ES2296297T3 - Orientacion molecular de macromoleculas mediante la accion de un menisco sobre superficies altamente especificas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA SUPERFICIE ENORMEMENTE ESPECIFICA PARA REACCIONES BIOLOGICAS. LA SUPERFICIE COMPRENDE UN SOPORTE QUE TIENE AL MENOS UNA CAPA DE UN COMPUESTO ORGANICO. ESTE COMPUESTO ORGANICO TIENE, FUERA DE LA CAPA, UN GRUPO EXPUESTO QUE TIENE UNA AFINIDAD PARA UNA PORCION, EN PARTICULAR UNA EXTREMIDAD, DE UNA MOLECULA BIOLOGICAMENTE ACTIVA. LOS OTROS ELEMENTOS DE LA CAPA NO TIENEN ESENCIALMENTE NINGUNA ACTIVIDAD PARA LAS MOLECULAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS EN CONDICIONES DE REACCIONES DADAS. PREFERENTEMENTE EL GRUPO EXPUESTO QUEDA ACOPLADO AL SOPORTE A TRAVES DE UN GRUPO DE FIJACION. LA SUPERFICIE Y EL SUSTRATO SE PUEDEN INCLUIR EN ESTRUCTURAS Y DISPOSITIVOS ADECUADOS PARA MEDICIONES OPTICAS, DE FLUORESCENCIA, QUIMIOLUMINISCENCIA, SONDAS DE EXPLORACION Y/O ELECTRICAS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN PROCESO PARA ESTIRAR MACROMOLECULAS SOBRE LA SUPERFICIE (S) DE UN SOPORTE. SEGUN ESTE PROCESO, SE MUEVE UN MENISCO QUE REPRESENTA UNA LINEA TRIPLE (S/A/B) SOBRE LA SUPERFICIE YRESULTA DEL CONTACTO DE UN SOLVENTE (A) CON LA SUPERFICIE (S) Y UN MEDIO (B). PREFERENTEMENTE EL DESPLAZAMIENTO DEL MENISCO SE HACE BIEN POR EVAPORACION O BIEN POR UN CIZALLAMIENTO MECANICO HACIENDO USO DEL MOVIMIENTO DE LOS DOS SOPORTES, UNO RESPECTO AL OTRO.

Description

Orientación molecular de macromoléculas mediante la acción de un menisco sobre superficies altamente específicas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a una superficie o superficies altamente específicas que pueden utilizarse en biología, y sustratos, constructos y dispositivos que utilizan dicha superficie o superficies, así como a sus aplicaciones y procedimientos para su preparación. La invención también se refiere a un procedimiento para estirar macromoléculas tales como polímeros o moléculas biológicamente activas, particularmente ADN o proteínas.

Antecedentes de la invención

La elevada especificidad y selectividad de determinadas reacciones biológicamente activas es conocida desde hace mucho tiempo. Específicamente, las reacciones anticuerpo-antígeno, las hibridizaciones de ADN o ARN, las reacciones entre proteínas del tipo avidina/estreptavidina-biotina, así como las reacciones entre ligandos y sus receptores son bien conocidas. Actualmente es posible aprovechar dichas reacciones específicas, particularmente para demostrar la presencia o ausencia de uno de los elementos de la reacción apareada en una muestra, o posiblemente para separar uno de los elementos de la pareja de entre un medio más complejo. Sin embargo, cuando se desea detectar la presencia de una molécula a concentraciones muy bajas, en un medio complejo, los procedimientos disponibles actualmente a menudo proporcionan resultados aleatorios, particularmente debido al ruido de fondo experimentado durante las etapas de separación o detección. Ésta es la razón por la cual en adelante se denominará "pesca molecular", es decir la posibilidad de detectar cada una de las moléculas buscadas incluso a concentraciones muy bajas, no haya sido posible hasta el momento. Por ejemplo, el análisis de muestras de ADN requiere la utilización de una sonda de hibridización que se corresponde con la secuencia complementaria de la secuencia a identificar. En estas condiciones, el problema consiste en aislar el híbrido del medio, luego detectarlo con una buena relación señal/ruido (SNR), y finalmente determinar un número de reacciones positivas, aunque sea pequeño. Ésta es la razón por la que en muchos casos se utiliza una etapa intermedia a efectos de amplificar la secuencia a detectar, por ejemplo utilizando PCR o procedimientos de amplificación que conducen a los mismos resultados. En estas condiciones, se aumenta la concentración de la secuencia a analizar en la muestra y su detección resulta mucho más sencilla. Sin embargo, esta etapa de amplificación es sensible a contaminantes que pueden conducir a errores de detección. En consecuencia, resulta deseable poder detectar la presencia de la secuencia de ácido nucleico sin ninguna etapa de amplificación. Se ha propuesto utilizar, a efectos de destacar la reacción de hibridización, una etapa de anclaje intermedia del producto de hibridización sobre una superficie sólida que presenta ciertas especificidades de enlace. Por ejemplo, resulta posible utilizar ciertas superficies pretratadas que permiten el enlace de determinadas proteínas o ADN, tanto si dicho ADN ha sido modificado como si no. Dichas superficies están disponibles comercialmente (Covalink®, CoStar®, Estapor®, Bangs® y Dynal®, por ejemplo) en forma de perlas o pocillos que presentan en su superficie grupos -COOH, -NH_{2} ó -OH, por ejemplo. En consecuencia, el ADN puede funcionalizarse con un grupo reactivo, por ejemplo una amina, y la reacción puede proseguir con dichas superficies. Sin embargo, estos procedimientos requieren un pretratamiento particular o funcionalización del ADN a enlazar.

Se han descrito asimismo técnicas que permiten el anclaje sin ningún pretratamiento del ADN. Una de estas técnicas consiste en hacer reaccionar el grupo fosfato libre del extremo 5' de la molécula con una amina secundaria. También es posible fijar el ADN a un grupo de una proteína a efectos de hacerlo reaccionar con una superficie cubierta con un grupo de una segunda proteína susceptible de reaccionar específicamente con la primera proteína. El complejo enlazado (primera proteína-segunda proteína) puede ser del tipo biotina-estreptavidina, y anticuerpo anti-digoxina (anti-DIG) dirigido contra antígeno digoxina (DIG). Sin embargo, frecuentemente estas superficies no son suficientemente específicas. De este modo, la presencia de interacciones parásitas, aunque sean débiles, del tipo adsorción no específica, puede conducir, para una molécula larga, a la absorción sobre el sólido en un número grande de puntos de interacción débil (V. Lund y otros, Nucl. Acids Res. 16, 1861 (1988)). Estas superficies llevan a aplicaciones potenciales con déficit de sensibilidad y/o con un nivel elevado de ruido de fondo en caso de que haya un número pequeño de moléculas a "pescar". Además, algunas de estas superficies presentan un nivel elevado de fluorescencia parásita, que es potencialmente perjudicial durante la fase de detección (si se utilizan fotones en la detección). En cuanto a la propia detección, particularmente para resaltar la presencia de ADN, la patente francesa 78 10975 describe un procedimiento de acoplamiento de una sonda a una enzima que permite observar la liberación de un sustrato cromático, es decir un colorante que, al liberarse, cambia sus propiedades ópticas (ya sean las características de emisión o de absorción). Además, resulta posible cuantificar la reacción mediante una medición de densidad óptica, espectral o calorimétrica. Sin embargo, una técnica de este tipo no está directamente adaptada para la detección de cantidades del orden de trazas. En consecuencia, esta técnica debe ir precedida, en muchos casos, de un procedimiento de amplificación de la cantidad de ácidos nucleicos buscados, por ejemplo por el procedimiento PCR. El procedimiento de detección descrito como "técnica de sonda en frío" se ha desarrollado para evitar la utilización de marcadores radioactivos, que dan resultados similares en sensibilidad pero que presentan problemas de manipulación, teniendo en cuenta la presencia de radioactividad y los prolongados tiempos de desarrollo necesarios para una buena sensibilidad. Para determinadas aplicaciones particulares, tales como los procedimientos diseñados a partir de imágenes ex vivo, se han propuesto procedimientos directos de observación de la reacción mediante el acoplamiento del producto de hibridización a microperlas, particularmente a PMMA, convenientemente tratadas químicamente en su superficie. El procedimiento se basa en la identificación directa mediante un microscopio electrónico de la presencia de estas microperlas (con un diámetro típico de 60 nanómetros), y también se basa en técnicas conocidas de anclaje sólido que no son suficientemente específicas.

Evidentemente, las técnicas descritas anteriormente no se limitan a la detección de ácidos nucleicos. Ha sido sugerida la detección de anticuerpos utilizando los mismos sistemas. En estas situaciones, los ensayos son ensayos tipo ELISA, que no se describirán en la presente memoria y que, en resumen, permiten el acoplamiento de un anticuerpo a un lugar de anclaje asociado con una molécula de antígeno sobre un sólido. En esta situación, los problemas de especificidad y de reacciones parásitas siguen estando presentes. El procedimiento de detección puede estar basado en un acoplamiento a un sustrato cromático, que presenta sus propios problemas de sensibilidad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento reproducible de orientación, dirección, alineación, enderezamiento o estiramiento de una macromolécula sobre una superficie, que comprende las etapas de poner en contacto una macromolécula con una superficie S y un medio A, de tal modo que un lugar de la macromolécula está enlazado a S y una parte de la misma se encuentra en A, y desplazar por traslación mecánica los contenidos de A relativos a S, en condiciones eficaces para orientar, adaptar, alinear, enderezar o estirar la macromolécula.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de obtención de una superficie S que proporciona orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento consistentes, homogéneos y reproducibles de macromoléculas, el cual comprende las etapas de lavar una superficie S de un sustrato en condiciones eficaces para obtener una superficie S sin moléculas orgánicas y sin polvo, hidratar S, y recubrir S con un material deseado que comprende restos expuestos capaces de enlazarse selectivamente a macromoléculas; las etapas de lavado, hidratación y recubrimiento se llevan a cabo en una única cámara.

Asimismo, entra dentro del alcance de la presente invención una superficie preparada mediante el procedimiento descrito anteriormente, adecuada para su utilización en la orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento de macromoléculas de un modo consistente, homogéneo y reproducible; en la presente patente también se dan a conocer un sustrato, constructo o dispositivo que comprende la superficie según la invención, así como kits que comprenden la superficie, el sustrato, el constructo y/o el dispositivo, y otros componentes, e instrucciones para su uso, adecuados para diversas aplicaciones descritas a continuación.

La superficie según la presente invención se aplica ventajosamente, alcanzando un grado deseado de orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento de una macromolécula enlazada a una superficie S, poniendo la macromolécula en contacto con la superficie según la invención y un medio A, de tal modo que un lugar de la macromolécula está enlazado a la superficie y una parte de la misma está situada en A, modificando la característica hidrofóbica/hidrofílica de la superficie o de A, de un modo eficaz para producir un grado deseado de estiramiento de la macromolécula, evaporando A o desplazando por traslación los contenidos de A relativos a la superficie a efectos de orientar, alinear, enderezar o estirar la macromolécula, y determinando la longitud de la macromolécula estirada comparándola con un estándar o control.

El documento WO-A-92/08788 da a conocer un sustrato recubierto que tiene la capacidad de enlazar macromoléculas en una posición orientada, y que se lava a efectos de eliminar cualquier molécula orgánica y todo el polvo del mismo, a continuación se hidrata y se recubre con un reactivo. El sustrato puede obtenerse tras irradiación con radiación UV. Las macromoléculas pueden orientarse mediante una técnica "doctor blade". En dicho documento no se da a conocer un procedimiento para obtener una superficie que incluya etapas ejecutadas todas ellas en una única cámara, ni tampoco una etapa de traslación en la que dos superficies se desplazan paralelamente para desplazar una interfase.

La invención se refiere a un procedimiento para obtener una superficie S que proporciona orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento consistentes, homogéneos y reproducibles de macromoléculas según la reivindicación 1, o según la reivindicación dependiente 2. La invención también se refiere a un procedimiento reproducible de orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento de una macromolécula sobre una superficie, según la reivindicación independiente 4, o según la reivindicación dependiente 3 ó 5 ó 9. La invención se refiere asimismo a una superficie S obtenida mediante el procedimiento anterior.

Otra aplicación de la superficie según la invención se da, por ejemplo, en un procedimiento sensible de identificación de un tipo específico de macromolécula presente en una muestra, poniendo en contacto la macromolécula con la superficie y el medio, y orientando la macromolécula tal como se ha descrito anteriormente, y detectando la presencia de la macromolécula estirada de un modo cuantitativo y reproducible, e identificando específicamente el tipo de la macromolécula orientada.

Otra aplicación consiste en la determinación del número de un tipo específico de macromoléculas presente en un volumen conocido de muestra, poniendo en contacto una macromolécula con la superficie y el medio, orientando la macromolécula, y detectando la presencia de la macromolécula orientada tal como se ha descrito anteriormente, y determinando el número de macromoléculas orientadas presentes de un modo reproducible y cuantitativo.

