ES2296796T3 - Procedimiento de purificacion de proteinas epi-hne. - Google Patents
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-
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Abstract
Procedimiento para la purificación de proteínas EPI-HNE, a partir del medio de cultivo de una cepa huésped para la expresión de dichas proteínas, que comprende las etapas de: - (a) hacer pasar una parte derivada de un medio de cultivo sobre un lecho expandido de adsorbente de intercambio catiónico, con el fin de recuperar un eluato, - (b) llevar a cabo opcionalmente la separación cromatográfica de proteínas, de acuerdo con su hidrofobicidad, en el eluato resultante, - (c) hacer pasar el eluato resultante a través de una columna de intercambio catiónico, - (d) opcionalmente filtrar el medio resultante para obtener un filtrado estéril, y - (e) opcionalmente causar la precipitación de EPI-HNE en una forma cristalizada y recuperar los cristales de proteína.
Description
Procedimiento de purificación de proteínas
EPI-HNE.
La presente invención se refiere a un
procedimiento novedoso para la purificación de las proteínas
EPI-HNE.
La Solicitud de Patente Internacional WO
96/20278 de Ley y col. describe un número de proteínas novedosas
manipuladas genéticamente que inhiben la elastasa de los neutrófilos
humanos (hNE). Como se indica en la Solicitud de Patente citada
anteriormente, la elastasa de los neutrófilos humanos (también
conocida como elastasa de los leucocitos humanos) es una de las
proteasas neutrales principales de los gránulos azurófilos de los
leucocitos polimorfonucleares. Esta enzima está implicada en la
eliminación de patógenos, y en reestructuración del tejido
conectivo.
El inhibidor sistémico principal de hNE es el
inhibidor de \alpha-1-proteasa,
conocido en otros tiempos como
\alpha1-antitripsina. En un cierto número de
situaciones patológicas (trastornos hereditarios, enfisema,
fibrosis cística, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto
ARDS, enfermedad pulmonar obstructiva crónica COPD), este inhibidor
bien no está presente en cantidades suficientes en la corriente
sanguínea o bien está inactivado, conduciendo a actividad
elastolítica incontrolada de hNE, que causa destrucción extensiva
del tejido pulmonar.
El documento WO 96/20278 propone así proteínas
novedosas que son inhibidores altamente eficaces estables, no
tóxicos de hNE. Estos inhibidores forman parte de un grupo de
inhibidores derivados de un dominio inhibidor de tipo Kunitz
hallado en inhibidor de tripsina pancreática básico (BTPI) o una
proteína de origen humano, concretamente la cadena ligera del
inhibidor de inter-\alpha-tripsina
humana (ITI). Hay, entre otros,
EPI-HNE-1,
EPI-HNE-2,
EPI-HNE-3 y
EPI-HNE-4. Los inhibidores del
documento WO 96/20278 se producen mediante procedimientos
biotecnológicos y contienen secuencias modificadas de DNA, con
respecto a los dominios de Kunitz biológicos, que se vuelven
altamente potentes. Uno de estos inhibidores,
EPI-HNE-4, es de interés
particular.
El documento WO 96/20278 describe preparación de
sistemas de producción de Pichia pastoris para inhibidores
de hNE EPI-HNE-1,
EPI-HNE-2,
EPI-HNE-3 y
EPI-HNE-4, producción y purificación
de proteínas (véanse en particular ejemplos
10-15).
La cepa GS115 mutante de la levadura Pichia
pastoris que contiene un gen de deshidrogenasa de histidinol no
funcional (his4) se transformó mediante plásmidos de expresión que
comprenden una secuencia que codifica el prepropéptido de factor
alfa de apareamiento de S. cerevisiae condensado directamente
al extremo aminoterminal del inhibidor de hNE deseado, bajo el
control del promotor génico de aox1 de P. pastoris inducible
anterior en la cadena y de las secuencias de terminación de la
transcripción y de poliadenilación de aox1 posteriores en la
cadena. Los plásmidos de expresión se linearizaron mediante
digestión con SacI y el DNA lineal se incorporó mediante
recombinación homóloga dentro del genoma de la cepa GS115 de P.
pastoris mediante transformación esferoplástica, selección para
el crecimiento en ausencia de histidina añadida y rastreo de
fenotipo de utilización de metanol, niveles de secreción y dosis
génica (estimada mediante prueba de bandas de Southern). Se
seleccionaron así las cepas que se estimó que tenían
aproximadamente cuatro copias del plásmido de expresión integradas
según una disposición en tándem dentro del locus génico de aox1.
Los cultivos de las cepas seleccionadas se
cultivaron en modo de tandas con glicerol como la fuente de carbono,
después tras el agotamiento del glicerol se cultivaron en modo de
alimentación limitada en glicerol para incrementar adicionalmente
la masa celular y desreprimir el promotor aox1 y finalmente en modo
de alimentación limitada en metanol. Durante la última fase el
promotor aox1 estuvo plenamente activo y la proteína se segregó
dentro del medio de cultivo.
Ley y col. indicaron después que las proteínas
se purificaron usando técnicas bioquímicas estándar, variando el
procedimiento de purificación específico con las propiedades
específicas de cada proteína. Brevemente, el medio de cultivo se
centrifugó, el sobrenadante se sometió a microfiltración y
subsiguientemente a ultrafiltración, posiblemente a diafiltración,
y después la proteína se recuperó mediante precipitación de sulfato
de amonio y cromatografía de intercambio iónico.
