ES2295202T3 - Utilizacion de un antagonista especifico de erbb4 para el tratamiento de la estenosis. - Google Patents

Abstract

Utilización de un antagonista específico para un receptor de ErbB4 nativo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la estenosis, en donde dicho antagonista comprende una inmunoadhesina con una secuencia de dominio extracelular de un receptor ErbB4 nativo que se une a un ligando del receptor, o a un anticuerpo neutralizante o fragmento de lo mismo que se une específicamente a un receptor ErbB4 nativo.

Description

Utilización de un antagonista específico de ErbB4 para el tratamiento de la estenosis.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención hace referencia a los medios para controlar la proliferación y/o migración excesivas de las células musculares lisas, para el tratamiento de la estenosis, mediante la utilización de un receptor nativo de ErbB4 tal como se define en las reivindicaciones.

Descripción de materias relacionadas 1. Receptor tirosin quinasa ErbB

La transducción de señales que regula el crecimiento y la diferenciación celular esta regulada en parte por la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las protein tirosin quinasas son enzimas que catalizan este proceso. Las protein tirosin quinasas de receptor se cree están dirigidas al crecimiento celular mediante la fosforilación de tirosina estimulada por ligando de los sustratos intracelulares.

HER4/Erb4 es un receptor tirosin quinasa que pertenece a la familia de ErbB. La expresión aumentada de ErbB4 está estrechamente relacionada con ciertos carcinomas de origen epitelial, incluyendo los adenocarcinomas de mama (Plowman y col., Proc. Natl. Acada. Sci. USA 90:1746-1750 [1993]; Plowman y col., Nature 366:473-475 [1993]). Los procedimientos diagnósticos para la detección de patologías neoplásicas (especialmente cánceres de mama) que evalúan la expresión de ErbB4 se describen en la patente europea EP 599.274.

Otros miembros de la familia ErbB4 de receptores tirosin quinasa incluyen: el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR), el ErbB2(HER2/neu) y el ErbB3 (HER3). El gen erbB1 codifica el receptor de crecimiento epitelial de 170 KDa (EGFR) que ha sido implicado casualmente en procesos cancerosos humanos. En particular, la expresión aumentada de este gen se ha observado en los carcinomas más agresivos de mama, vejiga, pulmón y estómago (Modjtahedi, H. y Dean, C. (1994) Int. J. Oncol. 4:277-296). HER4 actúa, en ausencia de HER2, como un mediador de la respuesta antiproliferativa y diferenciadora en líneas celulares de cáncer. (Sartor y col., Mol. Cell Biol., 21:4265-75 (2001)).

El gen neu (también denominado erbB2 y HER2) codifica un receptor protein quinasa de 185 KDa que originalmente se identificó como el producto de la transformación génica de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La amplificación y/o sobre-expresión del gen HER2 humano se relaciona con un pronóstico peor en el cáncer de mama y de ovario (Slamon, D.J. y col., Science 235:177-182 (1987); Slamon y col., Science 244:707-712 (1989); y la patente americana US 4.968.603). La sobreexpresión de HER2 (es debida frecuentemente aunque no uniformemente a la amplificación génica) también se ha observado en otros carcinomas incluyendo los carcinomas de estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga.

Otro gen relacionado, denominado erbB3 o HER3, se ha descrito en la patente americana US 5.183.884; Kraus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197 (1989); la patente europea EP 444.961A; y Kraus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2900-2904 (1993). Kraus y col., (1989) reportaron que niveles acentuadamente elevados de mRNA de erbB3 en ciertas líneas de tumor de mama humano era indicativo de que erbB3, al igual que erbB1 y erbB2, desempeñaba un papel en el cáncer humano. El papel de erbB3 en el cáncer se ha explorado por diversos autores. Se ha hallado que está sobreexpresado en el cáncer de mama (Lemoine y col., Br. J. Cancer 66:1116-1121 (1992)), gastrointestinal (Poller y col., J. Pathol. 168:275-280 (1992), Rajkumer y col., J. Pathol. 170-27-278 (1993), y Sanidas y col., Int. J. Cancer 54:935-940 (1993)), y cáncer pancreático (Lemoine y col., J. Pathol. 168:269-273 (1992), y Friess y col., Clinical Cancer Research 1:1413-1420 (1995)). ErbB3 es único entre la familia de receptores ErbB ya que posee poca o ninguna actividad tirosina quinasa intrínseca (Guy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8132-8136 (1994) y Kim y col., J. Biol. Chem. 269:24747-55 (1994)).

Los receptores ErbB se hallan generalmente en diversas combinaciones en células y su heterodimerización ayuda a aumentar la diversidad de las respuestas celulares frente a una variedad de ligandos de ErbB (Earp y col., Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132 (1995)). El EGFR se une a seis ligandos diferentes; el factor de crecimiento epitelial (EGF), el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-), la amfiregulina, el factor de crecimiento epitelial de unión a la heparina (HB-EGF), la \beta-celulina y la epiregulina (Groenen y col., Growth Factors 11:235-257 (1994)). Una familia de proteínas de heregulina resultante del ayuste alternativo de un solo gen son los ligandos de ErbB3 y ErbB4. La familia de heregulina incluye las heregulinas \alpha, \beta y \gamma (Holmes y col., Science, 256:1205-1210 (1992); la patente americana 5.641.869; y Schefer y col., Oncogene 15:1385-1394 (1997)); los factores de diferenciación de neu (NDFs), los factores de crecimiento glial (GGFs); el receptor de la acetilcolina inductor de actividad (ARIA); y el factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF). Para una revisión, véase Groenen y col., Growth Factors 11:235 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell Neurosci./:247-262 (1996) y Lee y col., Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Últimamente, se han identificado tres ligandos de ErbB adicionales; la neuregulina-2 (NRG-2), la cual se ha reportado que se une a ErbB3 o ErbB4 (Chang y col., Nature 387: 509-512 (1997); y Carraway y col., Nature 387:512-516 (1997)); la neuregulina-3, que se une a ErbB4 (Zhang y col., PNAS (USA) 94 (18):9562-7 (1997)); y la neuregulina-4 que se une a ErbB4 (Harari y col., Oncogene 18:2681-89 (1999)). HB-EGF, \beta-celulina y epiregulina también se unen a ErbB4.

Mientras que EGF y TGF no se unen a ErbB2, el EGF estimula el EGFR y ErbB2 para formar un heterodímero, que activa el EGFR y da como resultado la transfosforilación de ErbB2 en el heterodímero. La dimerización y/o la transfosforilación parece ser que activa la ErbB2 tirosina quinasa. Véase Earp y col., supra. De igual modo, cuando ErbB3 se co-expresa con ErbB2, se forma un complejo de señalización activo y los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de romper dicho complejo (Sliwkowski y col., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). Adicionalmente, la afinidad de ErbB3 por la heregulina (HRG) se incrementa a un estado de mayor afinidad cuando se co-expresa con ErbB2. Véase también, Levi y col., Journal of Neuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435 (1995); y Lewis y col., Cancer Res., 56:457-1465 (1996) respecto al complejo de proteína ErbB2-ErbB3. ErbB4, al igual que ErbB3, forma un complejo de señalización activo con ErbB2 (Carraway y Cantley, Cell 78:5-8 (1994)).

Debido a su importancia fisiológica, los miembros de la familia de receptores tirosin quinasa han sido a menudo considerados como dianas terapéuticas. Por ejemplo, Hudziak y col., Mol Cell Biol. 9(3):1165-1172 (1989) describen la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2, uno de los cuales, denominado 4D5, inhibe la proliferación celular en un 56%. Una versión humanizada recombinante del anticuerpo anti-ErbB2 murino, 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 o HERCEPTIN®; patente americana US 5.821.337) es clínicamente activa en pacientes con cánceres de mama mestastásicos que sobreexpresan ErbB2 y han recibido previamente terapia anti-cancerosa extensiva (Baselga y col., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). HERCEPTIN® recibió la aprobación comercial de la Administración de Alimentos y Fármacos el 25 de Septiembre de 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína ErbB2/HER2. Ya que HER2 también se sobreexpresa en otros cánceres, además de los cánceres de mama, HERCEPTIN® también presenta un potencial elevado en el tratamiento de dichos otros cánceres.

2. Proliferación de células de músculo liso

Las células de músculo liso son elementos estructurales y funcionales muy importantes de muchos conductos huecos del cuerpo, incluyendo los vasos sanguíneos, el tracto gastrointestinal, las vías aéreas (tráquea y bronquios en los pulmones), el sistema del tracto urinario (vejiga y uretras), etc. Son responsables de la elasticidad, requisito crucial para el funcionamiento normal de estos órganos. Estas células responden a diversos estímulos fisiológicos por constricción o dilatación según sea necesario, por ejemplo, para la regulación del flujo de fluidos que transportan. Responden no sólo a estímulos químicos, como los factores de crecimiento y citoquinas, sino también a estímulos físicos, como la presión y la tensión. Una proliferación excesiva de las células musculares lisas da como resultado el engrosamiento de la pared y el estrechamiento del lumen de los órganos conocido como "estenosis" en diversos trastornos.

Diversos factores de crecimiento y de citoquinas están implicados en la proliferación de células musculares lisas. Una clase de dichas moléculas tan importantes son los ligandos relacionados con el EGF. Por ejemplo, se ha demostrado que las células musculares lisas de diversos órganos poseen receptores de EGF, y algunos de ellos incluso sintetizan y secretan ligandos de EGF como el HB-EGF, estableciéndose así un bucle autocrino. Diversos ligandos de EGF actúan como mitógenos potentes y estimulan la proliferación de células de músculo liso que a menudo resultan en el engrosamiento de la pared y por último en la estenosis. Por ejemplo, la proliferación excesiva de células de músculo liso vasculares (CMLV) está implicada en la patología de la estenosis vascular, la restenosis como resultado de la angioplasia o cirugía o los implantes de endoprótesis cardiovasculares, la aterosclerosis y la hipertensión (revisado en Casterella y Teirstein, Cardiol. Rev. 7:219-231 [1999]; Andres, Int J MOl Med 2:81-89 [1998]; y Rosanio y col., Thromb Haemost. 82 [suppl 1]:164-170 [1999]). El engrosamiento de los vasos sanguíneos aumenta la resistencia al flujo sanguíneo y por último conduce a la hipertensión. Además, una disminución del aporte sanguíneo al tejido también puede causar necrosis e inducir una respuesta inflamatoria conduciendo a un daño severo. Por ejemplo, el infarto de miocardio sucede como resultado de una falta de oxígeno y de la muerte local de los tejidos musculares del corazón.

La estenosis pilórica hipertrófica infantil (IHPS), que causa la obstrucción funcional del canal pilórico también implica la hipertrofia y la hiperplasia de las células musculares lisas pilóricas (Oue y Puri, Pediatr Res, 45:853-857 [1999]). Además, el EGF, el receptor de EGF y el HB-EGF están implicados en la patogénesis de la estenosis pilórica (Shima y col., Pediatr. Res. 47:201-207 [2000]).

De igual modo, el engrosamiento de la pared de la vejiga urinaria que tiene lugar en respuesta a los síndromes oclusivos que afectan el tracto urinario inferior implica la proliferación de las células musculares lisas de la vejiga urinaria. Una forma de precursor unido a membrana de HB-EGF se expresa en las células musculares lisas de la vejiga urinaria y HB-EGF es un mitógeno potente para la proliferación de SMC de la vejiga (Freeman y col., J. Clin. Invest. 99:1028-1036 [1997]; Kaefer y col., Urol. 163:580-584 [2000]; Borer y col., Lab Invest. 79:1335-1345 [1999]).

Las enfermedades oclusivas de vías respiratorias son otro grupo de enfermedades con patología subyacente que implican la proliferación de células musculares lisas. Un ejemplo de este grupo es el asma que se manifiesta en la inflamación de vías respiratorias y la broncoconstricción. El EGF está implicado en la proliferación patológica de CMLs de vías respiratorias en las enfermedades obstructivas de vías respiratorias (Cerutis y col., Am. J. Physiol. 273:L10-15 [1997]; Cohen y col., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 16:85-90 [1997]).

La presente invención describe la utilización de los antagonistas del receptor ErbB4 tal como se define en las reivindicaciones para el control de la migración y/o proliferación excesiva de las células musculares lisas para el tratamiento de la estenosis.

La patente internacional WO 96/15128 A describe compuestos que inhiben las tirosin quinasas. Los compuestos son útiles en el tratamiento de trastornos proliferativos incluyendo la restenosis.

Bianco y col., 1999, Journal of Biological Chemistry, vol 274, no. 13, pp 8624-8629 y Chen y col., 1996, Journal of Biological Chemistry, vol. 271, no. 13, pp 7620-7629 describen anticuerpos contra ErbB4. La utilización terapéutica de los anticuerpos no se describe.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención hace referencia a los medios para controlar la proliferación o la migración excesiva de las células musculares lisas para el tratamiento de la estenosis gracias a tratar las células musculares lisas con una cantidad efectiva de un antagonista de un receptor ErbB4 nativo, tal como se define en las reivindicaciones. El objetivo es la prevención o la inhibición, incluyendo la inhibición total, de la proliferación o migración excesiva de las células musculares lisas. En una realización, las células musculares lisas provienen de la vejiga urinaria, y en otra realización, de los conductos respiratorias.

La proliferación y/o migración excesivas de las células musculares lisas como las células musculares lisas vasculares pueden resultar en la estenosis incluyendo la estenosis vascular y la restenosis. En una realización, las células musculares lisas son humanas. La estenosis puede caracterizarse además por la proliferación o migración excesiva de las células endoteliales.

En una realización, el antagonista del receptor ErbB4 es una inmunoadhesina tal como se define en las reivindicaciones. En otra realización, el antagonista del receptor ErbB4 es un anticuerpo neutralizante contra un receptor ErbB4 nativo, tal como se define en las reivindicaciones. El antagonista puede administrarse en inyección o infusión. Los medios para el tratamiento también pueden utilizarse para reducir la hipertensión asociada con la estenosis. La estenosis puede ser vascular, incluyendo la restenosis, la estenosis pilórica, el engrosamiento de la pared de la vejiga urinaria o parte de una enfermedad oclusiva de vías respiratorias.

En una realización, el antagonista es una inmunoadhesina que comprende la región extracelular de un receptor ErbB4 nativo, tal como se define en las reivindicaciones. En otra realización, el antagonista es un anticuerpo neutralizador contra un receptor ErbB4 nativo humano tal como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la invención hace referencia a los medios de tratamiento de la estenosis en un paciente mamífero, como por ejemplo el hombre, en donde los medios se introducen en una célula del paciente utilizando un ácido nucleico que codifica un antagonista de un receptor de ErbB4 tal como se define en las reivindicaciones. El ácido nucleico puede introducirse in vivo o ex vivo, y con ayuda de un vector como un vector retroviral o un sistema de liberación basado en lípidos. Los medios de la presente invención son particularmente útiles para el tratamiento (incluyendo la prevención) de la estenosis y la restenosis vascular.

El antagonista puede ser una inmunoadhesina tal como se define en las reivindicaciones. El antagonista también puede ser un anticuerpo neutralizante contra un receptor ErbB4 nativo humano tal como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la invención concierne los medios para el tratamiento de la hipertensión asociada con la estenosis vascular en un paciente mamífero.

En todos los aspectos, los antagonistas de ErbB4 preferidos incluyen las inmunoadhesinas que comprenden una secuencia del dominio extracelular del receptor de ErbB4, preferentemente fusionada con una secuencia de la región constante de inmunoglobulina. La secuencia de inmunoglobulina preferentemente es de una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina IgG1, IgG2 o IgG3 y adicionalmente puede comprender una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina unida covalentemente a una molécula de fusión que comprende la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

Otra clase preferida de antagonistas de ErbB4 comprende los anticuerpos neutralizantes de unión específica al receptor ErbB4 nativo tal como se define en las reivindicaciones. Los anticuerpos son preferentemente humanos o humanizados. En una realización, los anticuerpos se unen esencialmente al mismo epitopo al igual que un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado a partir de un grupo que consiste en HER4.10H1.1A1 (número de acceso ATCC PTA-2828), HER4.1C6.A11 (número de acceso ATCC PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (número de acceso ATCC PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (número de acceso ATCC PTA-2827) y HER4.8B1.2H2 (número de acceso ATCC PTA-2825). Los anticuerpos también pueden tener residuos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en HER4.10H1.1A1 (número de acceso ATCC PTA-2828), HER4.1C6.A11 (número de acceso ATCC PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (número de acceso ATCC PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (número de acceso ATCC PTA-2827) y HER4.8B1.2H2 (número de acceso ATCC PTA-2825).

Las células del músculo liso pueden, por ejemplo, ser células pilóricas o del músculo liso de la vejiga urinaria, o células del músculo liso de una vía respiratoria. Preferentemente, las células del músculo liso son células de músculo liso vasculares.

La invención también concierne a la utilización de un anticuerpo que se une a ErbB4 con afinidad elevada tal como se define en las reivindicaciones. Este anticuerpo se une preferentemente a ErbB4 con una Kd inferior a 100 nM, más preferentemente con una Kd inferior a 50 nM, incluso más preferentemente con una kd inferior a 25 nM y más preferentemente con una Kd inferior a 10 nM. En una realización, este anticuerpo es un anticuerpo humano y en otra realización es un anticuerpo humanizado. En otra realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

En otro aspecto, la invención concierne a la utilización de un anticuerpo que se une con ErbB4 y reduce la unión con la heregulina, tal como se define en las reivindicaciones. Este anticuerpo puede unirse con ErbB4 con afinidad elevada.

Por último, la invención concierne la utilización de un anticuerpo que se une a ErbB4 y reduce la fosforilación de tirosinas inducida por heregulina, tal como se define en las reivindicaciones. Este anticuerpo también puede unirse a ErbB4 con afinidad elevada.

Descripción resumida de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia nucleotídica del ErbB4 humano (SEC ID NO:1).

La figura 2 muestra la secuencia aminoacídica del ErbB4 humano (SEC ID NO:2).

La figura 3 muestra la secuencia nucleotídica de una inmunoadhesina ErbB4-IgG (SEC ID NO:3).

La figura 4 muestra la secuencia aminoacídica del dominio extracelular de ErbB4 (ECD), que comprende los aminoácidos 26 a 640 (SECID NO:4) de la secuencia aminoacídia de ErbB4 en la Figura 2 (SEC ID NO:2).

La Figura 5 muestra el efecto de la inmunoadhesina ErbB4-IgG sobre la proliferación estimulada por PDGF de las células musculares lisas de aorta humana.

La Figura 6 muestra el efecto de la inmunoadhesina ErbB4-IgG sobre la respuesta quimiotáctica de las células musculares lisas de aorta humana frente a trombina.

La Figura 7 muestra la inhibición de la unión de heregulina a la inmunoadhesina HER4 por los anticuerpos monoclonales anti-HER4.

Descripción detallada de la realización preferida A. Definiciones

Excepto que se especifique lo contrario, los términos técnicos y científicos que se utilizan aquí tienen el mismo significado que el usualmente utilizado por un trabajador en la materia a quien dicha invención pertañe. Véase por ejemplo, Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Para los propósitos de la presente invención, los siguientes términos se definen más adelante.

Excepto que se indique lo contrario, el término "ErbB" cuando se utiliza aquí hace referencia a cualquiera de los receptores ErbB de mamífero (es decir, ErbB1 o el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF); ErbB2 o el receptor HER2; ErbB3 o el receptor HER3; ErbB4 o el receptor HER4; y cualquiera de los miembros de esta clase I de familia de tirosin quinasas que se identifiquen en un futúro)) y "erbB" hace referencia a los genes erbB de mamífero que codifican estos receptores.

Los términos "ErbB" y "HER4" se utilizan de forma indistinta y hacen referencia al polipéptido del receptor ErbB4 de secuencia nativa tal como se describe, por ejemplo, en la patente europea EP 599.274; Plowman y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:1746-1750 (1993); y Plown y col., Nature, 366:473-475 (1993), y a los derivados funcionales incluyendo las variantes de secuencia aminoacídica de lo mismo.