Otra utilización de la superficie consiste en la separación de una macromolécula de un tipo específico de entre otros tipos de macromoléculas, poniendo en contacto una macromolécula con la superficie y el medio A, evaporando A o desplazando por traslación los contenidos de A relativos a la superficie a efectos de desplazar A y otros componentes de la muestra, mientras que la macromolécula o macromoléculas del tipo específico permanecen enlazadas a la superficie y están orientadas, y detectando la presencia de toda macromolécula orientada de tipo específico de un modo reproducible y cuantitativo.

Otra aplicación de la superficie según la invención se da en la medición de la longitud de una macromolécula de un tipo específico, poniendo una macromolécula con un marcador en una posición de longitud conocida en contacto con la superficie según la invención y con un medio A, evaporando A o desplazando por traslación los contenidos de A relativos a la superficie, mientras que la macromolécula permanece enlazada a la superficie para orientar la macromolécula, y determinando la longitud de cualquier fragmento de la macromolécula orientada que se extiende entre la molécula y la parte de la macromolécula situada en A por comparación con un estándar o control.

La superficie según la invención resulta asimismo adecuada para medir una distancia deseada entre dos puntos sobre una superficie aplicando las etapas descritas anteriormente, y determinando posteriormente la distancia deseada por comparación con una longitud conocida.

Breve descripción de los dibujos

La subfigura 1A es una representación esquemática de la detección de un patógeno en una molécula de ADN fluorescente por hibridización con una molécula de anclaje. La subfigura 1B es una representación esquemática de la detección de una reacción inmunológica (ELISA) con una molécula bandera: el ADN fluorescente se utiliza en este caso como marcador de reacción. La subfigura 1C es una representación esquemática de cartografía genética o mapeo físico utilizando la extensión de ADN y la utilización de un ADN marcador.

La subfigura 2A y la subfigura 2B son micrográficos de video de fluorescencia que muestran, respectivamente,
\lambda-ADN cohesivo marcado en el extremo con DIG sobre una superficie cubierta con anti-DIG y estirado por el menisco y, como control, \lambda-ADN no marcado en el extremo sobre una superficie anti-DIG.

La figura 3 es una representación esquemática de la orientación de moléculas de ADN por el paso de un menisco en movimiento.

La figura 4 representa un histograma de las longitudes medidas de un conjunto de moléculas de \lambda-ADN y sus multímeros, después del enlace.

La figura 5 muestra un histograma que representa las longitudes medidas de un conjunto de moléculas de \lambda-ADN, obtenido por traslación mecánica de una superficie cubreobjetos S de vidrio en relación con la otra superficie S'.

Descripción de las formas de realización preferidas

La presente invención surgió del deseo del inventor de perfeccionar las superficies según la técnica anterior, que adolece del inconveniente de producir unos resultados muy inconsistentes producidos por las interacciones extrañas entre su estructura química y las sustancias presentes en un medio puesto en contacto con las superficies. La presente invención se basa en la preparación y utilización de superficies altamente específicas, por ejemplo, eliminando el enlace parásito y la adsorción no específica de una macromolécula o macromoléculas a la superficie, que puede ser utilizada para inmovilizar una macromolécula o macromoléculas para su conteo, medición de su longitud, estudio de sus características y de las relaciones de las mismas o de fragmentos de las mismas con respecto a segmentos vecinos, y puede ser utilizada en la preparación de mapas de secuencia, análisis genético de moléculas individuales, y ensayos de diagnosis y prognosis. Las superficies resultantes son superficies mejoradas con un nivel de ruido de fondo muy limitado.

Más particularmente, la presente invención se refiere a una superficie altamente específica adecuada para enlazar macromoléculas, por ejemplo, para su utilización en reacciones biológicas. Preferentemente, la superficie según la invención comprende, como mínimo, una capa de un compuesto orgánico que presenta un grupo expuesto o reactivo que tiene afinidad por una parte o lugar, particularmente una extremidad o sección final, de una macromolécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa. Opcionalmente, el grupo reactivo de la superficie puede modificarse químicamente para que se enlace a cualquier grupo o resto reactivo de la macromolécula. Los elementos restantes de la capa presentan muy pocas posibilidades de crear un enlace de ningún tipo, o no presentan sustancialmente ninguna afinidad por las macromoléculas en condiciones estándar de reacción de la macromolécula o macromoléculas con el grupo o grupos expuestos o reactivos.

Los términos siguientes se definen tal como se interpretan en el contexto de la presente invención a lo largo de la presente patente. El término "afinidad" se refiere a reactividad o absorción química de cierto tipo, para cualquier molécula o macromolécula enlazada al grupo o resto expuesto de la superficie, ya sea modificado o no. Los términos "fijación", "anclaje" y "enlace" tienen un significado sustancialmente similar, y debe entenderse que designan la unión de una molécula, macromolécula, parte de la misma, o un grupo o resto a otro grupo o resto, molécula o macromolécula o fragmento de la misma, superficie, soporte o sustrato. Los términos "orientación, alineación, estiramiento, dirección y enderezamiento" se utilizan en muchos casos de forma intercambiable, y designan la extensión de una macromolécula o polímero, desde una conformación aleatoria o determinada en solución a una conformación alineada, lineal y espacialmente orientada. El término "soporte o sustrato" designa un soporte o sustrato sólido o uno constituido por un elemento no sólido, tal como una partícula líquida o gaseosa que presenta, o está recubierta por, una capa compacta. Una superficie "compacta" es aquella que impide sustancialmente que la macromolécula acceda a la capa o capas interiores y/o al soporte, a efectos de minimizar las interacciones no específicas. Evidentemente, esta inaccesibilidad debe tener en consideración las condiciones en las que tiene lugar el enlace de la macromolécula. Entre las superficies de la invención, son preferentes aquellas que tienen un grupo o grupos expuestos, tales como enlaces insaturados, por ejemplo, un enlace o enlaces dobles -CH=CH_{2}. Estos enlaces insaturados pueden convertirse en otros restos, tales como -CHO, -COOH, -NH_{2}, and -OH, o pueden utilizarse como tales. Otros grupos reactivos adecuados para su utilización en la presente invención son aquellos que se encuentran, por ejemplo, en polímeros, hidrocarburos y fluorocarbonos ramificados o dendríticos. Dichos grupos se describirán con mayor detalle a continuación. Generalmente, debe evitarse la incorporación a la capa de superficie de otros grupos o restos reactivos, tales como los que comprenden oxígeno y cloro, además del grupo o grupos reactivos o resto o restos reactivos, dado que pueden introducir interacciones no específicas no deseadas y absorción parásita. Las superficies según la presente invención pueden obtenerse mediante diferentes procedimientos. Son ejemplos de ello superficies constituidas por una capa de un polímero carbonado, preferentemente ramificado, con un grosor de, por lo menos, aproximadamente 10 nanómetros (nm), que presentan una clase de grupos reactivos tales como los definidos a continuación, comprendiendo el resto de la capa sustancialmente grupos hidrocarbonados o fluorocarbonados, superficies obtenidas por deposición o anclaje de una o más capas moleculares, obtenidas formando capas sucesivas enlazadas entre sí mediante enlaces no covalentes, por ejemplo, películas Langmuir-Blodgett (LB), o mediante autoensamblaje molecular (SAM). El primer tipo de superficie puede obtenerse por polimerización, como mínimo, de un monómero que genera sobre la superficie del polímero el grupo expuesto deseado, por despolimerización parcial de la superficie de un polímero a efectos de generar el grupo o resto expuesto, o por deposición del polímero. En este procedimiento, uno de los monómeros es preferentemente un grupo vinilo C=C, siendo el polímero formado, por ejemplo, una poliolefina o un derivado poliénico. Son ejemplos de ello superficies del tipo caucho sintético, tal como polibutadieno, poliisopreno o caucho natural. Generalmente, la superficie altamente específica del segundo tipo, utilizada, por ejemplo, para reacciones biológicas, se constituye disponiendo sobre una estructura o sustrato alargado una capa esencialmente monomolecular y compacta de un compuesto orgánico que presenta, como mínimo, un grupo o resto de fijación o anclaje que tiene afinidad por la superficie o soporte o sustrato, y un grupo o resto expuesto o reactivo que no presenta sustancialmente ninguna afinidad, o una afinidad muy reducida, por el soporte y el grupo de fijación en condiciones eficaces para la fijación de la molécula al sustrato. El resto expuesto o reactivo en sí, o tras la modificación química que sigue a la fijación, proporciona afinidad o enlaza la macromolécula. Las capas preferentes son capas compactas obtenidas con monómeros o compuestos orgánicos que son diferentes del grupo o grupos expuestos o reactivos, y susceptibles de experimentar reacción lateral entre sí a efectos de crear enlaces transversales o entrecruzamiento. Dichas capas compactas hacen que el soporte sea sustancialmente inaccesible a macromoléculas o restos en un medio depositado sobre la superficie y, en consecuencia, eliminando sustancialmente las reacciones parásitas. Preferentemente, los compuestos orgánicos presentan un grupo o resto de fijación o anclaje en una extremidad o extremo, y un grupo o resto expuesto o reactivo en otra posición de la molécula, por ejemplo, la otra extremidad o extremo. La presente memoria también contempla otras formas de realización concebibles en las que el grupo de fijación está situado, por ejemplo, en el centro del compuesto orgánico, y presenta grupos expuestos en cada uno de sus extremos. A efectos de evitar las reacciones parásitas con los compuestos orgánicos en otros lugares que no sean su grupo o resto expuesto o reactivo, resulta preferente utilizar compuestos orgánicos con grupos expuestos y grupos de fijación relativamente inertes. Por ejemplo, pueden utilizarse cadenas saturadas, tales como parafinas.

La superficie o superficies según la invención pueden caracterizarse según (a) el soporte o sustrato, (b) la molécula dispuesta sobre el soporte, que presenta grupos expuestos o reactivos y grupos de fijación o anclaje, y (c) la interacción entre el soporte y la molécula con un grupo de fijación. En una forma de realización, el enlace es no covalente, particularmente del tipo hidrofílico-hidrofílico o hidrofóbico-hidrofóbico, tal como se dan en las películas Langmuir-Blodgett (LB) (K. B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935)). En este tipo de superficie o superficies, el grupo expuesto o enlazante es hidrofílico o hidrofóbico, particularmente un grupo alquiloxilo, alquilo o haloalquilo, tal como CH_{3}, CF_{3}, CHF_{3}, CH_{2}F, y el otro grupo (el grupo de fijación o anclaje) es hidrofílico. El enlace también puede ser covalente, en cuyo caso el grupo de enlace generalmente reaccionará químicamente con el soporte. Los grupos de enlace particularmente preferentes incluyen silanos, clorosilanos, silanoles, etoxisilanos, metoxisilanos, silazanos, fosfatos, hidroxilos, hidracidas, hidracinas, aminas, amidas, diazoniones, piridinas, sulfatos, sulfónicos, carboxilatos, borónicos, halogenuros, ácidos haluros, aldehídos y dioles. Más particularmente, resulta preferente utilizar grupos de enlace susceptibles de reaccionar de un modo transversal con un grupo vecino equivalente a efectos de proporcionar enlaces transversales, por ejemplo, silano, y más preferentemente diclorosilano, triclorosilano, dimetoxisilano, trimetoxisilano, dietoxisilano y trietoxisilano. Los enlaces transversales o entrecruzamientos también pueden alcanzarse en diversos puntos a lo largo del grosor de la capa por polimerización de la monocapa con grupos reactivos, eventualmente presentes en la cadena entre el lugar de enlace y el grupo expuesto. De este modo, las moléculas con grupo de fijación bifuncional y trifuncional permiten una polimerización unidimensional o bidimensional de la capa. Tal como se conoce en la técnica, el tipo de grupos de enlace utilizados también dependerá de la naturaleza del soporte. Los grupos del tipo silano están bien adaptados para el enlace covalente sobre vidrio y sílice. Independientemente de la superficie, los grupos expuestos se seleccionan preferentemente de entre vinilo o radicales aromáticos, aminas terciarias o secundarias, ésteres, nitrilos, aldehídos o halógenos. Son particularmente preferentes los grupos vinilo. Los grupos vinilo pueden modificarse químicamente después del enlace a efectos de obtener, por ejemplo, grupos metoxílicos o carboxílicos, o derivados de los mismos, tales como alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos, y aminas primarias, secundarias o terciarias. Las cadenas que enlazan el grupo expuesto con el grupo de fijación son preferentemente cadenas, como mínimo, con 1 átomo de carbono, preferentemente más de aproximadamente 6, y generalmente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 30 átomos de carbono. De este modo, incluso aunque el sustrato no esté completamente cubierto, mayoritariamente son los grupos inertes y no el sustrato los que están expuestos. Tanto en este caso como cuando existe acoplamiento lateral o entrecruzamiento dentro de la capa, ya sea iónico o covalente, se obtienen capas altamente organizadas por autoensamblaje, incluso aunque la superficie inicial sólo presente un número reducido de lugares de anclaje activos en comparación con el número de moléculas obtenidas en una capa compacta.

