ES2293975T3 - Gen de dehiscencia y procedimientos para regular la dehiscencia. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN aislada que codifica la proteína de la SEC ID Nº 16, o el complemento de dicho ADN.

Description

Gen de dehiscencia y procedimientos para regular la dehiscencia.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una mutación en Arabidopsis thaliana que evita la dehiscencia (destrucción de las vainas) del fruto maduro. El gen aislado se identifica como SGT10166 y codifica una proteína que se descubrió que era similar a la clase Hélice-bucle-Hélice básica de factores de transcripción. El patrón de expresión del gen y el fenotipo de las plantas mutantes indica su papel en la dehiscencia de la silicua.

Las publicaciones y otros materiales usados en este documento para iluminar los antecedentes de la invención o proporcionar detalles adicionales con respecto a la práctica se agrupan respectivamente en las Listas de Referencias adjuntas.

El fruto es un órgano vegetal especializado que es responsable de la maduración y dispersión de las semillas. La dispersión de las semillas sucede a través de un proceso de dehiscencia, por ejemplo, donde una vaina de semillas se abre para liberar las semillas de su interior. La dehiscencia es de importancia agronómica en cultivos como Brassica sp., donde conduce a pérdida significativa de semillas durante la recolección.

El fruto de Arabidopsis es conocido como silicua, que se desarrolla a partir de un gineceo fertilizado. El gineceo consta de un estigma apical, un estilo y un ovario basal. El ovario consta de dos carpelos que comparten un tejido fusionado llamado septo. Las paredes del carpelo son conocidas como valvas, que están unidas al replum. El replum representa el margen externo del septo (Sessions, 1999). Después de la fertilización, el gineceo se expande para formar una silicua alargada. La dispersión de las semillas sucede a través de un proceso de dehiscencia en el que la silicua se abre para liberar las semillas. La dehiscencia en Arabidopsis requiere el desarrollo de una zona de dehiscencia a lo largo de la unión replum-valvas que permite que las valvas se desprendan del replum, liberando las semillas (Gu y col., 1998).

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de investigar genes implicados en la dispersión de semillas a través del proceso de dehiscencia ya que la prevención de la dehiscencia en cultivos minimizaría significativamente la pérdida de semillas durante la recolección.

También se desea identificar genes vegetales que estén implicados en la dehiscencia para obtener un promotor y/o potenciador y/o secuencias intrónicas para su uso para preparar plantas transgénicas o para impedir la dehiscencia normal en plantas transgénicas para producir plantas indehiscentes.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a mutaciones en un gen que está implicado en la dehiscencia, que eviten la dehiscencia y construcciones que inhiban la actividad del producto génico. La presente invención se refiere adicionalmente a la prevención de la dispersión de semillas a través del proceso de dehiscencia (destrucción de las vainas), que conduce a una pérdida significativa de semillas durante la recolección de cultivos. De acuerdo con la presente invención, se ha identificado un gen en Arabidopsis thaliana que está implicado en la dehiscencia y una mutación del mismo que evita la dehiscencia del fruto maduro (silicua). El gen codifica una proteína que se descubrió que era similar a la clase Hélice-bucle-Hélice básica de factores de transcripción.

En este documento se describe la identificación y caracterización del gen SGT10166 en Arabidopsis thaliana.

En un aspecto, la presente invención se refiere a mutaciones en Arabidopsis thaliana que evitan la dehiscencia del fruto maduro. Específicamente, la invención proporciona una molécula de ADN aislada que codifica la proteína de la SEC ID Nº 16, o el complemento de dicho ADN.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan construcciones que comprenden dicho ADN aislado para alterar la dehiscencia del fruto maduro. Las construcciones generalmente comprenden un promotor heterólogo, es decir, uno no asociado de forma natural con el gen SGT10166, unido de forma operativa al ácido nucleico SGT10166 mutado. El SGT10166 puede estar en orientación con sentido o antisentido con respecto al promotor. También se describen vectores que contienen la construcción para su uso en la transformación de células vegetales. Las células vegetales de Arabidopsis pueden transformarse de acuerdo con la presente invención. Las células vegetales preferidas son células vegetales de plantas que desarrollan frutos, por ejemplo, la silicua, que se desarrolla a partir de un gineceo fertilizado para producir semillas en una vaina.

También se describen plantas que tienen al menos una célula transformada con una construcción que contiene el ácido nucleico SGT10166 para alterar la dehiscencia del fruto maduro. Dichas plantas tienen un fenotipo caracterizado por dehiscencia alterada. Las células vegetales preferidas son células vegetales de plantas que desarrollan frutos, por ejemplo, la silicua, que se desarrolla a partir de un gineceo fertilizado para producir semillas en una
vaina.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un procedimiento para producir una planta transformada que tenga dehiscencia alterada del fruto maduro. Los procedimientos comprenden las etapas de transformar células vegetales con el ADN aislado descrito anteriormente y regenerar plantas a partir de una o más de las células vegetales transformadas donde la planta es una planta en la que el fruto maduro es una silicua. Puede seleccionarse al menos una planta que muestra dehiscencia alterada.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la estructura del gineceo de tipo silvestre. Sg - Estigma; St - Estilo; O - Ovario; R - Replum; V - Valva.

La Figura 2 representa el patrón de expresión GUS de SGT10166 en el desarrollo de la silicua, en orden de edad creciente (izquierda a derecha).

La Figura 3 representa el fenotipo indehiscente de SGT10166, donde(a) es la silicua de tipo silvestre madura, y (b) es la silicua SGT10166 madura.

La Figura 4(a) representa el ADNc (SEC ID Nº 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 2) de SGT10166.La Figura 4(b) representa una comparación de secuencia de SGT10166 con algunas proteínas myc vegetales (SEC ID Nº 3-6).

La Figura 5 muestra la secuencia genómica que flanquea el sitio de inserción Ds y el análisis de huella genética. (1) Región del locus ALC de tipo silvestre antes de la inserción DsG (SEC ID Nº 8). (2) Alteración de secuencia en el locus ALC después de la inserción Ds. Los nucleótidos en negrita representan las bases añadidas durante la inserción Ds (SEC ID Nº 9 y 10). (3) y (4) muestran la huella de 9 pares de bases y 10 pares de bases (en negrita) observada después de la escisión Ds (SEC ID Nº 11 y 12).

Breve descripción de las secuencias

La SEC ID Nº 1 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de SGT10166.

La SEC ID Nº 2 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido SGT10166.

La SEC ID Nº 3 es la secuencia de nucleótidos del ADN genómico de SGT10166.

La SEC ID Nº 4 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido rd22BPI.

La SEC ID Nº 5 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PG1.

La SEC ID Nº 6 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido Lc.

La SEC ID Nº 7 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido B-Peru.

La SEC ID Nº 8 es una región del locus ALC de tipo silvestre antes de la inserción DsG.

La SEC ID Nº 9 es una región del locus ALC después de la inserción Ds.

La SEC ID Nº 10 es una región del locus ALC después de la inserción Ds.

La SEC ID Nº 11 es una región del locus ALC de un revertiente después de la escisión Ds.

La SEC ID Nº 12 es una región del locus ALC (alc10)después de la escisión Ds.

La SEC ID Nº 13 es el fragmento de ADN delecionado de la SEC ID Nº 1 y que codifica un dominio peptídico básico y está reemplazado por una secuencia que codifica un dominio ácido en la SEC ID Nº 14.

La SEC ID Nº 15 es la construcción de ADN dominante negativo creada delecionando la parte codificante del dominio básico (SEC ID Nº 13) de SGT10166 e insertando la SEC ID Nº 14.

La SEC ID Nº 16 es la proteína codificada por la SEC ID Nº 15.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a mutaciones en un gen implicado en la dehiscencia, que evita la dehiscencia (destrucción de las vainas) del fruto maduro. El gen SGT10166 codifica una proteína similar a la clase Hélice-bucle-Hélice básica de factores de transcripción. El patrón de expresión del gen y el fenotipo de las plantas mutantes indica su papel para posibilitar la dehiscencia de la silicua.

Se describe un gen que está implicado en la dehiscencia. Este gen se descubrió identificando una línea de Arabidopsis que contenía una mutación que evitaba la dehiscencia. Más específicamente, el gen aislado codifica una proteína que se descubrió que era similar a la clase Hélice-bucle-Hélice básica de factores de transcripción. Se descubrió que el producto proteico se encontraba en el gineceo como se describe más completamente en el Ejemplo 2. El ADNc que codifica el gen de tipo silvestre se descubrió en base al gen mutante, como se describe más completamente en el Ejemplo 3. El gen de Arabidopsis puede usarse para explorar ADN genómico de plantas que tienen vainas para identificar genes homólogos, que proporcionen ácidos nucleicos adicionales para su uso en la inhibición de la dehiscencia. El gen identificado de acuerdo con la presente invención se llama el gen SGT10166. La secuencia de ADN genómico del gen SGT10166 se describe en la base de datos EMBL, Nº de acceso AB020742. El documento EP 1 033 405 describe moléculas de ADN que constituyen fragmentos del genoma de Arabidopsis.

El proceso de dehiscencia, habitualmente conocido como destrucción de vainas, es de importancia agronómica en cultivos tales como colza (Brassica napus) que provoca la pérdida de semillas causando rendimientos bajos. Las pérdidas pueden ser tan elevadas como del 50% en condiciones adversas (Coupe y col., 1994). La línea mutante SGT10166 muestra un fenotipo indehiscente por el que la silicua no logra abrirse, y la proteína se parece a la familia de proteínas bHLH. Por tanto, el gen SGT10166 y genes homólogos son útiles para preparar plantas que tengan un fenotipo indehiscente. El fenotipo indehiscente puede conseguirse usando un enfoque anti-sentido o dominante negativo. Para el procedimiento antisentido (Gray y col., 1992), puede ser necesario clonar primero el gen correspondiente a partir de la planta de cultivo deseada por homología de ADN con el gen SGT10166. Los reguladores dominantes negativos pueden prepararse delecionado o mutando el dominio de unión a ADN de la proteína (Krylov y col., 1997). Dichas proteínas HLH funcionan como reguladores dominantes negativos por secuestro de proteínas bHLH para formar dímeros proteicos inactivos. En este enfoque, el gen de Arabidopsis puede usarse directamente.