Los procedimientos de producción y purificación
específicos se describen en el documento WO 96/20278 sólo para
EPI-HNE2 y EPI-HNE3, comenzando el
rendimiento de la purificación general a partir de un medio de
cultivo que contiene 720 mg/l y 85 mg/l siendo aproximadamente del
30% y el 15,0%, respectivamente, para una pureza para cada una de
esas proteínas de por encima del 95% según se valora mediante
análisis de PAGE de alta resolución teñido con plata. El
EPI-HNE3 purificado se describe que está
sustancialmente libre de una forma alternativamente procesada de
esta proteína que tiene una extensión amino de 7 a 9 residuos de
aminoácidos y que representa aproximadamente el
15-20% de la actividad inhibidora de hNE.
EPI-HNE1 y
EPI-HNE-4 se enseñan sólo según se
están produciendo y purificando en una forma análoga a
EPI-HNE2 y EPI-HNE3, sin
descripción alguna del procedimiento de purificación específico, el
rendimiento de purificación o la pureza de la proteína
purificada.
Los procedimientos para la purificación de
proteínas EPI-HNE descritas en el documento WO
96/20278 no son apropiados para obtener cantidades de proteínas
purificadas de calidad farmacéutica aceptable o a una escala
industrial. Es más la sucesión de las etapas de centrifugación,
microfiltración y ultrafiltración no se puede llevar a cabo en una
manera económicamente viable en una gran escala y conduce a
rendimientos insuficientes. Además, como se muestra por el
solicitante en el ejemplo 1, la proteína purificada no está separada
de contaminantes farmacéuticamente inaceptables tales como
pigmentos fluorescentes verdes segregados por P.
pastoris.
El problema al que se refiere la invención es
por lo tanto desarrollar un procedimiento para la purificación de
una proteína EPI-hNE a partir del medio de cultivo
de una cepa huésped capaz de expresar esa proteína, que no tenga
los inconvenientes anteriormente mencionados.
El problema anterior se resuelve mediante la
invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.
El procedimiento de la invención permite
purificar grandes cantidades de una proteína EPI-HNE
a partir de un medio de cultivo de una cepa de huésped que expresa
esa proteína, con un rendimiento general de al menos
aproximadamente el 40%, preferiblemente al menos el 60%, hasta un
grado aceptable para usos farmacéuticos.
La invención se refiere a un procedimiento para
la purificación de proteínas EPI-HNE, a partir del
medio de cultivo de una cepa de huésped para la expresión de dichas
proteínas, que comprende las etapas de:
- -
\;
(a) - hacer pasar una parte derivada del medio de cultivo sobre un lecho expandido de adsorbente de intercambio catiónico, con el fin de recuperar un eluato,
- -
\;
(b) - llevar a cabo opcionalmente separación cromatográfica de proteínas, de acuerdo con su hidrofobicidad, en el eluato resultante,
- -
\;
(c) - hacer pasar el eluato resultante a través de una columna de intercambio catiónico,
- -
\;
(d) - opcionalmente filtrar el medio resultante tal como para obtener un filtrado estéril, y
- -
\;
(e) - causar precipitación de EPI-HNE en una forma cristalizada y recuperar los cristales de proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, la invención se refiere a
un procedimiento para la purificación de proteínas
EPI-HNE, a partir del medio de cultivo de una cepa
huésped para la expresión de dichas proteínas, que comprende las
etapas
de:
de:
- -
\;
(a) - hacer pasar una parte derivada de un medio de cultivo sobre un lecho expandido de adsorbente de intercambio catiónico o una micromembrana inerte mecánicamente y químicamente, con el fin de recuperar un eluato,
- -
\;
(b) - llevar a cabo opcionalmente separación cromatográfica de proteínas, de acuerdo con su hidrofobicidad, en el eluato resultante,
- -
\;
(c) - hacer pasar el eluato resultante a través de una columna de intercambio catiónico,
- -
\;
(d) - opcionalmente filtrar el medio resultante tal como para obtener un filtrado estéril, y
- -
\;
(e) - opcionalmente causar precipitación de EPI-HNE en una forma cristalizada y recuperar los cristales de proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de huésped usadas para la expresión de
las proteínas EPI-HNE se pueden seleccionar entre
cepas adecuadas de cualesquiera organismos procariotas y eucariotas
transformados por un vector para la expresión de dichas proteínas.
Preferiblemente, la cepa de huésped se selecciona del grupo
constituido por bacterias tales como Escherichia coli,
Streptomyces o Lactococcus y levadura tal como
Saccharimyces cerevisiae, Schisasaccharamyces pombe,
Yarrovia lipilitica, Hansenula polymorpha,
Kluyverromyces lactis, Pichia metanolica y Pichia
pastoris, que son capaces de expresar niveles altos de una
proteína recombinante. Incluso más preferiblemente, la cepa huésped
es Pichia pastoris.
La expresión "parte derivada del medio de
cultivo" tiene un significado específico en el contexto de la
presente invención, como se indica más adelante.
Cuando la cepa huésped es capaz de segregar la
proteína fuera de la célula, la parte derivada del medio de cultivo
en la etapa (a) es el caldo de cultivo.
Cuando la cepa huésped expresa la proteína
dentro de la célula, por ejemplo en el periplasma, la parte derivada
del medio de cultivo en la etapa (a) es el producto de lisis de la
misma.
