ES2296750T3 - Forma mutada de la arginina deiminasa. - Google Patents
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Abstract
Una arginina deiminasa aislada de Mycoplasma hominis que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, en la que la arginina deiminasa se ha modificado sustituyendo al menos una lisina en el resto 112, 374, 405 ó 408 de la SEC ID Nº: 1.
Description
Forma mutada de la arginina deiminasa.
La presente invención está dirigida a mutaciones
de arginina deiminasa para una producción y procesamiento más
eficientes y, de esta forma, un tratamiento mejorado del cáncer y
otros estados patológicos.
En la actualidad se cree que el aminoácido
arginina puede desempeñar un papel importante a la hora de mediar
ciertos estados patológicos. Por ejemplo, se ha informado que
tumores como por ejemplo melanomas, hepatomas, sarcomas y leucemia
requieren arginina para su crecimiento. Sugimura y cols., Melanoma
Res. 2: 191-196 (1992); Takaku y cols., Int. J.
Cancer 51: 244-249 (1992); Miyazaki y cols., Cancer
Res. 50: 4522-4527 (1990); J. B. Jones, "The
Effect of Arginine Deiminase On Murine Leukemic Lymphoblasts",
Ph. D. Dissertation, The University of Oklahoma, páginas
1-165 (1981). El melanoma maligno (fase 3) y el
hepatoma son enfermedades mortales que matan a la mayoría de los
pacientes en menos de un año a partir del diagnóstico. En los
Estados Unidos, aproximadamente 16.000 personas al año mueren de
estas enfermedades. La incidencia de melanoma está aumentando
rápidamente en los Estados Unidos y es incluso más elevada en otros
países como por ejemplo Australia. La incidencia de hepatoma, en
partes del mundo donde la hepatitis es endémica, es incluso mayor.
Por ejemplo, el hepatoma es una de las formas principales de cáncer
en Japón y Taiwan.
Se ha informado también que muchos protozoos
requieren arginina para su crecimiento y de esta forma puede
desempeñar un papel importante en muchas enfermedades parasitarias.
van Wagtendonk y cols., "Nitrogen Metabolism in Protozoa", en
Comparative Biochemistry of Nitrogen Matabolism, páginas
1-56 (J. W. Campbell ed. 1970). La arginina
(derivada de la circulación) se ha visto también que es una fuente
de óxido nitroso, el cual puede desempeñar un papel importante a la
hora de mediar el choque séptico. Chang y cols., Am. J. Physiol.
274: H342-H348 (1998); McDonald y cols., J. Biol.
Chem. 272: 31213-31216 (1997). Se necesitan
urgentemente tratamientos eficaces para estas enfermedades.
Se ha informado que enzimas que degradan
aminoácidos no esenciales como por ejemplo la arginina, pueden ser
un medio eficaz de controlar algunas formas de cáncer. Por ejemplo,
J. B. Jones, "The Effect of Arginine Deiminase On Murine Leukemic
Lymphoblasts", Ph. D. Dissertation, The University of Oklahoma,
páginas 1-165 (1981) describió la arginina
deiminasa aislada de Pseudomonas pudita. Como la arginina
deiminasa cataliza la conversión de arginina en citrulina, ayudando
de esta forma a eliminar la arginina de la circulación de animales,
se cree que la arginina deiminasa puede usarse como una terapia
eficaz para el cáncer y otros estados patológicos en los que la
arginina desempeña un papel. Aunque la arginina deiminasa no se
produce en mamíferos, se encuentra en una serie de bacterias,
hongos y micoplasmas. La arginina deiminasa puede aislarse de esta
forma de aquellos organismos que la producen o, como alternativa,
la enzima puede producirse usando tecnología de ADN recombinante.
Misawa y cols., J. Biotechnol. 36: 145-155
(1994).
Han surgido ciertas desventajas asociadas con el
aislamiento de arginina deiminasa de organismos. Aunque eficaz a la
hora de matar células tumorales in vitro, la arginina
deiminasa aislada de Pseudomonas pudita no mostró eficacia
in vivo porque tenía poca actividad enzimática a un pH neutro
y se retiró rápidamente de la circulación de animales
experimentales. La arginina deiminasa derivada de Mycoplasma
arginini (SEC ID Nº: 5) se describe por ejemplo en Takaku y
cols., Int. J. Cancer 51: 244-249 (1992) y en la
patente de los EE.UU. nº 5.474.928. Un problema asociado con el uso
terapéutico de tal proteína heteróloga es su antigenicidad. La
modificación química de la arginina deiminasa procedente de
Mycoplasma arginini a través de un grupo que une cloruro
cianúrico con polietilenglicol se describe en Takaku y cols., Int.
J. Cancer Res. 84: 1195-1200 (1993). La proteína
modificada resultó tóxica cuando fue metabolizada debido a la
liberación de cianuro del grupo que une cloruro cianúrico.
La producción de arginina deiminasa a través de
técnicas de ADN recombinante proporciona también ciertas
desventajas. Por ejemplo, la arginina deiminasa producida en
Escherichia coli es inactiva desde el punto de vista
enzimático y por lo tanto debe desnaturalizarse y después
renaturalizarse adecuadamente con el fin de convertirse en activa
desde el punto de vista enzimático. El procedimiento habitual para
renaturalizar la arginina deiminasa producida en E. coli es
aislar la enzima inactiva, disolverla en clorhidrato de guanidinio y
renaturalizarla por dilución rápida en un tampón de baja fuerza
iónica. Esta última etapa requiere volúmenes muy grandes de tampón,
haciendo que la fabricación de arginina deiminasa sea cara y
requiera de mucho tiempo. Sin embargo, la tecnología recombinante
tiene ciertas ventajas. Por ejemplo, los organismos más susceptibles
de fermentación pueden usarse como huéspedes. Además, estos
huéspedes para fermentación son generalmente mucho menos patogénicos
y pueden obtenerse mayores cantidades de arginina deiminasa. Se ha
visto que E. coli puede producir grandes cantidades de
arginina deiminasa de Mycoplasma.