Un receptor ErbB4 o HER4 "nativo" o "secuencia nativa" tiene la secuencia aminoacídica de un receptor ErbB4 que se produce de forma natural en cualquier especie de mamíferos (incluyendo el hombre), independientemente de su modo de preparación. Según ello, un receptor ErbB4 nativo o de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza, producirse por técnicas del DNA recombinante, sintetizarse químicamente o producirse mediante cualquier combinación de estos u otros procedimientos similares. Los receptores ErbB4 nativos incluyen específicamente los polipétidos que tienen la secuencia aminoacídica de variantes alélicas naturales, isoformas o variantes de ayuste de ErbB4, conocidas en la materia o las descubiertas posteriormente. Los receptores ErbB4 de secuencia nativa se describen, por ejemplo, en la patente europea EP 599.274, supra, y en los dos artículos de Plown y col., supra. Elenius y col., J. Biol. Chem. 272:26761-26768 (1997) reportaron la identificación de dos isoformas de ayuste de ErbB4 en tejidos murinos y humanos, que diferían por la inserción de 23 (HER4 JM-a) o 13 (HER4 JM-b) aminoácidos alternativos en la región yuxtamembrana extracelular (JM). Elenius y col., Oncogene 18:2607-2615 (1999) reportaron la identificación y caracterización de otra isoforma natural de ErbB4 (denominada como ErbB4 CYT-2), con una deleción de secuencia del dominio citoplasmático necesario para la activación de la vía de transducción de señal intracelular de PI3-K. Las isoformas de HER4 también se describen en la patente internacional WO 99/19488. Una secuencia nucleotídica que codifica ErbB4 se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:1) y la correspondiente secuencia aminoacídica deducida se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:2).

El término "dominio extracelular de ErbB4" o "ErbB4 ECD" hace referencia a un fragmento soluble de ErbB4 que comprende los aminoácidos localizados entre la secuencia señal y la región transmembrana predicha. En una realización, "ErbB4 ECD" es un polipéptido que comprende los aminoácidos 26-640 (SEC ID NO:4) de la secuencia de ErbB4 humana que se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:2).

El término "mamífero" se utiliza aquí para referirse a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo, sin limitación, el hombre, los animales domésticos y de granja y los animales del zoo, los deportivos, o los animales de compañía, como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas, etc.

Los "derivados funcionales" incluyen las variantes de secuencia aminoacídica, y los derivados covalentes de polipéptidos nativos siempre que retengan una actividad biológica del polipéptido nativo correspondiente. Las variantes de secuencia aminoacídica difieren generalmente de una secuencia nativa en la sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos en cualquier sitio de una secuencia aminoacídica nativa. Las variantes delecionales incluyen fragmentos de los polipéptidos nativos, y variantes que tienen truncaciones N- y/o C-terminales. Generalmente, las variantes de secuencia aminoacídica tendrán al menos un 70% de homología, prferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90% de homología con un polipéptido nativo.

El término "homología" se define como el porcentaje de residuos en la variante de secuencia aminoacídica que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir, si fuera necesario, los huecos pertinentespara lograr el máximo porcentaje de homología. Los procedimientos y programas informáticos para el alineamiento son bien conocidos en la materia. Uno de dichos programas es el "Align 2", autorizado por Genentech, Inc., el cual se registró con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos de América, Washington, DC 20559, el 10 de Diciembre de 1991.

Un "antagonista" de ErbB es una molécula, que impide o interfiere con una función efectora de ErbB, por ejemplo que impide o interfiere con la unión y/o la activación del receptor ErbB de secuencia nativa por un ligando, y/o las vías cadena abajo utilizadas por el receptor ErbB de secuencia nativa. Dichas moléculas pueden cribarse, por ejemplo, basándose en su capacidad para inhibir competitivamente la activación del receptor ErbB por el ligando en el ensayo de fosforilación de tirosina. De modo similar, un antagonista de un receptor ErbB4 (HER4) de secuencia nativa es una molécula que previene o interfiere con una función efectora de ErbB4, por ejemplo, una molécula que impide o interfiere con la unión o con la activación de un receptor ErbB4 de secuencia nativa, y/o las vías corriente abajo utilizadas por el receptor ErbB4. Dichas moléculas pueden cribarse, por ejemplo, basándose en su capacidad para inhibir competitivamente la activación del receptor ErbB4 por el ligando en el ensayo de fosforilación de tirosinas. Ejemplos de antagonistas de ErbB4 incluyen, sin limitación, los receptores de ErbB4 solubles (como los dominios extracelulares/ECD) de los receptores ErbB4 de secuencia nativa y variantes), los anticuerpos neutralizantes de receptores ErbB4 de secuencia nativa, los anticuerpos neutralizantes de ligandos de receptores ErbB4 de secuencia nativa (por ejemplo, anticuerpos anti-HB-EGF), inmunoadhesina ErbB4-IgG (incluyendo heteroadhesinas quiméricas) y las moléculas pequeñas.

Por "ligando de ErbB4" se hace referencia a un polipéptido que se une a y/o activa un receptor ErbB4. Los ligandos de ErbB4 incluyen la betacelulina, la epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3 y las heregulinas.

En los procedimientos de la presente invención, el término "control" y las variantes gramaticales de lo mismo se utilizan para referirse a la prevención, inhibición parcial o completa, reducción, demora o ralentización de un suceso no deseado, por ejemplo, una patología fisiológica, como la proliferación y/o la migración excesiva de células musculares lisas y/o los tipos celulares, por ejemplo, las células endoteliales.

El término "proliferación y/o migración excesivas" significa proliferación y/o migración más allá de los niveles normales que se producen o es probable que se produzcan, si no se tratan las células, en el desarrollo de una patología o enfermedad fisiológica, como por ejemplo la estenosis, incluyendo la estenosis vascular, la restenosis, y la estenosis pilórica; el engrosamiento de la pared de la vejiga urinaria, y la enfermedad oclusiva de vías respiratorias.

El término "tratamiento" hace referencia tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a sus medidas preventivas. Los que necesitan un tratamiento son aquellos que ya presentan la enfermedad así como los propensos a desarrollarla, o aquellos en los que se desea su prevención. Para los propósitos de la invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de los síntomas, la disminución de la gravedad de la enfermedad, la estabilización (es decir el no empeoramiento) de la enfermedad, la demora o ralentización de la progresión de la enfermedad, el mejoramiento o alivio del estado de la enfermedad, y la remisión (parcial o total), bien sean detectables o no. El término "tratamiento" puede también significar la prolongación de la supervivencia según se compare con la supervivencia esperada sin recibir tratamiento. Los que requieren tratamiento incluyen los que presentan la patología o enfermedad, así como los propensos a presentarla, o aquellos en los que se desea su prevención.

El término molécula "aislada" define ampliamente una molécula que se identifica y aísla de al menos una molécula contaminante con la que generalmente se asocia en la fuente natural de la molécula. Preferentemente, la molécula aislada está libre de asociación con todos los componentes con los que se asocia normalmente.

El término "inmunoadhesina" se utiliza aquí para referirse a moléculas de tipo anticuerpo que combinan con el dominio de unión de una proteína como el dominio extracelular (la porción de adhesina) de un receptor de superficie celular con las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. El término "inmunoadhesina" incluye específicamente las secuencias del receptor de ErbB4 variante o nativo. La secuencia de ácido nucleico de una inmunoadhesina ErbB4-IgG se muestra en la figura 3 (SEC ID NO:3). Las inmunoadhesinas pueden presentar muchas de las propiedades químicas y biológicas de los anticuerpos humanos. Ya que las inmunoadhesinas pueden generarse a partir de una secuencia proteica humana con una especificidad deseada unida a una bisagra de inmunoglobulina humana y una secuencia de dominio constante (Fc), la especificidad de unión de interés puede lograrse utilizando únicamente los componentes humanos. Las inmunoadhesinas son mínimamente inmunogénicas al paciente, y son seguras para su uso crónico o repetido. El término "inmunoadhesina" hace referencia a una inmunoadhesina que se ha purificado a partir de una fuente o se ha preparado mediante procedimientos recombinantes o sintéticos y está suficientemente libre de otros péptidos o proteínas.

Las inmunoadhesinas reportadas en la literatura incluyen las fusiones del receptor de células T (Gascoigne y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon y col., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker y col., Nature 339: 68-70 (1989); Zettmeissi y col., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); y Byrn y col., Nature 344:667-670 (1990)); L-selectina o receptor de direccionamiento (Watson y col., J. Cell Biol. 110:2221-2229 (1990); y Watson y col., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo y col., Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 y B7 (Linsley y col., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTL-4 (Lisley y col., J. Exp. Med 174:561-569(1991)); CD22 (Stamenkovic y col., Cell 66:1133-1144 (1991)); el receptor del TNF (Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer y col., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); y Peppel y col., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); receptores NP (Bennett y col., J Biol Chem 266:23060-23067 (1991)); receptor del interferón (Kurschner y col., J. Biol Chem 267:9354-9360 (1992)); 4-1BB (Chalupny y col., PNAS USA 89:10360-10364 (1992)) y el receptor del IgE (Ridgway y Groman, J Cell Biol 115, Abstract no. 1448 (1991)).

Ejemplos de inmunoadhesinas que se han descrito para utilización terapéutica incluyen la inmunoadhesina CD4-IgG para bloquear la unión de VIH con el CD4 de superficie celular. Los resultados obtenidos de los ensayos clínicos de Fase I, en los que CD4-IgG se administró a mujeres embarazadas justo antes del parto, sugieren que esta inmunoadhesina puede ser útil en la prevención de la transferencia materno-fetal de VIH (Ashkenazi y col., Intern. Rev. Immunol. 102:219-227 (1993). También se ha desarrollado una inmunoadhesina que se une al factor de necrosis tumoral (TNF). El TNF es una citoquina proinflamatoria que ha mostrado ser un mediador de choque séptico. Basado en un modelo de choque séptico, una inmunoadhesina de receptor TNF presenta posibilidades como candidato para uso clínico en el tratamiento de choque séptico (Ashkenazi, A. y col., (1991) PNAS USA 88:10535-10539). ENBREL® (etanercept), una inmunoadhesina que comprende la secuencia del receptor del TNF fusionada con una región Fc de IgG fue aprobada por la Administración de Alimentación y Fármacos (FDA), el 2 de Noviembre de 1998, para el tratamiento de la artritis reumatoide. El nuevo uso extensivo de ENBREL® en el tratamiento de la artritis reumatoide se ha aprobado recientemente por la FDA el 6 de Junio del 2000. Para una información más reciente sobre bloqueantes del TNF, incluyendo ENBREL®, véase Lovell y col., N. Engl. J. Med 342:763-769 (2000), y el editorial que acompaña en pp. 810-811; y Weinblatt y col., N. engl. J. Med. 340:253-259 (1999); resumido en Maini y Taylor, Annu.Rev. Med. 51:207-229 (2000). Las inmunoadhesinas también tienen utilizaciones no terapéuticas. Por ejemplo, la inmunoadhesina del receptor de L-selectina se utilizó como un reactivo para la tinción histoquímica de las vénulas endoteliales superiores del nódulo linfático periférico (HEV). Este reactivo también se utilizó para aislar y caracterizar el ligando de la L-selectina (Ashkenazi y col., supra).

Si los dos brazos de la estructura de la inmunoadhesina tienen especificidades distintas, la inmunoadhesina se denomina "inmunoadhesina biespecífica" por analogía con los anticuerpos biespecíficos. Dietsch y col., J. Immunol Methods 162:123 (1993) describen como una inmunoadhesina biespecífica que combina los dominios extracelulares de las moléculas de adhesión, E-selectina y P-selectina, en donde cada una de dichas selectinas se expresa en un tipo celular distinto en la naturaleza. Los estudios de unión indicaron que la proteína de fusión de la inmunoglobulina biespecífica así formada presentaba una capacidad aumentada para unirse a una línea de célula mieloide comparada con las inmunoadhesinas monoespecíficas de las cuales se deriva.

El término "heteroadhesina" se utiliza de forma indistinta con la expresión "adhesina heteromultímera quimérica" y hace referencia a un complejo de molécula quiméricas (secuencias aminoacídicas) en las que cada molécula quimérica combina una porción activa biológicamente, como por ejemplo el dominio extracelular de cada uno de los monómeros de receptor heteromultimérico, con un dominio de multimerización. El "dominio de multimerización" facilita una interacción estable de las moléculas quiméricas dentro del complejo heteromultimérico. Los dominios de multimerización pueden interactuar mediante una secuencia de inmunoglobulina, cremallera de leucina, una región hidrofóbica, una región hidrofílica, o un tiol libre que forma un enlace disulfuro intermolecular entre las moléculas quiméricas del heteromultímero quimérico. El dominio de multimerización puede comprender una región constante de inmunoglobulina. Además, una región de multimerización puede diseñarse de modo que las interacciones estéricas no sólo faciliten una interacción estable, sino que además favorezcan la formación de los heterodímeros respecto a los homodímeros a partir de una mezcla de monómeros. Las "protuberancias" se construyen reemplazando los aminoácidos de cadenas laterales pequeñas de la interfaz del primer polipéptido por otros con cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades" compensadoras de igual o similar tamaño que las protuberancias se crean en la interfaz del segundo polipéptido reemplazando los de cadenas laterales mayores por unos más pequeños (por ejemplo, alanina o treonina). La secuencia de inmunoglobulina preferentemente, pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina. La porción de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención puede obtenerse a partir de subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferentemente IgG1 o IgG3.

El término "etiquetado epitópicamente" cuando se utiliza aquí hace referencia a un polipéptido quimérico que comprende la heteroadhesina quimérica completa, o un fragmento de lo mismo, fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el cual puede generarse un anticuerpo, el cual es suficientemente corto para que no interfiera con la actividad de la heteroadhesina quimérica. El polipéptido diana preferentemente es único de modo que el anticuerpo contra éste no presente reacción cruzada con otros epitopos. Polipéptidos diana adecuados tienen por lo menos 6 residuos aminoacídicos y generalmente entre 8-50 residuos aminoacídicos (preferentemente entre 9-30 residuos). Una realización la invención abarca una heteroadhesina quimérica unida a una etiqueta epitópica, etiqueta que se utiliza para detectar o recuperar la adhesina de una muestra.

Los términos "inmunoadhesina esencialmente homogénea/altamente purificada/aislada", "heteroadhesina esencialmente homogénea/altamente purificada/aislada", y "adhesina heteromultimérica quimérica esencialmente homogénea/altamente purificada/aislada" se utilizan de forma indistinta y hacen referencia a la adhesina que se ha purificado a partir de una fuente o se ha preparado por procedimientos recombinantes o sintéticos y está suficientemente libre de otros péptidos o proteínas hasta homogeneidad mediante técnicas cromatográficas u otras técnicas de purificación, como el SDS-PAGE en condiciones reductoras o no con tinción por Azul de Coomassie o, preferentemente, de plata. La homogeneidad aquí quiere decir menos del 5% de contaminación con proteínas de otro origen. Las heteroadhesinas quiméricas ErbB4-IgG de la invención que se unen con una afinidad suficientemente mayor en relación a los homodímeros que utilizan una mezcla de homodímeros y heterodímeros también se considera una realización de utilidad en la invención. Los términos "adhesina hetermultmérica quimérica", "heteroadhesina quimérica" y "CHA" se utilizan aquí indistintamente.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos que reconocen los receptores de ErbB4 nativos. Un anticuerpo que muestra una unión de "alta afinidad" tiene una kd inferior a 100 nM, preferentemente inferior a 50, más preferentemente inferior a 25, más preferentemente inferior a 10.

El término "anticuerpo monoclonal" que aquí se utiliza hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos esencialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural y que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un sitio único. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos (policlonal) que incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes distintos (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos por ayuste de un dominio variable (incluyendo el hipervariable) de un anticuerpo anti-heteroadhesina quimérica con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de las especies de origen o de la denominación de la clase o subclase de inmunoglobulina, así como de los fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab)2 y Fv), siempre que presenten la actividad deseada. (Véase por ejemplo, la patente americana US 4.816.567 y Mage & Lamoyi, en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.), New York (1987)).

De este modo, el término "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población homogénea de anticuerpos, y no debe considerarse que se requiera una producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento en especial. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden generarse por procedimientos del DNA recombinante (patente americana US 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de librerías de fagos generadas utilizando, por ejemplo, las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature 348:552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas específicas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de lo mismo (como Fv, Fab, Fab', F(ab)2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no-humana. En la mayoría de los casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el que residuos de regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) del anticuerpo receptor se reemplazan por residuos de las CDRs de una especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, la rata o el conejo con una especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan los residuos de la región de entramado Fv (FR) de la inmunoglobulina humana por los residuos FR no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que se no se hallen ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o FR importadas. Estas modificaciones se generan para posteriormente afinar y optimizar la realización del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todo o al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o esencialmente todos los de las regiones CDR corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todos o esencialmente todos los residuos FR son los de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

Las "células musculares" incluyen las células del tejido del músculo liso, esquelético o cardíaco. Este término abarca aquellas células que se diferencian para formar células del músculo más especializadas (por ejemplo, mioblastos). Las células musculares lisas vasculares hacen referencia a células del músculo liso presentes en una capa elástica media de los vasos sanguíneos.

El término "estenosis" hace referencia al estrechamiento o constricción de una vía hueca (por ejemplo, ducto o canal) en el cuerpo. El término "estenosis vascular" hace referencia a la oclusión o estrechamiento de vasos sanguíneos. La estenosis vascular a menudo se origina como consecuencia del depósito graso (como en el caso de la aterosclerosis) o en la migración y la proliferación excesiva de células musculares lisas vasculares y de células endoteliales. Las arterias son especialmente susceptibles a la estenosis. El término "estenosis" tal como se utiliza aquí incluye específicamente la estenosis inicial y la restenosis.

El término "restenosis" hace referencia a la recurrencia de la estenosis después del tratamiento de la estenosis inicial con éxito aparente. Por ejemplo, "restenosis" en el contexto de estenosis vascular, hace referencia a la recurrencia de estenosis vascular después de haberse tratado con éxito aparente, por ejemplo, mediante eliminación de depósitos grasos por angioplastia de balón. Uno de los factores que contribuyen a la restenosis es la hiperplasia de la íntima. El término "hiperplasia de la íntima", que se utiliza indistintamente junto con "hiperplasia de la neoíntima" y "formación de la neoíntima", hacen referencia al engrosamiento de la capa más interna de los vasos sanguíneos, la íntima, como consecuencia de una proliferación y migración excesivas de las células musculares vasculares y de las células endoteliales. Los diversos cambios que tienen lugar durante la restenosis hacen referencia en conjunto al "remodelado de la pared vascular".

Los términos "angioplastia de balón" y "angioplastia coronaria transluminal percutánea" (ACTP) se utilizan a menudo de forma indistinta, y hacen referencia al tratamiento basado en un catéter no quirúrgico para eliminar la placa de la arteria coronaria. La estenosis o la restenosis conducen a menudo a la hipertensión como resultado del aumento de la resistencia al flujo sanguíneo.

El término "estenosis pilórica" hace referencia al estrechamiento del píloro, el paso al extremo inferior del estómago que desemboca en el duodeno.

El término "hipertensión" hace referencia a una presión sanguínea anormalmente alta, es decir, mas allá del valor superior.