\newpage
La etapa (a) es una etapa de adsorción de lecho
expandido llevada a cabo en un adsorbente de intercambio catiónico,
bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, M. Hansson y col.,
1994, Biotechnol. 12, páginas 285-288) o una etapa
de filtración en una micromembrana mecánicamente y químicamente
inerte.
El adsorbente de intercambio catiónico se puede
basar en agarosa entrecruzada o sefarosa entrecruzada, modificada
por la inclusión de un material de núcleo inerte, tal como cuarzo
cristalino, para proporcionar la alta densidad requerida para
expansión de lecho estable, preferiblemente de 1,1 a 1,5 g/ml, o
circonio que tiene una densidad más alta entre aproximadamente 3,5
mg/ml, que permite un caudal más alto, y por unión de los grupos
funcionales catiónicos de superficie, notablemente grupos
catiónicos fuertes tales como sulfonato. Las partículas pueden ser
esféricas, con un tamaño de partícula medio de
100-300 \mum, preferiblemente de
180-220 \mum. Un adsorbente de intercambio
catiónico adecuado es Streamline SP o Streamline SPLX de
Amersham-Pharmacia.
En una realización preferida de la invención, el
paso a través de un lecho expandido se lleva a cabo como sigue:
Se equilibran 10 litros de matriz cromatográfica
(Streamline SP de Amersham-Pharmacia) en acetato de
amonio 50 mM a pH 3,5 y se fluidiza en el mismo tampón a 30 l a 300
cm/h. El sistema permite la carga directa del medio de cultivo
recogido, permitiendo así los aspectos adicionales de la
centrifugación, microfiltración y ultrafiltración de la técnica
previa, y permitiendo incremento en rendimientos. Después de cargar,
la columna se lavó en el acetato de amonio 10 mM a pH 3,5 para
obtener una absorción a 280 nm por debajo de 0,05. Las perlas se
empaquetan a 10 l y EPI-HNE-4 se
recuperó lavando la columna en acetato de amonio 1 M en tampón de pH
4,5.
Una micromembrana inerte mecánicamente y
químicamente aquí quiere decir un medio de microfiltración que tiene
una compatibilidad de pH amplia, preferiblemente al menos entre 3 y
14, permite un flujo alto de filtrado y es capaz de resistir
presión de ráfaga alta, preferiblemente al menos 10 bares, en
particular al menos 50 bares, y retropulsión. Tales membranas
comercialmente disponibles se fabrican generalmente de cerámica.
Ejemplos de tales membranas son Membralox® (J.M. Separations),
Carbosep®/Kerasep^{TM} (Rhodia) y Cartucho de Escala de Proceso
Grande Procell^{TM} (A/G Technology Corporation).
La etapa (b) es una etapa de interacción
hidrófoba o una etapa de cromatografía en fase reversa que permite
separar una mezcla de proteínas de acuerdo con su hidrofobicidad.
Esa etapa puede ser útil cuando se lleva a cabo la fermentación en
una gran escala (por encima de 1 metro cúbico) y posiblemente pueden
estar presentes contaminantes adicionales.
La cromatografía de interacción hidrófoba o la
cromatografía en fase reversa se conoce bien en la técnica y se
describe notablemente en "Protein purification, Second edition:
Principles, High resolution Methods and applications", Ed. J.C.
Janson y L. Rydén, páginas 239-282.
Es preferible una etapa de cromatografía de
interacción hidrófoba dado que se puede llevar a cabo sin usar
disolventes orgánicos.
Una matriz adecuada es un polímero tal como
poliestireno, metacrilato reticulado de
poliestireno-divinilbenceno, metacrilato
modificado, poliacrilamida, agarosa reticulada o sefarosa
reticulada, que lleva un ligando que tiene una hidrofobicidad entre
la hidrofobicidad conferida por un grupo alquilo de C2 y la
hidrofobicidad conferida por un grupo alquilo de C8. Ejemplos de
tales ligandos son etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo,
terciobutilo, pentilo, isopentilo, hexilo, fenilo, isopropanol,
isobutanol, éter C_{4}-C_{6}. Se prefiere
fenilo.
Ejemplos de matrices adecuadas son hexilo de
Toyopearl 650C (metacrilato modificado con ligando de hexilo), éter
de Toyopearl 650M (metacrilato modificado con ligando de butilo) y
fenilo de Toyopearl 650M (metacrilato modificado con ligando de
fenilo), disponibles de Tosohaas; Recurso ETH
(poliestireno-divinilbenceno con ligando de etilo),
Recurso ISO (polestireno-divinilbenceno con ligando
de isopropanol), Recurso Phe
(poliestireno-divinilbenceno con ligando de
fenilo), Flujo Rápido de Fenilsefarosa (sefarosa reticulada con
ligando de fenilo), disponibles de
Amersham-Pharmacia; t-butilo de
Macroprep (metacrilato reticulado con ligando de
t-butilo), y fenilo de Macroprep (metacrilato
reticulado con ligando de fenilo) disponibles de
Bio-Rad.
Lo más preferiblemente la matriz es Flujo Rápido
de Fenilsefarosa de Amersham-Pharmacia (matriz
rígida de perlas de 45-165 \mum de sefarosa
reticulada con ligando de fenilo).
