ES2295005T3 - Uso de hialuronano para la preparacion de un medicamento para la mejora de la eficacia de farmacos citotoxicos. - Google Patents
Uso de hialuronano para la preparacion de un medicamento para la mejora de la eficacia de farmacos citotoxicos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2295005T3 ES2295005T3 ES00902481T ES00902481T ES2295005T3 ES 2295005 T3 ES2295005 T3 ES 2295005T3 ES 00902481 T ES00902481 T ES 00902481T ES 00902481 T ES00902481 T ES 00902481T ES 2295005 T3 ES2295005 T3 ES 2295005T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tumor
- mtx
- drug
- hyaluronan
- mice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/728—Hyaluronic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
El uso de hialuronano en la elaboración de un medicamento para utilizar en combinación o coadministrado con un fármaco para el tratamiento de un cáncer que es resistente a dicho fármaco.
Description
Uso de hialuronano para la preparación de un
medicamento para la mejora de la eficacia de fármacos
citotóxicos.
La presente invención está relacionada con la
mejora de la eficacia de los fármacos, y más concretamente, con la
superación de la resistencia de las células u organismos a los
fármacos.
La utilidad clínica de cualquier agente o
fármaco quimioterapéutico puede verse gravemente afectada por la
emergencia de resistencia celular a ese fármaco. De acuerdo con
esto, una gran cantidad de investigaciones se han dirigido a
intentar elucidar los mecanismos celulares involucrados en la
resistencia a los fármacos, así como los métodos para superar dicha
resistencia. Hasta la fecha se han propuesto una serie de posibles
mecanismos celulares involucrados en la resistencia a un fármaco.
Estos incluyen:
(i) alteración del metabolismo de los fármacos,
lo que pueden incluir la disminución de la activación o aumento de
la desactivación;
(ii) impermeabilidad de la célula u organismo
diana al compuesto activo;
(iii) especificidad alterada de una enzima
inhibida;
(iv) aumento de la producción de una molécula
diana;
(v) aumento de la reparación de lesiones
citotóxicas; y
(vi) desviación de una reacción inhibida
mediante rutas bioquímicas alternativas.
Los mecanismos celulares involucrados en la
resistencia a los fármacos son complejos, y en consecuencia AH
habido poco progreso en el desarrollo de métodos de aplicación
general para superar los problemas de resistencia a los fármacos.
Otro factor de dificultad es el hecho de que aunque la resistencia a
los fármacos es un problema asociado con casi todas las
utilizaciones quimioterapéuticas, se asocia con mayor frecuencia con
enfermedades que requieren un tratamiento continuo y prolongado con
una serie de fármacos concomitantes.
En el tratamiento del cáncer, por ejemplo, la se
observa a menudo una impermeabilidad de las células cancerosas al
compuesto activo. Además, a menudo se detecta que la resistencia a
un fármaco puede conferir resistencia a otros fármacos
bioquímicamente distintos. Esto se AH denominado multiresistencia a
los fármacos. Fármacos que se ven afectados típicamente por el
problema de la multiresistencia a los fármacos incluyen la
doxorubicina, vincristina, vinblastina, colchicina y actinomicina
D. En al menos algunos casos, la multiresistencia a los fármacos es
un fenotipo complejo que se AH asociado con un elevado nivel de
expresión de un transportador de salida de fármaco de la membrana
celular denominado proteína MdrI, también conocido como
glicoproteína P. Esta "bomba" de la membrana tiene una amplia
especificidad, y actúa para eliminar de la célula una gran variedad
de toxinas químicamente no relacionadas (véase Endicott et
al., 1989).
Recientemente, se AH descrito un mecanismo
similar de resistencia de amplio espectro a los fármacos en ciertos
microorganismos. Estos resultados indican la existencia de sistemas
bacterianos de expulsión de especificidad de sustrato
extremadamente amplia que son similares a la bomba de
multiresistencia a los fármacos de las células de mamífero (véase
Nikaido, 1993).
Las sustancias que revierten la multiresistencia
a los fármacos son conocidas como agentes de modificación de la
resistencia (AMR), y son importantes en la potenciación de la
citotoxicidad de los agentes quimioterapéuticos a los que los
tumores humanos se han hecho resistentes. Aunque se han identificado
muchos agentes AMR in vitro, una gran proporción de ellos no
tiene o tiene poco potencial terapéutico a causa de la elevada
toxicidad in vivo a las dosis necesarias para revertir la
multiresistencia a los fármacos. Por ejemplo, los venenos
metabólicos, como la azida, son capaces de revertir la
multiresistencia a los fármacos in vitro, pero no son útiles
in vivo. La mayoría del resto de AMR altamente efectivos,
como el PSC833, parecen actuar como antagonistas competitivos de
una diana de unión de fármacos en la proteína MdrI. Muchos de estos
agentes también tiene una toxicidad que limita su utilidad in
vivo. En consecuencia, es necesario desarrollar estrategias
farmacológicas alternativas para revertir la multiresistencia a los
fármacos.
En un intento de superar la baja incorporación
de fármacos antineoplásicos en los tumores y de reducir la
toxicidad sistémica (Singh et al., 1991), los investigadores
han intentado dirigir los fármacos antineoplásicos como el
metotrexato (MTX) a la localización del tejido maligno. Varios
estudios ya han intentado dirigir los agentes quimioterapéuticos a
los tumores mediante la unión los fármacos a polímeros seleccionados
por su afinidad hacia los tumores (Hudecz et al., 1993;
Klein et al., 1994; Akima et al., 1996). Sin embargo,
aunque estos polímeros pueden ayudar a depositar los agentes
activos en sus tejidos diana, no necesariamente superan el problema
de resistencia a los fármacos.
Un polímero propuesto como agente de
focalización en los tumores es el hialuronano (AH). El AH, también
conocido como ácido hialurónico, es un polisacárido que aparece en
la naturaleza y comprende polímeros de cadena sencilla, que se
encuentra de forma ubicua en todo el reino animal. El AH es muy
hidrosoluble, lo que lo convierte en un vehículo de liberación de
fármacos ideal para sistemas biológicos.
Los solicitantes han detectado que
sorprendentemente el AH muestra unas propiedades estructurales y
fisicoquímicas únicas que no sólo mejoran su utilidad como
transportador de fármacos, sino que también contribuyen a la
superación de la resistencia a los fármacos. En concentraciones
elevadas de \sim1 g/L, el AH adopta una configuración rígida de
tirabuzón al azar que ocupa un volumen excepcional en relación con
la masa de la molécula (Laurent, 1970), y a este nivel o inferior,
forma uniones débiles a redes macromoleculares (Figura 1). Sin
intención de suscribir una teoría en particular, se considera que,
en base a las características físicas del AH, el mecanismo de
interacción entre el polisacárido y agentes como el metotrexato,
pueden tener una o ambas de estas formas:
Pueden aparecer enlaces iónicos entre los grupos
amina del MTX y los grupos carboxilo del AH, pero tal interacción
podría causar precipitación. Otra posible interacción es a través de
puentes de hidrógeno entre grupos amina disponibles en el fármaco y
grupos hidroxilo del AH, pero esto es improbables ya que el
metotrexato es relativamente insoluble en agua; por lo tanto si
esto ocurriera sería una interacción muy débil. La unión más
probable entre MTX y AH sería a través de interacciones
hidrofóbicas entre los numerosos grupos hidrofóbicos del MTX y las
regiones hidrofóbicas en la estructura secundaria del AH (Scott
et al., 1989).
Si el MTX está simplemente "mezclado" en un
gel de AH (Figura 2B) sin formación de un enlace químico específico,
MTX podría quedar atrapado en la red tridimensional formada por
concentraciones elevadas de AH (Mikelsaar y Scott, 1994), de forma
que el fármaco simplemente difunde desde el AH tras su
administración. Si el AH se incorpora rápidamente y se une a
receptores celulares específicos, el fármaco se liberará en una
concentración mayor en estos puntos, por ejemplo nódulos
linfáticos, hígado, médula ósea o células tumorales con receptores
de
AH.
AH.
De nuevo sin intención de suscribir una teoría
en particular, un mecanismo mediante el cual el AH contribuye a
dirigir los agentes activos podría ser a través de la sobreexpresión
característica de receptores de AH en muchos tipos tumorales
(Stamenkovic et al., 1991; Wang et al., 1998). Los
receptores de AH CD44, receptor para la motilidad mediada por
hialuronano (RHAMM) e ICAM-1, se han relacionado con
la formación (Bartolazzi et al., 1994) y progresión de
tumores (Günthert 1993; Arch et al., 1992). RHAMM es un
factor esencial en la mediación de la motilidad e invasión de las
células tumorales (Hardwick et al., 1992). Se ha demostrado
que RHAMM es necesario para la transformación de fibroblastos a
través de H-ras (Hall et al., 1995), lo que
indicaría que este receptor potencialmente participa en la
formación y crecimiento tumorales. ICAM-1, un
receptor provisionalmente asociado con el metabolismo del AH
(McCourt et al., 1994), tiene una elevada expresión en
tejidos transformados como los mastocitomas de ratón (Gustafson
et al., 1995a) y en el estroma y grupos de células tumorales
de los carcinomas de mama humanos (Ogawa et al., 1998).
La expresión aumentada de los receptores de AH
en células tumorales proporciona una razón para intentar la
incorporación de AH en los regímenes de tratamiento
quimioterapéutico. Sin embargo, los limitados datos obtenidos hasta
la fecha en realidad apuntan otros procesos diferentes del que aquí
se reivindica. Por ejemplo, se ha conseguido un éxito limitado
mediante los complejos químicos entre AH y mitomicina C o
epirubicina; los investigadores consiguieron inhibir el crecimiento
de carcinoma de colon en un 0,8-25% (Akima et
al., 1996). Klein y colegas (1994) describieron una
incorporación aumentada del fármaco en carcinomas mamarios y de
vejiga de Fischer implantados en ratas y se consiguió simplemente
mezclando AH con 5-FU. También se ha demostrado que
los mastocitomas de ratón muestran afinidad por el AH inyectado por
vía intravenosa (Gustafson et al., 1995b).
La WO-A-9902151
describe una formulación farmacéutica específica que contiene
hialuronano con un peso molecular inferior a 750.000 Daltons y
paclitaxel para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, no hay
experiencia previa no existen datos de que el hialuronano sea capaz
de superar la resistencia celular adquirida o inherente a los
agentes citotóxicos y antineoplásicos.
Klein et al, Reg. Cancer Treatment, vol.
7, 1994, págs. 163-164 discuten la utilización del
hialuronano y 5-fluorouracilo en ratones con
carcinoma mamario de rata "implantado en hígado" o carcinoma de
vejiga de Fischer con "implante subcutáneo". Los experimentos
descritos se centran en la incorporación de
5-fluorouracilo y, de nuevo, no mencionan la
cuestión de la utilización de hialuronano con un agente citotóxico
para superar o reducir la resistencia adquirida o inherente a dicho
agente.
La WO-A-9104058
no proporciona evidencia de la utilización de hialuronano en
combinación con un agente citotóxico o antineoplásico para superar
o reducir la resistencia adquirida o inherente de un cáncer. En
lugar de ello, aclara que se cree que el hialuronano facilita la
penetración del agente anticanceroso en el lugar a tratar.
\newpage
La WO-A-9606622
proporciona afirmaciones generales sobre la utilidad propuesta del
hialuronano. No se sugiere ni hay datos que relacionen la
utilización de AH para superar la resistencia celular a los
quimioterápicos o incluso que el hialuronano sea capaz de
transportar agentes quimioterápicos, como es el caso de la presente
invención.
Bioconjugate Chemistry, vol. 10, 1999, págs.
755-763 describe un tratamiento específico
anticanceroso con un conjugado de paclitaxel y hialuronano con un
peso molecular de 1,5 MDa. El conjugado, que es un compuesto
sintetizado químicamente conocido como hialuronano modificado con
dihidrazida de adípico (AH-DHA), es estructuralmente
muy diferente de los hialuronanos de la presente invención y no hay
experiencia previa ni datos de que el hialuronano sea capaz de
superar la resistencia celular adquirida o inherente a los
quimioterápicos, como es el caso de la presente invención.
Sin embargo, aunque algunas de las
investigaciones sobre el AH muestran que el AH puede utilizarse como
un transportador de fármacos, ninguna de estas investigaciones
demuestra que el AH es capaz de superar la resistencia celular a
los fármacos.
La presente invención proporciona una
utilización del hialuronano en la elaboración de un medicamento para
su uso en combinación o en coadministración con un fármaco para el
tratamiento de un cáncer que es resistente a dicho fármaco.
Típicamente, la coadministración de un agente
citotóxico o antineoplásico con hialuronano aumenta su potencial de
eliminación de células cancerosas. Es decir, las células cancerosas
que normalmente son resistentes al fármaco se hacen susceptibles a
éste.
Preferiblemente, el agente es metotrexato,
paclitaxel (taxol), 5-fluorouracilo
(5-FU) o ciclofosfamida o una combinación de los
mismos.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende
hialuronano con un peso molecular modal de 890.000 Da y un agente
citotóxico o antineoplásico. De acuerdo con un tercer aspecto de la
presente invención se proporciona una composición farmacéutica que
comprende hialuronano con un peso molecular modal de 750.000 Da y
un agente citotóxico o antineoplásico. Opcionalmente, pueden
incluirse adyuvantes farmacéuticos convencionales en las
composiciones farmacéuticas.
Típicamente dicho fármaco está unido o embebido
en el hialuronano.
Sin la intención de suscribir una teoría, se
cree que los posibles mecanismos para superar la resistencia a los
fármacos son: 1. El hialuronano se une a los receptores sobre las
células resistentes o entra en las células a través de endocitosis
inespecífica, lo que resulta en que el agente unido o embebido se
libera en la célula, permitiendo que sea terapéuticamente activo.
2. El hialuronano se une a la superficie de las células
resistentes, donde el agente unido o embebido se difunde desde la
red de hialuronano hacia la célula, lo que resulta la liberación
del agente en la célula resistente. 3. El hialuronano y otros
mucopolisacáridos adoptan una configuración enrollada que embebe el
agente, y también puede unir una serie de agentes.
Sin la intención de suscribir una teoría,
también es posible que una combinación de hialuronano con un fármaco
resulte en que el fármaco quede retenido en la célula durante un
periodo mayor, lo que permite una liberación prolongada y más
tiempo para que el fármaco ejerza su efecto farmacológico.
En un aspecto, dicha resistencia a los fármacos
es una multiresistencia a los fármacos.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones de esta especificación, la palabra
"comprenden" y las variaciones de la palabra, como "lo que
comprende" y "comprende", significa "que incluye pero no
se limita a" y no pretende excluir otros aditivos, componentes,
realizaciones o pasos.
La Figura 1 muestra que en elevadas
concentraciones el AH forma una red tridimensional que es capaz de
embeber pequeñas moléculas como el metotrexato. La focalización del
AH/fármaco en los lugares patológicos se consigue mediante la
rápida unión del AH a receptores celulares específicos, seguido de
la difusión del fármaco desde el AH, y/o la cointernalización del
AH y el fármaco a través de receptores del AH y/o del fármaco.
La Figura 2A muestra las posibles interacciones
moleculares entre el metotrexato y el AH. Estas incluyen (i)
enlaces iónicos, (ii) puentes de hidrógeno o (iii) interacciones
hidrofóbicas.
La Figura 2B es una representación o diagrama de
la trama del metotrexato en el AH. A elevadas concentraciones el AH
forma una red tridimensional que está representada por la gran
molécula enrollada. El (*) representa el metotrexato que tiene un
peso molecular de sólo 454D, y se embebe fácilmente en la molécula
de AH de 400-900 kD.
La Figura 3 muestra la patología general de los
tumores de cáncer de mama humanos desarrollados en ratones
desnudos. El Panel A muestra la morfología general de un tumor
humano de grado II-III. El panel B muestra una
micrografía de otra sección del tumor que se muestra en la Figura
3A. Esta sección muestra el músculo de ratón de alrededor (M), la
cápsula del tumor (C), las áreas necróticas del tumor (N), tumor
infiltrante (T) y (\rightarrow) indica un fenómeno común conocido
como "filas indias", en el que las células de carcinoma se
alinean en filas que a menudo se asocian con un carcinoma
infiltrante (Carter, 1990).
La Figura 4 muestra las características clásicas
patológicas de un tumor de mama. El Panel A muestra una sección de
un carcinoma ductal infiltrante característico con grandes áreas de
necrosis (N), lo que indica el curso más agresivo del tumor. El
Panel B muestra la presencia de células sanguíneas (\rightarrow),
lo que demuestra que el tumor está vascularizado y por lo tanto es
viable. Muy cercanos al vaso sanguíneo hay algunos ductos (D). El
Panel C muestra las células, marcadas como (A), que sufren
apoptosis, como lo indica la fragmentación nuclear.
La Figura 5 muestra la identificación
inmunohistoquímica de los receptores de AH en los tumores de cáncer
de mama humano desarrollados en ratones desnudos. El Panel A muestra
la localización del antígeno carcinoembriónico (CEA) en el tumor.
El Panel B muestra la expresión de RHAMM en el carcinoma de mama
humano. El Panel C muestra la expresión de ICAM-1
en el carcinoma de mama humano. La localización del receptor de AH,
ICAM-1 está principalmente alrededor del tejido
endotelial (\rightarrow). El Panel D muestra la expresión de CD44
en el carcinoma de mama humano. CD44H se detectó en aproximadamente
el 95% de las células tumorales. H: células de origen humano; M:
células de origen murino.
La Figura 6 muestra los resultados del análisis
de peso molecular del hialuronano utilizado como transportador para
la focalización del metotrexato en los tumores.
La Figura 7 muestra la focalización del
metotrexato en los tumores de cáncer de mama humano, utilizando el
AH como transportador.
La Figura 8 muestra la potenciación de la
entrada de metotrexato en el hígado en presencia de AH.
La Figura 9 muestra la reducción de la entrada
de metotrexato en el tracto gastrointestinal cuando el fármaco se
administra con AH.
La Figura 10 muestra una representación en
diagrama de las posibles interacciones físicas entre MTX/AH y las
subsiguientes capacidades de focalización en el tumor de la terapia
de combinación de fármaco/AH.
La Figura 11 muestra el efecto citotóxico
sinérgico in vitro de la combinación de AH con
5-FU.
La Figura 12 muestra la focalización del
5-FU en tumores de cáncer de mama humano utilizando
AH como transportador.
La Figura 13 muestra las rutas de eliminación
del AH en humanos.
La Figura 14 muestra un aumento de la
incorporación de 5-FU en el estómago, cerebro y
pulmones.
La Figura 15 muestra el efecto del AH sobre la
eliminación farmacocinética del 5-FU en plasma.
La Figura 16 muestra los criterios para la
definición del final del experimento. Se muestran el Criterio 2
(Panel A) y Criterio 3 (Panel B).
La Figura 17 muestra la eficacia de la terapia
de 5-FU/AH adyuvante (régimen de tratamiento de 6
semanas): Efecto sobre el volumen del tumor primario.
La Figura 18 muestra la eficacia de la terapia
de 5-FU/AH adyuvante (régimen de tratamiento de 6
semanas): Efecto sobre la masa corporal.
La Figura 19 muestra la eficacia la terapia de
5-FU/AH adyuvante (régimen de tratamiento de 6
semanas): Efecto sobre la expansión de nódulos linfáticos
cancerosos y la formación de nuevos tumores.
La Figura 20 muestra la apariencia general de
los tumores del estudio de eficacia de 6 meses.
La Figura 21 muestra el efecto de la terapia de
AH adyuvante/5-FU sobre la supervivencia de los
pacientes.
La Figura 22 muestra el % de cambio de la masa
corporal en los ratones tratados con terapia de CMF/AH durante un
periodo de 6 semanas.
La Figura 23 muestra el % de cambio del volumen
del tumor en ratones tratados con la terapia de CMF/AH durante un
periodo de 6 semanas.
La Figura 24 muestra el espectro de RMN 1 h del
MTX disuelto en H_{2}O. Este espectro identifica fácilmente cada
grupo de hidrógenos en el MTX.
La Figura 25 muestra las posibles interacciones
del MTX con el AH.
La Figura 26 muestra el espectro a 600 MHz del
ácido hialurónico a 600 MHz y 298 K.
La Figura 27 muestra el espectro a 600 MHz de
RMN 1 h del MTX sólo y del MTX con adiciones crecientes de AH (50
kDa) de 2 nmoles, 10 nmoles, 20 nmoles y 80 nmoles a 298 K.