Los procedimientos para impedir la función génica en una planta transgénica incluyen introducir un gen sintético que cause la supresión con sentido o antisentido del gen diana (Taylor y Jorgensen, 1992). Los procedimientos de supresión requieren una similitud sustancial entre el gen diana y el gen de supresión, mayor del 80% de identidad de secuencia de nucleótidos (Mol y col., 1994).

Como se describe con mayor detalle en este documento, el gen SGT10166 puede usarse para evitar la dehiscencia normal del fruto maduro en plantas. En resumen, dos técnicas para usar el gen SGT10166 para este propósito son la supresión antisentido o con sentido para disminuir el nivel de expresión del gen SGT10166 endógeno. Una tercera técnica es usar las secuencias reguladoras de SGT10166 para dirigir la expresión de un producto génico letal específicamente en tejidos de los frutos (ablación genética).

Definiciones

La presente invención emplea las siguientes definiciones, que se refieren, cuando sea apropiado, a SGT10166.

"Dehiscencia alterada" o "fenotipo de dehiscencia modificado" se refiere a una modificación física en la estructura del tejido de la silicua de la planta en comparación con la planta progenitora de la que se obtiene la planta que tiene el fenotipo modificado. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en el tamaño, forma, cantidad o localización de los órganos frutales. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios en los tipos o formas de las células que componen las estructuras frutales. Dichos fenotipos de fruto modificados pueden ser uniformes en toda la planta y típicamente surgen cuando cada una de las células en la planta contiene células transformadas con un vector que comprende al menos una parte del ácido nucleico SGT10166. Dichas plantas a veces se mencionan como plantas transgénicas. El fenotipo producido en una planta particular depende del diseño del vector usado para producirla. Por tanto, el vector puede diseñarse para transcribir un ácido nucleico que codifique al menos una parte de la proteína SGT10166. En dichos casos, la proteína SGT10166 producida de este modo es capaz de conferir un fenotipo particular basado en la presencia de esta proteína en la célula. Como alternativa, el vector puede construirse de modo que la transcripción provoque la formación de un transcrito que sea capaz de hibridar con un transcrito de ARN de un gen SGT10166 endógeno o un gen homólogo. Este enfoque emplea la tecnología antisentido bien conocida y provoca una modulación en el efecto fenotípico de los genes SGT10166 endógenos. Dicha modulación del gen SGT10166 endógeno también puede obtenerse potencialmente usando la cadena con sentido del gen SGT10166 para causar la supresión con sentido de los alelos SGT10166 endógenos así como el gen SGT10166 introducido en el vector. La producción de una planta que contenga dicho fenotipo se contempla en base a la supresión con sentido observada en Petunia hybrida como se expone en la Publicación PCT WO 90/12084. El vector puede comprender el promotor de SGT10166 que regula la transcripción de un gen que codifica una proteína que impide el crecimiento celular. En dichos casos, la dehiscencia alterada mostrada puede ser atrofia grave o pérdida de estructuras frutales.

La "amplificación de polinucleótidos" utiliza procedimientos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por ligamiento (o reacción en cadena de la ligasa, LCR) y procedimientos de amplificación basados en el uso de la Q-beta replicasa. También es útil la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), SDA termófila, y amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (3SR o NASBA). Estos procedimientos son bien conocidos y están ampliamente practicados en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.683.195 y 4.683.202 e Innis y col. (1990) (para PCR); Wu y Wallace (1989) (para LCR); las Patentes de Estados Unidos 5.270.184 y 5.455.166 y Walker y col. (1992) (para SDA); Spargo y col. (1996) (para SDA termófila) y la Patente de Estados Unidos 5.409.818, Fahy y col. (1991) y Compton (1991) (para 3SR y NASBA). Los reactivos y el hardware para realizar la PCR están disponibles en el mercado. Los cebadores útiles para amplificar secuencias de la región de SGT10166 son preferiblemente complementarios a, e hibridan específicamente con secuencias en la región de SGT10166 o en regiones que flanquean una región diana de la misma. Las secuencias de SGT10166 generadas por amplificación pueden secuenciarse directamente. Como alternativa, pero de forma menos deseable, la(s) secuencia(s) amplificada(s) puede(n) clonarse antes del análisis de secuencia. Se ha descrito un procedimiento para la clonación directa y el análisis de secuencia de segmentos genómicos amplificados enzimáticamente por Scharf y col. (1986).

"Polinucleótido analito" y "cadena analito" se refieren a un polinucleótido mono o bicatenario que se sospecha que contiene una secuencia diana, y que puede estar presente en una diversidad de tipos de muestras, incluyendo muestras biológicas.

"Compañero de unión" se refiere a una molécula capaz de unirse a una molécula ligando con alta especificidad, como por ejemplo, cadenas polinucleotídicas complementarias o una enzima y su inhibidor. En general, los compañeros de unión específicos deben unirse con suficiente afinidad para inmovilizar el dúplex de copia de analito/cadena complementaria (en el caso de hibridación de polinucleótidos) en condiciones de aislamiento. En el caso de compañeros de unión polinucleotídicos complementarios, los compañeros normalmente son de al menos aproximadamente 15 bases de longitud, y pueden ser de al menos 40 bases de longitud. Está bien reconocido por los especialistas en la técnica que también pueden usarse longitudes más cortas de 15 (por ejemplo, 8 bases), entre 15 y 40, y mayores de 40 bases. Los polinucleótidos pueden estar compuestos por ADN, ARN, o análogos nucleotídicos sintéticos. Pueden identificarse compañeros de unión adicionales usando, por ejemplo, el ensayo de exploración de levadura de doble híbrido como se describe en este documento.

Una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido que se sospecha que contiene un polinucleótido o polipéptido analito de una planta incluyendo, aunque sin limitación, por ejemplo, polen, óvulos, células, órganos, tejido y muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro.

"Codificar". Se dice que un polinucleótido "codifica" un polipéptido si, en su estado nativo o cuando se manipula por procedimientos bien conocidos para los especialistas en la técnica, puede transcribirse y/o traducirse para producir el ARNm y/o el polipéptido o un fragmento del mismo. La cadena anti-sentido es el complemento de dicho ácido nucleico, y la secuencia codificante puede deducirse a partir de la misma.

"Aislado" o "sustancialmente puro". Un ácido nucleico "aislado" o "sustancialmente puro" (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de forma natural a una secuencia vegetal o proteína nativa, por ejemplo, ribosomas, polimerasa, muchas otras secuencias genómicas y proteínas vegetales. El término abarca una secuencia de ácido nucleico o proteína que se ha retirado de su entorno de origen natural, e incluye aislados de ADN recombinantes o clonados y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos.

"Alelo SGT10166 " se refiere, respectivamente, a alelos normales del locus SGT10166 así como alelos de SGT10166 que tienen variaciones, aislados de plantas o producidos de acuerdo con la presente invención.

"Locus SGT10166 ", "gen SGT10166 ", "ácidos nucleicos SGT10166 " o "polinucleótido SGT10166 " se refieren cada uno a polinucleótidos, todos los cuales están en la región SGT10166, respectivamente, que probablemente tienen que expresarse en tejido normal y están implicados en la dehiscencia. Se entiende que el locus SGT10166 incluye secuencias codificantes, secuencias intermedias y elementos reguladores (por ejemplo, promotores y potenciadores) que controlan la transcripción y/o la traducción. Se entiende que el locus SGT10166 incluye todas las variaciones alélicas de la secuencia de ADN.

Estos términos, cuando se aplican a un ácido nucleico, se refieren a un ácido nucleico que codifica un polipéptido, fragmento, homólogo o variante, de SGT10166 vegetal incluyendo, por ejemplo, fusiones proteicas o deleciones. Los ácidos nucleicos de la presente invención tendrán una secuencia que se obtiene de, o es sustancialmente similar a, un gen que codifica SGT10166 natural o uno que tiene homología sustancial con un gen que codifica SGT10166 natural o una parte del mismo. El término ácido nucleico SGT10166 a veces se usa para hacer referencia a las cadenas con sentido y antisentido del gen SGT10166 colectivamente.

El gen o ácido nucleico SGT10166 incluye alelos normales del gen SGT10166, respectivamente, incluyendo alelos silenciosos que no tienen efecto sobre la secuencia de aminoácidos del polipéptido SGT10166 así como alelos que conducen a variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido SGT10166 que no afectan sustancialmente a su función. Estos términos también incluyen alelos que tienen una o más mutaciones que afectan de forma adversa a la función del polipéptido SGT10166. Una mutación puede ser un cambio en la secuencia de ácido nucleico de SGT10166 que produce un cambio nocivo en la secuencia de aminoácidos del polipéptido SGT10166, provocando una pérdida parcial o completa de la función de SGT10166, respectivamente, o puede ser un cambio en la secuencia de ácido nucleico que provoca la pérdida de la expresión eficaz de SGT10166 o la producción de formas aberrantes del polipéptido SGT10166.

El ácido nucleico SGT10166 puede ser el mostrado en la SEC ID Nº 1 o puede ser un alelo como se ha descrito anteriormente o una variante o derivado que difiere del mostrado por un cambio que es uno o más de adición, inserción, deleción y sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia mostrada. Los cambios en la secuencia de nucleótidos pueden provocar un cambio de aminoácidos a nivel proteína, o no, como se determina por el código genético.

Por tanto, un ácido nucleico puede incluir una secuencia diferente de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 que aún codifica un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2. Por otro lado, el polipéptido codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiera en uno o más restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2.

El gen SGT10166, respectivamente, también se refiere a (a) cualquier secuencia de ADN que (i) hibride con el complemento de las secuencias de ADN que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 en condiciones de elevada rigurosidad (Ausubel y col., 1992) y (ii) codifique un producto génico funcionalmente equivalente a SGT10166, o (b) cualquier secuencia de ADN que (i) hibride con el complemento de las secuencias de ADN que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 en condiciones menos rigurosas, tales como condiciones moderadamente rigurosas (Ausubel y col., 1992) y (ii) codifique un producto génico funcionalmente equivalente a SGT10166.Las secuencias descritas en este documento pueden incluir moléculas de ácido nucleico que son los complementos de estas secuencias.

