ES2296334T3 - Preparacion de alfa-1-antitripsina y procedimiento de produccion de la misma. - Google Patents

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Abstract

Preparado de alfa1-AT nativa, purificada por cromatografía, caracterizado porque contiene como mínimo el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4 y presenta una pureza de como mínimo 1,0 PU/mg de proteína y una actividad relativa de alfa1-AT en plasma de como mínimo el 120%.

Description

Preparación de alfa-1-antitripsina y procedimiento de producción de la misma.
La invención se refiere a preparaciones de alfa-1-antitripsina, a su procedimiento para de producción y también a la utilización de dichas preparaciones.
La alfa-1-antitripsina (\alpha1-AT) es una proteína presente en el plasma que, debido a sus propiedades estructurales y funcionales, se clasifica dentro de la superfamilia de las serpinas ( Serine protease inhibitors - inhibidores de la serina-proteasa). Debido a su efecto inhibidor de la serina-proteasa, la \alpha1-AT también es conocida con el nombre de inhibidor de la \alpha1-proteinasa. La \alpha1-AT es responsable de aproximadamente un 90% de la capacidad de inhibición tríptica del plasma normal, por lo que con frecuencia también se denomina serpina de plasma principal (major plasma serpin). La actividad inhibidora de la \alpha1-AT con respecto a la elastasa tiene una especial importancia fisiológica.
Principalmente, la \alpha1-AT es una proteína protectora que ha de proteger las células frente a enzimas proteolíticas libres. Se sintetiza en el hígado y se segrega en el plasma, donde tiene una vida media de aproximadamente 6 días. La concentración de \alpha1-AT en plasma normal es de 1,3 g/l.
La \alpha1-AT es una molécula relativamente pequeña y polar que llega rápidamente a los líquidos intracelulares, donde puede actuar. La \alpha1-AT humana consiste en una única cadena polipeptídica de 394 residuos de aminoácido con tres posiciones de glicosilación en los residuos de asparagina de las posiciones 46, 83 y 247. Mientras que las asparaginas 46 y 247 presentan cadenas laterales de hidrocarburo sializadas tanto bi- como tri- antenales, la asparagina 83 sólo presenta una cadena lateral biantenal sializada (Carrell y col., Nature 298 (1982), 329-334).
La cadena proteínica de la \alpha1-AT está presente en el plasma en dos formas, en una de las cuales se ha eliminado un pentapéptido N-terminal.
Debido a estas cadenas laterales de hidrocarburo, pero también posiblemente a la eliminación del pentapéptido, se produce una microheterogeneidad muy marcada que también puede variar dentro de un mismo individuo. Así, ocurre que se producen cambios considerables en las proporciones de estas isoformas de las moléculas de \alpha1-AT durante los procesos inflamatorios o durante la administración de estrógenos, lo que probablemente se puede atribuir a que, debido a la situación de estrés, se descomponen preferentemente las formas parcialmente desializadas, para la recuperación más rápida de los niveles de plasma normales (Patterson, Comp. Biochem. Physiol. 100 B (3) (1991, 439-454).
El efecto inhibidor de la serina-proteasa de la \alpha1-AT se atribuye a la formación de complejos 1:1 estables entre la \alpha1-AT y la proteasa diana. Por consiguiente, la \alpha1-AT actúa como una especie de "sustrato suicida" con el que se impide la posterior reacción de la proteasa de l serina-proteasa. El efecto de la \alpha1-AT es inhibido sobre todo por radicales libres, los cuales también se forman en el transcurso de los procesos inflamatorios. Fisiológicamente, esta labilidad de oxidación probablemente se utiliza para impedir la actividad inhibidora de las enzimas de la \alpha1-AT en las inmediaciones de la inflamación, para que proteasas tales como la elastasa y la catepsina G puedan desplegar todo su efecto en la lucha contra bacterias inflamatorias, por ejemplo.
Sin embargo, la labilidad de oxidación de la \alpha1-AT resulta desventajosa sobre todo en los lugares en los que la \alpha1-AT, o el líquido que contiene la \alpha1-AT, está expuesta, por ejemplo en los líquidos del tracto respiratorio. El tejido elástico del pulmón está protegido de los ataques superficiales esencialmente por dos inhibidores: el inhibidor de proteasa de leucocitos de secreción humano, el cual principalmente se encuentra en el tracto respiratorio superior, y la \alpha1-AT, que está presente predominantemente en el tracto respiratorio inferior. Aunque normalmente existe una capacidad inhibidora más que suficiente para la defensa del tracto respiratorio inferior, cuando existe una exposición excesiva a los radicales libres, como es el caso de los grandes fumadores, pueden surgir problemas (la capacidad inhibidora de la \alpha1-AT se reduce aproximadamente a la mitad en el caso de los grandes fumadores).
