ES2296872T3 - Peptidos derivados de tnf para uso en el tratamiento de edema. - Google Patents
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Abstract
Uso de un péptido derivado de TNF-¿ que comprende una cadena de 7-17 aminoácidos contiguos caracterizado por - una secuencia de AA que comprende el hexámero TX1EX2X3E en el que X1, X2 y X3 puede ser cualquier aminoácido natural o no natural y - que no tiene no actividad de unión al receptor de TNF para la preparación de un medicamento para tratar edema.
Description
Péptidos derivados de TNF para uso en el
tratamiento de edema.
La presente invención se basa en el hallazgo de
los péptidos derivados de un dominio específico de factor alfa de
necrosis tumoral (TNF-\alpha) se pueden usar de
manera eficaz para tratar edema. Más específicamente, la presente
invención se refiere al uso de péptidos derivados de la región de
TNF-\alpha humano de Ser^{100} a Glu^{116}
para tratar edema pulmonar. Por ejemplo, el péptido circularizado
que tiene la secuencia de aminoácidos CGQRETPEGAEAKPWYC se muestra
que es muy eficaz en la inducción de resorción de edema.
El transplante de pulmón se muestra que es
exitoso en el tratamiento de pacientes con enfermedad pulmonar en
la fase final. Sin embargo, el edema pulmonar o edema (ambos
términos se pueden usar de manera indistinta) después de la
repercusión del transplante es un problema clínico principal para el
que no existe un fármaco eficaz en este momento. Además, la
evidencia reciente indica que el endotelio juega un papel esencial
en la regulación de la interacción dinámica entre la vasodilatación
y vasoconstricción pulmonar y es el objetivo principal durante la
isquemia/reperfusión y lesión pulmonar relacionada con síndrome de
insuficiencia respiratoria (ARDS). De este modo, dado que el edema
pulmonar a menudo da como resultado el rechace de transplante de
pulmón y que existe una carencia persistente de pulmones
disponibles para el transplante, existe una necesidad urgente de
evitar o tratar de manera eficaz el edema pulmonar.
Durante la isquemia y reperfusión (I/R), tiene
lugar una inducción típica de citoquinas inflamatorias como factor
alfa de necrosis tumoral (TNF). TNF es una citoquina pleyotrópica,
producida principalmente por macrófagos activos, que se sintetiza
como una molécula transformada que se puede liberar por las
metaloproteinadas de la superficie celular en la circulación
(Gearing et al., 1994). TNF se ha mostrado que se une a al
menos dos tipos de receptores unidos a membrane, el receptor 1 de
TNF (55 kD) y el receptor 2 de TNF (75 kD), que se expresan en la
mayoría de las células somáticas, con la excepción de los
eritrocitos y linfocitos T no estimulados. TNF se puede considerar
como una espada de dos filos: de hecho, cuando se produce en exceso,
TNF se ha mostrado que está implicado en la patología de diversas
enfermedades infecciosas, tales como sepsis inducida por LPS
(Beutler et al., 1985), malaria cerebral (Grau et al.,
1987), así como la mortalidad asociada a tratamiento en African
trypanosomiasis (Lucas et al., 1993). Por el contrario, TNF
se mostró que es uno de los agentes más protectores eficaces contra
el ligamiento cecal y peritonitis séptica inducida por punción en
ratones y ratas (Echtenacher et al., 1990, Alexander et
al., 1991; Lucas et al., 1997) y está implicado en la
defensa de huésped durante la neumonía por neumococos en ratones
(van der Poll et al., 1997). Además, se ha mostrado que los
ratones deficientes en el receptor 1 de TNF son significativamente
más eficaces a la infección por Listeria monocytogenes (Rothe
et al., 1993; Pfeffer et al., 1993) y
Mycobacterium tuberculosis (Flynn et al., 1995) así
como contra infecciones fúngicas (Steinshamn et al., 1996) y
por Toxoplasma (Deckert-Schluter et
al., 1998). Por lo tanto, se hace evidente que aparte de sus
efectos prejudicial durante la producción en execso o durante la
secreción crónica prolongada, TNF también es uno de los agentes más
protectores contra infecciones por diversos patógenos. A este
respecto, los péptidos derivados de TNF se ha sugerido que se usan
como tratamiento contra (DE 3841759 to Böhm et al.)
Aparte de ejercer una plétora de efectos
mediados por la activación de sus dos tipos de receptores (receptor
1 de TNF, 55 kD, y receptor 2 de TNF 75 kD), TNF también media las
actividades independientes de receptor. El dominio extremo de TNF
se localiza en la parte superior de la estructura en forma de
campana y es de manera espacial distinto de sus sitios de unión al
receptor, que se localizan en la base de la molécula trimérica
(Lucas et al., 1994). Este dominio tiene afinidad de tipo
lecitina para oligosacáridos específicos tales como trimanosa y
diacetilquiitobiosa. Tanto TNF como el péptido de extremo de TNF son
capaces de mediar una actividadtripanolíptica mediante
interferencia con la integridad liposomal del tripanosoma, un efecto
dependiente de pH que implica probablemente la inserción de TNF en
la membrana liposomal (Magez et al., 1997). Además, los
mutantes del péptido de extremo en el que tres aminoácidos críticos
T(105); E(107); E(110)) se reemplazaron por A,
(Lucas et al., 1994). Un triple de mutante de TNF de ratón
(mTNF), T105A-E107A- E110A (de aquí en delante
denominado mTNF), carece de la afinidad triptanolítica y de tipo
lecitina a oligosacáridos cuando se compara con el TNF de tipo
salvaje. El triple de TNF tiene toxicidad sistémica reducida de
manera significativa cuando se compara con mTNF de tipo salvaje
in vivo, pero retiene su efecto protector de peritonitis en
un modelo murino (Lucas et al., 1997).