Las composiciones de polinucleótidos de esta invención incluyen ARN, ADNc, ADN genómico, formas sintéticas, y polímeros mixtos, cadenas tanto con sentido como antisentido, y pueden modificarse química o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los especialistas en la técnica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia señalada mediante enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que enlaces fosfato sustituyen a los enlaces peptídicos en la estructura de la molécula.

Los ácidos nucleicos recombinantes pueden comprender todo o parte de la región SGT10166. La construcción recombinante puede ser capaz de replicarse de forma autónoma en una célula huésped. Como alternativa, la construcción recombinante puede llegar a integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped. Dicho polinucleótido recombinante comprende un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semi-sintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación, 1) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; 2) está unido a un polinucleótido diferente al que está unido en la naturaleza; o 3) no existe en la naturaleza. Cuando un ácido nucleico incluye ARN, una referencia a la secuencia mostrada debe entenderse como una referencia al ARN equivalente, con T sustituida por U.

Por lo tanto, se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que comprenden secuencias de origen por lo demás no natural por esta invención. Aunque puede emplearse la secuencia de tipo silvestre, también puede alterarse, por ejemplo, por deleción, sustitución o inserción. Pueden explorarse bibliotecas de ADNc o genómicas de diversos tipos como fuentes naturales de los ácidos nucleicos de la presente invención, o dichos ácidos nucleicos pueden proporcionarse por amplificación de secuencias residentes en ADN genómico u otras fuentes naturales, por ejemplo, por PCR. La elección de bibliotecas de ADNc normalmente corresponde a una fuente tisular que es abundante en ARNm para las proteínas deseadas. Normalmente se prefieren bibliotecas de fagos, pero pueden usarse otros tipos de bibliotecas. Los clones de una biblioteca se propagan en placas, se transfieren a un sustrato para su exploración, se desnaturalizan y se sondean para la presencia de secuencias deseadas.

Se describen en líneas generales técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) o Ausubel y col. (1992). Los reactivos útiles para aplicar dichas técnicas, tales como enzimas de restricción y similares, se conocen ampliamente en la técnica y están disponibles en el mercado de proveedores tales como New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega, U. S. Biochemicals, New England Nuclear, y varias fuentes diferentes. Las secuencias de ácido nucleico recombinantes usadas para producir proteínas de fusión de la presente invención pueden obtenerse de secuencias naturales o sintéticas. Pueden obtenerse muchas secuencias génicas naturales de diversas bibliotecas de ADNc o genómicas usando sondas apropiadas. Véase, GenBank, National Institutes of Health.

Como se usa en este documento, una "parte" del locus o región o alelo SGT10166 se define como que tiene un tamaño mínimo de al menos aproximadamente ocho nucleótidos, o preferiblemente aproximadamente 15 nucleótidos, o más preferiblemente al menos aproximadamente 25 nucleótidos, y puede tener un tamaño mínimo de al menos aproximadamente 40 nucleótidos. Esta definición incluye todos los tamaños en el intervalo de 8-40 nucleótidos así como más de 40 nucleótidos. Por tanto, esta definición incluye ácidos nucleicos de 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 nucleótidos, o ácidos nucleicos que tienen cualquier cantidad de nucleótidos en estos intervalos de valores (por ejemplo, 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121, etc., nucleótidos), o ácidos nucleicos que tienen más de 500 nucleótidos.

"Proteína SGT10166 " o "polipéptido SGT10166 " se refiere a una proteína o polipéptido codificado por el locus SGT10166, variantes o fragmentos del mismo. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y sus equivalentes y no se refiere a una longitud específica del producto; por tanto, se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas en la definición de un polipéptido. Este término tampoco se refiere a, o excluye modificaciones del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, y similares. Se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural. Habitualmente, dichos polipéptidos serán al menos aproximadamente un 50% homólogos a la secuencia SGT10166 nativa, preferiblemente en exceso de aproximadamente un 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% homólogos. También se incluyen proteínas codificadas por ADN que hibridan en condiciones de elevada o baja rigurosidad, con ácidos nucleicos que codifican SGT10166 y polipéptidos o proteínas estrechamente relacionados recuperados por antisueros contra la(s) proteína(s) SGT10166.

El polipéptido SGT10166 puede ser el mostrado en la SEC ID Nº 2 que puede estar en forma aislada y/o purificada, libre o sustancialmente libre de material con el que está asociado de forma natural. El polipéptido puede, si se produce por expresión en una célula procariota o se produce sintéticamente, carecer de procesamiento post-traduccional nativo, tal como glicosilación. Como alternativa, los polipéptidos pueden ser una variante de secuencia, alelo o derivado del polipéptido SGT10166. Dichos polipéptidos pueden tener una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEC ID Nº 2 por uno o más de adición, sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos. Estos polipéptidos variantes pueden tener una función similar a la de SGT10166 de modo que puedan usarse para restaurar la fertilidad o usarse en lugar de genes homólogos. Como alternativa, estos péptidos variantes pueden no retener la función de SGT10166 de modo que puedan usarse como un dominante negativo.

Las variantes de sustitución típicamente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios en la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, tales como estabilidad frente a escisión proteolítica, sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse en base a la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Las sustituciones preferidas son las que son conservativas, es decir, se reemplaza un aminoácido por uno de forma y carga similar. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica y típicamente incluyen sustituciones en los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y tirosina, fenilalanina.

Ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas sustrato o sitios de unión en proteínas que interaccionan con el polipéptido SGT10166. Como es la capacidad de interacción y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de la proteína, pueden hacerse ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica, y su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Al hacer dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de hidrofobicidad de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva en una proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Como alternativa, la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de forma eficaz en base a la hidrofilicidad. La importancia de la hidrofilicidad para conferir una función biológica interactiva de una proteína se entiende generalmente en la técnica (Patente de Estados Unidos 4.554.101). El uso del índice de hidrofobicidad o hidrofilicidad en el diseño de polipéptidos se analiza adicionalmente en la Patente de Estados Unidos 5.691.198.

La longitud de secuencias polipeptídicas comparadas para la homología generalmente será de al menos aproximadamente 16 aminoácidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 restos, típicamente al menos aproximadamente 28 restos, y preferiblemente más de aproximadamente 35 restos.

"Unido de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de su modo pretendido. Por ejemplo, un promotor está unido de forma operativa a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripción o expresión.

"Sondas". Las sondas para alelos SGT10166 pueden obtenerse de las secuencias de la región SGT10166, su ADNc, secuencias funcionalmente equivalentes, o los complementos de las mismas. Las sondas pueden ser de cualquier longitud adecuada, que abarque todo o una parte de la región SGT10166, y que permita la hibridación específica con la región. Si la secuencia diana contiene una secuencia idéntica a la de la sonda, las sondas pueden ser cortas, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 8-30 pares de bases, ya que el híbrido será relativamente estable en condiciones de rigurosidad uniformes. Si se espera algún grado de desapareamiento con la sonda, es decir, si se sospecha que la sonda hibridará con una región variante, puede emplearse una sonda más larga que hibride con la secuencia diana con la especificidad necesaria.

Las sondas incluirán un polinucleótido aislado unido a un marcador o molécula informadora y pueden usarse para aislar otras secuencias polinucleotídicas, que tienen similitud de secuencia por procedimientos convencionales. Para las técnicas de preparación y marcaje de sondas véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) o Ausubel y col. (1992). Pueden seleccionarse otros polinucleótidos similares usando polinucleótidos homólogos. Como alternativa, pueden sintetizarse o seleccionarse polinucleótidos que codifiquen éstos o polipéptidos similares por el uso de la redundancia del código genético. Pueden introducirse diversas sustituciones de codones, por ejemplo, por cambios silenciosos (produciendo de este modo diversos sitios de restricción) o para optimizar la expresión para un sistema particular. Las mutaciones pueden introducirse para modificar las propiedades del polipéptido, quizá para cambiar la velocidad de degradación o renovación del polipéptido.

Las sondas que comprenden oligonucleótidos sintéticos u otros polinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse de polinucleótidos mono o bicatenarios de origen natural o recombinantes, o pueden sintetizarse químicamente. Las sondas también pueden marcarse por traslación de mellas, reacción de relleno de Klenow, u otros procedimientos conocidos en la técnica.

Se prefieren como sondas partes de la secuencia polinucleotídica que tienen al menos aproximadamente ocho nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos, y menos de aproximadamente 9 kb, habitualmente menos de aproximadamente 1,0 kb, de una secuencia polinucleotídica que codifica SGT10166. Por lo tanto, esta definición incluye sondas de tamaños de 8 nucleótidos a 9000 nucleótidos. Por tanto, este definición incluye sondas de 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400 ó 500 nucleótidos o sondas que tienen cualquier cantidad de nucleótidos en estos intervalos de valores (por ejemplo, 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121, etc., nucleótidos), o sondas que tienen más de 500 nucleótidos. Las sondas también pueden usarse para determinar si el ARNm que codifica SGT10166 está presente en una célula o tejido.

También se pueden aplicar consideraciones y longitudes de nucleótidos similares para los cebadores que pueden usarse para la amplificación de todo o parte del gen SGT10166. Por tanto, una definición de cebadores incluye cebadores de 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 nucleótidos, o cebadores que tienen cualquier cantidad de nucleótidos en estos intervalos de valores (por ejemplo, 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121, etc. nucleótidos), o cebadores que tienen más de 500 nucleótidos, o cualquier cantidad de nucleótidos entre 500 y 9000. Los cebadores también pueden usarse para determinar si el ARNm que codifica SGT10166 está presente en una célula o tejido.

"Purificación de proteínas" se refiere a diversos procedimientos para el aislamiento de los polipéptidos SGT10166 de otro material biológico, tal como de células transformadas con ácidos nucleicos recombinantes que codifican SGT10166, y son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden purificarse por cromatografía de inmunoafinidad empleando, por ejemplo, anticuerpos preparados contra SGT10166 usando técnicas convencionales. Se conocen bien en la técnica diversos procedimientos de purificación de proteínas, e incluyen los descritos en Deutscher (1990) y Scopes (1982).

