ES2296384T3

ES2296384T3 - Enzimas oxidantes de fenol.

Info

Publication number: ES2296384T3
Application number: ES99912837T
Authority: ES
Inventors: Antoine Amory; Huaming Wang; Patrick Dhase; Annick Lambrechts-Rongvaux; Cynthia Wang
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-03-23
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2019-03-23
Also published as: DE69937395D1; DE69937395T2; WO1999049020A2; AU3111499A; DK1064359T3; CA2322661A1; US7160709B2; JP4446599B2; TR200002735T2; CN1294629A; WO1999049020A3; BR9909012A; ATE376585T1; EP1064359B1; EP1064359A2; JP2002507411A; US7144717B1; US20050244923A1

Abstract

Una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys y que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de 65% con la enzima oxidante de fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2.

Description

Enzimas oxidantes de fenol.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas enzimas oxidantes de fenol, en particular, a nuevas enzimas oxidantes de fenol derivadas de cepas de Stachybotrys.

La presente invención proporciona métodos y células anfitrionas para expresar enzimas oxidantes de fenol de Stachybotrys así como métodos para producir sistemas de expresión. La presente invención también hace referencia a métodos para modificar un compuesto coloreado y transferir tinte durante el lavado de tejidos. Por otra parte la invención se refiere a una composición detergente enzimática para el blanqueo de manchas o anti-transferencia de tinte.

Antecedentes de la invención

Las enzimas oxidantes de fenol funcionan catalizando las reacciones rédox, esto es, la transferencia de electrones desde un donador de electrones (normalmente un compuesto fenólico) a un oxígeno molecular (que actúa como aceptor de electrones) que es reducido a H_{2}O. Si bien son capaces de utilizar una amplia variedad de compuestos fenólicos diferentes como donadores de electrones, las enzimas oxidantes de fenol son muy específicas para el oxígeno molecular como aceptor de electrones.

Las enzimas oxidantes de fenol se pueden utilizar para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo la industria de los detergentes, la industria del papel y la pasta de papel, la industria textil y la industria alimentaria. En la industria de los detergentes, las enzimas oxidantes de fenol se han utilizado para evitar la transferencia de tintes en solución desde un tejido a otro durante el lavado con detergente, una aplicación referida comúnmente como inhibición de la transferencia de tinte.

La mayoría de las enzimas oxidantes de fenol muestran un pH óptimo en el intervalo de pH ácido mientras son inactivas a pH neutros o alcalinos.

Se sabe que las enzimas oxidantes de fenol son producidas por una amplia gama de hongos, incluyendo especies de los géneros Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botytis, Pleurotus, Fomes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Rhizoctonia y Lentinus. No obstante, permanece la necesidad de identificar y aislar enzimas oxidantes de fenol, y organismos capaces de producir naturalmente las enzimas oxidantes de fenol, que presentan un pH óptimo en el intervalo alcalino para su uso en los métodos y composiciones de lavado con detergente.

En la publicación WO 95/01426 se describen lacasas y agentes capaces de intensificar las actividades de las lacasas. En JP 05 199882 A se describe una bilirrubina oxidasa.

Compendio de la invención

La presente invención hace referencia a enzimas oxidantes de fenol novedosas definidas en las reivindicaciones, que son capaces de modificar el color asociado con los tintes y compuestos coloreados que tienen diferentes estructuras químicas, en particular a pH neutro o alcalino. Basándose en su capacidad modificadora del color, las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, para el blanqueo de pasta de papel y papel, para el blanqueo del color de las manchas de tejidos y para la inhibición de la transferencia de tinte en detergentes y aplicaciones textiles. En un aspecto de la presente invención la enzima oxidante de fenol es capaz de modificar el color en ausencia de un potenciador. En otro aspecto de la presente invención, la enzima oxidante de fenol es capaz de modificar el color en presencia de un potenciador.

La presente invención proporciona una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys y que tiene una identidad de al menos 65% con la enzima oxidante de fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2.

Las enzimas oxidantes de fenol definidas en las reivindicaciones son obtenibles de Stachybotrys. En otra realización, las enzimas de Stachybotrys se seleccionan de cepas del grupo que consiste en S. parvispora, incluyendo, en particular, S. parvispora var. hughes MUCL 38996; cepas de la especie S. chartarum incluyendo, en particular, S. chartarum MUCL 38898; S. parvispora MUCL 9485; S. chartarum MUCL 30782; S. kampalensis MUCL 39090; S. theobromae MUCL 39293; y cepas de las especies S. bisby, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes y S. nilagerica. En un aspecto, la presente invención proporciona una enzima oxidante de fenol que tiene un peso molecular de aproximadamente 38 kD medido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE). En otro aspecto, la presente invención proporciona una enzima oxidante de fenol que tiene un peso molecular de aproximadamente 30,9 kD medido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.

Cuando la enzima oxidante de fenol parcialmente purificada obtenida de una cepa de S. parvispora o S. chartarum se hervía y se sometía a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, se observaban tres especies de peso molecular. Para la enzima oxidante de fenol obtenida de S. parvispora MUCL 38996, las tres especies de peso molecular eran aproximadamente 70 kD, 45 kD y 22,1 kD. Para la enzima oxidante de fenol obtenida de S. chartarum MUCL 38898, las tres especies de peso molecular eran aproximadamente 58,4 kD, 46,1 kD y 19,7 kD. La presente invención abarca cualquier actividad enzimática oxidante de fenol inherente a cualquiera de estas especies de peso molecular sola o combinada con al menos otra especie de peso molecular. La enzima oxidante de fenol definida en las reivindicaciones muestra un incremento del peso molecular aparente después de hervir, donde el peso molecular es determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.

Las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención son capaces de modificar el color asociado con los tintes o compuestos coloreados y tienen al menos un grupo antigénico en común con la enzima oxidante de fenol producida naturalmente por S. parvispora MUCL 38996 y/o la enzima oxidante de fenol producida naturalmente por S. chartarum MUCL 38898 medida mediante la técnica de Ouchterlony en la cual una enzima positiva muestra una línea de inmunoprecipitación. En una realización, la línea de inmunoprecipitación es una línea de Tipo I. En otra realización, la enzima oxidante de fenol que tiene al menos un grupo antigénico en común con la enzima oxidante de fenol producida naturalmente por S. parvispora MUCL 38996 es obtenible de Stachybotrys. La presente invención también abarca los mutantes de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys con tal que el mutante sea capaz de modificar el color asociado con los tintes o compuestos coloreados.

En otra realización, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys donde dicho polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% y al menos 95% con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 con tal que el polinucleótido codifique una enzima oxidante de fenol capaz de modificar el color asociado con tintes o compuestos coloreados. La presente invención también abarca secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridar en condiciones de medianamente a altamente restrictivas con el polinucleótido mostrado en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 o que son complementarias a este. La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el polinucleótido tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3. La presente invención también proporciona los vectores de expresión y las células anfitrionas que comprenden los polinucleótidos de la presente invención.

La presente invención se refiere adicionalmente a los métodos para producir una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para producir dicha enzima que comprende las etapas de obtener una célula anfitriona que comprende un polinucleótido que codifica dicha enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys donde dicha enzima tiene al menos una identidad de 65% con la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2; cultivar dicha célula anfitriona en condiciones adecuadas para la producción de dicha enzima oxidante de fenol; y opcionalmente recuperar dicha enzima oxidante de fenol producida. La presente invención también proporciona un método para producir una enzima oxidante de fenol que comprende la etapa de cultivar una célula anfitriona recombinante caracterizada por la expresión de un polinucleótido que codifica una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys donde dicha enzima tiene al menos una identidad de 65% con el aminoácido que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2 y opcionalmente recuperar dicha enzima oxidante de fenol. En una realización, el polinucleótido está presente en un plásmido replicante y en otra realización está integrado en el genoma del anfitrión.

En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 3. En una realización adicional, el polinucleótido es capaz de hibridar con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 en condiciones de medianamente a altamente restrictivas o es complementaria al SEQ ID NO: 1 o al SEQ ID NO: 3.

La presente invención también proporciona un método para producir una célula anfitriona recombinante que comprende un polinucleótido que codifica una enzima oxidante de fenol de la presente invención que comprende la etapa de introducir un polinucleótido que codifica dicha enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys y que tiene una identidad de al menos 65% con la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2 en una célula anfitriona, y opcionalmente cultivar dicha célula anfitriona en condiciones adecuadas para la producción de dicha enzima oxidante de fenol. En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 3. En una realización adicional, el polinucleótido es capaz de hibridar con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 en condiciones de medianamente a altamente restrictivas o es complementario al SEQ ID NO: 1 o al SEQ ID NO: 3.

En un aspecto de la presente invención, la célula anfitriona recombinante que comprende un polinucleótido que codifica una enzima oxidante de fenol incluye hongos filamentosos, levaduras y bacterias. En una realización, la célula anfitriona es un hongo filamentoso incluyendo especies de Aspergillus, especies de Trichoderma y especies de Mucor. En una realización preferida, la célula anfitriona de hongo filamentoso incluye A. niger var. awamori y T. reseei.

En otra realización de la presente invención, la célula anfitriona es una levadura que incluye especies de Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces y Yarrowia. En otra realización más, la especie de Saccharomyces es S. cerevisiae. En una realización adicional, la célula anfitriona es una bacteria gram positiva, tal como una especie de Bacillus, o una bacteria gram negativa, tal como una especie de Escherichia. La presente invención también abarca los métodos para purificar la enzima oxidante de fenol a partir de tales células anfitrionas.

También se proporcionan en la presente memoria composiciones detergentes que comprenden el aminoácido que tiene una secuencia con una identidad de al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la enzima oxidante de fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2 con tal que la enzima sea capaz de modificar el color asociado con tintes o compuestos coloreados. En una realización preferida, el aminoácido tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida, la enzima oxidante de fenol está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1. En otra realización, la enzima oxidante de fenol está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 3. En una realización adicional, el polinucleótido es capaz de hibridar con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 en condiciones de medianamente a altamente restrictivas o es complementario al SEQ ID NO: 1 o al SEQ ID NO: 3.

La presente invención también abarca métodos para modificar el color asociado con tintes o compuestos coloreados que existen en las manchas de los tejidos, que comprenden las etapas de poner en contacto el tejido con una composición que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% con la enzima oxidante de fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2 con tal que la enzima sea capaz de modificar el color asociado con los tintes o compuestos coloreados. En una realización del método, el aminoácido tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2. En un aspecto del método, el pH óptimo está entre 5,0 y 11, en otro aspecto, el pH óptimo está entre 7 y 10,5 y en otro aspecto más el pH óptimo está entre 8,0 y 10. En un aspecto adicional del método, la temperatura óptima está entre 20 y 60 grados C, y en otro aspecto entre 20 y 40 grados C. La presente invención también proporciona métodos para prevenir la transferencia de tintes en detergentes y aplicaciones textiles.

Asimismo se proporcionan en la presente memoria composiciones detergentes que comprenden una enzima oxidante de fenol de Stachybotrys de la presente invención sola o combinada con un potenciador y otros ingredientes detergentes, incluyendo proteasas, amilasas y/o celulasas.

Los potenciadores que se pueden utilizar en las composiciones detergentes de la presente invención incluyen pero no está limitados a ácido fenotiazino-10-propiónico (PPT), 10-metilfenotiazina (MPT), ácido fenoxazino-10-propiónico (PPO), 10-metilfenoxazina (MPO), ácido 10-etilfenotiazino-4-carboxílico (EPC), acetosiringona, siringaldehído, metilsiringato, 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonato (ABTS) y ácido 4-hidroxi-4-bifenil-carboxílico o derivados de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el perfil de pH de la oxidación de diversos cromóforos por la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys parvispora.

La Figura 2 ilustra el perfil de pH del blanqueo con Azul Directo 1 como comparación entre la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys parvispora y la bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria.

La Figura 3 ilustra el peso molecular de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum determinado mediante gel de poliacrilamida-SDS. La calle 1 representa la muestra no hervida y la calle 2 representa la muestra hervida.