Otro problema asociado con la arginina deiminasa
es que la enzima es altamente antigénica y de esta forma se retira
rápidamente de la circulación. Según esto, la arginina deiminasa
debe formularse apropiadamente antes de usarse como agente
terapéutico. Para los propósitos de la presente invención, el
término formulación puede definirse como la modificación química de
cualquier arginina deiminasa para los propósitos de reducir la
antigenicidad de la enzima. Por ejemplo, se ha visto que la
formulación de varias proteínas incluyendo arginina deiminasa con
polietilenglicol, es decir pegilación, puede reducir la
antigenicidad de la proteína y aumentar en gran medida su su
semivida en circulación. Desafortunadamente, la formulación de
arginina deiminasa con polietilenglicol inactiva a menudo la
enzima.
Hay una necesidad de procedimientos y compuestos
que enfoquen estos problemas asociados con la técnica anterior. La
presente invención está dirigida a estos, así como a otros
importantes fines.
La presente invención se refiere a una enzima
arginina deiminasa capaz de una producción y procesamiento más
eficientes, y a composiciones farmacéuticas que comprenden dicha
enzima.
Dichas composiciones pueden usarse para tratar
cáncer, así como para tratar y/o inhibir la metástasis de células
tumorales. Dichas composiciones pueden usarse también para tratar
una enfermedad parasitaria, choque séptico y otros estados
patológicos.
Estos y otros aspectos de la presente invención
serán elucidados en la siguiente descripción detallada de la
invención.
La Figura 1 describe la secuencia de aminoácidos
de la arginina deiminasa clonada de Mycoplasma hominis de
tipo salvaje (SEC ID Nº: 1).
La Figura 2 describe la secuencia de aminoácidos
de la arginina deiminasa modificada de Mycoplasma hominis
según realizaciones preferidas de la presente invención (SEC ID Nº:
4).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que modificaciones de uno o más restos de
aminoácidos que se dan en la naturaleza de la arginina deiminasa
procedente de Mycoplasma hominis pueden proporcionar una
enzima que se renaturaliza y se formula más fácilmente, mejorando
por lo tanto técnicas existentes para la fabricación de arginina
deiminasa y composiciones terapéuticas que comprenden la misma. Las
composiciones terapéuticas comprenden también vehículos o
diluyentes biocompatibles tal y como los expertos en la técnica
conocen. Las composiciones terapéuticas de la invención se elaboran
estériles y no pirogénicas con facilidad. Tales técnicas
composiciones y formulaciones mejoradas son necesarias para el
tratamiento eficaz del cáncer y otros estados patológicos.
Tal y como se usa e la presente memoria
descriptiva, el término "melanoma" puede ser un tumor maligno o
benigno que surge a partir del sistema melanocítico de la piel y
otros órganos, incluyendo la cavidad oral, esófago, canal anal,
vagina, leptomeninges y/o las conjuntivas o el ojo. El término
"melanoma" incluye, por ejemplo, melanoma
acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma
juvenil benigno, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno,
melanoma nodular, melanoma sublingual y melanoma de propagación
superficial.
"Hepatoma" puede ser un tumor maligno o
benigno del hígado, incluyendo, por ejemplo, carcinoma
hepatocelular.
"Paciente" se refiere a un animal,
preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
"Biocompatible" se refiere a materiales o
compuestos que son generalmente no dañinos para las funciones
biológicas y que no provocarán ningún grado de toxicidad
inaceptable, incluyendo estados alergénicos y patológicos.
"Polietilenglicol" o "PEG" se refiere
a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua,
en una cadena ramificada o lineal, representado por la fórmula
general H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH, en la que n es
al menos 4. Se prefiere que el polietilenglicol sea una cadena
lineal. Generalmente, aumentando el peso molecular del
polietilenglicol disminuye la inmunogenicidad de la arginina
deiminasa. El polietilenglicol puede usarse junto con arginina
deiminasa y, opcionalmente, un grupo de unión biocompatible, para
tratar cáncer, incluyendo por ejemplo melanomas, hepatomas y
sarcomas, preferiblemente melanomas.
Las células normales no requieren arginina para
su crecimiento porque pueden sintetizar arginina a partir de
citrulina en un procedimiento de dos etapas catalizado por
arginosuccinato sintasa y arginosuccinato liasa. Por el contrario,
los melanomas, hepatomas y algunos sarcomas no expresan
arginosuccinato sintasa; por lo tanto, son auxotróficos para
arginina, es decir, requieren arginina para su crecimiento. Esta
diferencia metabólica puede ser capitalizada tras desarrollar una
terapia segura y eficaz para tratar estas forma de cáncer. La
arginina deiminasa cataliza la conversión de arginina en citrulina y
puede usarse para eliminar arginina. De esta forma, la arginina
deiminasa puede utilizarse como tratamiento para melanomas,
hepatomas, algunos sarcomas y otros estado patológicos.