Las expresiones "aislado", "sustancialmente puro", y "sustancialmente homogéneo" se usan de forma intercambiable para describir una proteína o polipéptido que se ha separado de componentes que lo acompañan en su estado natural. Una proteína monomérica está sustancialmente pura cuando al menos aproximadamente del 60 al 75% de una muestra presenta una única secuencia polipeptídica. Una proteína sustancialmente pura típicamente comprenderá aproximadamente del 60 al 90% P/P de una muestra proteica, más habitualmente aproximadamente el 95%, y preferiblemente será más de aproximadamente el 99% pura. La pureza u homogeneidad proteica puede indicarse por varios medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra proteica, seguido de visualización de una única banda polipeptídica después de tinción del gel. Para ciertos propósitos, puede proporcionarse mayor resolución usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica que se utilizan para la purificación.

Una proteína SGT10166 está sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural cuando está separada de los contaminantes nativos que la acompañan en su estado natural. Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de forma natural estará sustancialmente libre de sus componentes asociados de forma natural. Una proteína también puede volverse sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica.

Un polipéptido producido como un producto de expresión de una secuencia genética aislada y manipulada es un "polipéptido aislado", como se usa en este documento, incluso si se expresa en un tipo celular homólogo. Las formas o moléculas fabricadas sintéticamente expresadas por células heterólogas son moléculas inherentemente aisladas.

"Ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico que no es de origen natural, o que se prepara por combinación artificial de dos segmentos de secuencia de otro modo separados. Esta combinación artificial a menudo se consigue por medios de síntesis química, o por manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética. Esto se hace habitualmente para unir juntos segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones. Como alternativa, se realiza para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o uno conservativo, introduciendo típicamente al mismo tiempo o retirando un sitio de reconocimiento de secuencia.

"Secuencias reguladoras" se refiere a aquellas secuencias normalmente en 100 kb de la región codificante de un locus, pero también pueden estar más distantes de la región codificante, o pueden localizarse en intrones del gen, que afectan a la expresión del gen (incluyendo transcripción del gen, y traducción, corte y empalme, estabilidad o similares del ARN mensajero).

"Homología, similitud o identidad sustancial". Un ácido nucleico o fragmento del mismo es "sustancialmente homólogo" ("o sustancialmente similar") a otro si, cuando se alinean de forma óptima (con inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas) con el otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 60% de las bases nucleotídicas, habitualmente al menos aproximadamente el 70%, más habitualmente al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95-98% de las bases nucleotídicas.

Identidad significa el grado de relación de secuencia entre dos secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas determinado por la identidad del apareamiento entre dos cadenas de dichas secuencias. La identidad puede calcularse fácilmente. Aunque existen varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, el término "identidad" es bien conocido para los especialistas en la técnica (Computational Molecular Biology, Lesk AM, ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith DW, ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin AM y Griffin HG, eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G, Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov M y Devereux J, eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Los procedimientos habitualmente empleados para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, aunque sin limitación los descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo y Lipman (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar el mayor apareamiento entre las dos secuencias ensayadas. Dichos procedimientos están codificados en programas informáticos. Los procedimientos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, aunque sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux y col. (1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul y col. (1990); Altschul y col. (1997)).

Como alternativa, existe homología sustancial o (similitud o identidad) cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo hibrida con otro ácido nucleico (o una cadena complementaria del mismo) en condiciones de hibridación selectivas, con una cadena, o con su complemento. Existe selectividad de hibridación cuando sucede una hibridación que es sustancialmente más selectiva que la ausencia total de especificidad. Típicamente, la hibridación selectiva sucederá cuando haya al menos aproximadamente un 55% de homología sobre un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente un 65%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 90%. Véase, Kanehisa (1984). La longitud de la comparación de homología, como se describe, puede ser sobre tramos más largos, y en ciertas realizaciones a menudo será sobre un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos.

La hibridación de ácido nucleico estará afectada por condiciones tales como concentración salina, temperatura, o disolventes orgánicos, además de la composición de bases, longitud de las cadenas complementarias, y la cantidad de desapareamientos de bases nucleotídicas entre los ácidos nucleicos de hibridación, como apreciarán fácilmente los especialistas en la técnica. Las condiciones de temperatura rigurosas generalmente incluyen temperaturas en exceso de 30ºC, típicamente en exceso de 37ºC, y preferiblemente en exceso de 45ºC. Las condiciones salinas rigurosas habitualmente serán menos de 1000 mM, típicamente menos de 500 mM, y preferiblemente menos de 200 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Las condiciones de rigurosidad dependen de la longitud del ácido nucleico y la composición de bases del ácido nucleico y pueden determinarse por técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968).

Las secuencias de sonda también pueden hibridar específicamente con ADN dúplex en ciertas condiciones para formar tríplex u otros complejos de ADN de mayor orden. La preparación de dichas sondas y condiciones de hibridación adecuadas son bien conocidas en la técnica.

Las expresiones "homología sustancial" o "identidad sustancial", cuando se hace referencia a polipéptidos, indican que el polipéptido o proteína en cuestión muestra al menos aproximadamente un 30% de identidad con una proteína de origen natural completa o una parte de la misma, habitualmente al menos aproximadamente un 70% de identidad, más habitualmente al menos aproximadamente un 80% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad.

La homología, para polipéptidos, se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia. Véase, por ejemplo, el Paquete de Software de Análisis de Secuencia de Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, así como el software descrito anteriormente con referencia a la homología de ácidos nucleicos. El software de análisis de proteínas establece correspondencias entre secuencias similares usando medidas de homología asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen sustituciones en los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

"Función sustancialmente similar" se refiere a la función de un ácido nucleico modificado o una proteína modificada, con referencia al ácido nucleico SGT10166 de tipo silvestre o el polipéptido SGT10166 de tipo silvestre. El polipéptido modificado será sustancialmente homólogo al polipéptido SGT10166 de tipo silvestre y tendrá sustancialmente la misma función. El polipéptido modificado puede tener una secuencia de aminoácidos alterada y/o puede contener aminoácidos modificados. Además de la similitud de función, el polipéptido modificado puede tener otras propiedades útiles, tales como semi-vida más larga. La similitud de función (actividad) del polipéptido modificado puede ser sustancialmente igual que la actividad del polipéptido SGT10166 de tipo silvestre. Como alternativa, la similitud de función (actividad) del polipéptido modificado puede ser mayor que la actividad del polipéptido SGT10166 de tipo silvestre. El polipéptido modificado se sintetiza usando técnicas convencionales, o está codificado por un ácido nucleico modificado y se produce usando técnicas convencionales. El ácido nucleico modificado se prepara por técnicas convencionales. Un ácido nucleico con una función sustancialmente similar a la función del gen SGT10166 de tipo silvestre produce la proteína modificada descrita anteriormente.

Un "fragmento", "parte" o "segmento" polipeptídico es un tramo de restos aminoacídicos de al menos aproximadamente cinco a siete aminoácidos contiguos, a menudo al menos aproximadamente siete a nueve aminoácidos contiguos, típicamente al menos aproximadamente nueve a 13 aminoácidos contiguos y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 20 a 30 o más aminoácidos contiguos.

Los polipéptidos de la presente invención, si son solubles, pueden acoplarse a un soporte en fase sólida, por ejemplo, nitrocelulosa, nylon, materiales de relleno de columna (por ejemplo, perlas de Sepharose), perlas magnéticas, lana de vidrio, plástico, metal, geles poliméricos, células, u otros sustratos. Dichos soportes pueden tener forma, por ejemplo, de perlas, pocillos, varillas, o membranas.

"Región diana" se refiere a una región del ácido nucleico que se amplifica y/o detecta. La expresión "secuencia diana" se refiere a una secuencia con la que una sonda, un cebador o una molécula antisentido formará un híbrido estable en condiciones deseadas.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante y genética. Véase, por ejemplo, Maniatis y col. (1982); Sambrook y col. (1989); Ausubel y col. (1992); Glover (1985); Anand (1992); Guthrie y Fink (1991); Weissbach y Weissbach (1986); Zaitlin y col. (1985) y Gelvin y col. (1990).

Procedimientos de Uso: Preparación de Ácidos Nucleicos Recombinantes o Sintetizados Químicamente; Vectores, Transformación, Células Huésped

Pueden producirse grandes cantidades de los polinucleótidos de la presente invención por replicación en una célula huésped adecuada. Se incorporarán fragmentos polinucleotídicos naturales o sintéticos que codifican un fragmento deseado en construcciones polinucleotídicas recombinantes, habitualmente construcciones de ADN, con capacidad de introducción en y replicación en una célula procariota o eucariota. Habitualmente, las construcciones polinucleotídicas serán adecuadas para la replicación en un huésped unicelular, tal como levaduras o bacterias, pero también puede pretenderse para la introducción en (con y sin integración en el genoma) líneas celulares cultivadas de mamífero o vegetales u otros eucariotas. La purificación de ácidos nucleicos producidos por los procedimientos de la presente invención se describe, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) o Ausubel y col. (1992).

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden producirse por síntesis química, por ejemplo, por el procedimiento de fosforamidita descrito por Beaucage y Caruthers (1981) o el procedimiento de triéster de acuerdo con Matteucci y Caruthers (1981) y puede realizarse en sintetizadores automatizados de oligonucleótidos, comerciales. Puede obtenerse un fragmento bicatenario a partir del producto monocatenario de síntesis química sintetizando la cadena complementaria e hibridando la cadena junta en condiciones apropiadas o añadiendo la cadena complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.

Las construcciones polinucleotídicas preparadas para la introducción en un huésped procariota o eucariota pueden comprender un sistema de replicación reconocido por el huésped, incluyendo el fragmento polinucleotídico pretendido que codifica el polipéptido deseado, y preferiblemente también incluirá secuencias de regulación del inicio de la transcripción y la traducción unidas de forma operativa al segmento que codifica el polipéptido. Los vectores de expresión pueden incluir, por ejemplo, un origen de replicación o secuencia de replicación autónoma (ARS) y secuencias de control de la expresión, un promotor, un potenciador y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias de estabilización del ARNm. Dichos vectores pueden prepararse mediante técnicas recombinantes convencionales bien conocidas en la técnica y analizadas, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) o Ausubel y col. (1992).