Entre tanto se conocen más de 70 variantes cualitativas y cuantitativas de la \alpha1-AT humana que se transmiten como alelos codominantes autosómicos, y se supone que aproximadamente un 10% (!) de la población europea es portadora de una variante patológica de la \alpha1-AT. También se conocen deficiencias de \alpha1-AT, que son relativamente corrientes. Los diagnósticos patológicos más notables en relación con la varianza genética de la \alpha1-AT consisten en una enfermedad pulmonar degenerativa que comienza a una edad relativamente temprana y una enfermedad hepática grave. Pero también se asocian a la varianza genética de la \alpha1-AT enfermedades renales, artritis y enfermedades malignas. Especialmente en el caso de la enfermedad pulmonar, es seguro que ésta se puede atribuir directamente al nivel plasmático de la \alpha1-AT correspondiente, que, debido al deterioro proteolítico acumulado, provoca una pérdida de la elasticidad pulmonar. Por ejemplo, un gran fumador con una carencia de \alpha1-AT homocigótica está doblemente expuesto y corre un alto riesgo de desarrollar un efisema grave, incluso a edades inferiores a 40 años. En comparación con un homocigoto no fumador, tendría una esperanza de vida 20 años menor.
La \alpha1-AT está presente en el plasma tanto en forma activa como en forma inactiva (véase, por ejemplo, Pajdak W. y col., Folia Histochemica et Cytobiologica, vol. 24 (1986), págs. 169-172).
Ya son conocidos diversos procedimientos para producir la \alpha1-AT, los cuales incluyen la precipitación fraccionada de plasma con polietilenglicol 4000, pero también la preparación de diferentes fracciones de plasma (precipitado IV-1 de fracción de Cohn o sobrenadante A o A+1 de Kistler y Nitschmann) (Feldman y Winkelman, Blood Separation and Plasma Fractionation (1991), Wiley-Liss, Inc., págs. 341-383).
De acuerdo con el documento WO 95/35306 A, la \alpha1-AT se purifica mediante precipitación con PEG, tratamiento con un intercambiador de aniones y en un medio de quelato metálico.
En purificaciones más profundas, las fracciones sanguíneas correspondientes se purifican con DEAE-celulosa, por ejemplo (Basis y col. (Vopr. Med. Khim. 33 (1) (1987), 54-59); Chan y col. (FEBS Lett. 35(1) (1973), 79-82)), con materiales de cromatografía de afinidad o con materiales de cromatografía de intercambio catiónico EP-0 698 615-A1).
Basis y col. describen un procedimiento para purificar la \alpha1-AT mediante precipitación con sulfato amónico de plasma y, a continuación, mediante cromatografía con DEAE-celulosa y cromatografía con hidroxilapatita. Este procedimiento se lleva a cabo siempre en presencia de mercaptoetanol, que ha de proteger la proteína frente a la oxidación de grupos con contenido en S. Después de la cromatografía con hidroxilapatita, se obtiene la \alpha1-AT en dos fracciones, pero las dos proteínas, \alpha1-AT y albúmina, no se separan por completo.
En el curso de los trabajos preparatorios para la presente invención se ha comprobado que con ninguno de los procedimientos de producción usuales, pero específicamente con los procedimientos según Basis y col. y según el documento EP-0 698 615-A1, se logra separar por completo la \alpha1-AT inactiva que está presente en la constitución del plasma junto con la \alpha1-AT activa, ni producir un preparado manteniendo los isómeros activos.
Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición un procedimiento con el que se pueda obtener un preparado de \alpha1-AT en el que se mejore la proporción entre la \alpha1-AT activa y la \alpha1-AT inactiva a favor de la \alpha1-AT activa; es decir, con el que la \alpha1-AT inactiva se pueda separar selectivamente de la \alpha1-AT activa.
Otro objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición un preparado de \alpha1-AT mejorado en comparación con los preparados usuales.
En consecuencia, el objeto de la presente invención constituye un preparado basado en \alpha1-AT nativa, purificada por cromatografía, que contiene como mínimo el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4 y presenta una pureza de como mínimo 1,0 PU/mg de proteína y una actividad relativa de \alpha1-AT en plasma de como mínimo el 120%.
La actividad relativa de \alpha1-AT en plasma se define como la proporción entre la \alpha1-AT activa y la inactiva, tomando como referencia para esta proporción un plasma con un 100% de actividad relativa en plasma de \alpha1-AT. Para las preparaciones propuestas según la invención, esta actividad relativa de \alpha1-AT en plasma preferentemente es superior al 130%, de forma especialmente preferente superior al 140% y en particular superior al 150%. En casos especiales, la actividad relativa de \alpha1-AT en plasma es incluso superior al 160%. Debido a su pureza, la proteína contenida en los productos según la invención se puede equiparar aproximadamente a la proteína \alpha1-AT, con lo que la actividad relativa de \alpha1-AT en plasma se puede calcular de forma sencilla.
