ES2294846T3 - Variantes de glucoamilasa. - Google Patents
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Abstract
Variante de una glucoamilasa progenitora que tiene mejor termoestabilidad con respecto a la glucoamilasa progenitora comprendiendo una o más mutaciones en la(s) siguiente(s) posición(es) en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 E408R+A425T+S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+Al 1 P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+0406N+L410R. A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+ S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, T2R+S386R+A393R, Y402F, V59A+A393R+T490A, y una extensión del N-terminal que consiste en PLASD Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H, y/o en una posición correspondiente en una glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos un 60% con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO: 2.
Description
Variantes de glucoamilasa.
La presente invención se refiere a variantes de
glucoamilasa nuevas (mutantes) de AMG progenitor, en particular con
termoestabilidad mejorada adecuada para, p. ej., la conversión de
almidón, p. ej., para producir glucosa de almidón. Más
específicamente, la presente invención se refiere a variantes de
enzima de glucoamilasa y el uso de tales variantes de enzimas.
La glucoamilasa
(1,4-\alpha-D-glucano
glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que cataliza la
liberación de D-glucosa de los extremos no
reductores de almidón o moléculas de oligo y polisacáridos
relacionadas. Las glucoamilasas son producidas por diferentes
hongos filamentosos y levaduras, siendo aquellos de
Aspergillus los más importantes comercialmente.
Comercialmente, la enzima glucoamilasa se
utiliza para convertir almidón de maíz que ya está parcialmente
hidrolizado por una \alpha-amilasa a glucosa. La
glucosa es posteriormente convertida por glucosa isomerasa a una
mezcla compuesta casi igualmente de glucosa y fructosa. Esta mezcla,
o la mezcla adicional enriquecida con fructosa, es el jarabe de
maíz rico en fructosa comúnmente usado comercializado en todas
partes del mundo. Este jarabe es el producto que se produce con
mayor tonelaje por un proceso enzimático. Las tres enzimas
implicadas en la conversión del almidón en fructosa se encuentran
entre las enzimas industriales producidas más importantes.
Uno de los principales problemas que existen con
el usa comercial de la glucoamilasa en la producción de jarabe de
maíz rico en fructosa es la termoestabilidad relativamente baja de
la glucoamilasa. La glucoamilasa no es térmicamente tan estable
como la \alpha-amilasa o glucosa isomerasa y es
más activa y estable a un pH inferior que la
\alpha-amilasa o la glucosa isomerasa. Por
consiguiente, debe ser usada en un recipiente separado a una
temperatura y pH inferiores.
La glucoamilasa de Aspergillus niger
tiene un dominio catalítico (aa 1-440) y de enlace
de almidón (aa 509-616) separado por un enlazador
largo y altamente O-glicosilado (Svensson et
al. (1983), Carlsberg Res. Commun. 48, 529-544,
1983 y (1986), Eur. J. Biochem. 154, 497-502). El
dominio catalítico (aa 1-471) de glucoamilasa de
A. awamori var. X100 adopta un pliegue
(\alpha\rightarrow\alpha)_{6} donde seis segmentos
del bucle \alpha\rightarrow\alpha conservados conectan los
cilindros externo e interno (Aleshin et al. (1992), J. Biol.
Chem. 267, 19291-19298). Las estructuras
cristalinas de la glucoamilasa en un complejo con
1-deoxinojirimicina (Harris et al. (1993),
Biochemistry; 32, 1618-1626) y los inhibidores de
pseudotetrasacáridos acarbosa y
D-gluco-dihidroacarbosa (Aleshin
et al. (1996), Biochemistry 35, 8319-8328)
son además compatibles con los ácidos glutámicos 179 y 400 que
actúan generalmente como ácido y base, respectivamente. El papel
crucial de estos residuos durante la catálisis también ha sido
estudiado usando ingeniería de proteínas (Sierks et al.
(1990), Protein Engng. 3, 193-198; Frandsen et
al. (1994), Biochemistry, 33, 13808-13816). Las
interacciones glucoamilasa-carbohidratos en cuatro
subsitios de enlace de residuos glicosílicos, -1, +1, +2 y +3 son
destacadas en las estructuras de los complejos de glucoamilasa
(Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35,
8319-8328) y los residuos importantes para el enlace
y la catálisis han sido extensamente investigados usando mutantes
dirigidos acoplados con análisis cinético (Sierks et al.
(1989), Protein Engng. 2, 621-625; Sierks et
al. (1990), Protein Engng. 3, 193-198; Berland
et al. (1995), Biochemistry, 34,
10153-10161; Frandsen et al. (1995),
Biochemistry, 34, 10162-10169.
Se han descrito diferentes sustituciones en la
glucoamilasa de A. niger para mejorar la termoestabilidad:
i) sustitución de glicinas \alpha-helicoidales:
G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9,
499-505); ii) eliminación de los enlaces peptídicos
Asp-X frágiles, D257E y D293E/Q (Chen et al.
(1995), Prot. Engng. 8, 575-582); prevención de
desamidación en N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301,
275-281); iv) ingeniería de enlace de bisulfuro
adicional, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry; 35,
8698-8704; y v) introducción de residuos Pro en la
posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10,
1199-1204. Además Clark Ford presentó un ensayo el
17 de octubre de 1997, ENZYME ENGINEERING 14, Beijing/China Oct
12-17, 97 Número de resumen: Libro de resumen p.
0-61. El resumen sugiere mutaciones en las
posiciones G137A, N20C/A27C, y S30P en una (no descrita)
glucoamilasa de Aspergillus awamori para mejorar la
termoestabilidad.
Se puede encotrar más información sobre la
glucoamilasa en una página de internet (http:
/www.public.iastate.edu/
\simpedro/glase/glase.html).
\simpedro/glase/glase.html).
La página "Glucoamylase WWW page"
(actualizada el 08/10/97) de Pedro M. Coutinho expone informaciones
referente a las glucoamilasas, incluyendo glucoamilasas derivables
de cepas de Aspergillus. Se relacionan las modificaciones
químicas y dirigidas al sitio en la glucoamilasa de Aspergillus
niger.
El objetivo de la presente invención es proveer
variantes de glucoamilasa mejoradas con mejor termoestabilidad
adecuada para el uso en, p.j., la fase de sacarificación en los
procesos de conversión de almidón.
El término "una variante de glucoamilasa con
mejor termoestabilidad" en el contexto de la presente invención
significa una variante de glucoamilasa que tiene un T_{1/2}
superior (duración media) que la glucoamilasa progenitora
correspondiente. La determinación de T_{1/2} (Método I y Método
II) es descrita abajo en el apartado de "Materiales y
Métodos". La actividad específica es determinada como Kcat o
AGU/mg (medido como se describe abajo en el apartado "Materiales
y Métodos").
Los inventores de la presente invención han
provisto un número de variantes mejoradas de una glucoamilasa
progenitora con mejor termoestabilidad en comparación con la enzima
progenitora correspondiente. La termoestabilidad mejorada es
obtenida substituyendo posiciones seleccionadas en una glucoamilasa
progenitora. Esto se describirá con detalle abajo.
En la presente descripción y reivindicaciones,
se usan los códigos convencionales de una y tres letras para
residuos aminoácidos. Para facilitar la referencia, las variantes
de glucoamilasa de la invención son descritas usando la
nomenclatura siguiente:
Aminoácido(s)
original(es):posición(es):aminoácido(s)
sustituido(s)
\vskip1.000000\baselineskip
Según esta nomenclatura, por ejemplo la
sustitución de alanina por asparraguina en la posición 30 es
mostrada como:
- Ala30Asn o A30N
una deleción de alanina en la misma posición es
mostrada como:
- Ala30* o A30*
y la inserción de un residuo aminoácido
adicional, tal como lisina, es mostrada como:
- Ala30AlaLys o A30AK
\vskip1.000000\baselineskip
Una deleción de una extensión consecutiva de
residuos aminoácidos, tales como residuos aminoácidos
30-33, es indicada como (33)* 30 o
(A30-N33).
Cuando una glucoamilasa específica contiene una
"deleción" en comparación con otras glucoamilasas y se hace
una inserción en esa posición esto es indicado como:
- *36Asp o *36D
para la inserción de un ácido aspártico en la
posición 36.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mutaciones múltiples son separadas por
signos de más, es decir:
- Ala30Asp + Glu34Ser ó A30N+E34S
representando mutaciones en las posiciones 30 y
34 sustituyendo alanina y ácido glutámico por asparraguina y
serina, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mutación múltiple también puede ser separada
como sigue, es decir, significando lo mismo que el signo de
más:
- Ala30Asp/Glu34Ser o A30N/E34S
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando uno o más residuos aminoácidos
alternativos pueden ser insertados en una posición esto es indicado
como
- A30N,E o A30N/E, o A30N o A30E
\vskip1.000000\baselineskip
Además, cuando se identifica una posición
adecuada para la modificación sin sugerir una modificación
específica, debe entenderse que cualquier residuo aminoácido puede
ser sustituido por el residuo aminoácido presente en la
posición.
Así, por ejemplo, cuando se menciona una
modificación de una alanina en la posición 30, pero no se
especifica, debe entenderse que la alanina puede ser eliminada o
sustituida por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera
de:
R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S,
T, W, Y, V.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra el plásmido pCAMG91
conteniendo el gen de glucoamilasa de Aspergillus niger
G1.
Un objetivo del trabajo base de la presente
invención fue mejorar la termoestabilidad de glucoamilasas
particulares que son obtenibles de organismos fúngicos, en
particular cepas del género de Aspergillus y que ellas
mismas han sido seleccionadas en base a sus propiedades adecuadas
para la conversión de almidón o fermentación de alcohol.
Las simulaciones de Dinámica Molecular (DM)
indican la movilidad de los aminoácidos en la estructura de la
proteína (ver McCammon, JA y Harvey SC., (1987), "Dynamics of
proteins and nucleic acids". Cambridge University Press.). Tales
dinámicas de la proteína son frecuentemente comparadas con los
B-factores cristalográficos (ver Stout, GH and
Jensen, LH, (1989), "X-ray structure
determination", Wiley). Al ejecutar la simulación DM en
diferentes estados de protonación de los residuos titulables, se
simula la movilidad relacionada con el pH de residuos. Las regiones
que tienen la máxima movilidad o flexibilidad (aquí fluctuaciones
isotrópicas) son seleccionadas para la mutagénesis aleatoria. Aquí
se entiende que la alta movilidad encontrada en áreas determinadas
de la proteína, puede ser térmicamente mejorada substituyendo
residuos en estos residuos. Las sustituciones son dirigidas contra
residuos que cambiarán el comportamiento dinámico de los residuos a
p. ej. cadenas laterales mayores y/o residuos que tienen capacidad
de formar mejores contactos para residuos en el entorno cercano. Se
usó el AMG de Aspergillus niger para la simulación DM. (En
el apartado de Materiales y Métodos abajo se describe cómo llevar a
cabo la simulación DM.)
Las regiones encontradas por simulaciones de
dinámica molecular (DM) adecuadas para la mutación cuando se quiere
obtener mejor i:ermoestabilidad son las siguientes:
- Región:
- 1-18,
- Región:
- 19-35,
- Región:
- 73-80,
- Región:
- 200-212,
- Región:
- 234-246,
- Región:
- 334-341,
- Región:
- 353-374,
- Región:
- 407-411,
- Región:
- 445-470,
Las regiones encontradas de interés para
aumentar la termoestabilidad son las regiones cercanas al centro
activo. Las regiones situadas entre las
\alpha-hélices, y que pueden incluir posiciones
en cada lado del N- y C-terminal de las
\alpha-hélices, en el sitio de enlace del sustrato
son importantes para la actividad de la enzima. Estas regiones
constituyen las regiones siguientes:
- Región:
- 40-62,
- Región:
- 93-127,
- Región:
- 170-184,
- Región:
- 234-246,
- Región:
- 287-319,
- Región:
- 388-414.