Se seleccionará un promotor apropiado y otras secuencias de vector necesarias para que sean funcionales en el huésped, y pueden incluir, cuando sea apropiado, las asociadas de forma natural con el gen SGT10166. Se describen ejemplos de combinaciones factibles de líneas celulares y vectores de expresión en Sambrook y col. (1989) o Ausubel y col. (1992); véase también, por ejemplo, Metzger y col. (1988). Se conocen muchos vectores útiles en la técnica y pueden obtenerse de proveedores tales como Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech, y otros. Pueden usarse promotores tales como los promotores trp, lac y promotores fágicos, promotores de ARNt y promotores de enzimas glicolíticas en huéspedes procariotas. Los promotores de levaduras útiles incluyen regiones promotoras para la metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas tales como la enolasa o gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa, y otros. Se describen vectores y promotores adecuados para su uso en expresión de levaduras adicionalmente en Hitzeman y col., documento EP 73.675A. Los promotores de mamíferos no nativos apropiados pueden incluir los promotores temprano y tardío de SV40 (Fiers y col., 1978) o promotores derivados del virus de la leucemia Molony murina, virus de tumores de ratones, virus de sarcomas de aves, adenovirus II, virus del papiloma bovino o polioma. Pueden obtenerse promotores de insectos de baculovirus. Además, la construcción puede unirse a un gen amplificable (por ejemplo, DHFR) de modo que puedan fabricarse múltiples copias del gen. Para un potenciador apropiado y otras secuencias de control de la expresión, véase también Enhancers and Eukaryotic Gene Expresion. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1983). Véanse también, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.691.198; 5.735.500; 5.747.469 y 5.436.146. Se describen secuencias de control vegetales en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.106.739; 5.322.938; 5.710.267; 5.268.526 y 5.290.294.

Aunque dichos vectores de expresión pueden replicarse de forma autónoma, también pueden replicarse insertándose en el genoma de la célula huésped, por procedimientos bien conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión y clonación probablemente contendrán un marcador de selección, un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula huésped transformada con el vector. La presencia de este gen asegura el crecimiento de solamente las células huésped que expresen los insertos. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras sustancias tóxicas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato, etc., (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa en bacilos. La elección del marcador de selección apropiado dependerá de la célula huésped, y se conocen bien en la técnica marcadores apropiados para diferentes huéspedes.

Los vectores que contienen los ácidos nucleicos de interés pueden transcribirse in vitro, y el ARN resultante puede introducirse en la célula huésped por procedimientos bien conocidos, por ejemplo, por inyección (véase, Kubo y col., 1988), o los vectores pueden introducirse directamente en células huésped por procedimientos bien conocidos en la técnica, que varían dependiendo del tipo de huésped celular, incluyendo electroporación; transfección empleando cloruro cálcico, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; infección (donde el vector es un agente infeccioso, tal como un genoma viral); y otros procedimientos. Véase en líneas generales, Sambrook y col. (1989) y Ausubel y col. (1992). La introducción de los polinucleótidos en la célula huésped por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, los descritos anteriormente, se mencionarán en este documento como "transformación". Se entiende que las células en las que se han introducido los ácidos nucleicos descritos anteriormente también incluyen la descendencia de dichas células.

Pueden prepararse grandes cantidades de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la presente invención expresando el ácido nucleico SGT10166 o partes del mismo en vectores u otros vehículos de expresión en células huésped procariotas o eucariotas compatibles. Los huéspedes procariotas más habitualmente usados son cepas de Escherichia coli, aunque también pueden usarse otros procariotas, tales como Bacillus subtilis o Pseudomonas.

También pueden ser útiles células huésped de mamífero u otras células eucariotas, tales como las de levaduras, hongos filamentosos, plantas, insectos, o especies de anfibios o aves, para la producción de las proteínas de la presente invención. La propagación de células de mamífero en cultivo es per se bien conocida. Véase, Jakoby y Pastan (eds.) (1979). Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero habitualmente usadas son células VERO y HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), y las líneas celulares WI38, BHK, y COS, aunque los especialistas en la técnica apreciarán que pueden ser apropiadas otras líneas celulares, por ejemplo, para proporcionar mayor expresión, patrones de glicosilación deseables, u otras características. Un ejemplo de una línea celular de insecto habitualmente usada es SF9.

Los clones se seleccionan usando marcadores dependiendo del modo de construcción del vector. El marcador puede estar en la misma molécula de ADN o una diferente, preferiblemente la misma molécula de ADN. En huéspedes procariotas, el transformante puede seleccionarse, por ejemplo, por resistencia a ampicilina, tetraciclina u otros antibióticos. La producción de un producto particular en base a la sensibilidad de temperatura también puede servir como un marcador apropiado.

Las células procariotas o eucariotas transformadas con los polinucleótidos de la presente invención serán útiles no sólo para la producción de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la presente invención, sino también, por ejemplo, para estudiar las características de polipéptidos SGT10166.

Las sondas y cebadores basados en la secuencia génica de SGT10166 descrita en este documento se usan para identificar secuencias génicas y proteínas homólogas a SGT10166 en otras especies. Estas secuencias génicas y proteínas se usan en el diagnóstico/pronóstico, tal como predicción del fenotipo reproductor en plantas transgénicas y procedimientos de ingeniería genérica descritos en este documento para las especies de las que se han aislado.

Procedimientos de Uso: Control de la Dehiscencia Reproductora

Los vectores usados para transformar células vegetales comprenden un ácido nucleico SGT10166 o ácido nucleico homólogo o parte del mismo que sea capaz de hibridar con el gen endógeno homólogo al gen SGT10166 de Arabidopsis. Para propósitos de descripción, la invención se describirá con referencia al gen SGT10166 y la proteína SGT10166. Se entiende que dicha referencia también incluye genes y proteínas homólogos. Por tanto, dichos ácidos nucleicos incluyen la cadena positiva del gen SGT10166 u homólogo que codifica todo o parte de una proteína y la cadena antisentido. En cualquier caso, el ácido nucleico SGT10166 u homólogo o su transcrito es capaz de hibridar con un gen endógeno definido en este documento o su transcrito. Las condiciones en las que sucede dicha hibridación incluyen las condiciones fisiológicas o equivalentes encontradas en células vegetales incluyendo las encontradas en el núcleo y el citoplasma así como condiciones estándar in vitro normalmente usadas por los especialistas en la técnica para determinar la homología de secuencia como entre dos ácidos nucleicos. Dichas condiciones in vitro varían de condiciones de rigurosidad moderada (aproximadamente 5 x SSC a 52ºC) a elevada (aproximadamente 0,1 x SSC a 65ºC).

El gen SGT10166 u homólogo se usa para construir vectores con sentido o antisentido para transformar células vegetales. La construcción de dichos vectores está facilitada por el uso de un vector binario que tiene capacidad de manipulación y selección tanto en una planta como en un huésped de clonación conveniente tal como un procariota. Por tanto, dicho vector binario puede incluir un gen de resistencia a kanamicina o herbicida para la selección en células vegetales y un gen de resistencia a actinomicina para la selección en un huésped bacteriano. Dichos vectores, por supuesto, también contienen un origen de replicación apropiado para el huésped procariota usado, y preferiblemente al menos un sitio de restricción único o un poliengarce que contiene sitios de restricción únicos para facilitar la construcción del vector.

En una realización, se usa un promotor constitutivo para dirigir la expresión del ácido nucleico SGT10166 en al menos una parte de los tejidos reproductores en la planta receptora. Un promotor particularmente preferido es el promotor del transcrito 35S del virus del mosaico de la coliflor (Guilley y col., 1982; Odell y col., 1985; y Saunders y col., 1987). Sin embargo, pueden usarse otros promotores constitutivos, tales como los promotores de la \alpha-1 y \beta-1 tubulina (Silflow y col., 1987) y los promotores de histona (Chaubet y col., 1987). También pueden usarse promotores específicos de tejido. Por ejemplo, el promotor "endógeno" del gen SGT10166 puede usarse para dirigir la expresión de transgenes antisentido o dominantes negativos en la región donde se expresa el gen de tipo silvestre.

En una realización adicional de la invención, el vector usado para transformar la célula vegetal para producir una planta que tenga un fenotipo de dehiscencia alterado se construye para dirigir la inserción del ácido nucleico SGT10166 uhomólogo en un promotor endógeno en una célula vegetal. Un tipo de vector que puede usarse para dirigir la integración de un ácido nucleico SGT10166 uhomólogo a un promotor endógeno comprende un vector de selección positiva-negativa análogo al expuesto por Monsour y col. (1988), que describe la dirección de ADN exógeno a un locus endógeno predeterminado en células ES de mamífero. Pueden diseñarse fácilmente construcciones similares utilizando marcadores de selección positiva y negativa funcionales en células vegetales en base a la identificación del promotor vegetal endógeno y la secuencia que lo rodea (Kempin y col., 1997). Cuando se usa dicho enfoque, se prefiere que se use un vector tipo reemplazamiento para minimizar la probabilidad de reversión al fenotipo de tipo silvestre.

Los vectores de la invención se diseñan de modo que la secuencia promotora contenida en el vector o la secuencia promotora dirigida en el genoma de la célula vegetal esté unida de forma operativa al ácido nucleico que codifica el gen SGT10166 uhomólogo. Cuando se usa la cadena positiva del gen SGT10166 o gen homólogo para expresar todo o parte de la proteína SGT10166, la expresión "unido de forma operativa" significa que la secuencia promotora se coloca con relación a la secuencia codificante del ácido nucleico agamous de modo que la ARN polimerasa sea capaz de iniciar la transcripción del ácido nucleico SGT10166 a partir de la secuencia promotora. En dichas realizaciones también se prefiere proporcionar sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias de poliadenilación apropiadas para producir un transcrito de ARN funcional que pueda traducirse en la proteína SGT10166. Cuando se usa una orientación antisentido del ácido nucleico SGT10166, todo lo que se requiere es que el promotor esté unido de forma operativa para transcribir la cadena antisentido de SGT10166. Por tanto, en dichas realizaciones, solamente se necesitan secuencias de inicio y terminación de la transcripción para proporcionar un transcrito de ARN capaz de hibridar con el ARNm u otro transcrito de ARN a partir del gen SGT10166 endógeno. Además de promotores, pueden añadirse otras secuencias de regulación de la expresión, tales como potenciadores, al vector para facilitar la expresión del ácido nucleico SGT10166
in vivo.