Las Figuras 4A-4B son un alineamiento de aminoácidos de fragmentos de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum (denominada St. ch.) con la bilirrubina oxidasa de Myrothecium verracaria (denominada biliru oxidas) y la proteína oxidante de manganeso de LEPTOTHRIX DISCOPHORA (denominada mpf-A).

Las Figuras 5A-5B ilustran la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) y aminoácidos (SEQ ID NO: 2) para una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys chartarum.

La Figura 6A-6B ilustra la secuencia genómica (SEQ ID NO: 3) de una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys chartarum.

La Figura 7 es un alineamiento de aminoácidos de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys SEQ ID NO: 2 (línea de más abajo) y bilirrubina oxidasa (SEQ ID NO: 4).

La Fig. 8 proporciona una ilustración del vector pGAPT que se utilizó para la expresión de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys en Aspergillus. Las bases 1 a 1134 contienen un promotor del gen de la glucoamilasa de Aspergillus niger. La base 1227 a 1485 y 3079 a 3100 contienen un terminador de la glucoamilasa de Aspergillus niger. Se insertó el gen pyrG de Aspergillus nidulans desde 1486 a 3078 como marcador para la transformación fúngica. El resto del plásmido contiene secuencias de pUC18 para la propagación en E. coli. El ácido nucleico que codifica la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys del SEQ ID NO: 1 se clonó en los sitios de restricción Bgl II y Xba I.

La Figura 9A-9B muestra la secuencia de ácido nucleico del fragmento generado por PCR de Stachybotrys descrito en el Ejemplo 17 que fue expresado en Aspergillus.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Según se utiliza en la presente memoria, el término enzima oxidante de fenol hace referencia a aquellas enzimas que catalizan las reacciones rédox y son específicas para el oxígeno y el peróxido de hidrógeno como aceptor de electrones. Cuando se hierven las enzimas oxidantes de fenol de Stachybotrys de la presente invención y se someten a electroforesis en gel SDS, se observan tres especies de peso molecular. Según se utiliza en la presente memoria, el término "enzima" abarca cualquier especie de peso molecular que, sola o combinada con al menos una especie de peso molecular, es capaz de modificar el color asociado con un tinte o compuesto coloreado.

Según se utiliza en la presente memoria, Stachybotrys hace referencia a cualquier especie de Stachybotrys que produce una enzima oxidante de fenol como se define en las reivindicaciones, capaz de modificar el color asociado con los tintes o compuestos coloreados. La presente invención abarca los derivados de los productos aislados naturales de Stachybotrys, incluyendo la progenie y los mutantes, con tal que el derivado sea capaz de producir una enzima oxidante de fenol capaz de modificar el color asociado con tintes o compuestos coloreados. En una realización preferida, la enzima oxidante de fenol es obtenible de Stachybotrys y se purifica mediante el método descrito en los Ejemplos 4 y 5.

Según se utiliza en la presente memoria en referencia a las enzimas oxidantes de fenol, el término "obtenible de" representa enzimas oxidantes de fenol equivalentes a las originadas a partir de o producidas naturalmente mediante la cepa microbiana concreta mencionada. Para ilustrar, las enzimas oxidantes de fenol obtenibles de Stachybotrys hacen referencia a aquellas enzimas oxidantes de fenol que son producidas naturalmente por Stachybotrys. La presente invención abarca enzimas oxidantes de fenol idénticas a las producidas por las especies de Stachybotrys pero que por el uso de técnicas de ingeniería genética son producidas por organismos distintos de Stachybotrys transformados con un ácido nucleico que codifica dicha enzima oxidante de fenol. Ser equivalente significa que la enzima oxidante de fenol tiene al menos un grupo antigénico en común con la enzima oxidante de fenol obtenible de S. parvispora MUCL 38996 y/o S. chartarum MUCL 38898 medido mediante la técnica de Ouchterlony en la cual una enzima positiva muestra una línea de inmunoprecipitación. Alternativamente, ser equivalente significa que la enzima oxidante de fenol está codificada por un polinucleótido capaz de hibridar con el polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 en condiciones medianamente o altamente restrictivas. Ser equivalente significa que la enzima oxidante de fenol comprende una identidad de al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% con la enzima oxidante de fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2. El porcentaje de identidad a nivel de ácido nucleico se determina utilizando el programa FastA y el porcentaje de identidad a nivel de aminoácidos se determina utilizando TFastA ambos los cuales utilizan el método de Pearson y Lipman (PNAS USA, 1988, 85:2444-2448). Alternativamente, la identidad se determina por medio del Programa MegAlign de DNAstar (DNASTAR, Inc. Maidson, WI 53715) mediante el método de Jotun Hein (1990, Method in Ezimology, 183:626-645) con una penalidad de espacio = 11, una penalidad de longitud del
espacio = 3 y Parámetros de Alineamiento por Pares Ktuple = 2. La presente invención también abarca los mutantes, las variantes y los derivados de las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención con tal que el mutante, la variante o derivado de la enzima oxidante de fenol sea capaz de conservar al menos una actividad característica de la enzima oxidante de fenol de origen natural.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "compuesto coloreado" hace referencia a una sustancia que añade color a los textiles o a sustancias que dan como resultado la apariencia visual de manchas. Según se define en el Dictionary of Fiber and Textile Technology (Hoechst Celanese Corportation (1990) PO Box 32414, Charlotte NC 23232), un tinte es un compuesto coloreado que se incorpora a la fibra mediante una reacción química, absorción, o dispersión. Los ejemplos de los tintes incluyen los tintes Azul Directo, Azul ácido, tinte rojo directo, tintes Azul reactivo y Negro reactivo. Un catálogo de los tintes textiles utilizados comúnmente se encuentra en Colour Index, 3ª ed. Vol. 1-8. Los ejemplos de las sustancias que dan como resultado la apariencia visual de manchas son polifenoles, carotenoides, antocianinas, taninos, productos de la reacción de Maillard, etc.

Según se utiliza en la presente memoria, la frase "modificar el color asociado con un tinte o compuesto coloreado" o "modificación del compuesto coloreado" significa que el tinte o compuesto cambia por la oxidación de manera que cualquier color aparece modificado, esto es, visualmente el color parece disminuir, reducirse, decolorarse, blanquearse, o eliminarse, o el color no resulta afectado pero el compuesto se modifica de tal manera que se inhibe el re-depósito del tinte. La presente invención abarca la modificación del color mediante cualquier método incluyendo, por ejemplo, la eliminación completa del compuesto coloreado de la mancha del tejido mediante cualquier método así como la reducción de la intensidad de color o un cambio en el color del compuesto.

El efecto "anti-transferencia de tinte" o "anti-redepósito del tinte" puede ser una función de la actividad modificadora del color de un compuesto oxidante de fenol, esto es, los tintes o componentes coloreados solubles se oxidan o blanquean y no son susceptibles de ser redepositados como color en el tejido, o una función de la modificación del sustrato en ausencia de modificación del color de manera que un tinte o componente coloreado se vuelve soluble en agua y es enjuagado. La capacidad de un compuesto oxidante de fenol utilizado solo o junto con un potenciador para oxidar un tinte o compuesto coloreado soluble o dispersado a una especie incolora en una solución de lavado evita el efecto de redepósito del color.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "mutantes y variantes", cuando hace referencia a enzimas oxidantes de fenol, se refiere a enzimas oxidantes de fenol obtenidas por alteración de la secuencia de aminoácidos de origen natural y/o la estructura de la misma, por ejemplo mediante alteración de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen estructural y/o mediante sustitución directa y/o alteración de la secuencia de aminoácidos y/o la estructura de la enzima oxidante de fenol. El término "derivado" de enzima oxidante de fenol según se utiliza en la presente memoria hace referencia a una porción o fragmento de la secuencia de aminoácidos de la enzima oxidante de fenol de origen natural o variante completa que conserva al menos una actividad de la enzima oxidante de fenol de origen natural. Según se utiliza en la presente memoria, el término "mutantes y variantes", cuando hace referencia a cepas microbianas, hace referencia a células que son cambiadas a partir de un producto aislado natural en cierta forma, por ejemplo, que tienen alterada la secuencia de nucleótidos del ADN, por ejemplo, del gen estructural que codifica la enzima oxidante de fenol; alteraciones en un producto aislado natural con el fin de intensificar la producción de enzima oxidante de fenol; u otros cambios que tienen efecto en la expresión de la enzima oxidante de fenol.

El término "potenciador" o "mediador" hace referencia a cualquier compuesto que es capaz de modificar el color asociado con un tinte o compuesto coloreado asociado con una enzima oxidante de fenol o un compuesto que aumenta la actividad oxidante de la enzima oxidante de fenol. El agente potenciador es típicamente un compuesto orgánico.

Enzimas oxidantes de fenol

Las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención funcionan catalizando reacciones rédox, esto es, la transferencia de electrones de un donador de electrones (normalmente un compuesto fenólico) a oxígeno molecular o peróxido de hidrógeno (que actúa como aceptor de electrones) que es reducido a agua. Los ejemplos de tales enzimas son las lacasas (EC 1.10.3.2), las bilirrubina oxidasas (EC 1.3.3.5), las fenol oxidasas (EC 1.14.18.1), las catecol oxidasas (EC 1.10.3.1).

La presente invención abarca las enzimas oxidantes de fenol de Stachybotrys definidas en las reivindicaciones, que son capaces de modificar el color asociado con un tinte o compuesto coloreado y que tienen al menos un grupo antigénico en común con la enzima oxidante de fenol producida naturalmente por S. parvispora MUCL 38996 y/o la enzima oxidante de fenol producida naturalmente por S. chartarum MUCL 38898. Un método para medir la presencia de determinantes antigénicos comunes son los ensayos de doble difusión (técnica de Ouchterlony) siguiendo el protocolo mostrado, y en las condiciones especificadas, por Clausen J. (1988) en Immunochemical Technique for the Identification and Estimation of Macromolecules (3ª ed. revisada) Burdon, R.H., y P.H. van Knippenperg, eds., en la página 281 (apéndice 11, microtécnica) e interpretado siguiendo el protocolo descrito y en las condiciones especificadas por Clausen, supra, capítulo 6, pág. 143-146. Otro método para medir la presencia de determinantes antigénicos comunes es mediante transferencia Western (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, John Wiley y Sons, Inc. Sección 10.8: Immunoblotting and Immunodetection).

La enzima oxidante de fenol obtenible de S. parvispora MUCL 38996 y producida según los Ejemplos 4 y 5 tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 38 kilodaltons (kD) determinado mediante el método de análisis SDS-PAGE y un punto isoeléctrico aparente de menos de 2,8 definido en el Ejemplo 6. La enzima oxidante de fenol obtenible de S. chartarum MUCL 38898 y producida según el método de los Ejemplos 4 y 5 tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30,9 kilodaltons determinado mediante un método de análisis SDS-PAGE.

La presente invención abarca las enzimas oxidantes de fenol de Stachybotrys que comprenden una identidad de al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la enzima oxidante de fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2.

Ácido nucleico que codifica enzimas oxidantes de fenol

La presente invención abarca polinucleótidos que codifican las enzimas oxidantes de fenol obtenibles de especies de Stachybotrys cuyos polinucleótidos comprenden una identidad de al menos 65%, una identidad de al menos 70%, una identidad de al menos 75%, una identidad de al menos 80%, una identidad de al menos 85%, una identidad de al menos 90% y una identidad de al menos 95% con la secuencia de polinucleótidos descrita en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 con tal que la enzima codificada por el polinucleótido sea capaz de modificar el color asociado con los tintes o compuestos coloreados. En una realización preferida, la enzima oxidante de fenol tiene la secuencia de polinucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 o mostrada en el SEQ ID NO: 3 o es capaz de hibridar con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 o es complementaria a estos. Como comprenderá un artesano experto, debido a la degeneración del código genético, una variedad de polinucleótidos puede codificar la enzima oxidante de fenol descrita en el SEQ ID NO: 2. La presente invención abarca todos estos polinucleótidos.