Las secuencias de aminoácidos de la arginina
deiminasa del gen de Mycoplasma hominis se describe en las
Figuras 1 (SEC ID Nº: 1) o 2 (SEC ID Nº: 4). La modificación química
y genética de la enzima arginina deiminasa puede afectar a sus
actividades biológicas. Por ejemplo, se ha visto que la arginina
deiminasa es típicamente antigénica y se retira rápidamente de la
circulación en un paciente. Sin embargo, se ha visto también que la
formulación de la arginina deiminasa con polietilenglicol reduce la
antigenicidad y aumenta la semivida de la enzima en la circulación.
Abuchowski y cols., Cancer Biochem. Biophys. 7:
175-186 (1984); Abuchowski y cols., J. Biol. Chem.
252: 3582-3586 (1977). En particular, la arginina
deiminasa puede modificarse covalentemente con polietilenglicol. De
aquí en adelante puede hacerse referencia a la arginina deiminasa
modificada covalentemente con polietilenglicol (con o sin un grupo
de unión) como "ADI-PEG". En la solicitud de
patente de los EE.UU. con nº de serie 09/023.809,Clark describe
modificaciones mejoradas de arginina deiminasa con polietilenglicol.
Cuando se compara con la arginina deiminasa nativa,
ADI-PEG conserva la mayor parte de su actividad
enzimática, es con mucho menos antigénica, tiene una semivida en
circulación bastante mayor y es mucho más eficaz en el tratamiento
de tumores. Para los propósitos de la invención, puede hacerse
referencia a la modificación de cualquier arginina deiminasa con
polietilenglicol como pegilación.
Resulta necesario, sin embargo, modificar la
arginina deiminasa con la máxima cantidad de polietilenglicol con
el fin de disminuir su antigenicidad. Por ejemplo, la arginina
deiminasa puede formularse con la máxima cantidad de succinimidil
succinato polietilenglicol (SS-PEG). El
SS-PEG se une a aminas primarias en proteínas (el
extremo n-terminal y lisinas) durante el
procedimiento de pegilación. Desafortunadamente, se ha visto que el
procedimiento de pegilación puede inactivar la arginina deiminasa si
se le permite llegar hasta el final. Aunque no se pretende limitar
la presente invención de ningún modo, actualmente se cree que la
arginina deiminasa se inactiva porque el polietilenglicol se une a
sitios en la enzima que interfieren con la capacidad de las enzimas
para catalizar una reacción. De esta forma, ha sido necesario
tradicionalmente determinar con sumo cuidado la relación exacta de
SS-PEG a enzima, concentración de reactivo y tiempo
de reacción con el fin de prevenir inactivación mientras disminuye
la antigenicidad (es decir, pegilación óptima). Además, comienza a
resultar cada vez más difícil controlar las reacción de pegilación a
medida que aumenta la escala de producción, y a menudo es necesario
inactivar el SS-PEG antes de la retirada del exceso
de polietilenglicol.
Se ha visto también que la arginina deiminasa
producida por tecnología recombinante, en particular arginina
deiminasa producida en células de Escherichia coli, es
inactiva inicialmente. De esta forma ha sido necesario la arginina
deiminasa recombinante desnaturalizando y después renaturalizando de
forma adecuada la enzima. Típicamente, la enzima inactiva se ha
aislado, disuelto en clorhidrato de guanidinio y después
renaturalizado a través de una dilución rápida con tampón de baja
fuerza iónica. Sin embargo, se requieren grandes volúmenes de
tampón, haciendo de esta forma que la producción de arginina
deiminasa recombinante se a cara y lleve mucho tiempo.
Se ha descubierto ahora que ciertas
modificaciones de la arginina deiminasa pueden facilitar la
renaturalización y formulación (es decir, la pegilación) de la
enzima mejorando por lo tanto los procedimientos de fabricación. La
presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que
ciertos cambios en los aminoácidos de la arginina deiminasa
proporcionan excelentes resultados en la producción recombinante y
formulación de la enzima. La producción de arginina deiminasa
tradicionalmente a resultado cara y ha llevado mucho tiempo debido
a las dificultades asociadas a la producción recombinante y
formulación. La presente invención describe de esta forma una
arginina deiminasa modificada que proporciona procedimientos
mejorados de renaturalización y formulación a la vez que conserva
la capacidad de convertir arginina en citrulina. Para los propósitos
de la presente invención, la arginina deiminasa modificada puede
definirse como una arginina deiminasa aislada de Mycoplasma
hominis que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:
1, en la que la arginina deiminasa ha sido modificada sustituyendo
al menos una lisina en el resto 112, 374, 405 ó 408 de la SEC ID
Nº: 1. Debe entenderse que la arginina deiminasa modificada puede
incluir arginina deiminasa que tiene una sustitución de un único
aminoácido o sustituciones de varios aminoácidos. También se
describe una secuencia de ADN que codifica la arginina deiminasa
modificada de la invención. La arginina deiminasa modificada de la
invención puede proporcionar excelentes resultados en el tratamiento
de ciertos tipos de cáncer, inhibiendo la metástasis del cáncer y
tratando otros estados patológicos.