Donde la etapa (b) es una etapa de cromatografía
en fase reversa una matriz adecuada es un polímero tal como
poliestireno, poliestireno-divinilbenceno,
metacrilato reticulado, metacrilato modificado, que no lleva ningún
ligando o lleva un ligando que tiene una hidrofobicidad mayor que la
conferida por un grupo alquilo de C10.
Ejemplo de matrices adecuadas son
CG300-M
(poliestireno-divinilbenceno),
CG161-M
(poliestireno-divinilbenceno) disponibles de
Tosohaas; Recurso 15RP
(poliestireno-divinilbenceno), Recurso RPC
(poliestireno-divinilbenceno), disponibles de
Amersham-Pharmacia; Macroprep High S C18
(metacrilato reticulado con ligando de C18) disponible de
Bio-Rad; Poros 50R1 y Poros 40R2
(poliestireno-divinilbenceno), disponibles de
Perspective Biosystems.
\newpage
En una realización preferida del procedimiento
de acuerdo con la invención, la matriz en la que se lleva a cabo la
cromatografía en fase reversa está constituida por perlas hidrófobas
sintéticas. Preferiblemente, la matriz es una matriz de
poliestirenodivinilbenceno, preferiblemente con perlas de
60-90 \mum, más preferiblemente de 75 \mum, y
con un tamaño de poro mayor de 150 \ring{A}, preferiblemente un
tamaño de poro de 300 \ring{A}.
Lo más preferiblemente, la matriz es una matriz
de CG 300 M, disponible de TosoHaas (matriz de poliestireno, perlas
de 75 \mum con tamaño de poro promedio de 300 \ring{A}).
En el procedimiento de acuerdo con la presente
invención los contaminantes principales después de la cromatografía
o microfiltración de lecho expandido, son los pigmentos de las
células hospedadoras, que incluyen polifenoles y productos de
degradación de los mismos.
La columna de intercambio catiónico de la etapa
(c) se selecciona de tal forma que la proteína de
EPI-HNE no precipita mientras que pasa a través de
la columna. Con el fin de obtener un rendimiento alto, esta etapa
se lleva a cabo preferiblemente a un pH entre 1,8 y 5,0
preferiblemente entre 2,0 y 3,0. La elución se lleva a cabo bajo
condiciones tales como para obtener una concentración alta de
EPI-HNE (durante 10 mg/ml) y fuerza iónica baja
(menos de 25 ms/cm). Una elución tal se pudo obtener mediante
"cromatografía de desplazamiento" usando un policatión tal
como polietilenoimina, polilisina, poliarginina o cualquier otro
polímero, tal como por ejemplo polivinilpirrolidona (PVP), que
contiene una densidad alta de cargas positivas a un pH entre 1,8 y
5. Se puede obtener el mismo resultado cargando un pico diluido
después de la etapa (a) o (b) en un intercambiador catiónico débil
a un pH entre 4,5 y 5,0 y mediante elución a pH 2,0 dado que el
intercambiador catiónico débil no posee ninguna carga aniónica a
tal pH ácido y no retiene más proteínas catiónicas.
Ejemplos de un matriz adecuada para la columna
de intercambio catiónico incluyen matriz de Macroprep High S
(matriz rígida basada en metacrilato reticulado que lleva grupos de
superficie de sulfonato) de Biorad; Flujo Rápido de Sefarosa S.
(agarosa reticulada que lleva grupos sulfonato) y Carboximetil
Sefarosa (sefarosa entrecruzada que lleva grupos carboximetilo) de
Amersham-Pharmacia.
La etapa (c) es una etapa de intercambio
catiónico convencional que permite concentrar la proteína
EPI-HNE para permitir su rendimiento alto y
cristalización de velocidad alta si se usa la etapa (e) y, si se usa
un solvente orgánico durante la etapa (b), eliminar trazas del
mismo que no son aceptables para un producto farmacéutico.
El propósito de la etapa opcional (d) es
eliminar todos los microorganismos tales como por ejemplo bacterias
o levadura. Esta etapa es de particular importancia cuando las
condiciones subsiguientemente usadas son capaces de causar
crecimiento sustancial de microorganismos, por ejemplo cuando se
lleva a cabo la etapa (e) durante un periodo de tiempo por encima
de 3 horas. La filtración bajo condiciones estériles se lleva a cabo
bajo condiciones bien conocidas en la técnica, por ejemplo a 0,22
\mum.
En la etapa (e) la precipitación de
EPI-HNE en una forma cristalizada se lleva a cabo
adecuadamente en un vehículo acuoso a un pH comprendido entre 3,0 y
8,0, preferiblemente 4,0 y 6,0, lo más preferiblemente a un pH de
4,0 a 5,0, estando comprendida la concentración de la proteína
EPI-hNE en el vehículo acuoso entre 1 y 80 mg/ml,
preferiblemente entre 2 y 50 mg/ml.
La etapa (e) se lleva a cabo preferiblemente
usando ciclos de cristalización/sonicación. La última efectivamente
incrementa dramáticamente las cinéticas de precipitación, reduciendo
de este modo sustancialmente el tiempo necesario para llevar a
cabo la etapa (e).
El vehículo acuoso es adecuadamente una solución
salina que tiene una presión iso-osmótica. La
solución salina puede comprender acetato de sodio o de amonio y
cloruro de sodio o de amonio, o citrato de sodio o de amonio.
