única
administración nasal de dosis convencional de virus influenza
fragmentado inactivado que dé como resultado una seroconversión
equivalente a la obtenida mediante inyección.
La invención proporciona por primera vez una
vacuna contra la gripe fragmentada de administración única para la
administración intranasal. La vacuna cumple al menos dos o todos los
criterios de la UE para vacunas contra la gripe según lo expuesto
en la tabla anteriormente en el presente documento para la o todas
las cepas de virus influenza representadas en la vacuna, de tal
manera que la vacuna puede aprobarse en Europa como una vacuna
comercial de una dosis. Más preferiblemente, se cumplen al menos dos
criterios para todas las cepas y el tercer criterio se cumple por
todas las cepas o al menos por todas salvo una de las cepas. Lo más
preferiblemente, todas las cepas cumplen los tres criterios.
Por tanto, la invención proporciona en un
aspecto el uso de una preparación de antígeno del virus influenza
fragmentado muerto en la fabricación de una formulación de vacuna
para una vacunación nasal de una dosis contra la gripe en el que la
vacunación de una dosis logra un efecto según la reivindicación 1.
La vacuna puede administrarse en un formato de monodosis o un
formato de bidosis (generalmente una subdosis para cada orificio
nasal).
La invención proporciona en otro aspecto el uso
de una dosis baja de material antígeno del virus influenza
fragmentado muerto en la fabricación de una vacuna mucosa para la
inmunización frente a la gripe.
Preferiblemente, la preparación de antígeno del
virus influenza fragmentado muerto contiene al menos un tensioactivo
que puede ser en particular un tensioactivo no iónico.
Preferiblemente, el tensioactivo no iónico es al menos un
tensioactivo seleccionado del grupo constituido por octil- o
nonilfenoxipolioxietanoles (por ejemplo la serie Triton^{TM}
comercialmente disponible), ésteres de polioxietilenosorbitano
(serie Tween^{TM}) y ésteres o éteres de polioxietileno de
fórmula general (I):
(I)HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R
en la que n es
1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo
C_{1-50} o fenilalquilo
C_{1-50}; y combinaciones de dos o más de
éstos.
Los tensioactivos preferidos que se encuentran
dentro de la fórmula (I) son moléculas en las que n es
4-24, más preferiblemente 6-12, y
lo más preferiblemente 9; el componente R es
C_{1-50}, preferiblemente alquilo
C_{4}-C_{20} y lo más preferiblemente alquilo
C_{12}.
Los octilfenoxipolioxietanoles y ésteres de
polioxietilenosorbitano se describen en "Surfactant systems"
Eds: Attwood and Florence (1983, Chapman and Hall). También se
describen los octilfenoxipolioxietanoles (los octoxinoles),
incluyendo t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton
X-100^{TM}) en la entrada 6858 del Merck Index
(página 1162. 12ª edición, Merck & Co. Inc., Whitehouse
Station. N.J., EE.UU.; ISBN
0911910-12-3). Los ésteres de
polioxietilenosorbitano, incluyendo monooleato de
polioxietilenosorbitano (Tween 80^{TM}) se describen en la entrada
7742 del Merck Index (página 1308, 12ª edición, Merck & Co.
Inc., Whitehouse Station, N.J., EE.UU.; ISBN
0911910-12-3). Ambos pueden
fabricarse usando procedimientos descritos en los mismos, o
adquirirse de fuentes comerciales tales como Sigma Inc.
Los tensioactivos no iónicos particularmente
preferidos incluyen Triton X-45,
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton
X-100), Triton X-102, Triton
X-114, Triton X-165, Triton
X-205, Triton X-305, Triton
N-57, Triton N-101, Triton
N-128, Breij 35, lauril éter de polioxietileno 9
(Laureth 9) y estearil éter de polioxietileno 9 (Steareth 9). Se
prefieren particularmente Triton X-100 y Laureth 9.
También se prefiere particularmente el éster de
polioxietilenosorbitano, monooleato de polioxietilenosorbitano
(Tween 80^{TM}).
Otros éteres de polioxietileno adecuados de
fórmula general (I) se seleccionan del siguiente grupo: estearil
éter de polioxietileno 8, lauril éter de polioxietileno 4, lauril
éter de polioxietileno 35 y lauril éter de polioxietileno 23.
En el registro CAS se dan a conocer nombres o
términos alternativos para el lauril éter de polioxietileno. El
número de registro CAS de lauril éter de polioxietileno 9 es:
9002-92-0. Los éteres de
polioxietileno tales como lauril éter de polioxietileno se dan a
conocer en el Merck index (12ª ed.: entrada 7717, Merck & Co.
Inc., Whitehouse Station, N.J., EE.UU.; ISBN
0911910-12-3). El Laureth 9 se forma
haciendo reaccionar óxido de etileno con alcohol dodecílico, y
tiene un promedio de nueve unidades de óxido de etileno.
La proporción de la longitud de la sección de
polioxietileno a la longitud de la cadena de alquilo en el
tensioactivo (es decir, la proporción de n:longitud de la cadena de
alquilo), afecta a la solubilidad de esta clase de tensioactivo en
un medio acuoso. Por tanto, los tensioactivos de la presente
invención pueden estar en disolución o pueden formar estructuras
particuladas tales como micelas o vesículas. Como disolución, los
tensioactivos de la presente invención son seguros, fácilmente
esterilizables, fáciles de administrar y pueden fabricarse de una
manera sencilla sin los problemas de BPF y CC asociados con la
formación de estructuras particuladas uniformes. Algunos éteres de
polioxietileno, tales como Laureth 9, pueden formar disoluciones no
vesiculares. Sin embargo, el palmitoil éter de polioxietileno 8
(C_{18}E_{8}) puede formar vesículas. En consecuencia, las
vesículas de palmitoil éter de polioxietileno 8 en combinación con
al menos otro tensioactivo no iónico, pueden emplearse en las
formulaciones de la presente invención.
Preferiblemente, el éter de polioxietileno usado
en las formulaciones de la presente invención tiene actividad
hemolítica. La actividad hemolítica de un éter de polioxietileno
puede medirse in vitro, con referencia al siguiente ensayo,
y es tal como se expresa como la mayor concentración del
tensioactivo que no consigue provocar la lisis de los glóbulos
rojos:
1. Se lava sangre fresca de cobayas con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces en una centrifuga de
mesa. Tras la resuspensión hasta el volumen original, se diluye
adicionalmente la sangre 10 veces con PBS.
2. Se añaden 50 \mul de esta suspensión de
sangre a 800 \mul de PBS que contienen diluciones de dos veces de
detergente.
3. Tras 8 horas, se evalúa la hemólisis
visualmente o mediante la medición de la densidad óptica del
sobrenadante. La presencia de un sobrenadante rojo que absorbe luz
a 570 nm indica la presencia de hemólisis.
4. Los resultados se expresan como la
concentración de la primera dilución con detergente a la que ya no
se produce hemólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de la variabilidad experimental inherente
de un ensayo biológico de este tipo, los éteres de polioxietileno,
o tensioactivos de fórmula general (I), de la presente invención
tienen preferiblemente una actividad hemolítica, de aproximadamente
entre el 0,5-0,0001%, más preferiblemente entre el
0,05-0,0001%, aún más preferiblemente entre el
0,005-0,0001% y lo más preferiblemente entre el
0,003-0,0004%. De manera ideal, dichos ésteres o
éteres de polioxietileno deben tener una actividad hemolítica
similar (es decir, dentro de una diferencia de diez veces) a la de
laurel éter de polioxietileno 9 o bien estearil éter de
polioxietileno 8.
Dos o más tensioactivos no iónicos de los
diferentes grupos de tensioactivos descritos pueden estar presentes
en la formulación de vacuna descrita en el presente documento. En
particular, se prefiere una combinación de un éster de
polioxietilenosorbitano tal como monooleato de
polioxietilenosorbitano (Tween 80^{TM}) y un octoxinol tal como
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton)
X-100^{TM}. Otra combinación particularmente
preferida de tensioactivos no iónicos comprende Laureth 9 más un
éster de polioxietilenosorbitano o un octoxinol o ambos.
Preferiblemente el o cada tensioactivo no iónico
está presente en la formulación de vacuna final a una concentración
de entre el 0,001% y el 20%, más preferiblemente del 0,01% al 10% y
lo más preferiblemente hasta aproximadamente el 2% (p/v). Cuando
están presentes uno o dos tensioactivos, generalmente están
presentes en la formulación final a una concentración de hasta
aproximadamente el 2% cada uno, normalmente a una concentración de
hasta aproximadamente el 0,6% cada uno. Pueden estar presentes uno
o más de otros tensioactivos, generalmente hasta una concentración
de aproximadamente el 1% cada uno y normalmente en trazas de hasta
aproximadamente el 0,2% o el 0,1% cada uno. Puede estar presente
cualquier mezcla de tensioactivos en las formulaciones de vacuna
según la invención.
Los tensioactivos no iónicos tales como los
tratados anteriormente tienen concentraciones preferidas en la
composición de vacuna final tal como sigue: ésteres de
polioxietilenosorbitano tales como Tween 80^{TM}: del 0,01% al
1%, lo más preferiblemente de aproximadamente el 0,1% (p/v); octil-
o nonilfenoxipolioxietanoles tales como Triton
X-100^{TM} u otros detergentes en la serie Triton:
del 0,001% al 0,1%, lo más preferiblemente del 0,005% al 0,02%
(p/v); éteres de polioxietileno de fórmula general (1) tales como
Laureth 9: del 0,1% al 20%, preferiblemente del 0,1% al 10% y lo
más preferiblemente del 0,1% al 1% o de aproximadamente el 0,5%
(p/v).