La Figura 28 muestra los espectros a 600 MHz de
RMN 1 h del 5-FU y del 5-FU (1,25
mg/ml, 1,6 mg/ml y 6,4 mg/ml) con AH (750 kDa, 3 mg/ml) entre 70,0
y 8,5 ppm, a 298 K.
\vskip1.000000\baselineskip
- BSA
- Albúmina sérica bovina
- Ci
- Curies
- CMF
- Ciclofosfamida, Metotrexato y 5-Fluorouracilo
- Cyc
- Ciclofosfamida
- DNA
- Ácido desoxiribonucleico
- Dpm
- Deterioraciones por minuto
- DTTP
- Desoxitimidina trifosfato
- ECM
- Matriz extracelular
- EDTA
- Ácido etilendiaminotetraacético
- ELISA
- Ensayo inmunosorbente acoplado a enzima
- SFB
- Suero fetal bovino
- 5-FU
- 5-fluorouracilo
- GAG
- Glicosaminoglicano
- GlcNAc
- N-acetil glucosamina
- GlcUA
- Ácido glucurónico
- AH
- Hialuronano/Ácido hialurónico
- HABP
- Proteína de unión a hialuronano
- AHasa
- Hialuronidasa
- HBSS
- Solución salina equilibrada de Hanks
- HRP
- Peroxidasa de rábano picante
- h
- Hora
- K_{av}
- Volumen disponible de distribución dentro del gel
- l
- Litro
- min
- Minuto
- PBS
- Salina tamponada con fosfato
- MP
- Membrana plasmática
- RHAMM
- Receptor de la motilidad mediada por AH
- RMCa
- Carcinoma mamario de rata
- RNA
- Ácido ribonucleico
- TA
- Temperatura ambiente
- fase S
- Fase de síntesis
- DE
- Desviación estándar
- EEM
- Error estándar de la media
- V_{e}
- Volumen de elución
- V_{o}
- Volumen inicial
- V_{t}
- Volumen total
- RCT
- Retraso del Crecimiento Tumoral
- TDT
- Tiempo de Duplicación del Tumor
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se describirá en más detalle a
continuación, sólo a modo de referencia, mediante los siguientes
ejemplos no limitantes. Debe entenderse, sin embargo, que los
siguientes ejemplos sólo son ilustrativos, y no deben tomarse de
ninguna forma como restricción de las generalidades de la invención
descrita anteriormente. En particular, aunque la invención se
describe en detalle en relación con el cáncer, se entenderá que los
hallazgos que se muestran no se limitan al tratamiento del cáncer.
Por ejemplo, los agentes citotóxicos pueden utilizarse para el
tratamiento de otros estados; el metotrexato se ha utilizado
ampliamente para el tratamiento de la artritis reumatoide
severa.
severa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para establecer un modelo animal apropiado para
el cáncer de mama humano, fue necesario realizar pruebas
patológicas. Para que un tumor sea fisiológicamente viable es
esencial la neovascularización, porque la red de capilares
proporciona los nutrientes al tumor. La presencia de
vascularización, invasión ductal, necrosis, apoptosis, un índice
mitótico elevado y anormalidades nucleares son todas ellas
características de un carcinoma de mama.
La línea celular de carcinoma de mama humano
MDA-MB-468 (American Tissue Culture
Collection, Rockville, U.S.A) se seleccionó en base a su expresión
de los receptores de AH, CD44, RHAMM e ICAM-1. Las
células se cultivaron de forma rutinaria y se subcultivaron como
una monocapa en recipientes de cultivo de 175 cm^{2} en medio
Leibovitz L-15 suplementado con suero fetal bovino
(SFB) al 10% y gentamicina 10 \mug/ml. Para su inyección en
ratones la células se cultivaron hasta una confluencia del 100%, se
tripsinizaron en una solución de tripsina 0,05%/EDTA 0,01%, se
lavaron dos veces mediante centrifugación en una centrífuga de
sobremesa Beckman TJ-6 (Beckman, Australia) a 400
g_{av} durante 10 min., se contaron utilizando un contador
Model-ZM Coulter (Coulter Electronics, England), y
se resuspendieron en medio Leibovitz L-15 libre de
suero a 1 x 10^{8} células/ml.
85 ratones hembra desnudos atímicos Balb/c/WEHI
(Walter y Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne,
Australia), de 6 a 8 semanas de edad, se mantuvieron bajo
condiciones específicas libres de patógenos, con alimento
esterilizado y agua disponible a voluntad. Se prepararon un millón
de células MDA-MB 468 como se ha descrito
anteriormente, y se inyectaron directamente en el panículo adiposo
bajo el pezón de cada ratón. Se observó crecimiento tumoral en el
96% de los ratones. Cuando el crecimiento tumoral era visualmente
detectable, la progresión tumoral se monitorizó mediante medidas
semanales del volumen del tumor. El volumen de los tumores se
calculó a partir de 3 diámetros perpendiculares utilizando la
ecuación;
V =
(1/6)p(d1d2d3)
\newpage
en la
que:
- \quad
- V es el volumen del tumor (en mm^{3}),
- \quad
- d1 es el primer diámetro del tumor (en mm),
- \quad
- d2 es el segundo diámetro del tumor (en mm),
- \quad
- y d3 es el tercer diámetro del tumor (en mm) (Lamszus et al, 1997).
Ocho semanas tras la inoculación del tumor la
media del tamaño del tumor fue de 482,2 mm^{3} (EEM, 39,8
mm^{3}).
Aproximadamente 8 semanas tras la inducción del
tumor a dos ratones con tumores se les administró una dosis letal
de Nembutal. Dentro de los 3 min. posteriores al sacrificio de los
ratones, los tumores se extirparon quirúrgicamente y se fijaron
inmediatamente en formalina tamponada al 10% durante 12 horas. El
tumor fijado se deshidrató durante toda la noche en una serie de
lavados de etanol del 70-100%, seguido por una
inclusión en parafina de la que se cortaron secciones de
2-4 \mum. Las secciones se colocaron en
portaobjetos, se desparafinaron, y se hidrataron. Las preparaciones
se lavaron 3 x 5 min. en salina tamponada con fosfato (PBS). Las
proteínas heterófilas se bloquearon mediante la incubación con suero
fetal bovino al 10% durante 10 min., seguido por un lavado con PBS.
Los anticuerpos de detección se aplicaron durante 60 min. a
temperatura ambiente (TA). Los antisueros o anticuerpos eran
dirigidos contra RHAMM (Applied Bioligands Corporation (Manitoba,
Canadá), ICAM-1, CD44v6, CD44v10, CD44H total y CAE.
El resto de anticuerpos de detección se adquirieron de Zymed
(California, U.S.A). Las preparaciones se lavaron 3 x 5 min. en PBS
y se bloqueó la actividad peroxidasa endógena mediante inmersión en
H_{2}O_{2} 0,3%/metanol durante 20 min. Tras un nuevo lavado con
PBS, se aplicó un antisuero secundario anti-conejo
de cerdo conjugado con peroxidasa (Dako, Denmark) durante 60 min. a
TA, seguido por un lavado de 3 x 5 min. en PBS. Se prepararon las
tabletas Sigma Fast DAB (3,3'-Diaminobenzidina,
Sigma, St. Louis, U.S.A) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante y la solución de DAB se aplicó durante
5-10 min. a TA. Las preparaciones se lavaron en agua
corriente durante 10 min., se realizó una contratinción con
hematoxilina, se deshidrataron y se
montaron.
montaron.
El examen de las secciones de tumor de mama
teñidas con hematoxilina y eosina demostró que todas las
características típicas asociadas con los tumores viables, como se
muestra en las Figuras 3 y 4, lo que confirma que el animal huésped
ha mantenido con éxito un carcinoma de mama humano de grado II. Hay
varias características que son típicas de un cáncer. La sección de
las preparaciones marcadas (B) muestra estas características. Todas
las características patológicas de un cáncer observadas están en la
sección (B), es decir
i) elevada proporción entre
núcleo/citoplasma
ii) cromatina y nucleolos angulares
iii) membrana nuclear irregular
Se concluyó que era posible mantener un tumor de
grado II-III en el modelo de ratones desnudos.
Generalmente, un tumor de grado II-III tiene un
pronóstico de tasa de supervivencia de alrededor del 47% (Bloom y
Richardson, 1957). Un tumor de grado II-III se
caracteriza por:
i) pleomorfismo nuclear moderado, hipercromatina
y actividad mitótica, características observadas a lo largo de la
sección del tumor mostrada; y
ii) poca o nula formación de ductos.
Las grandes áreas de necrosis (N) pueden
correlacionarse con la expansión del tumor, lo que sugiere un curso
invasivo más agresivo (Carter, 1990). El borde de infiltración del
tumor se indica mediante ( ).
Un objetivo primordial de este experimento fue
la validación de que el comportamiento histológico y citológico de
los tumores establecidos en estos ratones era comparable a aquellos
tumores de este tipo en sus huéspedes humanos naturales. En la
consecución de este objetivo también se ha demostrado que las
células tumorales en los ratones son de origen humano y que
expresan receptores de AH muy relevantes como lo son RHAMM, CD44 y
ICAM-1 putativo. Ya que se había realizado la
hipótesis de que la focalización en el tumor podría darse a través
de una internalización o unión mediada por receptores, era necesario
confirmar la expresión de los receptores de AH,
ICAM-1, CD44 y RHAMM. Las Figuras
5B-D demuestran que todos estos receptores estaban
presentes. La Tabla 1 lista el grado de expresión de los receptores
en los dos tumores analizados.
\newpage
El índice de clasificación del porcentaje de
expresión de epítopos en el tumor se cuantificó como:
El origen humano de las células tumorales se
confirmó mediante la tinción del tumor y el tejido circundante con
un marcador tumoral específico de humano. La presencia de CEA
demostró claramente que el tumor era humano, aunque estaba
mantenido por el sistema cardiovascular de un huésped murino (Figura
5A). El antisuero policlonal CEA se seleccionó porque reacciona
exclusivamente con CEA humano. Esta micrografía demuestra que el
tumor era de origen completamente humano (H), como lo muestra la
tinción marrón. La cápsula que circunda el tumor y el tejido
adiposo es definitivamente de origen murino, como lo indica la
ausencia de tinción con el antisuero (M). La tinción marrón muestra
la elevada expresión de RHAMM en las células tumorales. La mayor
intensidad de tinción puede observarse en las áreas que circundan
el tejido necrosado y la infiltración de tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Establecida la utilidad del modelo de ratones
desnudos, este puede utilizarse para probar la efectividad de una
preparación de AH/MTX.
Se preparó una solución de reserva de MTX
disolviendo MTX en polvo en carbonato sódico al 0,5% p/v (pH 9), y
se llevó a una concentración de 24,5 mg/ml con NaCl al 0,9% p/v. La
solución de reserva se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum
para asegurar su esterilidad antes de la adición de
[^{3}H]metotrexato y su dilución hasta la concentración de
inyección con cloruro sódico para inyección. Los datos comparativos
de la farmacocinética del MTX ya se han publicado para ratones
desnudos y humanos (Inaba et al, 1988), y se utilizaron para
el diseño de este estudio, para simular las dosis terapéuticas
humanas de la forma más cercana posible. Las inyecciones
individuales se prepararon de acuerdo con las masas corporales de
los ratones individuales, con el objetivo de proporcionar 15 mg/kg
de MTX en 50 \mul (equivalentes a una dosis terapéuticas humana
de 0,42 mg/kg para una peso corporal medio de 60 kg; Inaba et
al, 1988).
Se añadió AH desecado (Mr modal 8,9 x 10^{5}
kDa) a una porción de la solución de reserva de 24,5 mg/ml de MTX y
se disolvió durante toda la noche con agitación, para proporcionar
una concentración final de 21 mg/ml. Para asegurar la esterilidad
se añadió gentamicina hasta una concentración de 50 \mug/ml y se
incubó durante toda la noche a 4ºC. Tras la adición de
[^{3}H]metotrexato, la mezcla de reserva de AH/MTX se
diluyó hasta la concentración inyección con cloruro sódico para
inyección. Las inyecciones se prepararon individualmente de acuerdo
con las masas corporales de los ratones, para proporcionar 15 mg/kg
de MTX y 12,5 mg/kg de AH en 50 \mul. Con esta cantidad de AH
inyectado en el cuerpo, la cinética de saturación se podría observar
durante el periodo del experimento (Fraser et al,
1983).
1983).
Para asegurar que el AH mantiene su peso
molecular durante la preparación de la mezcla de inyección de
metotrexato/AH, se analizó la solución de inyección en gel de
exclusión por tamaño Sephacryl S-1000 (Pharmacia,
Uppsala, Suecia) con especificaciones de columna de 1,6 cm x 70 cm,
tamaño de muestra 2 ml, tasa de flujo de 18 ml/h y 2 ml de tamaño
de fracción. La Figura 6 muestra que el AH retuvo su peso molecular
durante el proceso de
mezclado.
mezclado.
Los ratones se dividieron aleatoriamente en 2
grupos de 40 animales. el Grupo I recibió sólo MTX, y el Grupo 2
recibió una terapia de combinación de MTX/AH. Los animales se
dejaron de forma individual en una caja de inyección, y se
administraron las inyecciones a través a de la vena de la cola. En
cada inyección se proporcionó metotrexato tritiado
(desintegraciones medias inyectadas por minuto (dpm) \pm error
estándar de la media (EEM): 19.159.146 \pm 1.336.819) contenido
en 15 mg/kg de MTX \pm 12,5 mg/kg de AH. Los ratones se
mantuvieron individualmente en recintos de plástico blandos e
impermeables para poder recolectar la orina. Los ratones se
anestesiaron tras 30 min., 1 h, 2 h, 4 h u 8 h tras la inyección
mediante 0,1 ml de inyección intra-peritoneal de
Nembutal (Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia), y se
extrajo sangre del corazón o de los grandes vasos utilizando una
aguja y jeringa. Tras la extracción de sangre los animales se
sacrificaron mediante dislocación cervical.
La sangre se recogió en tubos de vidrio
recubiertos de EDTA y se preparó plasma mediante centrifugación a
14.000 g_{av} durante 10 min. Se contó la radioactividad en una
alícuota de 50 \mul tras la decoloración con 100 \mul de
peróxido de hidrógeno al 30% v/v y la adición de 3 ml de líquido de
centelleo HiSafeII. Para superar la quimio- y fotoluminiscencia,
las muestras se contaron durante 2 min. en un contador Wallac 1410
b durante un periodo de 3, 7 o 20 d., dependiendo de la fuente de
las muestras. Durante los periodos entre contaje, las muestras se
almacenaron en oscuridad a temperatura ambiente. Todos los cálculos
se realizaron en muestras estabilizadas de las que se había
eliminado toda quimio- y fotoluminiscencia.
Para determinar el porcentaje de MTX inyectado
en el plasma, fue necesario calcular el volumen total de plasma de
cada ratón (ml), utilizando la fórmula estándar:
Masa del ratón
(g) x volumen de sangre del ratón (0.07) x proporción de plasma en
la sangre
(0,59)
El porcentaje de MTX inyectado en plasma se
calculó entonces:
Para asegurar una cuantificación adecuada de la
cantidad de MTX liberada al torrente sanguíneo, el punto de
inyección en la vena de la cola se diseccionó y se cuantificó el
MTX. El porcentaje medio de la inyección de MTX que permanece en el
punto de inyección era del 3,78% (EEM: 0,57%). La cantidad de MTX
liberado al torrente sanguíneo (MTX disponible para su distribución
a los tejidos y al tumor) se calculó como:
La cantidad de MTX liberado al torrente
sanguíneo a partir de este momento se denominará la "dosis
inyectada".
Para realizar comparaciones precisas entre la
población de muestras y normalizar las pequeñas variaciones en las
masa de los órganos y tumores, la concentración de MTX en los
órganos y tumores y el fluido corporal se expresó como % de la
dosis inyectada/gramo de tejido.
El porcentaje medio de la inyección de MTX que
permanece en el lugar de inyección fue de 3,78% (EEM: 0,57%). Para
normalizar estas variaciones, el porcentaje de dpm encontrado en el
tumor y los tejidos se calculó como el porcentaje de dpm inyectadas
menos las dpm que permanece en el lugar de inyección. Esta cantidad
a partir de este momento se denominará la dpm disponible o
metotrexato disponible. Los resultados se resumen en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
2
Los valores son la mediana \pm EEM, en los que
n=8
* y fondo coloreado representan cálculos
estadísticamente significativos cuando los datos se analizan
mediante la prueba de suma de rangos de
Mann-Whitney
# representa la Dpm de MTX en el volumen de
plasma total del ratón. Los cálculos representan las Dpm de MTX en
plasma como % de la dosis de MTX inyectado
\arr{1} representa la Dpm de MTX en el volumen
de orina total del ratón. Los cálculos se representan como % de la
dosis inyectada. N=3-8
ID representa datos insuficientes para el
análisis
1 Sólo MTX (% mediana \pm ES)
2 AH/MTX (% mediana \pm DE)
- 3 Tumor
- 4 Hígado
- 5 Bazo
- 6 Nódulos linfáticos
- 7 Riñón izquierdo
- 8 Riñón derecho
- 9 Vejiga
- 10 Intestinos
- 11 Estómago
- 12 Cerebro
- 13 Corazón
- 14 Pulmones
- 15 Útero
- 16 Plasma #
17 Orina \arr{1}
No se encontraron diferencias estadísticamente
significativas en los niveles de plasma de MTX cuando el fármaco se
coinyectó con AH. La farmacocinética general del MTX permanece
inalterada, con niveles en plasma máximos de MTX que se alcanzan
entre 0,5 y 2 h tras la administración intravenosa (MIMS, 1997).
Cuando fue posible se recogió orina de los
recintos de plástico impermeables con una jeringa y aguja. La orina
se clarificó mediante centrifugación a 14.000 g_{av} durante 10
min. Su contenido radiactivo se midió tras la adición de 3 ml de
líquido de centelleo HiSafeII a las muestras que oscilan entre
8-30 \mul. A pesar de las dificultades técnicas
en la cuantificación precisa del volumen de orina producida por cada
ratón se calculó el porcentaje de la dosis de MTX inyectado en la
orina mediante la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
No fue posible recoger orina de cada ratón, a
causa de las variaciones en la tasa de micción. Cuando habían
disponible 3 o más especímenes de orina por unidad de tiempo por
tratamiento se realizó un análisis estadístico no paramétrico de
los datos de estos puntos temporales. Tras una hora de la
administración había un 50% (p = 0,043) más de MTX en la orina de
los ratones que recibieron MTX/AH (véase la Tabla 2).
Inmediatamente tras el sacrificio del ratón se
extrajeron el tumor, hígado, corazón, bazo, vejiga, riñones
izquierdo y derecho, útero, pulmones, estómago, intestinos, cerebro
y nódulos linfáticos y se analizó la radiactividad total. La
radioactividad total en cada tejido se determinó solubilizando
100-400 mg de tejido en 3-6 ml de
OptiSolv (ACC, Melbourne, Australia) durante 36 h, 22ºC. Tras
completarse la solubilización, se contó la radiactividad en el
tejido tras añadir 10 ml de líquido de centelleo HiSafeIII. De nuevo
para superar la quimio- y fotoluminiscencia, las muestras se
contaron durante 2 min. en un contador Wallac 1410 \beta durante
un periodo de 3, 7 o 20 d., dependiendo de la fuente de las
muestras. Durante los periodos entre contaje, las muestras se
almacenaron en oscuridad a temperatura ambiente. Todos los cálculos
se realizaron en muestras estabilizadas de las que se había
eliminado toda quimio- y fotoluminiscencia. Los cálculos representan
la mediana \pm EEM (n=8).
Era importante establecer que los órganos
metabólicamente activos como el hígado, bazo y riñones no sufren un
nivel elevado de focalización de fármaco que pudiera contrarrestar
cualquier aspecto positivo del aumento de focalización del tumor.
La Tabla 2 lista la entrada de metotrexato de cada tejido a los
diferentes puntos temporales analizados.
Utilizando la prueba de la suma de rangos de
Mann-Whitney y la prueba de t de Student no había
diferencias estadísticamente significativas en la concentración de
MTX/g tejido cuando el MTX se coinyectó con AH. Debido al bajo
número de animales en cada punto temporal, la prueba de
Mann-Whitney era estadísticamente inválida si un
punto de datos se solapaba, pero en el hígado, útero e intestino
pudo observarse una tendencia clara.