La \alpha1-AT siempre está presente en la sangre o el suero en una proporción determinada en forma inactiva, es decir, prácticamente no posee ninguna actividad inhibidora de la elastasa, pero sigue siendo inmunorreactiva. La cantidad total de \alpha1-AT (activa e inactiva) se puede determinar con todos los métodos habituales, por ejemplo métodos inmunológicos de cuantificación de antígenos como ELISA.
Las causas de la presencia de \alpha1-AT inactiva pueden ser diversas, por ejemplo la \alpha1-AT puede estar inactiva debido a una disociación de la molécula o debido a deficiencias en la conformación.
Dado que normalmente la sangre o el suero pueden presentar hasta un 20% de \alpha1-AT inactiva y que ésta no se puede separar con los métodos usuales, el preparado según la invención constituye un avance esencial con respecto a los preparados de \alpha1-AT convencionales, que hasta ahora siempre "arrastraban consigo" la porción inactiva. Como ya se ha mencionado, la concentración de \alpha1-AT en plasma normal es de aproximadamente 1,3 g/l, lo que corresponde a una actividad específica de 0,77 PU (unidades de plasma, determinadas en el ensayo de inhibición de elastasa, véase el Ejemplo 3)/mg.
El preparado de \alpha1-AT según la invención contiene preferentemente como mínimo el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4.
Sorprendentemente se ha comprobado que la actividad de la \alpha1-AT es muy alta precisamente a causa de la presencia de este isómero. Dado que en los procedimientos para la obtención de \alpha1-AT descritos en el estado actual de la técnica el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4, a causa de su naturaleza ácida, siempre se ha separado junto con la albúmina de la fracción de \alpha1-AT a obtener, hasta ahora no se encuentra ninguna proporción digna de mención de dicho isómero en ningún preparado de \alpha1-AT. Sin embargo, en el curso de la presente invención se ha reconocido precisamente la importancia de este isómero con respecto al rendimiento de la actividad y, en consecuencia, de acuerdo con la invención, en el procedimiento de producción preferentemente sólo se prevén pasos que no permitan la separación de este isómero del resto de la \alpha1-AT, o que sólo la permitan en una proporción insignificante, con lo que la mayor parte de este isómero ácido también está presente en el preparado final.
Por consiguiente, la distribución de isómeros del preparado preferente corresponde a la de la proteína nativa, especialmente a la de la proteína obtenible a partir de un pool de plasma. En particular, en la representación por enfoque isoeléctrico (IEF), la distribución de isómeros del preparado de \alpha1-AT según la invención corresponde a un patrón de bandas en cuadruplete.
En particular, el IEF se lleva a cabo con el gel Ampholine PAG plate IEF^{TM} (pH 4,0 - 6,5 o pH 4,0 - 5,0), de Pharmacia, de acuerdo con las instrucciones de Pharmacia, utilizando marcadores de IEF de la firma Sigma (IEF Mix 3,6 - 6,6).
El isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4 corresponde a la banda más ácida. Pero precisamente en los preparados de \alpha1-AT puros o muy puros, este isómero falta por completo o sólo está contenido en una pequeña cantidad por debajo del límite de detección.
En particular, el preparado de \alpha1-AT según la invención presenta una alta pureza, por ejemplo una pureza superior a 1 PU/mg. Incluso se ha comprobado que, de acuerdo con la invención, se pueden alcanzar purezas de más de 1,1 PU/mg, en especial de más de 1,2 PU/mg.
El preparado según la invención contiene normalmente menos del 10%, preferentemente menos del 5%, en particular menos del 2%, de \alpha1-AT inactiva.
De acuerdo con la presente invención también se puede obtener un preparado de \alpha1-AT esencialmente libre de \alpha1-AT inactiva.
La proporción de \alpha1-AT activa con respecto a \alpha1-AT inactiva aparece aumentada en el preparado según la invención, en particular es mayor que en el plasma normal humano. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención se puede obtener una \alpha1-AT hiperactiva o calificable como "naciente".
De acuerdo con la presente invención, por "plasma normal" se ha de entender un plasma normalizado con respecto al contenido en \alpha1-AT activa. La normalización, es decir, la determinación de \alpha1-AT activa, se puede llevar a cabo mediante los métodos habituales para ello, por ejemplo mediante inhibición de la actividad de la elastasa o la
tripsina.