Para ciertas formulaciones de vacuna, pueden
incluirse otros componentes de vacuna en la formulación. Como
tales, las formulaciones de la presente invención también pueden
comprender un ácido biliar o un derivado del mismo, en particular
en forma de una sal. Éstos incluyen derivados de ácido cólico y
sales del mismo, en particular sales de sodio del ácido cólico o
derivados del ácido cólico. Los ejemplos de ácidos biliares y
derivados de los mismos incluyen ácido cólico, ácido desoxicólico,
ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico,
ácido hiodesoxicólico y derivados tales como derivados glico-,
tauro-,
amidopropil-1-propanosulfónico-,
amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónico
de los ácidos biliares mencionados anteriormente, o
N,N-bis(3-D-gluconoamidopropil)desoxicolamida.
Un ejemplo particularmente preferido es el desoxicolato de sodio
(NaDOC) que puede estar presente en la dosis de vacuna final.
Preferiblemente, las formulaciones de la
presente invención están en la forma de una disolución acuosa o una
suspensión de formas no vesiculares. Tales formulaciones son fáciles
de fabricar de manera reproducible, y también de esterilizar
(filtración terminal a través de una membrana de poros de 450 nm o
220 nm) y son fáciles de administrar a la mucosa nasal en forma de
una pulverización sin degradación de la compleja estructura física
del adyuvante.
La preparación de antígeno del virus de la gripe
muerto para su uso en la invención es una preparación de virus
fragmentado.
En una realización preferida, la formulación de
vacuna comprende una preparación de virus de la gripe fragmentado
en combinación con uno o más tensioactivos no iónicos. El uno o más
tensioactivos no iónicos pueden ser residuales del procedimiento
mediante el cual se produce la preparación de antígeno del virus de
la gripe fragmentado, y/o añadirse a la preparación de antígeno
posteriormente. Se cree que el material de antígeno del virus de la
gripe fragmentado puede estabilizarse en presencia de un
tensioactivo no iónico, aunque se entenderá que la invención no
depende de que éste sea necesariamente el caso.
La invención proporciona en otro aspecto el uso
de una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado
muerto, en la fabricación de una vacuna intranasal contra la gripe
de una dosis sin un inmunoestimulante añadido. En el contexto de
esta invención, un inmunoestimulante es una sustancia que puede
estimular directamente células en el sistema inmunitario, en
oposición a estimular sólo de manera indirecta, por ejemplo,
actuando como vehículo para un antígeno que tiene en sí mismo un
efecto estimulante cuando está en combinación con el vehículo.
En un aspecto alternativo de la presente
invención, la formulación comprende además adyuvantes o
inmunoestimulantes incluyendo toxina del cólera y su subunidad B,
lípido A destoxificado procedente de cualquier fuente, derivados no
tóxicos de lípido A incluyendo los descritos en los documentos US
4.912.094 y GB 2.220.211, incluyendo derivados no tóxicos de
monofosforil y difosforil-lípido A tales como
monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL) y difosforil-lípido A
3-des-O-acilado,
saponinas tales como Quil A (derivada de la corteza del árbol
sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y fracciones de los
mismos, incluyendo QS21 y QS17 (documento US 5.057.540; Kensil, C.
R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):
1-55; documento EP 0 362 279 B1; Kensil et
al. (1991. J. Immunology vol. 146, 431-437;
documento WO 99/10008) y el sistema de adyuvantes de
oligonucleótidos que contiene un dinucleótido CpG no metilado (según
lo descrito en el documento WO 96/02555).
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, la formulación comprende un derivado de lípido A no
tóxico seleccionado de 3D-MPL y derivados no tóxicos
de difosforil-lípido A, particularmente
3D-MPL. Más preferiblemente, la formulación
comprende 3D-MPL junto con un éster o éter de
polioxietileno de fórmula general (I) tal como se definió
anteriormente en el presente documento, en particular Laureth 9.
Por tanto, la invención proporciona además una
vacuna que comprende una combinación de 3D-MPL y
Laureth 9, y una preparación de antígeno del virus influenza,
particularmente una preparación de antígeno fragmentado. Esta
vacuna es adecuada en particular, aunque no exclusivamente, para la
administración mucosa incluyendo la administración intranasal según
lo descrito en el presente documento.
Otros componentes que están preferiblemente
presentes en la formulación según este aspecto de la invención
incluyen otros detergentes no iónicos tales como los octoxinoles y
ésteres de polioxietileno según lo descrito en el presente
documento, particularmente
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton
X-100) y monooleato de polioxietilenosorbitano
(Tween 80): y sales biliares o derivados de ácido cólico según lo
descrito en el presente documento, en particular taurodesoxicolato
o desoxicolato de sodio. Por tanto, una formulación particularmente
preferida comprende 3D-MPL, Laureth 9, Triton
X-100, Tween 80 y desoxicolato de sodio, que pueden
combinarse con una preparación de antígeno del virus influenza
fragmentado para proporcionar una vacuna adecuada para la aplicación
mucosa o intranasal.
La invención también proporciona un
procedimiento para fabricar una vacuna que comprende mezclar
3D-MPL, Laureth 9 y una preparación de antígeno del
virus influenza fragmentado tal como una preparación de antígeno
fragmentado empleada en una vacuna contra la gripe intramuscular
convencional.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit
farmacéutico que comprende un dispositivo de pulverización
intranasal y una vacuna contra el virus influenza fragmentado muerto
de una dosis que genera una respuesta inmunitaria que logra al
menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1
para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la
vacuna. Preferiblemente, el dispositivo es un dispositivo de
administración de bidosis para dos subdosis de vacuna.
La dosis baja de hemaglutinina según la
invención es preferiblemente una dosis de hemaglutinina comparable
a la dosis de las vacunas contra la gripe comerciales actuales. Por
tanto, la dosis baja preferida es preferiblemente no superior a
aproximadamente 30 \mug, más preferiblemente no superior a 15
\mug de hemaglutinina por cepa de virus influenza. Esto equivale
normalmente a alrededor de entre 0,1 \mug/kg de peso corporal y 2
\mug/kg de peso corporal. De manera preferible, pero no
necesariamente, las vacunas de dosis baja de la invención se
administran como una vacuna de una dosis, por ejemplo, en dos
subdosis, una para cada orificio nasal.
Ventajosamente, una dosis de vacuna según la
invención se proporciona en un volumen menor a las vacunas contra
la gripe fragmentadas inyectadas convencionales, que son
generalmente de 0,5 ml o 1 ml por dosis. Las dosis de volumen
pequeño según la invención son preferiblemente inferiores a 500
\mul, más preferiblemente inferiores a 300 \mul y lo más
preferiblemente de no superiores a aproximadamente 200 \mul o
menos por dosis. Cuando se administran dos subdosis, el volumen
preferido por subdosis es la mitad de los volúmenes de dosis totales
mencionados anteriormente.
Por tanto, una dosis de vacuna preferida según
la invención es una dosis con una dosis baja de antígeno en un
volumen pequeño, por ejemplo de aproximadamente 15 \mug o de
aproximadamente 7,5 \mug de HA (por cepa) en un volumen de
aproximadamente 200 \mul.
La invención también da a conocer un
procedimiento para la profilaxis de la enfermedad o infección por
influenza en un sujeto, procedimiento que comprende administrar al
sujeto una vacuna contra la gripe muerta de una dosis a través de
una superficie mucosa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención da a conocer además un
procedimiento para la profilaxis de enfermedad o infección por
influenza en un sujeto, procedimiento que comprende administrar al
sujeto una dosis baja de una vacuna contra la gripe muerta a través
de una superficie mucosa.
Preferiblemente, la vacuna se administra por vía
intranasal.
Lo más preferiblemente, la vacuna se administra
localmente a la zona nasofaríngea, preferiblemente sin inhalarse
hacia el interior de los pulmones. Es deseable utilizar un
dispositivo de administración intranasal que administra la
formulación de vacuna a la zona nasofaríngea, sin entrar o sin
entrar sustancialmente en los pulmones.
Los dispositivos preferidos para la
administración intranasal de la vacunas según la invención son
dispositivos de pulverización. Los dispositivos de pulverización
nasal disponibles comercialmente adecuados incluyen Accuspray^{TM}
(Becton Dickinson). Los nebulizadores producen una pulverización
muy fina que puede inhalarse fácilmente hacia el interior de los
pulmones y por tanto no alcanza eficazmente la mucosa nasal. Por
tanto, no se prefieren los nebulizadores.
Los dispositivos de pulverización preferidos
para uso intranasal son dispositivos para los que el rendimiento
del dispositivo no depende de la presión aplicada por el usuario.
Estos dispositivos se conocen como dispositivos con umbral de
presión. Se libera líquido de la boquilla sólo cuando se aplica una
presión umbral. Estos dispositivos hacen más fácil lograr una
pulverización con un tamaño de gota regular. Los dispositivos con
umbral de presión adecuados para su uso en la presente invención se
conocen en la técnica y se describen por ejemplo en los documentos
WO 91/13281 y EP 311 863 B y EP 516 636. Tales dispositivos están
disponibles comercialmente de Pfeiffer GmbH y también se describen
en Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, sept. de 1999.