Por "anticuerpo neutralizante" se quiere indicar una molécula de anticuerpo, tal como se define aquí, que es capaz de bloquear o reducir de modo significativo una función efectora de los receptores de ErbB. Según ello, un anticuerpo anti-ErbB4 "neutralizante" es capaz de bloquear o reducir de forma significativa una función efectora, como la unión al ligando y/o la inducción de una respuesta celular, de ErbB4. Para el propósito de la presente invención, la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB4 para neutralizar la unión de un ligando de ErbB4 (heregulina, HRG) con ErbB4 puede monitorizarse, por ejemplo, cuantificando la unión de HRG marcada de forma detectable al ErbB4 purificado o a una línea celular que exprese o esté modificada para expresar ErbB4 en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-ErbB4 candidato. Dichos ensayos se describen en el Ejemplo 4 de más adelante. Para el propósito de la presente invención, la capacidad de los anticuerpos anti-ErbB4 para neutralizar la inducción de una respuesta celular por ErbB4 se ensaya preferentemente mediante inhibición monitorizada de fosforilación de tirosina de Erbb4 por heregulina (HRG), en un ensayo de proliferación celular. Los ensayos representativos se describen en el Ejemplo 4 de más adelante. Por reducción "significativa" se entiende por lo menos un 60%, o al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, aún más preferentemente un 85%, todavía más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente un 90%, aún más preferentemente un 95% y todavía mejor al menos un 99% de reducción de una función efectora de un antígeno diana (por ejemplo ErbB4), como la unión al ligando (por ejemplo, HRG) y/o la inducción de una respuesta celular. Preferentemente, los anticuerpos "neutralizantes" tal como se definen aquí serán capaces de neutralizar al menos un 60%, o al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%; incluso más preferentemente al menos un 85%, todavía más preferentemente al menos un 90%, todavía más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 99% de la fosforilación de tirosina de ErbB4 por HRG, tal como se determina por el ensayo descrito en el Ejemplo 4.

Un anticuerpo "aislado" es un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con las utilizaciones diagnósticas o terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpos se purificará (1) a un grado superior al 95% en peso del anticuerpo, tal como se determina por el procedimiento de Lowry, y más preferentemente al 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o de la interna mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando la tinción de Azul de Coomassie o la tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Por lo general, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

El término "epitopo" se utiliza para referirse a los sitios de unión para anticuerpo monoclonales o policlonales) en los antígenos proteicos.

Los anticuerpos que se unen a un epitopo en particular pueden identificarse mediante "mapeo epitópico". Existen muchos procedimientos conocidos en la materia para el mapeo y caracterización de la localización de epitopos en las proteínas, incluyendo la resolución de la estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo, los ensayos de competición, los ensayos de expresión de fragmentos génicos y los ensayos basados en péptidos sintéticos, tal como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Los ensayos de competición se discuten más adelante. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmentos génicos, la pauta de lectura abierta que codifica la proteína se fragmenta bien aleatoriamente o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de la proteína con el anticuerpo a analizar. Los fragmentos génicos pueden, por ejemplo, producirse por PCR y luego transcribirse y traducirse en proteína in vitro en presencia de aminoácidos radioactivos. La unión del anticuerpo con los fragmentos de proteína marcada radioactivamente se determina a continuación mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Ciertos epitopos también pueden identificarse utilizando librerías grandes de secuencias peptídicas aleatorias expresadas en la superficie de partículas fágicas (librerías de fagos). Alternativamente, una librería definida de fragmentos peptídicos solapantes puede analizarse mediante la unión del anticuerpo a analizar en ensayos de unión simple. La última aproximación es adecuada para definir epitopos lineales de aproximadamente 5 a 15 aminoácidos.

Un anticuerpo se une "esencialmente al mismo epitopo", un anticuerpo de referencia, mientras que dos anticuerpos reconocen epitopos idénticos o estéricamente solapantes. Los procedimientos más ampliamente utilizados y rápidos para determinar si dos anticuerpos se unen a epitopos idénticos o estéricamente solapantes son los ensayos de competición, los cuales pueden configurarse en todo tipo de formatos distintos, utilizando bien el antígeno marcado o el anticuerpo. Generalmente, el antígeno se inmoviliza en una placa de 96 pocillos, y la capacidad de los anticuerpo no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados se cuantifica utilizando marcajes radioactivos o enzimáticos.

El término "inhibición del receptor ErbB4 (HER4)" hace referencia a la capacidad de un antagonista de ErbB4 para inhibir o impedir la activación de un receptor de Erb4, por ejemplo, mediante el bloqueo de la unión de un ligando con el receptor de ErbB4. La "activación" de un receptor de ErbB4 hace referencia a la fosforilación del receptor, el cual puede cuantificarse utilizando los ensayos de fosforilación de tirosina y los eventos cadena abajo que constituyen la inducción de la transducción de señal por el ligando unido. La "inhibición" en cualquiera de estos ensayos será de al menos un 60%, o al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, todavía más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, todavía más preferentemente al menos un 95% y más preferentemente al menos un 99%.

La expresión "disminución de la supervivencia de una célula" hace referencia al hecho de disminuir el periodo de existencia de una célula, en relación con una célula no tratada que no ha sido expuesta a un antagonista de ErbB4, in vitro o in vivo. La expresión "disminución de la proliferación celular" hace referencia a la disminución en el número de células en una población expuesta a un antagonista de ErbB4 bien in vivo o in vitro, en relación con una célula no tratada.

El término "actividad biológica" cuando se usa junto con un antagonista de ErbB4 hace referencia a la capacidad de un antagonista de ErbB4 para controlar la proliferación o la migración excesiva de células musculares lisas, tal como se determina en un ensayo in vitro o in vivo, incluyendo los ensayos de de proliferación de células musculares lisas estimuladas con PDGF y los ensayos de migración de células musculares lisas de aorta humana descritos en los Ejemplos de más adelante, los modelos animales y los ensayos clínicos en humanos, independientemente del mecanismo subyacente. En consecuencia, la actividad biológica de un antagonista de ErbB4 incluye, sin limitación, el funcionamiento como un inhibidor de la unión de un ligando o la activación de un receptor de ErbB4 nativo, y/o la inhibición del crecimiento y/o la migración de células musculares lisas que expresan el receptor de ErbB4 en su superficie.

El término "estado de la enfermedad" hace referencia a un estado fisiológico de una célula o el de todo un mamífero en los que tiene lugar una interrupción, el cese o una anomalía de los sistemas funcionales celulares o corporales o de los órganos.

El término "cantidad efectiva" hace referencia a una cantidad de un fármaco efectivo para el tratamiento (incluyendo la prevención) de una enfermedad, trastorno o condiciones fisiológicas no deseadas en un mamífero. En la presente invención, una "cantidad efectiva" de un antagonista de ErbB4 puede reducir, ralentizar, decaer la proliferación de las células musculares lisas; reducir, ralentizar o decaer la migración de células musculares lisas; prevenir o inhibir (es decir, ralentizar hasta una cierta magnitud y preferentemente parar) el desarrollo de la estenosis o la restenosis; y/o mitigar a una cierta magnitud uno o más de los síntomas asociados con la estenosis o la restenosis, en particular, prevenir o inhibir (es decir, ralentizar a una cierta magnitud y preferentemente parar) el desarrollo de la presión sanguínea elevada asociada con la estenosis o restenosis.

El ácido nucleico está "unido operativamente" si se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA de una presecuencia o líder secretor está operativamente unido al DNA de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador están operativamente unidos a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si se posiciona para facilitar la traducción. Por lo general, "operativamente unido" hace referencia a que las secuencias de DNA unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas en la misma fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porque ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en dianas de restricción adecuadas. Si no existieran dichas dianas, los adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o engarces se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

Los vehículos, excipientes o estabilizantes "farmacéuticamente aceptables" son aquellos no tóxicos para la célula o el mamífero que se expone a las dosis y concentraciones utilizadas. A menudo el vehículo aceptable fisiológicamente es una solución acuosa tamponada. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen los tampones como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); las proteínas como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos como el Tween, el polietilén glicol (PEG) y el Pluronics.

B. Procedimientos para llevar a cabo la invención

La invención hace referencia al tratamiento de la estenosis por los antagonistas de los receptores de ErbB4 nativos, tal como se define en las reivindicaciones. Aunque la invención no está por ello limitada, en una realización preferida, el antagonista es una inmunoadhesina o una adhesina heteromultimérica quimérica tal como se define en las reivindicaciones. Las inmunoadhesinas (referidas como inmunoglobulinas híbridas), incluyendo su estructura y preparación, se describen, por ejemplo, en la patente internacional WO 91/08298; y en las patentes americanas U.S. 5.428.130 y 5.116.964.

1. Producción de una inmunoadhesina o de una adhesina heteromultimérica quimérica

La descripción de más adelante se relaciona en primer lugar con la producción de una inmunoadhesina mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico de la inmunoadhesina. Desde luego se contempla la posibilidad de utilizar procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la materia en la preparación de la inmunoadhesina. Por ejemplo, la secuencia de inmunoadhesina, o las porciones de lo mismo, pueden producirse mediante síntesis directa utilizando técnicas de fase sólida [véase por ejemplo, Stewart y col., Solid-Phase Peptide Syntehsis, W.H. Freeman co., San Francisco, CA (1969); Merrified, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Diversas porciones de la inmunoadhesina pueden sintetizarse químicamente de forma separada y combinarse utilizando procedimientos enzimáticos o químicos para producir la inmunoadhesina de longitud completa.

El ácido nucleico que codifica un receptor de ErbB4 de secuencia nativa puede, por ejemplo, aislarse de las células conocidas por expresar el receptor de ErbB4, tal como se describe en la patente europea EP 599.274, supra, y en las referencias de Plowman y col., supra, o sintetizarse.

El DNA que codifica las regiones de cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina o es conocido, de fácil disponibilidad a partir de librerías de cDNA o puede sintetizarse. Véase por ejemplo, Adams y col., Biochemistry 19:2711-2719 (1980); Gough y col., Biochemistry 19:2702-2710 (1980): Dolby y col., P.N.A.S. USA 77:6027-6031 (1980); Rice y col., P.N.A.S. USA79:7862-7865 (1982); Falkner y col., Nature 298:286-288 (1982); y Morrison y col., Ann. Rev. Immunol. 2:239-256 (1984).

Una inmunoadhesina o una heteroadhesina quiméricas, tal como se define en las reivindicaciones y se utiliza en la invención, se produce preferentemente por la expresión en una célula huésped y se aísla a partir de ella. Una célula huésped se transforma generalmente con el ácido nucleico de la invención. Preferentemente, el ácido nucleico se incorpora en un vector de expresión. Las células huéspedes adecuadas para el clonaje o la expresión de los vectores aquí son células huésped procariotas (como E. coli, cepas de Bacillus, Pseudomonas y otras bacterias), levaduras y otros microbios eucariotas y células eucariotas superiores (como las células de ovario de hámster chino (CHO) y otras células de mamífero). Las células también pueden estar presentes en animales vivos (por ejemplo, en vacas, cabras u ovejas). También pueden utilizarse células de insecto. Las metodologías de clonaje y expresión son bien conocidas en la materia.

Para obtener la expresión de una inmunoadhesina como una molécula ErbB4-IgG, se introducen uno o más vectores de expresión en las células huésped mediante transformación o transfección y las células huésped recombinantes resultantes se cultivan en medios nutrientes convencionales, modificados adecuadamente para la inducción de promotores, selección de células recombinantes o amplificación del DNA de ErbB4-IgG. En general, los principios, protocoles y técnicas prácticas para la maximización de la productividad de cultivos de células de mamífero in vitro pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed., (IRL Press, 1991).

(i) Construcción del ácido nucleico que codifica la inmunoadhesina

Cuando se preparan las inmunoadhesinas utilizadas en la presente invención, se fusiona preferentemente el ácido nucleico que codifica un domino extracelular de un receptor natural por el extremo C-terminal con un ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal de un dominio constante de una secuencia de inmunoglobulina, sin embargo, también son posibles las fusiones por el extremo N-terminal. Típicamente, en dichas fusiones el polipéptido quimérico codificado retendrá al menos funcionalmente una bisagra activa, los dominios CH2 y CH3 de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan en el extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente por el extremo N-terminal con la cadena pesada CH1 o la región correspondiente de la cadena ligera. La construcción de la fusión del DNA resultante se expresa en las células huéspedes adecuadas.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia aminoacídica de los dominios extracelulares de secuencia nativa (como los de ErbB4) y/o las secuencias del anticuerpo se utilizan para preparar la inmunoadhesina deseada, se preparan mediante diversos procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia aminoacídica que suceden de forma natural, como las mencionadas anteriormente respecto a ErbB4) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida), mutagénesis por PCR, y mutagénesis en casete de una versión de variante o de una no-variante preparada anteriormente de una secuencia de ErbB4 nativa.

Las variantes de secuencia aminoacídica del dominio extracelular de secuencia nativa incluidas en la heteroadhesina quimérica se preparan por introducción de cambios de nucleótidos adecuados en la secuencia de DNA del dominio extracelular nativo, o mediante la síntesis in vitro del polipéptido monomérico de heteroadhesina quimérico deseado. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, las deleciones de, o las inserciones o sustituciones de, residuos en la secuencia aminoacídica de la inmunoadhesina o heteroadhesina quimérica.

Las variaciones en la secuencia nativa tal como se han descrito anteriormente pueden generarse utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadas y no conservadas que se muestran en la Tabla 1.

En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una molécula quimérica en la que la secuencia del dominio extracelular del receptor de ErbB4 se fusiona con la porción del extremo N- o C-terminal de un anticuerpo (el particular el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo IgG1. Es posible fusionar toda la región constante de cadena pesada con la secuencia del dominio extracelular del receptor de ErbB4. Sin embargo, más preferentemente, se utiliza en la fusión una secuencia que se inicia en la región bisagra justo cadena arriba del corte con papaína (que define químicamente IgG Fc; el residuo 216, considerando el primer residuo de la región constante de cadena pesada a 114 [Kobet y col., supra], o sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una realización particularmente preferida, la secuencia del dominio extracelular del receptor de ErbB4 se fusiona con la región bisagara y dominios CH2 y CH3 o CH1, bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG3. El sitio preciso en el cual se realiza la fusión no es crítico, y el sitio óptimo puede determinarse mediante experimentación de rutina.

Para las inmunoadhesinas humanas, es preferible la utilización de secuencias de inmunoglobulina IgG1 e IgG3. Una ventaja principal de la utilización de IgG1 es que las inmunoadhesinas de IgG1 pueden purificarse de forma eficiente sobre proteína A inmovilizada. Por el contrario, la purificación de IgG3 requiere una proteína G, un método significativamente menos versátil. Sin embargo, cuando se elige la pareja de fusión Ig para una construcción de inmunoadhesina particular, deberían considerarse otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas. Por ejemplo, la bisagra de IgG3 es más larga y más flexible, de modo que puede acomodar dominios de "adhesina" mayores que quizás no se plieguen o funcionen adecuadamente cuando se fusionan a IgG1. Otra consideración puede ser la valencia; las inmunoadhesinas de IgG son homodímeros bivalentes, mientras que los subtipos de Ig como IgA e IgM pueden ocasionar estructuras diméricas o pentaméricas, respectivamente, de la unidad de homodímero de Ig básica.

Para las inmunoadhesinas de ErbB4 diseñadas para la aplicación in vivo, las propiedades farmacocinéticas y las funciones efectoras especificadas por la región Fc son también importantes. Aunque IgG1, IgG2 e IgG4 tienen todas una vida media in vivo de 21 días, sus potencias relativas en la activación del sistema del complemento son diferentes. IgG4 no activa el complemento e IgG2 es significativamente más débil en la activación del complemento que IgG1. Además, al contrario que IgG1, IgG2 no se une a los receptores Fc en las células mononucleares o neutrófilos. Mientras que IgG3 es óptima para la aplicación del complemento, su vida media in vivo es aproximadamente un tercio de los otros isotipos Ig.

Otra consideración importante para las inmunoadhesinas diseñadas para su utilización como terapéuticos humanos es el número de variantes alotípicas del isotipo particular. En general, los isotipos IgG con pocos alotipos definidos serológicamente son los preferidos. Por ejemplo, la IgG1 tiene sólo cuatro sitios alotípicos definidos serológicamente, dos de los cuales (G1m y 2) se localizan en la región Fc; y uno de estos sitios G1m1, es no inmunogénico. Por el contrario, existen 12 alotipos definidos serológicamente en IgG3, todos en la región Fc; sólo tres de estos sitios (G3m5, 11 y 21) tienen un halotipo que no es inmunogénico. En consecuencia, la inmunogenicidad potencial de una inmunoadhesina IgG3 es superior que la de una inmunoadhesina IgG1.

Los cDNAs que codifican la secuencia receptora de ErbB4 (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular) y las partes de Ig de la inmunoadhesina se insertan en tandem en un vector plasmídico que dirige la expresión de forma eficiente en las células huéspedes elegidas. Para la expresión en células de mamífero pueden utilizarse, por ejemplo, vectores derivados de pRK5 de [Schall y col., Cell 61, 361-370 (1990)] y vectores derivados de CDM8 [Seed, Nature 329, 840 (1989)]. La unión exacta puede crearse eliminando las secuencias extras entre los codones de unión diseñados utilizando la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos [Zoller y Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); Capon y col., Nature 337, 525-531 (1989)]. Pueden utilizarse oligonucleótidos sintéticos, en los que cada mitad es complementaria de la secuencia a cada lado de la unión; idealmente, éstos son de 36 a 48 mers. Alternativamente, pueden utilizarse técnicas de PCR para unir las dos partes de la molécula en la misma pauta de lectura con un vector adecuado.

Aunque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina no es necesaria en las inmunoadhesinas de la presente invención, una cadena ligera de inmunoglobulina puede estar presente asociada covalentemente a un polipéptido de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina-receptor trk, o directamente al dominio extracelular del receptor trk. En el primer caso, el DNA que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se co-expresa típicamente con el DNA que codifica la proteína de fusión de cadena ligera de inmunoglobulina-receptor de Erbb4. Tras la secreción, la cadena pesada y la cadena ligera híbridas estarán asociadas covalentemente para proporcionar una estructura de tipo inmunoglobulina que comprende dos parejas de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina unidas por dos disulfuros. El procedimiento adecuado para la preparación de dichas estructuras se describe, por ejemplo, en la patente americana US 4.816.567 publicada el 28 de Marzo de 1989.

Otro antagonista del tipo Erbb4 quimérico preferido aquí es una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular, como el monómero de ErbB4, unido a un polipéptido heterólogo, como un dominio de multimerización. Dicha secuencia puede construirse utilizando técnicas del DNA recombinante. Alternativamente, el polipéptido heterólogo puede unirse covalentemente con el polipéptido del dominio extracelular mediante procedimientos bien conocidos en la materia tal como la utilización de reactivos de unión heterobifuncionales. Ejemplos de agentes acoplantes incluyen N-succinidimidil-3-(2-piridititiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (como disuccinimidil suberato), aldehidos (como el glutaraldehido), compuestos bis-azido (como el bis(p-axidobenzoil)hexanediamine), derivados del bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato), y los compuestos de flúor bis-activo (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).

En una realización, un polipéptido de heteroadhesina quimérico comprende una fusión de un monómero de la heteroadhesina quimérica con un polipéptido etiqueta que proporciona un epitopo con el que un anticuerpo anti-etiqueta puede unirse selectivamente. Dichas formas etiquetadas epitópicamente de la heteroadhesina quimérica son de utilidad, al igual que la presencia de lo mismo puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado contra el polipéptido etiqueta. También, proporcionar la etiqueta epitópica permite a la heteroadhesina quimérica purificarse fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando el anticuerpo anti-etiqueta. Los polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la materia. Ejemplos de ello incluyen el polipéptido etiqueta HA y su anticuerpo 12CA5, (Field y col., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165 (1988)); la etiqueta de c-myc y los anticuerpos de lo anterior 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan y col., Molecular and Cellular Biology 5(12):3610-3616 (1985)); y la etiqueta de glicoproteína D del virus Herpes Simplex (gD) y su anticuerpo (Paborsky y col., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)).

Otro tipo de modificación covalente de un heteromultímero quimérico comprende la unión de un polipéptido monomérico del heteromultímero a uno de los muchos polímeros no proteicos, como por ejemplo el polietilén glicol, el polipropilén glicol, los polioxialquilenos, o los copolímeros de polietilén glicol y el polipropilén glicol. Un hetermultímero quimérico también puede encerrarse en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A., Ed., (1980).

(ii) Selección y transformación de células huéspedes

Las células huéspedes se transfectan o transforman con los vectores de expresión o clonaje que se describen aquí para la producción de inmunoadhesina y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea adecuado para la inducción de promotores, selección de transformantes, o amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, como el medio, temperatura, pH y similares, pueden seleccionarse por el experto en la materia sin demasiada experimentación. Por lo general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares puede hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y col., supra.