El término "forma cristalizada" de
EPI-HNE aquí quiere decir una forma insoluble de esa
proteína que tiene una estructura en forma de vara y un tamaño
principalmente por debajo de 10 \mum.
Los cristales de EPI-HNE se
recuperan mediante centrifugación o filtración.
Los cristales recuperados pueden suspenderse
directamente en un tampón farmacéuticamente aceptable o secarse por
congelación en un tampón adecuado tal como bicarbonato de amonio 10
mM o secarse por pulverización dentro de un polvo de aerosol.
Las proteínas de EPI-HNE se
pueden seleccionar para purificarse de acuerdo con el procedimiento
de la presente invención a partir del grupo constituido por
EPI-HNE-1,
EPI-HNE-2,
EPI-HNE-3, y
EPI-HNE-4. Se prefiere
EPI-HNE-4.
La invención se ilustrará mediante los
siguientes elementos.
(Ejemplo
Comparativo)
Los inhibidores de hNE se producen como
proteínas segregadas en los sobrenadantes de cultivo de
fermentaciones de cepa GS115 de Pichia pastoris de densidad
celular alta. Los plásmidos de expresión se construyen ligando
secuencias de DNA sintéticas que codifican el prepropéptido factor
\alpha de apareamiento de Saccharomyces cerevisiae
directamente al extremo 5' del DNA sintético que codifica el
inhibidor de hNE deseado. Este gen de fusión está empotrado entre
un promotor de gen aox1 de P. pastoris inducible
anteriormente en la cadena y secuencias de terminación de
transcripción y poliadenilación de gen aox1 más adelante en la
cadena que se llevan en un plásmido que también codifica un gen
his4 de S. cerevisiae. Se incorpora DNA de plásmido de
expresión linearizado mediante recombinación homóloga dentro del
genoma de la cepa GS15 de P. pastoris mediante
transformación esferoplástica. Los esferoplastos regenerados se
seleccionan para cultivo en ausencia de histidina añadida. Los
aislados individuales se rastrearon para fenotipo de utilización de
metanol (mut +), niveles de secreción, y número de copias del gen.
Se seleccionó la cepa PEY-53 que segrega un alto
nivel de EPI-HNE-4 así. Esta cepa
se estima mediante análisis de Southern de DNA genómico que contiene
cuatro copias de DNA de plásmido de expresión integradas dentro del
locus del
gen aox1.
gen aox1.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa PEY-53 de P.
pastoris se cultiva en fermentaciones de alimentación mixta de
forma similar al procedimiento descrito en el documento WO
96/20278, con la diferencia de que el aire presurizado se usa en vez
de oxígeno purificado. Brevemente, los cultivos se cultivan primero
en modo de tandas con glicerol como la fuente de carbono. Después
del agotamiento de glicerol, los cultivos se cultivan durante
aproximadamente cuatro horas en modo de alimentación de glicerol
limitado incrementando adicionalmente masa celular y desreprimiendo
el promotor de aox1. En la fase de producción final, los cultivos
se hacen crecer en modo de alimentación de metanol limitado.
Durante esta fase, el promotor de aox1 está totalmente activo y los
inhibidores de hNE se segregan dentro del medio acondicionado
(C.M). La concentración final de
EPI-HNE-4 en el C.M. de fermentación
de PEY-53 fue aproximadamente 600 mg/l como se
determina por el análisis de SDS-PAGE.
La especie molecular principal producida por
cultivos de PEY-53 es la proteína
EPI-HNE-4 apropiadamente procesada.
Sin embargo, esta cepa también segrega aproximadamente
5-20% de una proteína procesada alternativamente que
tiene peso molecular ligeramente superior.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron 2,5 l del C.M. de
PEY-53 mediante centrifugación y el sobrenadante se
sometió a microfiltro de
0,2 \mu como se describe anteriormente. Se llevó a cabo una ultrafiltración de 30 KDa en el filtrado a través de microfiltro de 0,2 \mu, y cuando el volumen de retentato se reduce a aproximadamente 250 ml, se lleva a cabo una diafiltración del retentato a un volumen de retentato constante (250 ml) durante 60 minutos a una velocidad de 10 ml/min. El volumen final resultante de filtrado de 30 Kda es aproximadamente 3 1.
0,2 \mu como se describe anteriormente. Se llevó a cabo una ultrafiltración de 30 KDa en el filtrado a través de microfiltro de 0,2 \mu, y cuando el volumen de retentato se reduce a aproximadamente 250 ml, se lleva a cabo una diafiltración del retentato a un volumen de retentato constante (250 ml) durante 60 minutos a una velocidad de 10 ml/min. El volumen final resultante de filtrado de 30 Kda es aproximadamente 3 1.
EPI-HNE-4
apropiadamente procesado se purifica sustancialmente libre de forma
alternativamente procesada y otros componentes de cultivo de
fermentador mediante cromatografía de intercambio iónico en un gel
de poliacrilamida que lleva grupos sulfonato (Macroprep 50S
Biorad). Un volumen de lecho de 50 ml de Macroprep 50S se equilibra
con citrato de sodio 10 mM a pH 3,5, el filtrado de ultrafiltración
de 30 Kda aplicado a la columna (unión completa de
EPI-HNE-4 a la columna se confirma
demostrando la ausencia de actividad de inhibidor hNE en el eluato
de columna), y la columna se lavó con diez volúmenes de columna de
citrato de sodio 10 mM, a pH 3,5. La columna se eluyó después con
un gradiente de acetato de amonio 10 mM a pH 3,5 a acetato de amonio
1M a pH 3,5 en volúmenes de 30 columnas.