Los dispositivos intranasales preferidos
producen gotas (medidas usando agua como líquido) en el intervalo
de 1 \mum a 200 \mum, preferiblemente de 10 \mum a 120 \mum.
Por debajo de 10 \mum, hay riesgo de inhalación, por tanto es
deseable tener no más de aproximadamente el 5% de las gotas
inferiores a 10 \mum. Las gotas por encima de 120 \mum no se
expanden tan bien como las gotas más pequeñas, de manera que es
deseable tener no más de aproximadamente el 5% de gotas que superen
los 120 \mum.
La administración de bidosis es otra
característica preferida de un sistema de administración intranasal
para su uso con la vacunas según la invención. Los dispositivos de
bidosis contienen dos subdosis de una única dosis de vacuna, una
subdosis para la administración a cada orificio nasal. Generalmente,
las dos subdosis están presentes en una única cámara y la
construcción del dispositivo permite la administración eficaz de
una única subdosis cada vez. Como alternativa, puede usarse un
dispositivo de monodosis para administrar las vacunas según la
invención.
La invención proporciona en otro aspecto un kit
farmacéutico que comprende un dispositivo de administración
intranasal según lo descrito en el presente documento que contiene
una formulación de vacuna según la invención.
La invención no se limita necesariamente a la
administración mediante pulverización de formulaciones líquidas.
Las vacunas según la invención pueden administrarse en otras formas,
por ejemplo, como un polvo.
La vacuna contra la gripe según la invención es
preferiblemente una vacuna contra la gripe multivalente que
comprende dos o más cepas de virus influenza. Lo más preferiblemente
es una vacuna trivalente que comprende tres cepas. Las vacunas
contra la gripe convencionales comprenden tres cepas de virus
influenza, dos cepas A y una cepa B. Sin embargo, las vacunas
monovalentes, que pueden ser útiles por ejemplo en una situación de
pandemia, no se excluyen de la invención. Una vacuna contra la gripe
pandémica, monovalente, contendrá lo más probablemente antígeno del
virus influenza de una única cepa A.
Las preparaciones de virus influenza fragmentado
muerto pueden derivarse del procedimiento de huevo embrionado
convencional, o pueden derivarse de cualquiera de los procedimientos
de nueva generación que usan el cultivo tisular para hacer crecer
el virus. Los sustratos celulares adecuados para hacer crecer el
virus incluyen, por ejemplo, células de riñón de perro tales como
MDCK o células de un clon de MDCK, células similares a MDCK,
células de riñón de mono tales como células AGMK incluyendo células
Vero, o cualquier otro tipo de células de mamífero adecuado para la
producción de virus influenza para fines de vacuna. Los sustratos
celulares adecuados también incluyen células humanas, por ejemplo,
células MRC-5. Los sustratos celulares adecuados no
se limitan a líneas celulares; por ejemplo también se incluyen
células primarias tales como fibroblastos de embrión de pollo.
La preparación de antígeno del virus influenza
puede producirse mediante cualquiera de varios procedimientos
aplicables comercialmente, por ejemplo el procedimiento de la gripe
fragmentada descrito en las patentes números DD 300 833 y DD 211
444. Tradicionalmente, la gripe fragmentada se producía usando un
tratamiento con disolvente /
detergente, tal como fosfato de tri-n-butilo, o dietil éter en combinación con Tween^{TM} (conocido como fragmentación de "Tween-éter") y este procedimiento todavía se usa en algunas instalaciones de producción. Otros agentes de fragmentación empleados ahora incluyen detergentes o enzimas proteolíticas o sales biliares, por ejemplo desoxicolato de sodio según lo descrito en la patente número DD 155 875. Los detergentes que pueden usarse como agentes de fragmentación incluyen detergentes catiónicos, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), otros detergentes iónicos, por ejemplo, laurilsulfato, taurodesoxicolato, o detergentes no iónicos tales como los descritos anteriormente incluyendo Triton X-100 (por ejemplo, en un procedimiento descrito en Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103) y Triton N-101, o combinaciones de dos cualesquiera o más detergentes.
detergente, tal como fosfato de tri-n-butilo, o dietil éter en combinación con Tween^{TM} (conocido como fragmentación de "Tween-éter") y este procedimiento todavía se usa en algunas instalaciones de producción. Otros agentes de fragmentación empleados ahora incluyen detergentes o enzimas proteolíticas o sales biliares, por ejemplo desoxicolato de sodio según lo descrito en la patente número DD 155 875. Los detergentes que pueden usarse como agentes de fragmentación incluyen detergentes catiónicos, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), otros detergentes iónicos, por ejemplo, laurilsulfato, taurodesoxicolato, o detergentes no iónicos tales como los descritos anteriormente incluyendo Triton X-100 (por ejemplo, en un procedimiento descrito en Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103) y Triton N-101, o combinaciones de dos cualesquiera o más detergentes.
Otros agentes de fragmentación adecuados que
pueden usarse para producir preparaciones del virus de la gripe
fragmentado incluyen:
1. Ácidos biliares y derivados de los mismos
incluyendo: ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido
quenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido
hiodesoxicólico y derivados tales como derivados glico-, tauro-,
amidopropil-1-propanosulfónico-,
amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónico
de los ácidos biliares mencionados anteriormente, o
N,N-bis(3-D-gluconoamidopropil)desoxicolamida.
Un ejemplo particular es desoxicolato de sodio (NaDOC) que puede
estar presente en cantidades traza en la dosis de vacuna final.
2. Alquilglucósidos o alquiltioglucósidos, en
los que la cadena de alquilo es entre C6-C18,
normalmente entre C8 y C14, el resto de azúcar es cualquier pentosa
o hexosa o combinaciones de las mismas con diferentes uniones,
tales como 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1-2.
La cadena de alquilo puede estar saturada, insaturada y/o
ramificada.
3. Derivados de los 2 de los anteriores, en los
que uno o más grupos hidroxilo, preferiblemente el grupo
6-hidroxilo está(n) modificado(s), tales
como ésteres, etoxilatos, sulfatos, éteres, carbonatos,
sulfosuccinatos, isetionatos, etercarboxilatos, compuestos de
amonio cuaternario.
4. Acil-azúcares en los que la
cadena de acilo es entre C6 y C18, normalmente entre C8 y C12, el
resto de azúcar es cualquier pentosa o hexosa o combinaciones de
los mismos con diferentes uniones, tales como 1->6, 1->5,
1->4, 1->3, 1-2. La cadena de acilo puede
estar saturada o insaturada y/o ramificada, ser cíclica o no
cíclica, con o sin uno o más heteroátomos, por ejemplo, N, S, P u
O.
5. Sulfobetaínas de la estructura
R-N,N-(R1,R2)-3-amino-1-propanosulfonato,
en las que R es cualquier cadena de alquilo o cadena de arilalquilo
entre C6 y C18, normalmente entre C8 y C16. La cadena de alquilo R
puede estar saturada, insaturada y/o ramificada. R1 y R2 son
preferiblemente cadenas de alquilo entre C1 y C4, normalmente C1, o
R1, R2 pueden formar un anillo heterocíclico junto con el
nitrógeno.
6. Betaínas de la estructura
R-N,N-(R1,R2)-glicina, en las que R
es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C18, normalmente entre C8
y C16. La cadena de alquilo puede estar saturada, insaturada y/o
ramificada. R1 y R2 son preferiblemente cadenas de alquilo entre C1
y C4, normalmente C1, o R1 y R2 pueden formar un anillo
heterocíclico junto con el nitrógeno.
7.
N,N-dialquil-glucamidas, de la
estructura R-(N-R1)-glucamida, en
las que R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C18,
normalmente entre C8 y C12. La cadena de alquilo puede estar
saturada, insaturada y/o ramificada o ser cíclica. R1 y R2 son
cadenas de alquilo entre C1 y C6, normalmente C1. El resto de azúcar
puede estar modificado con pentosas o hexosas.
8. Compuestos de amonio cuaternario de la
estructura R-N^{+}(-R1,-R2,-R3), en la que R es
cualquier cadena de alquilo entre C6 y C20, normalmente C20. La
cadena de alquilo puede estar saturada, insaturada y/o ramificada.
R1, R2 y R3 son preferiblemente cadenas de alquilo entre C1 y C4,
normalmente C1, o R1, R2 pueden formar un anillo heterocíclico
junto con el nitrógeno. Un ejemplo particular es bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB).
El procedimiento de preparación para una vacuna
fragmentada incluirá varias etapas de filtración y/u otra
separación diferentes tales como etapas de ultracentrifugación,
ultrafiltración, centrifugación zonal y cromatografía (por ejemplo
de intercambio iónico) en una variedad de combinaciones, y
opcionalmente una etapa de inactivación, por ejemplo, con
formaldehído o \beta-propiolactona o U.V. que
puede llevarse a cabo antes o después de la fragmentación. El
procedimiento de fragmentación puede llevarse a cabo como un
procedimiento discontinuo, continuo o semicontinuo.
Preferiblemente, una sal biliar tal como
desoxicolato de sodio está presente en cantidades traza en una
formulación de vacuna fragmentada según la invención,
preferiblemente a una concentración no superior al 0,05%, o no
superior a aproximadamente el 0,01%, más preferiblemente a
aproximadamente el 0,0045% (p/v).