En comparación con los preparados según el estado actual de la técnica, el preparado según la invención, en especial el preparado previsto para la administración farmacéutica, tiene la ventaja esencial de que, debido a su bajo contenido en \alpha1-AT inactiva, está mucho más definido en cuanto a su eficacia que los preparados conocidos, lo que resulta enormemente ventajoso, sobre todo en caso de su utilización en medicina.
Preferentemente se obtiene una \alpha1-AT conservativa, en la que se puede evitar la utilización de estabilizantes de oxidación, como \beta-mercaptoetanol. Por consiguiente, en el marco de la presente invención, "conservativa" significa que la \alpha1-AT también es suficientemente estable sin la presencia de estabilizantes de oxidación tales como \beta-mercaptoetanol, lo que ha resultado sorprendente, sobre todo teniendo en cuenta la alta labilidad de oxidación conocida de la \alpha1-AT.
El preparado según la invención se puede producir a partir de sangre, de plasma, de suero o de fracciones de éstos, pero también a partir de cultivos celulares, en particular de cultivos celulares recombinantes, o de sobrenadantes de cultivos celulares.
Preferentemente, el contenido en monómeros del preparado según la invención es de como mínimo el 95%, preferentemente de como mínimo el 98%.
Una forma de preparación preferente del preparado según la invención consiste en que el preparado no sólo está mejorado en cuanto al contenido en \alpha1-AT activa, sino que también presenta una alta pureza, por ejemplo de al menos el 90% (mg/mg proteína).
Otro objeto de la presente invención consiste en un preparado farmacéutico que contiene el preparado de \alpha1-AT según la invención, en caso dado junto con sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, por ejemplo tampones, estabilizantes, adyuvantes, antioxidantes, sales o excipientes.
Dado que el presente preparado se ha de utilizar principalmente en el sector farmacéutico, una forma de realización preferente consiste en que el preparado se trata para inactivar posibles patógenos presentes. El preparado se presenta adecuadamente en una forma estable al almacenamiento, preferentemente en forma de liofilizado o en solución (ultracongelada), en particular en forma de una solución adecuada para la administración i.v., como aerosol o como spray. El preparado también se puede presentar asociado a liposomas o fosfolípidos o a otras formas microparticuladas o nanoparticuladas, lo que resulta ventajoso en determinadas formas de administración.
Otro objeto de la presente invención consiste en un procedimiento para la producción del preparado de \alpha1-AT según la invención, mediante purificación de una fracción que contiene \alpha1-AT y que preferentemente se obtiene a partir de un pool de plasma humano mediante cromatografía de adsorción, de tal modo que se adsorbe la \alpha1-AT, dado el caso se separa la \alpha1-AT inactiva y se obtiene la \alpha1-AT activa que contiene el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4, en una fracción por elución.
De acuerdo con la presente invención, por cromatografía de adsorción se ha de entender una cromatografía en la que la \alpha1-AT es adsorbida (unida) sobre el material cromatográfico. Por último, la fracción deseada se puede obtener por elución.
Para la cromatografía de adsorción se puede utilizar, por ejemplo, un material de cromatografía inorgánico, por ejemplo hidroxilapatita, preferentemente hidroxilapatita cerámica. No obstante, la cromatografía de adsorción también se puede llevar a cabo en un intercambiador de aniones, preferentemente en presencia de un detergente.
Como intercambiadores de aniones se utilizan preferentemente materiales basados en hidrocarburos o en polímeros vinílicos que han dado buenos resultados en trabajos de laboratorio y aplicaciones industriales, en especial productos disponibles en el mercado, por ejemplo DEAE-Sephacel®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose® CL6B, DEAE-Sepharose® Fast Flow, QAS-Sephadex®, Q-Sepharose® Fast Flow, Q-Sepharose Big Beats®, Q-Sepharose® High Performance (firma Pharmacia); DEAE-Trisacryl, DEAE-Spherodex®, Q-Hyper-D® (firma Sepracor); DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Toyopearl Super-Q® (firma Tosohaas); Fractogel®-EMDT, -TMAE u otros materiales Fractogel, Licrospher 1000 TMAE®, Licrospher 1000 DEAE® y Licrospher 4000 DMAE® (firma Merck); Macroprep DEAE®, Macropep Q® (firma BioRad); Protein PAK DEAE® (firma Waters), siendo especialmente preferente el tratamiento con un intercambiador de aniones fuerte, por ejemplo Q-Sepharose. Las condiciones exactas bajo las que se produce la obtención de \alpha1-AT pueden variar dependiendo del material intercambiador, pero los especialistas pueden determinar u optimizar dichas condiciones para el material correspondiente fácilmente y con poco gasto una vez conocida la presente invención.