El soporte o sustrato puede estar constituido por cualquier tipo de materia sólida, aunque son preferentes el vidrio, la sílice, otros polímeros (naturales y sintéticos) y el oro, con o sin pretratamiento de la superficie. Cuando se utiliza vidrio o sílice, es preferente la utilización de técnicas conocidas de funcionalización de superficie con derivados de silano, tal como, por ejemplo, la que incluye la reacción: Si-OH + Cl_{3}-Si-R-CH=CH_{2} dando Si-O-Si-R-CH=CH_{2}, en la que R es, por ejemplo, (CH_{2})_{4}. La reacción puede llevarse a cabo con disolventes puros, y da como resultado un número de moléculas que presentan un extremo C=C expuesto fuera de la superficie. El término soporte o sustrato pretende incluir no únicamente soportes sólidos únicos, sino también partículas tales como polvo de sílice y perlas poliméricas, así como otras formas de sustrato, tales como fibras o soportes estructurados, que pueden volverse magnéticos, fluorescentes o coloreados, tal como se conoce por varias técnicas de medición. El soporte se selecciona preferentemente de tal modo que sea básicamente no fluorescente cuando la detección se lleva a cabo utilizando fluorescencia. Las superficies obtenidas mediante los procedimientos (A) y (B), descritos anteriormente, muestran una especificidad importante, que se obtiene debido a (I) la presencia de lugares reactivos específicos obtenidos a partir de los grupos expuestos o a partir de la molécula fijada, (II) una proporción muy débil de interacciones no específicas causada por la ausencia de enlaces parásitos (enlace covalente, enlace débil de tipo absorción, o enlace hidrofóbico) (Las superficies disponibles comercialmente, tales como Nunc® y Costar®, presentan numerosos lugares de interacción no específicos, y macromoléculas tales como ADN pueden anclarse de forma no deseada en múltiples lugares, mientras que en las superficies según la presente invención, las macromoléculas experimentan anclaje únicamente por sus extremidades), (iii) una proporción de fluorescencia intrínseca muy débil cuando así se requiere, y un ruido de fondo de fluorescencia más débil que la señal de fluorescencia de la molécula individual a detectar, (iv) la posibilidad de detectar moléculas aisladas con una relación señal a ruido (SNR) independiente del número de moléculas, utilizando diversas técnicas que se describen a continuación. Éstas se basan mayoritariamente en la identificación de la presencia de un marcador macroscópico que presenta una interacción no específica débil con la superficie.

Preferentemente, las superficies obtenidas de este modo se enlazan adicionalmente, o se recubren, con una molécula o moléculas biológicamente activas, tales como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos o polisacáridos y derivados de los mismos. Son ejemplos de proteínas los antígenos, anticuerpos, ligandos, receptores celulares, enzimas, transmisores, productos tales como avidina o estreptavidina, y derivados de los mismos. Son ejemplos de ácidos nucleicos ARN y ADN, así como los derivados \alpha, \beta y tiólicos de dichos compuestos, y compuestos mixtos, tales como los PNA. También es posible enlazar compuestos mixtos, tales como glicopéptidos y liposacáridos, u otras sustancias, tales como virus y células, o compuestos químicos, tales como biotina. Las moléculas biológicas pueden estar enlazadas covalentemente o no covalentemente a la superficie, tal como por absorción, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y/o interacciones iónicas. Es posible entrecruzar las moléculas enlazadas, por ejemplo, moléculas injertadas biológicamente, mediante técnicas conocidas, a efectos de reforzar su cohesión ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S. C. Wong, CRC Press, 1991). Tal como se ha mencionado previamente, es posible tener un grupo expuesto o reactivo en la superficie, el cual reacciona directamente con la molécula o moléculas. Sin embargo, el grupo expuesto también puede tratarse después de enlazarse al sustrato, convirtiéndose a hidroxilo, amina, alcohol, tiol, aldehído, cetona o -COOH, antes de fijar la molécula al mismo. Una vez que se ha dotado a la superficie de este grupo o grupos expuestos, las macromoléculas, por ejemplo, polímeros en general, proteínas, ARN y/o ADN, pueden enlazarse a los mismos mediante las técnicas conocidas en la técnica. Generalmente, estas reacciones se llevan a cabo sobre superficies que ya se utilizan para análisis biológicos, particularmente superficies Costar® o Nunc®, o microperlas tales como Estapor®, Bangs®, y Dynal®, por ejemplo, sobre las cuales se anclan macromoléculas, particularmente moléculas biológicamente útiles, tales como ADN, ARN, PNA, proteínas y anticuerpos.

Las superficies según la invención son reactivas con ácidos no ionizados, tales como ácidos que contienen los restos COOH y PO_{3}H_{2}, mientras que son sustancialmente no reactivas con sus respectivas especies aniónicas. Esta propiedad particular permite el anclaje de ácidos nucleicos o proteínas dentro de un intervalo definido de pH, frecuentemente donde la velocidad de reacción puede controlarse fácilmente mediante el pH. De este modo, por ejemplo, la reacción de anclaje puede llevarse a cabo en segundos (si no está limitada por fenómenos de difusión), para una macromolécula, tal como ADN, presente en un medio A a un pH de 5,5. Sin embargo, en algunos casos puede ser preferible dejar que la reacción tenga lugar durante períodos de tiempo más prolongados (2 horas). Sin embargo, en un medio con un pH de 8,0, la misma reacción da lugar a un anclaje muy débil. Este efecto de anclaje dependiente del pH constituye una mejora considerable con respecto a la técnica anterior, particularmente en comparación con otras superficies que requieren el pretratamiento o la funcionalización de la macromolécula para enlazarse a la superficie. Por ejemplo, en el caso de ADN, mediante la adición de biotina, DIG, NHS y similares, u otros reactivos más específicos, tales como carbodiimida, dimetil pimelidato y similares, que pueden producir un enlace péptido o fosforimida entre los grupos -NH_{2} y -COOH o -POOH.

Las superficies que comprenden restos C=C y otros restos enlazantes de moléculas y macromoléculas pueden utilizarse para el anclaje directo de moléculas, por ejemplo, proteínas tales como proteína A, anti-DIG, anticuerpos, estreptavidina, etc. La actividad de la molécula puede preservarse, mientras que la superficie, que originalmente contenía grupos C=C, se modifica de este modo a efectos de enlazarse selectivamente a cualquier macromolécula de interés. En consecuencia, resulta posible pasar de una superficie con una reactividad relativamente amplia a otra con una reactividad altamente específica, que se enlaza selectivamente a macromoléculas con afinidad para lugares específicos situados sobre una proteína. Injertando en la superficie un anticuerpo específico, tal como por ejemplo anti-DIG, una superficie que originalmente tenía una reactividad limitada hacia el antígeno (DIG), pasa a tener una afinidad selectiva con respecto al mismo, dado que los grupos químicos iniciales se han vuelto inactivos mediante los anticuerpos injertados. Asimismo, resulta posible injertar en las superficies reactivas originales, tanto química como bioquímicamente, otras moléculas biológicas, tales como virus, u otros componentes, tales como membranas, receptores de membrana, polisacáridos y PNA. También resulta posible enlazar el producto de una reacción biológica (tal como PCR) sobre las superficies preparadas, y determinar de este modo si la reacción tuvo lugar o no, o la extensión en la cual tuvo lugar, tal como determinando el número de moléculas de producto obtenidas.

De este modo, la presente invención se refiere a superficies altamente específicas para aplicaciones en kits y ensayos, tales como ensayos cualitativos y cuantitativos para macromoléculas, reacciones biológicas y similares. La superficie de la invención comprende una capa esencialmente compacta de un compuesto orgánico que presenta una estructura alargada, opcionalmente fijada sobre un soporte, presentando dicha capa, como mínimo, un grupo o grupos de fijación o anclaje para enlazarse a un soporte, y un grupo o resto expuesto o reactivo que presenta una afinidad baja, o sustancialmente ninguna afinidad, por el soporte y el grupo de enlace o de anclaje en condiciones eficaces para enlazar estos dos últimos entre sí. El grupo reactivo es capaz, particularmente tras una posterior modificación química, de enlazarse a moléculas, tales como moléculas biológicas o moléculas que se enlazan selectivamente a macromoléculas.

La presente invención también se refiere a aplicaciones de las superficies según la invención para la detección de macromoléculas aisladas con moléculas específicas o reactivos, más particularmente en procedimientos de detección con una SNR independiente del número de moléculas detectadas.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento reproducible de dirección, alineación, enderezamiento o estiramiento de una macromolécula sobre una superficie, que comprende poner una macromolécula en contacto con una superficie S y un medio A, de tal modo que un lugar de la macromolécula se enlaza a S y una parte de la misma se sitúa en A; y desplazar por traslación mecánica los contenidos de A en relación con S, en condiciones eficaces para orientar, alinear, enderezar o estirar la macromolécula. El procedimiento según la invención es sencillo y novedoso, y en una de sus formas de realización se desplaza la macromolécula o macromoléculas y una línea de interfase triple S/A/B, que resulta del contacto entre el medio o disolvente A y una superficie S y un medio B, a lo largo de la superficie S, en forma de menisco. Aunque la macromolécula no debe necesariamente ser completamente soluble en el medio A, en una forma de realización particular la macromolécula es soluble en dicho medio.

De acuerdo con la presente invención, se ha observado que el simple paso del menisco sobre las macromoléculas, que están ancladas, por ejemplo en un extremo, a un sustrato, permite una alineación que es sustancialmente uniforme y en una dirección sustancialmente perpendicular a la dirección de movimiento del menisco, que deja las moléculas "orientadas" secadas y absorbidas sobre la superficie, por detrás del menisco. Al obtenerse un micrográfico de video de fluorescencia, éste puso de manifiesto la extensión de la fase \lambda-ADN por el movimiento del menisco (imagen no representada). En la parte izquierda, se observaron moléculas de ADN todavía en solución antes de ser orientadas o estiradas por el menisco; en la parte derecha, se observaron las moléculas de ADN tras el paso del menisco (ver figura 1, Bensimon et al., Science 265: 2096 (1994)). Más particularmente, el estiramiento del extremo libre de la macromolécula (la parte situada en el medio A) tiene lugar a medida que la línea de interfase triple S/A/B se desplaza a lo largo de la superficie S en la interfase del medio A y B, que puede ser un gas, tal como aire o similar, u otro medio discontinuo, incluyendo un disolvente. En una forma de realización particular de la invención, el menisco comprende una interfase aire/agua en la que, por ejemplo, el medio A comprende una solución acuosa y el medio B comprende aire. Evidentemente, también se contemplan otras combinaciones. Además, es posible extender el uso del menisco aire/agua a otros sistemas, tales como agua/aceite, agua/tensioactivo/aire, agua/anfífilo/aceite, y muchos otros. El desplazamiento del menisco puede llevarse a cabo utilizando cualquier elemento para el desplazamiento relativo del medio A y/o B con respecto a la superficie S. Esto incluye todas las formas de energía de entrada, incluyendo, aunque sin limitarse a las mismas, energía térmica, eléctrica, mecánica, química, y otras formas que desplazan la interfase A/B a lo largo de la superficie S. Particularmente, el menisco puede desplazarse utilizando elementos mecánicos, particularmente por succión o soplado de un gas o por empuje o succión del medio A y/o B. El desplazamiento del menisco también puede alcanzarse por evaporación progresiva del medio A. Cuando el desplazamiento del menisco se lleva
a cabo mediante elementos mecánicos, esto puede alcanzarse por traslación de la interfase A/B o de la superficie S.

En una forma de realización particular de la invención, el medio A se coloca entre dos superficies S y S', que pueden ser parte de soportes o sustratos, y el menisco puede desplazarse por evaporación o desplazando una superficie con respecto a la otra, o ambas. El término soporte, tal como se utiliza en la presente memoria, designa cualquier sustrato que presenta una conexión suficiente o efectiva para resistir el paso del menisco. En otra forma de realización de la invención, los cambios o gradientes de voltaje o potencial eléctrico también pueden provocar el movimiento o el control de un medio, tal como un fluido. De este modo, un elemento eléctrico constituye una de las formas de realización más preferentes para realizar la traslación de la interfase, por ejemplo sobre un "biochip", o en un chip de laboratorio de microanálisis, tal como uno formado por silicio, o uno de las variedades micro o nano. De acuerdo con la invención, se ha observado que la fuerza de estiramiento actúa localmente en el entorno inmediato del menisco. Generalmente, esta fuerza es independiente de la longitud de la macromolécula, o del número de macromoléculas ancladas, y en un intervalo muy amplio, también de la velocidad del menisco. Estas características son particularmente eficaces e importantes, y dan como resultado la alineación de las macromoléculas de un modo homogéneo, reproducible y cuantitativo. La presente invención permite la preparación de superficies, sustratos, otros constructos y dispositivos que presentan en sus superficies macromoléculas orientadas. Una superficie, sustrato, constructo o dispositivo de este tipo puede encontrar aplicación, por ejemplo, en el ámbito de la electrónica o la óptica, tal como biosensores o biochips utilizados para realizar mediciones en base a sus propiedades eléctricas o fotónicas. Una orientación uniaxial puede alcanzarse del mejor modo mediante un mecanismo uniaxial, por ejemplo, traslación, mientras que la evaporación conduce típicamente a una distribución más amplia y más aleatoria de las moléculas orientadas.