En el hígado parecía haber un aumento a corto
plazo en la incorporación de MTX cuando se combinó con AH, como se
muestra en la Figura 7.
A los 30 min. y 1 h el hígado contenía una
aumento medio de la concentración de MTX del 65% y 26%
respectivamente. A las 2 h no se observaron diferencias en la
cantidad de MTX en el hígado independientemente del tratamiento.
Una tendencia interesante se hizo aparente tras 4 h, cuando se
encontraba menos MTX en el hígado cuando se coinyectaba con AH (4
h: 68% menos MTX y 8h: 75% menos MTX), como se muestra en la Figura
8.
Apareció una tendencia significativa en el
intestino, donde la combinación de AH y MTX resultó en un descenso
de la incorporación del fármaco en cada punto temporal, como se
muestra en Figura 9.
El intestino se homogenizó completamente,
seguido de la solubilización de aproximadamente 400 mg de tejido en
3-6 ml de OptiSolv durante 24 h a 22ºC, seguido de
la adición de 10 ml de líquido de centelleo
Hisafe-3. Para superar la quimio- y
fotoluminiscencia, las muestras se contaron durante 2 min. en un
contador Wallac 1410 \beta durante un periodo de 3, 7 o 20 d.,
dependiendo de la fuente de las muestras. Durante los periodos
entre contaje, las muestras se almacenaron en oscuridad a
temperatura ambiente. Todos los cálculos se realizaron en muestras
estabilizadas de las que se había eliminado toda quimio- y
fotoluminiscencia.
Los cálculos representan la mediana \pm EEM
(n=8). El análisis de los datos con la prueba de aleatorización no
paramétrica para pares equiparados demostró que la coadministración
de AH redujo de forma significativa la excreción de fármaco al
tracto GI (p = 0,031, prueba de una cola).
La disminución en la concentración de MTX osciló
entre 43-67%. La prueba de aleatorización no
paramétrica para pares equiparados mostró que la coadministración
de AH redujo significativamente la excreción de fármaco al tracto
gastrointestinal (p = 0,031, prueba de una cola).
En los pulmones había significativamente menos
MTX presente a las 4 h cuando se coadministró con AH, con un
descenso medio del 52% (p = 0,014). Sin embargo, no se demostraron
diferencias en otros puntos temporales, por lo que la significación
de esta observación permanece incierta.
No se detectaron tendencias observables en bazo,
útero, cerebro, corazón, nódulos linfáticos, estómago y riñones.
Existen dos posibles mecanismo de focalización
del metotrexato mediante AH a las células tumorales (Figura
10).
Se observó un efecto de focalización
significativo cuando el AH se combinó con MTX (Figura 7). El mayor
aumento relativo en la retención del fármaco en el tumor se observó
a las 0,5 h (aumento medio del 24%), 1 h (aumento medio del 30%) y
2 h (aumento medio del 119%), mientras que a las 4 h y 8 h el
aumento era negligible. A causa del pequeño tamaño de la población
y la distribución no paramétrica de los datos se utilizó la prueba
de la suma de rangos de Mann-Whitney, y reveló un
aumento significativo de incorporación del fármaco al tumor cuando
el AH se coinyectaba. Tras 1 h la significación estadística era p =
0,021 y a las 2 h, p = 0,050. Los otros puntos temporales no
demostraron una diferencia estadísticamente significativa, pero la
tendencia en la concentración de MTX/g de tumor era
consistentemente mayor cuando se coinyectaba con AH.
Los datos que se muestran en la Figura 7
demuestran inequívocamente que la coadministración con AH ha
aumentado en gran medida la incorporación de MTX por el tumor
dentro de los 30 min. tras la inyección. Además, la coadministración
también mantiene un nivel distintivamente superior durante el
subsiguiente descenso en la concentración de fármaco en el tumor.
Tras 1 h la diferencia era significativa con una p = 0,021 (n_{1}
=8, n_{2} =8), y tras 2 h con una p = 0,05 (n_{1} =8, n_{2}
=8) evaluado mediante pruebas no paramétricas.
El AH que contiene MTX embebido se une a los
receptores (CD44 y/o I-CAM-1) y se
internaliza a través de endocitosis mediada por receptores,
liberando asó el fármaco a la célula tumoral.
La red molecular de AH actuará como impedimento
para la difusión hacia el exterior, de forma que tras la unión del
AH a los receptores (CD 44, RHAMM y/o ICAM-1), el
MTX embebido puede difundir a las células tumorales. Mientras se
mantiene en la superficie de las células con la matriz de AH el MTX
tiene una mayor disponibilidad para los mecanismos de transporte
activo que normalmente se utilizan para el transporte de MTX hacia
la célula subyacente.
Los efectos colaterales y la distribución de un
fármaco a tejidos diferentes a los puntos de actividad deseables
también puede estar influenciada por su asociación con el AH. Por
ejemplo, el AH normalmente se elimina del torrente sanguíneo
mediante la incorporación celular mediada por receptores y el
catabolismo en el hígado (80-90%), riñones (10%),
bazo y médula ósea, con alguna variación menor según la especie en
los dos últimos lugares. Como es esperable el AH parece aumentar la
liberación hepática del fármaco al menos durante un corto periodo.
Tras 30 min. y 1 h el hígado mostró un aumento medio en la
concentración de MTX del 65% y 26% respectivamente. Tras 2 h no se
observó diferencia en la cantidad de MTX en el hígado,
independientemente del tratamiento. Una tendencia interesante se
hizo aparente tras 4 h, cuando se encontró menos MTX en el hígado
cuando se coinyectó con AH (4 h: 68% menos MTX y 8h: 75% menos
MTX). Tras la administración intravenosa el MTX está ampliamente
distribuido en el agua corporal, y puede retenerse en el hígado
durante meses (McEvoy, 1988); por lo tanto el descenso de
concentración medio de MTX en el hígado a las 4 y 8 h cuando se
coinyecta con AH podría indicar un equilibrio alterado de las rutas
de eliminación farmacocinética. Teniendo en consideración que el AH
se metaboliza rápidamente en las células endoteliales del hígado
(CEH) se deduce que el MTX que se cointernaliza con el AH podría
ser liberado en las células de la capa sinusoidal del hígado, donde
podría difundir hacia los hepatocitos para ser secretado en la
bilis y subsiguientemente al tracto gastrointestinal, o bien ser
devuelto a la circulación para su redistribución al agua corporal y
su excreción urinaria, o ambas.
Podría existir una ventaja terapéutica por la
focalización hepática a corto plazo. En el caso de la metástasis de
hígado una exposición rápida y elevada a MTX podría ser beneficiosa,
y ya que la focalización observada es sólo de 1 h esto podría
contrarrestar cualquier problema de toxicidad a largo plazo. La
focalización hepática puede utilizarse con fármacos que requieren
una bioactivación, por ejemplo la mitomicina C, doxorubicina, en la
que la mezcla de fármaco/AH se focalizaría a las CEH. Con el fármaco
inactivo concentrado en las CEH éste podría difundir hacia los
hepatocitos para su activación, actuando así como un mecanismo de
focalización de la activación.
Uno de los puntos principales de toxicidad del
MTX es el tracto gastrointestinal. La coadministración de MTX con
AH disminuyó significativamente la cantidad de fármaco liberado al
tracto GI. Puede haber muchos mecanismos asociados con la
disminución de la concentración de MTX en el intestino.
El metotrexato es una molécula muy pequeña, que
se esperaría en condiciones normales que atravesara la mayoría de
paredes capilares, mientras que la asociación con AH reduciría en
gran medida su paso a través de esta ruta.
La degradación rápida del AH en las células
endoteliales del hígado resultó en una liberación rápida de MTX en
el hígado y el retorno al torrente sanguíneo, donde puede sufrir una
mayor eliminación renal, como se indica tras 1 h, cuando un 50% más
de MTX se excretó en la orina de los ratones que recibieron
preparaciones de MTX/AH.
La ruta principal para la eliminación final del
MTX del cuerpo es la excreción en la orina. Parece haber un ligero
aumento del contenido renal del fármaco con AH, pero se cree por
otras evidencias que el AH es incorporado y catabolizado muy
rápidamente por los riñones, de forma que el tiempo de residencia
sería corto y el fármaco asociado se liberaría rápidamente a la
orina.
Los resultados aquí presentados representan la
primera fase de un estudio preclínico para estudiar la hipótesis de
que la administración de agentes terapéuticos junto con hialuronano
conseguirá una liberación selectiva en la diana deseada del tejido
patológico; consiguiendo así una concentración mayor y más efectiva
en ese punto. En ese caso el metotrexato, un fármaco citotóxico
ampliamente utilizado en los regímenes de tratamiento actuales para
el cáncer de mama humano y otros tumores humanos, y para la artritis
reumatoide, se ha estudiado mediante la vía de administración
intravenosa con y sin hialuronano.
Se ha encontrado que el modelo de ratones
desnudos es un modelo particularmente adecuado para el estudio del
cáncer de mama humano en un huésped vivo, y para resolver algunas
cuestiones fundamentales en la utilización del AH para dirigir
agentes terapéuticos a los puntos de tejido enfermo, y por lo tanto
para potenciar sus efectos beneficiosos. Nuestros resultados se han
alcanzado con un fármaco de bajo peso molecular que no muestra una
forma específica de asociación con el AH, lo que demuestra que el AH
puede liberar tal fármaco en cantidades mejoradas en tejidos
patológicos cuando se inyecta en el torrente sanguíneo. Este estudio
demuestra que en las condiciones prevalentes en el cuerpo, el MTX
es retenido de forma suficiente con el AH para causar una
potenciación significativa de la liberación en el cáncer de mama
humano, así como una reducción potencial de los efectos colaterales
no deseados de toxicidad gastrointestinal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una vez establecida la utilidad del modelo de
ratones desnudos para el AH/Paclitaxel, puede utilizarse para
probar la efectividad de otros quimioterápicos. Se decidió que,
debido a su importancia terapéutica, debía utilizarse el paclitaxel
(también conocido como taxol).
El paclitaxel se aísla del tejo americano,
Taxus brevifolia, (Wani et al 1971), y es clínicamente
activo contra el cáncer de ovario y mama avanzado (Rownisky et
al 1990; McGuire et al 1989) y actualmente está en fase
de ensayo clínicos para el tratamiento de una variedad de otros
tumores. Sin embargo, el problema principal asociado con el
paclitaxel es su extrema lipofilia y la consecuente baja solubilidad
en agua. En un esfuerzo por solucionar este problema se han
sintetizado análogos de paclitaxel y profármacos junto con grandes
esfuerzos por producir formulaciones seguras y biocompatibles.
Hasta la fecha los profármacos no han mostrado la suficiente
estabilidad, solubilidad o actividad que pueda garantizar el
desarrollo clínico (Mathew et al 1992; Vyas et al
1993). Sin embargo, los taxanos semisintéticos están mostrando una
mayor solubilidad y potencia que el paclitaxel (Bissery et
al 1991) y una forma el Taxotere ha iniciado ensayos en humanos
(Bisset et al 1993).
La formulación clínica actual del paclitaxel
utilizada para la liberación intravenosa utiliza etanol y Cremophor
EL en una proporción 1:1 (v/v) con el fármaco a 6 mg/ml. El
Cremophor EL es en realidad aceite de castor polietoxilado; un
surfactante claro, de viscosidad aceitosa, amarillo. Los estudios de
estabilidad han mostrado que la formulación original tiene una
caducidad de 5 años a 4ºC. La preparación se diluye antes de su uso
con salina al 0,9% o dextrosa al 5% hasta concentraciones de
0,3-1,2 mg/ml y la estabilidad física y química del
material en estas condiciones es ca. 27 h. Sin embargo, la dilución
del vehículo hasta estos niveles puede producir una solución
supersaturada (Adams et al 1993) que puede tener tendencia a
la precipitación si se utiliza fuera de las especificaciones
establecidas. Por lo tanto es necesario un filtro en línea durante
la administración como salvaguarda frente a la infusión de
partículas. También es recomendable que las soluciones de
paclitaxel diluido se utilicen durante las 24 h desde su
preparación. En las anteriores soluciones también se ha observado
un enturbiamiento y se ha atribuido a la extracción por el Cremophor
de los plastificantes de las bolsas y tubos de infusión (Waugh
et al 1991).
Además de los problemas de inestabilidad física
mencionados previamente el problema más significativo con el
Cremophor es el hecho de que se ha descrito que tiene actividad
farmacológica. Una serie de fármacos se administran utilizando
Cremophor EL, lo que incluye la ciclosporina, tacrolimus y
teniposida. Sin embargo, la dosis de Cremophor EL administrada con
paclitaxel es superior que con cualquier otro fármaco del mercado.
Se ha observado que el Cremophor causa episodios de
hipersensibilidad serios o fatales. La toxicidad del vehículo
también puede ser en gran parte responsable de las reacciones
anafilácticas fatales o muy graves observadas tras una infusión
rápida de paclitaxel en animales o humanos (Dye & Watkins 1980;
Lorenz et al 1977; Weiss et al 1990).
Se prepara una solución de reserva de paclitaxel
y se preparan inyecciones individuales de acuerdo con las masa
corporal individual de cada ratón.
Se añadió AH desecado (Mr modal 8,9 x 10^{5}
kDa) a una porción de la solución de reserva de 24,5 mg/ml de
paclitaxel y se disolvió durante toda la noche con agitación, para
proporcionar una concentración final de 21 mg/ml. Para asegurar la
esterilidad se añadió gentamicina hasta una concentración de 50
\mug/ml y se incubó durante toda la noche a 4ºC. Tras la adición
de [^{3}H]paclitaxel, la mezcla de reserva de AH/paclitaxel
se diluyó hasta la concentración inyección con cloruro sódico para
inyección. Las inyecciones se prepararon individualmente de acuerdo
con las masas corporales de los ratones, para proporcionar 15 mg/kg
de paclitaxel y 12,5 mg/kg de AH en 50 \mul. Con esta cantidad de
AH inyectado en el cuerpo, la cinética de saturación se podría
observar durante el periodo del experimento (Fraser et al,
1983).
Para asegurar que el AH mantiene su peso
molecular durante la preparación de la mezcla de inyección de
paclitaxel/AH, se analizó la solución de inyección en gel de
exclusión por tamaño Sephacryl S-1000 (Pharmacia,
Uppsala, Suecia) con especificaciones de columna de 1,6 cm x 70 cm,
tamaño de muestra 2 ml, tasa de flujo de 18 ml/h y 2 ml de tamaño
de fracción. La Figura 4 muestra que el AH retuvo su peso molecular
durante el proceso de mezclado.
Los ratones se dividieron de forma aleatoria en
2 grupos de 40 animales. el Grupo I recibió sólo paclitaxel, y el
Grupo 2 recibió una terapia de combinación de paclitaxel/AH. Los
animales se dispusieron de forma individual en una caja de
inyección, y se administraron las inyecciones a través de la vena de
la cola. En cada inyección se proporcionó paclitaxel tritiado
(media de desintegraciones inyectadas por minuto (dpm) \pm error
estándar de la media (EEM): 19.159.146 \pm 1.336.819). Los
ratones se mantuvieron individualmente en recintos de plástico
blandos e impermeables para poder recolectar la orina. Los ratones
se anestesiaron tras 30 min., 1 h, 2 h, 4 h u 8 h tras la inyección
mediante una inyección intra-peritoneal de 0,1 ml de
Nembutal (Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia), y se
extrajo sangre del corazón o de los grandes vasos utilizando una
aguja y jeringa. Tras la extracción de sangre los animales se
sacrificaron mediante dislocación cervical.
La sangre se recogió en tubos de vidrio
recubiertos de EDTA y se preparó plasma mediante centrifugación a
14.000 g_{av} durante 10 min. Se contó la radioactividad en una
alícuota de 50 \mul tras la decoloración con 100 \mul de
peróxido de hidrógeno al 30% v/v y la adición de 3 ml de líquido de
centelleo HiSafeII. Para superar la quimio- y fotoluminiscencia,
las muestras se contaron durante 2 min. en un contador Wallac 1410
\beta durante un periodo de 3, 7 o 20 d., dependiendo de la fuente
de las muestras. Durante los periodos entre contaje, las muestras
se almacenaron en oscuridad a temperatura ambiente. Todos los
cálculos se realizaron en muestras estabilizadas de las que se
había eliminado toda quimio- y fotoluminiscencia.
Para determinar el porcentaje de paclitaxel
inyectado en el plasma, fue necesario calcular el volumen total de
plasma de cada ratón (ml), utilizando la fórmula estándar:
Masa del ratón
(g) x volumen de sangre del ratón (0.07) x proporción de plasma en
la sangre
(0,59)
El porcentaje de paclitaxel inyectado en plasma
se calculó entonces:
Para asegurar una cuantificación adecuada de la
cantidad de paclitaxel liberada al torrente sanguíneo, el punto de
inyección en la vena de la cola se diseccionó y se cuantificó el
paclitaxel. El porcentaje medio de la inyección de paclitaxel que
permanece en el punto de inyección también se determinó. La cantidad
de paclitaxel liberado al torrente sanguíneo (paclitaxel disponible
para su distribución a los tejidos y al tumor) se calculó como:
La cantidad de paclitaxel liberado al torrente
sanguíneo a partir de este momento se denominará la "dosis
inyectada".
Para realizar comparaciones precisas entre la
población de muestras y normalizar las pequeñas variaciones en las
masa de los órganos y tumores, la concentración de paclitaxel en los
órganos y tumores y el fluido corporal se expresó como % de la
dosis inyectada/gramo de tejido.
Se calculó el porcentaje medio de la inyección
de paclitaxel que permanece en el lugar de inyección. Para
normalizar estas variaciones, el porcentaje de dpm encontrado en el
tumor y los tejidos se calculó como el porcentaje de dpm inyectadas
menos las dpm que permanecen en el lugar de inyección. Esta cantidad
se denominará la dpm disponible o paclitaxel disponible.
Cuando fue posible se recogió orina de los
recintos de plástico impermeables con una jeringa y aguja. La orina
se clarificó mediante centrifugación a 14.000 g_{av} durante 10
min. Su contenido radiactivo se midió tras la adición de 3 ml de
líquido de centelleo HiSafeII a las muestras que oscilan entre
8-30 \mul.
Inmediatamente tras el sacrificio del ratón se
extrajeron el tumor, hígado, corazón, bazo, vejiga, riñones
izquierdo y derecho, útero, pulmones, estómago, intestinos, cerebro
y nódulos linfáticos y se analizó la radiactividad total. La
radioactividad total en cada tejido se determinó solubilizando
100-400 mg de tejido en 3-6 ml de
OptiSolv (ACC, Melbourne, Australia) durante 36 h, 22ºC. Tras
completarse la solubilización, se contó la radiactividad en el
tejido tras añadir 10 ml de líquido de centelleo HiSafeIII. De nuevo
para superar la quimio- y fotoluminiscencia, las muestras se
contaron durante 2 min. en un contador Wallac 1410 \beta durante
un periodo de 3, 7 o 20 d., dependiendo de la fuente de las
muestras. Durante los periodos entre contaje, las muestras se
almacenaron en oscuridad a temperatura ambiente. Todos los cálculos
se realizaron en muestras estabilizadas de las que se había
eliminado toda quimio- y fotoluminiscencia.
Ejemplo
4
El 5-fluorouracilo es
(5-FU) un antimetabolito que se utiliza normalmente
en el tratamiento del cáncer de mama y del tracto gastrointestinal
(Piper y Fox, 1982). El 5-FU se convierte en su
forma de nucleótido activo de forma intracelular donde éste
interfiere tanto con la síntesis de DNA como de RNA. El fármaco
funciona a través de dos mecanismos in vivo:
(i) El FdUMP se une fuertemente a la timidilato
sintasa lo que evita la formación de timidilato, que es un precursor
esencial de la desoxitimidina trifosfato (dTTP) que es uno de los
cuatro desoxiribonucleótidos necesarios para la síntesis de DNA. El
estado de carencia de timina creado por esta inhibición es tóxico
para las células en división activa (Pinedo y Peters, 1988).
(ii) La segunda forma en la que el
5-FU funciona es que la incorporación de FUTP al
RNA interfiere con la función del RNA. La inhibición de la
timidilato sintasa causada por incorporación de Fdurd y
5-FU al RNA es capaz de causar efectos citotóxicos
en las células. Tanto la concentración como la duración de la
exposición al 5-FU son determinantes importantes de
la citotoxicidad. Los efectos dirigidos al RNA son probablemente
predominantes con la duración prolongada de la exposición, mientras
que los efectos dirigidos al DNA serán más importantes durante una
exposición a corto plazo de células en fase S.