Las preparaciones de antígeno de vacuna contra
la gripe fragmentado preferidas según la invención comprenden una
cantidad residual de Tween 80 y/o Triton X-100
restante procedente del procedimiento de producción, aunque pueden
añadirse éstos o ajustarse sus concentraciones tras la preparación
del antígeno fragmentado. Preferiblemente, están presentes tanto
Tween 80 como Triton X-100. Los intervalos
preferidos para las concentraciones finales de estos tensioactivos
no iónicos en la dosis de vacuna son:
Tween 80: del 0,01% al 1%, más preferiblemente
de aproximadamente el 0,1% (v/v)
Triton X-100: del 0,001% al 0,1
(% p/v), más preferiblemente del 0,005% al 0,02% (p/v).
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró que la presencia de la combinación
de estos dos tensioactivos, en bajas concentraciones, promovía la
estabilidad del antígeno en disolución. Es posible que esta
estabilidad potenciada volviese al antígeno más inmunogénico por
vía nasal de lo que habían sido las formulaciones anteriores. Una
potenciación de este tipo podría surgir de una prevalencia de
agregados pequeños de antígeno o la potenciación de la conformación
nativa del antígeno. Se apreciará que la invención no depende de que
esta explicación teórica sea correcta.
También hay evidencias que muestran que en el
caso de una preparación de virus influenza fragmentado, la presencia
de fragmentos del virus influenza entero asociados con las
proteínas virales o que contienen las proteínas virales, en
particular HA, puede conservar la presentación del antígeno y pueden
contribuir a inducir una fuerte respuesta inmunitaria. Por tanto,
el virus influenza fragmentado es el antígeno de elección para su
uso en los diversos aspectos de la presente invención.
En una realización particular, la preparación de
virus fragmentado preferida también contiene Laureth 9,
preferiblemente en el intervalo del 0,1% al 20%, más
preferiblemente del 0,1% al 10% y lo más preferiblemente del 0,1% al
1% (p/v).
La vacunas según la invención contienen
generalmente no más del 25% (p/v) de detergente o tensioactivo,
preferiblemente menos del 15% y lo más preferiblemente no más de
aproximadamente el 2%.
La invención proporciona en otro aspecto un
procedimiento de fabricación de una vacuna contra la gripe de una
dosis para la aplicación nasal, procedimiento que comprende:
(i) proporcionar una preparación de virus
influenza fragmentado producida esencialmente tal como para una
vacuna contra la gripe convencional inyectada (por ejemplo,
intramuscular) y que comprende al menos un tensioactivo no
iónico;
(ii) ajustar opcionalmente la concentración de
la hemaglutinina y/o la concentración de tensioactivo no iónico en
la preparación;
(iii) llenar un dispositivo de administración
intranasal con una dosis de vacuna de la preparación de virus
influenza fragmentado, siendo dicha dosis un volumen adecuado para
la administración intranasal, opcionalmente en un formato de
bidosis, y aplicación de una dosis que genera una respuesta
inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo
expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus
influenza presentes en la vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra etapa opcional en el procedimiento según
este aspecto de la invención incluye la adición de un tensioactivo
potenciador de la absorción tal como Laureth 9, y/o la adición de un
adyuvante tal como un derivado de lípido A no tóxico, especialmente
3D-MPL.
Los procedimientos para producir vacunas contra
la gripe inactivadas inyectadas convencionales se conocen bien y se
describen en la bibliografía. Tales procedimientos pueden
modificarse para producir una vacuna mucosa de una dosis para su
uso en la presente invención, por ejemplo, mediante la inclusión de
una etapa de concentración previa a la filtración estéril final de
la vacuna, ya que las vacunas intranasales emplean ventajosamente
un volumen menor de formulación de vacuna que las vacunas
inyectadas. O el procedimiento puede modificarse mediante la
inclusión de una etapa para ajustar la concentración de otros
componentes, por ejemplo, tensioactivos no iónicos, hasta un %
(p/v) adecuado para una vacuna intranasal según la invención. Sin
embargo, el principio activo de la vacuna, es decir el antígeno del
virus influenza, puede ser esencialmente el mismo para la vacuna
intramuscular convencional y las vacunas intranasales de una dosis
según la invención.
La invención se describirá ahora adicionalmente
en los siguientes ejemplos no limitantes.
Se preparó vacuna fragmentada monovalente según
el siguiente procedimiento.
En día de la inoculación de huevos embrionados,
se prepara un inóculo reciente mezclando el lote de siembra de
trabajo con una solución salina tamponada con fosfato que contiene
sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a 25 \mug/ml
(dependiendo de la cepa del virus). Se conserva el inóculo de virus
a 2-8ºC.
Se usan huevos embrionados de nueve a once días
de edad para la replicación viral. Se descontaminan las cáscaras.
Se inocula a los huevos 0,2 ml del inóculo viral. Se incuban los
huevos inoculados a la temperatura apropiada (dependiendo de la
cepa del virus) durante 48 a 96 horas. Al final del periodo de
incubación, se destruyen los embriones mediante enfriamiento y se
almacenan los huevos durante 12-60 horas a
2-8ºC.
Se recoge el líquido alantoideo de los huevos
embrionados enfriados. Normalmente, se recogen de 8 ml a 10 ml de
líquido alantoideo bruto por huevo. Al total de virus monovalente
bruto, se añade opcionalmente tiomersal 0,100 mg/ml.
Se aclara el líquido alantoideo recogido
mediante centrifugación a velocidad moderada (intervalo: 4000 -
14000 g).
Para obtener un gel de CaHPO_{4} en la reserva
de virus aclarado, se añaden disoluciones de Na_{2}HPO_{4} 0,5
mol/l y CaCl_{2} 0,5 mol/l para alcanzar una concentración final
de CaHPO_{4} de 1,5 g a 3,5 g de CaHPO_{4}/litro dependiendo de
la cepa del virus.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tras la sedimentación durante al menos 8 horas,
se elimina el sobrenadante y resolubilizarse el sedimento que
contiene el virus influenza mediante la adición de una disolución de
EDTA-Na 0,26 mol/l, dependiendo de la cantidad de
CaHPO_{4} usado.
Se filtra el sedimento resuspendido sobre una
membrana filtrante de 6 \mum.
Se concentra el virus influenza mediante
centrifugación isopícnica en un gradiente lineal de sacarosa (al
0,55% (p/v)) que contiene tiomersal 100 \mug/ml. El caudal es de 8
- 15 litros/hora.
Al final de la centrifugación, se recupera el
contenido del rotor mediante cuatro fracciones diferentes (la
sacarosa se mide en un refractómetro):
- fracción 1 el 55-52% de
sacarosa
- fracción 2 aproximadamente el
52-38% de sacarosa
- fracción 3 el 38-20% de
sacarosa*
- fracción 4 el 20-0% de
sacarosa
* dependiendo de la cepa del virus:
la fracción 3 puede reducirse hasta el 15% de
sacarosa.
Para la otra preparación de vacuna, sólo se usan
las fracciones 2 y 3.
Se lava la fracción 3 mediante diafiltración con
tampón fosfato con el fin de reducir el contenido en sacarosa hasta
aproximadamente inferior al 6%. Se sedimenta el virus influenza
presente en esta fracción diluida para eliminar contaminantes
solubles.
Se resuspende el sedimento y se mezcla
vigorosamente para obtener una suspensión homogénea. Se combinan la
fracción 2 y el sedimento resuspendido de la fracción 3 y se añade
tampón fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40
litros. Este producto es el concentrado de virus entero
monovalente.
Se aplica el concentrado de virus influenza
entero monovalente a una ultracentrífuga ENI-Mark
II. El rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (al 0,55%
(p/v)) en el que se sobrepone adicionalmente un gradiente de
desoxicolato de sodio. Tween 80 está presente durante la
fragmentación hasta el 0,1% (p/v). La concentración máxima de
desoxicolato de sodio es del 0,7-1,5% (p/v) y
depende de la cepa. El caudal es de 8 - 15 litros/hora.
Al final de la centrifugación, se recupera el
contenido del rotor mediante tres fracciones diferentes (se mide la
sacarosa en un refractómetro). La fracción 2 se usa para el
tratamiento adicional. El contenido en sacarosa para los límites de
fracción (47-18%) varía según las cepas y se fija
tras la evaluación.
Se filtra la fracción de virus fragmentado sobre
membranas filtrantes que terminan con una membrana de 0,2 \mum.
Se usa tampón fosfato que contiene Tween 80 al 0,025% (p/v) para la
dilución. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el
volumen de fracción original.
Se incuba el material monovalente filtrado a
22ºC \pm 2ºC durante 84 horas como máximo (dependiendo de las
cepas del virus, esta incubación puede acortarse). Entonces se añade
tampón fosfato que contiene Tween 80 al 0,025% con el fin de
reducir el contenido en proteína total hasta un máximo de 250
\mug/ml. Se añade formaldehído hasta una concentración final de
50 \mug/ml y la inactivación tiene lugar a 20ºC \pm 2ºC durante
al menos 72 horas.
Se concentra el material de virus fragmentado
inactivado al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltración,
equipada con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 kDa.
Posteriormente se lava el material con tampón fosfato que contiene
Tween 80 al 0,025% (p/v) y va seguido por solución salina tamponada
con fosfato que contiene Tween al 0,01% (p/v).