Es posible controlar la calidad o el grado de estiramiento u orientación de las macromoléculas utilizando, por ejemplo, más de un parámetro diferente, incluyendo (i) las interacciones entre las macromoléculas y la superficie, y (ii) la acción local del menisco sobre las macromoléculas. De este modo, la fuerza de estiramiento aumenta generalmente cuando la energía de interacción entre la macromolécula y la superficie es grande. En el caso de una superficie hidrofílica o humectante, por ejemplo, una que presente anti-DIG enlazado a la misma, habitualmente esta energía de interacción es pequeña, y en consecuencia la fuerza de estiramiento sobre la molécula de ADN no es grande. En una forma de realización de la invención, la intensidad de la fuerza de estiramiento se limita voluntariamente a efectos de evitar la ruptura de la macromolécula, o la ruptura de sus enlaces con la superficie. De este modo, los cambios en la hidrofobia/hidrofilia de la superficie comportan generalmente cambios definidos en el grado de orientación o estiramiento de una macromolécula. En una forma de realización de la invención, se llevan a cabo modificaciones en los restos de la superficie y/o las moléculas enlazadas a la misma, lo que produce cambios predeterminados en el grado de estiramiento para diferentes macromoléculas. También es posible alcanzar un efecto similar, de acuerdo con la presente invención, añadiendo tensioactivos, moléculas anfifílicas, polímeros y copolímeros, por ejemplo copolímeros en bloque, y/u otras sustancias asimétricas en el medio A y/o B a efectos de modificar las propiedades de la interfase que, a su vez, también modificará el grado de estiramiento de una macromolécula. De este modo, el grado de estiramiento de una macromolécula puede variarse mediante la adición de sustancias anfifílicas, por ejemplo tensioactivos, al medio, o mediante un tratamiento de superficie apropiado. De este modo, el estiramiento de ADN en agua/aire (medio A/B) sobre una superficie hidrofóbica (no humectante), tal como vidrio silanado, provocó un estiramiento de aproximadamente el 50%, mientras que un ensayo similar realizado sobre una superficie hidrofílica (humectante) (cubierta con proteína A y anti-DIG), provocó un estiramiento de únicamente el 10% (ver Bensimon y otros, Phys. Rev. Lett. 74: 4754 (1995)). Una atracción superficie/molécula excesiva (por ejemplo, un nivel elevado de adsorción) puede ser perjudicial para la alineación de las moléculas por parte del menisco, de acuerdo con la presente invención, dado que las moléculas pueden permanecer absorbidas a la superficie en un estado que no es necesariamente un estado estirado u orientado. Preferentemente, la superficie presenta una proporción de absorción débil para la macromolécula, de tal modo que únicamente las moléculas ancladas se orientan o se alinean, mientras que las otras moléculas son arrastradas por el menisco. Una vez que las moléculas están alineadas, se adhieren fuertemente a la superficie. En el caso de ADN, por ejemplo, se observaron extendidas durante diversos meses tras su alineación. Las macromoléculas pueden anclarse a la superficie utilizando las técnicas descritas anteriormente. Sus enlaces con la superficie pueden ser covalentes o no covalentes, en función de si resultan de una interacción o interacciones químicas o fisicoquímicas. Asimismo, es posible utilizar superficies disponibles comercialmente, aunque las mismas generalmente requieren pretratamiento o funcionalización de las macromoléculas, por ejemplo, ADN, antes de su anclaje. El procedimiento según la presente invención no sólo permite observar y/o cuantificar moléculas biológicas, sino que también permite separar moléculas biológicas utilizando, por ejemplo, técnicas de acoplamiento, tales como acoplamiento antígeno-anticuerpo o ADN-ARN. Particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de una macromolécula que comprende una secuencia de ADN o una proteína en una muestra, que comprende poner en contacto una macromolécula con una superficie S y un medio A, de tal modo que un lugar de la macromolécula se enlaza a S y una parte de la misma se sitúa en A; y desplazar por traslación mecánica los contenidos de A en relación con S, en condiciones eficaces para orientar, alinear, enderezar o estirar la macromolécula. En el caso de nucleótidos, por ejemplo, esto puede llevarse a cabo tomando una muestra correspondiente al medio A que comprende la macromolécula, preferentemente en solución, y poniéndola en contacto con la superficie, en condiciones que favorezcan la formación de un híbrido ADN-ADN, la formación de un híbrido ADN-ARN, o la formación de un producto de reacción proteína-proteína; a continuación se tiñe, se estira o se orienta adecuadamente el híbrido o producto de reacción, por ejemplo mediante el desplazamiento de un menisco, creado por el contacto del medio con la superficie, a efectos de proporcionar una orientación particular a las macromoléculas, y a continuación se miden, observan o detectan las macromoléculas orientadas de este modo.

El paso del menisco, que estira linealmente las moléculas en forma de pequeños bastones, las hace más fácilmente detectables si están teñidas (por ejemplo, fluorescentemente). Dado que las macromoléculas marcadas presentan una señal correlacionable que tiene una orientación uniforme en su estiramiento, pueden distinguirse eficazmente del ruido de fondo. De este modo, resulta fácil descartar la presencia de polvo y elementos no homogéneos, que no presentan ninguna correlación espacial particular. La capacidad de alinear macromoléculas tiene una importancia extrema, dado que las moléculas aglomeradas situadas en un medio generalmente fluctúan desde un punto de vista térmico, lo que provoca variaciones significativas en la señal de fluorescencia resultante, limitando su observación y medición cuantitativa. La presente invención permite la observación de moléculas aisladas con una SNR mejorada. Las macromoléculas estiradas pueden ponerse de manifiesto mediante diferentes procedimientos enzimáticos u otros procedimientos, tales como fluorescencia o utilización de sondas "calientes" o "frías". Su detección puede alcanzarse midiendo una señal global, por ejemplo, la fluorescencia total, o mediante la observación individual de las macromoléculas por microscopia óptica de fluorescencia, microscopia electrónica o procedimientos que utilizan sondas de barrido, tales como un microscopio de efecto túnel (STM), un microscopio de fuerza atómica (AFM) o un microscopio de barrido en el campo corto (NSOM).

De un modo general, la presente invención permite la observación, separación y/o medición de una cantidad de una macromolécula biológicamente activa en una muestra mediante un procedimiento, utilizando una superficie sobre la cual se enlaza una molécula capaz de reconocer la macromolécula de la muestra. La observación, separación o medición cuantitativa puede llevarse a cabo utilizando reactivos fluorescentes o no fluorescentes a efectos de detectar la presencia de la molécula enlazada o de la macromolécula. Es importante distinguir entre los reactivos fluorescentes y los no fluorescentes. Los reactivos fluorescentes contienen moléculas fluorescentes, frecuentemente seleccionadas con una longitud de aproximadamente 0,1 \mum o más para que reaccionen directa o indirectamente con las superficies pretratadas. Como ejemplo no limitativo, una molécula de ADN de doble hélice teñida con sondas fluorescentes, tal como bromuro de etidio, YOYO-1 o nucleótidos fluorescentes, puede anclarse directamente a una superficie exponiendo enlaces C=C, o por modificación de la molécula de ADN (marcada en su extremo con DIG, biotina, etc.) sobre una superficie que presenta proteínas complementarias enlazadas a la misma (anti-DIG, estreptavidina, etc.). Los reactivos no fluorescentes comprenden particularmente perlas ancladas a través de una molécula enlazada específicamente directa o indirectamente a la superficie pretratada. Debido al tratamiento de las superficies, dichas perlas presentan una interacción no específica débil con la superficie. Son ejemplos no limitativos las perlas DynaI^{R} cubiertas con estreptavidina y ancladas a una molécula de ADN biotinilado en un extremo, y a una superficie que presenta lugares capaces de reaccionar con el otro extremo de la molécula de ADN. En función de si la macromolécula examinada se detecta directamente por fluorescencia, o indirectamente utilizando los reactivos mencionados anteriormente, puede utilizarse detección directa o detección indirecta por "bandera".

A efectos de limitar los problemas asociados con los tiempos de reacción lentos, es posible reducir el tiempo de difusión de los reactivos a través de la superficie utilizando volúmenes de reacción pequeños. Por ejemplo, esto puede realizarse llevando a cabo la reacción en un volumen de unos pocos microlitros, lo que determina la separación entre dos superficies de área fijada, una de las cuales se trata para que presente lugares reactivos según la presente invención, y siendo la otra inerte o tratada. La detección del número de reacciones específicas que ha tenido lugar puede llevarse a cabo en un pequeño número de moléculas, típicamente entre 1 y 100, mediante un ensayo físico macroscópico de ruido reducido que no requiere ni microscopios electrónicos, ni radioactividad ni amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR). En función del tipo de reactivo utilizado, pueden utilizarse dos formas de realización diferentes de la invención (forma de realización X y forma de realización Y) para la detección macroscópica de ruido reducido del pequeño número de reacciones de anclaje. En la forma de realización X, un ensayo del número de reacciones específicas que han tenido lugar se obtiene directamente mediante una técnica de fluorescencia que permite, para ciertas formas de realización de la invención, identificar individualmente el número de lugares que han reaccionado. En este caso, la superficie se selecciona particularmente para que presente una proporción de fluorescencia muy débil. Particularmente, la superficie o el soporte deben presentar una fluorescencia débil. Una vez que ha tenido lugar el anclaje del reactivo fluorescente, la detección y el conteo del número de reacciones de anclaje pueden llevarse a cabo utilizando un microscopio óptico de fluorescencia con un objetivo de apertura amplia, que permite identificar, directamente a vista o tras detectar la señal a través de un CCD intensificado, el número de macromoléculas fluorescentes ancladas, o alternativamente con un sistema fotométrico. Particularmente, es posible y preferente realizar un barrido del campo de visión de observación a efectos de explorar toda la superficie de una muestra, que frecuentemente es mayor que un único campo de visión de observación. En la forma de realización Y de la presente invención, se detecta un reactivo macroscópico del tipo perla. La novedad y no evidencia de este procedimiento se refiere principalmente a la utilización de perlas con una reactividad específica, la utilización de perlas con un tamaño comprendido entre 0,1 y 200 \mum, que puede detectarse mediante técnicas macroscópicas, y la ausencia de una reacción no específica entre las perlas y la superficie, que se debe a la utilización del producto de acuerdo con la presente invención. El número de estas perlas macroscópicas, caracterizando cada una de ellas un anclaje, puede determinarse a continuación por un procedimiento físico macroscópico, por ejemplo, por difusión de luz en las perlas, microscopia óptica y/o fluorescencia de las perlas, entre otros.

La especificidad de determinadas reacciones biológicas puede ser limitada. Así, en un contexto de hibridización, los híbridos pueden ser imperfectos y presentar un número de coincidencias reducido y, en consecuencia, una menor calidad de enlace. La presente invención cubre también la posible utilización de una etapa de ensayo para detectar la calidad de enlace obtenida. Dicho ensayo permite la disociación de productos enlazados de un modo no específico por absorción, por fuerzas hidrofóbicas, por enlaces de hidrógeno imperfectos y por hibridización imperfecta, entre otros. La presente invención también expande la aplicación de un procedimiento de detección o medición, tal como el descrito anteriormente, a un procedimiento en el que el producto de reacción entre la molécula y la macromolécula de la muestra se somete a una restricción física a efectos de destruir los enlaces débiles antes de la detección. Este procedimiento ofrece la posibilidad de destruir los pares enlazados erróneamente y la posibilidad de orientar los productos de acoplamiento. Esto facilita las mediciones o las observaciones. En este contexto, es posible aplicar a las superficies, tras el enlace de los elementos complementarios, una restricción, por ejemplo, el uso individual o combinado de centrifugación, un campo magnético, agitación, paso de un menisco, electroforesis y/o variación de la temperatura a efectos de disociar los enlaces no deseados. Es importante indicar que, gracias a la utilización de las superficies según la invención, es posible orientar las moléculas tras su enlace mediante el paso de un menisco aire/agua, particularmente sobre ADN.

De este modo, aplicando el procedimiento según la invención, la traslación de una macromolécula enlazada a una superficie, por ejemplo ADN, en un medio aire/agua, da como resultado una extensión regular de las moléculas ancladas. Estas observaciones remarcables e inesperadas muestran que es completamente posible contar el número de macromoléculas, tales como ADN, ancladas a una superficie. Por un lado, las superficies utilizadas pueden ser sólo ligeramente fluorescentes, proporcionando una relación de señal a ruido (SNR) relativamente baja. Por otro, debido a que se busca la presencia de un objeto extremadamente correlacionable (en forma de bastoncillos), es muy fácil aumentar la SNR. En otras palabras, es posible ignorar las partículas de polvo y las partes no homogéneas que no presentan una correlación espacial particular. Debe indicarse que la SNR alcanzada por la presente invención es independiente del número de reacciones de anclaje. La SNR en la detección de 1 molécula es la misma que para 10.000 moléculas. Además, el procedimiento de estiramiento u orientación según la invención permite discriminar fácilmente entre moléculas con longitudes diferentes. Adicionalmente, es posible utilizar etapas, por ejemplo las siguientes, a efectos de aumentar adicionalmente la relación señal a ruido: (i) estando fijada la molécula, es posible integrar su señal de fluorescencia, (ii) la observación con un microscopio de campo reducido (típicamente 100 \mum x 100 \mum con un objetivo de inmersión en aceite de N.A. 1,25). Para una muestra de un centímetro cuadrado, es posible proceder por barrido, o mediante la utilización de un objetivo de baja potencia con un campo de visión mayor, (iii) siendo siempre paralelos los bastoncillos, es posible utilizar un procedimiento de filtración espacial óptica a efectos de aumentar adicionalmente la SNR, (iv) pueden utilizarse otros procedimientos de fluorescencia global, por ejemplo, ver solicitud EP 103426, (v) el estiramiento de las moléculas en líneas rectas se observa en el contexto de un injerto químico o en el contexto de enlace inmunológico, (vi) una vez que la superficie se expone al aire, las moléculas de ADN son estables y fluorescentes durante muchas semanas. Es posible utilizar esta propiedad para separar en el tiempo la etapa de anclaje del análisis de las moléculas ancladas, si dicha detección se lleva a cabo por microscopia de fluorescencia, (vii) también puede utilizarse una técnica de fluorescencia doble para mejorar la SNR o para detectar una funcionalidad doble.