Varios estudios han examinado la utilización de
AH como un sistema de liberación de fármacos para fármacos
antitumorales. Coradini et al (1999) unió covalentemente
butirato sódico a AH, para determinar si esta combinación de
AH/butirato sódico podía potenciar la incorporación de fármaco por
las células de cáncer de mama in vitro. Este estudio indicó
que el mecanismo de acción del AH como vehículo de liberación de
fármacos podía involucrar que el derivado
AH-butirato-éster se llevara hasta los receptores
CD44. El complejo AH/fármaco se internalizó, seguido por la
hidrólisis citoplasmática del complejo AH/fármaco, que
subsiguientemente libera el butirato que ejerce un efecto
antiproliferativo. Se ha realizado un estudio in vivo que une
covalentemente la mitomicina C al AH como tratamiento de los
xenoinjertos de pulmón de Lewis murinos (Akima et al, 1996).
Se encontró que el complejo AH-MMC resultó en
actividad antitumoral a una dosis tan baja como 0,01 mg/kg mientras
que sólo el agente, la mitomicina C no mostró actividad
antitumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Las líneas celulares de adenocarcinoma de mama
humano MDA-MB-468,
MDA-MB-435 y
MDA-MB-231 se seleccionaron en base
a la afinidad de unión a AH (Culty et al, 1994) y la
expresión de los receptores de AH de CD44 y RHAMM (Wang et
al, 1996). Un resumen de las características de las líneas
celulares se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares
MDA-MB-468,
MDA-MB-435 y
MDA-MB-231 se cultivaron de forma
rutinaria como se describe en el Ejemplo 1.
Puede verse en la Tabla 4 que las células de
cáncer de mama cultivadas en medios que contienen 0 nM de
5-FU + 100 nM de AH no mostraron un efecto
proliferativo o citotóxico estadísticamente significativo comparado
con células no tratadas.
Las pruebas estadísticas se realizaron
utilizando tanto la prueba de la suma de rangos no paramétrica como
la prueba paramétrica de t de Student.
Por lo tanto todos los resultados se expresaron
como un porcentaje del contaje celular a 0 nM 5-FU/0
nM AH. Se detectaron diferencias claras en los patrones de
crecimiento entre líneas celulares, por ejemplo las células
MDA-MB-231 y
MDA-MB-468 mostraron una baja
eficiencia de crecimiento en placa, en las que había presentes
numerosas células flotantes antes de la aplicación del medio de
prueba. La línea celular MDA-MB-435
mostró una elevada eficiencia de crecimiento en placa y una tasa de
crecimiento muy rápida.
Cuando se combinó AH con 5-FU se
observó un efecto sinérgico citotóxico con la línea celular
MDA-MB-468, pero no con las líneas
celulares de cáncer de mama
MDA-MB-231 o
MDA-MB-435. Esto se muestra en la
Figura 11. La CI_{50} del 5-FU solo fue de >50
\muM, pero cuando se combinó con AH la CI_{50} fue de 40 nM, una
reducción en la dosis de fármaco de hasta 1250 veces.
Los resultados de los experimentos in
vitro demostraron un aumento en la muerte celular cuando se
aplicó 5-FU a las células de cáncer de mama en
presencia de AH. Las células
MDA-MB-468 mostraron la mayor
susceptibilidad a la terapia de 5-FU/AH, en las la
CI_{50} se redujo de >50 \muM hasta 40 nM, mientras tanto
MDA-MB-231 como
MDA-MB-435 prácticamente no se
vieron afectadas por la combinación de 5-FU/AH.
Todas las líneas celulares de cáncer de mama expresaron niveles
elevados del receptor CD44:
MDA-MB-468 (60-80%),
MDA-MB-231 (40-60%)
y MDA-MB-435
(40-60%) determinado como en Culty et al
(1994). Se ha demostrado que las tres líneas celulares utilizadas
en estos experimentos pueden degradar el AH, lo que implica que la
función de CD44 en las células tumorales puede ser la de mediar la
degradación del AH (Culty et al, 1994).
Otro factor a considerar es la exposición previa
de las células a los fármacos quimioterápicos. Antes de que una
línea celular tumoral se aísle a partir de un paciente, el paciente
de cáncer a menudo se ha sometido a quimioterapia o radiación, lo
que puede resultar en que el tumor contenga células resistentes al
tratamiento. En el caso de la
MDA-MB-435 y
MDA-MB-231, los pacientes de los que
se derivaron las líneas celulares habían sido expuestos previamente
a 5-FU (Cailleau et al, 1974). A causa de que
las células tumorales tienen varios mecanismos de adaptación para
superar la citotoxicidad del fármaco, es muy probable que la masa de
tumor que permanece tras el tratamiento sea resistente al
5-FU, alterando subsiguientemente la susceptibilidad
de las células al fármaco in vitro.
Con la intención de extrapolar cualquier dato
in vivo obtenido en ratones al tratamiento de sus homólogos
humanos, el modelo y diseño experimentales se desarrollo
cuidadosamente. Para demostrar definitivamente la focalización
in vivo y la eficacia terapéutica de la terapia de
5-FU/AH adyuvante en los xenoinjertos de cáncer de
mama humano, se examinaron los siguientes factores:
Los tumores de cáncer de mama humano se
establecieron en una cepa de ratón desnudo bien validada del Walter
and Eliza Hall Institute, un modelo ampliamente aceptado para estos
estudios que evita una respuesta inmune contra las células
alogénicas.
Los datos comparativos sobre la farmacocinética
del 5-FU ya habían sido publicados para los ratones
desnudos y humanos (Inaba et al, 1988), y se utilizaron en
el diseño de este estudio, para simular dosis lo más cercanas
posible a las terapéuticas en humanos.
Un objetivo principal fue la validación de que
el comportamiento histológico y citológico de los tumores
establecidos en estos ratones eran comparables al de los tumores en
sus huéspedes humanos naturales. En la realización de este objetivo
también se ha demostrado que las células tumorales en los ratones
son de origen humano y que éstas expresan receptores de AH
altamente relevantes como RHAMM y CD44.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se preparó una reserva de solución de AH (10
\muM, 7 mg/ml) disolviendo AH desecado (Mr modal 7 x 10^{5}
kDa,) en NaCl para inyección al 0,9% p/v libre de pirógenos. Para
asegurar una solución homogénea el AH se disolvió durante toda la
noche a 4ºC seguido de agitación abundante. Para asegurar que el AH
mantenía su peso molecular durante la preparación de la solución de
reserva, la solución se analizó en un gel de exclusión por tamaño
Sephacryl S-1000 con especificaciones de columna de
1,6 cm x 70 cm, tamaño de muestra de 2 ml, tasa de flujo de 18 ml/h
y tamaño de fracción de 2 ml. El AH se utilizó a una concentración
final de 100 nM, con todas las diluciones realizadas en el medio de
cultivo apropiado.
La solución de reserva de 5-FU
se preparó mediante la disolución de 5-FU en
hidróxido sódico 0,1 M y se llevó a una concentración de 20 mg/ml
con NaCl para inyección al 0,9% p/v libre de pirógenos. La solución
de reserva se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum para
asegurar la esterilidad antes de la adición de
[3H]-FU y la dilución hasta la concentración de
inyección con cloruro sódico para inyección. Las inyecciones
individuales se prepararon de acuerdo con las masas corporales de
los ratones individuales, con el objetivo de proporcionar 30 mg/kg
de 5-FU en 50 \mul (equivalentes a una dosis
terapéuticas humana de 10,5 mg/kg para una peso corporal medio de
60 kg; Inaba et al, 1988).
Una solución de reserva libre de pirógenos de AH
(10 mg/ml; Mr modal 7 x 10^{5} Da) se añadió a una porción de la
solución de reserva de 5-FU 20 mg/ml y se incubó
durante toda la noche con agitación, hasta una concentración final
de AH equivalente a 12,5 mg/kg de masa del ratón. Las inyecciones se
prepararon individualmente de acuerdo con las masas de los ratones,
para liberar 30 mg/kg de 5-FU y 12,5 mg/kg de AH en
50 \mul. Con esta cantidad de AH inyectado en el cuerpo, la
cinética de saturación se podría observar durante el periodo de
experimentación (Fraser et al, 1983). Para asegurar que el AH
había mantenido su peso molecular durante la preparación de la
mezcla de inyección, la solución de inyección se analizó en un gel
de exclusión por tamaño Sephacryl S-1000 con
especificaciones de columna de 1,6 cm x 70 cm, tamaño de muestra de
2 ml, tasa de flujo de 18 ml/h y tamaño de fracción de 2 ml. El
hialuronano se detectó en las fracciones de la columna mediante el
ensayo del ácido urónico.
El ensayo del ácido urónico se utilizó para
detectar la presencia de hialuronano cualitativamente a partir de
las fracciones recogidas del procedimiento de cromatografía de gel
filtración. Una alícuota de 25 \mul de cada fracción se
transfirió entonces a una placa de 96 pocillos. Entonces se
añadieron 250 \mul de un reactivo de carbazol (carbazol 3
M/borato 0,025 M en H_{2}SO_{4}) a esas fracciones. La placa de
96 pocillos se incubó durante 45-60 min. a 80ºC. Se
utilizó un lector de placas Dynatech MR7000 con un filtro de 550 nm
para leer la placa de 96 pocillos. La absorbancia se consideró que
era significativa cuando fue superior en >3 desviaciones
estándar a la absorbancia basal. La absorbancia basal se calculó
tomando el mismo número de puntos de la muestra antes y después de
Vo y Vt siendo el número medio de puntos 16 (Fraser et al.
1988).
La formulación del AH y 5-FU (AH
10 mg/ml y 5-FU 20 mg/ml en NaCl 0,5%, pH 8,9) no
mostró un efecto de degradación en el peso molecular del AH. El
análisis cromatográfico en un gel de exclusión por tamaño indicó que
el peso molecular modal de 700.000 Da se mantenía.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
En el diseño de los experimentos de titulación
del fármaco in vitro es deseable utilizar concentraciones de
fármaco similares a las concentraciones que se alcanzan en plasma
tras la administración intravenosa. Cuando el 5-FU
se administra terapéuticamente mediante vía intravenosa (iv) a 10,5
mg/kg (400 mg/m^{2}), el nivel máximo en plasma dentro de los 30
min. es de 8 \mug/ml [61 \muM, Kubo, 1990). En base a estas
concentraciones de plasma in vivo se seleccionaron las
siguientes concentraciones de fármaco: 0, 1, 5, 10, 20, 50 y 100
\muM de 5-FU \pm 100 nM de AH. Las líneas
celulares MDA-MB-468,
MDA-MB-231 y
MDA-MB-435 se cultivaron como se ha
especificado anteriormente en los ejemplos 4 a 5. Cuando los
cultivos alcanzaron la confluencia las células se recogieron de los
recipientes en tripsina al 0,25%/EDTA 0,05%. La suspensión de
células simples se contó con un contador Coulter (modelo ZM1) y las
células se resuspendieron a 100.000 células/ml en un medio
específico de las células. Las células se sembraron en placas de
24-pocillos (área de la superficie 2 cm^{2})
añadiendo 0,5 ml de la suspensión celular por pocillo, lo que
resultó en 50.000 células/pocillo. Se permitió que los cultivos se
adhirieran durante 24 h, antes de eliminar el medio, se lavaron las
monocapas con HBSS y se añadió el medio de prueba
(5-FU + AH). Tras 4 días de crecimiento en el medio
de prueba los cultivos se lavaron con HBSS, las células se
recogieron del pocillo mediante tripsinización con tripsina al
0,25%/EDTA 0,05% 0 y las células se contaron con un contador
Coulter.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
En base a los resultados de los experimentos de
sensibilidad al fármaco in vitro como se describe en los
ejemplos 5 a 7, y la expresión de los receptores de AH de CD44 y
RHAMM, la línea celular de carcinoma de mama humano
MDA-MB-468 se seleccionó como la
célula tumoral a inocular para la generación de cualquier
xenoinjerto de tumor humano en ratones desnudos. Las células se
cultivaron de forma rutinaria y se subcultivaron como se ha
descrito previamente en el Ejemplo 5. Para su inyección en ratones,
las células se cultivaron hasta un confluencia del 100%, se
tripsinizaron en una solución de tripsina al 0,025%/EDTA 0,01%, se
lavaron dos veces mediante centrifugación en una centrífuga de
sobremesa Beckman TJ-6 a 400 g_{av} durante 10
min., se contaron utilizando un contador Model-ZM
Coulter y se resuspendieron en un medio de Leibovitz
L-15 libre de suero a 1 x 10^{8} células/ml.
Los ratones hembra desnudos atímicos CBA/WEHI,
de 6 a 8 semanas de edad, se mantuvieron bajo condiciones
específicas libres de patógenos, con comida esterilizada y agua
disponible a voluntad. Cada ratón recibió una inyección que
contiene 5 x 10^{6} células en 50 \mul. Las células se
inyectaron con una aguja de calibre 26 en la panícula adiposa
mamaria directamente bajo el primer pezón (Lamszus et al,
1997). Las medidas de los tumores se realizaron semanalmente
midiendo
\hbox{tres diámetros perpendiculares (d1d2d3). El
volumen del tumor se estimó utilizando la fórmula:}
(1/6)\pi\
(d1d2d3)
El tratamiento con 5-FU \pm AH
se comenzó aproximadamente 4-8 semanas tras la
inoculación de las células tumorales. El tamaño medio del tumor en
los ratones utilizados en cada estudio se resume en la Tabla 5.
Para establecer la tumorigenicidad de la línea
celular de cáncer de mama MDA-MB-468
y su capacidad para generar tumores tras la inyección en un huésped
animal apropiado, fue necesario realizar pruebas patológicas. Para
que un tumor sea fisiológicamente viable es esencial la
neovascularización en la que la red capilar aporta los nutrientes
al tumor. La presencia de vascularización, invasión ductal,
necrosis, apoptosis, índice mitótico elevado y anormalidades
nucleares son todas características del carcinoma de mama. El examen
de las secciones de los tumores de mama teñidos con hematoxilina y
eosina mostró todas estas características, confirmando así que el
huésped animal mantiene con éxito un carcinoma de mama humano de
grado II.
El tumor fijado se deshidrató durante toda la
noche en una serie de lavados de etanol del 70-100%,
seguido por una inclusión en parafina de la que se cortaron
secciones de 2-4 \mum. Las secciones se colocaron
en portaobjetos, se desparafinaron, y se hidrataron. Las
preparaciones se lavaron 3 x 5 min. en PBS. Las proteínas
heterófilas se bloquearon mediante la incubación con suero fetal
bovino al 10% durante 10 min., seguido por un lavado con PBS. Los
anticuerpos de detección se aplicaron durante 60 min. a TA. Los
antisueros o anticuerpos de detección eran dirigidos contra RHAMM,
CD44H y CAE. Las preparaciones se lavaron 3 x 5 min. en PBS y se
bloqueó la actividad peroxidasa endógena se bloqueó mediante
inmersión en H_{2}O_{2} 0,3%/metanol durante 20 min. Tras un
nuevo lavado con PBS, se aplicó un antisuero secundario
anti-conejo de cerdo conjugado con peroxidasa
durante 60 min. a TA, seguido por un lavado de 3 x 5 min. en PBS. Se
prepararon las tabletas Sigma Fast
3,3'-diaminobenzidina (DAB) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y la solución de DAB se aplicó durante
5-10 min. a TA. Las preparaciones se lavaron en agua
corriente durante 10
\hbox{min., se realizó una contratinción
con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron.}
El origen humano de las células tumorales se
confirmó mediante la tinción del tumor y el tejido circundante con
un marcador tumoral específico de humano. La presencia de CEA
demostró claramente que el tumor era humano, aunque estaba
mantenido por el sistema cardiovascular de un huésped murino. Ya que
se realizó la hipótesis que la focalización en el tumor podía
ocurrir a través de una internalización o unión mediada por
receptor, fue necesario establecer la expresión de los receptores
de AH, CD44 y RHAMM. La Tabla 6 lista el grado de expresión del
receptor en los xenoinjertos de cáncer de mama humano.
Índice de clasificación para el porcentaje de
expresión de epítopo en tumores:
\newpage
Ejemplo
9
Los ratones se dividieron de forma aleatoria en
2 grupos de 25 animales. El Grupo 1 recibió
[^{3}H]5-FU solo, y el Grupo 2 recibió la
combinación de [^{3}H]5-FU/AH. Los
tratamientos se administraron cuantitativamente por medio de la
vena de la cola pesando la jeringa de inyección antes y después de
la inyección. Se dispensó en cada inyección 5-FU
tritiado (dpm medias inyectadas \pm EEM: 31.313.002 \pm 131.348)
contenido en 30 mg/kg de 5-FU \pm 12,5 mg/kg de
AH.
Para asegurar una cuantificación precisa de la
cantidad de [^{3}H]5-FU liberada al
torrente sanguíneo, se diseccionó el lugar de inyección en la vena
de la cola y se midió su contenido de
[^{3}H]5-FU. La cantidad de
5-FU liberada al torrente sanguíneo
(5-FU disponible para la distribución a los tejidos
y al tumor) se calculó como:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de 5-FU liberada al
torrente sanguíneo se denominó la "dosis inyectada".
Para poder realizar comparaciones exactas entre
la población de muestra y normalizar las pequeñas variaciones en
las masas de los órganos y tumores, se expresó la concentración de
5-FU en los órganos del cuerpo y el fluido corporal
y tumoral como % de la dosis inyectada/gramo de tejido.
Los ratones se situaron individualmente en un
recinto de plástico, impermeable para poder recoger la orina. A los
10 min., 20 min., 30 min., 1 h o 2 h después de la inyección, los
ratones se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de
0,1 ml de Nembutal.
Tras anestesiar los animales, se recogió sangre
del corazón o de los grandes vasos sanguíneos utilizando una
jeringa con aguja. La sangre se recogió en tubos de vidrio con EDTA
y el plasma se preparó mediante centrifugación a 14.000 g_{av}
durante 10 min. Se contó la radioactividad en 50 \mul tras su
decoloración con 100 \mul de peróxido de hidrógeno al 30% v/v y
la adición de 3 ml de líquido de centelleo HiSafeII. Para superar la
quimio- y fotoluminiscencia, las muestras se contaron durante 2
min. en un contador Wallac 1410 \beta durante un periodo de 3, 7
o 20 días, dependiendo del origen de la muestra. Durante los
periodos de contaje, las muestras se almacenaron en la oscuridad a
temperatura ambiente. Todos los cálculos se realizaron en muestras
estabilizadas en la que la quimio- y fotoluminiscencia habían
desaparecido. Para determinar el porcentaje de 5-FU
inyectada en plasma, fue necesario calcular el volumen total de
plasma de cada ratón (ml). La fórmula estándar fue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de 5-FU inyectado
en el plasma se calculó mediante:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando fue posible, se recogió la orina del
recinto de plástico impermeable con una aguja y una jeringa. La
orina se clarificó por centrifugación a 14.000 g_{av} durante 10
min. Se midió su contenido radioactivo tras la adición de 3 ml de
líquido de centelleo HiSafeII a las muestras entre un rango de
8-30 \mul. Debido a las dificultades técnicas en
la cuantificación exacta del volumen de orina producida por cada
ratón, el % de la dosis de 5-FU inyectada en la
orina se calculó mediante la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez extraída la sangre, los ratones se
sacrificaron mediante dislocación cervical. Inmediatamente después
de sacrificar a los ratones se extrajeron el tumor, hígado, corazón,
bazo, vejiga, riñones, útero, pulmones, estómago, intestinos,
cerebro y nódulos linfáticos y se analizó su radioactividad total.
La radioactividad total por tejido se determinó mediante la
solubilización de 100-400 mg de tejido en
3-6 ml de durante 36 h, a 22ºC. Tras la
solubilización se contó el tejido tras añadir 10 ml de líquido de
centelleo HiSafeIII. Las muestras se contaron como se ha descrito
anteriormente para evitar la quimioluminiscencia.