Los términos "transformación" y "transfección" se utilizan de forma indistinta aquí y hacen referencia al proceso de introducción del DNA en una célula. Después de la transformación o la transfección, el ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma de la célula huésped, o puede existir como un elemento extracromosómico. Los procedimientos de transfección de células eucariotas y de transformación de células procariotas son conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, el CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediado por liposomas y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándares adecuadas a dichas células. El tratamiento con calcio utiliza cloruro cálcico, tal como se describe en Sambrook y col., supra, o la electroporación que se utiliza generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como se describe por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de transfecciones en sistema de células huéspedes de mamífero se han descrito en la patente americana U.S. 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact. 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl.Acad.-si. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para la introducción de DNA en las células, como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos de bacterias con células intactas, o los policationes, por ejemplo, el polibreno, la poliornitina. Para diversas técnicas de transformación de células de mamí-
fero, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336:348-352 (1988).

Las células huéspedes adecuadas para el clonaje o la expresión del DNA en los vectores de la presente invención incluyen las células procariotas, las levaduras, o las eucariotas superiores. Procariotas adecuadas incluyen sin limitarse por ello a éstas a las eubacterias, como los organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, las Enterobacteriáceas como E. coli. Diversas cepas de E. coli están disponibles al público, como E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635). Otras células procariotas huéspedes adecuadas incluyen las Enterobacteriáceas como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en la patente DD 266.710 publicada el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferido porque es una cepa huésped común para la fermentación de productos de DNA recombinantes. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para introducir una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, ejemplos de dichos huéspedes incluyen la cepa W3110 de E. coli 1A2, la cual tiene el genotipo completo tonA; cepa 9E4 de E.coliW3110 con el genotipo tonaA ptr3; cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244) con el genotipo tonA ptr3 phA E15 (argF-lac)169 degP ompT Kan^{r}; cepa 37D6 de E.coliW3110, con el genotipo tonA ptr3 phA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG Kan^{r}; cepa 40B4 de E. coli W3110, que corresponde con la cepa 37D6 con una mutación de deleción degP de resistencia a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la patente americana 4.946.783 publicada el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, los procedimientos in vitro de clonaje, por ejemplo, PCR u otras reacciones de ácido nucleico son los adecuados.

Además de los microbios procariotas, los eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son adecuados para el clonaje o la expresión de huéspedes para vectores que codifican inmunoadhesinas. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior utilizado comúnmente. Otros incluyen Shizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 [1980]; patente europea 139.383 publicada el 2 de Mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente americana 4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) como por ejemplo, K. Lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol., 154(2):737-1742 [1983]), K. fragilis (atcc 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y col., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1998]); Candida; Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis (patente europea EP 394.538, publicada el 31 de Octubre de 1990); y hongos filamentosos como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente internacional WO 91/00357 publicada el 10 de Enero de 1991), y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn y col., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton y col., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (kelly y Hynes, EMBO J 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas aquí e incluyen, pero no se limitan a, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionado del género consistente en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son un ejemplo de esta clase de levaduras puede hallarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Las células huésped para la expresión de inmunoadhsinas de inmunoglobulinas se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamífero incluyen las de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Más ejemplos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humana (células 293 o las 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, Hb 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped adecuada es competencia del experto en la materia.

En general, la elección de una línea de células huéspedes de mamífero para la expresión de inmunoadhesinas ErbB4-IgG depende principalmente del vector de expresión (véase más adelante). Otra consideración es la cantidad de proteína que se requiere. Se producen a menudo cantidades de miligramos mediante transfecciones transitorias. Por ejemplo, la línea celular de riñón embrionario humano 293 transformada con el adenovirus EIA puede transfectarse de forma transitoria con vectores pRK5 mediante una modificación del procedimiento de fosfato cálcico para permitir la expresión de inmunoadhesinas. Los vectores basados en CDM8 pueden utilizarse para transfectar células COS mediante el procedimiento del DEAE-dextrano (Aruffo y col., Cell 61, 1303-1313 (1990)]; Zettmeissi y col., DNA Cell Biol. (US) 9, 347-353 (1990)]. Si se desean cantidades mayores de proteína, la inmunoadhesina puede expresarse después de una transfección estable de una línea de células huéspedes. Por ejemplo, un vector derivado de pRK5 puede introducirse en células de ovario de hámster chino (CHO) en presencia de un plásmido adicional que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) y que confiere resistencia a G418. Los clones resistentes a G418 pueden seleccionarse en cultivo; estos clones se crecen en presencia de niveles crecientes de metotrexato inhibidor de DHFR; los clones se seleccionan, en los cuales se coamplifica el número de copias que codifican las secuencias de DHFR y de la inmunoadhesina. Si la inmunoadhesina contiene una secuencia líder hidrofóbica en su extremo N-terminal, seguramente será procesada y secretada por las células transfectadas. La expresión de inmunoadhesinas con estructuras más complejas puede requerir únicamente células huéspedes adecuadas; por ejemplo, los componentes como la cadena ligera o la cadena J pueden proporcionarse por ciertas células huéspedes de mieloma o hibridomas [Gascoigne y col., 1987, supra; Martin y col., J. Virol. 67, 3561-3568 (1993)].

(iii) Selección y utilización de un vector replicable

El ácido nucleico que codifica la inmunoadhesina puede insertarse en un vector replicable para el clonaje (amplificación del DNA) o para la expresión. Diversos vectores son de disponibilidad pública. El vector puede por ejemplo estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico adecuada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. Por lo general, el DNA se inserta en dianas de endonucleasas de restricción mediante técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector incluyen generalmente, sin limitarse por ello, una o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más marcadores génicos, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia finalizadora de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de ligación estándar que son conocidas por el experto en la materia.

La inmunoadhesina puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene una diana de corte en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. Por lo general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del DNA que codifica la inmunoadhesina que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o los líderes de la enterotoxina II termoestable. Para secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo el líder de la invertasa de levaduras, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes de factore-\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente americana US 5.010.182) o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (patente europea EP 362.179, publicado el 4 de Abril de 1990), o la secuencia señal descrita en la patente internacional WO 90/1346 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, puede utilizarse las secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tal como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma o especies relacionadas, así como líderes secretores virales.

Tanto los vectores de clonaje como los de expresión contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más de las células huéspedes seleccionadas. Dichas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido PBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram negativas, el origen de replicación del plásmido 2\mu es adecuado para levaduras y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus o BPV) son útiles para vectores de clonaje en células de mamífero.

Los vectores de expresión y clonaje contendrán típicamente un gen de selección también denominado un marcador seleccionable. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) presentan deficiencias auxotróficas del complemento, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina de Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico que codifica la inmunoadhesina, como el DHFR o la timidina quinasa. Una célula huésped adecuada si se utiliza el DHFR de tipo silvestre es la línea CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe en Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para utilizar en levaduras es el gen trp1 en el plásmido YRp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7:141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de clonaje y expresión generalmente contienen un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunoadhesina para dirigir la síntesis del mRNA. Son bien conocidos los promotores reconocidos por una gran diversidad de células huéspedes potenciales. Los promotores adecuados para su utilización con células huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa [Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del triptófano (trp) [Goeddel y col., Nucleic Acid Res 8:4057 (1980); patente europea EP 36.776], los promotores híbridos como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas de bacterias también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno unida operativamente al DNA que codifica la inmunoadhesina.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son inducibles con la ventaja adicional de tener una transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones del promotor para la alcohol deshidrogenasa 2, la isocitocromo C y la fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneina, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen además en la patente europea EP 73.657.

La transcripción de inmunoadhesina de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus como el polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK 2.211.504 publicada el 5 de Julio de 1989), el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino (como el virus del sarcoma aviar), el citomegalovirus, el virus de la hepatitis B y el virus Simian-40 (SV40); de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, o promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huéspedes.

La transcripción de un DNA que codifica la inmunoadhesina por eucariotas superiores puede aumentarse gracias a la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos del DNA que actúan en cis, generalmente desde aproximadamente unas 10 a 300 pb, y actúan sobre el promotor aumentando su transcripción. En la actualidad, se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se utilizará un intensificador de un virus de célula eucariota. Ejemplos incluyen el intensificador del SV40 en el sitio tardío del origen de replicación (a 100-270 pb), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma en el sitio tardío del origen de la replicación y los intensificadores de adenovirus. El intensificador puede ayustarse en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia codificante de inmunoadhesina, pero preferentemente se localiza en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias están disponibles generalmente desde las regiones no traducidas en 3' de los DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica la inmunoadhesina.

Otros procedimientos, vectores y células huéspedes adecuadas para la adaptación a la síntesis de inmunoadhesina en el cultivo de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething y col., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281:40-46 (1979); patente europea EP 117.060; y la patente europea EP 117.058.

(iv) Purificación de inmunoadhesina

Una inmunoadhesina o heteroadhesina quimérica se recupera preferentemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse de lisados de células huésped. En una primera etapa, se eliminan los restos particulados, bien sean células huéspedes o fragmentos lisados mediante, por ejemplo, centrifugación o ultracentrifugación; opcionalmente, la proteína puede concentrarse con un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, seguido de la separación de la heteroadhesina quimérica de otras impurezas mediante uno o más procedimientos de purificación seleccionados entre: el fraccionamiento en una columna de inmunoafinidad; el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; el sulfato amónico o la precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice; cromatografía en heparina Sepharose; cromatografía en una resina de intercambio iónico; cromatoenfoque; SDS-PAGE; y filtración en gel.

Un procedimiento particularmente ventajoso de purificación de inmunoadhesinas es la cromatografía por afinidad. La elección de un ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo del dominio Fc de la inmunoglobulina que se utilice en la quimera. La proteína A puede utilizarse para purificar inmunoadhesinas que están basadas en las cadenas pesadas de IgG1, IgG2 o IgG4 humanas [Lindmark y col., J. Immunol. Methd. 62, 1-13 (1983)]. La proteína G se recomienda para isotipos de ratón y para la IgG3 humana [Guss y col., EMBO J5, 1567-1575 (1986)]. La matriz sobre la cual se adhiere el ligando de afinidad es a a menudo la agarosa, pero se pueden utilizar otras matrices. Las matrices estables mecánicamente como las de vidrio de poro controlado o de poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo mayores y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con la agarosa. Las condiciones de unión de una inmunoadhesina a una columna de afinidad con proteína A o G están dictadas en su totalidad por las características del dominio Fc; es decir, es decir su especie e isotipo. Por lo general, si se elige el ligando adecuado, tiene lugar una unión eficiente directamente del fluido del cultivo no condicionado. Una característica diferencial de las inmunoadhesinas es que, para las moléculas de IgG1 humanas, la capacidad de unión para la proteína A a veces está disminuida en relación con un anticuerpo del mismo tipo Fc. La inmunoadhesina unida puede eluirse tanto a pH acídico (igual o inferior a 3), o en un tampón de pH neutro que contenga una sal ligeramente caotrópica. Esta etapa de cromatografía de afinida puede resultar en una preparación de inmunoadhesina con una pureza >95%.

Otros procedimientos conocidos en la materia pueden utilizarse en lugar de, o además de, la cromatografía de afinidad con proteína A o G para purificar inmunoadhesinas. Las inmunoadhesinas presentan un comportamiento similar a los anticuerpos en cromatografía en gel tiofílico [Hutchens y Porath, Anal Biochem 159, 217-226 (1986)] y la cromatografía de resinas quelantes de afinidad por iones metálicos inmovilizados [Al-Mashikhi y Makai, J. Dairy Sci. 71, 1756-1763 (1988)]. Al contrario que los anticuerpos, su comportamiento en columnas de intercambio iónico está dictado no sólo por su punto isoeléctrico, sino también por una carga dipolar que puede existir en la molécula debido a su naturaleza quimérica.

La preparación de la inmunoadhesina etiquetada epitópicamente, como ErbB4-IgG, facilita la purificación con una columna de inmunoafinidad que contenga un anticuerpo contra el epitopo para adsorber el polipéptido de fusión. Las columnas de inmunoafinidad como la columna de anticuerpo policlonal anti-ErbB4 de conejo pueden utilizarse para absorber la ErbB4-IgG por la unión con un epitope inmune de Erbb4.

En algunas realizaciones, las quimeras de receptor ErbB4-IgG (inmunoadhesinas) se ensamblan como monómeros, o hetero-, u homo-multímeros, y en particular como dímeros o tetrámeros, esencialmente tal como se ilustra en la patente internacional WO 91/08298. Por lo general, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras de unidades conocidas. Una unidad estructural de 4 cadenas básica es la forma en la que IgG, IgD e IgE existen. Una estructura de 4 unidades se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular superior; IgM existe generalmente como un pentámero de cuatro unidades básicas mantenidas juntas por puentes disulfuro. Ocasionalmente, también existen en forma multimérica en el suero la globulina IgA e IgG. En el caso de multímeros, cada una de las cuatro unidades puede ser idéntica o distinta.

Tal como se indicó anteriormente, las inmunoadhesinas de la presente invención pueden ser biespecíficas, y pueden, por ejemplo, incluir regiones de unión de dos receptores ErbB distintos, al menos uno de los cuales es ErbB4. En consecuencia, las inmunoadhesinas de la presente invención pueden tener especificidades de unión para dos ligandos ErbB4 distintos. Las moléculas biespecíficas, las moléculas triméricas, compuestas de una cadena pesada de anticuerpo quimérico en un brazo y una cadena ligera-cadena pesada de anticuerpo quimérico en el otro brazo de su estructura de tipo anticuerpo son ventajosas, debido a la facilidad de purificación. Al contrario que los cuadromas productores de anticuerpos utilizados tradicionalmente para la producción de inmunoadhesinas biespecíficas, que producen una mezcla de diez tetrámeros, las células transfectadas con el ácido nucleico que codifica las tres cadenas de una estructura de inmunoadhesina trimérica produce una mezcla de tan sólo tres moléculas, y la purificación del producto deseado a partir de dicha mezcla es consiguientemente mucho más fácil.

(v) Caracterización de la inmunoadhesina

Por lo general, los heteromultímeros quiméricos ErbB4 de la invención tendrán uno o más de las siguientes propiedades: (a) la capacidad para competir con un receptor heteromultimérico natural por la unión a un ligando como el HB-EGF; (b) la capacidad para formar complejos ErbB2-IgG/ErbB4-IgG; y (c) la capacidad para inhibir la activación de un receptor heteromultimérico natural mediante el agotamiento del ligando del entorno del receptor natural, y en consecuencia la inhibición de la proliferación de células que expresan el receptor ErbB2 y el ErbB4.

El cribado por la propiedad de (a) capacidad de la adhesina heteromultimérica de ErbB4 quimérica para unirse a un ligando puede determinarse fácilmente in vitro. Por ejemplo, pueden generarse formas de inmunoadhesina de estos receptores y la heteroinmunoadhesina ErbB3/4-Ig puede inmovilizarse en una fase sólida (por ejemplo, en placas de ensayo recubiertas con anticuerpo anti-humano de cabra). Para más detalles, véase el ensayo de unión HRF-I^{125} descrito en el Ejemplo de más adelante.

Referente a la propiedad (c), el ensayo de fosforilación de tirosinas con células MCF7 proporciona un medio de cribado para la activación de receptores de ErbB4. En una realización preferida de la invención, puede utilizarse el ELISA-KIRA descrito en la patente internacional WO 95/14930 para cuantificar cuantitativa y cualitativamente la capacidad de una heteroadhesina quimérica HER4 para inhibir la activación de un receptor HER4.

La capacidad de una inmunoadhesina, heteroadhesina quimérica como la ErbB2/4-Ig, u otra molécula de la presente invención para inhibir la proliferación de una célula que expresa el receptor ErbB2 y ErbB4 se determina fácilmente en el cultivo de células mediante procedimientos estándares. Las células de utilidad para este experimento incluyen las células MCF7 y las SK-BR-3 obtenibles del ATCC y las células de Schwann (véase por ejemplo, LI y col., J. Neuroscience 16(6):2012-2019 (1996)). Estas líneas de células tumorales pueden sembrarse en placas de cultivo de células y dejar que se adhieran a éstas. Se añade el ligando de HRG en presencia y ausencia de un antagonista de ErbB4 como la heteroadhesina quimérica de Erbb4. Las monocapas se lavan y se tiñen/fijan con cristal violeta y se cuantifica la inhibición del crecimiento celular.

2. Preparación de anticuerpos

Otra clase preferida de antagonistas de ErbB4 comprende los anticuerpos neutralizantes de este receptor.

Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden generarse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples. Puede ser de utilidad conjugar el agente inmunizante con una proteína inmunogénica en el mamífero a inmunizar, como por ejemplo la seroalbúmina, o el inhibidor de la tripsina de soja. Ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse incluyen el adyuvante completo de Freund y el MPL-TDM.

(ii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden generarse utilizando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature; 256:495 (1975), o pueden generarse por procedimientos del DNA recombinantes (patente americana U.S. 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped adecuado, como el hámster o el mono macaco, tal como se describió más arriba, para generar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada en la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan con las células del mieloma mediante un agente de fusión adecuado, como el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, [Academic Press, 1986]).

Las células de hibridoma se siembran y crecen en un medio adecuado de cultivo que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o impiden la supervivencia de las no fusionadas, células parentales de mieloma. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la transferasa hipoxantina guanina fosforibosil (HGPT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente la hipoxantina, la aminopterina y la timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan una producción de alto rendimiento y estable del anticuerpo por las células productoras del anticuerpo y son sensibles a un medio como medio HAT. Entre éstas, las preferidas son las líneas celulares de mieloma murino, como las derivadas de los tumores de ratón MOP-21 y MC-11 disponibles por el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA y las células SP-2 o X63-Ag-653 disponibles del American Type Culture Collection, Roxckville, Maryland USA. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma murino-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, [1987]).

El medio de cultivo en el que las células de hibridoma crecen se analiza para determinar el nivel de producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por análisis de Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la deseada especificidad, afinidad y/o actividad, las células pueden subclonarse por dilución limitada y crecerse por procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo para este propósito incluye, por ejemplo, DMEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecerse in vivo como tumores de ascitas en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitas o del suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como, por ejemplo, Sepharose-proteína A, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en los vectores de expresión, los cuales se transfectan en células huésped como las células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. El DNA también puede modificarse, por ejemplo, colocando la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y cadena murinos en lugar de los homólogos humanos, Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 (1984), o mediante la unión covalente con la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o una parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. De esta manera, se preparan los anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-receptor ErbB4 de la presente invención.

Típicamente dichos polipéptidos no-inmunglobulínico se sustituyen por los dominios de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación antigénica de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación antigénica que tiene la especificidad para un receptor ErbB4 y otro sitio de combinación antigénica que tiene la especificidad para un antígeno distinto.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se preparan in vitro mediante procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden generarse mediante una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y la 4-mercaptobutirimidato.

La producción recombinante de anticuerpos se describirá con mayor detalle más adelante.

(iii) Anticuerpos humanizados

Por lo general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos introducidos en él de una fuente no humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos son a menudo referidos como residuos "de importación", los cuales se obtienen generalmente de un dominio variable "de importación". La humanización puede realizarse esencialmente según el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante sustitución de las secuencias CDR de un anticuerpo humano por las correspondientes de roedores.

Según ello, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly, supra) en donde esencialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos en sitios análogos de anticuerpos de roedores.

Es importante que los anticuerpos a humanizar retengan una alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr dicho objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y de diversos productos humanizados conceptuales mediante la utilización de tres modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los tres modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están disponibles comúnmente y son bien conocidos por los expertos en la materia. Los programas informáticos que ilustran y ofrecen estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas configuraciones permite el análisis de la función posible de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno. De esta forma, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de una secuencia consenso y de importación para lograr la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad aumentada por el antígeno(s) diana. Por lo general, los residuos CDR están directa y más esencialmente implicados en influenciar la unión con el antígeno. Para mayores detalles, véase la patente americana U.S. 5.821.337.

(iv) Anticuerpos humanos

Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por el procedimiento del hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales se han descrito, por ejemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984), y Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

En la actualidad es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos después de un estímulo con el antígeno. Véase, por ejemplo Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-2555 (1993); Kakobovits y col., Nature 362, 255-258 (1993).