La presente invención proporciona asimismo un instrumento, aparato, lector o dispositivo dedicado a realizar observaciones, determinaciones o mediciones de macromoléculas orientadas enlazadas a una superficie. Generalmente, el instrumento incluye, sin limitarse a ello, una fuente o fuentes de luz, un soporte de muestra o muestras, una disposición óptica y un detector o detectores.

Las técnicas de alineación y detección descritas de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse para numerosas aplicaciones, incluyendo, sin limitarse a las mismas, la identificación de uno o más elementos de secuencia de ADN o ARN, lo que puede utilizarse ventajosamente para la diagnosis de patógenos o para la cartografía genética y mapeo físico; la medición de la distribución de la longitud de fragmentos de ADN extendidos también puede utilizarse para cartografía genética y mapeo físico; la mejora de la sensibilidad de las técnicas ELISA con la posibilidad de detectar un número pequeño de reacciones inmunológicas. La identificación de secuencias de ADN/ARN puede llevarse a cabo (a) por reacción en el volumen de la solución de moléculas de ADN/ARN con sondas complementarias (por ejemplo, por hibridización), o (b) mediante proteínas específicas del segmento buscado. De este modo, son posibles dos modos de operación.

La presente invención se refiere asimismo a un kit para la detección de la presencia de una molécula de interés en una muestra, o de la posición de una parte de una molécula de interés dentro de una molécula mayor. Generalmente, dicho kit comprende, además de las instrucciones de uso, una superficie que enlaza la macromolécula de interés, por lo menos, en un punto de anclaje, y los reactivos necesarios para identificar, revelar o anclar la molécula de interés. Son ejemplos de reactivos, utilizados individualmente o en combinación, amortiguadores, moléculas sonda o de marcaje (ADN, ARN, proteínas, ...), tinciones fluorescentes, las moléculas enlazantes específicas, por ejemplo, complementarias a las macromoléculas, tales como ligando-receptor, biotina-estreptavidina, y medios opcionales para llevar a cabo un movimiento no evaporativo del menisco (por ejemplo, medios de cizallamiento mecánico, tales como una segunda superficie que se aplica sobre la superficie descrita en (I), tal como se ha descrito anteriormente). Los medios de cizallamiento son opcionales porque es posible dejar que la muestra se evapore (con tiempo).

Dado que únicamente las moléculas ancladas a la superficie son estiradas por el menisco, mientras que el medio y las otras moléculas contenidas en el mismo son arrastradas por el mismo, el procedimiento según la invención puede ser utilizado para detectar la presencia de un anclaje selectivo o específico entre una molécula y la superficie, y en consecuencia de una reacción biológica, tal como una reacción ELISA. De este modo, es posible utilizar ADN fluorescente u otros polímeros como marcadores de reacción (por ejemplo, acoplando el ADN a un elemento que reconoce una reacción inmunológica del tipo ELISA) y estimar el número de reacciones contando el número de moléculas estiradas sobre la superficie (el umbral de detección es menor de 1.000 reacciones). Asimismo, es posible utilizar la presente invención para la detección de la presencia de un patógeno, por ejemplo, mediante la hibridización de ADN a un oligonucleótido complementario, capaz de anclarse específicamente a una superficie, y a continuación contando las moléculas de ADN estiradas sobre la superficie. En cuanto a la cartografía molecular o mapeo físico, el estiramiento de una molécula también puede utilizarse para detectar un patrón determinado a lo largo de dicha molécula, por ejemplo, tal como se hace en cartografía genética. Por ejemplo, un marcador de ADN con aproximadamente 3.000 pares de bases y un extremo de una sola hélice complementario al gen buscado a lo largo de la molécula, puede teñirse con un marcador fluorescente A. A continuación, este ADN marcador puede hibridizarse con un ADN de una sola hélice procedente de la molécula de la cual se requiere una cartografía, y el complejo obtenido se tiñe a continuación con una segunda sustancia fluorescente B (después de una reacción de cebado al azar para transformar el híbrido en ADN de doble hélice). A continuación, el complejo puede anclarse por una de sus extremidades y estirarse por la acción del menisco. La distancia entre la extremidad de la molécula y la posición del marcador, que puede observarse en microscopia de fluorescencia doble (dos colores A y B) hace posible establecer la posición del gen buscado con una precisión del orden de 1.000 bp. Otra posibilidad consiste en utilizar las técnicas de FISH y DIRVISH (I. Parra y B. Windle, Nature Genetics 5: 17 (1993)) para llevar a cabo el mapeo físico o la cartografía en moléculas ya estiradas. Sin embargo, dado que la fuerza que el menisco ejerce sobre una molécula de ADN o polímero es suficiente para estirarlos más allá de su longitud natural o cristalográfica, resulta necesario calibrar las distancias medidas sobre una superficie (ver, por ejemplo, la figura 2 de A. Bensimon et al., Science 265: 2096 (1994)). Por ejemplo, si la longitud natural de una molécula es l_{o} (3,3 Angstroms/bp), 16,1 \mum en el caso de \lambda-ADN, a continuación si el pico del histograma de las longitudes medidas de la población de \lambda-ADN resultara por medición I_{P} = 24 \mum, la extensión relativa debida al paso del menisco sería I_{P}/l_{o} = 24/16,1 = 1,49, o un 49% de extensión relativa. De este modo, todas las mediciones de distancia, típicamente realizadas a través de microscopia basada en fluorescencia, tal como se menciona en los ejemplos anteriores y posteriores, deben ser corregidas mediante este factor de extensión relativo, antes de poder realizar cualquier determinación de distancia o posición verdadera o precisa. Frecuentemente, resulta deseable hacer el promedio de las mediciones e integrar las señales a efectos de cuantificar las observaciones con mayor precisión. A menudo, los picos de los histogramas conducen al modo de una distribución útil en mediciones y cuantificación. Esto puede realizarse específicamente por calibración directa o indirecta. En el modo indirecto, en un lote de superficies equivalentes se calibra el factor relativo de extensión, que a continuación es utilizado y aplicado para todas las superficies del lote. El riesgo de este enfoque es que se observó, por lo menos en el caso de superficies silanadas, que pueden existir fluctuaciones entre superficie y superficie en el grado de extensión, las cuales se convierten en una fuente de error en las determinaciones de distancia o posición. En el modo directo, una pequeña cantidad de una molécula conocida de longitud estándar teñida (por ejemplo, \lambda-ADN, un fragmento grande del mismo, o un marcador) pueden añadirse a la alícuota que se pretende analizar sobre una superficie. Tras la orientación, la extensión relativa de la población de ADN de longitud estándar se mide a efectos de determinar el factor relativo de extensión exacto para dicha superficie y condiciones de paso de menisco, y este factor se utiliza únicamente para las determinaciones de distancia o posición en esa superficie. Esto aumenta la carga de trabajo, pero reduce las fuentes de error.

La presente invención se refiere asimismo a una superficie, y a un sustrato, constructo, o dispositivo provisto, como mínimo, de una superficie de este tipo, en los que la superficie presenta, enlazada a ella, una macromolécula alineada obtenida por el procedimiento de estiramiento descrito anteriormente. Particularmente, es posible obtener superficies que presentan propiedades eléctricas u ópticas, tal como pueden utilizarse en "biochips", biosensores, o en microlaboratorios analíticos, en dispositivos tipo silicio de nanofabricación y litografía. La siguiente descripción se expone con respecto a los dibujos adjuntos, en los que la subfigura 1A es una representación esquemática de la detección de un patógeno en una molécula de ADN fluorescente por hibridización con una molécula anclada. Esta subfigura muestra un ADN fluorescente 1, una secuencia complementaria 2, una molécula anclada 3, un antígeno DIG 4, un anticuerpo anti-DIG 5, un sustrato 6, y una superficie 12; la subfigura 1B es una representación esquemática de la detección de una reacción inmunológica (ELISA) con una molécula bandera: en este caso, el ADN fluorescente se utiliza como marcador de reacción. Esta subfigura muestra un ADN fluorescente 1, un sustrato 6, una macromolécula a detectar 7, un anticuerpo 8, y una superficie 12; y la subfigura 1C es una representación esquemática de cartografía genética o mapeo físico utilizando la extensión de ADN y la utilización de un ADN marcador. Esta subfigura muestra una secuencia complementaria 2, un marcador de ADN (color A) 8, un ADN anclado (color B) 9, una posición de superposición 10, y una dirección de estiramiento 11. La subfigura 2A es una imagen de un micrográfico de video de fluorescencia que muestra \lambda-ADN cohesivo marcado en el extremo con DIG sobre una superficie cubierta con anti-DIG y estirado por el menisco, y la subfigura B es también una imagen de un micrográfico de video de fluorescencia que muestra un control de \lambda-ADN cohesivo no marcado en el extremo sobre una superficie cubierta con anti-DIG. Puede notarse la especificidad muy restringida de las superficies y la ausencia de absorción no específica. La figura 3 es una representación esquemática de la orientación de moléculas de ADN al paso de un menisco en movimiento. Esta figura muestra una superficie 12, sobre la cual está fijada una macromolécula (ADN) 14 dispuesta en un medio A 13, contiguo a un medio B 15, y opuesta a dicha superficie se encuentra una segunda superficie 16, y las interfases A/B 17, B/S 18, y A/S 19. La molécula estirada 20 también se muestra fijada sobre la superficie 12. La solución de ADN está cubierta con un vidrio cubreobjetos no tratado. La figura 4 representa un histograma de las longitudes medidas de un conjunto de moléculas \lambda-ADN y sus multímeros, después del enlace. El mayor pico de la distribución corresponde a la longitud de los monómeros 21 (16 \mum), mientras que pueden identificarse picos que corresponden a los dímeros 22
(32 \mum), y los trímeros 23 (48 \mum). Los otros picos resultan del fraccionamiento y cizallamiento mecánico de las frágiles moléculas de ADN durante su manipulación. Esta figura demuestra el carácter homogéneo del estiramiento, que es independiente de la longitud de la molécula. La figura 5 muestra un histograma que representa las longitudes medidas de un conjunto de moléculas de \lambda-ADN, obtenido por traslación mecánica de un vidrio cubreobjetos (superficie S) en relación con la otra superficie S'. Un pico a 21 \mum indica un estiramiento desde la longitud cristalográfica de 16 \mum. Esta muestra era idéntica a otra muestra que contenía el mismo ADN enlazado a una superficie silanada, excepto que se orientó o estiró por evaporación del medio A. De este modo, ésta puede compararse directamente con la figura 2 de Bensimon et al, Science 265: 2096 (1994). Esto da como resultado una extensión relativa mayor al 30%, y un número de fragmentos N = 345.

Cuando se utilizan en aplicaciones, tales como en diagnosis, las sondas (anclas) pueden tener un grupo reactivo, por ejemplo, DIG, biotina, etc., capaz de ser anclado de un modo específico a una superficie de acuerdo con la presente invención (que tiene, por ejemplo, como lugar de anclaje, un anticuerpo anti-DIG o una estreptavidina). La detección de la reacción de anclaje puede llevarse a cabo directamente por fluorescencia de la molécula de ADN teñida por moléculas fluorescentes (bromuro de etidio, YOYO, nuevos nucleótidos fluorescentes) (ver subfigura 1A). Asimismo, puede llevarse a cabo indirectamente, mediante la detección de una molécula bandera, por ejemplo, un reactivo de acuerdo con la presente invención capaz de ser fijado sobre la molécula de ADN o ARN (por ejemplo, por hibridización o interacción proteína-ADN, etc.), pero que no tiene sustancialmente ninguna afinidad por los lugares de anclaje de la sonda.