Tal como se muestra en la Figura 12, existe un
efecto de focalización significativo cuando se combinan AH y
5-FU. El gran aumento relativo en la retención del
fármaco en el tumor se observó a los 10 min., cuando el AH aumentó
la incorporación del fármaco en un factor de 2,42 (p = 0,001, prueba
t Student). A los 20 min. y a los 30 min. tras la administración de
AH/5-FU, también se notó un aumento estadísticamente
significativo en la incorporación de 5-FU en el
tumor, con un aumento de la incorporación del fármaco de 1,5 y 2
veces respectivamente (p<0,001, prueba t Student). Los otros
puntos temporales no mostraron una diferencia estadísticamente
significativa entre 5-FU administrado como un único
agente y la coinyección con AH.
Fue importante establecer que los órganos
metabólicos como el hígado, bazo y riñones no experimentaron un
alto nivel de focalización de fármaco que pudiera neutralizar
cualquier aspecto positivo de un aumento de la focalización en el
tumor. La tabla 7 muestra la incorporación de
[^{3}H]5-FU en cada tejido en los
diferentes puntos temporales analizados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La Figura 13 muestra que los órganos metabólicos
primarios del AH son el hígado, nódulos linfáticos y bazo, mientras
que el 5-FU se metaboliza mayoritariamente en el
hígado.
Estos órganos no presentan un aumento
significativo en la incorporación de 5-FU cuando se
coinyecta con AH. No obstante, los riñones demostraron un aumento
significativo en la focalización de 5-FU a los 10
min. tras la administración con AH (aumento de
1,8-veces, p = 0,004). Tras este punto, aunque no
fue estadísticamente significativo, esta tendencia de aumento de la
incorporación del fármaco continuó hasta la finalización del tiempo
de
muestreo.
muestreo.
La vejiga, los intestinos y la médula ósea no
demostraron un aumento de la incorporación de 5-FU.
En los tejidos como el útero, hubo un aumento a corto plazo en la
incorporación del fármaco a los 10 min. (aumento de
1,8-veces, p = 0,032), pero no se mostraron
diferencias en los otros puntos de tiempo, por lo que la
significación de esta observación permanece incierta.
El estómago, cerebro y pulmones mostraron un
aumento de la incorporación de 5-FU en uno o dos
puntos de muestreo. No obstante, debido al pequeño número de
animales en cada punto de tiempo (n=5) no fue posible obtener una
significación estadística sustancial, aunque se pudo observar una
marcada tendencia como se muestra en la Figura
14A-C.
En los últimos puntos de muestreo de 1 h y 2 h,
se notó un descenso significativo en el 5-FU
cardíaco, en la que la coadministración con AH resultó en un
descenso del 59% (p = 0,003) y 53% (p = 0,021) respectivamente.
No fue posible recoger orina de cada ratón,
debido a las variaciones en la tasa de micción; por lo que no se
recogió orina suficiente para permitir el análisis estadístico.
Cuando el 5-FU se coinyectó con
AH hubo un descenso temprano en los niveles circulantes de
5-FU (Tabla 7). El hialuronano redujo el
5-FU en plasma en un 55% (p = 0,001). La vida media
en plasma farmacocinética se alteró de 28 min. a 56 min. en los
ratones que recibieron 5-FU/AH como se muestra en la
Figura 15.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Uno de los regímenes de tratamiento más
utilizados para el cáncer de mama humano es la ciclofosfamida,
metotrexato y 5-fluorouracilo que se administró en
el día 1 y 8 de un ciclo de 28 días. En el cáncer de mama humano, el
régimen de tratamiento inicial es de 6 ciclos, al cabo del cual se
reevalúa el estado del paciente, por lo tanto intentamos simular el
régimen de tratamiento humano de la forma más cercana posible
exponiendo a los ratones a 6 ciclos (6 meses) de tratamiento en un
estudio de eficacia a largo plazo y a 6 ciclos (6 semanas) en un
estudio de eficacia a corto plazo. Considerando que el ciclo de vida
de un ratón es de aproximadamente 2 años, comenzamos ambos
protocolos de tratamiento a corto y largo plazo tal como se muestra
en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los ratones se dividieron de forma aleatoria en
7 grupos de 8 animales por grupo para el estudio a corto plazo y 5
grupos de 8 animales para el estudio a largo plazo (consultar la
Tabla 8 para el calendario de dosificación y administración de
tratamiento).
El tratamiento no se extendió más allá de los 6
meses ya que se ha demostrado que la quimioterapia que dura más de
seis meses no se asocia generalmente con un mayor beneficio (Harris
et al, 1992).
Se pesaron los animales y se midieron los
volúmenes del tumor en el día de la aplicación del tratamiento para
el estudio a largo plazo tal como se ha descrito en el Ejemplo 8. Se
pesaron los animales del estudio de 6 semanas y se midieron los
volúmenes del tumor en una base diaria. Los animales se situaron por
separado en una caja de inyección, y las inyecciones se
administraron a través de la vena de la cola. Se ha probado de
forma experimental que el estrés puede ser un factor esencial en la
respuesta de pacientes a la quimioterapia (Shackney et al,
1978), por lo que nos aseguramos de colocar el mismo número de
ratones en cada jaula, el número de animales por jaula varió entre
5 y 8 dependiendo de la fase del experimento.
La finalización del experimento ocurrió cuando
se tuvo que sacrificar al animal debido al grado de progresión de
la enfermedad o cuando se completó el régimen de tratamiento de 6
meses (largo plazo) o 6 semanas (corto plazo). Debido a las guías
éticas de los animales, éstos fueron monitorizados quincenalmente
por un agente de ética animal independiente que valoró el grado de
progresión de la enfermedad. Tal como se muestra en la Figura 16,
se utilizaron los siguientes criterios para determinar si un animal
había alcanzado la fase de finalización del experimento de muerte
necesaria:
1). el animal no comía o bebía y sufrió una
dramática pérdida de peso;
2). el tamaño del tumor era mayor que el 10% de
la masa corporal (Panel A);
3). la masa tumoral era tan grande que el animal
estaba inmovilizado (Panel B).
En la finalización del experimento, los animales
se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de 0,1 ml de
Nembutal (60 mg/ml), se recogió sangre después de sacrificar a los
animales mediante dislocación cervical.
Al final del estudio de 6 semanas, se determinó
la masa tumoral y ambas terapias de 5-FU y
5-FU/AH presentaban tumores significativamente más
pequeños que el grupo con salino (p = 0,005) tal y como se muestra
en la Figura 17. No existe una diferencia significativa en el
volumen tumoral entre los grupos de tratamiento 5-FU
y AH/5-FU, lo que indica que ambas terapias
mostraron la misma eficacia frente al tumor primario. No se
encontraron diferencias estadísticas entre el volumen del tumor
primario del grupo con salino y AH.
Inmediatamente después de sacrificar al ratón,
se extrajeron el tumor, hígado, corazón, bazo, vejiga, riñones,
útero, pulmones, estómago, intestinos, cerebro y nódulos linfáticos
y se sumergieron en formalina al 4% tamponada con fosfato 0,06 M pH
7,5, y cloruro de cetilpiridinio al 1,0% p/v. El tejido se fijó
durante 16-24 h antes de su procesado histológico.
El tejido fijado se deshidrató por pasos en etanol al 100% y se
incluyó en bloques de parafina de las que se colocaron secciones de
2-4 \mum en portaobjetos de vidrio para el
microscopio. La tinción de las secciones de tejido con una tinción
nuclear de hematoxilina y una tinción citoplasmática de eosina
resaltó cualquier característica patológica que pudiera indicar
toxicidad del tratamiento.
Se recogieron de 9 a 11 nódulos linfáticos por
cada animal, asegurando la recogida de todos los nódulos que
drenaban el área del tumor. Actualmente existen dos métodos para la
detección de metástasis en los nódulos linfáticos:
i) tinción rutinaria con hematoxilina y eosina
de la estructura bruta del órgano
ii) inmunohistoquímica utilizando un marcador
para el cáncer como el antígeno carcinoembriónico
Ambos métodos de detección de la metástasis se
utilizaron en este estudio. No todos los anticuerpos CEA disponibles
comercialmente reaccionan con las células de cáncer de mama humano,
por lo que probamos la reactividad de 5 anticuerpos diferentes
(DAKO, Amersham y KPL).
Los nódulos linfáticos teñidos con hematoxilina
y eosina fueron examinados por el Dr. P. Allen (patólogo titulado),
y cada nódulo se examinó al microscopio en busca de células
tumorales. Los nódulos linfáticos teñidos de forma inmunológica con
CEA se examinaron al microscopio, en el que se contó cualquier
nódulo teñido de forma positiva y considerado positivo para
metástasis en los nódulos linfáticos.
El volumen del tumor se monitorizó diariamente o
semanalmente mediante mediciones con un pie de rey y se calculó el
volumen del tumor tal como se ha descrito anteriormente en el
Ejemplo 8.
Uno de los efectos tóxicos más comunes del
5-FU es sobre el tracto gastrointestinal en el que
pueden aparecer enteritis hemorrágicas y perforación intestinal
(Martindale, 1993). Los animales se monitorizaron diariamente en
busca de desordenes en el tracto GI como la diarrea y semanalmente
en busca de manifestaciones de toxicidad más severas, como la
pérdida de peso. La pérdida de peso se monitorizó mediante el
cálculo del peso corporal neto estimado restando el peso del tumor,
que se calculó como 1 g x volumen de tumor (cm^{3}) como se cita
en Shibamoto et al, 1996. Para confirmar cualquier cambio en
el peso, el peso corporal del animal se normalizó con el peso
corporal en el día de inicio del tratamiento como:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
No se detectó ningún desorden diario en el
tracto GI, como diarrea, en ninguno de los animales
independientemente del régimen de tratamiento. Se estimó la
toxicidad gastrointestinal severa para cada régimen de tratamiento
utilizando como indicador la pérdida de peso (excluyendo el peso del
tumor). En el momento de la muerte de cada animal, se calculó el
porcentaje de cambio en la masa corporal como se ha descrito
previamente. Existe una diferencia estadísticamente significativa
en el peso corporal normalizado entre los grupos de tratamiento con
salino, AH y 5-FU comparado con el grupo de
tratamiento con 5-FU/AH (Figura 18). Los ratones que
recibieron la terapia adyuvante 5-FU/AH mostraron
un aumento del 16% en el peso corporal (prueba t Student, p = 0,025)
a través del tratamiento en comparación con el grupo no tratado que
sufrió un aumento neto del 2% en su peso.
La combinación de la detección
inmunohistoquímica del antígeno carcinoembriónico (CEA) con un
diagnóstico clásico de la patología proporcionó una cuantificación
excelente de la metástasis en los nódulos linfáticos. El ratón
medio contiene 15-19 nódulos linfáticos (Lamszus
et al, 1997), por lo que en este estudio se examinaron
aproximadamente un 60-70% de los nódulos linfáticos
de los animales. Se siguió un procedimiento cuidadoso para asegurar
que se retiraban y examinaban todos los nódulos que drenaban el
panículo adiposo mamario y la región pectoral. Tal como se muestra
en la Tabla 9A, todos los animales mostraron metástasis en los
nódulos
linfáticos.
linfáticos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La Figura 19A muestra que el porcentaje de
afectación de los nódulos linfáticos (número de nódulos metastásicos
por animal) se vio afectado en gran medida por los tratamientos con
5-FU, 5-FU/AH y AH, en el que el
grupo salino demostró un aumento de 6 veces en la cantidad de
nódulos linfáticos involucrados. Una vez más, el AH demostró que
puede tener valor terapéutico.
Mientras se diseccionaba el animal al final del
estudio, cada tejido se examinó micro- y macroscópicamente en busca
de tumores en los nódulos. Con la excepción de los ratones que
recibieron la terapia AH/5-FU o AH, se observaron
nuevos tumores alrededor del cuello o de la región axilar del área
adyacente al tumor primario. La incorporación de AH al régimen de
tratamiento inhibió la nueva formación de tumores, tal y como se
muestra en la Figura
19B.
19B.
No existe una diferencia significativa en la
supervivencia general del paciente independientemente del
tratamiento (Tabla 9A), en el que los animales de todos los grupos
completaron los regímenes de tratamiento.
Como una de las principales toxicidades
asociadas con el tratamiento de 5-FU es la depresión
de la médula ósea y la posterior caída en el número de las células
linfocitarias, fue necesario evaluar cualquier tratamiento asociado
con la toxicidad en la sangre. Tras anestesiar a los animales, se
recogió la sangre del corazón o de los grandes vasos sanguíneos
utilizando una jeringa y una aguja. Se estimó el número de células
linfocitarias mediante una dilución 1/10 de la sangre en salino de
tenacidad de ratón (M) y se contó en un hemocitómetro. Se realizó
un contaje diferencial de sangre, con contaje de neutrófilos,
linfocitos, y eritrocitos. La estimación total de las
subpoblaciones de células sanguíneas se comparó con los datos
publicados de la sangre de ratón.
Para asegurar que los tratamientos no inducían
una atrofia o hipertrofia de los órganos, se extrajeron los órganos
y se pesaron durante el post mortem. La masa de cada órgano
se calculó como % del peso corporal total neto, y se comparó con
las masas de los órganos de sólo el grupo salino (Grupo 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Mientras este estudio está todavía en marcha se
están generando datos significativos.
El TDT es el tiempo que tarda un tumor (días) en
doblar su masa o número de células, un parámetro de crecimiento
tumoral que es fácil de medir y puede relacionarse fácilmente con el
comportamiento clínico del tumor en términos conceptuales (Shackney
et al, 1978). Al monitorizar el tiempo que tarda el tumor en
doblar su masa, a menudo es posible evaluar la respuesta
quimioterapéutica del tumor, ya que los tumores de crecimiento lento
tienden a responder peor a la quimioterapia (Schabel, 1975).
El tiempo que tarda el tumor en doblar su masa
en cada tratamiento se muestra en la Tabla 9B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
No existe una diferencia significativa en el TDT
entre el tratamiento 5-FU/AH y 5-FU.
Como pasaba con el estudio de 6 semanas, la administración de AH
también mostró un efecto terapéutico sobre el tumor primario,
mostrando un TDT de 26 \pm 1,75 frente al salino de 13 \pm 4
días. La administración de AH 24 h antes del 5-FU
pareció contrarrestar cualquier valor terapéutico del
5-FU en relación al retraso en el crecimiento del
tumor.
La masa del tumor y el volumen son parámetros
útiles en la monitorización de la progresión y respuesta al
tratamiento del tumor, pero no demuestran en última instancia los
efectos citotóxicos relacionados con la terapia. Se pretende
establecer si la terapia de AH/5-FU elimina más
células tumorales y la localización de las células. Las muerte de
las células puede manifestarse patológicamente mediante:
i). la desintegración del núcleo (apoptosis)
ii). lisis de la célula (necrosis)
El barrido de la imagen del tumor completo en un
ordenador MCID que calcula el área total del tumor cuantificó el
número de células que se está muriendo. Las células con núcleos
fragmentados o células lisadas se marcaron y escanearon, estas
áreas se digitalizaron posteriormente y se calculó el área exacta de
células que se está muriendo. El porcentaje del tumor atribuido a
células muertas se calculó mediante:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una célula viable contiene más agua que una
célula muerta o moribunda, por lo que al determinar la proporción
de masa de tumor seca respecto a la masa de tumor húmeda es posible
estimar el área total de células viables frente a no viables. Los
tumores se diseccionaron bilateralmente y una mitad se procesó para
analizar la patología del tumor y la mitad restante se pesó antes y
después de secarla a 50ºC durante 48 h. La masa seca como porcentaje
de masa de tumor húmeda se calculó mediante:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El tiempo de supervivencia total del paciente se
calculó como el tiempo (días o semanas) que el animal vivió después
del inicio del tratamiento.
El tiempo que tarda el tumor en doblar su masa
para cada tratamiento se muestra en la Tabla 9A. No existe una
diferencia significativa en el TDT entre los tratamientos con
5-FU/AH y 5-FU. No obstante, la
administración de AH demostró un efecto terapéutico sobre el tumor
primario, en el que el TDT fue significativamente superior al del
grupo salino (p, 0,05, prueba Tukey de comparación múltiple). La
administración de AH 24 horas antes de 5-FU pareció
contrarrestar cualquier valor terapéutico de 5-FU en
relación al retraso del crecimiento tumoral.
La tasa de curación citada para el
5-FU es del 26% (Inaba et al, 1989), pero los
animales que recibieron 5-FU no experimentaron un
"curación". Dos ratones que recibieron la terapia adyuvante
AH/5-FU experimentaron una "curación" en la
que los tumores necrotizaron totalmente y se desprendieron después
de aproximadamente 12 semanas de tratamiento. La Figura 20B muestra
la apariencia característica de formación de pequeñas costras en
ratones que recibieron el tratamiento con AH y
AH/5-FU, mientras que la Figura 20C muestra la
apariencia de pequeñas áreas de necrosis seguidas por la formación
de un gran área de costra. Uno de los ratones experimentó el
recrecimiento de un pequeño nódulo, pero el segundo ratón estuvo
libre de tumores durante las 22 semanas. Tal como se muestra en la
Figura 20A, los ratones que recibieron 5-FU o salino
poseían tumores grandes que acabaron con el sacrificio del ratón
debido a la carga de la masa del tumor (Tabla 9B), pero los ratones
que recibieron AH + 5-FU mostraron la aparición de
tumor característica, en la que un área pequeña necrotizada estaba
seguida por la formación de una costra.
En la semana 22, el 37,5% de los ratones
5-FU/AH todavía sobrevivían, y la principal causa de
muerte de los ratones en terapia adyuvante de
5-FU/AH fue la pérdida de peso y estrés metabólico
(Tabla 9B).
Parece haber una diferencia significativa en la
supervivencia total de los pacientes cuando se administra AH \pm
5-FU a ratones portadores de xenoinjertos de cáncer
de mama humano. En la semana 22 de un estudio de 24 semanas los
únicos grupos supervivientes fueron los grupos
5-FU/AH y AH, tal y como se muestra en la Figura
21.
Los datos de la focalización de
5-FU muestran que hay un aumento estadísticamente
significativo en la incorporación de 5-FU a los
tumores cuando el 5-FU se inyectó con AH en los
puntos temporales 10, 20 y 30 minutos con un aumento de 2,4, 1,5 y
2 veces respectivamente en la incorporación de 5-FU
(Tabla 7). Esto indicó que el 5-FU había sido
dirigido hacia el tumor por el AH. Existen dos posibles mecanismos
de focalización del 5-FU por el AH hacia las
células tumorales:
El AH que contiene asociado el
5-FU se une a los receptores (CD44) y se internaliza
mediante la endocitosis mediada por el receptor, por lo que libera
el fármaco dentro de la célula tumoral.
La malla molecular de AH actuará como una
impedancia hacia la difusión externa, por lo que después de que AH
se una a los receptores (CD44 y RHAMM), el 5-FU
incorporado es capaz de difundir hacia las células tumorales.
Mientras se mantiene en la superficie de las células mediante la
matriz de AH, el 5-FU aumenta la disponibilidad del
mecanismo de transporte activo utilizado normalmente para el
transporte de 5-FU en la célula subya-
cente.
cente.
El catabolismo de AH sucede principalmente en
los nódulos linfáticos (Fraser et al, 1988) y el hígado
(Laurent et al, 1986). El AH se clarifica normalmente del
torrente sanguíneo mediante una incorporación celular mediada por
receptor y el catabolismo en el hígado (80-90%),
riñones (10%), bazo (0,1%) y médula ósea (0,1%) (Fraser et
al, 1983). El AH circulante se capta mediante el receptor
metabólico, también conocido como el receptor de células
endoteliales del hígado (LEC) (Eriksson et al, 1983),
mientras que el receptor CD44 parece estar involucrado con la
internalización de AH asociado con procesos celulares en lugar del
metabolismo, mientras que el receptor RHAMM está sólo involucrado
en la motilidad celular. La combinación de AH con
5-FU puede resultar en altos niveles de
5-FU siendo dirigidos a los lugares de metabolismo
de AH o 5-FU. Los datos de los experimentos de
focalización (Tabla 6) muestran que no hay un aumento significativo
en la focalización de 5-FU hacia el hígado cuando
se administra con AH. Como no se observó un aumento de la
focalización hacia el hígado, esto sugiere que el receptor LEC en
el hígado puede tener una menor afinidad de unión del AH en
comparación con el receptor CD44. Otra posibilidad es que la
isoforma CD44 expresada en las células del hígado (Stamenkovic
et al, 1991) no se una a AH con una alta afinidad. Como en el
caso del hígado, no se detectó un aumento de la focalización de
5-FU en el resto de órganos metabólicos como el
bazo, la médula ósea y los nódulos linfáticos.