Rhizopus, Talaromyces, tales como
Talaromyces emersonii (descrito en WO 99/28448), y
Thielavia tienen alta actividad específica hacia las
maltodextrinas, incluyendo maltosa y maltohepatosa. En consecuencia,
las regiones que son de interés especial respecto a (transferir)
mayor actividad específica son:
- Región:
- 200-212,
- Región:
- 287-300,
- Región:
- 305-319.
Los presentes inventores han encontrado que de
hecho es posible mejorar la termoestabilidad de una glucoamilasa
progenitora modificando uno o más residuos aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa progenitora. La
presente invención se basa en este hallazgo.
Por consiguiente, en un primer aspecto la
presente invención se refiere a una variante mejorada de una
glucoamilasa progenitora comprendiendo una o más mutaciones en las
regiones y posiciones descritas con más detalle abajo.
La glucoamilasa progenitora contemplada según la
presente invención incluye glucoamilasas fúngicas, en particular
glucoamilasas fúngicas obtenibles de una cepa de
Aspergillus, tal como un Aspergillus niger o
glucoamilasas de Aspergillus awamori y variantes o mutantes
de los mismos, glucoamilasas homólogas y otras glucoamilasas que
son estructuralmente y/o funcionalmente similares a la SEC ID NO:
2. Se contemplan específicamente las glucoamilasas de
Aspergillus niger G1 y G2 descritas en Boel et al.
(1984), "Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger
are synthesized from two different but closely related mRNAs",
EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102. La glucoamilasa G2 está
descrita en la SEC ID NO: 2. La glucoamilasa G1 está descrita en la
SEC ID NO: 13. Otra base principal de AMG contemplada es
Talaromyces emersonii, especialmente Talaromyces
emersonii DSM descrito en WO 99/28448 (Novo Nordisk).
Las glucoamilasas progenitoras comercialmente
disponibles incluyen AMG de Novo Nordisk, y también glucoamilasa de
las compañías Genencor, Inc. EEUU, y Gist-Brocades,
Delft, Holanda.
La invención se refiere a una variante de una
glucoamilasa progenitora comprendiendo una o más
mutación(es) en la(s) siguiente(s)
posición(es) en la secuencia de aminoácidos mostrada en NO:
2:
- \quad
- E408R+A425T+S465P+T494A, E408R-S386N,T2Q+A11 P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+D406N+L410R, A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+7402F+N427S+S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2R+S386R+A393R, Y402F, extensión del N-terminal de PLASD + V59A+ A393R+T490A, Y402F+S411V, S119P+Y402F+3411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H, y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homóloga que muestra un grado de identidad de al menos un 60% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2.
La homología a la que se hace referencia arriba
de la glucoamilasa progenitora es determinada como el grado de
identidad entre, dos secuencias proteínicas que indican una
derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La
homología puede ser determinada apropiadamente mediante programas
informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado
en el paquete informático GCG (Manual del Programa para el paquete
Wisconsin, versión 8; Agosto 1994; Genetics Computer Group, 575
Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and
Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p.
443-453). Usando GAP con los ajustes siguientes
para comparar las secuencia polipeptídicas: penalización de
creación Gap de 3,0 y penalización de extensión Gap de 0,1, la parte
madura de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN
análoga de la invención exhibe un grado de identidad preferiblemente
de al menos un 60%, tal como un 70%, al menos un 80%, al menos un
90%, más preferiblemente al menos un 95%, más preferiblemente al
menos un 97%, y más preferiblemente al menos un 99% con la parte
madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:
2.
Preferiblemente, la glucoamilasa progenitora
comprende las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO: 2; o
variantes alélicas de las mismas; o fragmentos de las mismas con
actividad glucoamilasa.
Un fragmento de la SEC ID NO: 2 es un
polipéptido que tiene uno o más aminoácidos cancelados del terminal
amino y/o carboxilo de esa secuencia de aminoácidos. Por ejemplo,
el AMG G2 (SEC ID NO: 2) es un fragmento de la glucoamilasa de
Aspergillus niger G1 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3
(5), p. 1097-1102) que tiene actividad
glucoamilasa. Una variante alélica denota cualquiera de dos o más
formas alternativas de un gen que ocupa el mismo lugar cromosómico.
La variación alélica surge naturalmente por mutación, y puede
producir polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones
genéticas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido
codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias
de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es
un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
Las secuencias de aminoácidos de glucoamilasas
progenitoras homólogas pueden diferir de la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID NO: 2 por una inserción o deleción de uno
o más residuos aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos
aminoácidos por residuos aminoácidos diferentes. Preferiblemente,
los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, es decir
las sustituciones de aminoácido conservadoras que no afectan
significativamente el pliegue y/o actividad de la proteína; pequeñas
deleciones, normalmente de una a aproximadamente 30 aminoácidos;
pequeñas extensiones de terminales amino o carboxilicos, tales como
un residuo de metionina de terminal amino; un pequeño enlace
péptido de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o
una pequeña extensión que facilite la purificación cambiando la
carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un
epítopo antigénico o un dominio de enlace.
En otra forma de realización, la glucoamilasa
progenitora aislada es codificada por una secuencia de ácidos
nucléicos que hibrida bajo condiciones de astringencia muy bajas,
preferiblemente condiciones de astringencia bajas, más
preferiblemente condiciones de astringencia media, más
preferiblemente condiciones de astringencia
medio-altas, incluso más preferiblemente
condiciones de astringencia altas, y más preferiblemente condiciones
de astringencia muy altas con una sonda de ácido nucleico que
hibrida según las mismas condiciones con (i) la secuencia de ácidos
nucléicos de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la SEC
ID NO:1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena
complementaria de (i), (ii), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y
T. Maniatus; 1989; Clonación Molecular, Manual de Laboratorio, 2ª
Edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). La subsecuencia de la SEC
ID NO: 1 puede ser de al menos 100 nucleótidos o preferiblemente al
menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia puede codificar un
fragmento de polipéptido con actividad glucoamilasa. Los
polipéptidos progenitores también pueden ser variantes o fragmentos
alélicos de los polipéptidos que tienen actividad glucoamilasa.
Se puede usar la secuencia de ácidos nucléicos
de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, al igual que la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, o un fragmento de la
misma, para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y
clonar polipéptidos de codificación de ADN con actividad
glucoamilasa, de cepas de diferentes géneros o especies según
métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las sondas de
este tipo pueden ser usadas para la hibridación con el ADN genómico
o ADNc del género o especie de interés, según los procedimientos
estándares de transferencia de Southern, para identificar y aislar
su gen correspondiente. Las sondas de este tipo pueden ser
considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían
ser de al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más
preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. También se
pueden usar sondas más largas. Se pueden usar sondas de AIJN y ARN.
Las sondas son normalmente marcadas para detectar el gen
correspondiente (por ejemplo, con 32 P; 3 H; 35S, biotina, o
avidina). Tales sondas están contempladas por la presente
invención.
invención.
Así, una biblioteca de ADN genómico o ADNc
obtenida a partir de tales otros organismos puede ser seleccionada
para el ADN que hibridiza con las sondas anteriormente descritas y
que codifica un polipéptido que tiene glucoamilasa. Un ADN genómico
u otro de tales otros organismos puede ser separado por
electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida u otras
técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado
puede ser transferido a e inmovilizado en nitrocelulosa u otro
material de soporte adecuado. Para identificar un clon o ADN que
sea homólogo a la SEC ID NO: 1, o sus subsecuencias, el material de
soporte es usado en una transferencia Southern. Para los objetivos
de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de
ácidos nucléicos hibrida a una sonda de ácido nucleico
correspondiente a la secuencia de ácidos nucléicos mostrada en la
SEC ID NO: 1, su cadena complementaria, o una subsecuencia de la
misma, bajo condiciones de astringencia desde muy bajas a muy
altas. Las moléculas a las que la sonda de ácido nucleico hibrida
bajo estas condiciones son detectadas usando película de rayos
X.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos
de longitud, el material de soporte es finalmente lavado tres
veces, cada una durante 15 minutos, usando 2 x SSC, 0,2% SDS
preferiblemente al menos a 45ºC (astringencia muy baja), más
preferiblemente al menos a 50ºC (astringencia baja), más
preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media), más
preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia
medio-alta), incluso más preferiblemente al menos a
65ºC (astringencia alta), y más preferiblemente al menos a 70ºC
(astringencia muy alta).
Para sondas cortas que son de aproximadamente 15
nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las
condiciones de astringencia son definidas como prehibridación,
hibridación, y post-hibridación con lavado a de 5ºC
a 10ºC por debajo del T_{m} calculado usando el cálculo según
Bolton y McCarthy (1962; Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl; 0,09 M de
tris-HCl pH 7,6, 6 M de EDTA, 0,5%
NP-40, solución IX Denhardt, 1 mM de pirofosfato de
sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP, y 0,2 mg
de ARN de levadura por ml según los procedimientos de transferencia
de Southern estándares.
Para sondas cortas que son de aproximadamente 15
nucleótidos hasta aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el
material de soporte es lavado una vez en 6x SCC más 0,1% SDS
durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos usando
6x SSC a de 5ºC a 10ºC por debajo del T_{m} calculado.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas producidas por a)
hibridación de ADN bajo condiciones de astringencia muy bajas,
bajas, medias, medio-altas, altas o muy altas con la
secuencia de la SEC ID NO:1, o su cadena complementaria, o una
subsecuencia de la misma; y (b) aislamiento de la secuencia de
ácidos nucléicos. La subsecuencia es preferiblemente una secuencia
de al menos 100 nucleótidos tal como una secuencia que codifica un
fragmento de polipéptido con actividad glucoamilasa.
Las glucoamilasas progenitoras contempladas
tienen al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, más
preferiblemente al menos un 60%, incluso más preferiblemente al
menos un 80%, incluso más preferiblemente al menos un 90%, y más
preferiblemente al menos el 100% de la actividad glucoamilasa del
polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2.
En una forma de realización preferida la
variante de la invención tiene mejor termoestabilidad,
preferiblemente dentro del intervalo de temperatura de
aproximadamente 60-80ºC, preferiblemente
63-75ºC, preferiblemente a un pH de
4-5, en particular 4,2-4,7, usando
maltodextrina como sustrato.
En otra forma de realización preferida se usa
una variante de la invención para, p. ej., la fermentación de
alcohol.
En una forma de realización preferida, la
glucoamilasa progenitora es la glucoamilasa de Aspergillus
niger G1 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p.
1097-1102. La glucoamilasa progenitora puede ser una
glucoamilasa truncada, p. ej., la glucoamilasa AMG G2.
La secuencia de ADN que codifica una
glucoamilasa progenitora puede ser aislada de cualquier célula o
microorganismo que produzca la glucoamilasa en cuestión, usando
varios métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar se
debería construir un ADN genómico y/o biblioteca de ADNc usando ADN
cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la
glucoamilasa que debe ser estudiada. Luego, si se conoce la
secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa, se puede sintetizar
sondas de oligonucleótidos marcadas y usarlas para identificar
clones de codificación de glucoamilasa de una genoteca obtenida a
partir del organismo en cuestión. Alternativamente se podría
utilizar una sonda de oligonucleótidos marcada conteniendo
homólogos de secuencias para otro gen de glucoamilasa conocido como
una sonda para identificar clones de codificación de glucoamilasa,
usando condiciones de hibridación y lavado de astringencia desde muy
bajas a muy altas. Esto está descrito arriba.
Aún otro método para identificar clones de
codificación de glucoamilasa implicaría insertar fragmentos de ADN
genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido,
transformar las bacterias glucoamilasa-negativas con
la biblioteca de ADN genómico resultante, y luego depositar en
placas las bacterias transformadas sobre agar conteniendo un
sustrato para glucoamilasa (es decir, maltosa), permitiendo de ese
modo identificar los clones que expresan la glucoamilasa.