Otra actividad independiente del receptor de TNF
es su inserción en membrane y capacidad de formación de canal
(Baldwin et al. 1996). De hecho, otros han mostrado que TNF
forma una canal de Na^{+} -en un modelo de bicapa de lípido
artificial, una actividad que disminuye el pH, probablemente debido
a que requiere el "rompimiento" del trímero, de esta manera se
expone los restos hidrófobos a la membrana (Kagan et al.,
1992).
Las observaciones recientes han indicado la
instalación del anticuerpo neutralizante de TNF en los pulmones de
ratas 5 min antes de la inducción bacteriana inhibe el incremento de
la eliminación líquida intraalveaolar , que se sabe que está
dirigida por una carga en el contenido en sodio dentro de las
células en las células epiteliales alveolares. Además, la
instalación de TNF en ratas normales incrementa la eliminación de
líquido intraalveolar en un 43% en 1 hora (Rezaiguia et al.,
1997). Aunque los hallazgos posteriores indican que TNF se podrían
usar para inducir la eliminación del líquido alveolar, el TNF de
tipo salvaje se puede usar de manera terapéutica debido a su alta
toxicidad sistémica. La presente invención se refiere al uso de un
grupo seleccionado de péptidos derivados de TNF que pueden, para la
sorpresa de los inventores, usarse de manera eficaz para inducir
resorción de edema y que, comparado con el TNF de tipo salvaje,
pérdida de toxicidad sistémica.
Está claro que existe una necesidad urgente para
prevenir o evitar el edema pulmonar. Aunque algunos datos
demuestran que TNF podrían estar implicados en la resorción de
edema, es evidente que esta molécula pleyotrópica y potencialmente
tóxica no se puede usar para tratar el edema.
A este respecto, la presente invención intenta
proporcionar una molécula no tóxica con la misma resorción de edema
que induce tanta capacidad como TNF. Más específicamente, la
presente invención intenta proporcionar péptidos no tóxicos
derivados de de TNF que se pueden usar para evitar o tratar edema.
Además, la presente invención intenta proporcionar una composición
farmacéutica que proporciona un nuevo uso médico de los péptidos
tripanocidales derivados de TNF como ha descrito Lucas et al.
(1994) y sus fragmentos o variantes.
Todos los objetos de la presente invención se
considera que han cumplido con las realizaciones como se establece
más adelante.
Figura 1: (A) Relación corriente - tensión en
células del endotelio microvasculares de pulmón de tipo murino,
preincubación durante 30 min con wt mTNF (100 ng/ml) o tampón NES a
pH 6 y a pH 7,3. Los valores representan las medias de \geq 5
células \pm ETM (*: P \leq 0,05). (B) Cantidades pequeñas de
corriente característica de un MVEC de pulmón tratado previamente
con medio (parte superior) o con 100 ng/ml de TNF (parte inferior) a
pH 6,0.
Figura 2: Relación corriente - tensión en
macrófagos peritoneales residentes aislados de (A) control y (B)
ratones TNFR ½ ^{0/0} Cb/BL/6. La células se trataron previamente
durante 30 min con medio, wt mTNF (100 ng/ml) o péptido Ltip (100
\mug/ml).
Los valores indicando las medias de \geq 5
células \pm ETM (*: P \leq 0.05).
Figura 3: Efecto de amilorida (100 \muM),
añadido durante 30 min durante la etapa de incubación previa, en
incremento inducido por wt mTNF en la conductancia de membrana en
MVEC. Comparación del efecto de mTNF triple (100 ng/ml) y wt de mTNF
(100ng/ml), tras 30 min de incubación previa con MVEC de pulmón. Los
valores indican las medias de \geq 5 células \pm ETM (*: P <
0,05).
Figura 4: (A) Efecto de Ltip (100 \mug/ml)
contra los controles en MVEC de pulmón CBA a pH 6 y pH 7,3. (B)
Comparación del efecto de 30 min de incubación previa de MVEC con
péptido Ltip, péptido mutTip, y péptido scramblTip a pH 6. Efecto de
amilorida (100 mM) añadido durante la incubación previa, sobre el
incremento inducido por el péptido Ltip en la conductancia de
membrana en MVEC. Los valores indican la media de \geq 5 células
\pm ETM (*:P \leq 0,05).