Mendez y col., (Nature Genetics 15:146-156 [1997]) mejoraron la tecnología y generaron una línea de ratones trangénicos denominada "Xenoratón II" que, cuando al ser estimulada con un antígeno genera anticuerpos completamente humanos de afinidad alta. Ello se logró mediante integración en línea germinal de loci de cadena pesada y cadena ligera humanas en ratones con deleción en el segmento J_{H} endógeno tal como se describió anteriormente. El Xenoratón II tiene 1.020 Kb del locus de cadena pesada humana que contiene aproximadamente 66 genes VH, regiones DH y JH completas y tres regiones constantes distintas (\mu, \delta y \chi), y también tiene 800 Kb del locus humano \kappa que contiene 32 genes V\kappa, segmentos J\kappa y genes C\kappa. Los anticuerpos producidos en estos ratones son estrechamente parecidos a los humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento génico, y el repertorio. Los anticuerpos humanos se expresan preferentemente sobre los anticuerpos endógenos debido a la deleción del segmento endógeno JH que evita las reordenaciones en el locus murino.

Alternativamente, la tecnología de expresión en fagos (McCafferty y col., Nature 348, 52-553 [1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en la misma pauta de lectura que un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como el M13 o el fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fágica. Debido a que las partículas filamentosas contienen una copia del DNA de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que expresa dichas propiedades. Por ello, el fago mimetiza algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fagos puede realizarse de muchas formas; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Es posible utilizar varias fuentes de segmentos de genes V para la expresión en fagos. Clackon y col., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron una serie de anticuerpos anti-oxaxolone de una librería combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivados del bazo de ratones inmunizados. Es posible construir un repertorio de genes V de donantes humanos inmunizados y aislar los anticuerpos contra diversas series de antígenos (incluyendo auto-antígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks y col., J. Mol. 222, 581-597 (1991), o Girffiths y col., EMBO J 12, 725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, las mutaciones de genes de anticuerpos acumulan mutaciones a una tasa elevada (hiper mutaciones somáticas). Algunos de los cambios introducidos les conferirán afinidad superior, y las células B que expresen inmunoglobulina de alta afinidad en la superficie se replicará preferencialmente y se diferenciará durante el estímulo antigénico consiguiente. Este proceso natural puede mimetizarse utilizando la técnica conocida como "barajamiento de cadenas" (Marks y col., Bio/Technol. 10, 779-783 [1992]). En este procedimiento, la capacidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos de la expresión en fagos puede mejorarse reemplazando secuencialmente los genes de la región V de cadena pesada y cadena ligera con repertorios de variantes naturales de genes de dominio C de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en un rango nM. Una estrategia para realizar repertorios muy amplios de anticuerpos de fagos (también conocida como "la madre de todas las librerías") se ha descrito por Waterhouse y col., Nucl. Acids. Res. 21, 2265-2266 (1993), y el aislamiento de un anticuerpo humano de alta afinidad directamente de una librería grande de fagos se ha reportado por Griffiths y col., EMBO J. 13:3245-3260 (1994). El barajamiento de genes también puede utilizarse para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos de roedor, si el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares con el anticuerpo de roedor de inicio. De acuerdo con este procedimiento, que también es referido como "impronta epitópica", el gen del dominio V de cadena pesada o ligera de los anticuerpos de roedor obtenido por la técnica de la expresión en fagos se reemplaza por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando así quimeras roedor-humanas. La selección del antígeno resulta en el aislamiento de dominios variables capaces de restaurar un sitio funcional de unión al antígeno, es decir, el epitopo dirige (marca con una impronta) la elección de la pareja. Cuando el proceso se repite con el fin de reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la patente internacional WO 93/06213), publicada el 1 de Abril de 1993). Al contrario que con la humanización tradicional de anticuerpos de roedor por injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de entramado o CDR de origen de roedor.

(v) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, los anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos distintos. En el caso presente, una de las especificidades de unión es para que el receptor ErbB4 proporcione un anticuerpo antagonista, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para otro receptor o subunidad de receptor.

Los procedimientos para anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia. Tradicionalmente, la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos parejas de cadena pesada-ligera de inmunoglobulina, y en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades distintas (Millstein y Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Debido al reordenamiento aleatorio de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es a veces engorrosa, y los rendimiento de producto son pobres. Procedimientos similares se describen en la patente internacional WO 93/08829 (publicada el 13 de Mayo de 1993), y en Traunecker y col., EMBO 10, 3655-3659 (1991).

De acuerdo con una aproximación distinta y más preferida, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación antígeno-anticuerpo) se fusionan con las secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos en parte la bisagra, las regiones CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en organismos huéspedes adecuados. Esto proporciona una gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones con proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción que proporciona rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para las dos o tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión si la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en igual proporción produce rendimientos superiores o si las proporciones no son importantes. En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadenas pesada-ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha hallado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina, al igual que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo la mitad de la molécula biespecífica proporciona una vía fácil de separación.

Para más detalles de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).

(vi) Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados se hallan también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, que dichos anticuerpos dirigen las células del sistema inmune contra células no deseadas (patente americana US 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (patentes internacionales WO 91/00360 y WO 92/200373; patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden generarse mediante la utilización de cualquier procedimiento de unión convencional. Los agentes de unión adecuados son bien conocidos en la materia, y se describen en la patente americana U.S. 4.676.980, junto con numerosas técnicas de unión.

(vii) Fragmentos de anticuerpos

En ciertas realizaciones, el anticuerpo antagonista de ErbB4 (incluyendo los anticuerpos murinos, humanos y los humanizados, y las variantes de anticuerpo) es un fragmento de anticuerpo. Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase por ejemplo, Morimoto y col., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse directamente por las células huéspedes recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y unirse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')2 se forma utilizando la cremallera de leucina GCN4 para facilitar el ensamblamiento de la molécula F(ab')2. De acuerdo con otra aproximación, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de células huéspedes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes al experto en la materia.

(viii) Variantes de secuencia aminoacídica de anticuerpos

Las variantes de secuencia aminoacídica de los anticuerpos antagonistas de ErbB4 se prepararon introduciendo los cambios nucleotídicos en el DNA del anticuerpo antagonista de ErbB4, o mediante síntesis de péptidos. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias aminoacídicas de los anticuerpos antagonistas de Erbb4 de los ejemplos que se muestran aquí. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se realiza para lograr la construcción final, siempre que ésta posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos del anticuerpo antagonista del ErbB4 humanizado o variante, tal como el cambio del número y posición de sitios de glicosilación.

Un procedimiento de utilidad para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo del receptor de ErbB4 que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por cribado de alaninas", tal como se describe por Cunnigham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para modificar la interacción de los aminoácidos con el antígeno del receptor ERbB4. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran una sensibilidad funcional con las sustituciones se reajustan introduciendo posteriormente otras variantes en los sitios de sustitución. En consecuencia, mientras el sitio para introducir una variación de secuencia aminoacídica se predetermina, la naturaleza de la mutación, per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar la realización de una mutación en un sitio dado, se realiza un cribado por ala o una mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se criban variantes del anticuerpo ErbB4 expresado por su actividad deseada.

Las inserciones de secuencia aminoacídica incluyen fusiones amino- y/o carboxi-terminales que se hallan en el intervalo de longitudes desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencias de uno o múltiples residuos aminoacídicos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo antagonista de ErbB4 con un residuo metionil N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta epitópica. Otras variantes insercionales de la molécula del anticuerpo antagonista de ErbB4 incluyen la fusión con el extremo C- o N-terminal del anticuerpo antagonista de ErbB4 de una enzima o un polipéptido que aumente la vida media en el suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoacídico eliminado en la molécula del anticuerpo antagonista de ErbB4 y un residuo distinto insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, los cambios más esenciales se muestran en la Tabla 1 como "ejemplos de sustituciones", o como se describen más adelante en referencia a clases de aminoácidos, pueden introducirse y a continuación es posible cribar el producto.

TABLA 1

1

Las modificaciones esenciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran mediante selección de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o en hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren de forma natural se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de las cadenas laterales.

(1)

hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofóbicos neutros: cys, ser, thr;

(3)

acídicos: asp, glu;

(4)

básicos: asn; gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influencian la orientación de la cadena lateral: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras implican el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo cisteína no implicado en el mantenimiento de la propia conformación del anticuerpo antagonista de ErbB4 también puede sustituirse por generalmente una serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la unión aberrante. De forma inversa, pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como por ejemplo un fragmento V).

Un tipo especialmente preferido de variante de sustitución implica la sustitución de una o más regiones hipervariables de un anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). Por lo general, las variantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas relativas al anticuerpo parental del cual se han generado. Un procedimiento conveniente para generar dichas variantes de sustitución es la maduración de la afinidad mediante la expresión en fagos. En resumen, se mutan varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones aminoacídicas posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se muestran de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III del M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes expresadas en fagos se criban a continuación por su actividad biológica (por ejemplo, actividad antagonista), tal como se describe aquí. Con el fin de identificar los sitios de regiones hipervariables candidatos para su modificación, puede realizarse la mutagénesis de cribado por alanina para identificar residuos de regiones hipervariables que contribuyan de forma significativa a la unión del antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el receptor de ErbB4. Dichos residuos de contacto y los residuos colindantes son los candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas aquí. Se genera una de tales variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe aquí y a continuación pueden seleccionarse los anticuerpos con propiedades superiores demostradas en uno o más ensayos para su posterior desarrollo.

Otro tipo de variante aminoacídica del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alteración se quiere significar la deleción de una o más porciones de carbohidratos hallados en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de anticuerpos es típicamente N- u O-glicosilación. La N-glicosilación hace referencia a la unión de una porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparraguina-X-serina y asparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimáticamente de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de asparraguina. Por ello, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La O-glicosilación hace referencia a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente la serina o treonina, aunque también pueden utilizarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra de forma conveniente alterando la secuencia aminoacídica de modo que contenga una o más secuencias tripeptídicas de las descritas anteriormente (para los sitios de N-glicosilación). La alteración puede también realizarse por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de O-glicosilación).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia aminoacídica de los anticuerpos antagonistas de ErbB4 se prepararon mediante diversos procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, sin limitarse por ello, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia aminoacídica naturales) o la preparación por mutagénesis mediada (o dirigida) por oligonucleótidos, la mutagénesis por PCR y la mutagénesis en casete de una variante preparada anteriormente o de una versión del anticuerpo antagonista de ErbB4.

(ix) Otras modificaciones de anticuerpos

Los anticuerpos antagonistas de ErbB4 descritos aquí también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se prepararon por procedimientos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y la patente americana U.S. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un tiempo de circulación aumentado se describen en la patente americana U.S. 5.013.556.

En particular, los liposomas útiles pueden generarse por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende la fosfatidilcolina, el colesterol y la fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de poro definido para conseguir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas tal como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (como la Doxorubicina) se halla por lo general dentro de los liposomas. Véase Gabizon y col., J.NationalCancer Inst. 81 (19):1484 (1989).

El anticuerpo utilizado en la presente invención también puede utilizarse en ADEPT mediante conjugación del anticuerpo con una enzima activadora del profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidil, véase la patente internacional WO81/01145) en un fármaco anti-canceroso activo. Véase, por ejemplo, la patente internacional WO 88/07378 y la patente americana U.S. 4.975.278.

El componente enzimático del inmunoconjugado de utilidad para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco para convertirlo en fármaco más activo, forma citotóxica.

Las enzimas que se utilizan en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la fosfatasa alcalina de utilidad para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; la arilsulfatasa de utilidad para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; la desaminasa citosina de utilidad para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer,5-fluorouracil; las proteasas, como la proteasa de serratia, la termolisina, la subtilina, las carboxipeptidasas y las catepsinas (como las catepsinas B y L), que son útiles para lo profármacos que contienen péptidos conversores en fármacos libres; la D-alanilcarboxipeptidasas, de utilidad para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que hidrolizan carbohidratos como la galactosidasa y la neuraminidasa de utilidad para convertir los profármacos glicosilados en fármacos libres; la -lactamasa de utilidad para convertir fármacos derivados con -lactamas en fármacos libres; y las amidasas de penicilina, como la penicilina V amidasa o la penicilina G amidasa, de utilidad para convertir fármacos modificados en sus nitrógenos del grupo amino con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la materia como "abzimas", pueden utilizarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos libres activos (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse tal como se describió aquí para la liberación de la abzima en una población de células tumorales.

Las enzimas utilizadas en la presente invención pueden unirse covalentemente con los anticuerpos antagonistas de ErbB4 mediante técnicas bien conocidas en la materia como la utilización de reactivos de unión heterobifuncionales que se trataron más arriba. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención unido al menos a una porción de una enzima de la invención puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Neuberger y col., Nature 312:604-608 [1984]).

En algunas realizaciones de la invención, puede ser deseable la utilización de un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su vida media en el suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante incorporación de un epitopo de unión de tipo silvestre en el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, mediante mutación de la región adecuada en el fragmento de anticuerpo o mediante incorporación del epitopo en una etiqueta epitópica que se fusiona a continuación con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el medio, por ejemplo, mediante síntesis de DNA o peptídica). Véase la patente internacional WO96/32478 publicada el 17 de Octubre de 1996.

El epitopo de unión al receptor de tipo silvestre constituye por lo general una región en donde cualquier residuo de aminoácido de uno o más bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Aún más preferentemente, se transfieren tres o más residuos de uno o más bucles del dominio Fc. Todavía más preferentemente, el epitopo se obtiene del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3, o VH, o más de una de tales regiones, del anticuerpo. Alternativamente, el epitopo se obtiene del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

Las modificaciones covalentes de los anticuerpos antagonistas de ErbB4 también se incluyen dentro del ámbito de la invención. Ello puede lograrse mediante síntesis química o mediante hidrólisis enzimática o química del antibiótico, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula mediante reacción de los residuos de aminoácidos de anticuerpo con un agente modificador orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales. Ejemplos de modificaciones covalentes de polipéptidos se describen en la patente americana U.S. 5.534.615, específicamente incorporada aquí en la referencias. Una modificación de tipo covalente preferida del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de entre los muy variados polímeros no proteicos existentes, por ejemplo, polietilén glicol, polipropilén glicol, o polioxialquilenos, en la forma indicada en las patentes americanas U.S 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; o 4.179.337.

3. Preparación de receptores ErbB4 solubles

Los receptores de ErbB4 solubles, como el dominio extracelular de ErbB4, pueden prepararse mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico codificante. Desde luego, los procedimientos alternativos que se contemplan, que son bien conocidos en la materia, pueden utilizarse para preparar dichos receptores solubles. Por ejemplo, la secuencia del receptor soluble, o las porciones de lo mismo, pueden producirse mediante síntesis directa utilizando técnicas de fase sólida (véase por ejemplo, Stewart y col., supra; y Merrifield, supra). La síntesis de proteínas in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, con un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Diversas porciones del receptor soluble pueden sintetizarse químicamente por separado y combinadas con procedimientos químicos o enzimáticos para producir el receptor soluble de tamaño completo.

La producción recombinante de receptores de ErbB4 solubles se realiza esencialmente tal como se describió anteriormente en relación con las inmunoadhesinas.

El procedimiento más conveniente para la producción a gran escala de receptores de ErbB4 se realiza por corte a partir de una inmunoadhesina ErbB4-Ig. La similitud estructural entre inmunoadhesinas y anticuerpos sugiere que es posible cortar las inmunoadhesinas por enzimas proteolíticos como la papaína, para generar fragmentos de tipo Fd que contienen la porción "adhesina". Con el fin de proporcionar una aproximación más genérica para el corte de inmunoadhesinas, se utilizan proteasas que son altamente específicas para su secuencia diana. Una proteasa adecuada para este propósito es un mutante diseñado a partir de la subtilisina BPN, que reconoce y corta la secuencia AAHYTL. La introducción de esta secuencia diana en la región bisagra soporte de una inmunoadhesina ErbB4-IgG (por ejemplo IgG1) facilita el corte altamente específico entre los dominios Fc y trk. La inmunoadhesina IgG1 se purifica por cromatografía de proteína A y se corta con una forma inmovilizada de la enzima. El corte da como resultado dos productos: la región Fc y la región ErbB4, que es preferentemente un dominio extracelular de ErbB4. Estos fragmentos pueden separarse fácilmente mediante un segundo pasaje por una columna de proteína A para retener el Fc y obtener el fragmento de ErbB4 purificado en las fracciones eluídas. Puede utilizarse una aproximación similar para generar una porción de ErbB4 dimérica colocando la secuencia factible de ser cortada en la bisagra inferior.

4. Composiciones y utilizaciones terapéuticas

Los miembros de la familia de receptores ErbB y ligandos correspondientes están implicados en la proliferación de células musculares lisas en diversos órganos. Según ello, un antagonista de receptor ErbB4 puede utilizarse para el tratamiento de diversas "enfermedades o trastornos" que implican la proliferación de células musculares lisas en un mamífero, como el hombre.

En una realización preferida, la presente invención hace referencia a la utilización de antagonistas del receptor ErbB4 tal como se define en las reivindicaciones para el tratamiento de la estenosis, como la estenosis vascular, la restenosis que se produce de una angioplastia o cirugía o implantes de endoprótesis cardiovasculares, la aterosclerosis y la hipertensión (revisado en Casterella y Teirstenin, Cardiol. Rev. 7:219-231 [1999]; Andres, Int. J.Mol Med 2:81-89 [1998]; y Rosanio y col., Thromb. Haemost. 82 [suppl 1]:164-170 [1999]). Existe una interacción complicada entre diversas células y citoquinas liberadas que actúan de forma autocrina, paracrina o yuxtacrina, que da como resultado la migración de CMLV desde su localización normal en la media a la íntima lesionada. Las células CMLV que han proliferado excesivamente conducen a un engrosamiento de la íntima, lo que provoca la estenosis o la oclusión de los vasos sanguíneos. El problema se agrava por la agregación plaquetaria y la deposición en el sitio de la lesión. La \alpha-trombina, una serin proteasa multifuncional se concentra en el sitio de la lesión vascular y estimula la proliferación de CMLV. Después de la activación de este receptor, las CMLV producen y secretan diversos factores autocrinos, incluyendo el PDGF-AA, HB-EGF y TGF-\beta (revisado en Stouffer y Runge, Semin. Thromb. Hemost. 24:145-150 [1998]).

Diversos miembros de la familia del EGF desempeñan papeles importantes en el crecimiento normal y mantenimiento de los vasos sanguíneos, así como en las condiciones patológicas. Por ejemplo, el factor de crecimiento de tipo EGF de unión a heparina es un mitógeno potente y un factor quimiotáctico para los fibroblastos, así como las CMLV y no las células endoteliales (revisado en Raab y Klagsbrun, Biochim. Biophys. Acta 1333:F179-199 [1997]). El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un factor angiogénico potente, induce la expresión de las células endoteliales vasculares HB-EGF (Arkonac y col., J. Biol. Chem. 273:4400-4405 [1998]). El HB-EGF se une a y activa los receptores HER1 y ErbB4 iniciando una cascada de transducción de señal que por último provoca la migración y proliferación de fibroblastos y de CMLV. El HB-EGF también estimula las CMLV para secretar diversos factores que son mitogénicos para las células endoteliales (Abramovicht y col., FEBS Lett. 425:441-447 [1998]). Además, también induce la respuesta quimiotáctica en las células endoteliales. De forma similar, otro ligando que activa los receptores de EGF, la epiregulina, se secreta por las células CMLV estimuladas por angiotensina II, endotelina-1 y trombina, y actúa también como un mitógeno potente para la proliferación de CMLV (Taylor y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1633-1638 [1999]).