Alternativamente, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos
estándares establecidos, p. ej. el método de la fosforamidita
descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron
Letters 22, p. 1859-1869, o el método descrito por
Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p.
801-805. En el método de la fosforamidita, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej., en un sintetizador de ADN
automático, purificados, anelados, ligados y donados en vectores
apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen mixto genómico y sintético, mixto de origen sintético y ADNc
o mixto de origen genómico y ADNc, preparado ligando fragmentos de
origen sintético, genómico o ADNc (como sea apropiado, los
fragmentos correspondiendo a varias partes de toda la secuencia de
ADN), según técnicas estándares. La secuencia de ADN también puede
ser preparada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando
cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202
o R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp.
487-491.
Una vez que una secuencia de ADN de codificación
de glucoamilasa ha sido aislada, y los sitios deseables para la
mutación identificados, se pueden introducir mutaciones usando
oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen
secuencias de nucleótidos flanqueando los sitios de mutación
deseada. En un método específico, un espacio vacío monocatenario de
ADN, la secuencia de codificación de glucoamilasa, es creada en un
vector llevando el gen de glucoamilasa. Luego el nucleótido
sintético, llevando la mutación deseada, es anelado a una porción
homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante es luego
llenado con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y el constructo es
ligado usando ligasa T4. Un ejemplo específico de este método está
descrito en Morinaga et al., (1984), Biotechnology 2, p.
646-639. US 4,760,025 expone la introducción de
oligonucleótidos de codificación de mutaciones múltiples realizando
alteraciones menores del casete. No obstante, se puede introducir
una variedad incluso superior de mutaciones en cualquier momento
por el Método de Morinaga, ya que se puede introducir una multitud
de oligonucleótidos de varias longitudes.
Otro método para introducir mutaciones en
secuencias de ADN de codificación de glucoamilasa está descrito en
Nelson y Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p.
147-151. Este implica la generación en 3 fases de un
fragmento de PCR conteniendo la mutación deseada introducida usando
una cadena de ADN químicamente sintetizada como uno de los
cebadores en las reacciones PCR. Del fragmento generado por
reacción en cadena de polimerasa, un fragmento de ADN llevando la
mutación puede ser aislado por seccionamiento con endonucleasas de
restricción y reinsertado en un plásmido de expresión.
Además, Sierks. et al., (1989), Protein
Eng., 2, 621-625; Sierks et al., (1990),
Protein Eng. vol. 3, 193-198; también describe la
mutagénesis dirigida en una glucoamilasa de Aspergillus.
La mutagénesis aleatoria es realizada de manera
adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica de
la región en al menos tres partes del gen que traduce a la secuencia
de aminoácidos mostrada en cuestión, o en todo el gen.
La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN
que codifica una glucoamilasa progenitora puede ser
convenientemente realizada usando cualquier método conocido en la
técnica.
En relación con lo anterior, otro aspecto de la
presente invención se refiere a un método para generar una variante
de una glucoamilasa progenitora donde la variante exhibe una mayor
termoestabilidad con respecto a la progenitora, el método
comprendiendo:
- (a)
- someter una secuencia de ADN que codifica la glucoamilasa progenitora a mutagénesis aleatoria,
- (b)
- expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la fase (a) en una célula huésped, y
- (c)
- seleccionar las células huéspedes de expresión de una variante de glucoamilasa con una propiedad alterada (es decir termoestabilidad) con respecto a la glucoamilasa progenitora.
La fase (a) del método indicado arriba de la
invención es preferiblemente realizado usando cebadores dopados,
como se describe en los ejemplos de trabajo (véase abajo).
Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser
realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado,
usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de
ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis
aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos
agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser
uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones,
aleatorizaciones, deleciones, y/o inserciones.
Los ejemplos de un agente mutagenizante físico o
químico adecuado para el presente objetivo incluyen irradiación
ultravioleta (UV), hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso,
etilmetano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y
análogos de nucleótidos. Cuando se usan tales agentes, la
mutagénesis es normalmente realizada incubando la secuencia de ADN
que codifica la enzima progenitora que debe ser mutagenizada en
presencia del agente mutagenizante seleccionado bajo condiciones
adecuadas para que ocurra la mutagénesis, y seleccionar el ADN
mutado teniendo las propiedades deseadas.
Cuando la mutagénesis es realizada usando un
oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado
con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del
oligonucleótido en las posiciones que deben ser cambiadas. Se puede
hacer el dopaje o adición de modo que se eviten los codones para
aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado
puede ser incorporado en el ADN de codificación de la enzima
glucoamilasa por cualquier técnica publicada, usando, p. ej., PCR,
LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa que se considere
apropiado.
Preferiblemente, el dopaje se realiza usando
"dopaje aleatorio constante", donde el porcentaje de tipo
salvaje y mutación en cada posición es predefinida. Además, el
dopaje puede dirigirse a una preferencia para la introducción de
ciertos nucleótidos, y de ese modo una preferencia para la
introducción de uno o más residuos aminoácidos específicos. Se puede
hacer el dopaje, p. ej., de tal manera que permita la introducción
del 90% de tipo salvaje y 10% de mutaciones en cada posición. Una
consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se
basa en las limitaciones genéticas así como estructurales de la
proteína. Se puede hacer el esquema de dopaje usando el programa
DOPE que, entre otras cosas, asegura que se evite la introducción
de codones de parada.
Cuando se usa la mutagénesis generada por
reacción en cadena de polimerasa un gen de codificación de una
glucoamilasa progenitora tratado o no tratado químicamente es
sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la desincorporación de
nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1,
1989; págs. 11-15).
Se puede usar una cepa mutágena de E.
coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet.; 133, 1974;
págs. 179-191), S. cereviseae o cualquier
otro organismo microbiano para la mutagénesis aleatoria del ADN de
codificación de la glucoamilasa, p. ej., transformando un plásmido
conteniendo la glicosilasa progenitora en la cepa mutágena,
haciendo crecer la cepa mutágena con el plásmido y aislando el
plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser
posteriormente transformado en el organismo de expresión.
\newpage
La secuencia de ADN que debe ser mutagenizada
puede estar convenientemente presente en una biblioteca de ADNc o
genómica obtenida a partir de un organismo que exprese la
glucoamilasa progenitora. Alternativamente, la secuencia de ADN
puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o
un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o expuesto de
otro modo al agente mutagenizante. El ADN que debe ser mutagenizado
puede estar también presente en una célula huésped bien estando
integrado en el genoma de dicha célula o estando presente en un
vector hospedado en la célula. Finalmente, el ADN que debe ser
mutagenizado puede estar en forma aislada. Se sobreentiende que la
secuencia de ADN que debe ser sometida a mutagénesis aleatoria es
preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.
En algunos casos puede ser conveniente
amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de
expresión b) o la fase de selección c). Tal amplificación puede ser
realizada según métodos conocidos en la técnica, el método
actualmente preferido es la amplificación generada por reacción en
cadena de polimerasa usando cebadores oligonucleótidos preparados en
base a la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima
progenitora.
Después de la incubación con o exposición al
agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado cultivando una
célula huésped adecuada llevando la secuencia de ADN bajo
condiciones que permitan que ocurra la expresión. La célula huésped
usada para este propósito puede ser una que haya sido transformada
con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un
vector, o una que lleve la secuencia de ADN que codifica la enzima
progenitora durante el tratamiento de mutagénesis. Los ejemplos de
células huéspedes adecuadas son las siguientes: bacterias gram
positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,
Bacillus lentus, Bacillus Ore vis, Bacillus stearothermophilus,
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
coagularas, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus
megsterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o
Streptomyces murinus; y bacterias
gram-negativas tales como E. coli.
La secuencia de ADN mutada puede comprender
además una secuencia de ADN que codifique las funciones que
permitan la expresión de la secuencia de ADN mutada.
La mutagénesis aleatoria puede ser
ventajosamente localizada para una parte de la glucoamilasa
progenitora en cuestión. Esta puede, p. ej., ser ventajosa cuando
ciertas regiones de la enzima han sido identificadas de particular
importancia para una propiedad dada de la enzima, y cuando son
modificadas se espera que produzcan una variante con propiedades
mejoradas. Las regiones de este tipo pueden normalmente ser
identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima
progenitora ha sido dilucidada y relacionada con la función de la
enzima.
La mutagénesis aleatoria localizada o específica
de la región es convenientemente realizada usando técnicas de
mutagénesis generadas por PCR del modo descrito anteriormente o
cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica.
Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la
secuencia de ADN que debe ser modificada puede ser aislada, p. ej.,
por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser
posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los
métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.
Métodos alternativo para proveer variantes de la
invención incluyen transposición de genes p. ej. como se describe
en WO 95/22325 (de Affymax Technologies N.V.) o en WO 96/00343 (de
Novo Nordisk NS).
Según la invención, una secuencia de ADN que
coclifica la variante producida por los métodos anteriormente
descritos, o por cualquier método alternativo conocido en la
técnica, puede ser expresada, en forma de enzima, usando un vector
de expresión que normalmente incluye secuencias de control que
codifican un promotor, operador, sitio de enlace de ribosoma, señal
de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un gen represor o
varios genes activadores.
El vector de expresión recombinante que lleva la
secuencia de ADN que codifica una variante de glucoamilasa de la
invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente
sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del
vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que debe
ser introducido. El vector puede ser uno que, cuando es introducido
en una célula huésped, se integrue en el genoma de la célula
huésped y se replique con el (los) cromosoma(s) en el (los)
que ha sido integrado. Ejemplos de vectores de expresión adecuados
incluyen pMT838.
En el vector, la secuencia de ADN debería ser
operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad
transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivar de
genes de codificación de proteínas bien homólogos o heterólogos a
la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de
glucoamilasa de la invención, especialmente en un huésped
bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los
promotores del gen de agarasa de Streptomyces coelicolor
dagA, los promotores del gen de la \alpha-amilasa
de Bacillus licheniformis (amiL), los promotores del gen de
amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM),
los promotores de \alpha-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xy1A y
xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un
huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos
derivados del gen que codifica la amilasa TAKA cle A. oryzae,
el promotor de TPI (triosa fosfato isomerasa) de S.
cerevisiae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1,
p. 419-434, proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, \alpha-amilasa neutra de A.
niger, \alpha-amilasa estable al ácido de
A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de
Rhizomucor miehei, proteasá alcalina de A. oryzae,
triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A.
nidulans.
El vector de expresión de la invención puede
también comprender un terminador de transcripción adecuada y, en
eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas
a la secuencia de ADN que codifica la variante de
\alpha-amilasa de la invención. Las secuencias de
terminación y de poliadenilación pueden derivar apropiadamente de
las mismas fuentes que el promotor.
El vector puede además comprender una secuencia
de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped
en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de
replicación de los plasmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1
y plJ702.
El vector también puede comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complemente una falta en
la célula huésped, tales como los genes dal de B. subtilis o
B. licheniformis, o uno que confiera resistencia antibiótica
tal como ampicilina, canamicina, cloranfenicol o resistencia a la
tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de
selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC,
un marcador que de lugar a resistencia a la higromicina, o la
selección puede ser realizada por cotransformación, p. ej. como se
describe en WO 91/17243.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención que codifica una variante de
glucoamilasa, el promotor, terminador y otros elementos,
respectivamente, y para insertarlos en veclores adecuados
conteniendo la información necesaria para la replicación, son
conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., Clonación Molecular: Manual de Laboratorio;
2nd Ed., Cold Spring Harbor; 1989).