Debe entenderse que la invención se basa en el
descubrimiento de que ciertos sitios de pegilación asociados a la
arginina deiminasa pueden localizarse en o adyacentes a la región
catalítica de la enzima. Para los propósitos de la presente
invención, la expresión "sitio de pegilación" puede definirse
como cualquier sitio o posición de la arginina deiminasa que pueda
estar covalentemente modificado con polietilenglicol. Un "sitio de
pegilación" puede considerarse localizado en o adyacente a la
región catalítica de la enzima en la que la pegilación del sitio da
lugar a una reducción significativa en la actividad catalítica de la
enzima. La pegilación de tales sitios ha dado lugar
tradicionalmente a la inactivación de la enzima. Por ejemplo, la
arginina deiminasa procedente de Mycoplasma hominis tiene
una lisina en la posición 112 que se cree está en o adyacente a la
región catalítica de la enzima. La unión de polietilenglicol a esta
lisina en la posición 112 puede inactivar la enzima. Además la
arginina deiminasa procedente de Mycoplasma hominis tiene una
cisteína en la posición 112 que se cree está en o adyacente a la
región catalítica de la enzima. La importancia de esta cisteína se
ha visto en que ahora se ha descubierto que las sustituciones de
aminoácidos para cisteína en la posición 397 pueden inactivar la
enzima. En particular, se ha visto que la sustitución de alanina,
histidina, arginina, serina, lisina o tirosina para cisteína en la
posición 397 da lugar a una pérdida de toda actividad enzimática
detectable. La arginina deiminasa procedente de Mycoplasma
hominis tiene también tres lisinas localizadas cerca de esta
cisteína conservada, en particular Lys^{374}, Lys^{405} y
Lys^{408}. La unión de polietilenglicol a Lys^{374}, Lys^{405}
y Lys^{408} o a combinaciones de los mismos se cree que inactivan
la enzima.
Debe entenderse que la arginina deiminasa
derivada de otros organismos puede tener también sitios de
pegilación correspondientes a la posición 112 de la arginina
deiminasa procedente de Mycoplasma hominis. Por ejemplo, la
arginina deiminasa procedente de Streptococcus pyrogenes
tiene una lisina en la posición 104, la arginina deiminasa
procedente de Mycoplasma pneumoniae tiene una lisina en la
posición 104 y la arginina deiminasa procedente de Giardia
intestinalis tiene una lisina en la posición 114. Además, la
arginina deiminasa procedente de algunos organismos, puede tener
lisinas que corresponden a la misma localización general que en la
posición 112 de la arginina deiminasa procedente de Mycoplasma
hominis. La localización de lisina en la arginina deiminasa
procedente de tales organismos puede indicarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la actualidad se cree que la unión de
polietilenglicol a tales lisinas o a combinaciones de las mismas
puede inactivar la enzima. Actualmente se cree que las sustituciones
de aminoácidos en tales lisinas pueden dar lugar a una proteína que
pierda menos de su actividad enzimática tras pegilación.
La presente invención proporciona de esta forma
ciertas sustituciones de aminoácidos en la cadena polipeptídica de
la arginina deiminasa. Estas sustituciones de aminoácidos
proporcionan una arginina deiminasa modificada que pierde menos
actividad tras la pegilación; es decir, tras la pegilación la
reducción de actividad enzimática que sigue a la pegilación en las
arginina deiminasas modificadas es menor que la reducción de
actividad enzimática que sigue a la pegilación en las arginina
deiminasas no modificadas. Eliminando los sitios de pegilación en o
adyacentes a la región catalítica de la enzima, puede lograrse una
pegilación óptima sin la tradicional pérdida de actividad. Tal y
como se describe anteriormente, la arginina deiminasa procedente de
ciertos organismos tiene sitios de pegilación localizados en varias
posiciones en la cadena peptídica. En la actualidad se cree que la
arginina diminasa puede tener el aminoácido lisina localizado en o
adyacente a la región catalítica de la enzima y que la pegilación
de estos sitios puede inactivar la enzima. Eliminando al menos uno
de estos sitios de pegilación, puede lograrse la pegilación y
conservarse más actividad enzimática. Según la invención, se
prefiere que la lisina esté sustituida por ácido glutámico, valina,
ácido aspártico, alanina, isoleucina, leucina o combinaciones de
los mismos. Resulta más preferible que la lisina esté sustituida por
ácido glutámico. La arginina deiminasa modificada procedente de
Mycoplasma hominis de la invención tiene una sustitución de
aminoácidos de Lys^{112} a Glu^{112}, Lys^{374} a Glu^{374},
Lys^{405} a Glu^{405}, Lys^{408} a Glu^{408}, o
combinaciones de los mismos. Resulta más preferible que la arginina
deiminasa modificada procedente de Mycoplasma hominis tenga
lisina en la posición 112 sustituida por ácido glutámico (SEC ID Nº:
2).
Debe entenderse que otras realizaciones
preferidas de la invención se basan en el descubrimiento de que
ciertas características estructurales de la arginina deiminasa
puede prevenir o interferir con la renaturalización propia y rápida
de la arginina deiminasa cuando es producida a través de tecnología
recombinante. En particular, estas características estructurales
impiden o previenen que la enzima asuma una conformación activa
durante la producción recombinante. Para los propósitos de la
presente invención, la expresión "conformación activa" puede
definirse como una estructura tridimensional que permite actividad
enzimática por arginina deiminasa no modificada o modificada. En
particular, la conformación activa puede ser necesaria para
catalizar la conversión de arginina en citrulina. La expresión
"característica estructural" puede definirse como cualquier
rasgo, cualidad o propiedad de la cadena polipeptídica que resulta
de un aminoácido o combinación de aminoácidos en particular. Por
ejemplo, la arginina deiminasa puede contener un aminoácido que da
lugar a un pliegue o rizo en la cadena polipeptídica normal y de
esta forma impide a la enzima que asuma una conformación activa
durante la renaturalización de la enzima. En particular, la arginina
deiminasa procedente de Mycoplasma hominis tiene una prolina
en la posición 210 que puede dar lugar a un pliegue o rizo en la
cadena polipeptídica, haciéndola más difícil de renaturalizar la
enzima durante la producción recombinante. Debe entenderse que la
arginina deiminasa derivada de otros organismos puede tener también
sitios correspondientes a la posición 210 de la arginina deiminasa
procedente de Mycoplasma hominis.