La estenosis vascular conduce a la hipertensión como resultado de una resistencia aumentada al flujo sanguíneo. Además, una disminución en el aporte de flujo sanguíneo puede causar necrosis e inducir la respuesta inflamatoria que conduce a una lesión severa. Por ejemplo, el infarto de miocardio tiene lugar como resultado de la falta de oxígeno y la muerte local de los tejidos del músculo cardiaco. La angioplastia coronaria (PTCA), referida simplemente como una angioplastia de balón, es un tratamiento basado en el cateterismo no quirúrgico para la enfermedad oclusiva de las arterias coronarias. En este procedimiento, se introduce un catéter en el vaso sanguíneo y se infla un balón en el lugar de la placa con el fin de desplazar mecánicamente la placa. Alternativamente, la endoprótesis cardiovascular se implanta para restaurar el flujo sanguíneo sin estorbos. Sin embargo, la formación de neoíntima tiene lugar aún dentro del implante de la endoprótesis cardiovascular, conocido como "restenosis de endoprótesis". Por ejemplo, el despligue de la endoprótesis cardiovascular da como resultado la pronta deposición de un trombo y la inflamación aguda, el desarrollo del tejido de granulación, y por último la proliferación de células musculares lisas y la síntesis extracelular de matriz (revisado en Virmani y Farb, Curr. Opin. Lipidol. 10:499-506 [1999]). La cirugía de bypass se realiza sorteando el vaso sanguíneo afecto únicamente en casos graves, y generalmente sólo después de que múltiples series de angioplastia han fallado en la restauración del flujo sanguíneo.

\newpage

Aunque la angioplastia de balón se ha utilizado ampliamente para el tratamiento de la estenosis, su éxito a largo plazo está limitado por la restenosis. La restenosis persiste como el factor limitante en el mantenimiento de la apertura del diámetro vascular después de una PTCA, lo que ocurre en el 30-50% de los pacientes y siendo responsable de la morbilidad significativa y del gasto consecuente en salud pública. Los mecanismos subyacentes de la restenosis están compuestos de una combinación de efectos de retroceso vascular, remodelaje vascular negativo, formación de trombo e hiperplasia de neoíntima. A destacar que estos eventos están interconectados. Por ejemplo, la hiperplasia de neoíntima se estimula mediante factores de crecimiento, que se liberan por los trombos locales y el propio segmento arterial lesionado, y actúan para intensificar la expresión de otras proteínas estimulantes del crecimiento en las respuestas proliferativas e inflamatorias. Por ejemplo, la lesión endotelial induce la expresión del EGF y factores del tipo EGF y del EGFR en las CMLV, que actúan tras su estimulación de forma autocrina para inducir su proliferación que conduce al engrosamiento de la íntima y la restenosis. La formación de matriz extracelular (ECM) y la acumulación en la pared del vaso es otro componente importante de la lesión de restenosis que se desarrolla después de la angioplastia de balón.

Se han realizado múltiples ensayos farmacológicos en un intento de prevenir la restenosis, pero la mayoría han sido poco beneficiosos. Los ensayos clínicos iniciales en la prevención de la restenosis con diversos dispositivos de revascularización, fármacos anti-plaquetas, fármacos anti-trombóticos fueron en su mayoría negativos (revisado en Casterella y Teirstein, Cardiol. Rev. 7:219-231 [1999]; Andres, Int. J. Mol. Med. 2:81-89 [1998]; y Rosanio y col., Thrmob. Haemost. 82 [suppl 1]:164-170 [1990]). A pesar de todos los progresos recientes, aún no existe un tratamiento satisfactorio o de prevención de la restenosis después de una angioplastia de balón o de una implantación de endoprótesis cardiovascular. Aunque se ha logrado un éxito limitado en ensayos pequeños y aleatorios, la estenosis, y particularmente la restenosis, continúa siendo el principal problema clínico. La presente invención describe la utilización de antagonistas del receptor ErbB4 para el tratamiento de la estenosis o restenosis mediante el control de la proliferación de células musculares lisas vasculares.

La estenosis pilórica hipertrófica infantil (EPHS) es una enfermedad relativamente común que afecta principalmente a los niños pequeños. La estenosis subyacente causa la obstrucción funcional del canal pilórico. En consecuencia, el llenado gástrico de leche se ve gravemente alterado. La EPHS implica la hipertrofia y la hiperplasia de la masa de músculo liso pilórico y resulta en la estenosis pilórica (Oue y Puri, Pediatr. Res. 45:853-857 [1997]). Además, se ha reportado la expresión aumentada de EGF, receptor de EGF y HB-EGF en CMLC en el músculo circular y longitudinal pilórico de pacientes con EPHS en comparación con tejidos controles (Shima y col., Pediatr. Res. 47:201-207 [2000]). Los antagonistas de ErbB4 descritos aquí pueden hallar una utilización en el control de la proliferación de las células musculares lisas pilóricas y en consecuencia en el tratamiento de la estenosis pilórica.

La naturaleza contráctil de células musculares lisas y la regulación de su contracción por factores diversos desempeñan un papel crucial en el sistema recolector urinario que incluye la vejiga, los uréteres y la uretra. Una forma precursora unida a membrana de HB-EGF se expresa en las células musculares lisas de la vejiga urinaria y en las células epiteliales (Freeman y col., J. Clin. Invest. 99:1028-1036 [199]; Kaefer y col., J. Urol. 163:580-584 [2000]). Además, el tratamiento de las células CMLV de la vejiga con la toxina de la difteria, conocida por utilizar el HB-EGF unido a membrana como un receptor, inhibe su proliferación (Kaefer y col., ibid). HB-EGF es un potente mitógeno para la proliferación de CMLV de la vejiga, y actúa uniéndose a receptores ERbB1 (HER1) que se expresan por estas células; y de esta manera actúa como un factor de crecimiento autocrino (Borer y col., Lab Invest 79:1335-1345 [1999]). Los autores también han demostrado la expresión de los receptores de ErbB2 y ErbB3 pero no de ErbB4 en las CMLV. Estos hallazgos plantean la posibilidad de que HB-EGF desempeña un papel en el engrosamiento de la pared de la vejiga que tiene lugar en respuesta a los síndromes oclusivos que afectan el tracto urinario inferior. En consecuencia, los antagonistas de ErbB4 de la presente invención, en particular la inmunoadhesina de ErbB4, pueden tener una utilidad en el control de la proliferación de las células musculares lisas de la vejiga, y en consecuencia en la prevención o el tratamiento de los síndromes oclusivos urinarios.

Las enfermedades respiratorias oclusivas son otro grupo de enfermedades con patología subyacente que implica la proliferación de las células musculares lisas. Un ejemplo de este grupo es el asma que se manifiesta en la inflamación de vías respiratorias y en la broncoconstricción. Se ha demostrado que el EGF estimula la proliferación de las CMLV y es probablemente uno de los factores implicados en la proliferación patológica de las CMLV respiratorias en las enfermedades respiratorias oclusivas (Cerutis y col., Am. J. Physiol. 273:L10-15 [1997]; Cohen y col., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 16:85-90 [1997]). Según ello, los antagonistas de ErbB4 de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de las enfermedades respiratorias oclusivas.

Existen dos aproximaciones importantes para introducir el ácido nucleico (contenido opcionalmente en un vector) en las células del paciente: in vivo y ex vivo. Para la liberación in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, generalmente en el sitio donde la heteroadhesina quimérica se requiere. Para el tratamiento ex vivo, se obtienen las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, la patente americana U.S. 4.892.538 y 5.283.187).

Existe una diversidad de técnicas disponibles para la introducción de ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas varían dependiendo que el ácido nucleico se transfiera in vitro a las células cultivadas o in vivo en las células del huésped. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en las células de mamífero in vitro incluyen la utilización de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, el DEAE-dextrano, el procedimiento de la precipitación con fosfato de calcio, etc.

Un vector utilizado comúnmente para la liberación in vivo del gen es un retrovirus. Las técnicas de transferencia in vivo de ácido nucleico preferidas incluyen la transfección con vectores virales (como el adenovirus, el virus Herpes simplex I, o el adenovirus asociado) y los sistemas basados en lípidos (de utilidad para la transferencia de genes son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que se dirige a las células diana, como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie o la célula diana, un ligando para un receptor de la célula diana, etc. Si se utilizan liposomas, las proteínas que se unen a la proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis pueden utilizarse para dirigir y/o facilitar la incorporación, por ejemplo de proteínas de cápside o de fragmentos de lo mismo trópicos para un tipo de célula específico, los anticuerpos para proteínas que llevan a cabo la internalización durante el ciclo, y las proteínas que están dirigidas a una localización intracelular e incrementan la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu y col., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); y Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:3410-3414 (1990). Para una revisión actual de los protocoles de terapia génica y marcado de genes véase Anderson y col., Science 256:808-813 (1992). Véase también la patente internacional WO 93/25673 y las referencias citadas aquí.

Las formulaciones terapéuticas se prepararon para el almacenamiento mediante mezcla del antagonista de ErbB4 con el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables fisiológicamente opcionales (Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A., Ed., (1980)), en la forma de una pasta liofilizada o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables farmacéuticamente no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones como fosfatos, citratos y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos); proteínas como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina; la arginina o la lisina; los monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, manosa o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y/o tensoactivos no iónicos como el Tween, el Pluronics, o el polietilén glicol (PEG).

Un anticuerpo o una inmunoadhesina a utilizar para la administración in vivo debe ser estéril. Ello se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. La formulación generalmente se guardará en una forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas se colocan generalmente en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración del anticuerpo, inmunoadhesina o heteroadhesina quimérica está de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenidos tal como se indica más abajo. La heteroadhesina o anticuerpo se administra de forma continua mediante infusión o por inyección de bolo.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, cuyas matrices son artículos de formas determinadas, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal como se describe por Langer y col., J. Biomed Mater Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem.Tech., 12:98-105 (1982) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919, patente europea EP 58.481), o copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22:547-556 (1983), etilén-vinil acetato no degradable (langer y col., supra), copolímeros de ácido láctico-glicocólico degradables como el Lupron Depot (microsferas inyectables compuestas del copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (patente europea EP 133.988).

El antagonista de ErbB4 de liberación prolongada también incluye el fármaco encerrado en liposomas. Los liposomas que contienen el antagonista de ErbB4 se preparan por procedimientos conocidos per se: Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); patente europea EP 36.676; patente europea EP 88.046; patente europea 143.949; patente europea EP 142.641; patente japonesa 83-118008; patentes americanas US 4.485.045 y 4.544.545; y patente europea EP 102.324. Por lo general los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente de unos 200-800 Angstroms) en los que el contenido lipídico es superior a aproximadamente 30 mol% de colesterol, la proporción seleccionada se ajusta para una terapia óptima. Es posible generar liposomas de particular interés por el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprenda la fosfatidilcolina, el colesterol y la fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido con el diámetro deseado. Un agente quimioterapéutico (como la Doxorubicina) está contenido opcionalmente dentro de los liposomas. Véase Gabizon y col., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).

El antagonista de ErbB4 utilizado en la invención y definido en las reivindicaciones puede utilizarse para unir y secuestrar el ligando de ErbB4 o bloquear el receptor Erbb4 con lo que se inhibe la activación de ErbB4 en la célula y por tanto la proliferación celular. El antagonista de ErbB4 de la invención puede administrarse a un paciente junto con otra terapia como un agente quimioterapéutico. Las pautas de preparación y dosificación para cada uno de los agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o determinarse empíricamente por el trabajador especializado. Las pautas de preparación y dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Williams, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder, o proseguir a la administración del antagonista o puede administrarse simultáneamente.

Una cantidad efectiva de antagonista a utilizar terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y del estado del paciente. Según ello, será necesario para el terapeuta el titular la dosificación y modificar la vía de administración requerida para obtener el efecto terapéutico máximo. Una dosificación típica puede hallarse en el intervalo de 1 g/Kg hasta 10 mg/Kg de peso corporal del paciente, preferentemente de hasta 10 g/Kg a 10 mg/Kg. Típicamente, el clínico administrará el antagonista hasta alcanzar la dosis que logre el efecto deseado para el tratamiento de los trastornos mencionados anteriormente.

5. Procedimientos para la identificación de moléculas que inhiben o intensifican la proliferación o migración de células musculares

Se describe un procedimiento de cribado para identificar moléculas que pueden inhibir o intensificar la proliferación de células musculares lisas. Por ejemplo, una molécula candidata se incuba con un polipéptido que comprende el dominio extracelular de un receptor ErbB4, seguido de la adición a un cultivo de células musculares lisas y la determinación del efecto sobre la proliferación de las células. El receptor ErbB4 puede ser un receptor ErbB4 nativo como un receptor ErbB4 humano, o puede ser un polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 85% con la secuencia aminoacídica de un receptor ErbB4 nativo. La proliferación celular puede monitorizarse y cuantificarse de muy diversas formas. Por ejemplo, la incorporación de timidina-H^{3} en el DNA es un procedimiento bien establecido para monitorizar la síntesis de DNA indicativa de la proliferación celular. La incorporación de timidina-H^{3} en el DNA se monitoriza bien microscópicamente mediante contaje del número de granos de plata en una autorradiografía o bioquímicamente mediante contaje del líquido de centelleo. De modo similar, la incorporación de 5-bromo 2'-desoxiuridina (BRdU) en el DNA celular puede monitorizarse bien microscópica o inmunológicamente. Ambos ensayos utilizan los anticuerpos monoclonales específicos que reconocen el BrdU incorporado en el DNA. En el ensayo microscópico, las células se permeabilizan, reaccionan con anticuerpos monoclonales específicos anti-BrdU seguido del anticuerpo secundario seleccionado. Los anticuerpos secundarios se detectan gracias a un marcaje unido como un colorante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, Texas Red, etc.) o un marcaje enzimático (fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, etc.). A continuación, puede utilizarse un sustrato adecuado que produce un producto insoluble tras la acción enzimática para revelar y cuantificar los anticuerpos secundarios marcados enzimáticamente. Un ensayo enzimático monitoriza la cantidad de anticuerpos monoclonales específicos para BrdU mediante un inmunoensayo adecuado como un ELISA. Los anticuerpos monoclonales específicos para BrdU así como también los equipos ELISA que contienen dichos anticuerpos están disponibles comercialmente a partir de un número de fuentes que incluyen Boehringer Mannheim. Un citómetro de flujo también puede utilizarse para monitorizar la proliferación celular. En este procedimiento, las células se fraccionan según el contenido en DNA nuclear por célula. Ya que el contenido de DNA nuclear varía entre las células que están en división dependiendo de la fase en que se hallen del ciclo celular (2n en fase G1, 4n en fase G2+M y valores intermedios en fase S, en donde n es el valor del contenido de DNA de un núcleo haploide), la proliferación celular puede monitorizarse rápidamente mediante estimulación de la fracción de células en fases S y G2+M utilizando esta aproximación.

La proliferación dependiente de ErbB4 de las células musculares lisas implica la vía de transducción de señal mediada por ligando que utiliza el receptor ErbB4, cualquier etapa en esta vía puede monitorizarse y utilizarse como una medida de la proliferación celular. Dicha etapa es una autofosforilación de tirosina inducida por ligando del receptor de ErbB4, que puede monitorizarse por el ensayo de activación de receptor quinasa (KIRA) tal como se describe en la patente internacional WO95/14930. Este ensayo ELISA es adecuado para la medición cuantitativa o cualitativa de la activación de la quinasa mediante la cuantificación de la autofosforilación del dominio quinasa de un receptor tirosina quinasa como el ErbB4. El primer paso del ensayo implica la fosforilación del dominio quinasa del receptor ErbB4 presente en la membrana celular de una célula muscular lisa, una primera fase sólida (por ejemplo, un pocillo de una primera placa de ensayo) se recubre con una población esencialmente homogénea de células musculares lisas. Al ser las células adherentes, las células musculares lisas se adhieren de forma natural a la primera fase sólida. También es posible transfectar células musculares lisas con una "construcción del receptor" que comprende una fusión de un receptor quinasa y un polipéptido marcador. Los anticuerpos específicos para los polipéptidos marcadores se utilizan en el ELISA del ensayo para capturar el receptor con el péptido marcador. A continuación se añade una molécula candidata y un polipéptido que comprende el dominio extracelular de un receptor nativo ErbB4 a los pocillos que contienen las células musculares lisas, seguido de la monitorización de la autofosforilación de tirosina del receptor de ErbB4 por el ensayo KIRA. En el ensayo, también puede utilizarse un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica del dominio extracelular del receptor ErbB4. Después de la exposición, las células del músculo liso se solubilizan utilizando un tampón de lisis (que tiene un detergente solubilizante incorporado) y se agita suavemente, con lo que se libera el lisado celular que a continuación puede someterse al ELISA del ensayo directamente, sin necesidad de concentrar o clarificar el lisado celular.

El lisado celular así preparado se somete a la segunda etapa (ELISA) del ensayo. Al igual que en la primera etapa del paso ELISA, se recubre una segunda fase sólida (generalmente un pocillo de una placa de microtitulación ELISA) con un agente de captura (a menudo un anticuerpo de captura) que se une específicamente al receptor ErbB4 o, en el caso de una construcción de receptor, al polipéptido marcador. El recubrimiento de la segunda fase sólida se lleva a cabo de modo que el agente se adhiere a la segunda fase sólida. El agente de captura es por lo general un anticuerpo monoclonal, aunque también pueden utilizarse anticuerpos policlonales. El lisado celular obtenido se expone a continuación a, o se contacta con, el agente de captura adherente para que el receptor o la construcción del receptor se adhieran a (o se capturen en) la segunda fase sólida. Se lleva a cabo una etapa de lavado, para eliminar el lisado celular no unido, dejando capturado el receptor o la construcción de receptor. El receptor o construcción de receptor adherido o capturado se expone a continuación a, o se contacta con, un anticuerpo anti-fosfotirosina que identifica los residuos de tirosina fosforilados en el receptor de tirosina quinasa. En la realización preferida, el anticuerpo anti-fosfotirosina se conjuga (directa o indirectamente) a una enzima que cataliza un cambio de color de un reactivo de color no radioactivo. Según ello, la fosforilación del receptor puede cuantificarse por el cambio de color consiguiente del reactivo. La enzima puede unirse al anticuerpo anti-fosfotirosina directamente, o puede conjugarse con un anticuerpo anti-fosfotirosina una molécula específica (por ejemplo la biotina) y la enzima puede unirse a continuación con el anticuerpo anti-fosfotirosina mediante la molécula de conjugación. Por último, se cuantifica la unión del anticuerpo anti-fosfotirosina con el receptor o la construcción de receptor, por ejemplo, mediante un cambio de color en el reactivo. Los anticuerpos anti-fosfotirosina que están disponibles comercialmente pueden utilizarse para el ensayo.

Se describe un procedimiento de cribado de moléculas que pueden inhibir o aumentar la migración de células musculares lisas. Uno de los formatos utiliza cámaras de cultivo celular compartimentadas para quimiotaxis, como las cámaras de quimiotaxis de Neuroprobe ChemoTX disponibles por Neuroprobe Inc., Gatithersburg, MD. En este procedimiento, un filtro poroso separa las células musculares lisas en la cámara superior de un medio que contiene un quimioatrayente (por ejemplo la trombina) en la cámara inferior. Las células musculares lisas se incuban con una molécula candidata y un polipéptido que comprende el dominio extracelular de un receptor ErbB4. Al cabo del período de incubación, los filtros se tiñen y las células que han migrado a la parte inferior del filtro se cuentan con el microscopio invertido.

Para el propósito de cribado, es posible utilizar una librería convencional o una librería combinatoria de compuestos químicos. Una aproximación automatizada adapatada para alto rendimiento puede utilizarse de forma conveniente para el ensayo. Sin embargo, los ensayos de cribado no se restringen únicamente a moléculas pequeñas, incluso las macromoléculas como los anticuerpos pueden utilizarse para el cribado.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación. Así mismo, los ejemplos se ofrecen para proporcionar a los expertos en la materia una descripción completa de cómo realizar y utilizar los compuestos, composiciones y procedimientos de la invención, sin pretender limitar el ámbito de la invención tal como la han concebido los inventores. Se ha tenido especial interés en asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo en cantidades, temperatura, etc.), aunque es posible considerar que algunos errores experimentales y desviaciones puedan haberse incluido. Excepto que se especifique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura está en grados Celsis (C), y la presión corresponde a la atmosférica o cercana a ella.