Hubo un incremento significativo de 1,8 veces en
la focalización de 5-FU en los riñones en un lapso
de tiempo de 10 min. Aunque los otros cuatro puntos temporales no
mostraron un incremento significativo en la incorporación de
5-FU por el riñón cuando se coadministró
AH/5-FU, pareció ser una tendencia general que
sucedía, cuando más 5-FU se liberaba en los riñones
durante la administración con AH. La principal ruta para la
eliminación final de 5-FU del organismo es la
excreción urinaria. Aún cuando parece haber un pequeño aumento en el
contenido renal del fármaco con AH, creemos por otras evidencias
que el AH se capta y cataboliza muy rápidamente en los riñones por
lo que su tiempo de residencia será más corto y el fármaco asociado
se liberará rápidamente a la
orina.
orina.
En tejidos como el estómago, cerebro, pulmones y
útero, la focalización a corto plazo se detectó en uno o más puntos
temporales. No se generaron patrones farmacocinéticos consistentes,
que pudieran indicar que necesitemos aumentar la muestra de
población, que pudiera indicar definitivamente si estas
observaciones son genuinas. En el caso del aumento de focalización
en el cerebro a los 10-30 min., esto podría
explicarse por la observación previa de que el AH se había asociado
con un aumento de la capacidad de los fármacos de cruzar la barrera
hematoencefálica (Nelson & Falk, 1994).
Hubo un incremento significativo de los niveles
de 5-FU en los pulmones durante la administración
con AH en los puntos temporales de 30 min. y 1 h. Se describió que
los macrófagos de los pulmones contenían altos niveles de la
isoforma CD44 que se une al AH, (Underhill et al 1993), que
podía contar en el aumento de focalización. Esto podría asociarse
con una ventaja terapéutica en el tratamiento del carcinoma de
pulmón, entre los que se ha descrito que los carcinomas de células
pequeñas y grandes contienen una sobreexpresión de CD44 y RHAMM
(Horst et al,
1990).
1990).
Hubo un descenso significativo en el
5-FU focalizado al corazón en los puntos temporales
de 1 y 2 h cuando el AH se coinyectó con 5-FU. Ya
que la administración de 5-FU puede resultar en
cardiotoxicidad (MIMS, 1997), la administración de
5-FU con AH puede reducir el grado de toxicidad en
el corazón cuando se compara con la administración de
5-FU solo.
Cuando se evalúa la eficacia terapéutica de la
terapia adyuvante de AH/5-FU, varias observaciones
fueron consistentes con ambos protocolos de tratamiento a largo y
corto plazo.
Los ratones que recibieron
AH/5-FU o AH solo parecieron tener más energía y
mantuvieron o aumentaron su masa corporal, dichas observaciones
están apoyadas por los mayores tiempos de supervivencia de los
ratones AH/5-FU en el estudio de 6 meses.
\newpage
Los tumores de los ratones que recibieron
5-FU/AH o AH desarrollaron áreas de necrosis
externa, hasta el punto en que 2 tumores se desprendieron.
La adición de AH a 5-FU no
pareció tener un efecto significativo en el volumen del tratamiento
primario cuando la terapia se administró durante 6 semanas, pero
esto pudo ser debido a la vascularización del tumor. Los tumores
consisten en tres áreas. Cuando el AH se administró con y sin
5-FU pudo alcanzar al tumor, entrar en las áreas
bien vascularizadas y seminecróticas mediante grandes huecos en las
juntas de los vasos sanguíneos dañados. Debido a la capacidad del
AH de absorber agua, esto pudo resultar en un entrada de fluido
extracelular hacia el área necrótica del tumor, aumentando
posteriormente el volumen del tumor y provocando un mayor daño en
la vasculatura tumoral. Esta hipótesis es consistente con la
observación de que los tumores tratados con AH \pm
5-FU no mostró por rutina necrosis y filtración en
el fluido intracelular del tumor. Cuando se complete el cálculo de
las áreas necróticas frente a las células viables y la proporción de
masa seca:húmeda se podrá verificar esta
hipótesis.
hipótesis.
El estudio de eficacia a largo plazo mostró un
aumento de la tasa de supervivencia en los ratones que recibían el
tratamiento AH/5-FU tal como se muestra en la Figura
21. El volumen medio del tumor de estos ratones también parece
reducirse al compararse con el otro grupo de tratamiento. También se
notó en el estudio a largo plazo que la causa de muerte para el
grupo AH/5-FU era debida mayoritariamente al estrés
metabólico mientras que la causa de muerte del grupo
5-FU fue debida más a la inmovilización a causa de
que el tamaño del tumor era muy grande. Todos los ratones del grupo
AH solo, murieron por la inmovilización debido a que el tamaño del
tumor era muy grande y no por la toxicidad. Así el AH no pareció
tener ningún efecto de toxicidad cuando se administra. A partir de
los resultados de focalización se dedujo que aparece un aumento de
la focalización de 5-FU en el tumor cuando se
combina el AH con 5-FU (Figura 12). La capacidad del
AH de dirigir al 5-FU hacia el tumor mediante la
unión a AH en los receptores CD44 y RHAMM específicos de AH, que
habían mostrado estar presentes en cantidades aumentadas en los
tumores (Culty et al, 1994; Wang et al 1996), puede
indicar que la utilización de AH con 5-FU y otros
fármacos citotóxicos puede ayudar a superar el problema de la
insuficiencia de fármaco que alcanza el tumor para poder tener
cualquier impacto terapéutico. También se ha encontrado que en el
estudio a corto plazo los ratones 5-FU/AH mostraron
un aumento significativo en la masa corporal cuando se compara con
el resto de grupos (Figura 21). Consecuentemente la capacidad de
focalización del AH hacia la localización de los tumores puede
disminuir la cantidad de 5-FU que va a parar a otros
órganos como los intestinos y así reducir los efectos secundarios
del tratamiento asociados con la terapia con 5-FU,
en particular la toxicidad gastrointestinal.
En comparación con la evaluación inicial de la
terapia adyuvante de MTX/AH descrita en los ejemplos 1 a 3, se
notaron algunos resultados comunes y diferencias distintivos tal
como se resume en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La principal diferencia en los dos estudios fue
la masa inicial de los tumores, en el que el volumen medio del
tumor en el estudio de MTX/AH fue de 175,13 mm^{3} en comparación
con los 61,63 mm^{3} en el estudio 5-FU/AH. Por
la dinámica del movimiento de partículas hacia los tumores y la
respuesta de un paciente a la masa del tumor, esto podría ser
responsable de los diferentes resultados obtenidos en relación con
las estimaciones de
TDT.
TDT.
\newpage
Ejemplo
12
Uno de los regímenes de tratamiento más
utilizados para el cáncer de mama primario humano y metastásico es
la combinación de quimioterapia con ciclofosfamida (Cyc), MTX y
5-FU que se administran en el día 1 y 8 de un ciclo
de 28 días. La terapia de combinación, con frecuencia denominada
CMF, se administra normalmente en 6 ciclos al final de los cuales
se reevalúa el estado del paciente. La tasa de respuesta antitumoral
con la terapia CMF se ha descrito que es de aproximadamente un 50%
(Bonadonna, 1981; Bonadonna, 1988), pero la terapia presenta muchos
efectos secundarios asociados como la fatiga, náusea, leucopenia y
vómitos (Bonadonna, 1976; Meyerowitz, 1979). Debido al éxito de
utilizar AH como un vehículo de liberación de fármacos tanto para
MTX como para 5-FU se evaluó la eficacia
terapéutica y la toxicidad de la terapia adyuvante AH/CMF sobre un
régimen de tratamiento de 6-semanas y 6 meses.
El MTX y 5-FU se prepararon como
se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 2 y 6, respectivamente.
La concentración de reserva de Cyc, se preparó al disolver 1 g del
fármaco liofilizado en 1 ml de agua destilada para inyección libre
de pirógenos y se llevó hasta 50 ml de cloruro sódico al 0,9% para
inyección. La solución se alicuotó en pequeños volúmenes y se
congeló a -20ºC hasta que fue necesaria su utilización.
Se preparó una inyección de CMF tomando el
volumen adecuado de la solución de reserva del fármaco hasta
alcanzar las concentraciones finales del fármaco de:
30 mg/kg 5-FU (solución de
reserva: 20 mg/ml)
15 mg/kg MTX (solución de reserva: 24,5
mg/ml)
26 mg/kg Cyc (solución de reserva: 20 mg/ml)
12,5 mg/kg AH (solución de reserva: 10
mg/ml)
Para establecer la eficacia terapéutica y
cualquier posible toxicidad de la terapia adyuvante de CMF/AH, se
utilizaron xenoinjertos de tumor de mama humano en ratones desnudos.
Para simular el régimen de tratamiento en humanos tan exacto como
fuese posible, los ratones se trataron en un estudio de eficacia a
largo plazo en un tratamiento de 6 ciclos (6 meses) y un estudio de
eficacia a corto plazo en 6 ciclos (6 semanas). Los ratones se
dividieron en 7 grupos de 8 animales por grupo para el estudio a
corto plazo y 5 grupos de 8 animales para el estudio a largo
plazo.
Los ratones se trataron con 30 mg/kg de
5-FU; 15 mg/kg de MTX; 26 mg/kg de Cyc \pm 12,5
mg/kg en los días 1 y 2 de un régimen de 7 días para 6 semanas, o
en los días 1 y 8 de un régimen de 28 días para 6 meses. Los grupos
control consistieron en la administración de salino, 12,5 mg/kg AH o
ratones que tuvieron 12,5 mg/kg de AH el día 1 seguido por CMF el
día 2. Los ratones se monitorizaron diariamente en busca de
cualquier toxicidad del tratamiento y se midió la masa del tumor de
forma diaria o semanal (véase la Tabla 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la Tablas 12a y 12b, en
el estudio de 6 semanas se observó lo siguiente:
1). Los ratones que recibieron un régimen de
tratamiento que contenía AH (CMF/AH, AH seguido de CMF o AH solo)
mostró un aumento de la supervivencia en un 50% frente al grupo CMF
solo. El tiempo medio de supervivencia para el grupo de tratamiento
CMF fue de 40,4 días frente a 42 para el resto de grupos.
2). Los animales tratados con una combinación de
AH y CMF mostraron todos una ganancia de peso significativa (prueba
t, p<0,001) sobre los animales tratados con CMF solo o AH solo y
demostró un aumento de bienestar. (Véase la Figura 22).
3). El tiempo de duplicación de la masa del
tumor de los ratones tratados con salino (grupo control sin
tratamiento) fue significativamente inferior a los de otros grupos
de tratamiento (prueba t, p<0,001), pero no hubo una diferencia
estadísticamente significativa entre los otros grupos de tratamiento
(véase la Figura 23).
4). Existe una diferencia significativa (prueba
t, p = <0,001) entre los grupos de tratamiento con CMF y CMF/AH
respecto a los volúmenes finales de los tumores primarios, en el que
el CMF resultó en una reducción de la masa tumoral en 7/8 animales,
mientras que el CMF/AH redujo la masa del tumor primario en sólo 3/8
animales.
5). No se halló toxicidad en el tratamiento
cuando los ratones se trataron con AH \pm CMF, mientras que los
ratones tratados con CMF solo demostraron signos de fatiga,
conjuntivitis, salud general pobre.
Cuando la terapia CMF/AH o AH se administró en
el día 1 y 8 en un ciclo de 28 días, se observó lo siguiente: no
hubo una diferencia significativa en los tiempos de supervivencia
entre los grupos de tratamiento
1). No hubo una diferencia significativa en la
ganancia de peso entre los grupos de tratamiento.
2). El tumor primario de los ratones que
recibieron AH \pm CMF presentaron pequeñas áreas de necrosis y
formación de costras
3). En el tratamiento del tumor primario, CMF
como agente único no demostró una eficacia terapéutica sobre los
tratamientos con salino y AH. La adición de AH a CMF resultó en
tumores primarios significativamente más grandes (prueba t, p =
0,001).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se pueden extraer las siguientes conclusiones a
partir de este estudio:
1). La administración a largo plazo (6 meses) de
la terapia adyuvante de AH/CMF no muestra un aumento en la eficacia
terapéutica o una reducción en el tratamiento de los efectos
secundarios.
2). La administración a corto plazo (6 semanas)
de la terapia adyuvante de AH/CMF demuestra numerosas ventajas
sobre la administración de CMF como un tratamiento único.
3). Ganancia significativa de peso.
4). Aumento de un 50% en el número de animales
que completan el tratamiento
5). Abolición de los efectos secundarios como la
fatiga, conjuntivitis, pérdida de apetito
6). Los ratones que reciben AH no presentan
ningún signo de toxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Para investigar a fondo la naturaleza de la
interacción entre AH y los fármacos quimioterápicos, se utilizó la
espectroscopía por Resonancia Magnética Nuclear ^{1 h} (NMR). Se
obtuvo el óxido de Deuterio (^{2}H_{2}O (99,96%)) del Cambridge
Isotope Laboratories. El MTX se obtuvo de Faulding Pharmaceuticals y
el 5-FU y las soluciones de reserva de AH se
prepararon como se ha descrito anteriormente.
El espectro se registró a 298 K en un
espectrómetro Brüker DRX que funcionaba a 600 MHz con una unidad de
gradiente protegida. Los experimentos 2D se registraron en un modo
sensible a fases utilizando el incremento de fase proporcional al
tiempo para la detección de la cuadratura en la dimensión t_{1}
(Marion & Wüthrich, 1983). Los experimentos 2D incluyeron la
secuencia TOCSY utilizando una secuencia de bloqueo de espín
MLEV-17 (Bax & Davis, 1985) con un tiempo de
mezclado de 120 ms; espectro NOESY (Kumar et al., 1980) con
un tiempo de mezclado de 250 y 400 ms y ROESY con un tiempo de
mezclado de 250 ms. La temperatura de calibración de la sonda se
realizó por comparación con cambios químicos de etilenglicol. Todos
los cambios químicos (ppm) se referenciaron a la resonancia del
metilo de
4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfonato
(DSS, 0 ppm).
La supresión del disolvente de la señal de agua
para los experimentos NOESY, ROESY y TOCSY se logró utilizando una
secuencia WATERGATE modificada (Piotto et al., 1992) en la
que se aplicaron dos pulsos en gradiente de 1 ms en cada lado de un
pulso binomial 3-9-19. Los espectros
se adquirieron normalmente alrededor de 6024 Hz con 4096 puntos de
datos complejos en incrementos F_{2} y 512 en la dimensión
F_{1}, con 32 barridos por incremento para los experimentos TOCSY
y 80 barridos para los experimentos NOESY. Se detectó un lento
intercambio de protones NH al adquirir una serie de espectros de una
dimensión (1D), adquiridos sobre 16K puntos de datos y con
32
barridos.
barridos.
Los experimentos de difusión de RMN se
adquirieron en un espectrómetro Brüker AMX equipado con una unidad
de control de gradiente que funcionaba a 500 MHz. Todos los
experimentos se adquirieron con 16 o 64 barridos a 298 K sobre 16K
puntos de datos y 7575 Hz. Se utilizó una fuerza de gradiente de
15,44 G/cm para los experimentos de difusión. Cada experimento de
difusión se obtuvo de una serie de 12 espectros PFGLED en los que el
retraso (\tau= 20 ms, \Delta= 50 ms, T = 30 ms y T_{e} = 14
ms) y en los que la magnitud de G se mantuvo constante pero la
longitud del pulso del gradiente de campo (\delta) aumentó en
pasos de 1 ms desde 0,2 ms hasta 12,2 ms en el espectro final.
Todos los espectros se procesaron en una
estación de trabajo Silicon Graphics Indigo utilizando el programa
Xwinnmr (Bruker). Para los experimentos 2D la dimensión t_{1} fue
rellenada a cero para 2048 puntos de datos reales, y se aplicó un
cambio de fase de 90º a las funciones de la ventana de la campana
sinusoidal antes de la transformación Fourier.
Los experimentos de RMN se diseñaron para
monitorizar los cambios en el espectro ^{1h} RMN del MTX sobre la
adición de AH. Al monitorizar los cambios específicos en el espectro
del fármaco MTX, como la amplitud o movimiento de los picos, es
posible ver qué regiones de la molécula del fármaco, si las hay,
interaccionan con AH. La Figura 24 muestra el espectro ^{1 h} RMN
del MTX disuelto en H_{2}O. Este espectro identifica fácilmente
cada grupo de hidrógenos en el metotrexato.
El Metotrexato posee un número de grupos
funcionales que pueden interactuar potencialmente con la molécula
de hialuronano. Las porciones amina primarias en el anillo aromático
2,4-amino-pteridina del MTX pueden
formar una asociación iónica con los grupos carboxilo en la
molécula de hialuronano. Las interacciones de los enlaces de
hidrógeno entre los grupos amina sobre el Metotrexato y el grupo
hidroxilo sobre los anillos de carbohidrato del hialuronano son
otra posibilidad. Las interacciones hidrofóbicas son también
posibles entre los anillos aromáticos hidrofóbicos del MTX y los
parches hidrofóbicos del polímero plegado del hialuronano. Estas
interacciones están ilustradas en la Figura 25.
Para dirigir la cuestión de si existe una
interacción específica entre el Metotrexato y el AH, se diseñaron
experimentos de RMN para monitorizar los cambios en el espectro de
^{1\ h} RMN del MTX sobre la adición de AH. La Figura 26 muestra
el espectro de 600 MHz del ácido hialurónico a 600 MHz y 298 K.
La Figura 27 muestra el espectro de 600 MHz
^{1\ h} RMN del MTX solo y del MTX con adiciones crecientes de AH
(50 kDa) de 2 nmol, 10 nmol, 20 nmol y 80 nmol a 298 K. Estos
espectros muestran que no hay cambios en la posición de cambio
químico en ninguno de los picos del Metotrexato. Aparecieron picos
adicionales en el espectro a medida que se añadían cantidades
sucesivas de AH, completamente consistentes con resonancias debidas
al ácido hialurónico. Ya que no hay cambios en la posición de cambio
químico en ninguna de las resonancias del MTX en estos espectros,
parece que no existe una región específica en la molécula de MTX que
interactúe con la molécula de AH.
Una forma para determinar si existe una fuerte
interacción entre los grupos NH en el MTX y los grupos ácidos sobre
el AH es medir la tasa de intercambio de los protones NH. Estos
hidrógenos son lábiles y capaces de intercambiar rápidamente con el
volumen del solvente. No obstante si están involucrados en una
fuerte interacción con la molécula de AH entonces podrán estar
protegidos del volumen del solvente y su tasa de intercambio
disminuirá. En este experimento los hidrógenos de la amina del MTX
se intercambian con el deuterio del D_{2}O y la tasa de
intercambio proporcionará una estima cualitativa de la fuerza de la
interacción entre el MTX y el AH. El análisis de ^{1 h} RMN de
una solución preparada mediante la adición de óxido de deuterio a
una solución de MTX y AH disuelta en 0,5% p/v de Na_{2}CO_{3}
(pH 9) mostró que en 4 minutos todos los hidrógenos de la amina del
MTX se habían intercambiado con el deuterio en la muestra. Este
resultado sugiere que los hidrógenos de la amina del MTX no están
protegidos del intercambio con el volumen del solvente.
La razón por la que los picos de hidrógeno de la
amina desaparecen del espectro de ^{1\ h} RMN es debido a que el
deuterio posee una frecuencia de resonancia muy diferente a la del
hidrógeno y por lo tanto no aparecen en el espectro ^{1\ h} RMN.
Se utilizaron por rutina experimentos análogos para probar si la
estructura de hidrógenos de la amida en el polipéptido y las
proteínas está protegida del solvente. Cuando los hidrógenos de la
amida de las proteínas están involucrados en las disposiciones de
los enlaces de hidrógeno que estabilizan las estructuras
secundarias de hélice \alpha y de lámina \beta la tasa de
intercambio de estos hidrógenos disminuye a menudo de forma
dramática. En algunos casos las señales de los hidrógenos
involucrados en esta interacción pueden persistir durante horas,
días o incluso meses dependiendo de la fuerza de la interacción y
de su protección del volumen del solvente (por ejemplo en un núcleo
hidrofóbico de una proteína).