Preferentemente, el material de partida no se incuba o sólo se incuba muy poco tiempo (por ejemplo unos pocos minutos) durante la cromatografía de adsorción o antes de la misma. En particular, la cromatografía de adsorción o la obtención de \alpha1-AT tiene lugar bajo tales condiciones que se conserva el isómero con un valor pI entre 4,30 y 4,40, en particular entre 4,34 y 4,39, y de forma especialmente preferente de tal modo que el espectro de los isómeros activos también se mantiene durante o después de la purificación o del tratamiento. Los especialistas pueden optimizar fácilmente estas condiciones ensayando diferentes tampones de elución para los materiales de adsorción utilizados en cada caso, ya que el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4, o la fracción en la que está contenido dicho isómero, se pude detectar fácilmente mediante IEF. En este contexto se ha de procurar especialmente que dicho isómero ácido no sea separado junto con la albúmina. Pero los especialistas pueden lograrlo fácilmente sin más, por ejemplo mediante electroforesis en gel o verificación por IEF de las fracciones eluidas (y la detección de \alpha1-AT ácida y albúmina).
En otra forma de realización preferente no se lleva a cabo cromatografía en intercambiador de cationes alguna, en especial ninguna cromatografía en un intercambiador de cationes con un valor de pH bajo.
Por "detergente" (tensioactivo) normalmente se entiende una sustancia orgánica tensioactiva, en particular productos de síntesis orgánicos. De acuerdo con la invención, preferentemente se utilizan detergentes no iónicos, tales como poliéteres, en particular alquil, fenol o poliglicol éteres, productos de etoxilación de ácidos grasos, amidas de ácido graso, aminas grasas, alcoholes grasos, óxidos de amina, ésteres de ácido graso de polialcoholes y ésteres de azúcares. El detergente (tensioactivo) principalmente actúa sobre las proteínas de forma no desnaturalizante. Para los fines de la presente invención son especialmente preferentes un agente tensioactivo del grupo de los polisorbatos (por ejemplo Tween) y uno del grupo Triton®.
De acuerdo con una realización preferente del procedimiento según la invención, antes o después de la cromatografía de adsorción se puede llevar a cabo otro tratamiento, por ejemplo precipitación, filtración, filtración en gel, un tratamiento con un material de soporte inorgánico o una purificación cromatográfica. Se ha comprobado que la hidroxilapatita es un material de soporte inorgánico preferente, siendo especialmente preferente la hidroxilapatita cerámica. En otra forma de realización preferente, la cromatografía de adsorción se combina con una adsorción en hidroxilapatita en un intercambiador de aniones, preferentemente en presencia de un detergente.
Durante los trabajos para la presente invención, se ha comprobado sorprendentemente que en circunstancias especiales también se puede provocar la separación de la \alpha1-AT activa y de la \alpha1-AT inactiva mediante tratamiento con materiales inorgánicos tales como hidroxilapatita. Este fenómeno es particularmente pronunciado cuando la \alpha1-AT ya está esencialmente separada de la albúmina.
Por consiguiente, el tratamiento de un preparado de \alpha1-AT previamente purificado con el material de soporte inorgánico, en particular con hidroxilapatita, es adecuado por sí solo para producir un preparado según la invención. Preferentemente, anteriormente ya se ha separado un alto porcentaje de la albúmina del material de partida. La separación de la \alpha1-AT activa se realiza preferentemente mediante elución fraccionada. Preferentemente, el tratamiento con hidroxilapatita constituye el paso de purificación final.
Sorprendentemente se ha comprobado que, aunque se sabe que la \alpha1-AT es sumamente lábil a la oxidación, el procedimiento según la invención también se puede llevar a cabo sin utilizar \beta-mercaptoetanol u otros inhibidores de oxidación, que deben ser especialmente evitados en la producción de preparados farmacéuticos.
Por consiguiente, el procedimiento según la invención se lleva a cabo preferentemente en ausencia de \beta-mercaptoetanol o de otros estabilizantes de oxidación, es decir, no se utiliza ningún tampón que contenga un estabilizante de este tipo.
El material de partida procede preferentemente de un pool de plasma, en particular un pool obtenido por donaciones de sangre de individuos con \alpha1-AT normal. Para el procedimiento según la invención se utiliza preferentemente plasma o una fracción de plasma, en especial una fracción de partida empobrecida en albúmina, preferiblemente un precipitado de Cohn V, que corresponde esencialmente a una fracción de Cohn IV A (según Cohn, Review 28 (1941), 395-417). En otra forma de realización preferente se parte de una fracción previamente purificada, por ejemplo se puede partir de un preparado comercial tal como Prolastin.
Preferentemente, en el procedimiento según la invención también se lleva a cabo un paso de inactivación o empobrecimiento de patógenos eventualmente presentes. Preferentemente, este tratamiento de inactivación/empobre-
cimiento se asegura gracias a un tratamiento con un agente tensioactivo y/o con calor, por ejemplo tratamiento con calor en estado sólido, en particular tratamiento con vapor de acuerdo con el documento EP-0 159 311, el documento EP-0 519 901 o el documento EP-0 674 531, o también con disolventes orgánicos y/o detergentes, por ejemplo de acuerdo con los documentos EP-0 131 740 y EP-0 050 061.