En el modo de cartografía, las sondas complementarias están directamente acopladas a una reacción fluorescente de acuerdo con la presente invención. Puede tratarse, por ejemplo, de ADN de una hélice complementario que presenta nucleótidos fluorescentes modificados, o un ADN largo de una hélice teñido con fluoróforo A y terminado por un fragmento de una hélice complementario de la secuencia buscada. Para diferentes sondas, pueden utilizarse fluoróforos con diferentes colores. También es ventajosamente posible teñir el ADN sobre el que se hibridizan las sondas con un fluoróforo que presenta otro color. El híbrido ADN/sonda se ancla por una de sus extremidades y se estira mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente. La distancia entre los puntos de anclaje y los puntos de hibridización, o entre los puntos de hibridización, se determina mediante la detección de la fluorescencia de la sonda utilizando los procedimientos según la presente invención descritos anteriormente (ver subfigura 1C). Por ejemplo, sin limitarse a este ejemplo, un ADN marcador con aproximadamente 3.000 pares de bases y, en una de sus extremidades, un fragmento de una sola hélice complementario al gen buscado, se tiñe con fluoróforo A (por ejemplo, YOYO-1). Este ADN puede hibridizarse y ligarse con el ADN de una sola hélice para el que se desea obtener una cartografía, y este último ADN de una sola hélice se tiñe con un segundo fluoróforo B (POPO-1) (tras una reacción de cebado al azar a efectos de transformar el ADN en ADN de doble hélice). A continuación, la molécula se ancla por una de sus extremidades (por ejemplo, mediante una reacción DIG/anti-DIG) y se estira por acción de un menisco en movimiento. La distancia entre la extremidad de la molécula y la posición del gen marcado, que puede observarse en microscopia de fluorescencia doble (dos colores A y B) permite establecer la posición del gen buscado con una precisión del orden de 1.000 pares de bases (0,3 \mum). La identificación de secuencias de ADN/ARN puede llevarse a cabo asimismo mediante una reacción entre la secuencia buscada y los sitios reactivos de una superficie, de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, oligonucleótidos complementarios o el lugar de reacción de una proteína específica del segmento buscado). A continuación, la detección de la reacción de anclaje puede llevarse a cabo directa o indirectamente (con ayuda de una molécula bandera), tal como se ha descrito anteriormente. Debe entenderse que la identificación de las secuencias de ADN/ARN, de acuerdo con la presente invención, puede ser utilizada con propósitos diagnósticos (por ejemplo, para la detección de la presencia o ausencia de un patógeno vírico o cromosómico) o con el objetivo de obtener cartografías genéticas y mapeos físicos. Puede procederse con una etapa de amplificación utilizando diversos procedimientos, particularmente PCR. La cartografía genética y el mapeo físico pueden obtenerse mediante la medición del tamaño de los fragmentos de ADN. Esto es posible porque el enlace con las superficies y las técnicas de estiramiento de moléculas descritos anteriormente (particularmente, y ventajosamente, el estiramiento mediante un menisco) permiten una medición de la longitud de las moléculas estiradas, incluso para una cantidad o muestra mínima.

Es posible proceder, sin limitarse a este procedimiento, del modo siguiente. Puede fragmentarse una muestra de ADN, por ejemplo con enzimas de restricción, teñirse con un fluoróforo y anclarse sobre una superficie que presenta grupos reactivos (por ejemplo, superficies con grupos C=C). A continuación, las moléculas pueden estirarse mediante el menisco, y el tamaño de los fragmentos estirados se determina por microscopia óptica de fluorescencia con una resolución, y con un tamaño límite, del orden de 1.000 pares de bases (0,3 \mum). Los resultados obtenidos pueden mostrarse como un histograma de las longitudes medidas de moléculas de ADN extendidas incubadas en diferentes relaciones de fluoróforo con respecto al par de bases (fluoróforo:pares de bases de 1:5, ó 1:10, ó 1:20). El histograma muestra que el estiramiento de las moléculas más allá de su longitud cristalográfica no se debe a la intercalación del fluoróforo, sino que es debido a la acción de estiramiento del menisco (histograma no mostrado). La superficie según la invención puede utilizarse en procedimientos conocidos que permiten la identificación y/o cuantificación de antígenos o anticuerpos, particularmente procedimientos ELISA que utilizan sistemas enzimáticos, o procedimientos del tipo RIA que utilizan marcadores radioactivos. Estas técnicas son bien conocidas y no requieren de su descripción en la presente memoria. Asimismo, es posible utilizar la superficie según la invención como soporte de reacciones inmunológicas de un procedimiento ELISA que presenta una etapa de anclaje de reactivo de acuerdo con la presente invención (bandera) en uno de los reactivos ELISA (subfigura 1B). La detección puede llevarse a cabo globalmente midiendo la fluorescencia total. También es posible contar el número de reacciones localmente. Esto puede llevarse a cabo utilizando los procedimientos de detección según la presente invención, particularmente tras la extensión por parte del menisco. Esto es posible debido a la baja relación de fluorescencia y al reducido número de interacciones no específicas del producto según la presente invención. Esto también permite la detección de un número muy reducido de reacciones (de hasta menos de 100) con una SNR excelente. En consecuencia, es posible, utilizando modificaciones mínimas de los procedimientos ELISA sandwich (anticuerpo-antígeno modificado, por ejemplo biotinilado), insertar sobre la superficie un reactivo de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, ADN fluorescente anclado a estreptavidina. Todas las variantes de la técnica ELISA pueden aplicarse con una sensibilidad mejorada. Las técnicas de medición de fluorescencia ya se utilizan para determinar la calidad de las reacciones ELISA. Sin embargo, el procedimiento según la presente invención permite una detección con una sensibilidad mejorada, dado que es sensible a la señal de fluorescencia de una sola molécula.

La presente invención da a conocer asimismo un procedimiento y una tecnología novedosos, desconocidos anteriormente, para la transferencia de macromoléculas, por ejemplo, polinucleótidos tales como ADN, con un nivel del fondo de fluorescencia ultrabajo. La presente tecnología ofrece una alternativa a los "Southern blots" y "Northern blots" convencionales, frecuentemente utilizados en aplicaciones de biología molecular. Actualmente, la determinación de la "huella digital" de ADN puede resultar trabajosa, particularmente debido a la necesidad de amplificar los materiales obtenidos. La obtención de la huella molecular de muestras de ADN debe superar en primer lugar las barreras presentadas por las cantidades mínimas de ADN, frecuentemente limitadas por el tamaño de las muestras forenses, y los problemas asociados con una sensibilidad de detección baja. Las técnicas disponibles actualmente consumen tiempo, requiriendo típicamente varias semanas, y son complejas, requiriendo la exposición múltiple de membranas transferidas radiomarcadas. Las técnicas convencionales se basan en el corte de restricción del ADN por parte de un conjunto de marcadores enzimáticos (típicamente 5), cargándose a continuación cada corte de restricción en un pocillo separado en un gel estándar de alta resolución; los fragmentos de ADN de diversos tamaños se separan mediante electroforesis en gel para cada calle, dando como resultado patrones característicos; finalmente, para determinar cada patrón, es decir la "huella digital genética", cada gel se transfiere a una membrana adsorbente y típicamente fluorescente, transfiriéndose el ADN sobre la membrana en su localización espacial, y cada marcador se detecta mediante radiomarcaciones subsiguientes, exposición prolongada y separada a una película sensible (semanas), y lavado de la radiomarcación antigua antes de que la siguiente marcación pueda visualizarse en el radiográfico. Típicamente, el procedimiento según la técnica anterior conlleva aproximadamente 2 semanas por marcador, o aproximadamente 10 semanas para una huella molecular con 5 marcadores.

La presente invención da a conocer un procedimiento novedoso y altamente sensible para la detección y caracterización de huella molecular de cantidades mínimas de ADN utilizando microscopia de fluorescencia, en un periodo de tiempo relativamente corto. El presente procedimiento se basa en la utilización de una superficie sólida no fluorescente, que opcionalmente forma parte de un sustrato (por ejemplo, una superficie cubreobjetos de vidrio tratada con un recubrimiento de silano), sobre la cual se transfieren macromoléculas (por ejemplo, ADN o proteínas). En una forma de realización de la invención, un gel fino con un grosor de \mum, se coloca entre una superficie tratada y una superficie no tratada (por ejemplo, una superficie de silano con enlaces C=C expuestos), tales como las que se pueden obtener a partir de un vidrio cubreobjetos. Una muestra que contiene macromoléculas, por ejemplo polinucleótidos y/o proteínas, puede cargarse sobre el gel, y puede llevarse a cabo una electroforesis a un pH alcalino, por ejemplo pH 8,0, para el que se da un enlace muy reducido o sustancialmente nulo de la macromolécula a los enlaces C=C de la superficie. A continuación, el ADN/proteínas se separan por electroforesis, y el pH se disminuye a efectos de favorecer el enlace del grupo reactivo de la macromolécula, por ejemplo, a pH 5,5, en condiciones eficaces para aumentar el enlace, por ejemplo, en un medio MES 50 mM para el enlace del ADN a los enlaces C=C. A continuación, las muestras pueden teñirse, y elevarse la temperatura del gel de modo suficiente para fundir el medio gel, por ejemplo, agarosa de punto de fusión bajo, y desplazarse dicho medio por traslación con respecto a la superficie a la que se ha enlazado la macromolécula. Tras el paso del menisco, esto resulta en una muestra orientada o estirada. A continuación, el estado de la macromolécula puede observarse por microscopia de fluorescencia, lo que da como resultado una huella molecular espacial directa de la localización específica en el gel de todos los fragmentos de ADN en el momento en que se enlazaron a la superficie. La presente tecnología lleva a cabo todo el procedimiento en un período de tiempo corto, es decir, aproximadamente entre 1 y 2 días, sin necesitar recurrir a amplificación por PCR. La presente invención es un procedimiento de detección extremadamente sensible, y proporciona una resolución espacial óptica de aproximadamente 0,3 \mum, y en algunos casos incluso mejor.

En otra forma de realización de la invención, el procedimiento puede llevarse a cabo sobre superficies no tratadas, por ejemplo, superficies que no presentan enlaces C=C, recubriéndolas con una capa de gel fino, tal como se conoce en la técnica, y sometiéndolas a electroforesis, tal como se ha descrito anteriormente, eliminando a continuación la segunda superficie (sacando el vidrio cubreobjetos por "flotación"), modificando el pH del gel hasta un valor de pH eficaz para favorecer los enlaces, y transfiriendo el gel directamente, por ejemplo para polinucleótidos a pH bajo, a una superficie diferente con grupos C=C expuestos a efectos de favorecer los enlaces.

El procedimiento de obtención de huellas moleculares según la presente invención es rápido, utiliza como mínimo una superficie no fluorescente pero reactiva, por ejemplo, una superficie con enlaces C=C expuestos u otros enlaces reactivos, produce una huella digital microscópica óptica, no es tecnología de tamaño macroscópico, y proporciona una alta resolución óptica ventajosa utilizando un microscopio a alta magnificación. Este procedimiento se basa en cambios sencillos, tales como cambios en la temperatura, el pH y otros tratamientos del gel después de enlazar las macromoléculas al grupo C=C u otros grupos reactivos de la superficie, o llevando a cabo electroforesis a un pH en el que no se produce sustancialmente ningún enlace, fomentando a continuación el enlace mediante la disminución del pH. Claramente, esto supone una mejora sustancial con respecto a la técnica anterior, siendo el procedimiento rápido, sencillo de aplicar, y utilizando biotécnicas moleculares estándar y combinándolas de un modo novedoso y no evidente.