De esta forma, la presente invención proporciona
de nuevo ciertas sustituciones de aminoácidos en la cadena
polipeptídica de la arginina deiminasa. Tales sustituciones de
aminoácidos pueden eliminar las características estructurales
problemáticas en la cadena peptídica de la arginina deiminasa. Tales
sustituciones de aminoácidos proporcionan una renaturalización
mejorada de la arginina deiminasa modificada. Estas sustituciones de
aminoácidos hacen posible una renaturalización rápida de la
arginina deiminasa modificada usando cantidades reducidas de
tampón. Estas sustituciones de aminoácidos pueden proporcionar
también rendimientos aumentados de arginina deiminasa modificada
renaturalizada. En una realización de la invención se prefiere que
la arginina deiminasa modificada tenga una única sustitución de
aminoácidos en Pro^{210}. Tal y como se menciona anteriormente,
la arginina deiminasa derivada de Mycoplasma hominis tiene el
aminoácido prolina localizado en la posición 210. Mientras no se
limite la presente invención, actualmente se cree que la presencia
del aminoácido prolina en la posición 210 da lugar a un pliegue o
rizo en la cadena polipeptídica normal que incrementa la dificultad
de renaturalizar (es decir, el replegado) la arginina deiminasa. Las
sustituciones para prolina en la posición 210 hacen posible la
rápida renaturalización de la arginina deiminasa modificada usando
cantidades reducidas de tampón. Las sustituciones para prolina en
la posición 210 pueden proporcionar también rendimientos aumentados
de arginina deiminasa modificada renaturalizada. En una realización
preferida, la prolina en la posición 210 se sustituye con serina
(SEC ID Nº: 3). Debe entenderse según este aspecto de la invención
que pueden realizarse otras sustituciones en la posición 210.
Ejemplos de sustituciones preferidas incluyen Pro^{210} a
Thr^{210}, Pro^{210} a Arg^{210}, Pro^{210} a Asn^{210},
Pro^{210} a Gln^{210} o Pro^{210} a Met^{210}. Eliminando
aquellas características estructurales asociadas al aminoácido de la
posición 210 de la arginina deiminasa de tipo salvaje, puede
lograrse un repliegue adecuado de la enzima.
En otra realización de la invención, se prefiere
que la arginina deiminasa modificada tenga múltiples sustituciones
de aminoácidos. La arginina deiminasa modificada puede tener al
menos una sustitución de aminoácidos eliminando los sitios de
pegilación en o adyacentes a la región catalítica de la enzima. La
arginina deiminasa modificada puede tener también al menos una
sustitución de aminoácidos eliminando aquellas características
estructurales que interfieren con la renaturalización de la enzima.
Las sustituciones de aminoácidos pueden proporcionar de esta forma
una arginina deiminasa modificada de la invención. Las sustituciones
de aminoácidos pueden proporcionar la pegilación de la arginina
deiminasa modificada sin una pérdida de actividad enzimática. Las
sustituciones de aminoácidos hacen posible una renaturalización
rápida de la arginina deiminasa modificada usando cantidades
reducidas de tampón. Las sustituciones de aminoácidos pueden
proporcionar también rendimientos aumentados de arginina deiminasa
modificada renaturalizada. En una realización preferida, la arginina
deiminasa modificada derivada de Mycoplasma hominis incluye
la prolina en la posición 210 sustituida con serina y la lisina en
la posición 112 sustituida con ácido glutámico (SEC ID Nº: 4). Tal y
como se describe anteriormente, sin embargo, debe entenderse que la
arginina deiminasa modificada puede incluir otras sustituciones
preferidas.
Se prefiere que la arginina deiminasa modificada
de la invención sea derivada de Mycoplasma hominis. Según la
invención, sin embargo, los expertos en la materia entenderán que la
arginina deiminasa modificada puede derivar de otros organismos.
Por ejemplo, tal y como se describe anteriormente, la arginina
deiminasa modificada de la invención puede derivar de
Streptococcus pyrogenes, Mycoplasma pneumoniae, Giardia
intestinalis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma arginini, Clostridium
perfringens, Bacillus licheniformis, Borrelia burgdorferi, Borrelia
afzelii, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyrogenes,
Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus sakei. Debe entenderse
que la arginina deiminasa modificada puede tener una o más
sustituciones de aminoácidos según varios aspectos de la
invención.
Debe entenderse que en ciertas realizaciones de
la presente invención puede formularse arginina deiminasa
modificada con polietilenglicol. La presente invención proporciona
la unión de polietilenglicol a arginina deiminasa modificada para
aumentar la semivida en circulación, sin la tradicional inactivación
de la enzima. Tradicionalmente, la selección del sitio de unión de
polietilenglicol en la arginina deiminasa se determinó por el papel
de cada uno de los sitios dentro del dominio activo de la proteína,
tal y como conocería el experto en la materia. Según la presente
invención, el polietilenglicol puede estar unido a una amina
primaria de la arginina deiminasa modificada. La presente invención
proporciona la unión de polietilenglicol a las aminas primarias de
la arginina deiminasa sin pérdida sustancial de actividad
enzimática. Por ejemplo, la arginina deiminasa modificada
procedente de Mycoplasma hominis contiene aminoácidos lisina
que pueden modificarse con polietilenglicol. En otras palabras,
estas lisinas son todas posibles puntos a los que puede unirse
polietilenglicol en la arginina deiminasa modificada. Debe
entenderse, sin embargo, que el polietilenglicol puede estar unido
también a otros sitios en la arginina deiminasa modificada, tal y
como quedaría claro para los expertos en la materia. Aumentando el
número de unidades de polietilenglicol en la arginina deiminasa
modificada aumenta la semivida en circulación de la enzima sin la
tradicional disminución en la actividad específica de la enzima.