Otros tratamientos para la inactivación de virus o patógenos también incluyen el tratamiento con métodos químicos o químico-físicos, por ejemplo con sustancias caotrópicas de acuerdo con el documento WO 94/13329 o DE-44 34 538, o una fotoinactivación.
La irradiación o la nanofiltración constituyen procedimientos físicos preferentes para el empobrecimiento viral en el marco de la presente invención.
Preferentemente, el procedimiento según la invención se concibe de tal modo que también sea posible la obtención de otras proteínas, en particular la obtención de transferrina, albúmina, orosomucoide y apolipoproteína, que entonces se puede obtener en otra fracción de los tratamientos cromatográficos según la invención. Los especialistas pueden determinar u optimizar fácilmente las condiciones precisas para cada material cromatográfico una vez conocida la presente invención.
Durante la realización del procedimiento según la invención, en particular durante la elución, el pH oscila preferentemente entre 5,5 y 8,0, en particular entre 6,5 y 6,8. También se ha comprobado que en la realización del procedimiento según la invención resulta favorable utilizar un tampón con una fuerza iónica correspondiente a 10 mM de fosfato.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de un material soporte para separar la \alpha1-AT inactiva de la \alpha1-AT activa. Como material soporte sólido para la adsorción y separación preferentemente se utiliza un material soporte inorgánico tal como hidroxilapatita, o un intercambiador de aniones en presencia de un detergente, en particular Q-Sepharose en presencia de Tween, en otra forma de realización preferente.
La presente invención se explica más detalladamente por medio de los siguientes ejemplos, pero éstos no limitan la misma.
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de \alpha1-AT a partir de un precipitado de Cohn V (actualmente el mejor método para realizar la invención en opinión de la solicitante)
El precipitado de Cohn V se suspende con el triple en peso de tampón A (1,2 g/l Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O = 6,74 mM,
10 g/l NaCl = 171 mM, pH 7,0, obtenido con un 96% de ácido acético) durante 4 a 6 horas, a 4ºC, agitando. Después, a lo largo de la noche, a 6ºC, a partir de esta suspensión turbia precipita la \alpha1-AT con una concentración final de etanol del 17,5%.
El precipitado separado por centrifugación se agita junto con un peso 24 veces mayor de Tris-HCl 10 mM, pH 10,4 (ajustado con NaOH 6M) durante 1/2 hora a temperatura ambiente y a continuación durante 1,5 horas a 40ºC, después se ajusta el pH a un valor 6,5 y se purifica a través de un filtro CUNO 50SA. A continuación se añade al filtrado un 15% v/v de Tween 80 y la mezcla se agita durante 2 horas a 26ºC.
La solución obtenida se carga en una columna de cromatografía rellena de Q-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) y se equilibra con un tampón de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5, lo que corresponde a 10 mg de proteína por ml de gel (aproximadamente 2 volúmenes de columna), y se lava con 2,5 volúmenes de un tampón de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5 (elución de la mayor parte de Tween® 80) y después con 3 volúmenes de columna de cloruro de sodio 60 mM en tampón de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5 (elución de transferrina).
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Mediante elución con 3 volúmenes de columna de cloruro de sodio 100 mM en 25 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 6,5, se obtiene la fracción que contiene la \alpha1-AT con aproximadamente 0,40 a 0,60 unidades de plasma (PU) de \alpha1-AT por mg de proteína, determinándose la actividad mediante inhibición de la elastasa de acuerdo con el Ejemplo 3 (1 PU de \alpha1-AT corresponde a aproximadamente 1,3 mg de \alpha1-AT pura).
Después, con 3 volúmenes de columna de cloruro de sodio 125 mM en el tampón de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5, también se pueden eluir principalmente seroalbúmina y otras proteínas plasmáticas, y con cloruro de sodio 1 a 2M en el tampón de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5, se pueden eluir la \alpha1-AT inactiva (prácticamente ninguna inhibición de elastasa, pero \alpha1-AT inmunorreactiva) y las demás impurezas.
La fracción que contiene la \alpha1-AT se concentra en un factor de aproximadamente 30 con una membrana de ultrafiltración (límite de eliminación 30.000 dalton) y se somete a diafiltración con 0,15 g/l de Na_{3}-citrato \cdot 2H_{2}O = 0,5 mM.
A continuación, el diafiltrado obtenido se liofiliza. El polvo liofilizado se humedece hasta un contenido de agua residual de 7,5 \pm 0,5% y se somete a tratamiento con S-TIM 4 de acuerdo con el documento EP-0 159 311 (10 horas a 60ºC y 1 hora a 80ºC).