Se filtra el material tras la ultrafiltración
sobre membranas filtrantes que terminan con una membrana de 0,2
\mum. La concentración final de hemaglutinina, medida mediante SRD
(procedimiento recomendado por la OMS) debe superar los 450
\mug/ml.
Se almacena el volumen total final monovalente a
2 - 8ºC durante un máximo de 18 meses.
Se determinó la pureza mediante exploración de
D.O. de geles de poliacrilamida teñidos con Coomassie. Se
determinaron los picos manualmente. Se facilitan resultados de
muestras en la tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara la vacuna final formulando una vacuna
trivalente a partir del volumen total monovalente con las
concentraciones de detergente ajustadas según se requiera.
Se mezclan agua para inyección, PBS pH 7,4
concentrado 10 veces, Tween 80 y Triton X-100 para
obtener las concentraciones finales requeridas (PBS concentrado 1
vez, Tween 80 al 0,15% y Triton X-100 al 0,02%). Se
añaden los tres viriones fragmentados inactivados siguientes con 10
minutos de agitación entre ellos:
30 \mug de HA A/Beijing/262/95 (H1N1)
30 \mug de HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
30 \mug de HA B/Harbin/7/94
Tras 15 minutos de agitación, se ajusta el pH
hasta 7,2 +/- 0,2.
El volumen de dosis es de 200 \mul.
En la vacuna formulada con Laureth 9, se añade
el Laureth 9 antes del ajuste del pH para obtener una concentración
final del 0,5% (p/v).
Se aplican dos mechas contra el cornete inferior
(uno en cada orificio nasal) del voluntario. Se dejan las mechas en
la nariz durante 1 minuto antes de ponerse en 2 ml de NaCl al 0,9%,
BSA al 1% y azida de sodio al 0,1% (tampón conservante). Se dejan
todas las muestras durante un periodo de 2 horas en hielo. Entonces
se presionan las mechas para recuperar los anticuerpos. Tras la
centrifugación (10 minutos, 2000 g, 4ºC) se recogen los líquidos de
todas las muestras, se preparan alícuotas y se congelan a -20ºC
hasta la fecha de la prueba. Se suspenden los sedimentos en 400
\mul de agua fisiológica y se observan al microscopio para
determinar la contaminación de glóbulos rojos.
Tras la recogida usando mechas nasales y el
tratamiento de las secreciones nasales humanas, se realiza la
detección de IgA específica anti-gripe y total con
dos ELISA diferentes:
\vskip1.000000\baselineskip
Se captura IgA total con Ig purificada mediante
afinidad policlonal anti-IgA humana, inmovilizada
sobre placas de microtitulación y posteriormente se detecta usando
una Ig purificada mediante afinidad policlonal
anti-IgA humana diferente, acoplada a
peroxidasa.
Se usa una sIgA humana purificada como patrón
para permitir la cuantificación de sIgA en las secreciones nasales
recogidas.
Se usan 3 referencias de sIgA humana purificada
como referencias baja, media y alta en este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan tres ELISA diferentes, uno con cada
cepa de gripe presente en la formulación de vacuna.
Se capturan IgA específicas
anti-gripe con antígenos de la gripe inactivados
fragmentados recubiertos sobre placas de microtitulación y
posteriormente se detectan usando la misma Ig purificada mediante
afinidad policlonal anti-IgA humana diferente,
acoplada a peroxidasa que la usada para el ELISA de IgA total.
\vskip1.000000\baselineskip
- Ig purificada mediante afinidad de cabra
anti-IgA humana (Sigma 1-0884)
- IgA secretora humana purificada
(ICN-Cappel 55905) (patrón para la cuantificación de
IgA total)
- IgA secretora humana (Colostrum) (Biogenesis
5111-5504) (referencia Bio para la IgA total),
diluida para obtener referencias baja, media y alta
- IgA humana purificada (Sigma
I-1010) (referencia Sig para la IgA total)
- Referencia negativa para el ELISA específico
anti-gripe (reserva de secreciones nasales con
respuestas no detectables frente a las 3 cepas; punto de corte =
0,6 DO_{450nm})
- Referencia positiva baja para ELISA específico
anti-gripe (reserva de secreciones nasales con
respuestas detectables bajas frente a las 3 cepas)
- Referencia positiva media para ELISA
específico anti-gripe (reserva de secreciones
nasales con respuestas detectables medias frente a las 3 cepas;
punto de corte = 0,6 DO)
- Anticuerpo de cabra purificado mediante
afinidad en suero anti-IgA humana conjugado con HRP
(ICN 674221)
- Antígeno A/Beijing/262/95 H1N1 derivado de
huevo inactivado fragmentado
- Antígeno A/Sydney/5/97 H3N2 derivado de huevo
inactivado fragmentado
- Antígeno B/Harbin/7/94 derivado de huevo
inactivado fragmentado
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón de saturación (PBS, Tween 20 al 0,1%,
BSA al 1%, NCS al 4%)
- NaCl T20 (NaCl 9 g/l, Tween 20 al 0,05%)
\vskip1.000000\baselineskip
- Añadir 100 \mul/pocillo de anticuerpo
policlonal de cabra anti-IgA humana a 1 \mug/ml en
DPBS e incubar durante la noche a 4ºC.
- Añadir 200 \mul/pocillo de tampón de
saturación e incubar durante 1 hora a 37ºC.
- Añadir en la primera fila: 100 \mul/pocillo
de diluciones de dos veces de la IgA patrón en tampón de saturación
partiendo de 250 ng/ml hasta 0,12 ng/ml.
- Añadir en las otras filas: 100 \mul/pocillo
de diluciones de dos veces de las muestras (líquidos nasales) en
tampón de saturación partiendo de 1/100 hasta 1/102400, añadir 100
\mul de tampón de saturación en la columna 12 e incubar durante 2
horas a 22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de anticuerpo de
cabra anti-IgA humana conjugado con peroxidasa
diluido en tampón de saturación a 1/10000 e incubar durante 1 hora
y media a 22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de TMB
(tetrametilbencidina) e incubar a temperatura ambiente durante 10
min. en la oscuridad.
- Detener la reacción añadiendo 100
\mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,4 N.
- Medir la absorbancia (DO) de cada placa usando
un espectrofotómetro a 450 nm con una referencia a 630 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
- Añadir 100 \mul/pocillo de cada cepa de
virus de la gripe a 1 \mug/ml en DPBS e incubar durante la noche
a 4ºC.
- Añadir 200 \mul/pocillo de tampón de
saturación e incubar durante 1 hora a 37ºC.
- Añadir 100 \mul/pocillo de diluciones de dos
veces de las muestras en tampón de saturación partiendo de 1/5
hasta 1/640 e incubar las placas durante 2 horas a 22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de anticuerpo de
cabra anti-IgA humana conjugado con peroxidasa en
tampón de saturación a 1/10000 e incubar durante media hora a
22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de TMB
(tetrametilbencidina) e incubar a temperatura ambiente durante 10
min. en la oscuridad.
- Detener la reacción añadiendo 100
\mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,4 N.
- Medir la absorbancia (DO) de cada placa usando
un espectrofotómetro a 450 nm con una referencia a 630 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se expresan como \mug de IgA
total en 1 ml de líquidos nasales, usando un programa
Softmaxpro.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se expresan como título unitario
de criterio de valoración, que se calculan como la inversa de la
última dilución que da una DO_{450nm} superior al punto de corte
(DO_{450nm} = 0,6).
El valor del punto de corte se define como la
mayor densidad óptica de la referencia negativa (véase el protocolo
de validación) a una dilución de 1/5. Por tanto, puede calcularse el
límite de detección correspondiente al título unitario del criterio
de valoración en el punto de corte como 5 unidades de criterio de
valoración. Las muestras con un título \leq 5 unidades de
criterio de valoración se considerarán negativas y las muestras con
un título > 5 unidades de criterio de valoración se considerarán
positivas.
Los resultados finales de una muestra se
expresan tal como sigue:
Normalización de la respuesta específica
calculando la proporción entre la respuesta específica y la
concentración de IgA total: unidad de criterio de valoración/\mug
de IgA total (procedimiento de cálculo más comúnmente usado en la
bibliografía).
\vskip1.000000\baselineskip
Se tratan los sueros (50 \mul) con 200 \mul
de RDE (enzima destructora de receptores) durante 16 horas a 37ºC.
Se detiene la reacción con 150 \mul de citrato de Na al 2,5% y se
inactivan los sueros a 56ºC durante 30 min. Se prepara una dilución
1:10 añadiendo 100 \mul de PBS. Después se prepara una serie de
dilución de 2 veces en placas de 96 pocillos (fondo en V) diluyendo
25 \mul de suero (1:10) con 25 \mul de PBS. Se añaden 25 \mul
de los antígenos de referencia a cada pocillo a una concentración de
4 unidades de hemaglutinación por 25 \mul. Se mezclan el antígeno
y la dilución antisuero usando un agitador de placas de
microtitulación y se incuban durante 60 minutos a temperatura
ambiente. Entonces se añaden 50 \mul de glóbulos rojos (RBC) de
pollo (al 0,5%) y se dejan sedimentar los RBC durante 1 hora a TA.