El grupo de unión usado para unir covalentemente
polietilenglicol a arginina deiminasa modificada puede ser
cualquier grupo de unión biocompatible. Tal y como se discute
anteriormente, "biocompatible" indica que el compuesto o grupo
no es tóxico y puede utilizarse in vitro o in vivo sin
provocar daño, malestar, enfermedad o muerte. El polietilenglicop
puede estar unido al grupo de unión, por ejemplo, a través de un
enlace éter, un enlace éster, un enlace tiol o un enlace amida.
Grupos de unión biocompatibles adecuados incluyen, por ejemplo, un
grupo éster, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un
grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un hidrato de carbono, un
grupo maleimida (incluyendo, por ejemplo, succinato de succinimidilo
(SS), propionato de succinimidilo (SPA), carboximetilato de
succinimidilo (SCM), succinimidil succinamida (SSA) o
N-hidroxisuccinimida (NHS)), un grupo epóxido, un grupo
oxicarbonilimidazol (incluyendo, por ejemplo, carbonildimidazol
(CDI)), un grupo nitrofenilo (incluyendo, por ejemplo,carbonato de
nitrofenilo (NPC) o carbonato de triclorofenilo (TPC)), un grupo
trisilato, un grupo aldehído, un grupo isocianato, un grupo
vinilsulfona, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo
histidina o una amina primaria. Preferiblemente, el grupo de unión
biocompatible es un grupo éster y/o un grupo maleimida. Más
preferiblemente, el grupo de unión es SS, SPA, SCM, SSA o NHS; con
SS, SPA o NHS siendo más preferidos, y con SS o SPA siendo los más
preferidos.
Alternativamente, el polietilenglicol puede
acoplarse directamente a arginina deiminasa modificada (es decir,
sin un grupo de unión) a través de un grupo amino, un grupo
sulfhidrilo, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo. El
polietilenglicol puede estar unido covalentemente a arginina
deiminasa modificada a través de un grupo de unión biocompatible,
usando procedimientos conocidos en la técnica tal y como se
describe, por ejemplo, en Park y cols., Cancer Res., 33:
3-14 (1973); y Zaplipsky y Lee, Polyethylene Glycol
Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris,
eds., Plenum Press, NY, Capítulo 21 (1992).
La presente descripción se refiere también a
moléculas de ADN recombinante que codifican la arginina deiminasa
modificada de la invención. Se prefiere que las moléculas de ADN que
comprenden las moléculas de ADN recombinante de esta invención
deriven de ADNc a partir de ARNm molde o través de la reacción en
cadena de la polimerasa (véase patente de los EE.UU nº 4.800.159) o
a partir de aislados de especimenes clínicos. Alternativamente,
tales moléculas de ADN recombinante pueden sintetizarse por técnicas
convencionales de síntesis de ADN. También hay disponibles
públicamente varias cepas de Mycoplasma hominis en depósitos
comerciales, por ejemplo, a partir a partir de la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC, American Type Culture Collection),
Bethesda, MD, EE.UU.
Las moléculas de ADN descritas en la presente
memoria descriptiva pueden comprender secuencias adicionales de ADN
incluyendo, por ejemplo, un elemento regulador, uno o más marcadores
seleccionables y secuencias que codifiquen las funciones de
replicación y mantenimiento. La región reguladora contiene
típicamente un promotor que se encuentra corriente arriba de la
secuencia codificante de esta invención, el cual funciona en la
unión de ARN polimerasa y en el inicio de la transcripción de ARN.
En otras palabras, el elemento o región reguladora puede estar
unido operativamente a la secuencia codificante de esta invención.
Los expertos en la materia apreciarán que la selección de regiones
reguladoras dependerá de la célula huésped empleada.
La presente descripción se refiere también a
vectores recombinantes, particularmente a plásmidos recombinantes
que comprenden secuencias que codifican la arginina deiminasa
modificada de la invención.
También se describe en la presente memoria
descriptiva una célula huésped transformada con la molécula de ADN
recombinante de esta invención. Tal célula huésped es capaz de
crecer en un medio de cultivo adecuado y expresar la secuencia
codificante de la invención. Tal célula huésped puede prepararse por
procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva, por
ejemplo por transformación de una célula huésped deseada con el
plásmido de esta invención. Tal transformación puede llevarse a cabo
por utilización de técnicas convencionales de transformación.
Además, la molécula de ADN recombinante descrita en la presente
memoria descriptiva puede integrarse en el genoma de la célula
huésped por técnicas convencionales, por ejemplo recombinación
homóloga. Aquellas células huésped incluyen, pero no se limitan a,
células de mamífero, células de insecto, células de levadura y de
otras bacterias, por ejemplo, Streptomyces, Bacillus y Salmonella.