El polvo tratado se disuelve en un tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8, hasta aproximadamente 10 mg/ml de proteína y se carga en una columna de cromatografía rellena de hidroxilapatita cerámica (Macropep tipo I, tamaño de grano 80 \mum, Bio-Rad) y se equilibra con tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8, lo que corresponde a 10 mg de proteína por ml de lecho de columna (aproximadamente 1 volumen de columna).
Mediante elución con 5 volúmenes de columna de tampón de fosfato de sodio 40 mM, pH 6,8, se obtiene la fracción que contiene la \alpha1-AT con aproximadamente 0,90 a 1,05 unidades de plasma (PU) de \alpha1-AT por mg de proteína.
Después, con 3 volúmenes de columna de tampón de fosfato de sodio 100 mM, pH 6,8, también se pueden eluir principalmente la \alpha1-AT inactiva, la seroalbúmina y otras proteínas plasmáticas, y con tampón fosfato de sodio 500 mM, pH 6,8, el resto de las impurezas.
Se ha comprobado que con este procedimiento de purificación se puede obtener la \alpha1-AT con una alta actividad específica de 1,0 PU/mg (correspondiente a un 130% de actividad relativa de \alpha1-AT en plasma). La Tabla 1 siguiente muestra los resultados.
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TABLA 1
1
De acuerdo con la información del fabricante, el producto de \alpha1-AT disponible en el mercado farmacéutico Prolastin (firma Cutter) tiene una pureza de entre el 45 y el 80% y muestra una actividad específica de 0,60 PU/mg en el ensayo de inhibición de elastasa (correspondiente a un 78% de actividad relativa de \alpha1-AT en plasma).
Ejemplo 2 Purificación de \alpha1-AT (Serva) con hidroxiapatita cerámica
La \alpha1-AT de Serva, que con una pureza de al menos un 95% (de acuerdo con las instrucciones del fabricante, determinada en gel SDS) presentaba a 0,81 PU/mg la actividad específica de \alpha1-AT más alta medida hasta la fecha, también se trató posteriormente con hidroxiapatita cerámica. Las fracciones reunidas dieron como resultado una actividad específica de 0,92 PU/mg (correspondiente a aproximadamente un 120% de actividad relativa de \alpha1-AT en plasma). En el SDS-Excelgel reductor con tinción de plata de las proteínas se observa una clara separación de la \alpha1-AT inactiva y de otras proteínas contaminantes.
Ejemplo 3 Instrucciones para medir la inhibición de la elastasa
El ensayo se preparó conforme a unas instrucciones de J. Bieth, B. Spiess y C.G. Wermuth (1974), The synthesis and analytical use of a highly sensitive and convenient substrate of elastase, Biochem. Med. 11(4), 350-357, o J. Travis y D. Johnson (1981), Human alph\alpha1-Proteinase Inhibitor, Methods of Enzymology 80, 754-765.
Tris:
Tris-HCl 0,2M, pH 8,0
Tris+:
Tris mezclado con un 0,1% de seroalbúmina humana (HSA) poco antes de la utilización
Elastasa:
6% de elastasa (de páncreas de cerdo, Boehringer Mannheim) se diluye 1:1.000 y se congela a -20ºC congelada de forma estéril
Sustrato:
22,5 mg de succinil-(alanina)_{3}-para-nitroanilida (Bachem Feinchemikalien AG, Suiza) se disuelven en 5 ml de dimetilformamida y la solución se conserva a 4ºC.
Las muestras se diluyen con Tris+ hasta la concentración correspondiente.
Se diluyen 25 \mul de elastasa con 275 \mul de Tris+ (a temperatura regulada a 25ºC en baño de agua) y se incuban a 25ºC durante 3 minutos con 100 \mul de la muestra. A continuación, el sustrato se diluye 1:10 con Tris+, 200 \mul de esta mezcla se añaden a la carga e inmediatamente después se mide el aumento de la extinción a 405 nm y 25ºC durante 5 minutos. Como valor blanco de la inhibición, en lugar de añadir una muestra a la carga se añaden 100 \mul de Tris+.
En la carga arriba indicada, el valor blanco da como resultado entre 0,05 y 0,06 dA/min. Como curva estándar se utiliza una serie de dilución de 1:100 a 1:400 del plasma de referencia (Immuno AG, 1A3E). El Prolastin (Cutter), en una dilución previa 1:50 (congelado en partes alícuotas a -20ºC), se diluye a 1:80 con Tris+ (dilución 1:4.000) y se mide junto con la dilución 1:150 del plasma de referencia en cada serie de medidas. En caso de una desviación demasiado grande con respecto a la recta estándar, la serie de medidas correspondiente debe desecharse o los resultados sólo deben ser considerados como valores orientativos aproximados.