El título de HAI corresponde a la inversa de la última dilución de
suero que inhibe completamente la hemaglutinación inducida por
virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron dos formulaciones (A, B) de
antígenos del virus influenza fragmentados derivados de huevos. A
es una formulación intranasal y B es
Fluarix^{TM}/\alpha-Rix® administrada por vía
intramuscular. Las formulaciones contienen tres antígenos de virión
fragmentado inactivado preparados a partir de las cepas recomendadas
por la OMS de la temporada 1998/1999.
El dispositivo usado para la administración de
la vacunas fue la jeringuilla intranasal Accuspray^{TM} de Becton
Dickinson. El dispositivo funciona de manera similar a una
jeringuilla convencional, pero tiene una punta especial que
contiene canales en espiral que dan como resultado la producción de
una pulverización cuando se ejerce una presión uniforme sobre el
émbolo. Se llenó el dispositivo con 200 \mul de formulación de
vacuna, y se pulverizaron 100 \mul de la formulación A en cada
orificio nasal.
\vskip1.000000\baselineskip
La formulación intranasal (A) contenía los
siguientes viriones fragmentados inactivados:
1. 30 \mug de HA A/beijing/262/95 (H1N1)
2. 30 \mug de HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
3. 30 \mug de HA B/Harbin/7/94
y solución salina tamponada con
fosfato, pH 7,4 \pm 0,1, Tween 80 al 0,1%, Triton
X-100 al 0,015%, desoxicolato de Na al 0,0045% y
tiomersal por debajo de 35
\mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El volumen de una dosis fue de 200 \mul
(subdosis de 100 \mul para cada orificio nasal).
El producto de comparación
Fluarix^{TM}/\alpha-Rix® es la vacuna contra la
gripe fragmentada trivalente inactivada comercial de SmithKline
Beecham Biologicals. Se administró la dosis de 500 \mul por vía
intramuscular.
Esta dosis contiene:
15 \mug de HA de las tres cepas mencionadas
anteriormente, Tween 80 entre 500 y 1000 \mug por ml (al
0,05%-0,1%), Triton X-100 entre 50 y 170 \mug/ml
(al 0,005%-0,017%), desoxicolato de sodio a un máximo de 100
\mug/ml, tiomersal 100 \mug/ml y solución salina tamponada con
fosfato, pH entre 6,8 y 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Un estudio abierto, controlado y aleatorizado
evaluó la inmunogenicidad de una vacuna intranasal contra la gripe
fragmentada formulada con Tween 80 y Triton X-100 en
comparación con la vacuna parenteral convencional (es decir
Fluarix^{TM}). Veinte sujetos adultos sanos (de
18-40 años de edad) recibieron una dosis de
Fluarix^{TM} y diez sujetos recibieron una dosis de la vacuna
intranasal contra la gripe. La formulación intranasal (200 \mul)
contenía los siguientes viriones inactivados: 30 \mug de
hemaglutinina A/Beijing/262/95 (H1N1), 30 \mug de hemaglutinina
A/Sydney/5/97 (H3N2), 30 \mug de hemaglutinina B/Harbin/7/94 con
solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4 \pm 0,1), Tween 80
(al 0,1%), Triton X-100 (al 0,015%), desoxicolato de
sodio (al 0,0045%) y tiomersal (< 35 \mug/ml).
Hubo un periodo de seguimiento de ocho días para
los síntomas locales y generales solicitados y ambas vacunas se
toleraron bien con respecto a la seguridad y a la reactogenicidad.
No se notificaron acontecimientos adversos graves relacionados con
la vacunación.
Se examinó la inmunogenicidad de la vacunas
evaluando los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en
suero para determinar la tasa de seroconversión (definida como el
porcentaje de personas vacunadas que tienen un aumento de al menos
4 veces de los títulos de HI en suero el día 21 en comparación con
el día 0, para cada cepa de vacuna), el factor de conversión
(definido como el aumento en veces de la media geométrica de los
títulos (GMT) de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0,
para cada cepa de vacuna) y la tasa de seroprotección (definida
como el porcentaje de personas vacunadas con un título de HI en
suero \geq 40 tras la vacunación (para cada cepa de vacuna) que
se acepta como que indica protección). Además, se evaluó la
respuesta de anticuerpo IgA mucoso mediante ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Las tasas de seropositividad de HI,
seroconversión y de seroprotección veintiún días después de una
dosis de Fluarix^{TM} o la formulación intranasal pueden verse en
la tabla 2. El factor de conversión puede verse a partir de la
tabla 2a.
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos, el factor de conversión
(aumento en veces de GMT de HI en suero tras la vacunación) fue
superior a 2,5, el nivel requerido para una vacuna contra la gripe
satisfactoria.
El porcentaje de sujetos con un aumento de dos
veces o de cuatro veces en la proporción de anticuerpo IgA mucosa
específica/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis) puede
observarse en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de inmunogenicidad presentados en
forma de tabla anteriormente muestran que la formulación intranasal
produjo niveles similares de seropositividad, seroconversión y
seroprotección a los producidos por la vacuna parenteral
convencional (Fluarix^{TM}) veintiún días después de una dosis. La
formulación intranasal produjo una mejor respuesta de IgA mucosa
tras una dosis que la vacuna parenteral convencional
(Fluarix^{TM}).
Se evaluó una formulación intranasal de
antígenos del virus influenza fragmentados derivados de huevos,
formulada con Laureth 9, Triton X-100 y Tween 80
(A) y se comparó con Fluarix^{TM}/\alpha-Rix®
(B). Las formulaciones contenían tres antígenos de virión
fragmentado inactivado preparados a partir de las cepas recomendadas
por la OMS de la temporada 1998/1999. El dispositivo usado para la
administración de la vacunas fue la jeringuilla intranasal
Accuspray^{TM} de Becton Dickinson. El dispositivo funciona de
manera similar a una jeringuilla convencional, pero tiene una punta
especial que contiene canales en espiral que dan como resultado la
producción de una pulverización cuando se ejerce presión uniforme
sobre el émbolo. Se pulverizaron 100 \mul de la formulación en
cada orificio nasal.
La formulación intranasal (A) contenía los
siguientes viriones fragmentados inactivados:
1. 30 \mug de HA A/beijing/262/95 (H1N1)
2. 30 \mug de HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
3. 30 \mug de HA de B/Harbin/7/94
y solución salina tamponada con
fosfato pH 7,4 \pm 0,1, Tween 80 al 0,1%, Triton
X-100 al 0,015%, desoxicolato de sodio al 0,0045% y
tiomersal por debajo de 35
\mug/ml.
El volumen de una dosis fue de 200 \mul
(subdosis de 100 \mul para cada orificio nasal). La formulación A
se formuló con Laureth 9 para obtener una concentración final del
0,5% (p/v).
El compuesto de comparación
Fluarix^{TM}/\alpha-Rix® (B) es la vacuna contra
la gripe fragmentada trivalente inactivada comercial de
SmithKlineBeecham Biologicals, que se administra por vía
intramuscular en una dosis de 500 \mul.
Un estudio abierto, controlado y aleatorizado
evaluó la inmunogenicidad de una vacuna intranasal contra la gripe
fragmentada formulada con Laureth 9 complementada con Tween 80 y
Triton X-100 en comparación con la vacuna
parenteral convencional (es decir Fluarix^{TM}). Veinte sujetos
adultos sanos (de 18-40 años de edad) recibieron
una dosis de Fluarix^{TM} y diez sujetos recibieron una dosis (dos
subdosis, una por orificio nasal) de la vacuna intranasal contra la
gripe.
Hubo un periodo de seguimiento de ocho días para
determinar síntomas locales y generales solicitados y ambas vacunas
se toleraron bien con respecto a la seguridad y reactogenicidad. No
se notificaron acontecimientos adversos graves relacionados con la
vacunación.
Se examinó la inmunogenicidad de las vacunas
evaluando los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en
suero para determinar la tasa de seroconversión (definida como el
porcentaje de personas vacunadas que tienen un aumento de al menos
4 veces en los títulos de HI en suero el día 21 en comparación con
el día 0, para cada cepa de vacuna), factor de conversión (definido
como el aumento en veces de las medias geométricas de los títulos
(GMT) de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0, para
cada cepa de vacuna) y tasa de seroprotección (definida como el
porcentaje de personas vacunadas con un título de HI en suero \geq
40 tras la vacunación (para cada cepa de vacuna) que se acepta como
que indica protección). Además, se evaluó la respuesta de
anticuerpo IgA mucosa mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a
enzimas (ELISA).
Las tasas de seropositividad de HI,
seroconversión y seroprotección veintiún días después de una dosis
de Fluarix^{TM} o la formulación intranasal pueden verse en la
tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos, el factor de conversión
(aumento en veces de la GMT de HI en suero tras la vacunación) fue
superior a 2,5, el nivel requerido para una vacuna contra la gripe
satisfactoria.
El porcentaje de sujetos con un aumento de dos
veces o de cuatro veces en la proporción de anticuerpo IgA mucosa
específica/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis) puede verse en
la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de inmunogenicidad presentados en
forma de tabla anteriormente muestran que la formulación intranasal
produjo niveles similares de seropositividad, seroconversión y
seroprotección a los de la vacuna parenteral convencional
(Fluarix^{TM}) veintiún días después de una dosis. La formulación
intranasal produjo generalmente una mejor respuesta de IgA mucosa
tras una dosis que la vacuna parenteral convencional
(Fluarix^{TM}).
6.1. En un primer experimento, se vacunaron
ratones con formulaciones candidatas que contenían las mismas cepas
de virus influenza que las usadas para su sensibilización.