Una vez construido un vector, la transformación de las plantas puede realizarse de acuerdo con la invención por esencialmente cualquiera de los diversos procedimientos de transformación conocidos para los especialistas en la técnica de biología molecular vegetal. Dichos procedimientos se describen en líneas generales en Wu y Grossman (1987). Como se usa en este documento, el término "transformación" significa la alteración del genotipo de una célula vegetal por la introducción de una secuencia de ácido nucleico. Los procedimientos particulares para la transformación de células vegetales incluyen la microinyección directa del ácido nucleico en una célula vegetal por el uso de micropipetas. Como alternativa, el ácido nucleico puede transferirse en una célula vegetal usando polietilenglicol (Paszkowski y col., 1984). Otros procedimientos de transformación incluyen electroporación de protoplastos (Fromm y col., 1985); infección con un virus específico de plantas, por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (Hohn y col., 1982) o el uso de secuencias de transformación de bacterias específicas de plantas tales como Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, un plásmido Ti transmitido a una célula vegetal después de infección por Agrobacterium tumefaciens (Horsch y col., 1984; Fraley y col., 1983). Como alternativa, las células vegetales pueden transformarse por introducción del ácido nucleico contenido en la matriz o en la superficie de pequeñas perlas o partículas mediante penetración balística de elevada velocidad de la célula vegetal (Klein y col., 1987). El ácido nucleico introducido con balística puede ser un oligonucleótido quimérico diseñado para dirigir una pequeña cantidad de bases mutadas a un segmento seleccionado del gen SGT10166 endógeno o gen homólogo (Beetham y col., 1999). También puede introducirse una pequeña cantidad de bases mutadas en un segmento seleccionado del gen SGT10166 endógeno usando recombinación homóloga (Kempin y col., 1997).

Después de que el vector se haya introducido en una célula vegetal, la selección de la transformación exitosa se realiza típicamente antes de la regeneración de una planta. Dicha selección de la transformación no es necesaria, pero facilita la selección de plantas regeneradas que tienen el fenotipo deseado reduciendo el fondo de tipo silvestre. Dicha selección se basa convenientemente en genes de resistencia a antibióticos y/o de resistencia a herbicidas que pueden incorporarse en el vector de transformación.

Prácticamente todas las plantas pueden regenerase a partir de células o tejidos cultivados. Como se usa en este documento, el término "regeneración" se refiere al cultivo de una planta completa a partir de una célula vegetal, un grupo de células vegetales o una parte de la planta. Los procedimientos para la regeneración de plantas son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, la regeneración a partir de protoplastos cultivados se describe por Evans y col. (1983); y H. Binding (1985). Cuando la transformación es de una parte de un órgano, la regeneración puede ser a partir de callos vegetales, explantes, órganos o partes. Dichos procedimientos para la regeneración también son conocidos para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Wu y Grossman (1987); Weissbach y Weissbach (1986); y Klee y col. (1987).

Una vez que las plantas se han regenerado, se seleccionan una o más plantas en base al cambio en el fenotipo de dehiscencia. Dicha selección puede ser por observación visual de los cambios morfológicos grandes en la estructura del fruto, por ejemplo, fallo de la vaina de semillas en abrirse, por observación en un cambio en la inflorescencia o por observación en cambios en la estructura microscópica del fruto, por ejemplo, por microscopía electrónica y similares.

En casos en los que se confiere un fenotipo dominante después de la transformación con un vector que contiene un ácido nucleico SGT10166, la alteración en la dehiscencia puede provocar posiblemente una planta estéril. En dichos casos, la planta puede propagarse de forma asexual cultivando esquejes o por técnicas de cultivo tisular para producir múltiples plantas idénticas. Como alternativa, la alteración en la dehiscencia puede eliminarse cuando se desee como se describe adicionalmente en este documento.

Cuando la planta transformada se caracteriza por un fenotipo recesivo, por ejemplo, cuando se usa una construcción antisentido que es insuficiente para conferir el fenotipo deseado o que confiere un fenotipo intermedio que no provoca una planta que muestre indehiscencia, dichas plantas transformadas pueden reproducirse por endogamia a homocigosidad para obtener el fenotipo deseado. Dichas plantas después pueden propagarse de forma asexual o la alteración en la dehiscencia puede eliminarse cuando se desee como se describe adicionalmente en este documento.

Los mecanismos antisentido o de co-supresión usando ácidos nucleicos SGT10166 pueden provocar dehiscencia alterada. Las plantas que tienen dichos fenotipos de dehiscencia modificados pueden usarse como sistemas modelo para estudiar adicionalmente la formación y diferenciación de los tejidos de los frutos en plantas.

Procedimientos de Uso: Secuencias Reguladoras para Transformación de Plantas

Se describe una molécula de ADN que comprende secuencias reguladoras del gen SGT10166 unidas de forma operativa a uno o más genes o ADN antisentido. La secuencia genómica completa para Arabidopsis se ha clonado y determinado. En base a la secuencia genómica para SGT10166 descrita en este documento, las secuencias promotoras y/o potenciadoras y/o de terminación pueden determinarse fácilmente examinando las secuencias genómicas en GenBank. Las secuencias reguladoras pueden ser el promotor de SGT10166, secuencias intrónicas o secuencias de terminación. El promotor de SGT10166 comienza en el inicio del exón 1 de la SEC ID Nº 3 y se extiende cadena arriba en aproximadamente 2 kb de secuencia. Al menos una secuencia reguladora se encuentra en el intrón 1. El gen o ADN antisentido aporta un rasgo agronómicamente útil o marcador de selección a una planta transformada. En una realización, la molécula de ADN incluye el promotor de SGT10166 y una secuencia de nucleótidos adicional que influye en la expresión génica. Los ejemplos de secuencias de nucleótidos que influyen en la regulación de genes heterólogos incluyen potenciadores o regiones activadoras, tales como las derivadas de CaMV 35S, genes de la opina sintasa u otros genes vegetales (Patentes de Estados Unidos Nº 5.106.739; 5.322.938; 5.710.267; 5.268.526; 5.290.294). En una segunda realización, se usa un promotor tal como el promotor CaMV 35S con secuencias reguladoras, tales como secuencias intrónicas o secuencias de terminación de SGT10166. En una tercera realización, se inserta un intrón de SGT10166 en una molécula de ADN que se usará para transformar plantas como un medio para seleccionar o identificar fácilmente tejido transformado en presencia de bacterias transformantes. En una cuarta realización, la molécula de ADN es parte de un vector de expresión. En una quinta realización, la molécula de ADN es parte de un vector de transformación.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan células y tejidos vegetales transformados, plantas y semillas transformadas de plantas transformadas. La expresión del gen o ADN antisentido se regula por las secuencias reguladoras de SGT10166 y secuencias reguladoras adicionales, si están presentes.

Mediante la presente invención, pueden unirse genes agronómicos y genes marcadores de selección de forma operativa a secuencias reguladoras de SGT10166 y expresarse en plantas transformadas. Más particularmente, las plantas pueden modificarse por ingeniería genética para expresar diversos fenotipos de interés agronómico. Dichos genes incluían, aunque sin limitación, los descritos en este documento.

1. Genes Que Confieren Resistencia o Tolerancia a Plagas o Enfermedades

(A) Genes de resistencia a enfermedades vegetales. Las defensas vegetales a menudo se activan por interacción específica entre el producto de un gen de resistencia a enfermedades (R) en la planta y el producto de un gen de avirulencia (Avr) correspondiente en el patógeno. Una diversidad de plantas se puede transformar con genes de resistencia clonados para diseñar plantas que sean resistentes a cepas patógenas específicas. Los ejemplos de dichos genes incluyen, el gen Cf-9 del tomate para resistencia a Cladosporium fulvum (Jones y col., 1994), el gen Pto del tomate, que codifica una proteína quinasa, para resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin y col., 1993), y el gen RSSP2 de Arabidopsis para resistencia a Pseudomonas syringae (Mindrinos y col., 1994).

(B) Una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de la misma o un polipéptido sintético modelado sobre la misma, tal como, una secuencia de nucleótidos de un gen de la Bt \delta-endotoxina (Geiser y col., 1986). Además, las moléculas de ADN que codifican genes de la \delta-endotoxina pueden adquirirse de la American Type Culture Collection (Rockville, MD), con los números de acceso a la ATCC 40098, 67136, 31995 y 31998.

(C) Una lectina, tal como las secuencias de nucleótidos de varios genes de lectina de unión a manosa de Clivia miniata (Van Damme y col., 1994).

(D) Una proteína de unión a vitaminas, tal como avidina y homólogos de avidina que son útiles como larvicidas contra plagas de insectos. Véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.659.026.

(E) Un inhibidor enzimático, por ejemplo, un inhibidor de proteasa o un inhibidor de amilasa. Los ejemplos de dichos genes incluyen un inhibidor de la cisteína proteinasa del arroz (Abe y col., 1987), un inhibidor de la proteinasa I del tabaco (Huub y col., 1993), y un inhibidor de la \alpha-amilasa (Sumitani y col., 1993).

(F) Un péptido o neuropéptido específico para insectos que, después de su expresión, altera la fisiología de la plaga afectada. Los ejemplos de dichos genes incluyen, un receptor de la hormona diurética de insectos (Reagan, 1994), una alostatina identificada en Diploptera puntata (Pratt, 1989), neurotoxinas paralíticas específicas de insecto (Patente de Estados Unidos Nº 5.266.361).

(G) Un veneno específico de insecto producido en la naturaleza por una serpiente, una avispa, etc., tal como, un péptido de escorpión tóxico para los insectos (Pang, 1992).

(H) Una enzima responsable de una hiperacumulación de un monoterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no proteica con actividad insecticida.

(I) Una enzima implicada en la modificación, incluyendo la modificación post-traduccional, de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, enzima glicolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una quinasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quitinasa y una glucanasa, sea natural o sintética. Los ejemplos de dichos genes incluyen, un gen callas (solicitud publicada PCT WO 93/02197), secuencias codificantes de quitinasa (que pueden obtenerse, por ejemplo, de la ATCC con los números de acceso 3999637 y 67152), quitinasa del gusano del tabaco (Kramer y col., 1993) y el gen de la poliubiquitina ubi4-2 del perejil (Kawalleck y col., 1993).

(J) Una molécula que estimula la transducción de señales. Los ejemplos de dichas moléculas incluyen secuencias de nucleótidos para clones de ADNc de la calmodulina del fríjol chino (Botella y col., 1994), una secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de la calmodulina del maíz (Griess y col., 1994).