La célula de la invención, comprendiendo bien un
constructo de ADN o un vector de expresión de la invención tal como
se ha definido anteriormente, es ventajosamente usada como una
célula huésped en la producción recombinante de una variante de
glucoamilasa de la invención. La célula puede ser transformada con
el constructo de ADN de la invención codificando la variante,
convenientemente integrando el constructo de ADN (en una o más
copias) en el cromosoma huésped. Esta integración es generalmente
considerada una ventaja pues es muy probable que la secuencia de ADN
sea mantenida de forma estable en la célula. La integración de los
constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada
según métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o
heteróloga. Alternativamente, la célula puede ser transformada con
un vector de expresión del modo descrito anteriormente en relación
con los diferentes, tipos de células huéspedes.
La célula de la invención puede ser una célula
de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es
preferiblemente una célula microbiana, p. ej., una célula
bacteriana o fúngica (incluyendo levadura).
Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias
gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o
Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o
bacterias gram negativas tales como E. coli. La
transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada
por transformación de protoplasto o usando células competentes
conocidas per se.
El organismo de levadura puede favorablemente
ser seleccionado de una especie de Saccharomyces o
Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces
cerevisiae.
La célula huésped puede ser también un hongo
filamentoso p. ej. una cepa de una especie de Aspergillus,
más preferiblemente Aspergillus otyzae o Aspergillus
niger, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de
Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado
perfecto denominado Gribberella zeae, previamente
Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y
Gibberella roseum f. esp. cerealis), o Fusarium
sulphureum (en el estado perfecto denominado Gibberella
puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium
bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, y
Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium
cerealis (sinónimo de Fusarium crokkwellnse), o
Fusarium venenatum.
En una forma de realización preferida de la
invención la célula huésped es una cepa deficitaria de proteasa o
cepa negativa de proteasa.
\newpage
Esta puede por ejemplo ser la cepa deficitaria
de Aspergillus oryzae JaL 125 teniendo el gen de proteasa
alcalina llamado "alp" cancelado. Esta cepa está descrita en
WO 97/35956 (Novo Nordisk).
Las células de hongos filamentosos pueden ser
trans-Formadas por un proceso que implica la
formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos
seguida de regeneración de la pared celular de una manera conocida
per se. El uso de Aspergillus como microorganismo
huésped está descrito en EP 238 023 (Novo Nordisk NS),
En otro aspecto más, la presente invención se
refiere a un método para producir una variante de glucoamilasa de
la invención, cuyo método comprende cultivar una célula huésped
bajo condiciones propicias para la producción de la variante y
recuperación de la variante de las células y/o medio de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la
célula huésped en cuestión y obtener expresión de la variante de
glucoamilasa de la invención. Los medios adecuados se encuentran
disponibles en los proveedores comerciales o pueden ser preparados
según recetas publicadas (p. ej. como se describe en los catálogos
de la Colección Americana de Cultivos Tipo).
La variante de glucoamilasa segregada de las
células huéspedes puede convenientemente ser recuperada del medio
de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo la
separación de las células del medio por centrifugado o filtración,
y la precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante
una sal tal como sulfato de amonio, seguido del uso de
procedimientos cromatográficos tal como cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.
La presente invención provee un método para usar
variantes de glucoamilasa de la invención para producir glucosa y
similares de almidón. Generalmente, el método incluye las fases de
hidrolizar parcialmente almidón precursor en presencia de
\alpha-amilasa e hidrolizar luego aclicionalmente
la liberación de D-glucosa de los extremos no
reductores del almidón o moléculas oligo- o polisacáridas
relacionadas en presencia de glucoamilasa dividiendo los enlaces
glucosidicos \alpha-(1 100 4) y \alpha-(1
100 6).
La hidrólisis parcial del almidón precursor
utilizando \alpha-amilasa provee una
descomposición inicial de las moléculas de almidón al hidrolizar los
enlaces internos \alpha-(1 100 4). En
aplicaciones comerciales, la hidrólisis inicial usando
\alpha-amilasa se realiza a una temperatura de
aproximadamente 105ºC. Se procesa una concentración de almidón muy
alta, normalmente sólidos al 30% a 40%. La hidrólisis inicial es
normalmente realizada durante cinco minutos a esta temperatura
elevada. El almidón parcialmente hidrolizado puede después ser
transferido a un segundo tanque e incubado durante aproximadamente
1-2 horas a una temperatura de 85º a 98ºC para
obtener un equivalente de dextrosa (D.E.) de 10 a 15.
La fase de hidrolizar adicionalmente la
liberación de D-glucosa de los extremos no
reductores del almidón o moléculas de oligo- y polisacáridos
relacionadas en presencia de glucoamilasa se realiza normalmente en
un tanque separado a una temperatura reducida entre 30º y 62ºC.
Preferiblemente la temperatura del líquido de sustrato es bajada a
entre 55º y 60ºC. El pH de la solución es bajada de aproximadamente
5,5 a 6,5 a un rango entre 3 y 5,5. Preferiblemente, el pH de la
solución es 4 a 4,5. La glucoamilasa se añade a la solución y la
reacción se realiza durante 24-72 horas,
preferiblemente 36-48 horas.
Al usar una variante de glucoamilasa
termoestable de la invención se pueden realizar procesos de
sacarificación a una temperatura más alta que los procesos de
sacarificación por lotes tradicionales. Según la invención la
sacarificación puede ser realizada a temperaturas en el rango sobre
60-80ºC, preferiblemente 63-75ºC.
Esto se aplica tanto a los procesos por lotes tradicionales
(anteriormente descritos) como a los procesos de sacarificación
continuos.
En realidad, los procesos de sacarificación
continuos incluyendo una o más fases de separación por membrana, es
decir fases de filtración, deben ser realizados a temperaturas por
encima de 60ºC para poder mantener un flujo razonablemente alto
sobre la membrana o para minimizar la contaminación microbiana. En
consecuencia, las variantes termoestables de la invención
proporcionan la posibilidad de realizar procesos de sacarificación
continuos a gran escala a un precio justo y/o con una dosificación
de proteína enzimática inferior dentro de un periodo de tiempo
aceptable para los procesos de sacarificación industriales. Según
la invención el tiempo de sacarificación puede incluso ser
acortado.
La actividad de la variante de glucoamilasa (p.
ej. variante AMG) de la invención es generalmente sustancialmente
superior a temperaturas entre 60ºC-80ºC que a la
temperatura generalmente usada entre 30-60ºC. En
consecuencia, al aumentar la temperatura en la que opera la
glucoamilasa el proceso de sacarificación puede ser realizado
dentro de un periodo de tiempo más corto.
Además, al mejorar la termoestabilidad se mejora
el T_{1/2} (duración media, tal y como se define en el apartado
de "Materiales y Métodos"). Como la termoestabilidad de las
variantes de glucoamilasa de la invención es mejorada se necesita
añadir una cantidad menor de glucoamilasa para reemplazar la
glucoamilasa que es inactivada durante el proceso de sacarificación.
Durante el proceso de sacarificación según la presente invención se
mantiene más glucoamilasa activa. Además, se reduce también el
riesgo de contaminación microbiana cuando se lleva el proceso de
sacarificación a una temperatura por encima de 63ºC.
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El rendimiento de glucosa de una prueba de
sacarificación típica con glucoamilasa, amilasa ácida y pululanasa
es 95,5-96,5%. Los carbohidratos restantes
normalmente consisten en 1% de maltosa; 1,5-2% de
isomaltosa y 1-1,5% de oligosacáridos superiores.
Se producen disacáridos puesto que la glucoamilasa a
concentraciones altas de glucosa y altos niveles de materia seca
tiende a formar productos de reversión.
Una glucoamilasa con una actividad específica
aumentada hacia los sacáridos presentes en la solución después de
licuefacción y los sacáridos formados durante la sacarificación
serían una ventaja pues se podría utilizar una menor dosificación
de proteína enzimática o un tiempo de proceso más corto. En
general, la glucoamilasa tiene preferencia por los sustratos que
consisten en sacáridos más largos en comparación con los sacáridos
de cadena corta y la actividad específica hacia p. ej.
maltoheptaosa es en consecuencia aproximadamente 6 veces superior
que hacia maltosa. Una mayor actividad específica hacia los
sacáridos de cadena corta tales como maltosa (sin reducir la
actividad hacia los oligosacáridos) en consecuencia también
permitiría usar una dosificación de enzima inferior y/o tiempo de
proceso más corto.
Además, se puede obtener un rendimiento de
glucosa superior con una variante de glucoamilasa con una actividad
hidrolítica alfa-1,4 (si la actividad
alfa-1,6 es invariada o incluso disminuida), puesto
que una cantidad reducida de proteína enzimática está siendo usada,
y en consecuencia se disminuye la formación de producto de
reversión alfa-1,6 (menos isomaltosa).
La actividad específica puede ser medida usando
el método descrito en el apartado "Materiales y Métodos" a
37ºC o 60ºC.
Los ejemplos de proceso de sacarificación donde
las variantes de glucoamilasa de la invención pueden ser usadas
incluyen los procesos descritos en JP 3-224493; JP
1-191693; JP 62-272987; EP 452,238,
y WO 99/27124.
En otro aspecto la invención se refiere a un
método de sacarificación de una solución de almidón licuado,
incluyendo las siguientes fases
- (i)
- una fase de sacarificación durante la cual se desarrollan uno o más estadios de sacarificación enzimática, y la fase posterior de
- (ii)
- una o más fases de separación por membrana a alta temperatura donde la sacarificación enzimática se realiza usando una variante de glucoamilasa termoestable de la invención.
La(s) variante(s) de glucoamilasa
de la invención pueden ser usadas en el presente proceso inventivo
en combinación con una enzima que hidroliza sólo enlaces
\alpha-(1 100 16). glucosídicos en moléculas con
al menos cuatro residuos glucosilicos. Preferentemente, la variante
de glucoamilasa de la invención puede ser usada en combinación con
pululanasa o isoamilasa. El uso de isoamilasa y pululanasa para
desramificar las propiedades moleculares de las enzimas, y el uso
potencial de las enzimas con glucoamilasa está indicado en G.M.A.
van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel
Dekker, Nueva York, 1985, 101-142.
En otro aspecto la invención se refiere al uso
de una variante de glucoamilasa de la invención en un proceso de
conversión de almidón.
Además, la variante de glucoamilasa de la
invención puede ser usada en un proceso de conversión de almidón
continuo incluyendo una fase de sacarificación continua.
Las variantes de glucoamilasa de la invención
pueden también ser usadas en forma inmovilizada. Esto es
conveniente y frecuentemente usado para producir jarabes
especiales, tales como jarabes de maltosa, y otros para la
corriente refinada de oligosacáridos en relación con la producción
de jarabes de fructosa.
La glucoamilasa de la invención también puede
ser usada en un proceso para producir etanol para combustible o
bebidas o puede ser usado en un proceso de fermentación para
producir compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido
ascórbico, lisina, ácido glutámico.
AMG G1: glucoamilasa de Aspergillus niger
G1 descrita en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5),
1097-1102, y la SEC ID NO: 13; disponible en Novo
Nordisk.
AMG G2: glucoamilasa de Aspergillus niger
G1 truncada mostrada en la SEC ID NO: 2, disponible en Novo
Nordisk)
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tampón: 0,05M de acetato sódico (6,8 g en 1 l de
agua purificada en un sistema milli-Q), pH 4,5
Solución de detención: 0,4M de NaOH
GOD-perid, 124036, Boehringer
Mannheim
\vskip1.000000\baselineskip
Maltosa: 29 mM (1 g maltosa en 100 ml 50 mM de
acetato sódico, pH 4,5) (Sigma)
Maltoheptaosa: 10 mM, 115 mg/10 ml (Sigma)
\vskip1.000000\baselineskip
A. oryzae JaL 125: Aspergillus
oryzae IFO 4177 disponible en Institute for Fermention, Osaka;
17-25 Juso Hammachi 2-Chome
Yodogawa-ku, Osaka, Japón, que tiene el gen de
proteasa alcalina denominado "alp" (descrito por Murakami K
et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, p.
2807-2811) cancelado por un método de sustitución
de gen de una fase (descrito por G. May en "Applied Molecular
Genetics of Filamentous Fungi" (1992), p. 1-25.