Los experimentos de difusión se realizaron con
MTX solo y en presencia de AH. Estos experimentos pueden indicar si
la difusión del MTX atrapado está retardada por la presencia de la
red de AH. Los resultados de los experimentos de difusión de ^{1\
h} RMN por duplicado indicó que para la gran mayoría de moléculas
de MTX no hay un retraso en la tasa de difusión de MTX ya que hubo
una diferencia negligible entre los coeficientes de difusión de MTX
y MTX en presencia de AH. Este hallazgo puede sugerir que en la red
de AH existen grandes cavidades de solvente entre las moléculas de
AH que permiten al fármaco difundir libremente en este medio.
Los experimentos de difusión sugieren que el
volumen de las moléculas de MTX difunden libremente a través de la
red de AH. Este escenario no tiene en consideración si una pequeña
proporción (digamos un 5% de la moléculas de MTX) están
interactuando débilmente de forma no específica con las moléculas de
AH.
De los experimentos anteriores queda claro que
el MTX no interactúa fuertemente con el AH y que la interacción, si
la hay, no es específica. Una forma de probar los ligandos unidos
débilmente (10^{-3}-10^{-7} M) para la unión no
específica es llevar a cabo experimentos NOESY de transferencia. En
estos experimentos 2D aparecerán picos cruzados si el ligando se
une débilmente a la macromolécula de AH. Un espectro NOESY de
transferencia de MTX/AH no mostró picos cruzados debido a la unión
del MTX al AH que sugiere una interacción negligible entre el MTX y
el AH.
Como forma de comprobación de si una pequeña
proporción (digamos el 5% de la moléculas de MTX) están
interaccionando débilmente de forma no específica con las moléculas
de AH. Los picos en un espectro ROESY mostrarán si hay incluso una
pequeña proporción de moléculas de MTX en intercambio químico entre
los estados libres y unidos al AH. Un espectro ROESY de 250 ms no
muestra ningún pico de intercambio químico que sugiera que no existe
ni siquiera un pequeño porcentaje de MTX que interactúe con el
AH.
La Figura 28 muestra el espectro de 600 MHz
^{1\ h} RMN de 5-FU y 5-FU (1,25
mg/ml, 1,6 mg/ml y 6,4 mg/ml) con AH (750 kDa, 3 mg/ml) entre 70,0 y
8,5 ppm, a 298 K. Se realizaron los experimentos iniciales para
investigar si existe una interacción con ácido hialurónico de 50
kDa. No se observó interacción entre el 5-FU y el
AH (datos no mostrados). Para investigar si una interacción fue
dependiente del peso molecular del AH utilizado, se realizaron más
experimentos de titulación con hialuronano de 750 kDa. Las
concentraciones de 5-FU utilizado son equivalentes
a la de la terapia adyuvante AH/5-FU de los estudios
de formulación del Kings College de Londres que se realizaron en la
preparación para los estudios clínicos suecos. Estas concentraciones
se diseñaron para simular las concentraciones utilizadas al mezclar
AH/5-FU, en la bolsa de infusión y también la
concentración de AH/5-FU estimada en plasma. Por
desgracia, las resonancias de la amina del
5-fluorouracilo se intercambian rápidamente con el
agua del volumen del solvente al pH (8,8 a 9,1) de estas
formulaciones y por lo tanto estas resonancias no son visibles en
el espectro del 5-FU. Solo una resonancia de CH es
visible en el espectro de 5-FU. Disminuir el pH de
estas soluciones no es factible ya que el 5-FU
precipitaría de la solución a valores de pH inferiores. Estos
espectros muestran que no hay cambio en la posición de cambio
químico del pico CH del 5-FU. Estos espectros
indican que el 5-FU no parece interactuar con la
molécula de AH.
Se realizaron los experimentos de difusión con
5-FU solo y en presencia del AH. Estos resultados de
los experimentos de difusión duplicados de ^{1\ h} RMN mostrados
en la Tabla 13 indican que la difusión de 5-FU no
está retardada por la presencia de hialuronano porque hay una
diferencia negligible entre los coeficientes de difusión de
5-FU solo y 5-FU en presencia de
AH.
Los experimentos 2D, NOESY y ROESY: los
experimentos 2D sobre 5-FU no son posibles ya que
sólo una resonancia es visible en su espectro ^{1\ h} RMN.
El análisis por RMN del MTX y
5-FU en presencia de hialuronano utilizando
experimentos de titulación, experimentos de intercambio de
deuterio, experimentos de difusión y experimentos de NOESY
transferido con MTX, y experimentos de titulación y de difusión con
5-FU han mostrado que no se puede detectar
interacción entre los fármacos quimioterápicos y el hialuronano.
Estos resultados sugieren que la inclusión de los fármacos
quimioterápicos en la red de hialuronano es suficiente para
aumentar la cantidad de fármaco liberado al lugar de la patología.
Estos resultados están en total acuerdo con estudios previos que
utilizaron cromatografía de filtración en gel, diálisis de
equilibrio y espectroscopía CD de la interacción molecular entre
hialuronano y MTX y 5-FU que tampoco detectaron una
interacción.
Adams J D, Flora K P,
Goldspiel B R, Wilson J W, Finley R,
Arbuck S G y Finley R, 1993. J. Natl.
Cancer. Inst. Monographs 15:23-27.
Akima, K., Ho, H., Iwata,
Y., Matsuo, K., Watari, N., Yanagi, M.,
Hagi, H., Oshima, K., Yagita, A., Atomi,
Y & Tatekawa, I. (1996) Evaluation of antitumor
activities of hyaluronate binding antitumor drugs: Synthesis,
characterization and anti-tumor activity. Jap. J.
Drug Targeting 4, 1-8.
Arch R, Wirth K, Hofmann M,
Ponta H, Matzku S, Herrlich P y Zoller
M, 1992. Science
257(5070):682-685.
Bartolazzi A, Peach R,
Aruffo A y Stamenkovic I, 1994. J Exp
Med 180:53-66. Bax, A. &
Davis, D. G. (1985) MLEV-17 based
two-dimensional homo-nuclear
magnetization transfer spectroscopy. J. Magn. Reson. 65,
355-360.
Bissery M, Guenard D y
Lavelle F, 1991. Cancer Res
51:4845-4852.
Bisset D, Setanioans A,
Cassidy J, Graham M A y Kerr D J, 1993.
Cancer Res 53:523-527.
Bonadonna G (1976) N Engl J Med
Med 294: p. 405.
Bonadonna G (1981) N Engl J Med
Med 304: p. 10.
Bonadonna G (1988) Handbook of
Medical Oncology, 3rd edition. Chicago, Year Book Med Publ,
p. 1075.
Cailleau, R. (1974) Breast cancer
cell lines J NatI Cancer Inst 55: pp
661-674
Carter D, 1990. Interpretación of
Breast Biopsies, Second Edition Raven Press, New York.
Coradini, D., Pellizzaro, C.,
Miglierini, G., Daidone, M. G. y Perbellini, A.
(1999) Hyaluronic Acid As Drug Delivery For Sodium Butyrate:
Improvement Of The Anti-Proliferative Activity On A
Breast-Cancer Cell Line. Int. J. Cancer.
81:pp.411-416.
Culty M, Nguyen A H y
Underhill C B, 1992. J Cell Biol
116(4):1055-1062.
Culty, M., Shizari, M.,
Erik, W., Thompson. y Underhill, C. B.
(1994) Binding and degradation of hyaluronan by human breast
cancer cell lines expressing different forms of CD44: Correlation
with invasive potential. Journal of Cellular Physiology 160:
pp 275-286.
Dye D y Watkins J, 1980.
Br. Med. J 280:1353. Endicott J A et al,
1989. Annual Reviews in Biochemistry 58:
127-171.
Eriksson, S., Fraser, J R E.,
Laurent, T C., Perioft, H. y Smedsrod, B.
(1983) Endothelia cells are a site of uptake and degradation
of hyaluronic acid in the liver. Exp Cell Res. 144: pp.
223-228.
Fraser, J R E., Appelgren, L E. y
Laurent, T C. (1983) Tissue uptake of circulating
hyaluronic acid. A whole body autoradiographic study. Cell
Tissue Res 233(2): pp285-293.
Fraser, J R E., Kimpton, W G.,
Laurent, T C., Cahill, R N P. y Vakais, N.
(1988) Uptake and degradation of hyaluronan in lymphatic
tissue. Biochem. J. 256: pp. 153-158.
Friedrichs G, Folker H J,
Arlt P A y Gunthert U, 1995. The Lancet
345:1237-1238. Günthert U, 1993.
Curr Topics Microbiol Immunol 184:47-63.
Gustafson S, Björkman T,
Forsberg N, Lind T, Wikström T y Lidholt
K, (1995a). Accessible hyaluronan receptors identical to
ICAM-1 in mouse mast tumor cells. Glycoconjugate
J. 12, 350-355.
Gustafon, S., Björkman, T.,
Forsberg, N., McCourt, P., Wikström, T.,
Lilja, K., Tinner, B., Fuxe, K.,
Westlin, J.-E., Lidholt, K. Lind, T.,
Westerberg, G., Bergstrom, M, Langstrom, B., de
la Torre, M., Bergh, J., Hagberg, H.,
Glimelius, B., Lindahl, U., & Laurent, T.
C. (1995b) studies on receptors for hyaluronan and the
turnover of radioactively labelled hyaluronan in mice and rats.
Royal Soc. Med. Round Table Series nº 36,
5-7.
Hall, C L., Yang, B., Yang,
X., Zhang, S., Turley, M., Samuel, S.,
Lange, L A., Wang, C., Curpen, G D.,
Savani, R C., Greenberg, A H., Turley, E A.
(1995). Overexpression of the hyaluronan receptor RHAMM is
transforming and is also required for H-ras
transformation. Cell 82: pp 19-28.
Hardwick C, Hoare K, Owens
R, Hohn H P, Hook M, Moore D, Cripps V,
Austen L, Nance D M, Turley E A, 1992.
J Cell Biol 117(6):pp1343-1350.
Harris, J R., Lippman, M E.,
Veronesi, U. y Willett, W. (1992) Medical
Progress in Breast cancer. The New England Journal of
Medicine. 327: pp. 473-480.
Hudecz, F., Clegg, J A.,
Kajtar, J., Embleton, M J., Pimm, M V.,
Szekerke, M. y Baldwin, R W. (1993) Influence
of carrier on biodistribution and in vitro cytotoxicity of
Methotrexate-branched polypeptide conjugates.
Bioconjugate Chem 4: pp 25-33.
Inaba, M., Kobayashi, T.,
Tashiro, T. y Sakurai, Y. (1988).
Pharmacokinetic approach to rational therapeutic doses for human
tumor-bearing nude mice. Jpn J Cancer Res
79(4): pp509-516.
Klein E. S., He, W:,
Shmizu, S., Ascula, S., & Falk, R. E.
(1994). Hyaluronic acid enhances tritiated fluorouracil
uptake in experimental cancer. Royal Soc Med Round Table
series no33: 11-15.
Kumar, A., Ernst, R. R. &
Wuthrich, K. (1980) Studies of
J-Connectivities and selective
^{1}H-^{1 h} Overhauser effect in H_{2}O
solutions of macromolecules by two-dimensional NMR
experiments. Biochem. Biophys. Res. Commun. 96 (3),
1156-1163.
Lamszus, K., Jin, L.,
Fuchs, A., Shi, E., Chowdhury, S., Yao,
Y., Polverni, P J., Laterra, J., Goldberg, I D.
and Rosen, E M. (1997) Scatter factor stimulates
tumor growth and tumor angiogenesis in human breast cancers in the
mammary fat pads of nude mice. Lab Inv 76(3): pp
339-353.
Laurent, T. C, 1970. In: Chemistry
y Molecular Biology of the Intercellular Matrix. (Editor: Balazs,
E.A.) Academic Press, New York. 2: pp.
703-732.
Laurent, T C., Fraser, J. R. E.,
Pertoft, H. y Smedsrod, B. (1986) Binding of
hyaluronate and chondroitin sulphate to liver endothelial cells.
Biochem J. 234: pp.653-658.
Lorenz W, Riemann H J,
Schmal A, Schult H, Lang S, Ohman C,
Weber D, Kapp B, Luben L y Doenicke A,
1977. Agents Actions, 7:63-67.
Marion, D. & Wuthrich, K.
(1983). Application of phase sensitive
two-dimensional correlated spectroscopy (COSY) for
measurements of ^{1}H-^{1 h}
spin-spin coupling constants in proteins.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 113,
967-974.
Martindale, W. (1993) The extra
pharmacopoeia 30th Ed (editor: Reynolds, JEF y Parfilt, K.)
Pharmaceutical Press, London.
Mathew A E, Mejillano M R,
Nath J P, Himes R H y Stella V J, 1992.
J. Med. Chem 35:145-151.
McCourt, P A G., EK, B.,
Forsberg, N. y Gustafson, S. (1994)
Intercellular adhesion molecule-1 is a cell surface
receptor for hyaluronan. J Biol Chem.
269:pp.30081-30084.
McEvoy, 1988. American Hospital
Formulary Service-Drug Information 88.
Bethesda, M D, American Society of Hospital Pharmacists,
Inc. 2222.
Mikelsaar, R H. y Scott, J E.
(1994) Molecular modelling of secondary and tertiary
structures of hyaluronan, compared con electron microscopy and NMR
data. Possible sheets and tubular structures in aqueous solution.
Glycoconjugate J 11: pp 65-71.
MIMS Medical Network (1996)
http://www.medical.netau/mims-get5-FU/711
Nelson, J A. y Falk, R E.
(1994) Anticancer research. Int J Cancer Res
Treat.
Nikaido N, 1993. Science
264:382-388. Ogawa Y, Hirakawa K,
Nakata B, Fujihara T, Sawada T, Kato Y,
Yoshikawa K y Sowa M, 1998. Clin Cancer
Res 4(1):31-36.
Piotto, M., Saudek, V. &
Sklenar, V. (1992) Gradient-tailored
excitation for single-quantum NMR spectroscopy of
aqueous solutions. J. Biomol. NMR 2,
661-665.
Piper, A A. y Fox, M.
(1982) Biochemical basis for the differential sensitivity of
human T- and B-Lymphocyte lines to
5-fluorouracil. Cancer Research 42: pp
3753-3760.
Rownisky E K, Cazenave L A y
Donehower R C, 1990. J. Natl. Cancer. Inst
82:1247-1259.
Schabel, F M. (1975) Concepts for
systemic treatment of micrometastases. Cancer 35: pp.
15-24.
Scott, J E., Heatley, F. y
Hull, W E. (1989) Secondary structure of hyaluronate
in solution. A H-nmr investigation at 300 y 500 MHz
in (2H6)dimethyl sulphoxide solution. Biochem J. 220:
pp 197-205.
Shackney, S E., McCormack, G W. y
Cuchural, G J. (1978) Growth rate patterns of solid
tumors and their relation to responsiveness to therapy: An
analytical review. Annals of Internal Medicine. 89: pp
107-121.
Shibamoto, Y., Murata, R.,
Miyauchi, S., Hirohashi, M., Takagi, T.,
Sasai, K., Shibata, T., Oya, N. y
Takahashi M. (1996) Combined effect of clininically
relevant doses of emitefur, a new 5-fluorouracil
derivative, and radiation in murine tumors. Brit. J. Cancer.
74: pp 1709-1713.
Singh, M., Ghose, T.,
Kralovec, J., Blair, A H. y Belitsky, P.
(1991) Inhibition of human renal cancer by monoclonal
anti-body-linked Methotrexate in an
ascites
\hbox{tumor model. Cancer Immunol Immunotherapy
32 (50): pp 331-334.}
Stamenkovic I, Aruffo A,
Amiot M y Seed B, 1991. EMBO J
10:343-348.
Underhill, C B., Nguyen, H A.,
Shizari, M. y Culty, M. (1993) CD44 positive
macrophages take up hyaluronan during lung development.
Developmental Biology 155 (2): pp
324-336.
Vyas D M, Wong H, Crosswell
A R, Casazza A M, Knipe J O y Mamber S W,
1993. Bioorganic. Med. Chem. Lett.
3:1357-1360. Wang C, Thor A D,
Moore D H, Zhao Y, Kerschmann R, Stern
R, Watson P H y Turley E A, 1998. Clin
Cancer Res 4(3):567-76.
Wang, C., Zhang, S. y
Turley, E A. (1996) The role of hyaluronan and
hyaluronan receptors in breast cancer cell invasion, motility and
proliferation. In: Fourth International Workshop on Hyaluronan in
Drug Delivery. (Editor: Willoughby, D.A) Roy. Soc. Med.
Press. pp 37-53.
Wani M C, Taylor H L y Wall
M E, 1971. J. Am. Chem. Soc
93:2325-2327.
Waugh W, Trissel L y Stella
V J, 1991. Am. J. Hosp. Pharm 48:
1520-1524.
Weiss R B, Donehomer R C,
Weirnik P H, Ohnuma T, Gralla R J,
Leyland-Jones B, 1990. Br. J. Clin.
Oncol 8:1263-1268.
Claims (17)
1. El uso de hialuronano en la elaboración de un
medicamento para utilizar en combinación o coadministrado con un
fármaco para el tratamiento de un cáncer que es resistente a dicho
fármaco.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que dicho fármaco es un agente citotóxico o antineoplásico.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que dicho hialuronano posee un peso
molecular modal de 890,000 Da.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en
el que dicho hialuronano posee una polidispersión de 1,78.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que dicho hialuronano posee un peso
molecular modal de 750.000 Da.
6. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en la que el agente citotóxico y/o
antineoplásico se selecciona del grupo que consiste en metotrexato,
paclitaxel, 5-fluorouracilo y ciclofosfamida o
combinaciones de los mismos.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
la que dicho agente citotóxico y/o antineoplásico es metotrexato o
5-fluorouracilo.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
la que dicho agente citotóxico y/o antineoplásico es metotrexato y
dicho hialuronano posee un peso molecular modal de 890.000 Da.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
la que dicho agente citotóxico es paclitaxel y dicho hialuronano
posee un peso molecular modal de 890.000 Da.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 2,
en la que dicho agente citotóxico es 5-fluorouracilo
y dicho hialuronano posee un peso molecular modal de 750.000
Da.
11. Una composición farmacéutica que comprende
un hialuronano que posee un peso molecular modal de 890.000 Da y un
agente citotóxico o antineoplásico.
12. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 11, en la que dicho agente citotóxico y/o
antineoplásico se selecciona del grupo que consiste en metotrexato,
paclitaxel, 5-fluorouracilo y ciclofosfamida o
combinaciones de los mismos.
13. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 11, en la que dicho agente citotóxico y/o
antineoplásico es metotrexato.
14. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 11, en la que dicho agente citotóxico y/o
antineoplásico es paclitaxel.
15. Una composición farmacéutica que comprende
un hialuronano que posee un peso molecular modal de 750.000 Da y un
agente citotóxico o antineoplásico.
16. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 15, en la que dicho agente citotóxico y/o
antineoplásico se selecciona del grupo que consiste en metotrexato,
paclitaxel, 5-fluorouracilo y ciclofosfamida o
combinaciones de los mismos.
17. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 15, en la que dicho agente citotóxico y/o
antineoplásico es 5-fluorouracilo.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPP8131A AUPP813199A0 (en) | 1999-01-13 | 1999-01-13 | A composition and method for the enhancement of the efficacy of drugs |
| AUPP8131 | 1999-01-13 | ||
| AUPQ3938A AUPQ393899A0 (en) | 1999-11-09 | 1999-11-09 | A composition and method for the enhancement of the efficacy of drugs |
| AUPQ3938 | 1999-11-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2295005T3 true ES2295005T3 (es) | 2008-04-16 |
Family
ID=25645970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00902481T Expired - Lifetime ES2295005T3 (es) | 1999-01-13 | 2000-01-06 | Uso de hialuronano para la preparacion de un medicamento para la mejora de la eficacia de farmacos citotoxicos. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8741970B2 (es) |
| EP (1) | EP1140198B1 (es) |
| JP (2) | JP4790911B2 (es) |
| KR (1) | KR20010113642A (es) |
| CN (1) | CN100374163C (es) |
| AT (1) | ATE376824T1 (es) |
| CA (1) | CA2370003C (es) |
| DE (1) | DE60036915T2 (es) |
| DK (1) | DK1140198T3 (es) |
| ES (1) | ES2295005T3 (es) |
| HK (1) | HK1041209A1 (es) |
| NZ (1) | NZ512676A (es) |
| TW (1) | TWI284042B (es) |
| WO (1) | WO2000041730A1 (es) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60036915T2 (de) | 1999-01-13 | 2008-08-07 | Alchemia Oncology Pty Ltd., Hawthorn | Verwendung von hyaluronan zur herstellung eines medikaments zur erhöhung der wirksamkeit von zytotoxischen arzneimitteln |
| US7582311B1 (en) * | 1999-10-15 | 2009-09-01 | Genentech, Inc. | Injection vehicle for polymer-based formulations |
| US6593308B2 (en) * | 1999-12-03 | 2003-07-15 | The Regents Of The University Of California | Targeted drug delivery with a hyaluronan ligand |
| EP1250152B1 (en) | 1999-12-28 | 2013-05-15 | Bioniche Urology IP Inc. | Synergistic composition containing hyaluronic acid in the treatment of cancer |
| US9066919B2 (en) * | 2000-07-14 | 2015-06-30 | Alchemia Oncology Pty Limited | Hyaluronan as a chemo-sensitizer in the treatment of cancer |
| AUPQ879500A0 (en) * | 2000-07-14 | 2000-08-10 | Meditech Research Limited | Hyaluronan as cytotoxic agent, drug presensitizer and chemo-sensitizer in the treatment of disease |
| DE60219189T2 (de) * | 2001-07-20 | 2008-01-03 | Iomed, Inc., Salt Lake City | Iontophoretische okularvorrichtung zur abgabe von medikamenten auf methotrexat-basis und deren verwendung zur behandlung von neoplastischen, angiogenen, fibroplastischen und/oder immunsuppressiven augenunregelmässigkeiten |
| US20050042303A1 (en) * | 2001-08-27 | 2005-02-24 | Brown Tracey Jean | Therapeutic protocols |
| AU2002325635C1 (en) * | 2001-08-27 | 2008-09-25 | Alchemia Oncology Pty Limited | Improved therapeutic protocols |
| KR20030066927A (ko) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | 구자영 | 쿠르쿠민과 5-프루오로유라실로 이루어진 항암제 및 이항암제의 용도 |
| WO2004003545A1 (en) | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Tufts University | Methods and compositions for inhibition of multi-drug resistance by hyaluronan oligomers |
| ITPD20020271A1 (it) | 2002-10-18 | 2004-04-19 | Fidia Farmaceutici | Composti chimico-farmaceutici costituiti da derivati dei taxani legati covalentemente all'acido ialuronico o ai suoi derivati. |
| AU2003291872A1 (en) | 2002-12-04 | 2004-06-23 | Inrs (Institut National De Recherche Scientifique) | An exopolysaccharides delivery system for active molecules |
| NZ621449A (en) | 2003-05-30 | 2015-07-31 | Genentech Inc | Treatment with anti-vegf antibodies |
| AU2006274509B2 (en) * | 2005-07-27 | 2012-01-19 | Alchemia Oncology Pty Limited | Therapeutic protocols using hyaluronan |
| CN101287475B (zh) * | 2005-09-07 | 2012-11-14 | 阿尔卡米亚肿瘤学股份有限公司 | 包含透明质酸和治疗抗体的治疗组合物以及制药用途 |
| KR20110056042A (ko) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | 주식회사유한양행 | 종양세포 표적지향을 위한 나노 입자 및 이의 제조방법 |
| WO2017120504A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | Durfee Paul N | Osteotropic nanoparticles for prevention or treatment of bone metastases |
| WO2018160865A1 (en) * | 2017-03-01 | 2018-09-07 | Charles Jeffrey Brinker | Active targeting of cells by monosized protocells |
| WO2020068798A1 (en) | 2018-09-24 | 2020-04-02 | Guo Jimin | Living mammalian cells modified with functional modular nanoparticles |
| US12208164B2 (en) | 2019-02-28 | 2025-01-28 | Unm Rainforest Innovations | Modular metal-organic polyhedra superassembly compositions |
Family Cites Families (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA612307A (en) | 1961-01-10 | International Business Machines Corporation | Hydraulic drive tape handling system | |
| US4141973A (en) | 1975-10-17 | 1979-02-27 | Biotrics, Inc. | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof |
| US4256108A (en) | 1977-04-07 | 1981-03-17 | Alza Corporation | Microporous-semipermeable laminated osmotic system |
| US4160452A (en) | 1977-04-07 | 1979-07-10 | Alza Corporation | Osmotic system having laminated wall comprising semipermeable lamina and microporous lamina |
| US4265874A (en) | 1980-04-25 | 1981-05-05 | Alza Corporation | Method of delivering drug with aid of effervescent activity generated in environment of use |
| US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
| IT1229075B (it) | 1985-04-05 | 1991-07-17 | Fidia Farmaceutici | Medicamenti per uso topico, ottenuti tramite l'impiego dell'acido ialuronico |
| US5166331A (en) | 1983-10-10 | 1992-11-24 | Fidia, S.P.A. | Hyaluronics acid fractions, methods for the preparation thereof, and pharmaceutical compositions containing same |
| IN163192B (es) | 1983-10-11 | 1988-08-20 | Fidia Spa | |
| JPS6117A (ja) | 1984-06-11 | 1986-01-06 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | ムコ多糖系癌転移抑制剤 |
| CA1227427A (en) * | 1984-08-16 | 1987-09-29 | Albert Landsberger | Therapeutic agent for the use in cancer treatment |
| US5532341A (en) | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
| US4851521A (en) | 1985-07-08 | 1989-07-25 | Fidia, S.P.A. | Esters of hyaluronic acid |
| US5202431A (en) | 1985-07-08 | 1993-04-13 | Fidia, S.P.A. | Partial esters of hyaluronic acid |
| US4665107A (en) | 1986-03-21 | 1987-05-12 | Koh-I-Noor Rapidograph, Inc. | Pigment encapsulated latex aqueous colorant dispersions |
| IT1198449B (it) | 1986-10-13 | 1988-12-21 | F I D I Farmaceutici Italiani | Esteri di alcoli polivalenti di acido ialuronico |
| IT1219587B (it) | 1988-05-13 | 1990-05-18 | Fidia Farmaceutici | Polisaccaridi carbossiilici autoreticolati |
| US5128450A (en) | 1989-06-30 | 1992-07-07 | Urdal David L | Nonglycosylated human interleukin-3 analog proteins |
| CA1340994C (en) * | 1989-09-21 | 2000-05-16 | Rudolf Edgar Dr. Falk | Treatment of conditions and disease |
| US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| US5095037B1 (en) | 1989-12-21 | 1995-12-19 | Nissho Kk | Combined anti-inflammatory agent |
| CA2061703C (en) | 1992-02-20 | 2002-07-02 | Rudolf E. Falk | Formulations containing hyaluronic acid |
| CA2061566C (en) | 1992-02-20 | 2002-07-09 | Rudolf E. Falk | Treatment of disease employing hyaluronic acid and nsaids |
| US5733891A (en) * | 1990-10-18 | 1998-03-31 | Shiseido Co., Ltd. | Compound for medicinal ingredient and hyaluronic acid and process for producing the same |
| US5416071A (en) | 1991-03-12 | 1995-05-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Water-soluble composition for sustained-release containing epo and hyaluronic acid |
| NZ241954A (en) | 1991-03-15 | 1994-01-26 | Amgen Inc | Compositions of g-csf for pulmonary administration. |
| WO1998017320A1 (en) * | 1991-07-03 | 1998-04-30 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Use of hyaluronan in gene therapy |
| US5977088A (en) | 1991-07-03 | 1999-11-02 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Formulations containing hyaluronic acid |
| CA2122519C (en) * | 1994-04-29 | 2001-02-20 | Rudolf Edgar Dr. Falk | Cancer treatment and metastasis prevention |
| CA2076465C (en) | 1992-03-25 | 2002-11-26 | Ravi V. J. Chari | Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065 |
| CA2153661A1 (en) | 1993-01-12 | 1994-07-21 | Anthony George Gristina | Methods and compositions for the direct concentrated delivery of passive immunity |
| CA2087621C (en) | 1993-01-18 | 1996-08-20 | Albin L. Vazza | Livestock feed from potato waste |
| CA2089621A1 (en) * | 1993-02-16 | 1994-08-17 | Rudolf Edgar Falk | Formulations containing hyaluronic acid |
| CA2094203A1 (en) | 1993-04-16 | 1994-10-17 | Derek A. Willoughby | Inhibition of angiogenesis |
| US5847002A (en) | 1993-04-16 | 1998-12-08 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Compositions, for inhibition, control and regression of angiogenesis, containing hyaluronic acid and NSAID |
| US5744155A (en) | 1993-08-13 | 1998-04-28 | Friedman; Doron | Bioadhesive emulsion preparations for enhanced drug delivery |
| ITPD940054A1 (it) | 1994-03-23 | 1995-09-23 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Polisaccaridi solfatati |
| AU2479695A (en) | 1994-05-09 | 1995-11-29 | Hadasit Medical Research Services & Development Company Ltd | Prevention of tumor metastasis |
| EP0778776A1 (en) * | 1994-08-30 | 1997-06-18 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Hyaluronic acid and derivatives for modulation of cellular activity |
| CA2232000A1 (en) | 1995-09-14 | 1997-03-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Insulin-like growth factor binding protein 3 (igf-bp3) in treatment of p53-related tumors |
| US5968972A (en) | 1995-10-26 | 1999-10-19 | Baker Norton Pharmaceuticals, Inc. | Method for increasing the oral bioactivity of pharmaceutical agents |
| HUP9901935A3 (en) | 1995-12-01 | 2001-04-28 | Jagotec Ag | Dosage kit for targeting of dosages of medicine and therapeutic agents and other glycosaminoglycans (gags) |
| US5776925A (en) | 1996-01-25 | 1998-07-07 | Pharmacyclics, Inc. | Methods for cancer chemosensitization |
| DE69700887T2 (de) | 1996-01-31 | 2000-06-29 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Isoprenderivate |
| AUPN814496A0 (en) | 1996-02-19 | 1996-03-14 | Monash University | Dermal penetration enhancer |
| KR100236771B1 (ko) | 1997-04-01 | 2000-02-01 | 성재갑 | 히아루론산을 이용한 약물의 서방성 미세입자 제형 |
| CA2175282A1 (en) | 1996-04-29 | 1997-10-30 | Rudolf Edgar Falk | Use of forms of hyaluronic acid (ha) for the treatment of cancer |
| CA2189916C (en) | 1996-11-08 | 2001-01-16 | Parkash S. Gill | A new regime for paclitaxel in kaposi's sarcoma patients |
| IT1286510B1 (it) * | 1996-11-29 | 1998-07-15 | Cooperativa Centro Ricerche Po | Esteri butirrici ad attivita' antiproliferativa e composizioni farmaceutiche che li contengono |
| EP0891775A4 (en) | 1996-12-27 | 2002-07-24 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | MEDICINE FOR URBAN BLADDER DISORDERS |
| ATE229038T1 (de) | 1997-04-04 | 2002-12-15 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | N-sulfatierte hyaluronsäureverbindungen, ihre derivate und verfahren zu ihrer herstellung |
| CA2208924A1 (en) * | 1997-07-09 | 1999-01-09 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Sparing paclitaxel by the use of hyaluronan |
| US6087350A (en) | 1997-08-29 | 2000-07-11 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Use of pretreatment chemicals to enhance efficacy of cytotoxic agents |
| GB9727524D0 (en) | 1997-12-31 | 1998-02-25 | Pharmacia & Upjohn Spa | Synergistic antitumor composition containing a biologically active ureido compound |
| US20020015724A1 (en) | 1998-08-10 | 2002-02-07 | Chunlin Yang | Collagen type i and type iii hemostatic compositions for use as a vascular sealant and wound dressing |
| EP1117835A4 (en) | 1998-10-02 | 2005-03-09 | Genzyme Corp | PREVENTION OF ADHERENCES |
| IT1303735B1 (it) | 1998-11-11 | 2001-02-23 | Falorni Italia Farmaceutici S | Acidi ialuronici reticolati e loro usi medici. |
| DE60036915T2 (de) | 1999-01-13 | 2008-08-07 | Alchemia Oncology Pty Ltd., Hawthorn | Verwendung von hyaluronan zur herstellung eines medikaments zur erhöhung der wirksamkeit von zytotoxischen arzneimitteln |
| EP1044977B1 (en) | 1999-03-09 | 2002-05-02 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. | Camptothecin derivatives having antitumor activity |
| IT1306643B1 (it) | 1999-04-08 | 2001-10-02 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Processo per la preparazione dei composti autoreticolati dell'acidoialuronico e dei suoi derivati ottenibili mediante la tecnica |
| US7582311B1 (en) | 1999-10-15 | 2009-09-01 | Genentech, Inc. | Injection vehicle for polymer-based formulations |
| SE9904121D0 (sv) | 1999-11-15 | 1999-11-15 | Gustaf Jederstroem | Hydrophobe biomolecular structure |
| EP1250152B1 (en) | 1999-12-28 | 2013-05-15 | Bioniche Urology IP Inc. | Synergistic composition containing hyaluronic acid in the treatment of cancer |
| US6749865B2 (en) | 2000-02-15 | 2004-06-15 | Genzyme Corporation | Modification of biopolymers for improved drug delivery |
| US9066919B2 (en) | 2000-07-14 | 2015-06-30 | Alchemia Oncology Pty Limited | Hyaluronan as a chemo-sensitizer in the treatment of cancer |
| AUPQ879500A0 (en) | 2000-07-14 | 2000-08-10 | Meditech Research Limited | Hyaluronan as cytotoxic agent, drug presensitizer and chemo-sensitizer in the treatment of disease |
| EP1368309B2 (en) | 2001-02-22 | 2014-10-01 | Anika Therapeutics Inc. | Thiol-modified hyaluronan |
| US20050042303A1 (en) | 2001-08-27 | 2005-02-24 | Brown Tracey Jean | Therapeutic protocols |
| EP1480656A4 (en) | 2002-02-15 | 2007-07-18 | Res Dev Foundation | ADENOVIRAL TRANDUCTION INDUCED BY HYALURONIC ACID |
| JP2004262777A (ja) | 2003-02-27 | 2004-09-24 | Shiseido Co Ltd | アセチル化ヒアルロン酸含有眼用医薬組成物 |
| US7183381B2 (en) | 2004-10-26 | 2007-02-27 | Agennix, Inc. | Composition of lactoferrin related peptides and uses thereof |
| KR100754667B1 (ko) | 2005-04-08 | 2007-09-03 | 한미약품 주식회사 | 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물 |
| AU2006274509B2 (en) | 2005-07-27 | 2012-01-19 | Alchemia Oncology Pty Limited | Therapeutic protocols using hyaluronan |
| CN101287475B (zh) | 2005-09-07 | 2012-11-14 | 阿尔卡米亚肿瘤学股份有限公司 | 包含透明质酸和治疗抗体的治疗组合物以及制药用途 |
-
2000
- 2000-01-06 DE DE60036915T patent/DE60036915T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-06 AT AT00902481T patent/ATE376824T1/de active
- 2000-01-06 JP JP2000593339A patent/JP4790911B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-06 KR KR1020017008609A patent/KR20010113642A/ko not_active Withdrawn
- 2000-01-06 HK HK02102555.1A patent/HK1041209A1/zh unknown
- 2000-01-06 CN CNB00802748XA patent/CN100374163C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-06 WO PCT/AU2000/000004 patent/WO2000041730A1/en not_active Ceased
- 2000-01-06 DK DK00902481T patent/DK1140198T3/da active
- 2000-01-06 ES ES00902481T patent/ES2295005T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-06 EP EP00902481A patent/EP1140198B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-06 CA CA002370003A patent/CA2370003C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-06 NZ NZ512676A patent/NZ512676A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-04-06 TW TW089100433A patent/TWI284042B/zh not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-05-09 JP JP2011104334A patent/JP2011178802A/ja active Pending
- 2011-12-14 US US13/325,842 patent/US8741970B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1140198A4 (en) | 2004-08-04 |
| DE60036915T2 (de) | 2008-08-07 |
| WO2000041730A1 (en) | 2000-07-20 |
| CN100374163C (zh) | 2008-03-12 |
| CA2370003A1 (en) | 2000-07-20 |
| KR20010113642A (ko) | 2001-12-28 |
| JP4790911B2 (ja) | 2011-10-12 |
| CA2370003C (en) | 2008-08-19 |
| US8741970B2 (en) | 2014-06-03 |
| JP2011178802A (ja) | 2011-09-15 |
| HK1041209A1 (zh) | 2002-07-05 |
| DK1140198T3 (da) | 2008-03-10 |
| US20130197103A1 (en) | 2013-08-01 |
| TWI284042B (en) | 2007-07-21 |
| NZ512676A (en) | 2003-01-31 |
| EP1140198A1 (en) | 2001-10-10 |
| CN1336828A (zh) | 2002-02-20 |
| DE60036915D1 (de) | 2007-12-13 |
| ATE376824T1 (de) | 2007-11-15 |
| JP2002534484A (ja) | 2002-10-15 |
| EP1140198B1 (en) | 2007-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8741970B2 (en) | Composition and method for the enhancement of the efficacy of drugs | |
| Zhang et al. | Galactosylated chitosan triptolide nanoparticles for overcoming hepatocellular carcinoma: enhanced therapeutic efficacy, low toxicity, and validated network regulatory mechanisms | |
| Liu et al. | Redox‐responsive dual drug delivery nanosystem suppresses cancer repopulation by abrogating doxorubicin‐promoted cancer stemness, metastasis, and drug resistance | |
| Zhang et al. | Co-delivery of etoposide and cisplatin in dual-drug loaded nanoparticles synergistically improves chemoradiotherapy in non-small cell lung cancer models | |
| Scott et al. | A phase II study of pegylated-camptothecin (pegamotecan) in the treatment of locally advanced and metastatic gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinoma | |
| Shi et al. | Oxidative stress-driven DR5 upregulation restores TRAIL/Apo2L sensitivity induced by iron oxide nanoparticles in colorectal cancer | |
| Xia et al. | Functionalized selenium nanoparticles for targeted delivery of doxorubicin to improve non-small-cell lung cancer therapy | |
| Zhong et al. | Redox dual-responsive dendrimeric nanoparticles for mutually synergistic chemo-photodynamic therapy to overcome drug resistance | |
| Geng et al. | Bioactive phospho-therapy with black phosphorus for in vivo tumor suppression | |
| Ma et al. | Novel linear peptides with high affinity to αvβ3 integrin for precise tumor identification | |
| Dong et al. | Biomimetic, hypoxia‐responsive nanoparticles overcome residual chemoresistant leukemic cells with co‐targeting of therapy‐induced bone marrow niches | |
| Li et al. | Enhanced antitumor efficacy of doxorubicin-encapsulated halloysite nanotubes | |
| Song et al. | Hypoxia-targeting multifunctional nanoparticles for sensitized chemotherapy and phototherapy in head and neck squamous cell carcinoma | |
| Zhang et al. | Novel self‐assembled multifunctional nanoprobes for second‐near‐infrared‐fluorescence‐image‐guided breast cancer surgery and enhanced radiotherapy efficacy | |
| De Stefano et al. | Hyaluronic acid–paclitaxel: Effects of intraperitoneal administration against CD44 (+) human ovarian cancer xenografts | |
| Xiong et al. | Intracellular self-disassemble polysaccharide nanoassembly for multi-factors tumor drug resistance modulation of doxorubicin | |
| Kim et al. | Tumor targeting by doxorubicin-RGD-4C peptide conjugate in an orthotopic mouse hepatoma model. | |
| Yao et al. | Dual-targeting liposomal delivery of sorafenib and docetaxel for enhanced synergistic therapy in advanced hepatocellular carcinoma | |
| Liu et al. | Morphologically transformable peptide nanocarriers coloaded with doxorubicin and curcumin inhibit the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma | |
| Lee et al. | Hyaluronic acid-bilirubin nanoparticles as a tumor microenvironment reactive oxygen species-responsive nanomedicine for targeted cancer therapy | |
| Diamantopoulou et al. | Multivalent cationic pseudopeptide polyplexes as a tool for cancer therapy | |
| Wu et al. | A self-targeting MOFs nanoplatform for treating metastatic triple-negative breast cancer through tumor microenvironment remodeling and chemotherapy potentiation | |
| Zhao et al. | Hyaluronic acid-modified doxorubicin-covalent organic framework nanoparticles triggered pyroptosis in combinations with immune checkpoint blockade for the treatment of breast cancer | |
| Yu et al. | The use of nanoparticulate delivery systems in metronomic chemotherapy | |
| Bai et al. | An Fe (III)-covalent organic framework (COF)–sorafenib nanoplatform induces chemo-ferroptosis for enhanced hepatocellular carcinoma immunotherapy |