El ácido nucleico que codifica una enzima oxidante de fenol se puede obtener mediante procedimientos conocidos en la técnica a partir, por ejemplo, de ADN clonado (p. ej., una "genoteca" de ADN), mediante síntesis química, mediante clonación de ADNc, mediante PCR, o mediante clonación del ADN genómico, o fragmentos del mismo, purificado a partir de una célula deseada, tal como una especie de Stachybotrys (Véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). Las secuencias de ácido nucleico derivadas de ADNc genómico pueden contener regiones reguladoras además de regiones codificadoras. Cualquiera que sea la fuente, el ácido nucleico aislado que codifica una enzima oxidante de fenol de la presente invención debe ser clonada molecularmente en un vector adecuado para la propagación del gen.

En la clonación molecular del gen a partir de ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen deseado. El ADN puede ser escindido en sitios específicos utilizando diversas enzimas de restricción. Alternativamente, se puede utilizar ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o se puede someter a cizalla físicamente el ADN, por ejemplo, mediante sonicación. Los fragmentos de ADN lineal se pueden separar después según el tamaño mediante mecanismos normalizados, incluyendo pero no limitados a, agarosa y electroforesis en gel de poliacrilamida, PCR y cromatografía en columna.

Una vez que se generan los fragmentos de ácido nucleico, se puede completar de varias maneras la identificación del fragmento de ADN específico que codifica una enzima oxidante de fenol. Por ejemplo, se puede aislar y marcar un gen que codifica una enzima oxidante de fenol de la presente invención o su ARN específico, o un fragmento del mismo, tal como una sonda o cebador, y después utilizar en análisis de hibridación para detectar un gen generado. (Benton, W. y Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M y Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961). Aquellos fragmentos de ADN que comparten una similitud de secuencia sustancial con la sonda hibridarán en condiciones restrictivas.

La presente invención abarca enzimas oxidantes de fenol obtenibles de especies de Stachybotrys que se identifican por medio de técnicas de hibridación de ácidos nucleicos utilizando el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 como sonda o cebador y escrutando el ácido nucleico de origen genómico o de ADNc. El ácido nucleico que codifica las enzimas oxidantes de fenol obtenibles de especies de Stachybotrys y que tiene una identidad de al menos 65% con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3 puede ser detectado mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación utilizando sondas, porciones o fragmentos del SEQ ID NO: 1 o del SEQ ID NO: 3. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para la detección de ácido nucleico que codifica una enzima oxidante de fenol abarcada por la presente invención que comprende hibridar parte o toda la secuencia de ácido nucleico del SEQ ID NO: 1 o del SEQ ID NO: 3 con ácido nucleico de Stachybotrys de origen genómico o de ADNc.

También están incluidos en la presente invención secuencias de polinucléotidos que son capaces de hibridar con la secuencia de nucleótidos descrita en el SEQ ID NO: 1 en condiciones medianamente o sumamente restrictivas. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión al ácido nucleico, como ilustran Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzimology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) y confieren una "restricción" definida como se explica más abajo.

La "restricción máxima" se produce típicamente a una Tm de aproximadamentde -5ºC (5ºC por debajo de la Tm de la sonda); la "restricción elevada" de aproximadamente 5ºC a 10ºC por debajo de la Tm; la "restricción intermedia" de aproximadamente 10ºC a 20ºC por debajo de la Tm; y la "restricción baja" de aproximadamente 20 a 25ºC por debajo de la Tm. Como comprenderán los expertos en la técnica, una hibridación a una restricción máxima se puede utilizar para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos mientras una restricción intermedia o baja se puede utilizar para identificar o detectar secuencias de nucleótidos homólogas.

El término "hibridación" según se utiliza en la presente memoria incluirá "el proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria por medio de emparejamiento de bases" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York NY).

EL proceso de amplificación llevado a cabo en las tecnologías de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) lo describen Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY). Se puede utilizar una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y hasta aproximadamente 60 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, preferiblemente aproximadamente 12 a 30 nucleótidos, y más preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos como sonda o cebador de la PCR.

Un método de aislamiento preferido de un constructo de ácido nucleico de la invención de una genoteca de ADNc o genómico es el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando sondas oligonucleotídicas degeneradas preparadas basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, la PCR se puede llevar a cabo utilizando las técnicas descritas en la patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.202.

Sistemas de Expresión

La presente invención proporciona células anfitrionas, métodos de expresión y sistemas para la producción de enzimas oxidantes de fenol según la invención obtenibles de especies de Stachybotrys en microorganismos anfitriones, tales como hongos, levaduras y bacterias. Una vez que se obtiene el ácido nucleico que codifica una enzima oxidante de fenol de la presente invención, se pueden construir células anfitrionas recombinantes que contienen el ácido nucleico utilizando mecanismos conocidos en la técnica. Los mecanismos de la biología molecular los describen Sambrook et al., en Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). El ácido nucleico que codifica las enzimas oxidantes de fenol obtenibles de Stachybotrys y que tiene una identidad de al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%,al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% y al menos 95% con el ácido nucleico del SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 2 o que es capaz de hibridar en condiciones restrictivas intermedias o elevadas o que es complementario al SEQ ID NO: 1 o al SEQ ID NO: 3 se obtiene y se transforma en una célula anfitriona utilizando vectores apropiados. Los expertos en la técnica conocen una variedad de vectores y casetes de transformación y expresión adecuados para la clonación, transformación y expresión en hongos, levaduras y bacterias.

Típicamente, el vector o la casete contiene secuencias que dirigen la transcripción y la traducción del ácido nucleico, un marcador seleccionable, y secuencias que permiten la replicación autónoma o la replicación cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' del gen que alberga los controles de inicio de la transcripción y una región 3' del fragmento de ADN que controla la terminación de la transcripción. Estas regiones de control pueden derivar de genes homólogos o heterólogos para el anfitrión con tal que la región de control seleccionada sea capaz de funcionar en la célula anfitriona.

Las regiones de control del inicio o los promotores, que son útiles para conducir la expresión de las enzimas oxidantes de fenol en una célula anfitriona son conocidos por los expertos en la técnica. Virtualmente cualquier promotor capaz de conducir estas enzimas oxidantes de fenol es adecuado para la presente invención. El ácido nucleico que codifica la enzima oxidante de fenol está unido operablemente por medio de codones de inicio a regiones de control de la expresión seleccionadas para la expresión eficaz de las enzimas oxidantes o reductoras. Una vez que se construyen las casetes adecuadas, estas se utilizan para transformar la célula anfitriona.

Los procedimientos de transformación generales se ilustran en Current Protocols in Molecular Biology (vol. 1, editado por Ausubel et al., John Wiley y Sons, Inc. 1987, Capítulo 9) e incluyen métodos con fosfato de calcio, transformación utilizando PEG y electroporación. Para Aspergillus y Trichoderma, se puede utilizar la transformación de protoplastos mediada por PEG y Calcio (Finkelstein, DB 1992 Transformation. En Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (eds. por Finkelstein y Bill) 113-156. La electroporación de protoplastos la describen Finkelstein DB 1992 en Transformation. En Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (eds. por Finkelstein y Bill) 113-156. El bombardeo por microproyección sobre los conidios lo describen Fungaro et al. (1995) en Transformation of Aspergillus nidulans by microprojection bombardment on intact conidia. FEMS Microbiology Letters 125, 293-298. La transformación mediada por Agrobacterium es descrita por Groot et al. (1998) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology 16 839-842. Para la transformación en Saccharomyces, son conocidas por los expertos en la técnica la transformación mediada por acetato de litio y la transformación de protoplastos mediada por PEG y calcio así como las técnicas de electroporación.

Las células anfitrionas que contienen la secuencia codificadora de una enzima oxidante de fenol de la presente invención y expresan la proteína pueden ser identificadas mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, hibridación ADN-ADN o ADN-ARN y bioanálisis de proteínas o técnicas de inmunoanálisis que incluyen tecnologías basadas en membranas, basadas en soluciones, o basadas en chips para la detección y/o cuantificación de los ácidos nucleicos o proteínas.

Como se describe en la presente memoria, la secuencia genómica (SEQ ID NO: 3) que codifica la enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys chartarum (MUCL 38898) fue aislada y expresada en Aspergillus niger var. awamori y Trichoderma reseei. El ADNc (SEQ ID NO: 1) obtenible de Stachybotrys chartarum (MUCL 38898) fue aislado y expresado en Saccharomyces cerevisiae.

Actividades de la enzima oxidante de fenol

Las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención son capaces de utilizar una amplia variedad de compuestos fenólicos diferentes como donadores de electrones, a la vez que son muy específicas para el oxígeno molecular y el peróxido de hidrógeno como aceptores de electrones.

Dependiendo del sustrato específico y de las condiciones de reacción, p. ej. la temperatura, la presencia o ausencia de potenciadores, etc., cada reacción de oxidación de la enzima oxidante de fenol tendrá un pH óptimo. Por ejemplo, la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys parvispora producida como se describe en el Ejemplo 4 tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, como se determina mediante incubación durante 2 minutos a 20 grados C con ABTS como sustrato; un pH óptimo de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5, como se determina mediante incubación durante 2 minutos a 20 grados C con siringaldizina como sustrato; y un pH óptimo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0, como se determina mediante incubación durante 2 minutos a 20 grados C con 2,6-dimetoxifenol como sustrato, y que es capaz de oxidar el quiacol.

La enzima oxidante de fenol obtenida de Stachybotrys chartarum MUCL 38898, producida como se describe en los Ejemplos 4 y 5 y que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 tiene un pH óptimo de aproximadamente 8,0 a 20 y a 40 grados C como se determina mediante incubación con DMP como sustrato y en presencia de un total de 17,2 \mug de enzima y a un pH óptimo de aproximadamente 5,0 a 7,0 como se determina mediante incubación con ABTS como sustrato y en presencia de un total de 1,7 \mug de enzima.

Aplicaciones de las enzimas oxidantes de fenol

Como se describe más abajo, las enzimas oxidantes de fenol obtenibles de Stachybotrys son capaces de oxidar una amplia variedad de tintes o compuestos coloreados que tienen diferentes estructuras químicas, utilizando oxígeno o peróxido de hidrógeno como aceptor de electrones. Por consiguiente las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención se utilizan en aplicaciones en las que es deseable modificar el color asociado con los tintes o compuestos coloreados, por ejemplo en limpieza, para la eliminación de manchas de comida en tejidos y para el anti-redepósito de tintes; textiles; y aplicaciones de papel y pasta de papel. Una característica particularmente importante de las enzimas oxidantes de fenol es su expresión de elevados niveles de actividad enzimática, a aproximadamente 20-40 grados C, en un amplio intervalo de pH, incluyendo un amplio intervalo de pH de neutro a alcalino. En particular es su capacidad para expresar elevados niveles de actividad enzimática en el intervalo de pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 10,5 en temperaturas de aproximadamente 20-35 grados C.

Compuestos coloreados

En la presente invención, una variedad de compuestos coloreados podrían ser dianas para la oxidación por enzimas oxidantes de fenol de la presente invención. Por ejemplo, en aplicaciones de detergentes, las sustancias coloreadas que pueden existir en forma de manchas sobre los tejidos pueden ser una diana. Más abajo se describen diversos tipos o clases de sustancias coloreadas que pueden existir en las manchas.

Estructuras derivadas de porfirina

Las estructuras de porfirina, a menudo coordinadas con un metal, forman una clase de sustancias coloreadas que existen en las manchas. Los ejemplos son hemo y hematina de las manchas de sangre, clorofila como sustancia verde de las plantas, p. ej. hierba o espinacas. Otro ejemplo de una sustancia sin metal es la bilirrubina, un producto amarillo de la descomposición de la sangre.

Taninos, polifenoles

Los taninos son formas polimerizadas de ciertas clases de polifenoles. Tales polifenoles son catequinas, leuantocianinas, etc. (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver y Boyd, Edimburgo, 1972, págs. 169-198). Estas sustancias se pueden conjugar con fenoles simples como p. ej. ácido gálico. Estas sustancias polifenólicas existen en las manchas de te, las manchas de vino, las manchas de plátano, las manchas de melocotón, etc. y son notablemente difíciles de eliminar.

Carotenoides

Los carotenoides son las sustancias coloreadas que se encuentran en el tomate (licopeno, rojo), el mango (caroteno, naranja-amarillo) (G.E. Barley et al., The Plant Cell (1995) Vol. 7, 1027-1038). Se encuentran en las manchas de comida (tomate) que también son notablemente difíciles de eliminar, especialmente en tejidos coloreados, cuando no se aconseja el uso de agentes blanqueadores químicos.