EPI-HNE-4 se eluye al final del
gradiente como un pico simétrico individual. El eluato se secó por
congelación.
Se obtuvieron así 300 mg de
EPI-HNE4 purificado activo de 2,5 l de C.M. que
corresponden a un rendimiento de aproximadamente el 20%.
El análisis de SDS-PAGE mostró
una pureza del producto por encima del 95%. El contaminante
principal fue un pigmento fluorescente verde.
Se recogieron 100 l de C.M. de
PEY-53 obtenidos como se describe en el ejemplo 1 y
se hicieron pasar a través de un lecho expandido como sigue: 10 l
de matriz cromatográfica (Streamline SP de
Amersham-Pharmacia) se equilibraron en acetato de
amonio 50 mM a pH 3,5 y se fluidizaron en el mismo tampón a 30 l a
300 cm/h. Después de cargar, la columna se lavó en el acetato de
amonio 10 mM a pH 3,5 obteniéndose una absorción a 280 nm por debajo
de 0,05. Las perlas se empaquetaron a 10 l y
EPI-HNE-4 se recuperó lavando la
columna en tampón de pH 4,5 de acetato de amonio 1 M.
Así se obtuvo una solución de 10 l que contiene
aproximadamente 60 g de proteínas y pigmentos (como se determina
mediante ensayo espectrométrico a 280 nm y mediante ensayo de
proteínas de Coomasie). HPLC-FR (columna de sílice
Licrosphere 100RP de Pharmacia/gradiente de agua + TFA al 1% y
acetonitrilo + TFA al 1%) mostró que la cantidad de
EPI-HNE-4 fue sólo aproximadamente
30 g y la forma alternativamente procesada no se separó de la forma
principal. La contaminación mediante contaminantes verdes es
detectable.
La solución se filtró de forma estéril en un
filtro de 22 \mum (Millipack 200 de Millipore) antes de
purificación adicional.
La cromatografía de interacción hidrófoba se
llevó a cabo haciendo pasar la solución de 10 l anterior en un
sistema de BioProcess (Pharmacia), usando una matriz de Flujo Rápido
de fenil-sefarosa de Pharmacia en una columna BPTG
de 15 l de Pharmacia. Los tampones usados fueron A: 50 mM de acetato
de sodio a pH 4,5 + NaCl 1M, y B: 50 mM de acetato de sodio a pH
4,5. La elución se llevó a cabo en una etapa a B al 100% con un
caudal de 300 cm/h.
El eluato contenía aproximadamente 15 g de
EPI-HNE4 purificado (como se determina mediante
ensayo espectrométrico a 280 nm, ensayo de proteína de Coomassie y
ensayo de actividad biológica).
HPLC-FR mostró que la forma
procesada alternativamente no se separó. No fue detectable ningún
pigmento verde.
Se llevó a cabo después la cromatografía de
intercambio catiónico usando un sistema cromatográfico de Bioprocess
de Pharmacia. La matriz usada fue matriz Macroprep High S de Biorad
(matriz rígida basada en metacrilato reticulado que lleva grupos de
superficie sulfonato), en una columna BPG200 de 15 l de Pharmacia.
Los tampones usados fueron A: 10 mM de acetato de amonio a pH 3,5;
B: 50 mM de acetato de sodio a pH 6,2 y C: 10 mM de bicarbonato de
amonio a pH 7,8. Se usó una primera elución en tampón B para separar
la forma procesada alternativamente. Se llevó a cabo después
elución mediante etapa a C al 100% con un caudal de 300 cm/h.
El eluato contenía aproximadamente 12 g de
EPI-HNE4 purificado (como se determina mediante
ensayo espectrométrico a 280 nm, ensayo de proteína de Coomassie y
ensayo de actividad biológica), que corresponde a un rendimiento
general del procedimiento de purificación de aproximadamente el
40%.
HPLC-FR mostró menos del 1,5% de
la forma procesada alternativamente. No fue detectable ningún
pigmento verde.
Se recogieron 100 l del C.M. de
PEY-53 obtenidos como se describe en el ejemplo 1 y
se hicieron pasar a través de un lecho expandido como sigue: 10 l
de matriz cromatográfica (Streamline SP de
Amersham-Pharmacia) se equilibraron en acetato de
amonio 50 mM a pH 3,5 y se fluidizaron en el mismo tampón a 30 l a
300 cm/h. Después de cargar, la columna se lavó en el acetato de
amonio 10 mM a pH 3,5 obteniéndose una absorción a 280 nm por debajo
de 0,05. Las perlas se empaquetaron a 10 l y
EPI-HNE-4 se recuperó lavando la
columna en tampón de pH 4,5 de acetato de amonio 1 M.
Así se obtuvo una solución de 10 l que contiene
aproximadamente 60 g de proteínas y pigmentos (como se determina
mediante ensayo espectrométrico a 280 nm y mediante ensayo de
proteínas de Coomassie). HPLC-FR (columna de sílice
Licrosphere 100RP de Pharmacia/gradiente de agua + TFA al 1% y
acetonitrilo + TFA al 1%) mostró que la cantidad de
EPI-HNE-4 fue sólo aproximadamente
30 g y la forma alternativamente procesada no se separó de la forma
correcta. La contaminación mediante contaminantes verdes es
detectable.