La presente invención se extiende asimismo a la utilización de cantidades mínimas de un "marcador" o "etiqueta" como medio de autentificación de muestras, tales como fluidos. Sin embargo, también pueden utilizarse otras muestras colocándolas en un medio A, o disolviéndolas en el mismo. Frecuentemente, en el ámbito comercial, surgen problemas a la hora de autentificar en un determinado material, tal como un fluido, el hecho de que el mismo se corresponda con lo indicado en la etiqueta. Frecuentemente, se producen fraudes en la comercialización, por ejemplo, de perfumes, vinos, champanes falsificados y otros productos de precio elevado. Este aspecto de la invención se basa en la adición de cantidades mínimas de polinucleótidos conocidos de una hélice y de doble hélice (ds), tales como ADN, ARN y PNA, por ejemplo, ADN lineal de una hélice o ds-ADN lineal, en cantidades tan pequeñas como aproximadamente entre 10^{3} y 10^{6} macromoléculas, preferentemente entre aproximadamente 10^{4} y 10^{5} macromoléculas, hasta un volumen de entre aproximadamente 5 y 1.000 ml, por ejemplo en una botella de perfume o vino, como aditivo inerte que sería extremadamente difícil de detectar y/o duplicar a la hora de vender un producto fraudulento como sustituto del original. En una forma de realización de la presente invención, puede añadirse un polinucleótido ds lineal en una cantidad comprendida entre aproximadamente 10^{3} y aproximadamente 10^{6}, y en algunos casos incluso en cantidades menores, el cual tiene (i) una longitud, por lo menos, de aproximadamente diversos micrones (mayor o igual a aproximadamente 10 kb), y (ii) una o más secuencias de bases conocidas o específicas que producen un patrón o patrones de restricción únicos o huellas digitales al separarse mediante un campo eléctrico, por ejemplo, por electroforesis sobre un gel o un fluido, o tras un "mapeo óptico", tal como se describe en D. C. Schwartz (Meng, X, et al., Nature Genetics 9: 432 (1995)). El polinucleótido puede añadirse a una muestra fluida o, si la muestra no se encuentra en forma fluida, a un medio A adecuado para disolver y/o suspender la muestra que debe analizarse, por ejemplo, un perfume o vino. La adición del "marcador" puede llevarse a cabo durante el proceso de fabricación, o en el momento del embalaje para el transporte, en el lugar de origen o auténtico. Estas moléculas con una concentración y secuencia de bases inertes y desconocidas servirán como "sello pasivo" o "marcador interno" o "etiqueta de seguimiento", certificando la autenticidad de un producto o líquido. Es bien conocido el hecho de que el intestino puede romper y eliminar los polinucleótidos, por ejemplo ADN, al ser consumidos a través del tracto gastrointestinal y, en consecuencia, su adición no parece presentar ningún riesgo para la salud para humanos u otros mamíferos que pudieran ingerirlos. Además, no se conoce el hecho de que las aplicaciones de cantidades mínimas de polinucleótidos, por ejemplo ADN, sobre la piel u otras partes del cuerpo del mamífero, por ejemplo el cuerpo humano, presenten riesgos para la salud. A efectos de autentificar un producto o verificar su origen, puede extraerse para su análisis una muestra mínima, por ejemplo menos de aproximadamente 1 ml, que contiene varios cientos de macromoléculas. Sin embargo, cada muestra de ensayo requiere un volumen mucho menor, por ejemplo, típicamente entre aproximadamente 1 \mul y 50 \mul. Este pequeño volumen de muestra puede colocarse en un tubo Eppendorf, centrifugarse, y concentrarse, por ejemplo, en un evaporador de centrifugación rotativo por vacío, dejándose listo para su análisis y detección. Con este propósito pueden utilizarse diversos medios de detección sensible, tales como los descritos a continuación. El polinucleótido ds puede resuspenderse en un medio inerte apropiado, por ejemplo MES 50 mM a pH 5,5, para un volumen total, por ejemplo, de aproximadamente 20 \mul, y colocarse sobre una superficie, por ejemplo, una superficie no tratada o una superficie que comprende grupos C=C u otros grupos de enlace de macromoléculas, tales como los descritos anteriormente. A continuación, la muestra puede someterse directamente a la orientación macromolecular enlazando una parte, preferentemente un extremo de la misma, a la superficie (por ejemplo, una superficie con grupos C=C u otros grupos de enlace), o puede colocarse una superficie S' sobre la muestra y desplazarse la macromolécula por traslación, por ejemplo, por electroforesis, extrayéndose la superficie S' y sustituyéndose por una superficie S'' que comprende grupos C=C u otros grupos reactivos, y a continuación llevándose a cabo la orientación o estiramiento de acuerdo con lo descrito en la presente patente, por ejemplo, mediante el paso de una interfase aire/agua u otra combinación de medios (interfase), mediante evaporación o mediante medios mecánicos, incluyendo cizallamiento. A continuación, las macromoléculas pueden detectarse después de teñirse, por ejemplo, por microscopia de fluorescencia, tal como se ha descrito anteriormente. Si se desea, la secuencia de la macromolécula puede diseñarse de tal modo que contenga lugares de restricción específicos, y disponerse con una longitud apropiada, de tal modo que dichas macromoléculas pueden ser sometidas adicionalmente a una digestión de restricción mediante un cortador o cortadores conocidos específicos, por ejemplo, una enzima o enzimas de restricción, pudiéndose comparar el mapa físico resultante con un control para la macromolécula tratada de forma similar, por ejemplo, la huella molecular esperada o auténtica. Este procedimiento puede llevarse a cabo también en el orden inverso, pudiéndose concentrar el polinucleótido ds, a continuación digerirse mediante digestión de restricción en un tubo Eppendorf, y a continuación colocarse en un medio, por ejemplo, un gel fino a un pH en el que la macromolécula no se enlace con la superficie, por ejemplo, pH 8,0, y someterse a electroforesis a efectos de fraccionar los fragmentos, modificándose a continuación el pH a efectos de favorecer el enlace de la macromolécula, por ejemplo, disminuyéndose hasta aproximadamente un pH de 5,5, poniéndose en contacto S'' con el medio A, por ejemplo, transfiriendo la macromolécula a una superficie de enlace con grupos C=C u otros grupos de enlace, por ejemplo, un papel de filtro de enlace, y enlazándose a la misma, pudiéndose elevar a continuación la temperatura a efectos de fundir el medio de punto de fusión bajo, por ejemplo, gel de agarosa, y pudiéndose a continuación someterse a cizallamiento mecánico la macromolécula o macromoléculas, o los fragmentos de las mismas, a efectos de orientarlas o estirarlas. Alternativamente, las macromoléculas secadas y concentradas, por ejemplo ADN, pueden rehidratarse, por ejemplo, con un medio amortiguado adecuado, y a continuación la macromolécula o macromoléculas pueden amplificarse mediante la reacción en cadena de polimerasa a efectos de producir productos de PCR normales o largos (LR-PCR). A continuación, estos productos de PCR pueden detectarse, obtenerse su mapeo de restricción, o secuenciarse y compararse con un control, a efectos de determinar si el patrón o secuencia macromoleculares de la muestra coinciden con el patrón o secuencia macromoleculares auténticos conocidos o esperados. A continuación se exponen algunas de las mejoras no evidentes que la presente invención proporciona con respecto a la técnica anterior. Esta tecnología utiliza macromoléculas de una naturaleza extremadamente estable, por ejemplo, ADN, como medio de autentificación del origen de diferentes productos, y se utilizan y/o requieren cantidades muy pequeñas de las macromoléculas, es decir, concentraciones muy bajas. Además, la naturaleza específica de la macromolécula es difícil de detectar y duplicar, dado que para ello debe conocerse la secuencia exacta de la macromolécula, y la secuencia de la macromolécula puede modificarse fácilmente para cada uno de los lotes o cargamentos a efectos de introducir más variabilidad y, de este modo, ofrecer dificultades al potencial falsificador. La selección de medios para una detección sensible es novedosa y no evidente, así como lo es la utilización de superficies que comprenden grupos C=C y otros grupos de enlace para la orientación macromolecular como medio de detección ultrasensible, y la utilización de las enzimas y protocolos convencionales de PCR y LR-PCR, y/o combinaciones de los mismos. La presente tecnología proporciona a los fabricantes un medio sencillo de disuasión y autentificación o verificación, y/o prevención de las falsificaciones de sus productos. Esta tecnología es sencilla de implementar en el origen; sencilla de verificar y leer utilizando técnicas estándar de biología molecular; y difícil de falsificar, dado que la duplicación exacta de un fragmento largo de ds-ADN es difícil de llevar a cabo, ya que la secuencia precisa de la macromolécula debe primero determinarse y a continuación clonarse y sintetizarse en una cantidad y con una velocidad suficientes para utilizarla antes de que ese lote en particular desaparezca del mercado.

La presente invención se refiere asimismo a la utilización de las superficies según la invención que comprenden grupos C=C y otros grupos o restos reactivos descritos en la presente memoria para la preparación de sustratos y dispositivos estructurados. Las superficies reactivas según la invención pueden incorporarse a estructuras tales como "biochips" o "Microlabs", que comprenden un "microlaboratorio analítico completo" en un chip para un propósito determinado. Dichos chips comprenden un extremo frontal como zona de preparación de la muestra, una zona de fraccionamiento o separación, típicamente también una cámara o cámaras de reacción en las que se añaden diversos reactivos o productos, y típicamente un área de detección para la lectura de las propiedades de la macromolécula o macromoléculas, por ejemplo, mediante medios ópticos o eléctricos. Las superficies según la presente invención son útiles para la inmovilización de macromoléculas tales como ácidos nucleicos o proteínas, entre otras, en una cámara de reacción de un "biochip" de este tipo, y también como medio para efectuar separaciones mediante la acción de un menisco en movimiento, un flujo hidrodinámico, u otra restricción o campo de fuerzas. Las superficies según la presente invención también pueden ser utilizadas para la detección o cuantificación de las macromoléculas que se desee, en la fase de lectura del chip, por ejemplo, mediante dispositivos fotónicos internos (diodo láser/fotodiodo), externos (microscopio), y similares. Una de las aplicaciones de la presente invención es como medio de inmovilización de macromoléculas a efectos de llevar a cabo una separación o identificación de una macromolécula determinada o deseada dentro de una muestra. La invención utiliza superficies reactivas dentro de un dispositivo estructurado como medio de inmovilización de una molécula o moléculas o una macromolécula o macromoléculas, para posteriormente someter las macromoléculas enlazadas a una orientación o estiramiento, tal como se ha descrito anteriormente, a efectos de identificar, separar y/o medir la cantidad de una macromolécula deseada.

Otras ventajas y características de la presente invención podrán ser apreciadas haciendo referencia a los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

Se adquirieron \lambda-ADN y anticuerpos monoclonales (anti-DIG) a Boehringer-Mannheim. Se adquirieron los triclorosilanos a Roth-Sochiel. Se adquirieron colorantes fluorescentes de ácidos nucleicos (YOYO-1) a Molecular Probes. Se adquirieron vidrios cubreobjetos ESCO prelimpios (22 mm^{2}) a Erie Scientific. Se adquirieron perlas magnéticas a Dynal Corp. Los microscopios utilizados incluían (i) un objetivo invertido Nikon DiaphotR con 60x/1,4 N.A., equipado con un quemador Xenon para epifluorescencia, con un juego de filtros Omega Optical y un intensificador de imagen ICCD de Hamamatsu para la observación en video, o (ii) un microscopio invertido fabricado a medida que incluía un mecanismo de foco OlympusR, un objetivo Zeiss® 100x/1,3 N.A., un láser de argón (línea de 488 nm) para estimular el fluoróforo, un juego de filtros ópticos Omega, y un intensificador de imagen ICCD híbrido DEP.

Ejemplo 2

Tratamiento de superficie

Se retiraron los vidrios cubreobjetos prelimpios de la caja utilizando pinzas, y se colocaron en portadores de Teflón® construidos a medida, diseñados para soportar cada uno de los vidrios cubreobjetos verticalmente con una separación mínima de por lo menos 2 mm. A continuación, estas hileras de aproximadamente 20 cubreobjetos se cargaron en una cámara de reacción especial diseñada para el lavado y la silanación, con un volumen de aproximadamente 2 litros, y se pulverizaron con O_{2} puro durante 10 minutos a una velocidad de flujo de 4 l/min. El lavado orgánico de las superficies se llevó a cabo iluminando una fuente de UV dentro de la cámara, creándose ozono, que reacciona con las sustancias orgánicas de la superficie, durante típicamente un mínimo de 4-6 horas, siendo mucho más prolongados los períodos de lavado en que se alcanzaron los mejores resultados (de 12 a 72 horas). Tras purgar el ozono (en una campana de gases) durante 5-10 minutos con O_{2} seco, las placas limpias se hidrataron con una humedad controlada de O_{2} húmedo, generalmente en una atmósfera con una HR comprendida entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 30%, y a veces incluso más elevada, típicamente del 10%, durante 20 minutos y con una velocidad de flujo reducida de 250 ml/min, a efectos de permitir que las moléculas de agua se enlacen a la superficie. Las moléculas de agua son una especie química necesaria en la reacción de silanación para los triclorosilanos utilizados en la presente invención. A continuación, se introdujeron entre 100 y 200 \mul de un triclorosilano Cl_{3}-Si-(CH_{2})N-CH=CH_{2} en la cámara a través de un pequeño puerto y mediante una aguja de jeringuilla de acero inoxidable, a efectos de no perturbar las condiciones de reacción internas controladas. Si se desea, esto puede alcanzarse mediante bombeo hacia la cámara a efectos de vaporizar el silano, o calentándolo a efectos de aumentar la difusión del material de recubrimiento. Las superficies se recubrieron durante una noche (12 horas) para N = 6, o rápidamente (1 hora) para N = 1. Tras extraerlas, frecuentemente las superficies aparecían ligeramente borrosas y eran hidrofóbicas (es decir, no humectantes), dando ángulos de contacto grandes, de aproximadamente 90 grados, para una gota de agua. Las superficies se guardaron envueltas en bolsas de aluminio en estanterías de laboratorio hasta su utilización.

Los grupos funcionales expuestos de estas superficies con grupos C=C se convirtieron en grupos carboxilo -COOH sumergiendo los cubreobjetos tratados, tal como se ha descrito anteriormente, durante por lo menos 15 min. en una solución de 25 mg de KMnO_{4}, 750 mg de NaIO_{4} en 1 litro de H_{2}O, enjuagándolos posteriormente 3 veces en H_{2}O pura desionizada. En algunas situaciones, las superficies con C=C se hicieron reaccionar con proteínas. Se depositó un volumen de 300 \mul de una solución acuosa (20 \mug/ml) y de proteína (proteína A, estreptavidina, etc.) sobre la superficie, y se hizo reaccionar con el grupo funcional vinilo C=C. Las superficies se incubaron, típicamente durante 1-2 horas a temperatura ambiente, y posteriormente se enjuagaron 3 veces en una solución salina amortiguada con fosfato (PBS). En este estado, las superficies estaban limpias pero eran hidrofílicas (se mojaban muy bien). Las superficies incubadas en proteína A se convirtieron en superficies de anticuerpo (anti-DIG) incubando las superficies de proteína A, típicamente durante 1-2 horas a temperatura ambiente, con una solución de un anticuerpo (20 \mug/ml). Se cree que no debe proporcionarse demasiada proteína A o anticuerpo a la superficie, ya que de lo contrario los efectos de los impedimentos estéricos afectarían negativamente a la reactividad de las superficies.