Ejemplo 1 Construcción, aislamiento y caracterización bioquímica de inmunoadhesinas y quimeras de inmunoadhesinas heteromultiméricas

En un plásmido que expresa la cadena pesada de IgG (pDR, cedido por J. Ridgeway y P. Carter, Genentech, Inc.) se incluyó una diana única Mlu I en la región que codifica el dominio bisagra de la inmunoglobulina. Así mismo se incluyeron dianas Mlu I en plásmidos de expresión ErB4 en la región que codifica las uniones ECD/TM de estos receptores. Toda la mutagénesis se realizó según el procedimiento de Kunkel (Kunkerl; T., Proc. Acad. Sci. U.S.A. 82:488 (1985)). Las dianas Mlu I se utilizaron para realizar la fusión de construcciones ErB4-IgG. Para la obtención de la quimera ErB-IgG que se utilizó el puente de unión: G^{640}_{Erb84}-(TR)-DKTH^{224}_{VH}, con la numeración de los aminoácidos para el polipéptido ErbB4 descrita en Plowman y col. (Plowman, D. y col., (1993ª) PNAS USA 90:1746-1750)). La secuencia conservada TR se obtuvo con la diana Mlu I. La secuencia de la región Fc utilizada para preparar la fusión de las construcciones se encuentra en Ellison, J.W. y col. (Ellison, J.W. y col. (1982) NAR 10:4071-4079). La expresión final de las construcciones se realizó en el armazón de un plásmido de tipo pRK en el que la expresión eucariota está dirigida por un promotor CMV (Gorman y col., DNA Port. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)).

La obtención de proteína para los experimentos in vitro se realizó transfectando células adherentes HEK-293 (ATCC No. CRL-1573) con un plásmido de expresión mediante el procedimiento estándar del fosfato cálcico (Gorman y col., supra y Huang y col., Nucleic Acids Res. 18:937-947 (1990)). El medio con suero se reemplazó por medio sin suero a las 15 horas posteriores a la transfección y las células transfectadas se incubaron durante 5,7 días. Se recogió el medio condicionado resultante y se pasó por columnas de Proteína A (1 ml Pharmacia HiTrap). Las fusiones de IgG purificadas se eluyeron con ácido cítrico 0,1 M (pH 4,2) en tubos que contenían 1 M Tris a pH 9,0. Las proteínas eluídas se dializaron subsiguientemente contra PBS y se concentraron en un filtro Centricon-30 (Amicon). A continuación se añadió glicerol hasta una concentración final del 25% y el material se guardó a -20ºC. La concentración del material se determinó con un Fc-ELISA.

Ensayo de unión con HRG-I^{125}

El dominio de HRG 1_{(177-244)} de tipo EGF se expresó en E.coli, se purificó y marcó radioactivamente tal como se había descrito previamente (Sliwkowski, M. y col., J.Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994). La secuencia completa de rHRG 1 que se expresó en células de ovario de hámster chino se utilizó en el análisis por transferencia de Western. Los ensayos de unión se realizaron en placas de Inmuno-módulos BreApart de Nunc. Las placas se recubrieron con 100 \mul de anticuerpo de cabra anti-humano (Boehringer Mannheim) a una concentración de 5 g/ml en tampón carbonato 50 mM (pH 9,6) durante toda la noche a 4ºC. A continuación se lavaron dos veces con 200 \mul de tampón de lavado (PBS/Tween20 al 0,05%) seguido por una breve incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 \mul de 1% BSA en PBS. Se extrajo el tampón y se incubó cada pocillo con 100 \mul de proteína IgG de fusión en 1% BSA/PBS con agitación lateral vigorosa durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con el tampón de lavado y se llevó a cabo la unión competitiva por la adición de varias cantidades de competidor frío -HRG y ^{125}I-HRG 1 e incubación a temperatura ambiente durante 2-3 horas con agitación vigorosa. Se lavaron cuidadosamente los pocillos tres veces con tampón de lavado, se secaron y se contaron de forma individual en un contador 100 Series Iso Data. El análisis de Scatchard se realizó en el programa Ligand modificado (Muson, P. y Robard, D. (1980) Analytical Biochemistry 107:220-239).

Ensayo de incorporación de Timidina^{H3}

Los ensayos de incorporación de timidina tritiada se realizaron en un formato de placa de 96 pocillos. Las células MCF-7 se sembraron a razón de 10.000 células/pocillo en 50:50 F12/DMEM (concentración alta de glucosa) en suero bovino fetal al 0,1% (100 \mul). Las células se dejaron asentar durante 3 horas y a continuación se añadieron a los pocillos las proteínas de fusión ErB4-IgG y/o heregulina (en un volumen final de 200 \mul) y las placas se incubaron durante 14 horas en un incubador de tejidos a 37ºC. La timidina tritiada se añadió a los pocillos (20 \mul de un dilución 1/20 de timidina tritiada de Amersham TRA 120 B363, 1 mCi/ml) y se incubaron las placas durante 3 horas adicionales. El material tritiado se recuperó en filtros GF/C (formato para 96 pocillos) utilizando un extractor Packard Filtermate 196. Los filtros se contaron mediante un contador Packard Topcount.

Ejemplo 2 Efecto de la inmunoadhesina ErbB4-IgG en la proliferación de células musculares lisas de aorta humana

Las células musculares lisas de aorta humana (Clonetics) se sembraron a un 50% de confluencia (a una densidad de 5000 células/pocillo) en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos y se incubaron toda la noche en medio SM2 (Clonetics). Al día siguiente, el medio se cambió por M199 suplementado con ITS (1X), glutamina 2 mM, ácido ascórbico 50 \mug/, NaHCO_{3} 26,5 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100U/ml y 0,1% (v/v) de suero bovino fetal. Las células se incubaron durante 16 horas adicionales. Seguidamente se trataron tanto con Her4-IgG (400 nM) como con tampón durante 1 h., seguido por tratamiento con PDGF (100 ng/ml) durante 40 h. Las células control se dejaron sin tratar para estimar el nivel basal de crecimiento celular. Se añadió una alícuota de BrdU (10 \mul/pocillo de una solución de 10 \muM de 5-bromo 2'-deoxiuridina preparada en PBS) y se incubaron las células durante 2 h adicionales. La proliferación celular se controló mediante la cuantificación de la incorporación de BrdU con un ensayo de ELISA para BrdU (Equipo para Proliferación Celular de Boehringer Mannheim, Catálogo No. 1 647 229) siguiendo las instrucciones del fabricante para células adherentes.

Como se muestra en la Figura 5. El PDGF estimuló el crecimiento de las células musculares lisas de aorta en concordancia con anteriores trabajos (Ross y col., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 12: 155-169 [1990]). El pretratamiento de las células con la inmunoadhesina ErbB4-IgG redujo el aumento de la proliferación celular debida a PDGF. Las células control tratadas con un tampón en lugar de con ErbB4-IgG no mostraron ningún efecto significativo en la proliferación celular. Estos datos indicaron que al menos parte de la respuesta mitótica de las células musculares lisas es mediada por la activación del receptor de ErB4, y la eliminación de los ligandos que podrían activar el receptor de ErbB4 así como la presencia de la inmunoadhesina ErbB4 reducen en las células musculares lisas la estimulación de la proliferación debida a PDGF.

Ejemplo 3 Efecto de la inmunoadhesina ErbB4-IgG en la migración de las células musculares lisas de aorta humana

Las células musculares lisas de aorta humana se tripsinizaron y resuspendieron a una concentración de 5 X 10^{5} células por ml en DME con SBF al 10%. Las células se pre-incubaron con Her4-IgG (400 nM) o tampón durante 15 min. Los pocillos inferiores de las cámaras para quimiotaxis ChemoTX (Neuroprobe Inc., Cat 116-8) se llenaron con 300 \mul de una solución de 2 U/ml de trombina humana o tampón (PBS) como control negativo. Se montó un filtro en la parte superior de la cámara y las células musculares lisas (con tampón o tratadas con ErbB4) se añadieron a la parte superior de los pocillos en un volumen de 50 \mul. La placa y el filtro se recubrieron con una tapa de plástico clara y se incubaron durante 3 h a 37ºC en aire humidificado con CO_{2} al 5%. Al final de la incubación, los filtros se extrajeron y la cara superior se limpió con una punta Q para extraer cualquier célula remanente. Los filtros se tiñeron con solución de Diff-Quick y las células que habían migrado a la parte inferior del filtro se contaron con la ayuda de un microscopio invertido de contraste de fases. Se contaron seis pocillos para cada condición y 40 campos en cada pocillo.

Como se muestra en la Figura 6, la trombina actuó como un estímulo quimiotáctico y indujo la migración de las células musculares lisas de aorta. La inmunoadhesina ErbB4-IgG inhibió la migración celular estimulada por la trobina. Estos datos indican que al menos parte de la capacidad de la trombina para estimular la migración de las células musculares es mediada por la liberación de ligandos para el receptor ErbB4, y que la extracción de estos ligando con la inmunoadhesina ErbB4 reduce la respuesta quimiotática de la trombina.

Ejemplo 4 Producción y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-ErbB4 Generación de Mabs anti-ErbB4

Se produjo un panel de anticuerpos monoclonales murinos que se unían específicamente con el dominio extracelular de ErbB4, mediante tecnología convencional de hibridoma (Tabla 2). Se extrajo RNA total de células MDA-MB-453 y se utilizó como molde en la reacción de RT-PCR para la generación de la secuencia codificadora del dominio extracelular (ECD) de ErbB4 humano. Los oligonucleótidos específicos utilizados en las reacciones de RT-PCR se sintetizaron tomando como base el DNA de ErbB4. Se construyó una proteína de fusión gDErbB4 ECD por ligación de las secuencias codificadoras para los aminoácidos 1-52 de la glicoproteína D del virus herpes simplex tipo 1 con las secuencias codificadas por los aminoácidos 26-640 del ErB4 humano. El cDNA gDErbB4 ECD se insertó en el vector de expresión pRK5 9, derivado del citomegalovirus. Esta construcción se transfectó de forma trasiente a células humanas embrionarias de riñón 239 mediante un protocolo estándar de precipitación con fosfato cálcico.

Se preparó a continuación una columna de afinidad por acoplamiento de un anti-gD monoclonal 5B6 a Sefarosa CNBR (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden). El sobrenadante de células transfectadas 293 con gDErbB4 ECD se concentró entre 20-40 veces con membranas ym30 (Amicon, Beverly MA) y se cargó en una resina de afinidad. Las columna se lavó con PBS y el receptor se eluyó con ácido acético 100 mM/NaCl 500 mM pH 2,4. El tampón de ErbB4 ECD se cambió por PBS y se concentró. La concentración de proteína se determinó según su OD_{280}.

Se inmunizaron ratones Balb/c con aproximadamente de 5. g de ErbB4 ECD en RIBI MPL + TDM + CWS (RIBI ImmmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) en las almohadillas de sus patas traseras en las semanas 0, 1, 2, y 3. Los ratones inmunizados se examinaron en un ELISA según su respuesta a anticuerpos. A los ratones con los mayores títulos se les suministró 5 g. adicionales de ErbB4 ECD en RIBI durante la semana 4. Tres días más tarde, los linfocitos de los nódulos popliteal e inguinal se unieron con la línea de mieloma X63-Ag8.653. Las células fusionadas se plantaron a una densidad de 200.000 células por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y la selección del hibridoma con medio suplementado HAT (Sigma, St. Louis, MO) empezó en un día posterior a la fusión. Empezando en el día 10, los sobrenadantes del hibridoma se analizaron según la presencia de anticuerpos específicos ErB4 mediante el ensayo de captura radioactivo descrito más abajo. Los clones con producción estable de anticuerpos se obtuvieron por dilución limitada y se produjeron grandes cantidades de Mabs específicos en ascitas. Los anticuerpos se purificaron en columna de proteína A-Sefarosa (Fermentech, Inc., Edinburgh, Scotland) y se almacenaron en PBS estéril a 4ºC.

En el ensayo de captura radioactivo, módulos de Immuno-Maxisorp BreakApart (Nunc, Roshilde, Denmark) se recubrieron con 100 \mul (2 g/ml) de cabra anti-ratón IgG (Boehringer Mannheim) toda la noche a 4ºC. Los placas se lavaron con PBS/Tween20 0,5% (PBST), se bloquearon con el diluyente del ELISA (PBS/Tween20 0,5%) y se incubaron con sobrenadantes monoclonales durante 2 h. a temperatura ambiente. A continuación las placas, se lavaron y se incubaron otra hora adicional con 40.000 cuentas/pocillo de [^{125}I]ErbB4 ECD. Después del lavado, la cantidad de ErbB4 unido a los anticuerpos se determinó por contaje de los pocillos en un Gamma-Master Wallac 1277 (Wallac Inc, Gaithersburg, MD).

Los 34 anticuerpos monoclonales anti-ErB4 producidos por este método (Tabla 2) tienen una alta afinidad por el receptor, exhiben una alta diversidad de isotipos y se dirigen contra 18 epítopos distintos en el ErbB4 ECD. Los isotipos de los anticuerpos se determinaron utilizando un equipo para isotipado Mouse MonoAb ID/SP de Zymed (so. San Francisco, CA), según las instrucciones suministradas por el fabricante.

Examen de la especificidad de los anticuerpos anti-ErbB4

La especificidad de los Mabs se determinó en un ELISA que mide la capacidad de unión a HER2 inmobilizado, a HER3 y a los dominios extracelulares ErbB4 (aminoácidos 1-645, 1-617 y 1-640 respectivamente). Se recubrieron placas de ELISA con ECDs a una concentración de 1 g/ml y se incubaron con Mabs anti-ErbB4 biotinilados. Los Mabs unidos se detectaron mediante estreptavidina conjugada con peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO) y el substrato OPD (Sigma, St. Louis, MO). Tal como puede verse en la Tabla 2 casi todos los anticuerpos producidos resultaron altamente específicos para ErbB4 (indicado por un "4" en la columna rotulada como "Especificidad"). Cuatro de los anticuerpos mostraron alguna unión a HER3 (indicado por un "3" en la columna rotulada como "Especificidad").

Mapeo y caracterización de epitopos

El epitopo ErbB4 unido por cada anticuerpo monoclonal se determinó por análisis de la unión competitiva (Frendly y col., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)). Los Mabs anti-ErbB4 se diluyeron hasta una concentración de 25 mg/ml en diluyente de ELISA y 50 \mul se añadieron una placa de ELISA previamente recubierta con gDErbB4 ECD como arriba. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y se lavaron con PBST. Se prepararon las diluciones de los anticuerpos anti-ErB4 biotinilados en un rango de 1:1.000 a 1:10.000 y se añadieron 50 \mul a la placa de ensayo. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas y se añadieron 50 \mul de una dilución 1:5000 de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Sigma). Finalmente se revelaron las placas con ODP (Sigma). Los Mabs anti-ErbB4 se agruparon según sus epitopos en función de su capacidad para bloquear la unión de otros en un 50% o más en comparación con un Mab control irrelevante. El mapeo relativo de epitopos identificó 17 epitopos distintos identificados en la Tabla 2 de A-Q.

Posteriormente se investigaron las actividades de nueve anticuerpos representativos.

TABLA 2 Resumen de monoclonales anti-ErbB4

4

Determinación de la afinidad de unión

Las afinidades relativas de los Mabs anti-ErbB4 se determinaron de acuerdo con el método descrito por Friguet y col. (J. Immunol Methods. 77(2):305-19 (1985)). Se mezclaron varias concentraciones de ErbB4 ECD (1,1 X 10^{-7} M hasta 1,08 X 10^{-10} M) con una concentración constante de Mab anti-ErbB4 (2,08 X 10^{-10} M) y se incubaron toda la noche a 4ºC. Seguido a la incubación, los Mabs libres se examinaron por la adición de 100 \mul de mezcla de reacción en duplicado a placas de microtitulación (Nunc) previamente recubiertas con gDErbB4 ECD (100 \mul/pocillo a una concentración de 1 g/ml en tampón carbonato 0,05 M pH 9,6 durante 16 horas a 4ºC) y incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado con PBST, los Mabs unidos se detectaron añadiendo 100 \mul/pocillo de una dilución 1:5000 de F(ab')_{2} cabra anti-ratón con peroxidasa (Boehringer Mannheim) durante una hora a temperatura ambiente. El revelado de las placas se realizó con el substrato dihidrocloruro de o-fenilén diamina (OPD, Sigma, St. Louis, MO) y se leyeron en un lector de placas.

Todos los Mabs mostraron una gran afinidad de unión, con un Kd en el intervalo de 0,4 a 12 nm tal como se presenta en la Tabla 3.

Inmunotransferencia en condiciones no reductoras

Se examinó la capacidad de los Mabs anti-ErbB4 para unirse a ErbB4 ECD reducidos y no reducidos por análisis en inmunotransferencia. Se añadió ErbB4 ECD al tampón de muestras con glicina, con y sin BME, y se aplicó a un gel de tricina al 10-20% de Novex (Novez, San Diego, CA). El gel se corrió a 100 V y se electroblotó durante 60 min. con un amp 0,5 amp en una membrana de PVDF, Immobilon P (Millipore, Bedford MA). La membrana se lavó con PBST y se bloqueó toda la noche con PBS/0,5%/BSA/Tween20 0,1% y se incubó con 1 g/ml de anticuerpo monoclonal durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La membrana se lavó y se incubó durante una hora adicional con una dilución de 1:10000 de IgG de rata anti-ratón combinado con peroxidasa (Boehringer Mannheim). La membrana se lavó cuidadosamente y se reveló con el sistema quimioluminiscente de Amersham ECL (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights III).

Ninguno de los Mabs resultó capaz de reconocer a los ErbB4 ECD reducidos (los datos no se muestran), sugiriendo que estaban dirigidos a epitopos conformacionales. Los Mabs identificados como positivos en la Tabla 3 son aquellos capaces de reconocer bajas concentraciones de ErbB4 ECD no reducidas. Los Mabs 4-1459, 4-1460, 4-1461, 4-1462, 4-1492 y 4-1497 demostraron un alto nivel de immunoreactividad y resultaron capaces de unir ErbB4 ECD no reducido a niveles inferiores a 0,3 ng.

Inhibición de la unión a HRG

La línea celular K562 no expresa ningún receptor del tipo similar a EGFR y se utilizó para mejor caracterización de los anticuerpos monoclonales anti-ErbB4. La línea celular K562 se transfectó con ErbB4 (1E10.1H4) y se cultivó en RPMI 1640 con L-glutamina 2 mM (GIBCO/BRL), SBF 10% (Hyclone) y 800 g/ml Geneticina G418 (Gibco/BRL). Al menos 20 horas previas al ensayo, 1E10.1H4, se estimularon con 10 nm forbol-12-miristate, 13-acetato (PMA, Calbiochem, La Jolla CA9. A continuación, se evaluaron los Mabs anti-ErbB4 según su capacidad para bloquear la unión de HRG a esta línea celular.

Muestras cuadruplicadas que contenían 1,0 X 10^{5} células K562 ErbB4 resuspendidas en 200 \mul de RPMI 1640 con 10 mM HEPES y BSA 0.1% (tampón de unión) se incubaron con 132 pM [^{125}I]HRG 1 (177-244), en presencia de 100 nM de Mabs anti-ErbB4, toda la noche en hielo. Después de la incubación, las células se recogieron utilizando un dispositivo para filtración Multiscreen (Millipore) y se lavaron dos veces con 200 \mul de tampón de unión enfriado en hielo. Las cuentas asociadas a las células se midieron en un contador gamma. El porcentaje de unión se calculó respecto a una muestra control que no contenía Mab. La unión no específica se determinó por la incubación de una muestra en presencia de 500 nM de HRG1 _{(177-244)} frío. Los Mabs se consideraron positivos para el bloqueo de HRG si bloquearon la unión en un 90% o más. Tal como puede verse en la Tabla 3, seis de los nueve anticuerpos anti-ErbB4 examinados resultaron capaces de inhibir la unión de ^{125}I-HRG. Los Mab 4-1461 inhibieron la unión en un 7% y en el 4-1459 no exhibió bloqueo de HRG. El Mab anti-ErbB4 4-1497 no inhibió la unión sino que aparentemente aumentó la unión de HRG en un 26%.