Antocianinas

Estas sustancias son las moléculas altamente coloreadas que existen en muchas frutas y flores (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver y Boyd, Edimburgo, 1972, págs. 135-169). Los ejemplos típicos, relevantes para las manchas, son las bayas, pero también el vino. Las antocianinas tienen una gran diversidad de patrones de glicosilación.

Productos de la reacción de Maillard

Con el calentamiento de las mezclas de moléculas de carbohidratos en presencia de estructuras de proteína/péptido, se produce una sustancia coloreada amarilla/parda típica. Estas sustancias se encuentran por ejemplo en el aceite de cocinar y son difíciles de eliminar de los tejidos.

Para evitar la transferencia de tinte de una pieza de tejido coloreada a otras prendas durante el lavado, es deseable blanquear específicamente las moléculas de tinte en la solución de lavado. Diversos tipos de tintes de tejidos son dianas deseables para el proceso de oxidación: p. ej., tintes azufrados, tintes de tina, tintes directos, tintes reactivos y tintes azoicos.

Potenciadores

Una enzima oxidante de fenol de la presente invención puede actuar para modificar el color asociado con tintes o compuestos coloreados en presencia o ausencia de potenciadores dependiendo de las características del compuesto. Si un compuesto es capaz de actuar como sustrato directo para la enzima oxidante de fenol, la enzima oxidante de fenol puede modificar el color asociado con un tinte o compuesto coloreado en ausencia de potenciador, aunque todavía se prefiera un potenciador para una actividad de la enzima oxidante de fenol óptima. Para otros compuestos coloreados incapaces de actuar como sustrato directo para la enzima oxidante de fenol o no accesibles directamente para la enzima oxidante de fenol, se requiere un potenciador para una actividad de la enzima oxidante de fenol y una modificación del color óptimas.

Los potenciadores se describen por ejemplo en la publicación WO 95/01426 publicada el 12 de Enero de 1995; WO 96/06930, publicada el 7 de Marzo de 1996; y WO 97/11217 publicada el 27 de Marzo de 1997. Los potenciadores incluyen pero no están limitados a ácido fenotiazino-10-propiónico (PPT), 10-metilfenotiazina (MPT), ácido fenoxazino-10-propiónico (PPO), 10-metilfenoxazina (MPO), ácido 10-etilfenotiazino-4-carboxílico (EPC), acetosiringona, siringaldehído, metilsiringato, 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonato (ABTS) y ácido 4-hidroxi-4-bifenil-carboxílico o derivados de los mismos.

Cultivos

La presente invención abarca cepas de Stachybotrys y productos aislados naturales, y derivados de tales cepas y productos aislados, tales como cepas de las especies S. parvispora, incluyendo, en particular, S. parvispora var. hughes MUCL 38996; cepas de la especie S. chartarum incluyendo, en particular, Stachybotrys chartarum MUCL 38898; S. parvispora MUCL 9485; S. chartarum MUCL 30782; S. kampalensis MUCL 39090; S. theobromae MUCL 39293; y cepas de la especie S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes y S. nilagerica que producen las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención.

La presente invención proporciona cultivos sustancialmente biológicamente puros de cepas novedosas del género Stachybotrys y, en particular, cultivos sustancialmente biológicamente puros de las cepas S. parvispora MUCL 38996 y S. chartarum MUCL 38898 a partir de las cuales se pueden purificar las enzimas oxidantes de fenol.

Purificación

Las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención se pueden producir mediante cultivo de las cepas de Stachybotrys productoras de la enzima oxidante de fenol (tales como S. parvispora MUCL 38996, S. chartarum MUCL 38898) en condiciones aerobias en medio nutriente que contiene carbono y nitrógeno asimilable junto con otros nutrientes esenciales. El medio se puede componer de acuerdo con los principios bien conocidos en la técnica.

Durante el cultivo, las cepas productoras de la enzima oxidante de fenol secretan la enzima oxidante de fenol extracelularmente. Esto permite lograr el aislamiento y la purificación (recuperación) de la enzima oxidante de fenol, por ejemplo, mediante la separación de la masa de células de un caldo de cultivo (p. ej. mediante filtración o centrifugación). El caldo de cultivo sin células resultante se puede utilizar tal cual o, si se desea, se puede concentrar primero (p. ej. mediante evaporación o ultrafiltración). Si se desea, la enzima oxidante de fenol se puede separar después del caldo de cultivo sin células y purificar hasta el grado deseado mediante métodos convencionales, p. ej. mediante cromatografía en columna, o incluso, cristalizar.

Las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención se pueden aislar y purificar a partir del caldo de cultivo en el cual son secretadas extracelularmente mediante concentración del sobrenadante de cultivo del anfitrión, seguido de fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía de penetración en gel.

Las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención se pueden formular y utilizar de acuerdo con su aplicación pretendida. Con respecto a esto, si se está utilizando en una composición detergente, la enzima oxidante de fenol se puede formular, directamente a partir del caldo de fermentación, en forma de un sólido de revestimiento utilizando el procedimiento descrito en la United States Patent Núm. 4.689.297. Además, si se desea, la enzima oxidante de fenol se puede formular en forma líquida con un portador adecuado. La enzima oxidante de fenol también se puede inmovilizar si se desea.

La presente invención también abarca los vectores de expresión y las células anfitrionas recombinantes que comprenden la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys de la presente invención y la posterior purificación de la enzima oxidante de fenol a partir de la célula anfitriona.

Composiciones Detergentes

Se puede utilizar una enzima oxidante de fenol de Stachybotrys de la presente invención en composiciones detergentes o de limpieza. Tales composiciones pueden comprender, además de la enzima oxidante de fenol, ingredientes de detergentes convencionales tales como tensioactivos, reforzantes y enzimas adicionales tales como, por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas o peroxidasas. Otros ingredientes incluyen potenciadores, agentes estabilizantes, bactericidas, abrillantadores ópticos y perfumes. Las composiciones detergentes pueden tener cualquier forma física adecuada, tal como polvo, líquido acuoso o no acuoso, pasta o gel. Los ejemplos de las composiciones detergentes se proporcionan en la publicación WO 95/01426, publicada el 12 de Enero de 1995 y en la publicación WO 96/06930 publicada el 7 de Marzo de 1.996.

Habiendo descrito las enzimas oxidantes de fenol de la presente invención, se presentan ahora los siguientes ejemplos con fines ilustrativos y no se pretende que sean, ni deben ser, leídos como restrictivos. Las diluciones, cantidades, etc. que se expresan en la presente memoria en términos de porcentajes son, a menos que se especifique de otro modo, porcentajes dados en términos de peso por volumen por ciento (p/v). Según se utiliza en la presente memoria, las diluciones, cantidades, etc., que se expresan en términos de % (v/v) hacen referencia al porcentaje en términos de volumen por volumen. Las temperaturas referidas en la presente memoria se dan en grados centígrados (C).

Ejemplo 1 Aislamiento e identificación de la Cepa de Stachybotrys parvispora var. hughes

Se aisló una nueva cepa de la especie Stachybotrys parvispora var. hughes a partir de muestras de suelo sobre medio nutriente de agar-agar y se seleccionó por su producción de una enzima que tenía actividad oxidasa.

La nueva cepa se cultivó individualmente sobre agar con harina de maíz (DIFCO) a 25 grados C durante un período de tres semanas.

La nueva cepa de S. parvispora se identificó por su crecimiento lento en agar con harina de maíz a 25 grados C, que era menor de 4 cm en tres semanas, su formación de conidios y las características morfológicas de los conidios formados.

Después de crecer durante tres días en agar con harina de maíz a 25 grados C, la observación microscópica reveló que las células de la nueva cepa de S. parvispora tienen la forma de conidios de un tamaño de 5,25 x 3,75 - 4,5 mm que se vuelven toscamente ásperos y se reúnen en una gota mucilaginosa de color gris oliva oscuro, nacen de fiálides de 9-11 x 3,5-4,5 mm agrupadas en verticilos. Los conidióforos tienen pared blanda, de hasta 200 mm de longitud (véase Jong, S.C. y E.E. Davis, Mycotaxon 3:409-485).

La nueva cepa de S. parvispora identificada de este modo fue depositada bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest en la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Mycothäque de l'Universitä Catholique de Louvain (MUCL), Place Croix du Sud 3, Louvain-La-Neuve, Belgium B-1348 el 5 de Diciembre de 1995 y se le asignó el número de acceso MUCL 38996.

Ejemplo 2 Aislamiento e Identificación de un Cepa de Stachybotrys chartarum

Se aisló una nueva cepa de la especie Stachybotrys chartarum (inicialmente denominada Stachybotrys atra var. corda) a partir de muestras de suelo sobre medio nutriente de agar-agar y se seleccionó por su producción de una enzima que tenía actividad oxidasa.

La nueva cepa de S. chartarum se identificó por su crecimiento rápido en agar con harina de maíz a 25 grados C, que era mayor de 4 cm en tres semanas, su formación de conidios y las características morfológicas de los conidios formados.

Después de crecer durante tres días en agar con harina de maíz a 25 grados C, la observación microscópica reveló que las células de la nueva cepa de S. chartarum tienen la forma de conidios de un tamaño de 8-11 x 5-10 mm que se vuelven toscamente ásperos y se reúnen en una gota mucilaginosa de color gris oliva oscuro, nacen de fiálides de 10-13 x 4-6 mm agrupadas en verticilos. Los conidióforos tienen pared blanda, de hasta 1.000 mm de longitud (véase Jong, S.C. y E.E. Davis, Mycotaxon 3:409-485).

La nueva cepa de S. chartarum identificada de este modo fue depositada bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest en la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Mycothäque de l'Universitä Catholique de Louvain (MUCL), Place Croix du Sud 3, Louvain-La-Neuve, Belgium B-1348 el 5 de Diciembre de 1995 y se la asignó el número de acceso MUCL 38898.

Ejemplo 3 Preparación de una Suspensión de Partida de Conidios para la Inoculación

Se aisló Stachybotrys parvispora MUCL 38996, obtenido como se ha descrito antes en el Ejemplo 1, sobre placas de PDA (agar dextrosa patata) (DIFCO).

Una colonia se suspendió en 5 ml de NaCl al 0,9% (p/v), que contenía aproximadamente 30 cuentas de vidrio estériles (diámetro 5 mm). La suspensión se agitó cuidadosamente en una mezcladora de vórtice (BENDER & HOBEIN AG), hasta que se obtuvo la completa homogeneización del micelio (a toda velocidad durante aproximadamente 15-20 minutos). Después se cultivaron en placa varias diluciones (que oscilaban de 10^{-5} a 10^{-7}) de este producto homogeneizado sobre las respectivas placas de PDA estériles y se incubaron a 30 grados C durante aproximadamente 5 semanas para permitir la formación de conidios (de color parduzco oscuro).

Tres placas, que contenían cada una aproximadamente 50 colonias esporuladas aisladas (como evidenciaba su color parduzco oscuro) se diseminaron después con 5 ml de NaCl al 0,9% (p/v) y se rasparon con una varilla de vidrio para suspender los conidios. Las suspensiones resultantes se reunieron y se filtraron utilizando una membrana Miracloth (CALBIOCHEM) con el fin de eliminar el micelio restante. El resultado fueron las suspensiones de partida de conidios.

El título (medido en términos de unidades formadoras de colonias (cfu) de la suspensión resultante se determinó después cultivando en placa diluciones [en NaCl al 0,9% (p/v)] sobre las placas de PDA. Los títulos de las suspensiones de partida de conidios resultantes oscilaban de 10^{6} a 10^{7} cfu/ml.

Ejemplo 4 Producción de Enzima Oxidante de Fenol Producción de Enzima a partir de Stachybotrys parvispora

Se preparó un fermentador de veinte litros que contenía glucosa y extracto de patata hirviendo 4,5 kilogramos de patatas peladas y picadas durante 30 minutos en 15 litros de agua (calidad mili-Q), filtrando la suspensión resultante a través de gasa de algodón hidrófilo (STELLA), recogiendo el producto filtrado resultante y añadiendo después al producto filtrado recogido un suplemento de 300 gramos de glucosa. El producto filtrado con el suplemento de glucosa se colocó después en el fermentador y se esterilizó durante 30 minutos a 120ºC. El producto filtrado con el suplemento esterilizado tenía un pH de 5,8.