Ejemplo 3

Anclaje de ADN nativo a una superficie C=C

Utilizando una punta de pipeta con una abertura aumentada (realizada cortando la punta) a efectos de impedir el cizallamiento del ADN, se depositó una alícuota de 5-10 \mul de una solución de \lambda-ADN de 10^{7} moléculas/microlitro (10^{-16} moles) sobre una superficie tratada, recién enjuagada en agua ultrapura. Para las observaciones basadas en fluorescencia, el \lambda-ADN se tiño con YOYO-1 u otros fluoróforos. A continuación, un vidrio cubreobjetos redondo limpio y recién enjuagado de 18 mm de diámetro, típicamente no tratado, se hizo descender suavemente sobre la gota de líquido, de tal modo que se evitó que las fuerzas de cizallamiento rompieran la molécula. Típicamente se observó una extensión muy lenta de la gota, frecuentemente de 10 segundos, antes de que la línea de contacto en movimiento alcanzara el borde del vidrio cubreobjetos redondo.

Había por lo menos dos parámetros de control clave: el tiempo de incubación y el procedimiento de desplazamiento del menisco. La solución se incubó en un período comprendido desde diez segundos a diversas horas, en una atmósfera seca o húmeda (100% de HR), dependiendo del efecto deseado. Algunas muestras se incubaron durante entre 10 y 30 segundos, y a continuación se sometieron a cizallamiento mecánico tirando de los cubreobjetos superior e inferior, lateralmente y transversalmente entre ellos, durante un periodo de entre 5 y 10 segundos, utilizando pinzas para sujetar los bordes exteriores de las dos superficies. El tiempo de incubación afecta al porcentaje de ADN que se enlaza, ya que el procedimiento de enlace está limitado por la difusión y la probabilidad de enlazarse una vez en contacto con la superficie es constante. De este modo, cuanto mayor es el tiempo de incubación, más enlace existe. Sin embargo, si se espera demasiado tiempo, por ejemplo toda una noche, es probable que los dos extremos de una determinada molécula de ADN se enlacen, dando lugar a una forma en U o "bucle" tras el paso del menisco, en lugar de segmentos lineales rectos. La utilidad del cizallamiento mecánico, tal como se describe, consiste en que reduce el tiempo necesario de espera para ver el resultado, dado que el cizallamiento es rápido (un minuto como máximo) y la evaporación, por ejemplo, puede durar horas.

En un amortiguador de MES 50 mM, a pH 5,5, el enlace se observó homogéneamente a lo largo de superficies bien tratadas. Como comparación, en un amortiguador de Tris 10 mM, EDTA 2 mM, a pH 8,0, prácticamente no existe enlace (menos de 1 en 10^{6}). Esta dependencia puede permitir el control por la activación de las superficies en relación con el enlace de ADN utilizando un pH intermedio.

Ejemplo 4

Alineación y detección de ADN anclado mediante la acción del menisco

Tanto transfiriendo la muestra incubada a un entorno seco y dejando evaporar el disolvente, como sometiendo a cizallamiento mecánico la muestra, tal como se ha descrito anteriormente, el paso del menisco extiende las moléculas de ADN ancladas a la superficie por un extremo o por los dos, en dirección perpendicular al menisco (ver figura 5). La fuerza ejercida sobre las moléculas de ADN (típicamente de decenas de pN), cuya naturaleza se supone capilar, es de hecho suficiente para extender completamente la molécula (es decir, que es mayor que la fuerza entrópica elástica del movimiento browniano fluctuante), pero es demasiado débil para romper el enlace, quizás de naturaleza covalente, entre el ADN y la superficie silanada/tratada. El ADN, si se tiñe previamente con un fluoróforo (YOYO-1), se observa inmediatamente y puede observarse estirado, con una longitud total de 20-25 \mum. El anclaje entre la superficie y el ADN se limita a los extremos, quizás al fosfato 5', y también se ha observado con ADN de tipo \lambda, de YAC o de E. Coli (con una longitud mayor de 450 \mum). Esta preparación y fijación del ADN, estirado, fluorescente y secado al aire, es estable durante varios días, a veces incluso semanas y meses (si se almacena adecuadamente protegido de la luz ambiental), y puede observarse por microscopia de epifluorescencia, típicamente en un microscopio invertido con una ramificación alta/abertura numérica alta, con objetivo de inmersión en aceite (100x/1,4 N.A., por ejemplo).

Ejemplo 5

Anclaje específico y detección

Tras el tratamiento de superficie, tal como se ha descrito anteriormente, con un anticuerpo monoclonal específico, puede controlarse de forma muy precisa la especificidad de la superficie. De este modo, la especificidad de las superficies tratadas con anti-DIG se examinó frente a ADN hibridizado con un oligonucleótido complementario para uno de los extremos cohesivos o "pegajosos", y conteniendo una digoxina (DIG) frente a ADN no hibridizado. En el primer caso, se observó una extensión homogénea por la acción del menisco de las moléculas ancladas. En el segundo caso, se observaron menos de 10 moléculas de ADN ancladas en toda la muestra. Se estima que la especificidad del procedimiento según la presente invención es superior a 1:10^{6} (ver subfigura 2A y subfigura 2B) (ver subfigura
2A y 2B).

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Ejemplo 6

Detección sensible

A efectos de determinar la sensibilidad del procedimiento de detección a la extensión debida al paso de un menisco, se depositaron sobre una superficie alícuotas de 2,5 \mul de una solución de \lambda-ADN en MES 50 mM, a pH 5,5, que contenían 10^{5}, 10^{4} y 10^{3} moléculas. El enlace se llevó a cabo de forma similar a lo que se ha descrito anteriormente. A continuación, se observaron las diferentes superficies bajo el microscopio de epifluorescencia, a efectos de determinar la densidad de las moléculas ancladas. Para la dilución más baja (10^{3} moléculas), se observaron más de 10 moléculas de ADN (después de observar 125 campos de emisión) extendidas por la acción del menisco. Este número está limitado esencialmente por el elevado número de campos de visión necesarios para cubrir toda la muestra (aproximadamente 20.000). Esto hace que la búsqueda manual sea compleja, pero se puede llevar a cabo ventajosamente de forma automática mediante el control por computador del estado y del procesamiento de imágenes, o con un objetivo de baja potencia. Como conclusión, la sensibilidad del procedimiento de detección según la presente invención ya ha detectado la presencia de 1 en 100 moléculas de ADN, y se supone que tiene una sensibilidad aún mayor (suponiendo un límite de detección aún más bajo) para permitir la detección de una sola molécula.

Ejemplo 7

Dependencia del estiramiento con respecto al tratamiento de superficie

El histograma de las longitudes medidas de las moléculas de \lambda-ADN insertadas en una superficie silanada, tras la acción de un menisco en movimiento, muestra un pico bien definido a 24 \mum, mientras que en una superficie recubierta con proteína A y luego anti-DIG, el histograma de longitudes de \lambda-ADN extendido (marcado en un extremo con una molécula de DIG, tal como se ha descrito anteriormente), sólo muestra un pico definido a 16 \mum (frecuentemente hasta 18 \mum). Así pues, el estiramiento depende del tratamiento de superficie y de la preparación de la superficie. Los resultados pueden mostrarse como un histograma de las longitudes medidas de N fragmentos de moléculas de
\lambda-ADN, y como imagen típica (inserción), tras (A) estiramiento por el paso del menisco sobre una superficie hidrofóbica (tratada con silano), o (B) una superficie tratada para ser hidrofílica (con proteína A/anti-DIG). La figura demuestra la dependencia de la calidad o grado de estiramiento con respecto al tratamiento de superficie y la hidrofobia (ver figura 1, Bensimon et al., Phys. Rev. Lett. 74: 4754 (1995)).

Ejemplo 8

Estiramiento homogéneo

A efectos de determinar si el estiramiento es homogéneo (independientemente de la longitud de la molécula), se preparó una solución de multímeros de \lambda-ADN por ligación utilizando E. Coli T4 ligasa. Esta solución se injertó en algunas superficies silanadas y a continuación se estiró mediante la acción del menisco en movimiento. El histograma de longitudes de las moléculas extendidas muestra 3 picos equidistantes correspondientes a las longitudes de los monómeros, dímeros y trímeros. En consecuencia, el estiramiento por parte del menisco es bastante homogéneo. (Figura 4).

Claims (16)

1. Procedimiento de obtención de una superficie S que proporciona orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento consistentes, homogéneos y reproducibles de macromoléculas, que comprende:

lavar una superficie S de un sustrato bajo condiciones eficaces para obtener una superficie S sin moléculas orgánicas ni polvo;

hidratar S; y

recubrir S con un material deseado que comprende unos restos expuestos capaces de enlazarse selectivamente con macromoléculas, llevándose a cabo las etapas de lavado, hidratación y recubrimiento en una única cámara, y proporcionando la superficie S la orientación consistente, homogénea y reproducible de una macromolécula enlazada a la misma.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que incluye las etapas adicionales siguientes:

irradiar S con radiación UV en una atmósfera oxidante;

humidificar la atmósfera; y

recubrir S con un polímero que comprende un resto reactivo expuesto.

3. Procedimiento reproducible de orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento de una macromolécula sobre una superficie, que comprende:

poner una macromolécula en contacto con una superficie S obtenida mediante el procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 y un medio A, de tal modo que un lugar de la macromolécula se enlaza a S y una parte de la misma se sitúa en A; y

aplicar una fuerza aleatoria o no aleatoria a la macromolécula en contacto con el medio A, tal como una fuerza gravitacional, magnética, electroforética, o inducida por temperatura, en condiciones eficaces para orientar, alinear, enderezar o estirar dicha macromolécula.

4. Procedimiento reproducible de orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento de una macromolécula sobre una superficie, que comprende:

poner una macromolécula en contacto con una superficie S obtenida mediante el procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 y un medio A, de tal modo que un lugar de la macromolécula se enlaza a S y una parte de la misma se sitúa en A; y

desplazar por traslación mecánica los contenidos de A en relación con S, en condiciones eficaces para orientar, alinear, enderezar o estirar la macromolécula.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha etapa de traslación mecánica se lleva a cabo colocando una superficie de nivel S' en contacto con A, opuesta a S, y desplazando S o S' con respecto a la otra superficie.

6. Procedimiento reproducible de orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento de una macromolécula sobre una superficie, que comprende:

poner una macromolécula en contacto con una superficie S obtenida mediante el procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 y un medio A, de tal modo que un lugar de la macromolécula se enlaza a S y una parte de la misma se sitúa en A; y

desplazar por traslación mecánica los contenidos de A en relación con S, en condiciones eficaces para orientar, alinear, enderezar o estirar la macromolécula, llevándose a cabo dicha etapa de traslación mecánica colocando una superficie de nivel S' en contacto con A, opuesta a S, y desplazando S o S' con respecto a la otra superficie.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende la etapa adicional de añadir un tensioactivo a A o a un medio que tiene interfases con A y S antes de la etapa de traslación.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende asimismo la modificación de S mediante el anclaje sobre S de moléculas que se enlazan selectivamente a un tipo específico de macromolécula, o una parte de la misma, antes de la etapa de traslación.

\newpage

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, aplicado a cualquiera de las utilizaciones siguientes:

medir un grado deseado de orientación, alineación, enderezamiento o estiramiento de un tipo específico de macromolécula enlazado a la superficie S,

incluyendo dicho procedimiento la comparación, identificación, determinación y/o separación de la macromolécula o fragmento de la misma en relación con otras moléculas.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, aplicado a cualquiera de las siguientes utilizaciones:

identificar un tipo específico de macromolécula presente en una muestra,

incluyendo dicho procedimiento la comparación, identificación, determinación y/o separación de la macromolécula o fragmento de la misma en relación con otras moléculas.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, aplicado a cualquiera de las siguientes utilizaciones:

determinar el número de un tipo específico de macromolécula presente en un volumen conocido de una muestra,

incluyendo dicho procedimiento la comparación, identificación, determinación y/o separación de la macromolécula o fragmento de la misma en relación con otras moléculas.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, aplicado a cualquiera de las siguientes utilizaciones:

separar un tipo específico de macromolécula de entre otros tipos de macromoléculas presentes en una muestra,

incluyendo dicho procedimiento la comparación, identificación, determinación y/o separación de la macromolécula o fragmento de la misma en relación con otras moléculas.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, aplicado a cualquiera de las siguientes utilizaciones:

medir la longitud de un tipo específico de macromolécula o fragmento de la misma,

incluyendo dicho procedimiento la comparación, identificación, determinación y/o separación de la macromolécula o fragmento de la misma en relación con otras moléculas.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, en el que el enlace del tipo específico de macromolécula a las moléculas se detecta con una marca magnética, coloreada o fluorescente.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, aplicado a la medición de la longitud de un tipo específico de macromolécula o fragmento de la misma, incluyendo dicho procedimiento la determinación de una distancia deseada por comparación con una longitud determinada o de referencia.

16. Superficie S obtenida mediante un procedimiento según la reivindicación 1, que es hidrofóbica.