(K) Un péptido de momento hidrófobo. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.659.026 y 5.607.914, la última muestra péptidos antimicrobianos sintéticos que confieren resistencia a enfermedades.

(L) Una permeasa de membrana, un formador de canales o un bloqueante de canales, tal como, un análogo del péptido cecropin-\beta lítico (Jaynes y col., 1993) que vuelve a las plantas de tabaco transgénicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

(M) Una proteína viral o un polipéptido complejo derivado de la misma. Por ejemplo, la acumulación de proteínas de envuelta viral en células vegetales transformadas confiere resistencia a infección viral y/o al desarrollo de la enfermedad provocada por el virus del que deriva el gen de la proteína de envuelta, así como por virus relacionados. La resistencia mediada por proteínas de envuelta se ha conferido a plantas transformadas contra el virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico del pepino, virus del estriado del tabaco, virus X de la patata, virus Y de la patata, virus del grabado del tabaco, virus del cascabel del tabaco y virus del mosaico del tabaco. Véase, por ejemplo, Beachy y col. (1990).

(N) Un anticuerpo específico de insectos o una inmunotoxina derivada del mismo. Por tanto, un anticuerpo dirigido a una función metabólica crítica en el intestino del insecto inactivaría una enzima afectada, matando al insecto. Por ejemplo, Taylor y col. (1994) muestra la inactivación enzimática en tabaco transgénico mediante la producción de fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla.

(O) Un anticuerpo específico de virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki y col. (1993), que muestra que plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpos recombinantes están protegidas del ataque del virus.

(P) Una proteína de detención del desarrollo producida en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Por tanto, las endo \alpha-1,4-D poligalacturonasas fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes vegetales solubilizando la homo-\alpha-1,4-D-galacturonasa de la pared de la célula vegetal (Lamb y col., 1992). La clonación y caracterización de un gen que codifica una proteína que inhibe la endopoligalacturonasa de la alubia se describe por Toubart y col. (1992).

(Q) Una proteína de detención del desarrollo producida en la naturaleza por una planta, tal como el gen de inactivación de ribosomas de la cebada, ha aumentado la resistencia a enfermedades fúngicas (Longemann y col.,
1992).

2. Genes Que Confieren Resistencia o Tolerancia a un Herbicida

(A) Un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tal como una imidazalinona o una sulfonilurea. Los genes ejemplares en esta categoría codifican la enzima ALS (Lee y col., 1988) y AHAS (Miki y col., 1990) mutantes.

(B) Glifosato (resistencia conferida por la EPSP sintasa mutante y los genes aroA) y otros compuestos fosfono tales como glufosinato (genes PAT y bar), y ácidos piridinoxi o fenoxi propiónicos y ciclohexonas (genes que codifican el inhibidor de ACCasa). Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 4.940.835, que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSP sintasa que puede conferir resistencia a glifosato. Puede obtenerse una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante en el número de acceso a la ATCC 39256, y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se describe en la Patente de Estados Unidos 4.769.061. La Solicitud de Patente Europea Nº 0 333 033 y la Patente de Estados Unidos 4.975.374 describen secuencias de nucleótidos de genes de la glutamina sintasa que confieren resistencia a herbicidas tales como L-fosfinotricina. Se proporciona la secuencia de nucleótidos de un gen de la fosfinotricin acetiltransferasa en la Solicitud Europea Nº 0 242 246. De Greef y col. (1989) describe la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad fosfinotricin acetiltransferasa. Los genes ejemplares que confieren resistencia a ácidos fenoxipropriónicos y ciclohexonas, tales como setoxidim y haloxifop, son los genes Acc1-S1, Acc1-S2 y Acc1-S3 descritos por Marshall y col.
(1992).

(C) Un herbicida que inhibe la fotosíntesis, tal como una triazina (genes psbA y GST) y un benzonitrilo (gen de la nitrilasa). Przibilla y col. (1991) describe el uso de plásmidos que codifican genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. Se describen secuencias de nucleótidos para los genes de la nitrilasa en la Patente de Estados Unidos 4.810.648, y moléculas de ADN que contienen estos genes están disponibles en los números de acceso a la ATCC 53435, 67441 y 67442. La clonación y expresión de ADN que codifica GST (glutatión S-transferasa) se describe por Hayes y col. (1992).

3. Genes que Confieren Resistencia o Tolerancia a Estrés Medioambiental

(A) Frío, congelación o escarcha. Esto incluye genes que codifican proteínas que protegen de la congelación y enzimas que sintetizan solutos crioprotectores. Ejemplos de dichos genes son COR15a de Arabidopsis (Artus y col., 1996) y CAP160 de la espinaca (Kaye y col., 1998). También en esta categoría están los genes reguladores que controlan la actividad de otros genes de tolerancia al frío (Publicación Internacional PCT Número WO 98/09521).

(B) Estrés por sequía o estrés por agua. Kasuga y col. (1999) informan de cómo la expresión inducible por estrés de DREBIA en plantas transgénicas aumenta su tolerancia al estrés por sequía. Pilon-Smits y col. (1998) informan de que la expresión de genes bacterianos para la síntesis de trehalosa produce tolerancia de estrés por agua en tabaco transgénico.

(C) Salinidad o estrés por sal. Los genes que codifican proteínas que minimizan la captación de sodio en presencia de elevado contenido salino, o causan que la planta secuestre sodio en vacuolas, pueden posibilitar que las plantas toleren niveles mayores de sal en el suelo. El transportador de potasio HKTI del trigo, descrito por Rubio y col. (1999), es un ejemplo de los primeros. Apse y col. (1999) describen cómo un antiportador de Na^{+}/H^{+} de Arabidopsis puede funcionar del otro modo.

(D) Metales. La protección de los efectos tóxicos de metales tales como aluminio y cadmio puede conseguirse por expresión transgénica de genes que evitan la captación del metal, o que codifican agentes quelantes que se unen a iones metálicos para evitar que tengan un efecto tóxico. Ejemplos de dichos genes son ALR104 y ALR108 de Arabidopsis (Larsen y col., 1998) y genes de las enzimas implicadas en la síntesis de fitoquelatina (Schafer y col., 1998).

4. Genes Que Confieren o Contribuyen a un Rasgo de Valor Añadido

(A) Metabolismo modificado de ácidos grasos, por ejemplo, por transformación del maíz o Brassica con un gen antisentido o estearoil-ACP desaturasa para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta (Knutzon y col., 1992).

(B) Contenido disminuido de fitatos

(1)

La introducción de un gen que codifica fitasa potenciaría la descomposición de los fitatos, añadiendo más fosfato libre a la planta transformada, tal como el gen de fitasa de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt y col., 1993).

(2)

Podría introducirse un gen que reduzca el contenido de fitatos. En el maíz, por ejemplo, esto podría conseguirse clonando y después reintroduciendo ADN asociado con el único alelo que es responsable de los mutantes del maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico (Raboy y col., 1990).

(C) Composición modificada de carbohidratos realizada, por ejemplo, por transformación de plantas con un gen que codifica una enzima que altera el patrón de ramificación del almidón. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen, el gen de la fructosiltransferasa de Streptococcus mucus (Shiroza y col., 1988), el gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (Steinmetz y col., 1985), los genes de la \alpha-amilasa de Bacillus licheniformis (Pen y col., 1992), de la invertasa del tomate (Elliot y col., 1993), el gen de la amilasa de la cebada (Søgaard y col., 1993), y la enzima II de la ramificación del almidón del endosperma del maíz (Fisher y col., 1993).

(D) Contenido modificado de lignina. La cantidad o composición de la lignina puede alterarse aumentado o disminuyendo la expresión de las enzimas biosintéticas para los precursores fenilpropanoides de lignina, tales como cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), 4-cumarato:CoA ligasa (4CL), y O-metil transferasa (OMT). Estos y otros genes implicados en la formación de la lignina se describen en la Patente de Estados Unidos 5.850.020.

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5. Genes Marcadores de Selección:

(A) Están disponibles numerosos genes marcadores de selección para su uso en la transformación de plantas incluyendo, aunque sin limitación, neomicina fosfotransferasa II, higromicina fosfotransferasa, EPSP sintasa y dihidropteroato sintasa. Véase, Miki y col. (1993).

La síntesis de genes adecuadamente empleada en la presente invención puede realizarse mediante oligonucleótidos largos de cebado mutuo. Véase, por ejemplo, Ausubel y col. (1990) y Wosnick y col. (1987). Además, las técnicas actuales que emplean la reacción en cadena de la polimerasa permiten la síntesis de genes tan grandes como de 6 kilobases de longitud o mayores. Véase Adang y col. (1993) y Bambot y col. (1993). Además, los genes pueden sintetizarse fácilmente por técnicas automatizadas convencionales.

La presente invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos. Se utilizan las técnicas convencionales bien conocidas en la técnica o las técnicas específicamente descritas a continuación.

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Ejemplo 1

Aislamiento y Fenotipo de Mutación

Usando el enfoque de mutagénesis por retención de genes mediada por transposón, se aisló una mutación que bloquea el proceso de dehiscencia de la silicua (Sundaresan y col., 1995).

La mutación SGT10166 se aisló de un conjunto de líneas de inserción independientes generadas usando un elemento transponible Ds de retención de genes. El sistema de transposón de dos elementos utiliza un transposón Ac-Ds del maíz y el gen informador GUS (Sundaresan y col, 1995). En la línea SGT10166 de inserción por retención de genes, se identificó el mutante SGT10166 en la descendencia F3 de una línea de retención de genes en la que las silicuas presentaban un fenotipo indehiscente (Fig. 2). Las valvas no consiguieron separarse del replum, y las semillas podían recogerse solamente si se abría el fruto manualmente. Aparte del fenotipo indehiscente, la planta parecía
normal.

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Ejemplo 2

Patrón de Expresión de GUS

La inserción del elemento por retención de genes Ds confiere la expresión del gen informador GUS, por tanto fue posible analizar el patrón de expresión endógena del gen por tinción histoquímica de la actividad GUS (Véase, Sundaresan y col., 1995). La expresión de Gus comienza en brotes jóvenes en la punta del cilindro del gineceo. Después, según se desarrolla, la expresión se expande en las papilas estigmáticas y la parte distal del gineceo. En las flores maduras se tiñe el gineceo completo. Después de la fertilización, en la silicua, la expresión se limitó al límite valva-replum siendo más intenso en la parte distal y proximal de la valva (Fig. 3).