Se inocularon después 15 ml de la suspensión de partida de conidios, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 3 en el fermentador de 20 litros, y se llevó a cabo la fermentación durante 144 horas a 37 grados C.

La fermentación se realizó a un flujo de aire constante de 4,5 litros/minuto y una agitación constante de 100 RPM (revoluciones por minuto) (diámetro 13 cm) sin control del pH.

Después se retiró una muestra de aproximadamente 50 ml del cultivo (fermentación) del fermentador y se centrifugó a 12.000 g durante 5 minutos. El sobrenadante se separó después del sedimento.

La presencia de actividad de la enzima oxidante de fenol en el sobrenadante se midió después utilizando el siguiente procedimiento de análisis normalizado, basado en la oxidación de ABTS [2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonato)] por oxígeno: un volumen de reacción final de 1 ml que contenía Tris [Tris(hidroximetil)aminometano]/HCl 200 mM (pH 7,0), ABTS 0,9 mM (sal de diamonio de SIGMA) y se preparó una cantidad apropiada de la preparación que se va a analizar (que, en este ejemplo, es el sobrenadante diluido con agua como se describe más abajo). La reacción de análisis se inició mediante la adición de la preparación que se va a analizar (que en este ejemplo es la dilución de sobrenadante) para formar un volumen de reacción final de 1 ml. El color azul verdoso producido por la oxidación de ABTS se midió continuamente registrando la densidad óptica (DO) a 420 nm durante dos minutos, utilizando un espectrofotómetro (Ultraspec Plus de Pharmacia). Después se calculó la tasa de aumento de la densidad óptica por minuto (\DeltaDO/minuto) desde la parte lineal de la curva durante 1 minuto.

La cantidad apropiada de la preparación (enzima) sometida a este análisis normalizado, se ajustó mediante dilución con agua con el fin de obtener un \DeltaDO/minuto que oscila de 0,2 a 1,0 durante el análisis.

Según se utiliza en la presente memoria, una unidad de enzima ABTS patrón (referida en adelante como unidad de enzima o UE) se define como la cantidad de enzima que produce un incremento de una DO^{420} por minuto, en estas condiciones específicas.

De esta manera, se midió una actividad enzimática de 30 UE/ml de sobrenadante de cultivo.

Producción de enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum

Se hizo crecer Stachybotrys chartarum sobre placas de PDA (Difco) durante aproximadamente 5-10 días. Se utilizó una porción del cultivo en placa (aproximadamente 1,90 x 1,90 cm) para inocular 100 ml de PDB (caldo de patata dextrosa) en un matraz de 500 ml con sacudimiento. El matraz se incubó a 26-28 grados C,150 rpm, durante 3-5 días hasta que se obtuvo un buen crecimiento.

Se preparó un fermentador de 10 litros (que contenía en gramos/litro los siguientes componentes: glucosa 15; lecitina 1,51; ácido t-aconítico 1,73; KH_{2}PO_{4} 3; MgSO_{4}.7H_{2}O 0,8; CaCl_{2}.2H_{2}O 0,1; tartrato de amonio 1,2; peptona de soja 5; Staley 7359; alcohol bencílico 1; tween 20 1; ácido nitrilotriacético 0,15; MnSO_{4}.7H_{2}O 0,05; NaCl 0,1; FeSO_{4}.7H_{2}O 0,01; CoSO_{4} 0,01; CaCl_{2}.2H_{2}O 0,01; ZnSO_{4}.7H_{2}O 0,01; CuSO_{4} 0,001; ALK(SO_{4})_{2}.12H_{2}O 0,001; H_{3}BO_{3} 0,001; NaMoO_{4}.2H_{2}O 0,001). Se inoculó después el caldo de cultivo de 1 litro en el fermentador, y la fermentación se llevó a cabo a 28 grados C durante 60 horas, a un flujo de aire constante de 5,0 litros/minuto y a una agitación constante de 120 rpm. El pH se mantuvo a 6,0.

La presencia de actividad de la enzima oxidante de fenol en el sobrenadante se midió utilizando el siguiente procedimiento de análisis, basado en la oxidación de ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonato)) por medio de oxígeno. Se mezclaron ABTS (SIGMA, 0,2 ml, H_{2}O 4,5 mM) y NaOAc (1,5 ml, 120 mM en H_{2}O, pH 5,0) en una cubeta. La reacción se inició por medio de la adición de una cantidad apropiada de la preparación que se iba a medir (que en este ejemplo es la dilución de sobrenadante) para formar una solución final de 1,8 ml. El color producido por la oxidación de ABTS se midió después cada 2 segundos durante un período total de 14 segundos registrando la densidad óptica (DO) a 420 nm, utilizando un espectrofotómetro. Una unidad ABTS (una unidad enzimática o EACU) en este ejemplo se define como el cambio en la DO medido a 420 por minuto/2 (dada la no dilución de la muestra). De esta manera se midió una actividad de la enzima oxidante de fenol de 3,5 EACU/ml de sobrenadante de
cultivo.

Ejemplo 5 Purificación de la Enzima

El caldo de cultivo de Stachybotrys parvispora restante, obtenido como se ha descrito antes en el Ejemplo 4, se retiró después del fermentador y se centrifugó durante 15 minutos a 4.500 g. Se purificó Stachybotrys chartarum de una manera similar.

El sobrenadante resultante se separó después del sedimento y se concentró hasta 0,6 litros mediante ultrafiltración utilizando una unidad de ultrafiltración Amicon equipada con una membrana YMIO que tenía un corte a 10 kD.

Se añadió un volumen de 1,4 litros de acetona al producto concentrado y se mezcló con él. La mezcla resultante se incubó después durante 2 horas a 20-25 grados C.

Tras la incubación, la mezcla se centrifugó durante 30 minutos a 10.000 g y el sedimento resultante se separó del sobrenadante. El sedimento se resuspendió en un volumen final de 800 ml de agua.

La suspensión resultante se sometió después a fraccionamiento con sulfato de amonio como sigue: se añadió sulfato de amonio cristalino (JANSSEN) a la suspensión hasta una saturación del 40% y la mezcla se incubó a 4 grados C durante 16 horas con agitación magnética suave. Después la mezcla se centrifugó a 10.000 g durante 30 minutos y el sobrenadante se separó del sedimento de la centrifugación para su uso adicional. Después se añadió sulfato de amonio (JANSSEN) al sobrenadante para alcanzar una saturación del 80%, y la mezcla se incubó a 4 grados C durante 16 horas con agitación magnética suave. Luego se centrifugó la suspensión durante 30 minutos a 10.000 g y el sedimento resultante se separó del sobrenadante. El sedimento se resuspendió después en 15 ml de agua y se concentró a 6 ml mediante ultrafiltración utilizando un CENTIPREP 3000 (AMICON).

La actividad de la enzima oxidante de fenol de la suspensión se midió después utilizando el procedimiento de análisis normalizado, basándose en la oxidación de ABTS por medio de oxígeno, como se describió antes en el Ejemplo 4 (pero con la excepción de que la preparación que se esta analizando es la concentración resuspendida y no las diluciones de sobrenadante). La actividad de la enzima oxidante de fenol así obtenida fue de 5200 UE/ml.

La enzima se purificó después adicionalmente mediante cromatografía de penetración en gel. Con respecto a esto, se equilibró una columna que contenía 850 ml de SEPHACRYL S400 HIGH RESOLUTION (PHARMACIA) con un tampón que contenía KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 50 mM (pH = 7,0) y después se cargó con el resto de la suspensión de 6 ml descrita antes, y se hizo eluir con el tampón que contenía KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 50 mM (pH = 7,0), a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Después se obtuvieron las respectivas fracciones.

Las respectivas fracciones que contenían las actividades de enzima oxidante de fenol más altas se reunieron, proporcionando una suspensión de 60 ml que contenía la enzima oxidante de fenol purificada.

La actividad de la enzima oxidante de fenol de la suspensión se midió después utilizando el procedimiento de análisis normalizado, basado en la oxidación de ABTS por oxígeno, como se describió antes en el Ejemplo 4. La actividad de la enzima medida de este modo fue de 390 UE/ml.

Esta preparación se utilizó después para la caracterización adicional de la enzima, como se describirá detenidamente más abajo.

Ejemplo 6 Determinación del Punto isoeléctrico de la Enzima Oxidante de Fenol de S. parvispora

El punto isoeléctrico (pI) de la enzima producida por S. parvispora MUCL 38996, se determinó después a partir de la enzima purificada, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5.

Esta determinación se efectuó mediante focalización isoeléctrica en geles de poliacrilamida, empleando Pharmacia DryIEF Gels, que habían sido rehidratados con 2 ml de solución de anfolina (1 volumen de anfolina Pharmacia al 8-10,5% (p/v) añadido a 15 volúmenes de agua desionizada), siguiendo el protocolo recomendado por el proveedor).

La enzima purificada, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5, se sometió a un gel de enfoque isoeléctrico (IEF 3-9 de Pharmacia),como se describe en PHARMACIA Technical File IEF (Núm. 100).

Se utilizaron los siguientes marcadores de referencia de PHARMACIA en este enfoque isoeléctrico: pepsinógeno (2,8), amiloglucosidasa (3,5), rojo metilo (3,75), glucosa oxidasa (4,15), inhibidor de tripsina de soja (4,55), b-lactoglobulina A (5,2), anhidrasa carbónica bovina B (5,85) y anhidrasa carbónica humana B (6,55).

Las muestras que se van a someter a enfoque isoeléctrico se prepararon, como se describe en PHARMACIA Technical File IEF Núm.100.

Después del enfoque, los geles se tiñeron con Azul de Coomassie siguiendo el protocolo detallado en Separation Technique File Núm. 101 (publicación 18-1018-20, Pharmacia LKB Biotechnology).

Utilizando esta técnica, se determinó que el punto isoeléctrico aparente de la enzima oxidante de fenol secretada a partir de S. parvispora MUCL 38996 era menor de 2,8.

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Ejemplo 7 Determinación del pH óptimo para la enzima oxidante de fenol de S. parvispora y S. chartarum

Se prepararon trece muestras de tampón de 100 ml, conteniendo cada una Tris 50 mM, ácido cítrico 50 mM y Na_{2}HPO_{4} 50 mM.

Las treces muestras de tampón se ajustaron después a los respectivos pH indicados más abajo en la Tabla 1A con HCl o NaOH, según fuera aplicable, de manera que cada una de las muestras de tampón poseyera uno de los valores de pH indicados más abajo en la Tabla 1A.

Después se tomaron tres muestras de 0,9 ml de cada una de las trece muestras de tampón. De esta manera, se proporcionaron tres grupos (un primer grupo, un segundo grupo y un tercer grupo) de trece muestras cada uno, de manera que cada grupo poseyera una muestra respectiva de cada una de las trece muestras de tampón para el
pH.

Después se añadieron los respectivos sustratos a las respectivas muestras como sigue: se añadió ABTS 0,9 mM a las trece mezclas del primer grupo; se añadió DMP (2,6-dimetoxifenol) (FLUKA) 50 \muM a las trece mezclas del segundo grupo; y se añadió siringaldizina 1 mM (SIGMA) a las trece mezclas del tercer grupo.

Las respectivas reacciones se iniciaron mediante la adición de 2 UE de enzima oxidante de fenol purificada de S. parvispora MUCL 38996, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5.

El volumen final de cada una de las muestras sometidas a análisis fue de 1 ml.

Los análisis de cada una de las treinta y nueve muestras (ajustadas a los valores de pH indicados más abajo en la Tabla 1A) se realizaron a aproximadamente 20 grados C con un tiempo de incubación de 2 minutos siguiendo el protocolo mostrado antes en el Ejemplo 4.

La densidad óptica se registró durante 2 minutos (Ultraspec Plus de Pharmacia) a las siguientes longitudes de onda: 420 nm para las muestras del primer grupo (que tenían ABTS), 468 nm para las muestras del segundo grupo (que tenían DMP) y 526 nm para las muestras del tercer grupo (que tenían siringaldizina).