Se "sensibilizaron" ratones Balb/c hembra
(8 semanas de edad) por vía intranasal el día 0 con virus influenza
entero trivalente derivado de huevos inactivado por
\beta-propiolactona A/Beijing/262/95,
A/Sydney/5/97 y B Harbin/7/94; 5 \mug de HA/cepa) de manera que
se imita la sensibilización natural que se produce en los seres
humanos.
Tras 28 días, se vacunaron por vía intranasal
los ratones (10 animales por grupo) con las siguientes formulaciones
de vacuna trivalente que contenían las mismas cepas que las usadas
para la sensibilización:
Las formulaciones de vacuna intranasal
administradas a los ratones son similares a las que se administran
a seres humanos en el ejemplo 7 excepto porque la dosis administrada
para los ratones corresponde 1/10 de la dosis para seres
humanos.
Se recogieron muestras de suero el día 42 y se
sometieron a prueba para determinar los anticuerpos de inhibición
de la hemaglutinación (HI). Tras el sacrificio (día 42), se
realizaron lavados nasales y se sometieron a prueba para determinar
los títulos de anticuerpo IgA mediante ELISA. Se midieron los
anticuerpos IgA específica como títulos de criterio de valoración
(EPT) y se expresaron los resultados como EPT de IgA específica por
\mug de IgA total con el fin de excluir cualquier diferencia
debida al procedimiento de toma de muestras.
El primer objetivo del estudio fe confirmar que
las formulaciones de vacuna intranasal podían provocar títulos de
HI en suero no significativamente diferentes de los resultantes de
la administración parenteral. La figura 1 muestra los títulos de HI
observados en el suero el día 42 (es decir, 14 días tras la
vacunación) con las diversas vacunas.
Se realizó un análisis estadístico (ensayo
comparativo estadístico Tukey-HSD) con los títulos
de HI observados con el fin de comparar las vacunas intranasales
con la vacuna parenteral. Los títulos de HI observados con los
grupos sola 1 y 2 fueron significativamente diferentes (p < 0,05)
de los inducidos por la vacuna parenteral para dos de las tres
cepas de la gripe (cepas A/H1N1 y B). Los títulos
anti-cepa A/H3N2 no fueron significativamente
diferentes. La formulación L9 fue tan inmunogénica como la vacuna
parenteral para dos de las tres cepas (cepas A/H3N2 y B). En
cambio, la vacuna formulada con L9 + MPL provocó anticuerpos de HI
frente a las tres cepas de la gripe con títulos que no difirieron
significativamente de los observados con la vacuna parenteral.
El segundo objetivo fue determinar si la
respuesta de IgA nasal frente a la vacunación intranasal era o no
superior a la observada en animales con refuerzo por vía
intramuscular. La figura 2 presenta la respuesta de IgA nasal
registrada 14 días tras la vacunación de refuerzo (día 42).
No hubo diferencias significativas entre las
respuestas inducidas por cualquiera de las formulaciones
intranasales. La administración intranasal provocó respuestas de
dos a cuatro veces superiores en comparación con la vía parenteral.
Finalmente, la vacuna formulada con L9 + MPL pudo mantener el mismo
nivel de respuesta en comparación con las otras vacunas
intranasales pero con una dosis de antígeno inferior.
Los antígenos del virus influenza fragmentados
trivalentes formulados con L9 + MPL (0,75 \mug de HA + Laureth 9
al 0,5% + 5 \mug de MPL) fueron la formulación de vacuna
intranasal más inmunogénica en cuanto a la respuesta de anticuerpos
de HI.
Todas las vacunas administradas por vía nasal
sometidas a prueba fueron más potentes en la inducción de
anticuerpos IgA locales que la vacuna administrada por vía
parenteral. La formulación de L9 + MPL indujo una respuesta similar
a las otras formulaciones pero con un contenido en antígeno
reducido.
6.2 En un segundo experimento, se inmunizaron
ratones por vía intranasal con cepas que fueron diferentes a las
usadas para la sensibilización.
La deriva antigénica es responsable de las
epidemias anuales. Las cepas incluidas todos los años en la vacuna
contra la gripe son las encontradas más comúnmente, aunque también
pueden encontrarse otras cepas en el campo, más o menos
relacionadas. Como consecuencia, la mejor vacuna contra la gripe
candidata tendrá que inducir protección frente a una amplia gama de
cepas para ser eficaz. Por tanto, resultó interesante investigar
hasta qué grado podía una formulación intranasal dada provocar una
respuesta inmunitaria tras una "sensibilización" con cepas
heterólogas a las contenidas en la vacuna.
Se "sensibilizaron" ratones Balb/c hembra
(de 8 semanas de edad) por vía intranasal en el día 0 con virus
influenza entero trivalente derivado de huevos inactivado por
\beta-propiolactona (A/Johannesburg/82/96 H1N1,
A/Johannesburg/
33/94 H3N2 y B/Panama/45/90; 5 \mug de HA/cepa) para imitar la sensibilización natural que se produce en seres humanos.
33/94 H3N2 y B/Panama/45/90; 5 \mug de HA/cepa) para imitar la sensibilización natural que se produce en seres humanos.
Tras 28 días, se vacunaron los ratones (10
animales por grupo) por vía intranasal con las siguientes
formulaciones de vacuna trivalente (que contenían A/Beijing/262/95
H1N1, A/Sydney/5/97 H3N2 y B/Harbin/7/94 como cepas
heterólogas).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las cantidades de viriones fragmentados
trivalentes contenidos en las diversas formulaciones de vacuna
intranasal que iban a someterse a prueba en ratones correspondían
de nuevo a 1/10 de las dosis administradas a voluntarios humanos en
el ejemplo 7.
Se recogieron muestras de suero el día 42 y se
sometieron a prueba para detectar anticuerpos de inhibición de la
hemaglutinación (HI). Tras el sacrificio (día 42), se realizaron
lavados nasales y se sometieron a prueba para determinar los
títulos de anticuerpos IgA mediante ELISA. Se midieron los
anticuerpos de IgA específica como títulos de criterio de
valoración (EPT) y se expresaron los resultados como EPT de IgA
específica por \mug de IgA total con el fin de excluir cualquier
diferencia debida al procedimiento de toma de muestras.
El primer objetivo del estudio fue determinar si
las formulaciones de vacuna intranasal podían provocar respuestas
de HI en suero frente a antígenos de vacuna cuando se usan cepas de
heterosubtipos para la sensibilización. La figura 3 muestra los
títulos de HI observados en el suero 14 días tras la vacunación (día
42) con las diversas formulaciones de vacuna.
Todas las formulaciones intranasales con L9 o L9
+ MPL pudieron inducir respuestas inmunitarias dirigidas frente a
las tres cepas de virus influenza, que eran comparables a las
provocadas por la administración parenteral de la vacuna sola. El
análisis estadístico (ensayo comparativo estadístico
Tukey-HSD) confirmó que las respuestas provocadas
por todas las formulaciones intranasales fueron no
significativamente (p > 0,05) diferentes de las respuestas de la
administración parenteral. Dentro de las formulaciones intranasales,
no se observaron diferencias estadísticas. Sin embargo, las
formulaciones de L9 + MPL y L9 fueron generalmente más
inmunogénicas, conteniendo la primera la mitad del contenido en
antígeno de la segunda (0,75 \mug frente a 1,5 \mug de HA).
El segundo objetivo fue determinar (1) si podía
medirse una respuesta de IgA específica nasal frente a cepas
heterólogas tras la vacunación intranasal y (2) si esta respuesta
era superior a la observada en animales vacunados por vía
intramuscular. La figura 4 representa la respuesta de IgA específica
nasal anti-heteróloga registrada 14 días tras la
vacunación (día 42).
Se cumplieron ambos criterios del segundo
objetivo. Todas las formulaciones intranasales indujeron respuestas
de IgA frente a las tres cepas heterólogas que fueron de tres a ocho
veces superiores a las observadas cuando se inyectó vacuna sola por
vía intramuscular. La amplitud de las respuestas de IgA no fue
significativamente diferente dentro de las formulaciones
intranasales.
La magnitud de las respuestas observadas con la
vacunación heteróloga alcanzó el mismo intervalo que para la
vacunación homóloga (véase la figura 2). De nuevo aquí, la vacuna
formulada con L9 + MPL pudo mantener la misma amplitud de respuesta
con una dosis de antígeno menor (0,75 \mug de HA) en comparación
con las formulaciones solas o con L9 (3 y 1,5 \mug de HA).
La administración intranasal de vacuna contra la
gripe fragmentada trivalente, con o sin adyuvante o tensioactivo
potenciador de la absorción, pudo inducir respuestas a
heterosubtipos tanto en cuanto al anticuerpo de HI en suero como a
IgA intranasal específica para cepas de vacuna contra la gripe.
Aunque las diferencias entre los grupos no
fueron estadísticamente significativas, las vacunas en las que los
viriones fragmentados trivalentes se formulan con L9 o L9 + MPL
inducen generalmente una respuesta inmunitaria más potente
sistémica así como local. Además, en comparación con la vacuna que
contiene L9, la vacuna formulada con L9 + MPL indujo el mismo nivel
de inmunidad pero con una dosificación de antígeno menor.
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio se evalúan las respuestas
inmunitarias sistémicas y mucosas locales frente a las vacunas en
aproximadamente 120 sujetos varones y hembras sanos.