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Ejemplo 3

Análisis Génico

Para entender la naturaleza del defecto que causa un fenotipo indehiscente, se realizó una caracterización adicional del gen. A través de PCR de Extremo, se amplificó un fragmento de ADN genómico que flanquea el elemento Ds (Parinov y col., 1999). Una búsqueda de la base de datos genómica de Arabidopsis thaliana reveló que las secuencias flanqueantes eran idénticas a las secuencias genómicas del cromosoma 5, contenido en el clon BAC con número de acceso AB020742. Se diseñaron cebadores específicos de gen para amplificar una parte de la secuencia de ADNc de una biblioteca de ADNc de la flor de Arabidopsis thaliana (Los clones de ADNc se aislaron de una biblioteca de ADNc de la flor de Arabidopsis thaliana, preparada a partir del ecotipo Landsberg erecta. La biblioteca de ADNc está disponible en el Arabidopsis Stock Center ABRC en Ohio State University, y se había construido usando el sistema de vector Stratagene Uni-ZAP XR (Weigel y col., 1992). La biblioteca se exploró de acuerdo con el protocolo del fabricante). El fragmento de PCR después se usó como sonda para explorar la misma biblioteca. El clon de ADNc aislado de la exploración tenía una longitud de 931 pares de bases y se prevé que codifique una proteína de 210 aminoácidos. El análisis de la secuencia de ADNc reveló una fuerte similitud entre SGT10166 y proteínas que pertenecen a la clase de hélice bucle hélice básica (bHLH) de factores de transcripción. Los miembros de la familia de proteínas bHLH desempeñan un importante papel en la regulación transcripcional en animales, plantas y hongos. Estas proteínas generalmente funcionan como dímeros, estando implicada la región HLH en el proceso de homo/heterodimerización y las funciones de los dominios básicos de unión al ADN. En plantas, muchas proteínas con el dominio bHLH se han identificado e implicado en diferentes funciones (Murre y col., 1989). Por ejemplo, las proteínas bHLH regulan la biosíntesis de antocianina en el maíz (genes B-Peru y R/Lc) (Radicella y col., 1991; Ludwig y col., 1989), la respuesta a ácido abscísico y la deshidratación en Arabidopsis (rd 22 BPI) (Abe y col., 1997), y la expresión de proteínas de almacenamiento en semillas en Phaseolus (PG1) (Kawagoe y Murai, 1996).

La secuencia genómica con exones e intrones para SGT10166 se expone en la SEC ID Nº 3. Las secuencias para la SEC ID Nº 3 se exponen en la Tabla Nº 1.

TABLA 1 Exones e Intrones del Gen SGT10166

1

Ejemplo 4

Análisis de Reversión

Para confirmar que el fenotipo observado visto en SGT10166 estaba causado por la inserción del elemento Ds, se realizó un análisis de reversión (Yang y col., 1999). La secuenciación de ADN del sitio de inserción Ds reveló que la inserción Ds no provocaba una duplicación del sitio diana de 8 pb típico. Los cambios de pares de bases presentes en el sitio de inserción Ds se muestran en la Figura 5. La secuencia ALC de tipo silvestre mostrada en la Figura 5 (SEC ID Nº 8) corresponde a las bases 331-352 de la SEC ID Nº 1. El sitio marcado se muestra como las SEC ID Nº 9 y 10 que están interrumpidas por el inserto. Ds se removilizó cruzando plantas que tienen el gen de la transposasa Ac (Sundaresan y col., 1995) y se observaron ocho plantas mutantes con sectores de tipo silvestre revertientes, es decir, tenían silicuas dehiscentes. Las semillas de estas silicuas revertientes se plantaron, se preparó el ADN y se analizaron las alteraciones de secuencia esperadas de la escisión de Ds. Todos los genes revertientes secuenciados contenían un elemento Ds escindido como fue evidente por la ausencia de secuencias Ds, y una huella de 9 pb en el mismo sitio. La huella restaura la fase de lectura y provoca la adición de tres aminoácidos extra en la proteína original (Figura 5, 9 bases en negrita de la SEC ID Nº 11 mostrada como el revertiente). Este resultado confirma que la mutación estaba causada por la inserción del Ds en el locus SGT10166. Además, también se aisló un alelo estable con una huella de 10 pb que no restaura la fase de lectura y se denominó alc10 (Figura 5; SEC ID Nº 12). Las plantas alc10 permanecían indehiscentes como se esperaba.

Ejemplo 5

Estudios de Complementación

Para demostrar que la secuencia de ADNc aislada de SGT10166 es suficiente para conferir dehiscencia, se introdujo el clon de ADNc supuestamente de longitud completa de SGT10166 bajo el control del promotor CaMV 35S en las plantas mutantes por transformación mediada por Agrobacterium (Clough y Bent, 1998). De los 15 transformantes independientes obtenidos, se restauró la dehiscencia completamente en 2 plantas mutantes. Estos resultados muestran que la secuencia aislada es necesaria y suficiente para la dehiscencia del fruto.

Ejemplo 6

Estudios Dominantes Negativos

Como el gen SGT10166 codifica una proteína de dominio bHLH relacionado con myc, es posible preparar reguladores dominantes negativos contra ello para alterar el proceso de dehiscencia. Como se ha propuesto previamente, se preparó dicha construcción dominante negativa delecionando el dominio básico del gen SGT10166 y remplazándolo con secuencias ácidas (Krylov y col., 1997). Dicha proteína debe funcionar como un regulador dominante negativo secuestrando la proteína bHLH SGT10166 endógena para formar dímeros inactivos. Esta construcción se hizo delecionando las bases 290-340 de la SEC ID Nº 1 (mostrada como la SEC ID Nº 13) y reemplazándolos con la SEC ID Nº 14 para producir la SEC ID Nº 15 que codifica la SEC ID Nº 16. Esta construcción se transformó en platas de Arabidopsis de tipo silvestre por transformación mediada por Agrobacterium (Clough y Bent, 1998). Se obtuvo la capacidad de retardar la dehiscencia considerablemente en hasta dos semanas en 2 de los 35 transformantes independientes obtenidos. Este resultado también podría explicarse como el resultado de los mecanismos de co-supresión en lugar de los efectos dominantes negativos propuestos. No obstante, se ha establecido que el gen SGT10166 puede usarse en plantas transgénicas para retardar la dehiscencia. Debe ser posible de forma similar diseñar plantas indehiscentes o de dehiscencia retardada reduciendo la actividad de este gen usando un enfoque anti-sentido (Gray y col., 1992).

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Patentes y Solicitudes de Patente

Hitzeman y col., documento EP 73.675A.

Solicitud Europea Nº 0 242 246

Solicitud de Patente Europea Nº 0 333 033

Publicación PCT Número WO 90/12084

Publicación PCT Número WO 93/02197

Publicación PCT Número WO 98/09521.

Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101.

Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195.

Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202.

Patente de Estados Unidos Nº 4.769.061.

Patente de Estados Unidos Nº 4.810.648.

Patente de Estados Unidos Nº 4.940.835.

Patente de Estados Unidos Nº 4.975.374.

Patente de Estados Unidos Nº 5.106.739.

Patente de Estados Unidos Nº 5.266.361.

Patente de Estados Unidos Nº 5.268.526.

Patente de Estados Unidos Nº 5.270.184.

Patente de Estados Unidos Nº 5.290.294.

Patente de Estados Unidos Nº 5.322.938.

Patente de Estados Unidos Nº 5.409.818.

Patente de Estados Unidos Nº 5.436.146.

Patente de Estados Unidos Nº 5.455.166.

Patente de Estados Unidos Nº 5.607.914.

Patente de Estados Unidos Nº 5.633.441.

Patente de Estados Unidos Nº 5.659.026.

Patente de Estados Unidos Nº 5.691.198.

Patente de Estados Unidos Nº 5.710.267.

Patente de Estados Unidos Nº 5.735.500.

Patente de Estados Unidos Nº 5.747.469.

Patente de Estados Unidos Nº 5.850.020.

<110> Institute of Molecular Agrobiology

\hskip1cm

Sundaresan, Venkatesan

\hskip1cm

Rajani, Sarojam

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Gen de la Dehiscencia y Procedimiento para Regular la Dehiscencia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> GM/MC/R33-102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/SG01/00017

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 01-02-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/SG00/00022

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 11-2-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 931

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (23)..(652)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

2

3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2640

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1007)..(1293)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Exón 1 que no incluye la secuencia delante del sitio de inicio de la traducción.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1244)..(1355)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Intrón 1.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1356)..(1427)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Exón 2.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1428)..(1517)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Intrón 2.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1518).. (1583)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Exón 3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1589)..(1661)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Intrón 3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1662)..(1727)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Exón 4.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1728)..(1821)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Intrón 4.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1822)..(2013)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Exón 5 a través del codón de parada. El exón 5 continúa más allá de éste.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

5

6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 623

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 642

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Phaseolus vulgaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 610

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 562

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagaggagg agcaagatca ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagaggagg acct

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagcaa gatcaac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagaggagg accttaagga gcaagatcaa c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg acctctgagg agcaagatca ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagagaaaca ttgatgctca attccacaac ttgtctgaaa agaagaggag g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagaggaag acgatgaaga ggat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 904

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (23)..(625)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

20

21

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<210> 16

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<211> 201

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 16

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22

Claims (6)

1. Una molécula de ADN aislada que codifica la proteína de la SEC ID Nº 16, o el complemento de dicho ADN.

2. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 15.

3. Una molécula de ADN aislada de la reivindicación 1 ó 2 que comprende adicionalmente un promotor heterólogo unido de forma operativa que no está asociado de forma natural a la molécula de ADN que codifica la proteína de la SEC ID Nº 16, o el complemento de dicho ADN.

4. Una célula vegetal transformada que comprende la molécula de ADN aislada de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.

5. Un procedimiento para producir una planta transformada con dehiscencia alterada del fruto maduro que comprende transformar células de dicha planta con la molécula de ADN aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha planta es una planta en la que el fruto maduro es una silicua.

6. El procedimiento de la reivindicación 5 que comprende adicionalmente seleccionar células vegetales transformadas que contienen dicha molécula de ADN y regenerar planta(s) transgénica(s) a partir de dichas células vegetales transformadas.