Eds. J. R. Kinghorn y G. Turner; Blackie Academic and
Professional), usando el gen de A. oryzae pyrG como
marcador. La cepa JaL 125 está descrita con más detalle en WO
97/35956 (Novo Nordisk).
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa: Saccharomyces cerevisiae YNG318:
MAT\alphaleu2-\Delta2 ura3-52
his4-539 pep4-\Delta1 [cir+]
\vskip1.000000\baselineskip
pCAMG91: ver Figura 1. Plásmido comprendiendo la
glucoamilasa de Aspergillus niger G1 (AMG GI). La
construcción de pCAMG91 está descrita en Boel et al. (1984),
EMBO J. 3 (7) p.1581-1585.
pMT838: plásmido que codifica la glucoamilasa de
Aspergillus niger truncada G2 (SEC ID NO: 2).
pJS0026 (plásmido de expresión de S.
cerevisiae) (J.S. Okkels, (1996)''A
URA3-promoter deletion in a pYES vector increases
the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces
cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of
Biological and Engineering Sciences, vol. 782 de los Anales de la
Academia de Ciencias de Nueva York). Más específicamente, el
plásmido de expresión pJSO37, es derivado de pYES 2,0 reemplazando
el promotor inducible GAL1 de pYES 2,0 con el promotor
constitutivamente expresado de TPI (triosa fosfato isomerasa) de
Saccharomyces cerevisiae (Albert y Karwasaki, (1982), J.
Mol. Appl Genet., 1, 419-434), y cancelando una
parte del promotor URA3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de ADN y los vectores abiertos
son mezclados y transformados en la levadura de Saccharomyces
cerevisiae YNG318 por métodos estándares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban 750 microL de sustrato (1% maltosa;
50 mM de acetato sódico, pH 4,3) 5 minutos a temperatura
seleccionada, tal como 37ºC ó 60ºC.
Se añade 50 microL de enzima diluida en acetato
sódico. Se retiran partes alícuotas de 100 microL después de 0, 3,
6, 9 y 12 minutos y se transfieren a 100 microL 0,4 M de hidróxido
de sodio para parar la reacción. Se incluye un blanco. Se
transfiere 20 microL a placas de Microtitulación y se añaden 200
microL de solución GOLD-Perid. La absorbencia es
medida a 650 nm después de 30 minutos de incubación a temperatura
ambiente. Se usa glucosa como estándar y la actividad específica es
calculada como K_{cat} (sec.^{-1}).
Una unidad de amiloglucosidasa Novo (AGU) es
definida como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de
maltosa por minuto a 37ºC y pH 4,3. Una descripción detallada del
método analítico (AEL-SM-0131) está
disponible a petición en Novo Nordisk.
La actividad es determinada como AGU/ml por un
método modificado después de
(AEL-SM-0131) usando el kit de
glucosa GOD-Perid de Boehringer Mannheim; 124036.
Estándar: lote estándar de AMG, lote 7-1195, 195
AGU/ml.
Se incuban 375 microL de sustrato (1% maltosa en
50 mM de acetato sódico, pH 4,3) 5 minutos a 37ºC. Se añaden 25
microL de enzima diluida en acetato sódico. La reacción es detenida
después de 10 minutos añadiendo 100 microL 0,25 M de NaOH. Se
transfieren 20 microL a una placa de microtitulación de 96 pocillos
y se añaden 200 microL de solución GOD-Perid.
Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la absorbencia es
medida a 650 nm y la actividad calculada en AGU/ml del AMG
estándar.
La actividad específica en AGU/mg es luego
calculada de la actividad (AGU/ml) dividida por la concentración de
proteína (mg/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculan 100 ml de YPD (Sherman et
al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory) con esporas de A. oryzae y se incuban con
agitación durante aproximadamente 24 horas. El micelio es cosechado
por filtración a través de miracloth y lavado con 200 ml de 0.6 M de
MgSO_{4}. El micelio es suspendido en 15 ml de 1,2 M de
MgSO_{4}, 10 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 5,8. La suspensión es
enfriada en hielo y se añade 1 ml de tampón conteniendo 120 mg de
Novozym^{TM} 234. Después de 5 min. se añade 1 ml de 12 mg/ml BSA
(Sigma tipo H25) y se continúa la incubación con agitación suave
durante 1,5-2,5 horas a 37ºC hasta que un gran
número de protoplastos es visible en una muestra inspeccionada bajo
el microscopio.
La suspensión es filtrada por miracloth, el
filtrado transferido a un tubo estéril y cubierto con 5 ml de 0,6 M
de sorbitol, 100 mM de tris-HCl, pH 7,0. Se realiza
el centrifugado durante 15 min. a 1000 g y los protoplastos son
recogidos de la parte superior del lecho de MgSO_{4}. 2 volúmenes
de STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de tris-HCl, pH
7,5, 10 mM de CaCl_{2}) son agregados a la suspensión de
protoplastos y la mezcla es centrifugada durante 5 min. a 1000 g.
El granulado de protoplastos es resuspendido en 3 ml de STC y
regranulado. Esto se repite. Finalmente, los protoplastos son
resuspendidos en 0,2-1 ml de STC.
Se mezclan 100 \mul de suspensión de
protoplastos con 5-25 \mug de p3SR2 (un plásmido
que lleva el gen amdS de A. nidulans descrito en Hynes et
al., Mol. y Cel. Biol., Vol. 3; nº. 8,
1430-1439; Aug. 1983) en 10 \mul de STC. La
mezcla es dejada a temperatura ambiente durante 25 min. Se añade 0,2
ml de 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM de CaCl_{2} y 10 mM de
tris-HCl, pH 7,5 y se mezcla cuidadosamente (dos
veces) y finalmente se añade y mezcla cuidadosamente 0,85 ml de la
misma solución. La mezcla es dejada a temperatura ambiente durante
25 min., centrifugada a 2.500 g durante 15 min. y el granulado es
resuspendido en 2 ml de 1,2M de sorbitol. Después de una
sedimentación más los protoplastos son extendidos en placas mínimas
(Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56)
conteniendo 1,0 M de sacarosa, pH 7,0, 10 mM de acetamida como
fuente de nitrógeno y 20 mM de CsCl para inhibir el crecimiento
residual. Tras la incubación durante 4-7 días a 37ºC
las esporas son recogidas, suspendidas en agua estéril y
extendiclas en colonias individuales. Este procedimiento es repetido
y las esporas de una colonia individual después del segundo
reaislamiento son almacenadas como un transformante definido.
\vskip1.000000\baselineskip
La fermentación con alimentación por lotes es
realizada en un medio comprendiendo maltodextrina como fuente de
carbono, urea como fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La
fermentación con alimentación por lotes es realizada inoculando un
cultivo en un frasco de agitación de las células huéspedes de A.
oryzae en cuestión en un medio comprendiendo 3,5% de la fuente
de carbono y 0,5% de la fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de
cultivo a pH 5,0 y 34ºC se inicia la alimentación continua de
fuentes de nitrógeno y carbono adicionales. La fuente de carbono es
mantenida como el factor de limitación y se asegura que el oxígeno
esté presente en exceso. Se continúa el cultivo con alimentación
por lotes durante 4 días, después de los cuales las enzimas pueden
ser recuperadas por centrifugado, ultrafiltración, filtración clara
y filtración de gérmenes.
\vskip1.000000\baselineskip
El caldo de cultivo es filtrado y se le añade
amoniosulfato (AMS) en una concentración de 1,7 M AMS y el pH es
ajustado a pH 5. El material de precipitado es retirado por
centrifugado y la solución que contiene actividad glucoamilasa es
aplicada en una columna Toyo Pearl Butyl previamente equilibrada en
1,7 M de AMS, 20 mM de acetato sódico, pH 5. El material no
enlazado es. lavado con el tampón de equilibrado. Las proteínas
enlazadas son eluidas con 10 mM de acetato sódico, pH 4,5 usando un
gradiente lineal de 1,7-0 M AMS sobre 10 volúmenes
de columna. Las fracciones conteniendo glucoamilasa son recogidas y
dializadas contra 20 mM de acetato sódico, pH 4,5. La solución fue
luego aplicada en una columna de sefarosa Q, previamente
equilibrada en 10 mM de Piperazina, Sigma, pH 5,5. El material no
enlazado es lavado con el tampón de equilibrado. Las proteínas
enlazadas son eluidas con un gradiente lineal de
0-0,3 M de cloruro sódico en 10 mM de Piperazina, pH
5,5 sobre 10 volúmenes de columna. Las fracciones conteniendo
glucoamilasa son recogidas y la pureza fue confirmada por
SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
La termoestabilidad de las variantes es
determinada como T_{1/2} usando el método siguiente: Se incuban
950 microlitros de 50 mM de tampón de acetato sódico (pH 4,3)
(NaOAc) durante 5 minutos a 68ºC ó 70ºC. Se añaden 50 microlitros
de enzima en tampón (4 AGU/ml). Se toman muestras de 2 x 40
microlitros a 0, 5, 10, 20, 30 y 40 minutos y se enfría en hielo. Se
usa la actividad (AGU/ml) medida antes de la incubación (0 minutos)
como referencia (100%). El descenso de la estabilidad (en
porcentaje) es calculado en función del período de incubación. La
actividad de glucoamilasa residual en % es determinada en tiempos
diferentes. T_{1/2} es el periodo de tiempo hasta que el % de
actividad relativa ha disminuido un 50%.
\vskip1.000000\baselineskip
El T_{1/2} es medido incubando la enzima
(aprox 0,2 AGU/ml) en cuestión en 30% de glucosa; 50 mM de acetato
sódico a pH 4,5 a la temperatura en cuestión (p. ej.: 70ºC). Se
retiran muestras a intervalos de tiempo establecidos y se enfrían
en hielo y se mide la actividad enzimática residual por el método
pNPG (como se describe abajo).
El % de actividad de glucoamilasa residual es
determinada en tiempos diferentes. T_{1/2} es el periodo de
tiempo hasta que el % de actividad relativa ha disminuido un
50%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelve 0,2 g de pNPG
(p-nitrofenilglucopiranosido) en 0,1 M de tampón de
acetato (pH 4,3) y se completa a 100 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelven 3,8 g de Na_{2}B_{4}O_{7} 10
H_{2}O en agua purificada en un sistema Milli-Q y
se completa hasta 100 ml.
Se añaden muestras de 25 microL a 50 microL de
sustrato y se incuban 2 hr a 50ºC. La reacción es detenida
añadiendo 150 micoL ml de solución de borato. Se mide la densidad
óptica a 405 nm y se calcula la actividad residual.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pAMGY fue construido como sigue: el
gen de lipasa en pJSO026 fue sustituido por el gen AMG, que fue
amplificado por PCR con el cebador directo: FG2:
5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA
ATG-3' y el cebador inverso: RG2:
5'-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG
AGT-3' usando el plásmido patrón pLAC103
conteniendo el gen AMG. El plásmido pJSO026 fue digerido con XbaI y
SmaI a 37ºC durante 2 horas y el amplicon PCR fue hecho romo usando
el fragmento Klenow y luego digerido con XbaI. El fragmento del
vector y el amplicon PCR fueron ligados y transformados en E.
coli por electrotransformación. El vector resultante es
designado pAMGY.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa el clon de ADNc AMGII de A. Niger
(Boel et al., (1984), supra) como fuente para la
construcción de pLaC103 dirigido a la expresión de S.
cerevisiae de la forma GII de AMG.
La construcción se desarrolla en diferentes
fases indicadas abajo.
Se divide pT7-212
(EP37856/Patente estadounidense nº. 5162498) con XbaI, con extremos
romos con ADN polimerasa de Klenow y dNTP. Después de dividir con
EcoRI, el fragmento del vector resultante es purificado por una
electroforesis de gel de agarosa y ligado con el fragmento
EcoRI-EcoRV de 2,05 kb de pBoel53, recreando de ese
modo el sitio de XbaI en el extremo EcoRV del fragmento de
codificación AMG en el plásmido resultante pG2x.