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio se evalúan cinco formulaciones
de los antígenos del virus influenza fragmentados derivados de
huevos. Las vacunas candidatas se administran por vía intranasal.
Además, se usa Fluarix^{TM} de SmithKline Beecham Biologicals
(vacuna contra la gripe de virión fragmentada inactivada
administrada por vía muscular) como producto de comparación.
Las vacunas intranasales candidatas contienen
los tres antígenos de virión fragmentados inactivados usados en la
formulación de Fluarix^{TM}. Las cepas son las que ha recomendado
la OMS para la temporada 2000 en el hemisferio sur. Se presenta una
descripción general de las diversas formulaciones en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El volumen de una dosis es 0,2 ml.
El volumen de una dosis es 0,2 ml. La
formulación es según lo mostrado en la tabla 7, incluyendo además 1
mg de Laureth 9 por dosis, junto con una dosis de 15 ó 7,5 \mug de
HA por cepa. El Laureth 9 se obtiene de Kreussler, Alemania.
\vskip1.000000\baselineskip
El volumen de una dosis es 0,2 ml. La
formulación es según lo mostrado en la tabla 7, incluyendo además 1
mg de Laureth 9 y 50 \mug de 3D-MPL por dosis,
junto con una dosis de 7,5 \mug de HA por cepa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa Fluarix^{TM} 2000 (hemisferio sur),
como producto de comparación. Esta vacuna de una dosis de 0,5 ml se
administra por vía intramuscular.
Una dosis contiene 15 \mug de hemaglutinina de
cada cepa del virus influenza (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)
-A/Sydney/5/97 (H3N2) -B/Yamanashi/166/98) y 50 \mug de tiomersal
como conservante por dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de la formulación de las vacunas
candidatas finales, se concentraron por separado los tres viriones
fragmentados inactivados mediante filtración en flujo tangencial
hasta 1000 \mug a 1500 \mug de HA por ml. Se usaron casetes de
membrana equipados con una membrana de triacetato de celulosa con un
punto de corte de 10 kDa.
El diagrama de flujo de la formulación se
presenta a continuación:
Para las formulaciones que contienen Laureth 9,
se añade Laureth-9 hasta el 0,5% inmediatamente
antes del ajuste del pH y se continúa la agitación a temperatura
ambiente durante 15 minutos.
Para las formulaciones que contienen Laureth 9 +
3D-MPL, se añade 3D-MPL 250
\mug/ml inmediatamente antes de la adición del Laureth 9 y se
agita la formulación durante 15 minutos antes de añadir Laureth
9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llenan asépticamente viales de vidrio de tipo
1 (Farm. Eur.) de Pfeiffer (Alemania) con las reservas a granel
finales. Inmediatamente tras el llenado, se cierran esos viales con
un tapón de goma. Todas las operaciones se realizan en una sala
aséptica (sistema de flujo laminar).
Tras el llenado y el cierre, se insertan los
viales tapados en un émbolo de plástico y se montan en un
dispositivo con boquilla de pulverización para la generación de una
pulverización. Este dispositivo permite la administración de dos
pulverizaciones de 100 \mul.
Para todos los sujetos, se lleva a cabo el
siguiente análisis:
1. En los días 0, 21 y 42: títulos mediante
ELISA de IgA mucosa (respuesta inmunitaria local) ELISA, sometidos
a prueba por separado frente a cada una de las tres cepas de virus
influenza representadas en la vacuna.
2. En los días 0, 21 y 42: títulos de anticuerpo
de inhibición de la hemaglutinación (HI) en suero, sometidos a
prueba por separado frente a cada una de las tres cepas de virus
influenza.
\vskip1.000000\baselineskip
De esto se derivan:
1. Las GMT de anticuerpo de HI en suero (con
intervalos de confianza al 95%) en todos los puntos de tiempo.
2. Para HI: tasas de seroconversión en el día
21.
3. Para HI: factores de conversión en el día
21.
4. Para HI: tasas de protección en los días 21 y
42.
5. Sólo para IgA: porcentaje de sujetos que
tienen un aumento de 2 veces y de 4 veces en los títulos de IgA
desde el día 0 hasta el día 21 y del día 0 al día 42.
Claims (25)
1. El uso de una preparación de antígeno del
virus influenza fragmentado muerto en la fabricación de una
formulación de vacuna para una vacunación intranasal de una dosis
contra la gripe, en el que la vacunación de una dosis logra al
menos dos de los siguientes criterios para la o todas las cepas de
virus influenza presentes en la vacuna:
- (i)
- una tasa de seroconversión superior o igual al 40% para una población adulta humana (18-60 años) o al 30% en una población anciana humana (> 60 años);
- (ii)
- una tasa de seroprotección superior o igual al 70% para una población adulta humana (18-60 años) o al 60% en una población anciana humana (> 60 años); y
- (iii)
- un factor de conversión superior o igual a 2,5 para una población adulta humana (18-60 años) o a 2,0 en una población anciana humana (> 60 años).
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
se cumplen los tres criterios de la Unión Europea según lo expuesto
en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza
representadas en la vacuna.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la formulación comprende al menos un tensioactivo.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que
el tensioactivo es al menos un tensioactivo no iónico seleccionado
del grupo que consiste en los octilfenoxipolietoxietanoles (por
ejemplo de la serie Triton^{TM} disponible comercialmente),
ésteres de polioxietilenosorbitano (serie Tween^{TM}) y ésteres o
éteres de polioxietileno de fórmula general (I):
(I)HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R
en la que n es
1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo
C_{1-50} o fenilalquilo
C_{1-50}, y combinaciones de dos o más de
éstos.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que
el tensioactivo no iónico es al menos un tensioactivo seleccionado
del grupo constituido por
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton
X-100), monooleato de polioxietilenosorbitano
(Tween 80) y Laureth 9, o una combinación de dos o más de éstos.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que
la vacuna comprende una combinación de dos de los tres tensioactivos
no iónicos, concretamente monooleato de polioxietilenosorbitano
(Tween 80) y t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton
X-100).
7. El uso según la reivindicación 6, en el que
la vacuna comprende una combinación de los tres tensioactivos no
iónicos.
8. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la vacuna comprende además un
ácido biliar o ácido cólico, o derivado de los mismos tal como
desoxicolato de sodio.
9. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que cada dosis de la formulación de
vacuna contiene una dosis baja de hemaglutinina.
10. El uso según la reivindicación 9, en el que
el contenido en hemaglutinina por cepa de virus influenza es de 30
\mug o menos por dosis.
11. El uso según la reivindicación 10, en el que
el contenido en hemaglutinina por cepa de virus influenza es de 15
\mug o menos por dosis.
12. El uso según la reivindicación 11, en el que
el contenido en hemaglutinina es de 7,5 \mug o menos de
hemaglutinina por cepa de virus por dosis de vacuna.
13. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la formulación de vacuna está en
un volumen por dosis que es inferior a 500 \mul.
14. El uso según la reivindicación 13, en el que
el volumen por dosis es inferior a 300 \mul o no superior a 200
\mul por dosis.
15. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la vacuna se administra en un
formato de bidosis de dos subdosis.
16. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la vacuna no contiene un
inmunoestimulante añadido.
17. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que la vacuna comprende además un
derivado no tóxico de lípido A, preferiblemente seleccionado de
derivados no tóxicos de monofosforil-lípido A y
difosforil-lípido A.
18. El uso según la reivindicación 17, en el que
la vacuna comprende monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL).
19. El uso según la reivindicación 18, en el que
la vacuna comprende monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL) y Laureth 9.
20. Un kit farmacéutico que comprende un
dispositivo de administración intranasal y una vacuna de una dosis
que comprende una preparación de antígeno del virus influencia
fragmentado muerto sin un inmunoestimulante añadido, que genera una
respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según
lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de
virus influenza presentes en la vacuna.
21. Un kit farmacéutico que comprende un
dispositivo de administración intranasal y una vacuna contra la
gripe fragmentada de una dosis que genera una respuesta inmunitaria
que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la
reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza
presentes en la vacuna.
22. Un kit farmacéutico que comprende un
dispositivo de administración intranasal y una vacuna de una dosis
que comprende una dosis baja de HA de una preparación de antígeno
del virus influenza fragmentado muerto que genera una respuesta
inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo
expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus
influenza presentes en la vacuna.
23. El kit farmacéutico según una cualquiera de
las reivindicaciones 20 a 22, en el que el dispositivo es un
dispositivo de administración de bidosis para administrar dos
subdosis en una única administración.
24. El kit farmacéutico según una cualquiera de
las reivindicaciones 20 a 23, en el que el dispositivo es un
dispositivo de pulverización intranasal.
25. Un procedimiento de fabricación de una
vacuna contra la gripe de una dosis para la aplicación nasal,
procedimiento que comprende:
- (i)
- proporcionar una preparación de virus influenza fragmentado producida esencialmente tal como para una vacuna contra la gripe inyectada convencional y que comprende al menos un tensioactivo no iónico;
- (ii)
- ajustar opcionalmente la concentración de hemaglutinina y/o la concentración de tensioactivo no iónico en la preparación;
- (iii)
- llenar un dispositivo de administración intranasal con una dosis de vacuna de la preparación de virus influenza fragmentado, siendo dicha dosis un volumen adecuado para la administración intranasal, opcionalmente en un formato de bidosis, y cuya aplicación de una dosis genera una respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna.
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