La inhibición se calcula de la siguiente manera:
% = (1- (dA/min)_{muestra}/(dA/min)_{valor \ blanco}) \ x \ 100
La inhibición de las muestras ha de oscilar entre un 20 y un 50% y después se convierte en unidades de plasma mediante los aparatos estándar.
Ejemplo 4 Caracterización de diferentes productos de \alpha1-AT por inhibición de la elastasa 
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(Tabla pasa a página siguiente)
2

Claims (30)

1. Preparado de \alpha1-AT nativa, purificada por cromatografía, caracterizado porque contiene como mínimo el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4 y presenta una pureza de como mínimo 1,0 PU/mg de proteína y una actividad relativa de \alpha1-AT en plasma de como mínimo el 120%.
2. Preparado según la reivindicación 1, caracterizado porque se presenta en forma de un preparado farmacéutico.
3. Preparado según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se purifica a partir de un pool de plasma.
4. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque presenta una pureza de más de 1,1 PU/mg, preferentemente más de 1,2 PU/mg.
5. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proporción de \alpha1-AT inactiva es inferior al 10%.
6. Preparado según la reivindicación 4, caracterizado porque la proporción de \alpha1-AT inactiva es inferior al 5%, preferentemente inferior al 2%.
7. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque está libre de \alpha1-AT inactiva.
8. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la \alpha1-AT es una \alpha1-AT conservativa.
9. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la distribución de isómeros de la \alpha1-AT corresponde a la de la proteína nativa, en particular a un patrón de bandas de cuadruplete visible en el enfoque isoeléctrico.
10. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se ha trata para la inactivación de patógenos eventualmente presentes.
11. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se presenta en una forma estable al almacenamiento, preferentemente en forma de liofilizado o como solución, en particular en forma de una solución adecuada para la administración intravenosa, como aerosol o como spray.
12. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se presenta asociado a liposomas, fosfolípidos u otras formas microparticuladas o nanoparticuladas.
13. Procedimiento para producir un preparado según una de las reivindicaciones 1 a 12 mediante purificación de una fracción que contiene \alpha1-AT y que se puede obtener mediante cromatografía de adsorción, de tal modo que se adsorbe \alpha1-AT y, por elución, se obtiene en una fracción \alpha1-AT activa que contiene el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque como material de partida se utiliza plasma o una fracción de plasma, en particular una fracción empobrecida en albúmina, preferentemente un precipitado de
Cohn V.
15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque se parte de una fracción previamente depurada.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque para la cromatografía de adsorción se utiliza un material de cromatografía inorgánico, preferentemente hidroxilapatita, de forma totalmente preferente hidroxilapatita cerámica.
17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque para la cromatografía de adsorción se utiliza un intercambiador de aniones, preferentemente en presencia de un detergente.
18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el intercambiador de aniones es Q-Sepharose.
19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado porque la cromatografía de adsorción se lleva a cabo utilizando un tampón libre de mercaptoetanol.
20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizado porque el tampón utilizado en la elución presenta un valor pH entre 5,5 y 8,0, preferentemente entre 6,5 y 6,8.
21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 16 y 20, caracterizado porque el tampón utilizado en la elución contiene una sal con una fuerza iónica correspondiente a 60 mM, preferentemente 40 mM, de fosfato.
22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 15 y 17 a 20, caracterizado porque el tampón utilizado en la elución contiene una sal con una fuerza iónica correspondiente a 50 a 130 mM de cloruro de sodio.
23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 22, caracterizado porque se lleva a cabo otro paso seleccionado de entre el siguiente grupo: precipitación, filtración, filtración en gel, tratamiento con un material de soporte inorgánico y purificación cromatográfica.
24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 22, caracterizado porque la cromatografía de adsorción se combina con una adsorción en hidroxilapatita en un intercambiador de aniones, preferentemente en presencia de un detergente.
25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 22, caracterizado porque se lleva a cabo una única cromatografía de adsorción.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque está previsto otro paso de purificación que no incluye ninguna cromatografía de adsorción.
27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 26, caracterizado porque en otra fracción se obtiene una proteína seleccionada de entre el siguiente grupo: transferrina, albúmina, orosomucoide y apolipoproteína.
28. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 27, caracterizado porque se lleva a cabo un paso para la inactivación de patógenos eventualmente presentes.
29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 28, caracterizado porque como inactivación se lleva a cabo un tratamiento con detergentes, con disolventes y/o con calor.
30. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 29, caracterizado porque la elución se lleva a cabo de tal modo que la fracción que contiene \alpha1-AT también contiene el isómero con un valor pI entre 4,3 y 4,4.
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