La solución se filtró de forma estéril en un
filtro de 22 \mum (Millipack 200 de Millipore) antes de
purificación adicional.
La cromatografía en fase inversa se llevó a cabo
haciendo pasar la solución de 10 l anterior de un sistema de
BioProcess (Pharmacia), usando una matriz de CG-300
M de Tosohaas en una columna de BTSS de 50 l de Pharmacia. Los
tampones usados fueron A: agua + TFA al 0,1%, y B: acetonitrilo +
TFA al 0,1%, y B: acetonitrilo + TFA al 0,1%. El gradiente de
columna fue 25-45% B en volumen de columna 40 y el
caudal fue de 450 cm/h.
El eluato contenía aproximadamente 30 g de
EPI-HNE-4 (como se determina
mediante ensayo espectrométrico a 280 nm, ensayo de proteínas de
Coomassie y ensayo de actividad biológica).
HPLC-FR mostró menos del 2% de
la forma procesada alternativamente. No fue detectable ningún
pigmento verde.
Se llevó a cabo después cromatografía de
intercambio catiónico usando un sistema cromatográfico de Bioprocess
de Pharmacia. La matriz usada fue matriz Macroprep High S de Biorad
(matriz rígida basada en metacrilato reticulado que lleva grupos de
superficie sulfonato), en una columna BPG100 de 5 l de Pharmacia.
Los tampones usados fueron A: acetato de amonio 10 mM a pH 3,5, y
B: bicarbonato de amonio 10 mM a pH 7,8. Se llevó a cabo elución
mediante etapa a B al 100% y el caudal fue de 300 cm/h.
El eluato contenía aproximadamente 25 g de
EPI-HNE4 purificado (como se determina mediante
ensayo espectrométrico a 280 nm, ensayo de proteína de Coomassie y
ensayo de actividad biológica), que corresponden a un rendimiento
general del procedimiento de purificación de aproximadamente el
40%.
HPLC-FR mostró menos del 2% de
la forma alternativamente procesada. No fue detectable pigmento
verde.
Sólo estuvieron presentes trazas de
acetonitrilo.
Estas trazas de acetonitrilo se eliminaron
completamente bien mediante secado por congelación o bien mediante
diafiltración.
Se recogieron 100 l de la C.M. de
PEY-53 obtenida como se describe en el ejemplo 1 y
se hicieron pasar a través de un lecho expandido como sigue: 10 l
de matriz cromatográfica (Streamline SP de
Amersham-Pharmacia) se equilibraron en acetato de
amonio 50 mM a pH 3,5 y se fluidizaron en el mismo tampón a 30 l a
300 cm/h. Después de cargar, la columna se lavó en el acetato de
amonio 10 mM a pH 3,5 obteniéndose una absorción a 280 nm por debajo
de 0,05. Las perlas se empaquetaron a 10 l y
EPI-HNE-4 se recuperó lavando la
columna en tampón de pH 4,5 de acetato de amonio 1 M.
Así se obtuvo una solución de 10 l que contiene
aproximadamente 60 g de proteínas y pigmentos (como se determina
mediante ensayo espectrométrico a 280 nm y mediante ensayo de
proteínas de Coomassie). HPLC-FR (columna de sílice
Licrosphere 100RP de Pharmacia/gradiente de agua + TFA al 1% y
acetonitrilo + TFA al 1%) mostró que la cantidad de
EPI-HNE-4 fue sólo aproximadamente
30 g y la forma alternativamente procesada no se separó de la forma
correcta. La contaminación mediante contaminantes verdes es
detectable.
La solución se filtró de forma estéril en un
filtro de 22 \mum (Millipack 200 de Millipore) antes de
purificación adicional.
La cromatografía en fase inversa se llevó a cabo
haciendo pasar la solución de 10 ml anterior en un sistema de
Bioprocess (Pharmacia), usando una matriz CG-300 M
de Tosohaas en una columna BTSS de 50 l de Pharmacia. Los tampones
usados fueron A: agua + TFA al 0,1%, y B: acetonitrilo + TFA al
0,1%. La columna se lavó en B al 25% lavándose los pigmentos verdes
y el compuesto no identificado así en B al 60% eluyendo la proteína
EPI-hNE-4. El caudal fue de 450
cm/h.
El eluato contenía aproximadamente 25 g de
EPI-HNE-4 purificado (como se
determina mediante ensayo espectrométrico a 280 nm, ensayo de
proteínas de Coomasie y ensayo de actividad biológica).
HPLC-FR mostró que la forma
procesada alternativamente se conservó. No fue detectable ningún
pigmento verde.
Se llevó a cabo después la cromatografía de
intercambio catiónico usando un sistema cromatográfico de Bioprocess
de Pharmacia. La matriz usada fue matriz Macroprep High S de
BiorRad (matriz rígida basada en metacrilato reticulado que lleva
grupos de superficie sulfonato), en una columna XK50 de 0,5 l de
Pharmacia. Los tampones usados fueron A: 10 mM de acetato de sodio
a pH 2,0, y B: acetato de sodio 10 mM a pH 0,2 + 1% de imina de
polietileno. Se llevó a cabo la elución por etapas a B al 100% y el
caudal fue de 300 cm/h.