La tasa de incremento de la densidad óptica (DOD/min) se calculó a partir de la porción lineal de las curvas durante 1 minuto, como se ha descrito antes detenidamente en el Ejemplo 4.

Los resultados del análisis se resumen más abajo en la Tabla 1A.

TABLA 1A Actividad (\DeltaDO/minuto/ml) para la enzima de S. parvispora

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1

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De una manera similar, se obtuvo el perfil de pH para la enzima oxidante de fenol de S. chartarum. En lugar de DMP 50 \muM, se utilizó DMP 5 mM. La cantidad de enzima utilizada por análisis de ABTS fue de 1,7 \mug de enzima en un total de 0,9 ml de análisis. La cantidad de enzima utilizada por análisis de DMP fue de 17,2 \mug en un total de 0,9 ml de análisis. Los resultados se dan en la Tabla 1B.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1B Determinación del pH óptimo de la enzima de Stachybotrys Chartarum Actividad (\DeltaDO/minuto/ml)

2

	DMP = 2,6-dimetoxifenol
	El análisis se llevó a cabo a 20ºC y a 40ºC.

Se repitió el protocolo anterior para Stachybotrys parvispora con la excepción de que se ajustaron todas las muestras de tampón a un pH de 7,0 y de que los sustratos empleados fueron 5 mM de s-dianizidina (SIGMA), 3,4-dimetoxifenol (FLUKA), 3,4-dimetoxianilina (FLUKA), 3-metoxifenol (FLUKA) y alcohol veratrílico (SIGMA).

Con la excepción del alcohol veratrílico, se observó formación de color cualitativamente a partir de cada uno de los demás sustratos.

Ejemplo 8 Comparación con la Bilirrubina Oxidasa Perfil de pH del Blanqueamiento con DBI

Se prepararon 14 mezclas de reacción (1 ml volumen final) que contenían Tris 50 mM, ácido cítrico 50 mM y Na2HPO4 50 mM, ajustándose dos de cada una de dichas mezclas de reacción a cada uno de los pH respectivos indicados más abajo en la Tabla 2 con HCl o NaOH, y a esto se la añadió el sustrato, Azul Directo Núm. 1 (referido en la presente memoria más adelante como DBI, también conocido como Azul Cielo Chicago 6B) de (SIGMA) en una cantidad necesaria para obtener una Densidad Óptica inicial (DO) de 1,0 (620 nm).

Las respectivas reacciones se iniciaron mediante la adición de las respectivas mezclas de reacción de 4,5 UE de enzima oxidante de fenol de S. parvispora MUCL 38996 obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5, o bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria (adquirida de SIGMA).

El volumen final de cada una de las muestras analizadas fue de 1 ml.

Los análisis de cada una de las muestras se realizaron a aproximadamente 20 grados C con un tiempo de incubación de 2 minutos siguiendo el protocolo mostrado antes en el Ejemplo 4.

La densidad óptica se registró durante 2 minutos (Ultraspec Plus de Pharmacia), a una longitud de onda de 620 nm. La tasa de disminución de la densidad óptica (-\DeltaDO/min) se calculó a partir de la porción lineal de las curvas.

Los resultados del análisis se resumen más abajo en la Tabla 2.

TABLA 2

3

Oxidación de quiacol

Se prepararon mezclas de reacción (1 ml volumen final) que contenían Tris/HCl 200 mM (pH 7,0) y quiacol 5mM (2-metoxifenol) (MERCK) como sustrato.

Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 5 UE de enzima oxidante de fenol de S. parvispora MUCL 38996, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5, o mediante la adición de 5 UE de bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria (adquirida de SIGMA).

El volumen final de cada una de las muestras sometidas a análisis fue de 1 ml.

Los análisis de cada una de las muestras se realizaron a aproximadamente 20 grados C con un tiempo de incubación de 2 minutos siguiendo el protocolo mostrado en el Ejemplo 4.

Se registró la densidad óptica durante 2 minutos (Ultraspec Plus de Pharmacia), a una longitud de onda de 440 nm. La tasa de incremento de la densidad óptica (\DeltaDO/min) se calculó a partir de la porción lineal de las curvas.

Con la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys parvispora MUCL 38996, se registró un incremento de la DO (0,05 \DeltaDO/min). No obstante, no se detectó actividad con la bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria.

Ejemplo 9 Blanqueamiento de Diversos Tintes

Se estudió la especificidad de sustrato de la enzima oxidante de fenol de S. parvispora MUCL 38996 frente a numerosos tintes. Las mezclas de reacción (1 ml volumen final) contenían Tris/HCl 200 mM (pH 7,0) y los respectivos tintes enumerados más abajo en la Tabla 3, la concentración de cuyos tintes se ajustó mediante dilución con agua, de manera que se midió para ellos una densidad óptica de 1,0 (a las longitudes de onda enumeradas más abajo en la Tabla 3). La nomenclatura de los reactivos y tintes es según el índice de color.

Las reacciones de blanqueamiento se iniciaron mediante la adición de enzima oxidante de fenol de S. parvispora MUCL 38996, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5. La cantidad de enzima oxidante de fenol se ajustó mediante dilución con agua con el fin de medir una disminución de la DO (a las longitudes de onda enumeradas en la Tabla 3) en el intervalo de 0,05 a 0,25 - \DeltaDO/minuto, con el fin de obtener una curva lineal.

El volumen final de cada una de las muestras analizadas fue de 1 ml.

Los análisis de cada una de las muestras se realizaron a aproximadamente 20ºC con un tiempo de incubación de 2 minutos siguiendo el protocolo mostrado antes en el Ejemplo 4.

La densidad óptica se registró durante 2 minutos, a la longitud de onda indicada en la Tabla 3 (Ultraspec Plus de Pharmacia). La tasa de disminución de la densidad óptica (-\DeltaDO/min) se calculó a partir de la porción lineal de la curva, y se multiplicó por la dilución de enzima con el fin de expresar la tasa de blanqueamiento final en -\DeltaDO/min/ml de solución de enzima obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5.

Los resultados se resumen más abajo en la Tabla 3.

En un experimento separado, se midió la tasa de consumo de oxígeno con cada uno de los tintes, en una cámara con agitación magnética equipada con un electrodo Clark (oxígrafo K-IC de Gilson). La cámara del oxígrafo contenía, en un volumen final de 2 ml, Tris/HCl 200 mM (pH 7,0), 5 mM de cada uno de los tintes, y 100 ml (39 UE) de la enzima oxidante de fenol de S. parvispora MUCL 38996, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de la enzima, y la concentración de oxígeno disuelto se registró durante 5 minutos. La pendiente de las curvas se determinó a partir de sus porciones lineales.

Los resultados de este experimento también se resumen más abajo en la Tabla 3.

TABLA 3

4

Estos resultados demuestran que la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys es capaz de oxidar y blanquear una variedad de tintes que muestran diferentes estructuras químicas, utilizando oxígeno como aceptor de electrones, y en ausencia de mediadores.

Dos tintes (negro reactivo 5 y azul reactivo 71) son oxidados por la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys, pero no se puede observar la reacción de blanqueamiento. No obstante, los ensayos anti-transferencia de tinte (véase Ejemplo 12 más abajo), muestran en efecto, que la transferencia de negro reactivo 5 se puede evitar. De este modo, incluso aunque el tinte no es blanqueado directamente por la enzima oxidante de fenol, parece ser modificado de tal manera que la transferencia es inhibida.

Los resultados resumidos en la Tabla 3 también muestran que los tintes naturales de tipo antocianina, como la malvina, se pueden blanquear eficazmente por medio de la enzima oxidante de fenol, lo que demuestra su eficacia para eliminar las manchas que contienen semejante tipo de tintes (tales como vinos de frutas, etc.).

Ejemplo 10 Propiedades Inmunológicas

La enzima oxidante de fenol purificada de S. parvispora MUCL 38996, obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5, se diluyó dos veces con agua, y se mezclaron 0,5 ml de esta solución con 0,5 ml de coadyuvante completo de Freund,y se inyectó subcutáneamente en un conejo como se describe en Antibodies (1988) Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane eds. en la página 105. Este procedimiento de inmunización se repitió tres veces más (dando cuatro veces en total), permitiendo un intervalo de tiempo de 2 semanas entre cada inyección.

Dos semanas después de la cuarta inyección, se recogieron los antisueros como se describe en Antibodies (1988) supra, en la página 119.

Después se realizaron ensayos de inmunodifusión dobles (técnica de Ouchterlony) siguiendo el protocolo mostrado, por ejemplo, en las condiciones especificadas por Clausen, J. (1988) Immunochemical Technique for the identification and Estimation of Macromolecules (3ª edición revisada) Burdon, R.H. y P.H. van Knippenberg, eds., en la página 281 (apéndice 11, micro técnica).

Se prepararon cuatro portas de microscopio respectivos (25 mm x 75 mm x 1 mm), estando cubierto cada uno con 2,5 ml de medio de difusión fundido, compuesto por agar al 1,7% (p/v) (Agar granulado de Difco Núm. 0145-17-0), y NaCl al 0,9% (p/v), siguiendo la técnica descrita por Clausen, supra (en el apéndice 10, \NAK 10.1; microtécnica). Después se hicieron cinco pocillos en el agar de cada porta utilizando un molde con un dispositivo de succión (también descrito por Clausen, supra, en el apéndice 10, \NAK 10.1.1.1). Los cinco pocillos (uno en el centro y cuatro rodeando el pocillo central) realizados en los portas tenían cada uno diámetros respectivos de 3 mm, proporcionando una distancia entre los pocillos (centro a centro) de 8 mm.

Se aisló S. chartarum MUCL 38898 (obtenido como se ha descrito antes en el Ejemplo 2) sobre Placas de Extracto de Malta (ME de DIFCO). Una colonia del mismo se suspendió después en 5 ml de NaCl al 0,9% (p/v) que contenía aproximadamente 30 cuentas de vidrio estériles (diámetro 5 mm). La suspensión se agitó cuidadosamente con un mezclador de vórtice hasta que se obtuvo la completa homogeneización del micelio. Se disolvieron 30 gramos de polvo de TSB (Tripticase Soy Broth de BECTON DICKINSON) en 1 litro de agua y se llevó a cabo la esterilización calentando a 120 grados C durante 30 minutos. Después se añadieron las respectivas cantidades de 500 ml del medio de cultivo esterilizado a dos matraces de polipropileno con sacudimiento (volumen 2 litros). Después se inocularon las respectivas muestras de 1 ml de la suspensión de micelio en los matraces y se hicieron circular durante 96 horas con agitación constante (100 RPM con una excentricidad de 2,54 cm) a 37ºC.

Después de la fermentación, el medio de cultivo de los respectivos matraces de sacudimiento se centrifugó a 10.000 g durante 15 minutos. Los sobrenadantes resultantes se separaron después y cada una se concentró 20 veces mediante precipitación con acetona (1 volumen sobrenadante/3 volúmenes de acetona). Las mezclas se incubaron después a 4ºC con agitación magnética durante 45 minutos. Las suspensiones resultantes se centrifugaron de nuevo a 10.000 g durante 15 minutos y los sedimentos resultantes se separaron. Los sedimentos separados se resuspendieron después en 50 ml de agua (calidad Milli-Q). Se midió la actividad de la enzima oxidante de fenol de 0,5 U ABTS sobre ABTS. Las soluciones enzimáticas resultantes se utilizaron después para los ensayos inmunológicos.

Se prepararon las respectivas diluciones de 2X (que tenían 1 volumen de enzima y 1 volumen de diluyente); 4X (que tenían 1 volumen de muestra de enzima y 3 volúmenes de diluyente) y 8X (que tenían 1 volumen de muestra de enzima y 7 volúmenes de diluyente) utilizando NaCl al 0,9% (p/v) como diluyente y de muestras de enzima de 0,6 UE de enzima oxidante de fenol de S. parvispora MUCL 38996 (obtenida como se ha descrito antes en el Ejemplo 5), de la enzima oxidante de fenol de S. chartarum MUCL 38898 (obtenida como se describe más abajo) y de bilirrubina oxidasa de M. verrucaria (SIGMA).