Para eliminar el ADN corriente arriba de los cds
AMG, y proveer el ADN de codificación de AMG con un sitio de
reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiada, se hizo el
siguiente constructo:
\newpage
El fragmento EcoRI-PstI de 930
pares de bases de p53 fue aislado y sometido a seccionamiento de
AluI, el fragmento resultante Alu-PstI de 771 bp fue
ligado en pBR322 con el sitio de EcoRI romo (ver arriba) y dividido
con PstI en el plásmido resultante pBR-AMG', el
sitio EcoRI fue recreado justo 34 bp del codón iniciador de los cds
de AMG.
De pBR-AMG' se aisló el
fragmento EcoRI-PstI de 775 bp y se unió con el
fragmento PstI-XbaI de 1151 pb de pG2x en una
reacción de ligadura incluyendo el fragmento del vector
XbaI-EcoRI de pT7-212.
El plásmido resultante pT7GII fue sometido a un
seccionamiento de BamHI en presencia de fosfatasa alcalina seguido
de seccionamiento parcial SphI después de la inactivación de la
fosfatasa. De esta reacción el fragmento SphI-BamHI
de 2489 bp, abarcando el promotor de TPI de S.c. fue enlazado
a los cds de AMGII. El fragmento anterior junto con el fragmenta
BamHI de 1052 bp de pT7GII fue ligado con el fragmento del vector
trataclo con fosfatasa alcalina de pMT743 (EP37856 /US 5162498),
produciendo la digestión de SphI-BamHI. El plásmido
resultante es pLaC103.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bibliotecas son seleccionadas en el ensayo
de filtro termoestable descrito abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocan ibliotecas de levadura en placas en
un sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher &
Schuell, Dassel, Alemania) - y filtros de nitrocelulosa
(Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel,
Alemania) sobre placas de CFura- agar con 100 \mug/ml de
ampicilina a 30ºC durante al menos 72 hrs. Las colonias son
colocadas en réplicas en filtros PVDF (Immobilon-P,
Millipore, Bedford) activados con metanol durante 1 min o
alternativamente un filtro Protran (sin activación) y
posteriormente lavado en 0,1 M cle NaAc y luego incubadas a
temperatura ambiente durante 2 horas. Las colonias son lavadas de
los filtros PVDF/Protran con agua corriente. Cada sandwich de
filtros y los filtros PVDF/Protran son específicamente marcados con
una aguja antes de la incubación con el objetivo de poder localizar
variantes positivas en los filtros después de la selección. Los
filtros PVDF con variantes enlazadas son transferidos a un
contenedor con 0,1 M de NaAc, pH 4,5 e incubados a 47ºC o
alternativamente 67-69ºC en caso de filtros Protran
durante 15 minutos. El sándwich de acetato de celulosa y los
filtros de nitrocelulosa sobre placas de SC
ura-agar son almacenados a temperatura ambiente
hasta su uso. Tras la incubación, las actividades residuales son
detectadas en placas que contienen un 5% de maltosa; 1% de agarosa;
50 mM de NaAc, pH 4,5. Las placas de ensayo con filtros PVDF son
marcadas de la misma manera que los sandwich de filtros e incubadas
durante 2 hrs. a 50ºC. Después de retirar los filtros PVDF, las
placas de ensayo son coloreadas con
glucosa/GOD-perid (Boehringer Mannheim Gmbh,
Alemania). Las variantes con actividad residual son detectadas en
las placas de ensayo como manchas verde oscuro sobre fondo blanco.
Las variantes mejoradas son localizadas en las placas de
almacenamiento. Las variantes mejoradas son refiltradas dos veces
según las mismas condiciones que la primera selección.
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis aleatoria puede ser realizada por
las fases siguientes:
- 1.
- Seleccionar regiones de interés para modificar la enzima progenitora,
- 2.
- Decidir sitios de mutación y sitios no mutados en la región seleccionada,
- 3.
- Decidir qué tipo de mutación debería realizarse, p. ej., con respecto a la estabilidad deseada y/o rendimiento de la variante a construir,
- 4.
- Seleccionar mutaciones estructuralmente razonables,
- 5.
- Ajustar los residuos seleccionados en la fase 3 con respecto a la fase 4.
- 6.
- Analizar, usando un algoritmo DOPE adecuado, la distribución de nucleótidos.
- 7.
- Si es necesario, ajustar los residuos deseados al realismo del código genético, p. ej. teniendo en cuenta las limitaciones que resultan del código genético, p. ej. para evitar la introducción de codones de parada; el experto en la materia sabrá que algunas combinaciones de codón no pueden ser usadas en la práctica y necesitan ser adaptadas
- 8.
- Hacer cebadores
- 9.
- Realizar la mutagénesis aleatoria usando los cebadores
- 10.
- Seleccionar las variantes de glucoamilasa resultantes seleccionando las propiedades deseadas mejoradas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los algoritmos DOPE adecuados para el uso en la
fase 6 son muy conocidos en la técnica. Tal algoritmo está descrito
por Tomandl, D. et al.; 1997; Journal of
Computer-Aided Molecular Design
11:29-38. Otro algoritmo es DOPE (Jensen, LJ,
Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids
Research 26:697-702).
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura de rayos X y/o la estructura
modelo de construcción de la enzima de interés, aquí AMG, es
sometida a simulaciones de dinámica molecular. Las simulaciones de
dinámica molecular se hicieron usando el programa CHARMM (de
simulaciones moleculares (MSI) u otros programas adecuados, p. ej.,
DISCOVER (de MSI). Las dinámicas son hechas en vacío, o incluyendo
aguas de cristalización, o con la enzima en cuestión introducida en
aguas adecuadas, p. ej., una esfera o una caja. Las simulaciones son
realizadas durante 300 picosegundos (ps) o más, p. ej.;
300-1200 ps. Las fluctuaciones isotrópicas son
extraídas para los carbonos CA de las estructuras y se hace la
comparación entre las estructuras. Se pueden encontrar más detalles
de cómo obtener las fluctuaciones isotrópicas en el manual CHARMM
(disponible en MSI).
La simulación de dinámica molecular puede
llevarse a cabo usando cargas estándares en los aminoácidos
cargables. Por ejemplo, Asp y Glu son cargados negativamente y Lys
y Arg son cargados positivamente. Esta condición se asemeja al pH
del medio de aproximadamente 7,0. Para analizar un pH inferior, se
puede hacer la titulación de la molécula para obtener el pKa's
alterado de los residuos titulables normales dentro de pH
2-10; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr y His. También Ser,
Thr y Cys son titulables pero no son tenidos en cuenta aquí. Aquí
se han descrito las cargas alteradas debido al pH como todos Arg,
Lys negativos a pH alto, y todos Asp, Glu sin carga. Esto imita un
pH de alrededor de 4 a 5 donde normalmente tiene lugar la titulación
de Asp y Glu.
El modelo de construcción de la enzima de
interés puede ser obtenido usando el modelo HOMOLOGY del paquete
informático MSI La estructura cristalina de la variante de
Aspergillus awamori x100 puede ser encontrada en, p. ej.;
3GLY y 1 DOG en la base de datos Brookhaven.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción de variantes de AMG G2 (SEC
ID NO: 2) se usó el kit comercial de mutagénesis dirigida
bicatenaria Chameleon según las instrucciones del fabricante.
El gen que codifica la enzima AMG G2 en cuestión
está localizado en pMT838 preparado cancelando el ADN entre G2 nt.
1362 y G2 nt. 1530 en el plásmido pCAMG91 (ver Figura 1)
comprendiendo la forma AMO G1.
Según las instrucciones del fabricante el sitio
Scal del gen de Ampicilina de pMT838 fue cambiado a un sitio Mlul
usando el cebador siguiente:
- 7258:
- 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' (SEC ID NO: 3).
(Cambiando así el sitio Scal encontrado en el
gen de resistencia a la ampicilina y usado para cortar a un sitio
Mlul). El vector pMT838 comprendiendo el gen AMG en cuestión fue
luego usado como un molde para ADN polimerasa y oligo 7258 (SEC ID
NO: 3) y 21401 (SEC ID NO: 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador nº. 21401 (SEC ID NO: 4) como
el cebador de selección.
- 21401:
- 5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3'
(Cambia el sito Scal encontrado en el gen AMG
sin cambiar la secuencia de aminoácidos).
\vskip1.000000\baselineskip
La mutación deseada (p. ej., la introducción de
un residuo de cisteína) es introducida en el gen AMG en cuestión
por adición de olidos apropiados comprendiendo la mutación
deseada.
\newpage
Se usó el cebador 107581 para introducir
T12P
- 107581:
- 5' pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3'(SEC ID NO: 5)
\vskip1.000000\baselineskip
Las mutaciones son verificadas secuenciando todo
el gen. El plásmido fue transformado en A. oryzae usando el
método anteriormente descrito en el apartado "Materiales y
Métodos". La variante fue fermentada y purificada del modo
descrito anteriormente en el apartado "Materiales y
Métodos".
\vskip1.000000\baselineskip
Para mejorar la termoestabilidad de AMG de A.
niger se realizó la mutagénesis aleatoria en una región
preseleccionada.
\vskip1.000000\baselineskip
Residuo:
- Región:
- L19-G35
- Región:
- A353-V374
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el software DOPE (ver Materiales y
Métodos) para determinar los codones adicionados para cada cambio
sugerido en las regiones indicadas arriba minimizando la cantidad
de codones de parada (ver tabla 1). La distribución exacta de
nucleótidos fue calculada en las tres posiciones del codón para dar
la población sugerida de cambios de aminoácidos. Las regiones
dopadas fueron dopadas específicamente en las posiciones indicadas
para tener una alta probabilidad de conseguir los residuos
deseados, pero permitir además otras posibilidades.
La primera columna es el aminoácido que se debe
mutar, la segunda columna es el porcentaje de tipo salvaje y la
tercera columna define el (los) nuevo(s)
aminoácido(s).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena de oligonucleótidos dopada resultante
es mostrada en la tabla 2 como hebra codificante: con la secuencia
de cebador, la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, la
secuencia de aminoácidos progenitores y la distribución de
nucleótidos para cada posición dopada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Distribución de nucleótidos para cada posición
dopada.
- 1:
- A10, C90
- 2:
- A6; T94
- 3:
- A95,C5
- 4:
- G95, C5
- 5:
- G91, A3, T3, C3
- 6:
- G95, A3, C2
- 7:
- G3; A95, C2
- 8:
- G92, A4, T4
- 9:
- A3, T97
- 10:
- G95, T5
- 11:
- G3; A97
- 12:
- G95, A2, C3
- 13:
- T5, C95
- 14:
- G88, A8, C4
- 15:
- G7, A93
- 16:
- G4, C96
- 17:
- G4, A96
- 18:
- G95, A2, C3
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena de oligonucleótidos dopada resultante
es mostrada en la tabla 4 como hebra codificante: con la secuencia
de cebador, secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, la secuencia
de aminoácidos progenitores y la distribución de nucleótidos para
cada posición dopada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Distribución de nucleótidos para cada posición
dopada.