Se prefiere que las células huésped incluyan aquellas que
pertenecen a la especie E. coli. Esta invención y el producto
de la misma no se limitan a cualquier célula huésped específica. Se
prefiere que la arginina deiminasa modificada sea producida por la
célula huésped transformada descrita en la presente memoria
descriptiva, pero tal enzima puede prepararse por técnicas
convencionales de síntesis de péptidos.
La presente descripción se refiere también a
procedimientos para producir la enzima codificada por la molécula
de ADN recombinante de esta invención que comprende cultivar el
huésped transformado de la invención en un medio de cultivo
apropiado y el aislamiento de tal enzima. Para los propósitos de la
presente invención, la expresión "medio de cultivo apropiado"
puede definirse como aquel medio que facilita a tal huésped la
expresión de moléculas de ADN recombinante que codifican la
arginina deiminasa modificada de la invención. Los expertos en la
materia apreciarán que el medio de cultivo adecuado dependerá de la
célula huésped usada. El aislamiento de la enzima así producida
puede llevarse a cabo a partir de un lisado en cultivo del huésped
o, si fuera apropiado, directamente a partir del medio de cultivo
del huésped, y tal aislamiento se lleva a cabo por técnicas
convencionales de aislamiento de
proteínas.
proteínas.
La secuencia que codifica el ADN de la arginina
deiminasa modificada de la invención puede expresarse en una célula
huésped transformada de Mycoplasma hominis. Preferiblemente
la célula de Mycoplasma hominis es deficiente en arginina
deiminasa y por ello requiere complementación. En tales sistemas,
las secuencias que codifican la arginina deiminasa modificada se
localizan típicamente en un vector. Tales vectores contienen una
cantidad suficiente de ADN bacteriano para propagar el vector en
E. coli o en alguna otra célula huésped. Tal vector contiene
también una cantidad suficiente de ADN de Mycoplasma hominis
flanqueando la secuencia que codifica la enzima de modo que permita
la recombinación entre el huésped Mycoplasma hominis
deficiente en el gen de la arginina deiminasa y el gen heterólogo
de la arginina deiminasa modificada. Los expertos en la materia
deben entender que no resulta esencial usar un huésped Mycoplasma
hominis deficiente en el gen de la arginina deiminasa
modificada, pero que la ausencia del gen en el huésped antes de la
recombinación facilitará el rastreo y aislamiento de huéspedes
recombinantes que tengan incorporado el gen de interés. El
Mycoplasma hominis recombinante que surge de recombinación
homóloga puede seleccionarse entonces por técnicas convencionales
tal y como conocen los expertos en la materia.
La arginina deiminasa de la invención puede
usarse en el tratamiento de cáncer y/u otros estados patológicos
administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los
compuestos de la presente invención. Una cantidad terapéuticamente
eficaz de uno de los compuestos de la presente invención es una
cantidad que resulta eficaz a la hora la incidencia del estado
patológico. Cuando el estado patológico sea cáncer, una cantidad
terapéuticamente eficaz de uno de los compuestos de la presente
invención puede ser una cantidad que es eficaz a la hora de inhibir
crecimiento tumoral. Generalmente, el tratamiento se inicia con
pequeñas dosis que pueden aumentarse a razón de pequeños
incrementos hasta que se logre el efecto óptimo bajo las
circunstancias. Generalmente, una dosis terapéutica de compuestos
de la presente invención puede ser desde aproximadamente 1 a
aproximadamente 200 mg/kg dos veces a la semana hasta
aproximadamente una vez cada dos semanas. Por ejemplo, la dosis
puede ser aproximadamente 1 mg/kg una vez a la semana en forma de
una inyección intravenosa de 2 ml hasta aproximadamente 20 mg/kg
una vez cada tres días. Puede mezclarse PEG-ADI con
una solución salina tamponada con fosfato o cualquier otra solución
apropiada conocida por los expertos en la técnica antes de la
inyección. La formulación de PEG-ADI puede
administrarse en forma de un sólido (liofilizado) o en forma de una
formulación líquida, tal y como se desee.
Los procedimientos pueden requerir aplicaciones
in vitro o in vivo. En el caso de aplicaciones in
vitro, incluyendo aplicaciones con cultivo celular, los
compuestos descritos en la presente memoria descriptiva pueden
añadirse a las células en cultivos y después incubarse. Los
compuestos de la presente invención pueden usarse también con el
fin de facilitar la producción de anticuerpos monoclonales y/o
policlonales usando técnicas de producción de anticuerpos
perfectamente conocidas en la técnica. Los anticuerpos monoclonales
y/o policlonales pueden usarse después en una amplia variedad de
aplicaciones de diagnóstico, tal y como quedaría claro para los
expertos en la materia.
Los medios de administración in vivo de
los compuestos de la presente invención variarán dependiendo de la
aplicación pretendida. Tal y como reconocerá un experto en la
materia, la administración de la composición de
PEG-ADI de la presente invención puede llevarse a
cabo, por ejemplo, por vía oral, vía intranasal, vía
intraperitoneal, vía parenteral, vía intravenosa, vía
intralinfática, vía intratumoral, vía intramuscular, vía
intersticial, vía intra-arterial, vía subcutánea,
vía intraocular, vía intrasinovial, vía transepitelial y vía
transdérmica.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención queda demostrada adicionalmente en
los siguientes ejemplos, los cuales tienen propósito de ilustración
y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron cultivos de Mycoplasma
hominis (ATCC 23114) de la colección americana de cultivos tipo,
Bethesda, MD. Se extrajo ADN y se aisló el gen que codificaba la
arginina deiminasa por la reacción en cadena de la polimerasa.