El eluato contenía aproximadamente 50 g de
EPI-HNE-4 purificado (como se
determina mediante ensayo espectrométrico a 280 nm, ensayo de
proteínas de Coomassie y ensayo de actividad biológica).
El eluato contenía aproximadamente 50 mg/ml de
EPI-hNE-4 a fuerza iónica baja (15
ms/cm).
El pH de este eluato se incrementó a pH 4,5 con
hidróxido de sodio 1 M y se dejó cristalizar durante toda una
noche.
Los cristales se recuperaron mediante
centrifugación (30 min, 10.000 g) y se resuspendieron en tampón de
bicarbonato de amonio 10 mM antes de secado por congelación.
Se recuperaron así 20 g de
EPI-hNE-4, que corresponden a un
rendimiento general del procedimiento de purificación de
aproximadamente el 66%.
HPLC-FR mostró menos del 5% de
la forma procesada alternativamente. Ningún pigmento verde ni ningún
material que absorba a la longitud de onda de 200 nm fue
detectable.
Este ejemplo destacará la ventaja de usar etapa
(e). Dado que la purificación mediante etapa de cristalización (e)
es muy eficiente en eliminar los pigmentos verdes, la etapa (b)
parece no ser necesaria cuando se usa la etapa (e).
Las condiciones experimentales son las mismas
que en el ejemplo 4, excepto por la etapa (b) que no se usa. En la
etapa (e), se introdujeron varios ciclos de
sonicación/cristalización.
Las cantidades de EPI-HNE4
obtenidas después de la etapa (a), la etapa (c) y la etapa (e)
durante 4 actuaciones de fermentación que usan diferentes volúmenes
de caldo de fermentación se exponen en la tabla 1 a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Procedimiento para la purificación de
proteínas EPI-HNE, a partir del medio de cultivo de
una cepa huésped para la expresión de dichas proteínas, que
comprende las etapas de:
- -
\;
(a) - hacer pasar una parte derivada de un medio de cultivo sobre un lecho expandido de adsorbente de intercambio catiónico, con el fin de recuperar un eluato,
- -
\;
(b) - llevar a cabo opcionalmente la separación cromatográfica de proteínas, de acuerdo con su hidrofobicidad, en el eluato resultante,
- -
\;
(c) - hacer pasar el eluato resultante a través de una columna de intercambio catiónico,
- -
\;
(d) - opcionalmente filtrar el medio resultante para obtener un filtrado estéril, y
- -
\;
(e) - opcionalmente causar la precipitación de EPI-HNE en una forma cristalizada y recuperar los cristales de proteína.
2. Procedimiento para la purificación de
proteínas EPI-HNE, a partir del medio de cultivo de
una cepa huésped para la expresión de dichas proteínas, que
comprende las etapas de:
- -
\;
(a) - hacer pasar una parte derivada de un medio de cultivo sobre un lecho expandido de adsorbente de intercambio catiónico o una micromembrana inerte mecánicamente y químicamente, con el fin de recuperar un eluato,
- -
\;
(b) - llevar a cabo opcionalmente separación cromatográfica de proteínas, de acuerdo con su hidrofobicidad, en el eluato resultante,
- -
\;
(c) - hacer pasar el eluato resultante a través de una columna de intercambio catiónico,
- -
\;
(d) - opcionalmente filtrar el medio resultante para obtener un filtrado estéril, y
- -
\;
(e) - opcionalmente causar precipitación de EPI-HNE en una forma cristalizada y recuperar los cristales de proteína.
3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2, en el que la etapa (c) se lleva a cabo
a un pH entre 1,8 y 5,0, preferiblemente entre 2,0 y 3,0.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la elución en la etapa (c) se lleva a
cabo cargando un pico diluido después de la etapa (a) o (b) en un
intercambiador catiónico débil a un pH entre 4,5 y 5,0 y por elución
a un pH 2,0.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la elución se obtiene mediante
cromatografía de desplazamiento.
6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa (e) se lleva a
cabo la precipitación de EPI-HNE en una forma
cristalizada en un vehículo acuoso a un pH entre 3,0 y 8,0,
preferiblemente entre 4,0 y 6,0.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la concentración de
EPI-HNE en el vehículo acuoso es de 1 a 80 mg/ml,
preferiblemente de 2 a 50 mg/ml.
8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que la etapa (e) se lleva a cabo
usando ciclos de cristalización/sonicación.
9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (b) es una
etapa de cromatografía de interacción hidrófoba donde la matriz es
un polímero que lleva un ligando que tiene una hidrofobicidad entre
la hidrofobicidad conferida por un grupo alquilo de C_{2} y la
hidrofobicidad conferida por un grupo alquilo de C_{8}.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9 en el que la matriz es un polímero que lleva un
ligando seleccionado del grupo constituido por etilo, propilo,
isopropilo, butilo, isobutilo, terciobutilo, pentilo, isopentilo,
hexilo, fenilo, isopropanol, isobutanol, éter
C_{4}-C_{6}, preferiblemente fenilo.
11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (b) es una
etapa de cromatografía en fase inversa llevada a cabo en una matriz
compuesta de perlas hidrófobas sintéticas.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la matriz es una matriz de
poliestireno-divinilbenceno, preferiblemente con
perlas de 60-90 \mum, más preferiblemente 75
\mum, y con un tamaño de poro mayor de 150 \ring{A},
preferiblemente un tamaño de poro de 300 \ring{A}.
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