- 1:
- G91, A3, T3, C3
- 2:
- A13, C87
- 3:
- A40, T60
- 4:
- G3, A3, C94
- 5:
- A6, T94
- 6:
- G4, A4; T92
- 7:
- G2, A96, C2
- 8:
- G93, A3.5, C3.5
- 9:
- G87, A8, C5
- 10:
- A84; C16
- 11:
- G93, T7
- 12:
- G92, A5, T3
- 13:
- A3, C97
- 14:
- G3, A97
- 15:
- G2, A2, T4, C92
- 16:
- G93, A7
- 17:
- G93, C7
- 18:
- A90, T10
- 19:
- G4, A96
- 20:
- G95, A5
- 21:
- G96, A4
- 22:
- G3, C97
- 23:
- G2, A1, T95, C2
- 24:
- A3, C97
- 25:
- G95, A3, C2
- 26:
- G2, A96, C2
- 27:
- A5, C95
- 28:
- A95, T5
- 29:
- G2, A98
- 30:
- G94, A4, C2
- 31:
- G94, A3, T1, C2
- 32:
- A4, T96
- 33:
- A20, C80
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los oligonucleótidos adicionados que aparecen en
la Tabla 2 y 3 (que por término común es designado FAMG) y los
cebadores inversos RAMG para la región L19-G35 y
los cebadores específicos de la SEC ID NO: 2 que cubren el terminal
N (FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA
ATG-3' (SEC ID NO: 10) y el terminal C (RG2:
5'-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT (SEC ID NO:
11) se utilizan para generar fragmentos de biblioteca de PCR por el
método de extensión de superposición (Horton et al., Gene, 77
(1989), págs. 61-68) con una superposición de 21
pares de bases. El plásmido pAMGY es un patrón para la reacción en
cadena de la polimerasa. Los fragmentos de la PCR son clonados por
recombinación homóloga en el vector transportador pAMGY de E.
coli/levadura (ver Materiales y Métodos).
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca fue seleccionada en los ensayas de
filtro de termoestabilidad usando un filtro Protran e incubando a
67-69ºC, como se describe en el apartado de
"Materiales y Métodos" arriba
\vskip1.000000\baselineskip
El método de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) fue usado para preparar fragmentos de ADN llevando el gen AMG
y las regiones flanqueantes. Aproximadamente 10 ug de ADN fue
digerido con ADNsa, y realizado sobre un 2% de gel de agarosa. Se
purificaron fragmentos de 50-150 bp del gel.
Aproximadamente 1 ug de fragmentos purificados fueron mezclados con
un exceso molar de 5-15 veces de óligos llevando las
mutaciones deseadas. Los óligos fueron del siguiente tipo (para la
construcción de Hklibl, Hklib2, Hklib3 etc., respectivamente):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
A la mezcla de ADN tratado con ADNsa y óligos se
añadió nucleótidos, tampón PCR y polimerasa Taq/Pwo. Se realizó una
reacción de ensamblaje PCR usando primero 94ºC durante 2 min.,
luego 35-40 ciclos con los siguientes tiempos de
incubación: 94ºC; 30 seg.; 45ºC; 30 seg.; 72ºC; 60 seg; luego
finalmente 72ºC durante 5 min. Se realizó una reacción de
amplificación PCR con 1 uL de la reacción de ensamblaje como patrón
y añadiendo cebadores que anelan para las regiones flanqueantes del
gen AMG. Parámetros: primero 94ºC durante 2 min., luego
35-40 ciclos con los siguientes tiempos de
incubación: 94ºC; 30 seg.; 55ºC; 30 seg.; 72ºC; 90 seg; luego
finalmente 72ºC durante
10 min.
10 min.
El producto resultante de la PCR fue purificado
de un 1% de gel de agarosa, mezclado con vector linealizado y
transformado en células de levadura competentes del modo descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron variantes de AMG G2 del modo
descrito anteriormente en el ejemplo 1. Se midió la actividad
específica como K_{cat} sobre muestras purificadas a pH 4,3,
37ºC, usando maltosa y maltohepatosa como sustrato como se describe
en el apartado de "Materiales y Métodos" arriba. También se
midió la actividad específica como AGU/mg a pH 4,3, 37ºC, usando
maltosa como sustrato como se describe en el apartado de
"Materiales y Métodos" arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó una variante de AMG G2 S119P usando
el procedimiento descrito en el ejemplo 1.
La termoestabilidad fue determinada como
T_{1/2} usando el Método I, y como % de actividad residual tras
la incubación durante 30 minutos en 50 mM de NaOAc, pH 4,5, 70ºC;
0,2 AGU/ml, como se describe en el apartado de "Materiales y
Métodos" arriba. El resultado de las pruebas está relacionado en
la tabla abajo y en comparación con AMG G2 de A. niger de
tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron variantes de AMG G2 usando el
procedimiento descrito en el ejemplo 3, salvo las variantes nos. 1
y 2 en la tabla abajo, que fueron preparadas por redistribución
como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.). La
termoestabilidad fue determinada como T_{1/2} usando el método I
a 68ºC como se describe en el apartado de "Materiales y
Métodos" y en comparación con AMG G2 de A. niger de tipo
salvaje según las mismas condiciones. Se realizó la evaluación de
las variantes en el caldo de cultivo después de filtrar los
sobrenadantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se construyeron variantes de AMG G2 por
redistribución usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3
seguido de redistribución de variantes positivas.
La termoestabilidad fue determinada como
T_{1/2} usando el Método I a 68ºC como se describe en el apartado
de "Materiales y Métodos" y en comparación con el AMG G2 de
A. niger de tipo salvaje bajo las mismas condiciones. Se
realizó la evaluación de las variantes en el caldo de cultivo
después de filtrar los sobrenadantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron variantes de AMG G2 usando el
procedimiento descrito en el ejemplo 3. La termoestabilidad fue
determinada como T_{1/2} usando el Método I a 68ºC como se
describe en el apartado de "Materiales y Métodos" y en
comparación con el AMG G2 de A. niger de tipo salvaje bajo
las mismas condiciones. Se realizó la evaluación de las variantes
en el caldo de cultivo después de filtrar los sobrenadantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron las variantes de AMG G2 usando
el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 y se evaluó como muestras
semipurificadas (filtración de caldo de cultivo seguido de
desalación en un columna G-25).
La termoestabilidad fue determinada como % de
actividad residual usando el Método I en 50 mM de NaOAc, pH 4,5,
70ºC, como se describe en el apartado de "Materiales y
Métodos" arriba. El resultado de la prueba está relacionado en
la tabla abajo y en comparación con el AMG G2 de A. niger de
tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron variantes de AMG G2 usando el
procedimiento descrito en el ejemplo 3.
La termoestabilidad fue determinada como
T_{1/2} usando el Método II a 70ºC como se describe en el
apartado de "Materiales y Métodos" y en comparación con el AMG
G2 de A. niger de tipo salvaje bajo las mismas
condiciones.
Se evaluó el rendimiento de sacarificación de
las variantes de AMG S119P+Y402F+S411V y
PLASD(N-terminal)+V59A+A393R+T490A,
respectivamente, ambos teniendo termoestabilidad mejorada a 70ºC
como se describe abajo.
La enzima de referencia es el AMG G2 de A.
niger de tipo salvaje. La sacarificación es realizada bajo las
condiciones siguientes:
- Substrato
- 10 DE Maltodextrina, aprox. 30% DS (p/p)
- Temperatura
- 70ºC
- pH inicial
- 4,3 (a 70ºC)
- Dosificación de Enzima
- 0,24 AGU/g DS
\vskip1.000000\baselineskip
Se hace el sustrato para la sacarificación
disolviendo maltodextrina (obtenida de maíz común) en agua
purificada con un sistema Milli-Q en ebullición y
ajustando la materia seca a aproximadamente 30% (p/p). El pH es
ajustado a 4,3. Partes alícuotas del sustrato correspondiente a 15 g
de materia seca son transferidas a frascos de vidrio con tapón azul
de 50 ml y colocados en un baño de agua con agitación. Se añaden
las enzimas y se reajusta el pH si es necesario. El experimento es
realizado por duplicado. Se toman muestras periódicamente y se
analizan en HPLC para determinar la composición del
carbohidrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: NOVO NORDISK A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Allé
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (Identificación de Zona Postal): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 4449 3256
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE INVENCIÓN: Variantes de glucoamilasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 81
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1605 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "ADNc"
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Aspergillus Niger
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:73..1602
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1..1602
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 534 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador 7258"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador 21401"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador 107581"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaacgaagc gcccgtggct cgtac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 109 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador FAMGII"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 30, 33, 42, 44, 47, 48, 51, 53, 56, 57, 58, 62, 63, 66, 69, 71, 72, 73, 74, 75
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /Note=
\vskip0.500000\baselineskip
- 1: A10, C90
\vskip0.500000\baselineskip
- 2: A6; T94
\vskip0.500000\baselineskip
- 3: A95, C5
\vskip0.500000\baselineskip
- 4: G95, C5
\vskip0.500000\baselineskip
- 5: G91, A3, T3, C3
\vskip0.500000\baselineskip
- 6: G95, A3, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 7: G3, A95, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 8: G92, A4, T4
\vskip0.500000\baselineskip
- 9: A3, T97
\vskip0.500000\baselineskip
- 10: G95, T5
\vskip0.500000\baselineskip
- 11: G3, A97
\vskip0.500000\baselineskip
- 12: G95, A2, C3
\vskip0.500000\baselineskip
- 13: T5, C95
\vskip0.500000\baselineskip
- 14: G88, A8, C4
\vskip0.500000\baselineskip
- 15: G7, A93
\vskip0.500000\baselineskip
- 16: G4, C96
\vskip0.500000\baselineskip
- 17: G4, A96
\vskip0.500000\baselineskip
- 18: G95, A2, C3
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador RAMG1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGCAGTA CGAGCCACGG TCGCTTCG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador FAMGIV"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature
\vskip0.500000\baselineskip
- LOCALIZACIÓN: 22, 23, 24, 25, 26, 28, 31, 32, 34, 35; 37, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 55, 56, 59, 60; 61, 62, 67, 68, 70, 71, 74, 77, 79, 80, 85, 86, 87
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /Note=
\vskip0.500000\baselineskip
- 1: G91, A3, T3, C3
\vskip0.500000\baselineskip
- 2: A13, C87
\vskip0.500000\baselineskip
- 3: A40, T60
\vskip0.500000\baselineskip
- 4: G3, A3, C94
\vskip0.500000\baselineskip
- 5: A6, T94
\vskip0.500000\baselineskip
- 6: G4, A4, T92
\vskip0.500000\baselineskip
- 7: G2, A96, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 8: G93, A3.5, C3.5
\vskip0.500000\baselineskip
- 9: G87, A8, C5
\vskip0.500000\baselineskip
- 10: A84, C16
\vskip0.500000\baselineskip
- 11: G93, T7
\vskip0.500000\baselineskip
- 12: G92, A5, T3
\vskip0.500000\baselineskip
- 13: A3, C97
\vskip0.500000\baselineskip
- 14: G3, A97
\vskip0.500000\baselineskip
- 15: G2, A2, T4, C92
\vskip0.500000\baselineskip
- 16: G93, A7
\vskip0.500000\baselineskip
- 17: G93, C7
\vskip0.500000\baselineskip
- 18: A90, T10
\vskip0.500000\baselineskip
- 19: G4, A96
\vskip0.500000\baselineskip
- 20: G95, A5
\vskip0.500000\baselineskip
- 21: G96, A4
\vskip0.500000\baselineskip
- 22: G3, C97
\vskip0.500000\baselineskip
- 23: G2, A1, T95, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 24: A3, C97
\vskip0.500000\baselineskip
- 25: G95, A3, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 26: G2, A96, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 27: A5, C95
\vskip0.500000\baselineskip
- 28: A95, T5
\vskip0.500000\baselineskip
- 29: G2, A98
\vskip0.500000\baselineskip
- 30: G94, A4, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 31: G94, A3, T1, C2
\vskip0.500000\baselineskip
- 32: A4, T96
\vskip0.500000\baselineskip
- 33: A20, C80
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- descripción de la secuencia: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador RAMGVI"
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGAAGAAG TCCAGCGACA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador FG2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCCCCAGG ATCCTTACTC AGCAATG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador RG2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCAAACGAC TCACCAGCCT CTAGAGT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2602
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (270) ... (323)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (342) ...(2438)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (484) ...(558)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (846) ... (900)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (998) ...(1058)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1697) ... (1754)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Aspergillus
niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
HK1-T2X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgtgatttc caagcgcgcg vnnttggatt catggttgag caa
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-N9X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttggattc atggttgagc vnngaagcga ccgtggctcg tac
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-A1 IX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattcatggtt gagcaacgaa vnnaccgtgg ctcgtactgc cat
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERISTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-L66X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctcaagac cctcgtcgat vnnttccgaa atggagatac cag
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERISTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-S386X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctttcgccga tggcttcgtc vnnattgtgg aaactcacgc cgc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-E389X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcttcgt ctctattgtg vnnactcacg ccgcaagcaa cgg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-T390X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTCGTCTC TATTGTGGAA VNNCACGCCG CAAGCAACGG CTC
\hfill43
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-A393X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattgtgga aactcacgcc vnnagcaacg gctccatgtc cga
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-S394X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgtggaaac tcacgccgca vnnaacggct ccatgtccga gca
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-N395X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaaactca cgccgcaagc vnnggctcca tgtccgagca ata
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-G296X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaactcacgc cgcaagcaac vnntccatgt ccgagcaata cga
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-K404X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgtccga gcaatacgac vnntctgatg gcgagcagct ttc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-D406X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgagcaata cgacaagtct vnnggcgagc agctttccgc tcg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-E408X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatacgacaa gtctgatggc vnncagcttt ccgctcgcga cct
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-L410X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaagtctga tggcgagcag vnntccgctc gcgacctgac ct
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-L423X
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggtctta tgctgctctg vnnaccgcca acaaccgtcg taa
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO: 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-N426X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgctgctct gctgaccgcc vnnaaccgtc gtaactccgt cgtg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hkl-N427X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCTCTGCT GACCGCCAAC VNNCGTCGTA ACTCCGTCGT GCCT
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk1-Y402X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGCTCCAT GTCCGAGCAA NNCGACAAGT CTGATGGCGA GCAGCT
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-L234X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaccggc agcttcattn nkgccaactt cgatagcagc c
\hfill41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-A235S antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacggctgc tatcgaagtt agacagaatg aagctgccgg tc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-NF237X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcttcatt ctggccaacn atgatagcag ccgttccggc a
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO: 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-D238T antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttgccgga acggctgcta gtgaagttgg ccagaatgaa gc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-D238S antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttgccgga acggctgcta gagaagttgg ccagaatgaa gc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-S239X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcattctggc caacttcgat nncagccgtt ccggcaagga cg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-S240G antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcgtcctt gccggaacga ccgctatcga agttggccag aa
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO: 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-S242X antisertido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtgtttgc gtccttgcca knacggctgc tatcgaagtt g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-G243X antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagggtgtt tgcgtcctta knggaacggc tgctatcgaa g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-K244R sentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatagcagc cgttccggca gagacgcaaa caccctcctg g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-T310V antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgggttgcc gttgtagtaa acgtcctcag ggtaccgacc c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-T310S antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgggttgcc gttgtagtaa gagtcctcag ggtaccgacc c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-Y311N sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggtaccct gaggacacga attacaacgg caacccgtgg t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-Y312Q antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaccacgg gttgccgttt tggtacgtgt cctcagggta c
\hfill41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:47.