Después se cargó un volumen constante de 10 ml de las respectivas muestras (diluciones) que se iban a someter a ensayo en los respectivos cuatro pocillos circundantes (como se describe más abajo) y el antisuero originado contra la actividad de la enzima oxidante de fenol obtenida de S. parvispora MUCL 38996 se cargó en el pocillo central (también como se describe más abajo). Los portas se incubaron después durante 18 horas a 37ºC, antes de ser examinados sobre fondo negro utilizando una lámpara de hendidura. Los cuatro portas preparados de este modo contenían las siguientes muestras:

5

La Muestra 1 es una muestra no diluida de enzima de S. parvispora.

La Muestra 2 es una dilución 2X de enzima de S. parvispora.

La Muestra 3 es una dilución 4X de enzima de S. parvispora.

La Muestra 4 es una dilución 8X de enzima de S. parvispora.

La Muestra 5 es una muestra no diluida de enzima de S. chartarum.

La Muestra 6 es una dilución 2X de enzima de S. chartarum.

La Muestra 7 es una dilución 4X de enzima de S. chartarum.

La Muestra 8 es una dilución 8X de enzima de S. chartarum.

La Muestra 9 es una muestra no diluida de bilirrubina oxidasa de M. verrucaria

La Muestra 10 es una dilución 2X de bilirrubina oxidasa de M. verrucaria

La Muestra 11 es una dilución 4X de bilirrubina oxidasa de M. verrucaria

La Muestra 12 es una dilución 8X de bilirrubina oxidasa de M. verrucaria

La muestra 13 es una mezcla 1/1 (v/v) de muestras no diluidas de enzima oxidante de fenol de S. parvispora y bilirrubina oxidasa de M. verrucaria.

Las interpretaciones de las reacciones de precipitación resultantes de este ensayo se realizaron después siguiendo el protocolo descrito y en las condiciones especificadas por Clausen, supra, en el capítulo 6, pág. 143-146.

Los resultados del Porta A (que contenía las diversas diluciones de la enzima oxidante de fenol de S. parvispora) demostraron un claro arco de precipitación (o línea de inmunoprecipitación) del tipo denominado Tipo I que ha sido identificado como típico de una completa identidad (véase Clausen, supra, en las páginas 144-146, \NAK 6.1.2.1). Esto se esperaba puesto que se originaba antisuero frente a la enzima oxidante de fenol de S. parvispora.

Los resultados del Porta B (que implicaba que se estaba realizando el mismo ensayo utilizando el mismo protocolo y en las mismas condiciones descritas con detenimiento antes en este ejemplo con cantidades equivalentes (UE) de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum MUCL 38898) demostraron un claro arco de precipitación del tipo denominado TIPO I, que había sido identificado por ser típico de una completa identidad (véase Clausen, supra, en las páginas 144-146, \NAK 6.1.2.1).

Los resultados del Porta C (que implican que se estaba realizando el mismo ensayo utilizando el mismo protocolo y en las mismas condiciones descritas con detenimiento antes en este ejemplo con cantidades equivalentes (UE) de la bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria), demostraron que no se observaba arco de precipitación, lo que se identificó por ser típico de una ausencia de identidad (véase Clausen, supra, en las páginas 144-146, \NAK 6.1.2.1). De este modo, la bilirrubina oxidasa de M. verrucaria y la enzima oxidante de fenol de S. parvispora no eran totalmente (ni parcialmente) idénticas inmunoquímicamente.

Los resultados del Porta D (que implican que se estaba realizando el mismo ensayo utilizando el mismo protocolo y en las mismas condiciones descritas con detenimiento antes en este ejemplo pero con la enzima oxidante de fenol o la bilirrubina oxidasa y con las cantidades (UE) de enzima oxidante de fenol y de bilirrubina oxidasa indicadas antes) demostraron que se observaba un arco de precipitación en el pocillo (pocillo 4) que contenía la enzima oxidante de fenol de S. parvispora y la bilirrubina oxidasa de M. verrucaria (además del pocillo 1 y 2 pero no el 3), confirmando de ese modo que la observación de una carencia de arco de precipitación en el medio en el porta 3 no era el resultado de la inhibición debida a algo distinto de la enzima oxidante de fenol. De este modo, este porta y los resultados del mismo, confirman que la bilirrubina oxidasa de M. verrucaria y la enzima oxidante de fenol de S. parvispora no son totalmente (ni parcialmente) idénticas inmunoquímicamente.

Ejemplo 11 Prevención de la Transferencia de Tinte

El potencial del sistema enzimático para evitar la transferencia de tinte se analizó lavando una muestra de tela coloreada en presencia de una muestra de tela seleccionada de color blanco. Los experimentos se realizaron en 25 ml de tampón carbonato, pH 9, que contenía las dos muestras de tela de 5x5 cm. La enzima se dosificó en forma de unidades ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico). Una unidad ABTS se define como la cantidad de enzima que incrementa la densidad óptica de 1 DO/min a 418 nm en presencia de ABTS 2 mM en tampón Tris 20 mM, pH 9. Los experimentos se realizaron en presencia de 0 unidades (u), 0,5 u, 1 u, y 2 u/ml de solución de lavado. Se añadió fenotiazina-10-propionato como potenciador de la actividad enzimática. Este potenciador se añadió a concentraciones de 0 \muM, 50 \muM, 100 \muM y 250 \muM. Los tejidos se agitaron en la solución de lavado durante 30 minutos. Después de eso, se centrifugaron y se midieron los espectros de reflectancia utilizando un espectrómetro Minolta. Los datos obtenidos de este modo se transfirieron a los parámetros del espacio de color CIELAB L*a*b*. En este espacio de color, L* indica la luminosidad y a* y b* son las coordenadas de cromaticidad.

Las diferencias de color entre la muestra de tela de control, sin la adición del sistema de blanqueo enzimático, y la muestra de tela lavada en presencia de la enzima y/o fenotiazino-10-propionato, se expresaron como \DeltaE, calculado a partir de la siguiente ecuación:

6

La blancura (\DeltaL) y la diferencia de color (\DeltaE) obtenidas mediante el método anterior se dan en la siguiente tabla.

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8

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Ejemplo 12 Blanqueamiento de Manchas de Tomate

La capacidad de la enzima oxidante de fenol de la presente invención para blanquear las manchas se evaluó lavando muestras de tela de algodón manchadas con pasta de tomate en presencia de enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum (que es obtenible mediante los métodos descritos en el Ejemplo 4 y 5) y un potenciador. Los experimentos se realizaron en 15 ml de tampón borato, pH 9, y tampón fosfato, pH 7. La enzima se dosificó en forma de unidades ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico). Una unidad ABTS se define como la cantidad de enzima que incrementa la densidad óptica 1 DO/min a 418 nm en presencia de ABTS 2 mM, en tampón Tris 20 mM, pH 9. Los experimentos se realizaron en presencia de 2,8 unidades/ml de solución de lavado.

Se añadió fenotiazina-10-propionato como potenciador de la actividad enzimática. Este potenciador se añadió a concentraciones de 250 \muM. Las muestras de algodón extraíbles se lavaron durante 30 minutos, a 30ºC. Después del lavado, se midió el color residual de las manchas como en el Ejemplo 11. En la siguiente tabla se da la diferencia en las medidas de color entre la mancha antes y después del lavado.

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9

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Como se puede observar a partir de los valores de \DeltaE, el blanqueamiento de la mancha de tomate mejora en presencia de la preparación de enzima.

Ejemplo 13 Análisis de la Secuencia de Aminoácidos de la Enzima Oxidante de Fenol de Stachybotrys chartarum

Se sometió la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum preparada como se ha descrito en el Ejemplo 4 a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se aisló. La fracción aislada se trató con urea y yodoacetamida y se digirió por medio de la enzima endoLysC. Los fragmentos resultantes de la digestión con endoLysC se separaron por medio de HPLC (columna C18 monoboro en fase reversa, gradiente CH3CN) y se recogió en una placa multitítulo. Las fracciones se analizaron mediante MALDI para la determinación de la masa y se secuenció vía degradación de Edman. Se determinaron las siguientes secuencias de aminoácidos y se muestran con la orientación extremo amino a extremo carboxi:

N' DYYFPNYQSARLLXYHDHA C'

N' RGQVMPYESAGLK C'

Las Figuras 4A-4B son el alineamiento de aminoácidos de los fragmentos de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum con bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria y proteína oxidante de manganeso de LEPTOTHRIX DISCOPHORA.

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Ejemplo 14 Clonación del Ácido Nucleico Genómico

Se diseñaron dos cebadores degenerados basados en la secuencia peptídica. El cebador 1 contiene la siguiente secuencia: TATTACTTTCCNAAYTAYCA donde N representa una mezcla de los cuatro nucleótidos (A, T, C y G) e Y representa una mezcla de T y C solamente. El cebador 2 contiene la siguiente secuencia:

TCGTATGGCATNACCTGNCC.

Para el aislamiento del ADN genómico que codifica la enzima oxidante de fenol, se utilizó el ADN aislado de Stachybotrys chartarum (MUCL núm. 38898) como molde para la PCR. El ADN se diluyó 100 veces con tampón Tris-EDTA a una concentración final de 88 ng/ul. Se añadieron 10 microlitros de ADN diluido a la mezcla de reacción que contenía 0,2 mM de cada nucleótido (A, G, C y T), 1x tampón de reacción, 0,295 microgramos de cebador 1 y 0,311 microgramos de cebador 2 en un total de 100 microlitros de reacción. Después de lavar la mezcla a 100ºC durante 5 minutos, se añadieron a la mezcla de reacción 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq. La reacción de PCR se realizó a 95ºC durante 1 minuto, los cebadores se hibridaron con el molde a 45ºC durante 1 minuto y la prolongación se realizó a 68ºC durante 1 minuto. Este ciclo se repitió 30 veces para lograr un fragmento de PCR visible en el gel. El fragmento de la PCR detectado mediante el gel de agarosa contenía un fragmento de aproximadamente 1 kilobase que después se clonó en el vector plasmídico pCR-II (Invitrogen). El inserto de 1 kb se sometió después a secuenciación de ácido nucleico. Los datos de la secuencia revelaron que era el gen que codificaba Stachybotrys chartarum debido a que la secuencia peptídica deducida coincidía con las secuencias peptídicas descritas antes secuenciadas por medio de la degradación de Edman. Los fragmentos de la PCR que contenían el gen 5' y el gen 3' se aislaron después y se secuenciaron. La Figura 6 proporciona la secuencia genómica completa (SEQ ID NO: 3) de la oxidasa de Stachybotrys incluyendo las secuencias del promotor y el terminador.

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Ejemplo 15 Clonación del ADNc que codifica la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys

Se hizo crecer la cepa de Stachybotrys chartarum (MUCL 38898) en medio de producción de lacasa y se extrajo el ARN y se utilizó como molde para el aislamiento de ADNc. El ADNc total extraído se sintetizó mediante trancriptasa inversa utilizando 4,3 microgramos de ARN en una reacción de 20 microlitros que contenía 0,34 microgramos de cebador oligo dT_{18}, 0,5 mM de cada uno de los cuatro nucleótidos (A, G, C y T), 20 unidades de inhibidor de ARN y 100 unidades de transcriptasa inversa. El ADNc que codificaba la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys se clonó después mediante PCR en dos etapas. Primero, se clonó el ADNc 5' como un fragmento de 678 pb utilizando los dos cebadores siguientes:

GTCAATATGCTGTTCAAG y CTCGCCATAGCCACTAGG. Segundo, se clonó el ADNc 3' en forma de un fragmento de 1301 pb utilizando los dos cebadores siguientes:

CTTTCGATGGTTGGGCTG y GTTCTAGACTACTCCTCGATTCCAAGATC. La secuencia del ADNc de 1791 pb se muestra en la Figura 5.

Ejemplo 16 Comparación del ADN genómico de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum y el ADNc

Una comparación del ADNc con el ADN genómico reveló que había cinco intrones en el ADN genómico. El sitio de inicio de la traducción de la proteína (ATG) está en el nucleótido núm. 1044 al núm. 1046 y el sitio de terminación de la traducción está en el nucleótido núm. 3093 al núm.3095. La secuencia de la proteína traducida a partir del ADNc y el ADN genómico contiene 594 aminoácidos.