Inhibición de la unión de HRG en líneas celulares humanas de cáncer de mama

Como un cierto número de Mabs anti-ErbB4 bloquearon la unión de HRG a células transfectadas K562, se ensayó su capacidad de bloqueo de la unión de HRG a algunas líneas celulares de carcinoma mamario humano. Las líneas celulares MDA-MB-453, T47D y BT474 (ATCC, Rockville, MD) se sembraron en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de 1 X 10^{5} células por pocillo y se dejaron adherir durante toda la noche. Los Mabs anti-ErbB4 o Mabs control anti-HER-2 2C4 y 4D5 se diluyeron hasta una concentración de 100 nM en Ham's F-12 y medio Dulbecco-Eagle modificado (1:1 v/v) más HEPES 10 mM y BSA 0,1% (tampón de unión) y se añadió en triplicado. Después de 30 minutos de incubación en hielo, se añadieron 1,5 X 10^{5} cuentas de [^{125}I]HRG 1_{(144-277)}. Las placas se incubaron en hielo durante cuatro horas y se lavaron dos veces con tampón de unión enfriado en hielo. Las células se solubilizaron con urea 8 M/ácido acético 3 M y las cuentas asociadas a las células se midieron en un GammaMaster Wallac 1277. El porcentaje de unión se calculó como se ha indicado más arriba. La unión no específica se determinó por incubación de una muestra en presencia de 100 nM HRG _{1(144-277}) frío.

Ninguno de los Mabs anti-ErbB4 causó una inhibición significativa de la unión de 125IHRG a las líneas de carcinoma examinadas. En contraste, Mabs control anti-HER-2, 2C4 y 4D5, bloquearon la unión en un 84% y 29% respectivamente en células MDA-MB-453, 70% y 48% en células T47D y 57% y 12% en células BT474. El control HRG no marcado bloqueó el 99% de la unión en células MDA-MB 453, 98% unión en células T47D y 96% en células BT474 a una concentración de 100 nM. Estos datos sugieren que en estas líneas celulares el receptor ErbB4 puede jugar un papel menor en la mediación de las respuestas HRG.

Inhibición de la fosforilación en tirosinas

Se ha mostrado que las heregulinas inducen la fosforilación de tirosinas del ErbB4. En este sentido, interesó determinar si los Mabs anti-ErbB4 eran capaces de afectar a la fosforilación del receptor estimulada por HRG\beta1_{(177-244)}en la línea celular K562 ErbB4.

La línea celular K562 transfectada con ErbB4 (1E10.1H4) se creció en medio de cultivo RPMI 1640 hasta una densidad de 1 X 10^{6} células/ml. Las células a continuación se cambiaron a medio sin suero sin PMA (tampón de ensayo) y se incubaron a 37ºC durante 2-6 horas. Se lavaron con tampón de ensayo y duplicados que contenían 2,5 X 10^{5} células en tampón de ensayo con BSA 0.1%, se incubaron con 25 ug de Mabs anti-ErbB4 o control Mab durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Después de la incubación, un grupo de muestras se estimularon con HRG 1 _{(177-244)} 15 mM durante 8 minutos a temperatura ambiente. Se extrajeron los sobrenadantes y las células se lisaron durante 5 minutos a 100ºC en 100 \mul de tampón de muestras SDS que contenía 50 \mul/ml \beta-mercaptoetanol. Una alícuota de 30 \mul de cada muestra se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida 4-12% (Novex) y se realizó una electro transferencia a una membrana de PVDF (Millipore). Las membranas se bloquearon con BSA 2% en tampón Tris salino que contenía Tween20 al 0,05% durante toda la noche a 4ºC y se incubaron con una dilución 1:1000 del monoclonal recombinante anti-fosfotirosina peroxidasa RC20H (Transduction Laboratories, Lexington Kentucky) durante 4 horas a temperatura ambiente. El Ab anti-fosfotirosina unido se visualizó mediante el sistema Amersham ECL (Amersham Life Science Inc.) y se cuantificó por densitometría.

Seis de los nueve anticuerpos monoclonales examinados inhibieron la generación de la señal de fosforilación en tirosinas inducida por HRG (Tabla 3). Los tres restantes no resultaron inhibitorios y ninguno de los Mabs anti-ErbB4 resultó capaz de estimular la fosforilación del receptor ErbB4.

Inmunohistoquímica

Puesto que los Mabs anti-ErbB4 pueden ser útiles como reactivos de diagnóstico, se investigó su capacidad para teñir precipitados congelados de células mediante técnicas inmunocitoquímicas estándares. Células K562 transfectadas ErbB4 (1E10.1 H4) y las líneas de carcinoma de mama humano MDA-MB-453, T47D y BT474 (ATCC, Rockville, MD) se precipitaron y congelaron con el compuesto OCT (Miles Inc., Elkhart, IN). Los precipitados congelados se seccionaron en un criostato a un grosor de 5 micras, se montaron en portas, se fijaron en acetona fría (4ºC) durante 3-5 min., y se secaron al aire. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó según una modificación del método de la glucosa oxidasa. Las preparaciones se lavaron con PBS y se bloqueó la actividad biotina endógena con suero normal de caballo al 10% (Vector). Se incubaron las células con 10 g/ml de Mabs anti-ErbB4 durante una hora a RT, seguido por incubación 30 minutos con una IgG biotinilada de caballo anti ratón (Vector) diluída 1:200. Finalmente se incubaron los portaobjetos con el reactivo ABC Elite (Vector) durante 30 min y se revelaron con DAB (Pierce, Rockford, IL). Se utilizó hematoxilina de Mayer (Rowley Biomedical Institute, Rowley, MA) para contrateñir las células.

Bastantes Mabs anti-ErbB4 resultaron capaces de teñir las células K562 transfectadas ErbB4 con una intensidad variable y poco o ningún fondo en la tinción (Tabla 3). Los números representan la intensidad de la tinción en comparación con un control irrelevante. Ninguno de los Mabs tiñó las células del carcinoma de mama humano congelado examinado (los datos no se muestran).

TABLA 3 Resumen de la actividad de los anticuerpos monoclonales

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Análisis por FACS

Para determinar si los Mabs anti-ErbB4 pueden unirse a ErbB4 en la superficie de células viables, se realizó un análisis por FACS con la línea celular K562 transfectada con ErbB4 y las líneas de carcinoma mamario MDA-MB-453, T47D y BT-474. Las células adherentes se desengancharon de las botellas cultivo de tejido mediante EDTA 10 mM en PBS, se centrifugaron a 14000 rpm durante 15 min. y se resuspendieron en PBS con suero bovino fetal 1% (diluyente de FACS). Las células se contaron, ajustaron a 10^{7} células/ml y 0,1 ml de células se incubaron con 10 g/ml de cada Mab en 100 \mul de diluyente de FACS durante 30 min, a 4ºC. Las muestras se lavaron, resuspendieron en 0,1 ml de diluyente y se incubaron con 1 g de FITC conjugado con un fragmento F(ab')_{2} de cabra anti-ratón IgG (Boehringer Mannheim) durante 30 min a 4ºC. Las células se lavaron, resuspendieron en 0,5 ml diluyente de FACS y analizado mediante un separador celular FACScan (Becon Dickinson, Mat. View, CA). Los datos se perfilaron por análisis con el programa que permite la selección de poblaciones de células según diferentes parámetros, una vez teñidas con ioduro de propidio y así e excluyeron los desechos, dobletes o células muertas.

Todos los Mabs se unieron al receptor ErbB4 en la línea cellar K562 transfectada ErB4, que expresó aproximadamente 2 X 10^{5} receptores/célula. Se observó un aumento en la fluorescencia celular, de 2 a 50 veces, en células K562 transfectadas ErbB4 cuando se comparó con isotipos control. Algunas uniones débiles podrían reflejar un epitopo ErbB4 ECD que es secuestrado en las células intactas. En contraste, los anticuerpos anti-ErbB4 4-1440, 4-1464 y 4-1492, que dieron la mayor intensidad de fluorescencia en la línea celular transfectada, mostraron una unión mínima a las células de las líneas celulares de carcinoma de mama MDA-MB-453, T47D y BT-474. El control positivo anti-HER2 Mavb 2-2C4 mostró unión a las líneas tumorales en proporción a la expresión de HER-2. Estos resultados indican a respecto de la expresión de ErbB4 en MDA-MB-453, T47D y BT-474 cual es el límite inferior de detección en este ensayo.

Inhibición de la unión de la Heregulina a la inmunoadhesina ErbB4

La figura 7 muestra un desplazamiento de la curva de unión de ^{125}I HRG a la inmunoadhesina ErbB4 capturada en módulos BreakApart mediante las concentraciones indicadas de anti-ErbB4 Mabs 4-1440, 4-1460, y 4-1464- Los módulos de BreakApart Maxisorb (Nunc) se recubrieron con 100 \mul de una dilución de 1:200 de Ig cabra anti-humano (Boehringer Mannheim) en tampón carbonato 50 mM pH 9,6 toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron con PBST, se bloquearon con diluyente de ELISA y se incubaron con 100 \mul de 200 ng/ml inmunoadhesina ErbB4 durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron en 50 \mul de Mabs diluidos (0,1 hasta 100 nM finales) y se añadió a la placa 50 \mul de 125I-HRG 1 (177-244) diluido hasta una concentración final de 132 pM. A continuación 1,5 hr incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron y la cantidad de ^{125}IHRG unida al receptor se determinó por contaje de los pocillos en un GammaMaster Wallac 1277.

La figura 7 demuestra que los Mabs inhiben la unión de la heregulina a la inmunoadhesina de forma dosis dependiente con valores de ED_{50} en el rango de 0,7 a 1,1 nM. Esto indica que los Mabs poseen un alto grado de capacidad de bloqueo.

Depósito de material

Los siguientes hibridomas han sido depositados en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

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Cada uno de los hibridomas depositados produce uno de los anticuerpos monoclonales anti-ErbB4 identificados en la Tabla 2. HER4. 10H1.1A1 produce mAb 4-1464, HER4.1C6.A11 produce mAb 4-1440, HER4.3B9.2C9 produce mAb 4-1460, HER4.1A6.5B3 produce mAb 4-1492 y HER4.8B1-2H2 produce mAb 4-1473.

El depósito de hibridomas en la ATCC se realizó según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y sus Regulaciones (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo viable en depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. El depósito estará disponible por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech Inc., y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público bajo expedición de la patente americana pertinente o tras poner a disposición pública de cualquier solicitud de patente U.S. o extranjera, cualquiera que sea la primera, y asegurar la disponibilidad de la progenie por la persona determinada por el Comisionado U.S. de Patentes y Marcas Registradas de acuerdo con la norma 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisionado según lo acordado (incluyendo 37 CFR \NAK 1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente aplicación acuerda que si el cultivo de los materiales en depósito pereciera, se perdiera o fuera destruido mientras se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales serán reemplazados rápidamente, bajo notificación, por otros similares. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para la práctica de la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno y de acuerdo con sus leyes de patentes.

\newpage

Las especificaciones precedentes se consideran suficientes para permitir a un experto en la materia la práctica de la invención. La presente invención no se limita al ámbito de la construcción depositada, ya que la aplicación depositada se entiende como una ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que se defina en las reivindicaciones se halla dentro del ámbito de la presente invención. El presente depósito de material no constituye una admisión de que la descripción aquí descrita sea inadecuada para permitir la práctica de cualquiera aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de lograrlo, tampoco debe considerarse como limitante del ámbito de las reivindicaciones respecto a las ilustraciones que se representan. Por descontado, varias modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas aquí, resultarán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripción precedente.

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Referencias citadas en la descripción

La lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector, no forman parte del documento de patente Europea. Aún cuando se ha puesto el mayor cuidado para rellenar las referencias, no se puede excluir la existencia de errores u omisiones por lo que la EPO no se hace responsable a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción

200

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<110> Genentech, Inc.

\hskip1cm

Gerritsen, Mary

\hskip1cm

Sliwkowski, mark X.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> ANTAGONISTAS de ErbB4

\vskip0.400000\baselineskip

<130> GENENT. 072VPC

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<150> 60/229.67>151> 2000-09-01

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/265.516

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-01-31

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 5484

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<212> DNA

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

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7

8

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 1308

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 2

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9

10

11

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<210> 3

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<211> 2601

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 3

12

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<210> 4

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<211> 615

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

13

14

Claims (54)

1. Utilización de un antagonista específico para un receptor de ErbB4 nativo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la estenosis, en donde dicho antagonista comprende una inmunoadhesina con una secuencia de dominio extracelular de un receptor ErbB4 nativo que se une a un ligando del receptor, o a un anticuerpo neutralizante o fragmento de lo mismo que se une específicamente a un receptor ErbB4 nativo.

2. Utilización según la reivindicación 1, en donde el medicamento es para el tratamiento de la estenosis mediante la prevención de la proliferación o migración excesiva de las células musculares lisas.

3. Utilización según la reivindicación 1, en donde el medicamento es para el tratamiento de la estenosis mediante la inhibición de la proliferación o migración excesiva de células musculares lisas.

4. Utilización según la reivindicación 3, en donde dicha inhibición es una inhibición total.

5. Utilización según la reivindicación 2 o la 3 en donde dichas células musculares lisas son células musculares lisas vasculares.

6. Utilización según la reivindicación 1 en donde dichas células musculares lisas son células musculares lisas pilóricas.

7. Utilización según la reivindicación 1 en donde dichas células musculares lisas son células musculares lisas de la vejiga urinaria.

8. Utilización según la reivindicación 1 en donde dichas células musculares lisas son células de una vía respiratoria.

9. Utilización según la reivindicación 1 en donde dicha estenosis resulta de la proliferación o migración excesiva de las células musculares lisas.

10. Utilización según la reivindicación 1 en donde dicha estenosis resulta de la proliferación o migración excesiva de las células musculares lisas vasculares.

11. Utilización según la reivindicación 1 en donde dichas células musculares lisas vasculares son humanas.

12. Utilización según la reivindicación 1 en donde dichas células musculares lisas vasculares son células musculares lisas de aortas humanas.

13. Utilización según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde dicha estenosis es una estenosis vascular.

14. Utilización según la reivindicación 13, en donde dicha estenosis vascular se caracteriza además por una proliferación o migración excesiva de las células endoteliales.

15. Utilización según la reivindicación 14, en donde dicha estenosis es la restenosis.

16. Utilización según la reivindicación 1, en donde dicha inmunoadhesina comprende una secuencia de dominio extracelular de un receptor ErbB4 nativo que se une a un ligando del receptor.

17. Utilización de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el receptor de ErbB4 nativo es humano.

18. Utilización según la reivindicación 17, en donde el receptor ErbB4 nativo es el receptor ErbB4 de la SEC ID NO:2.

19. Utilización según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en donde la secuencia del dominio extracelular del receptor ErbB4 nativo humano se fusiona con una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

20. Utilización según la reivindicación 19, en donde dicha inmunoglobulina es del isotipo IgG.

21. Utilización según la reivindicación 20, en donde la mencionada inmunoglobulina es del isotipo IgG1, IgG2 o IgG3.

22. Utilización según la reivindicación 21, en donde dicha inmunoadhesina comprende al menos una cadena de inmunoglobulina ligera de IgG.

23. Utilización según la reivindicación 21, en donde dicho antagonista es un anticuerpo monoclonal.

24. Utilización según la reivindicación 23, en donde el receptor de ErbB4 nativo es el receptor de ErbB4 de la SEC ID NO:2.

25. Utilización según la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en donde el mencionado anticuerpo es un anticuerpo neutralizante que se une específicamente a un receptor de ErbB4 nativo.

26. Utilización según la reivindicación 25, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado quimérico o humano.

27. Utilización según la reivindicación 25, en donde dicho anticuerpo está glicosilado.

28. Utilización según la reivindicación 25, en donde dicho anticuerpo se une esencialmente al mismo epitopo que un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado a partir del grupo que consiste en HER4. 10H1.1A1 (número de acceso ATCC, PTA-2828), HER4.1C6.A11 (número de acceso ATCC, PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (número de acceso ATCC, PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (número de acceso ATCC, PTA-2827) y HER4.8B9.2H2 (número de acceso ATCC, PTA-2825).

29. Utilización según la reivindicación 25, en donde dicho anticuerpo tiene residuos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado a partir del grupo que consiste en HER4.10H1.1A1 (número de acceso ATCC, PTA-2828), HER4.1C6.A11 (número de acceso ATCC, PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (número de acceso ATCC, PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (número de acceso ATCC, PTA-2827) y HER4.8B9.2H2 (número de acceso ATCC, PTA-2825).

30. Utilización según la reivindicación 9, en donde dicho antagonista es el definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 29.

31. Utilización según la reivindicación 9, en donde para el tratamiento de las células musculares lisas, dicho antagonista se administra a un paciente por medio de una inyección o infusión.

32. Utilización según la reivindicación 9, en donde dicho tratamiento reduce además la hipertensión asociada con la mencionada estenosis.

33. Utilización según la reivindicación 9, en donde dicho tratamiento es preventivo.

34. Utilización según la reivindicación 9, en donde dicha estenosis es una estenosis pilórica.

35. Utilización según la reivindicación 9, en donde dicha estenosis es el engrosamiento de la pared de la vejiga urinaria.

36. Utilización según la reivindicación 9, en donde dicha estenosis es parte de una enfermedad respiratoria oclusiva.

37. Utilización según la reivindicación 1, en donde para dicho tratamiento, el mencionado antagonista de un receptor de ErbB4 se introduce en una célula utilizando un ácido nucleico que codifica el mencionado antagonista del receptor ErbB4.

38. Utilización según la reivindicación 37, en donde dicho paciente es el hombre.

39. Utilización según la reivindicación 38, en donde dicho antagonista es el definido en cualquiera de las reivindicaciones 16-29.

40. Utilización según la reivindicación 37, en donde dicho ácido nucleico es para la introducción in vivo.

41. Utilización según la reivindicación 37, en donde el ácido nucleico es para la introducción ex vivo.

42. Utilización según la reivindicación 1, en donde dicho antagonista comprende un anticuerpo seleccionado de entre el grupo formado por un anticuerpo producido por un hibridoma seleccinado a partir del grupo que consiste en HER4.10H1.1A1 (número de acceso ATCC, PTA-2828), HER4.1C6.A11 (número de acceso ATCC, PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (número de acceso ATCC, PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (número de acceso ATCC, PTA-2827) y HER4.8B9.2H2 (número de acceso ATCC, PTA-2825).

43. Utilización según la reivindicación 1, en donde dicho antagonista comprende un anticuerpo neutralizante que se une esencialmente al mismo epitopo de ErbB4 unido por un anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales anti-ErbB4 4-1440, 4-1460, 4-1492 y 4-1464.

44. Utilización según la reivindicación 1, en donde dicho antagonista comprende un anticuerpo neutralizante que tiene residuos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales anti-ErbB4 4-1440, 4-1460, 4-1492 y 4-1464.

45. Utilización según la reivindicación 1, en donde el mencionado antagonista comprende un anticuerpo neutralizante que se une a un receptor de ErbB4 nativo con alta afinidad.

46. Utilización según la reivindicación 45, en donde dicho anticuerpo se une a un receptor de ErbB4 nativo con una Kd inferior a 100 nM.

47. Utilización según la reivindicación 45, en donde el mencionado anticuerpo se une a un receptor de ErbB4 nativo con una kd inferior a 50 nM.

48. Utilización según la reivindicación 45, en donde el mencionado anticuerpo se une a un receptor de ErbB4 nativo con una kd inferior a 10 nM.

49. Utilización según la reivindicación 45, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

50. Utilización según la reivindicación 45, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.

51. Utilización según la reivindicación 45, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

52. Utilización según la reivindicación 45, en donde dicho anticuerpo se une a un receptor de ErbB4 nativo y reduce la unión a la heregulina.

53. Utilización según la reivindicación 45, en donde dicho anticuerpo se une a un receptor de ErbB4 nativo y reduce la fosforilación de tirosina inducida por heregulina.

54. Utilización según la reivindicación 52-53, en donde dicho anticuerpo se une a un receptor de ErbB4 nativo con elevada afinidad.