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-Y312N antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaccacgg gttgccgtta ttgtacgtgt cctcagggta c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-N313T sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgaggac acgtactaca ctggcaaccc gtggttcctg t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-N313S sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgaggac acgtactact ctggcaaccc gtggttcctg t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-N313G sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgaggac acgtactacg gtggcaaccc gtggttcctg t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-N315Q antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO: 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtgcacag gaaccacggt tggccgttgt agtacgtgtc c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-N315E antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO: 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtgcacag gaaccacggt tcgccgttgt agtacgtgtc c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-N315R antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtgcacag gaaccacggt ctgccgttgt agtacgtgtc c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-F318Y antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcagccaa ggtgcacaga taccacgggt tgccgttgta g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID N0:55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk2-Q409P sentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacaagtct gatggcgagc cactttccgc tcgcgacctg a
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-D336X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatgctcta taccagtggn nkaagcaggg gtcgttggag g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-K337X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctctatac cagtgggacn nkcaggggtc gttggaggtc a
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-Q338X antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtgacctc caacgacccg nncttgtccc actggtatag a
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-G339X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataccagtgg gacaagcagn cutcgttgga ggtcacagat g
\hfill41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S34OX antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacatctgt gacctccaaa ntcccctgct tgtcccactg g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S340C antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacatctgt gacctccaaa nccccctgct tgtcccactg g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-L341X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggacaag caggggtcgn uugaggtcac agatgtgtcg c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-K352Q sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgtcgctg gacttcttcc aagcactgta cagcgatgct g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-K352R sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgtcgctg gacttcttca gagcactgta cagcgatgct g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-A352D antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagcagcatc gctgtacaga tccttgaaga agtccagcga c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-A353S antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagcagcatc gctgtacaga gacttgaaga agtccagcga c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S356P sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacttcttcaag gcactgtacc cagatgctgc tactggcacc t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S356N sentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacttcttcaa ggcactgtac aaugatgctg ctactggcac cta
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S356X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacttcttcaa ggcactgtac gaugatgctg ctactggcac cta
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-D357S antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtaggtgc cagtagcagc agagctgtac agtgccttga aga
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-A359S sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO: 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcactgtac agcgatgctt ctactggcac ctactcttcg t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-T360V antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggacgaaga gtaggtgcca acagcagcat cgctgtacag t
\hfill41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-G361X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtacagcga tgctgctact nctacctact cttcgtccag ttc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-T362R antiseritido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgaactgg acgaagagta tctgccagta gcagcatcgc tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> LONGITUD: 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CARACTERÍSTICA:
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S364X sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctgctact ggcacctacn nktcgtccag ttcgacttat ag
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:76
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<211> LONGITUD: 42
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<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<220> CARACTERÍSTICA:
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<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S365X sentido
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<400> SEC ID NO:76
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\hskip-.1em\dddseqskiptgctactggc acctactctn nktccagttc gacttatagt ag
\hfill42
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<210> SEC ID NO:77
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<211> LONGITUD: 42
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<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<220> CARACTERÍSTICA:
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<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S366T antisentido
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<400> SEC ID NO: 77
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\hskip-.1em\dddseqskipatgctactat aagtcgaact agtcgaagag taggtgccag ta
\hfill42
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<210> SEC ID NO:78
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<211> LONGITUD: 42
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<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<220> CARACTERÍSTICA:
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<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S368X antisentido
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<400> SEC ID NO:78
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\hskip-.1em\dddseqskiptctacaatgc tactataagt agnactggac gaagagtagg tg
\hfill42
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<210> SEC ID NO:79
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<211> LONGITUD: 43
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<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<220> CARACTERÍSTICA:
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<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-T369X sentido
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<400> SEC ID NO:79
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\hfill43
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<210> SEC ID NO:80
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<211> LONGITUD: 43
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<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<220> CARACTERÍSTICA:
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<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S371X antisentido
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<400> SEC ID NO:80
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\hfill43
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<210> SEC ID NO:81
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<211> LONGITUD: 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> TIPO: ADN
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<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
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<220> CARACTERÍSTICA:
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<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador
Hk3-S372X sentido
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<400> SEC ID NO:81
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\hskip-.1em\dddseqskipcgtccagttc gacttatagt nntattgtag atgccgtgaa gac
\hfill43
Claims (23)
1. Variante de una glucoamilasa progenitora que
tiene mejor termoestabilidad con respecto a la glucoamilasa
progenitora comprendiendo una o más mutaciones en la(s)
siguiente(s) posición(es) en la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 E408R+A425T+S465P+T494A,
E408R+S386N, T2Q+Al 1 P+S394R, A11E+E408R,
T2M+N9A+T390R+0406N+L410R. A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R,
A1V+L66R+Y402F+N427S+
S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, T2R+S386R+A393R, Y402F, V59A+A393R+T490A, y una extensión del N-terminal que consiste en PLASD Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H, y/o en una posición correspondiente en una glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos un 60% con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO: 2.
S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, T2R+S386R+A393R, Y402F, V59A+A393R+T490A, y una extensión del N-terminal que consiste en PLASD Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H, y/o en una posición correspondiente en una glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos un 60% con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO: 2.
2. Variante según cualquiera de la
reivindicación 1, donde la glucoamilasa homóloga progenitora es la
glucoamilasa de Aspergillus niger G1.
3. Variante según cualquiera de la
reivindicaciones 1-2, donde la glucoamilasa es una
glucoamilasa truncada, en particular en el
C-terminal.
4. Constructo de ADN comprendiendo una secuencia
de ADN que codifica una variante de glucoamilasa según cualquiera
de las reivindicaciones 1-3.
5. Vector de expresión recombinante que lleva un
constructo de ADN según la reivindicación 4.
6. Célula que es transformada con un constructo
de ADN según la reivindicación 4 o un vector según la
reivindicación 5.
7. Célula según la reivindicación 6, que es un
microorganismo, tal como una bacteria o un hongo.
8. Célula según la reivindicación 7, que es un
Aspergillus oryzae o Aspergillus niger deficiente en
proteasa.
9. Proceso para convertir almidón de almidón
parcialmente hidrolizado en un jarabe conteniendo dextrosa, dicho
proceso incluyendo la fase de sacarificar el almidón hidrolizado en
presencia de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3.
10. Proceso según la reivindicación 9, donde la
dosificación de glucoamilasa está presente en el rango de 0,05 a
0,5 AGU por gramo de materia seca.
11. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 10, comprendiendo la sacarificación de un
almidón hidrolizado de al menos 30 por ciento en peso de materia
seca.
12. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 9-11, donde la sacarificación es
conducida en presencia de una enzima desramificante seleccionada
del grupo de pululanasa e isoamilasa, preferiblemente una
pululanasa derivada de Bacillus acidopullulyticus o
acillus deramificans o una isoamilasa derivada de
Pseudomonas amyloderamosa.
13. Proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 9-12, donde la sacarificación es
conducida a un pH de 3 a 5,5 y a una temperatura de
60-80ºC. preferiblemente 63-75ºC,
durante 24 a 72 horas, preferiblemente durante
36-48 horas a un pH de 4 a 4,5.
14. Método de sacarificación de una solución de
almidón licuado, cuyo método comprende
- (i)
- una fase de sacarificación durante cuya fase se realiza uno o más estadios de sacarificación enzimática, y la fase posterior de
- (ii)
- una o más fases de separación por membrana a alta temperatura donde la sacarificación enzimática se realiza usando una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
15. Uso de una variante de glucoamilasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
proceso de conversión de almidón.
16. Uso de una variante de glucoamilasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
proceso de conversión de almidón continuo.
17. Uso según la reivindicación 16, donde el
proceso de conversión de almidón continuo incluye un proceso de
sacarificación continuo según la reivindicación 14.
18. Uso de una variante de glucoamilasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
proceso para producir oligosacáridos.
19. Uso de una variante de glucoamilasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
proceso para producir jarabes especializados.
20. Uso de una variante de glucoamilasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
proceso para producir etanol para combustible.
21. Uso de una variante de glucoamilasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
proceso para producir una bebida.
22. Uso de una variante de glucoamilasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un
proceso de fermentación para producir compuestos orgánicos, tales
como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutámico.
23. Método para mejorar la termoestabilidad de
una glucoamilasa progenitora haciendo una mutación en una o más de
la(s) siguiente(s) posición(es) en la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2:
E408R+A425T+
S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+A11P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+D408N+L410R, A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2E+T379A+S386K+A393R.
S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+A11P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+D408N+L410R, A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2E+T379A+S386K+A393R.
T2R+S386R+A393R, Y402F, V59A+A393R+T490A, y una
extensión del N-terminal que consiste en PLASD,
Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V,S119P+Y312Q+Y402F+T416H.
y/o en una posición correspondiente en una
glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos
un 60% con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO:
2.
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