Comparación de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys chartarum con otras enzimas oxidantes

La secuencia de la proteína SEQ ID NO: 2 se utilizó como interrogante para investigar las bases de datos de ADN y proteína GCG (Genetics Computer Group University Research Park, Madison Wisconsin). Esto demostró que la oxidasa de Stachybotrys compartía un 60% de identidad con la bilirrubina oxidasa a nivel de la secuencia de la proteína. La Figura 7 muestra el alineamiento de la secuencia de las dos proteínas.

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Ejemplo 17 Expresión de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys en Aspergillus niger var. awamori

El fragmento de ADN que contenía el ácido nucleico que codificaba la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys flanqueada por dos sitios para la enzima de restricción recién introducidos (Bgl II y Xba I) se aisló mediante PCR (Figura 9). Este fragmento de la PCR se clonó primero en el vector plasmídico pCR-II y se sometió a secuenciación del ácido nucleico para verificar la secuencia génica. Este fragmento de ADN se clonó después en el sitio Bgl II a Xba I del vector (pGAPT, véase la Fig. 8). El vector utilizado para expresar la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys contiene el promotor del gen de la glucoamilasa de Aspergillus niger (de las bases 1 a 1134) y el terminador (de las bases 1227 a 1485), un sitio de multiclonación (de las bases 1135 a 1227), el gen pyrG de Aspergillus nidulans (de las bases 1486 a 3078) como marcador de selección para la transformación fúngica y el esqueleto del plásmido puc18 para la propagación en E. coli. El plásmido de expresión denominado pGAPT-gDO104 se transformó después en Aspergillus (cepa dgr246:p2, Appl. Micro. Biotechnol., 1993, 39:738-743) mediante métodos PEG normalizados. Los transformantes se seleccionaron sobre placas sin uridina. Se hicieron crecer cuarenta transformantes sopre placas CSA y después se transfirieron a matraces con sacudimiento que contenían medio especial CSL con maltosa. Las placas CSA contienen: NaH2PHO4\cdotH20: 1 g/l; MgSO_{4}: 1 g/l; Maltosa: 50 g/l; Glucosa: 2 g/l; Promosoy: 10 g/l; Mazu: 1 ml/l; y Bacto Agar: 15 g/l. El medio CSL lo describen Dunn-Coleman et al., 1991, Bio/Technology 9:976-981. El medio especial CSL es un medio CSL con la glucosa y la fructosa eliminadas. Los análisis ABTS se realizaron los días 3, 6 y 10. Los transformantes también se hicieron crecer en CSL primero y después se transfirieron al cabo de 1 día de crecimiento a medio especial Clofine. Después de 6 días de crecimiento, estas muestras se sometieron a análisis en cuanto a las actividades ABTS (>0,2 unidades). Se purificaron las esporas de los cinco mejores transformantes y se sometieron a ensayo de nuevo en cuanto a la actividad ABTS (>5 unidades/ml) después de 8 días de crecimiento en medio Clofine. La Figura 10 muestra un gel de poliacrilamida-SDS-proteína indicando el nivel de expresión de la oxidasa de Stachybotrys recombinante en Aspergillus niger var. awamori de un cultivo de 6 días desarrollado en medio especial CSL.

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Ejemplo 18 Expresión de la Enzima oxidante de fenol en Trichoderma reesei

El plásmido de expresión para su uso en la transformación en Trichoderma reesei se construyó como sigue. Los extremos del fragmento Bgl II a Xba I mostrado en la Figura 9 que contiene el gen que codifica la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys se volvieron romos por medio de la ADN polimerasa de T4 y se insertaron en el sitio de restricción PmeI del vector de expresión de Trichoderma, pTrex, que es una versión modificada de pTex, véase la Publicación PCT Núm. WO 96/23928 para una descripción completa de la preparación del vector pTEX, que contiene un promotor CBHI y un terminador para la expresión génica y un gen pyr4 de Trichoderma como marcador de selección para los transformantes. El fragmento de ADN lineal que contiene solamente el promotor CBH1, el gen oxidante de fenol de Stachybotrys, el terminador CBH1 y el marcador de selección pyr 4 se aisló del gel y se utilizó para transformar una cepa auxótrofa para uridina de Trichoderma reseei (véase la Patente de los Estados Unidos núm. 5.472.864) que tiene los cuatro genes principales de la celulasa suprimidos. Los transformantes estables se aislaron sobre placas mínimas de Trichoderma sin uridina. Los transformantes se hicieron crecer sobre 50 ml de medio Proflo en matraces con sacudimiento durante 7 días de 28ºC a 30ºC y se analizó la expresión de la enzima oxidante de fenol mediante ABTS (>0,2 unidades/ml) y gel para proteínas de SDS-PAGE. El medio Proflo está compuesto de (g/l) Proflo 22,5; lactosa 30,0; (NH_{4})_{2}SO_{4} 6,5; KH_{2}PO_{4} 2,0; MgSO_{4} 7H_{2}O 0,3; CaCl_{2} 0,2; CaCO_{3} 0,72; solución de partida de metales vestigiales 1,0 ml/l y Tween 80 al 10% 2,0 ml/l. La solución de partida de metales vestigiales utilizada tenía (g/l) FeSO_{4}.7H_{2}O 5,0; MnSO_{4}.H_{2}O 1,6; ZnSO_{4}.7H_{2}O 1,4; CoCl_{2}.6H_{2}O 2,8.

Ejemplo 19 Expresión de la enzima oxidante de fenol de Stachybotrys en Saccharomyces cerevisiae

El fragmento Bgl II a XbaI del ADNc (SEQ ID NO: 1) del gen oxidante de fenol se clonó en el vector de expresión de levadura yES2.0 (Invitrogen) que contiene el promotor Gal 1 de levadura y el terminador Cyc 1, para controlar la expresión del gen oxidante de fenol, y el gen URA3 de levadura como marcador de selección. El plásmido de expresión se transformó en una cepa de levadura (Invitrogen cepa Sc2). Los transformantes se seleccionaron sobre una placa mínima de levadura sin uridina. Cuatro transformantes seleccionados al azar mostraron actividad en el análisis en placa (formación de halo coloreado en placa mínima de levadura con ABTS 1 mM) mientras el vector plasmídico de control no mostró formación alguna de halo coloreado.

<110> Genencor International, Inc.

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<120> Nuevas Enzimas Oxidantes de Fenol

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<130> GC477-PCT

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<140> PCT/US99/06327

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<141> 1999-03-23

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<150> 09/046,969

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<151> 1998-03-24

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<150> 09/218,702

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<151> 1998-12-22

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<160> 14

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1791

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<212> ADN

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<213> Stachybotrys chartarium

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<400> 1

10

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<210> 2

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<211> 594

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<212> PRT

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<213> Stachybotrys chartarum

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<400> 2

11

12

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<210> 3

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<211> 3677

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<212> ADN

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<213> Stachybotrys chartarum

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<400> 3

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13

14

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<210> 4

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<211> 572

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<212> PRT

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<213> Myrothecium Verracaria

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<400> 4

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15

16

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<210> 5

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<211> 2067

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Fragmento PCR

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<400> 5

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17

18

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<210> 6

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<211> 538

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<212> PRT

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<213> Leptothrix discophora

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<400> 6

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19

20

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<210> 7

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Stachybotrys chartarum

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<400> 7

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\sa{Asp Tyr Tyr Phe Pro Asn Tyr Gln Ser Ala Arg Leu Leu Xaa Tyr His}

\sac{Asp His Ala}

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<210> 8

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Stachybotrys chartarum

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<400> 8

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\sa{Arg Gly Gln Val Met Pro Tyr Glu Ser Ala Gly Leu Lys Cys}

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<210> 9

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebadores Degenerados

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

tattactttc cnaaytayca

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebadores degenerados

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcgtatggca tnacctgncc

\hfill

20

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<210> 11

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Clonado como un fragmento de 1301 pb

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtcaatatgc tgttcaag

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Clonado como un fragmento de 678 pb

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgccatag ccactagg

\hfill

18

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<210> 13

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Clonado como un fragmento de 1301 pb

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctttcgatgg ttgggctg

\hfill

18

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<210> 14

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Clonado como un fragmento de 1301 pb

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

gttctagact actcctcgat tccaagatc

\hfill

29

Claims

1. Una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys y que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de 65% con la enzima oxidante de fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2.

2. La enzima oxidante de fenol de la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en el SEQ ID NO: 2.

3. La enzima oxidante de fenol de la reivindicación 1, donde dicho Stachybotrys incluye S. parvispora, S. chartarum, S. kampalensis, S. theobromae, S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes y S. nilagerica.

4. Un polinucleótido aislado que codifica la enzima oxidante de fenol de la reivindicación 1.

5. Un polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2.

6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 4 que tiene una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos 65% con la secuencia de ácido nucleico descrita en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3, o que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico descrita en el SEQ ID NO:1 o el SEQ ID NO: 3 en condiciones de medianamente a altamente restrictivas, o que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico descrita en el SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

7. El polinucleótido aislado de la reivindicación 6 que tiene la secuencia de ácido nucleico descrita en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 3.

8. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8.

10. La célula anfitriona de la reivindicación 9, que es un hongo filamentoso, una levadura o una bacteria.

11. La célula anfitriona de la reivindicación 9,donde dicho hongo filamentoso incluye especies de Aspergillus, especies de Trichoderma y especies de Mucor, dicha levadura incluye especies de Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces y Yarrowia, y dicha bacteria incluye especies de Bacillus y Escherichia.

12. Un método para producir una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys en una célula anfitriona recombinante, que comprende las etapas de:

(a): obtener una célula anfitriona recombinante transformada con un polinucleótido que codifica dicha enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys, donde dicha enzima tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de 65% con la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2;

(b): cultivar dicha célula anfitriona en condiciones adecuadas para la producción de dicha enzima oxidante de fenol; y

(c): recuperar opcionalmente dicha enzima oxidante de fenol producida.

13. Un método para producir una enzima oxidante de fenol, comprendiendo dicho método la etapa de cultivar una célula anfitriona recombinante, en condiciones adecuadas, estando caracterizada dicha célula anfitriona por la expresión de un polinucleótido transformado en dicha célula anfitriona y codificando una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys, donde dicha enzima tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de 65% con la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2, y recuperar opcionalmente dicha enzima oxidante de fenol.

14. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, donde dicha enzima oxidante de fenol es obtenible de Stachybotrys incluyendo S. parvispora, S. chartarum, S. kampalensis, S. theobromae, S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes y S. nilagerica.

15. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, donde dicho polinucleótido se define como en la reivindicación 6.

16. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, donde dicha célula anfitriona incluye hongos filamentosos, levaduras y bacterias.

17. El método de la reivindicación 16, donde dicha levadura incluye especies de Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces y Yarrowia, y dicho hongo filamentoso incluye especies de Aspergillus, especies de Trichoderma y especies de Mucor.

18. El método de la reivindicación 17, donde dicho Saccharomyces es S. cerevisiae, y donde dicho hongo filamentoso es Aspergillus niger var. awamori o Trichoderma reseei.

19. Un método para producir una célula anfitriona que comprende un polinucleótido que codifica una enzima oxidante de fenol obtenible de Stachybotrys, teniendo dicha enzima una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de 65% con la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a): introducir un polinucleótido que codifica dicha enzima oxidante de fenol en una célula anfitriona;

(b): opcionalmente cultivar dicha célula anfitriona en condiciones adecuadas para la producción de dicha enzima oxidante de fenol.

20. El método de la reivindicación 19, donde dicha célula anfitriona incluye hongos filamentosos, levaduras y bacterias.

21. El método de la reivindicación 19, donde dicho polinucleótido se define como en la reivindicación 6.

22. Una célula anfitriona transformada con un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde la célula anfitriona no es una especie de Stachybotrys.

23. La célula anfitriona de la reivindicación 22, donde dicho polinucleótido está integrado en el genoma de la célula anfitriona.

24. La célula anfitriona de la reivindicación 22, que incluye hongos filamentosos, levaduras y bacterias.

25. Una composición detergente que comprende la enzima oxidante de fenol de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.