El gen de la arginina deiminasa se subclonó en
pGEM-t y en la cepa de E. coli JM101. La
mutagénesis dirigida de sitio se llevó a cabo uando elkit Sitios
Alterados II (Promega, Madison, Wisconsin).
La arginina deiminasa modificada se expresó en
células JM101 tal y como se describe previamente en Takaku y cols.,
supra. La arginina deiminasa modificada incluía ácido
glutámico en la posición 112 y serina en la posición 210. La
secuencia de aminoácidos de la arginina deiminasa modificada
procedente de Mycoplasma hominis se describe en la Figura 2
(SEC ID Nº: 4).
\vskip1.000000\baselineskip
La arginina deiminasa modificada (SEC ID Nº: 4)
se aisló y purificó tal y como se describe previamente en Takaku y
cols., supra. Sin embargo, se observaron varias mejoras.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como indica la Tabla 2 anteriormente, la
renaturalización de la arginina deiminasa modificada se completó a
temperatura ambiente en aproximadamente 6 a 12 horas usando una
relación de diluciones de cuerpos de inclusión de clorhidrato de
guanidinio en tampón. Por el contrario, Takaku y cols. informó de
que la renaturalización requirió 90 horas a 15ºC usando una
relación de diluciones 1:200. Además, la producción de arginina
deiminasa modificada fue rutinariamente de aproximadamente 500 mg
por litro de fermentación mientras que Takaku y cols. informó de
unas producciones de aproximadamente 70 mg por litro de
fermentación.
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La arginina deiminasa modificada (SEC ID Nº: 4)
se formuló usando SS-PEG tal y como se describe
previamente. El procedimiento de pegilación se dejó transcurrir sin
comprobación durante aproximadamente 4 horas sin que la arginina
deiminasa modificada se inactivara. Además, no fue necesario parar
el procedimiento de pegilación a través de la adición de glicina.
Con referencia a la Tabla 3, se mantuvo aproximadamente un
70-80% de actividad enzimática de la arginina
deiminasa modificada.
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\vskip1.000000\baselineskip
Esto indica que la arginina deiminasa modificada
permite un mayor número de formulaciones consistentes. Además, la
arginina deiminasa modificada permite aumentar la escala del
procedimiento de fabricación cuando se compara con la arginina
deiminasa de tipo salvaje.
<110> Phoenix Pharmacologics, Inc.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Forma novedosa mutada de arginina
deiminasa
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<130> PHOE-0063
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/564.559
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-05-2000
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 409
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<212> PRT
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<213> Mycoplasma hominis
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 409
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<212> PRT
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<213> Mycoplasma hominis
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 409
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<212> PRT
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<213> Mycoplasma hominis
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<213> Mycoplasma hominis
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<400> 4
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<110> Phoenix Pharmacologics, Inc.
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<120> Forma novedosa mutada de arginina
deiminasa
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<130> PHOE-0063
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<140> PCT/US01/14116
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<141>
02-05-2001
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<150> 09/564.559
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<151>
04-05-2000
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<160> 4
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 409
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<212> PRT
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<213> Mycoplasma hominis
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<213> Mycoplasma hominis
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<213> Mycoplasma hominis
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<400> 4
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Claims (12)
1. Una arginina deiminasa aislada de
Mycoplasma hominis que comprende la secuencia de aminoácidos
de SEC ID Nº: 1, en la que la arginina deiminasa se ha modificado
sustituyendo al menos una lisina en el resto 112, 374, 405 ó 408 de
la SEC ID Nº: 1.
2. La arginina deiminasa de la reivindicación 1,
en la que la arginina deiminasa se ha modificado sustituyendo al
menos una lisina en el resto 112, 374, 405 ó 408 de la SEC ID Nº: 1
con ácido glutámico, valina, ácido aspártico, alanina, isoleucina o
leucina.
3. La arginina deiminasa de la reivindicación 2,
en la que la arginina deiminasa se ha modificado sustituyendo al
menos una lisina en el resto 112 de la SEC ID Nº: 1 con ácido
glutámico, valina, ácido aspártico, alanina, isoleucina o
leucina.
4. La arginina deiminasa de la reivindicación 3,
en la que la arginina deiminasa se ha modificado sustituyendo al
menos una lisina en el resto 112 de la SEC ID Nº: 1 con ácido
glutámico.
5. La arginina deiminasa de la reivindicación 3
que comprende la SEC ID Nº: 2.
6. La arginina deiminasa de la reivindicación 3,
en la que la arginina deiminasa se ha modificado sustituyendo la
prolina en el resto 210 de la SEC ID Nº: 1.
7. La arginina deiminasa de la reivindicación 6,
en la que la arginina deiminasa se ha modificado sustituyendo la
prolina en el resto 210 de la SEC ID Nº: 1 con serina, treonina,
arginina, asparagina, glutamina o metionina.
8. La arginina deiminasa de la reivindicación 7,
en la que la arginina deiminasa se ha modificado sustituyendo la
prolina en el resto 210 de la SEC ID Nº: 1 con serina.
9. La arginina deiminasa de la reivindicación 6
que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº:
4.
10. La arginina deiminasa de la reivindicación 1
unida covalentemente a polietilenglicol.
11. La arginina deiminasa de la reivindicación
10, en la que la arginina deiminasa está unida covalentemente a
polietilenglicol a través de un grupo de unión.
12. Una composición farmacéutica que comprende
la arginina deiminasa de una cualquiera de las reivindicaciones
precedentes y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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