Figura 5: Efecto del péptido de extreme mTNF (1
\mug/pulmón) en el cambio del peso de pulmón (en g) durante un
experimento de perfusión de pulmón que dura 150 min.
Figura 6: Efecto de mTNF de tipo salvaje
(\medbullet,1 \mug/pulmón) o péptido de extremo mTNF
(\ding{115}, 1 mg/pulmón) contra controles [\medcirc,
NaCl] sobre el cambio de peso de pulmón (en % contra la línea base
de pulmón a 30 min) durante los experimentos de perfusión de pulmón
aislado después de 150 min. Cada símbolo [\medcirc, \medbullet o
\ding{115}] representa un pulmón.
La presente invención se refiere al uso de un
péptido que comprende una cadena de 7 a 17, preferiblemente una
cadena de 11 a 16, más preferiblemente una cadena de 13 a 15 y lo
más preferiblemente una cadena de 14 aminoácidos contiguos
derivados de la región de TNF-\alpha humano de
Ser^{100} a Glu^{116} o desde la región de
TNF-\alpha de ratón de Ser^{99} a Glu^{115}
para la fabricación de un medicamento para tratar edema. Más
específicamente la presente invención se refiere al uso de un
péptido como se ha descrito anteriormente en el que dicha cadena de
14 aminoácidos contiguos se eligen entre el grupo constituido por
las secuencias de aminoácidos contiguos QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID NO
1) y PKDTPEGAELKPWY (SEQ ID NO 2) como se ha descrito por Lucas
et al. (1994). Las últimas secuencias se proporcionan en el
código de una letra bien conocido para los aminoácidos (además el
código de tres letras se unas algunas veces).
El término "péptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos (aa) derivado del dominio TNF tripanolítico
que tiene afinidad de tipo lectina como se describe por Lucas et
al. (1994). Además , el ultimo término se refiere a un polímero
de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 17 aminoácidos contiguos
derivados de la región de TNF-\alpha humano
Ser^{100} a Glu^{116} o de la región de
TNF-\alpha de ratón Se^{r99} a Glu^{115}. Las
últimas regiones de TNF también se refieren a las regiones mostradas
en la Fig. 5, p. 172 de Pennica y Goeddel en Webb y Goeddel, eds.
(1987). Sin embargo, debe quedar claro que la región de
TNF-\alpha humano Ser^{100} a Glu^{116} es
idéntica a TNF-\alpha humano de Ser^{99} a
Glu^{116} en la Fig. 5, p. 172 de Pennica y Goeddel en Webb y
Goeddel, eds. (1987) y la región de TNF-\alpha de
ratón de Ser^{99} a Glu^{115} es idéntica a TNF- \alpha de
ratón de Ser^{99} a Glu^{115} en la Fig. 5, p. 172 de Pennica
and Goeddel en Webb y Goeddel, eds. (1987). El término
"péptido" más específicamente se refiere a un péptido que
comprende el hexámero TPEGAE (SEQ ID NO 3) de las últimas regiones
de TNF o cualquier péptido que comprende los aminoácidos
correspondientes T, E y E o el hexámero posterior que se muestra que
son los tres aminoácidos críticos según Lucas et al. (1994).
Debe resultar evidente que la presente invención se refiere a
cualquier péptido derivado las las últimas regiones de TNF y no
excluye las modificaciones después de la traducción de los péptidos
tales como glicosilación, acetilación, fosforilación, modificaciones
con ácidos grasos y similares, que se incluyen en la presente
invención son, por ejemplo, péptidos que contienen uno o más
análogos de un aa (incluidos aa naturales), péptidos con enlaces
sustituidos, versiones mutadas o variaciones de secuencia natural
de los péptidos, péptidos que contienen enlaces disulfuro entre
restos de cisteína, así como otros modificaciones conocidas en la
técnica. Los péptidos de la presente invención se pueden preparar
mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica tal como la
síntesis química, como se ha descrito por Houbenweyl (1974) y
Atherton & Shepard (1989), o mediante técnicas de ADN
recombinante como se describe por Maniatis et al. (1982) y,
más específicamente, por Lucas et al. (1994).
El término edema (o edema) se refiere a
cualquier acumulación en exceso anormal de (suero) fluido en el
tejido conectivo o en la cavidad serosa, en particular, el último
término se refiere a edema pulmonar (véase también la sección de los
Ejemplos).
Además, la presente invención se refiere al uso
de un péptido como se ha descrito anteriormente en el que dicho
péptido es circularizado. Más específicamente, la presente invención
se refiere al uso de un péptido como se ha descrito anteriormente,
en el que dicho péptido se hace circularizado reemplazando los
aminoácidos NH_{2}- y COOH terminal por cisteína de manera que se
forma un puente disulfuro entra las últimas cisternas. A este
respecto, la presente invención se refiere al uso de un péptido como
se ha descrito anteriormente en el que dichos péptidos
circularizados se eligen entre el grupo constituido por los péptidos
circularizados CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO 4) y CGPKDTPEGAELKPWYC
(SEQ ID NO 5) como se ha descrito por Lucas et al.
(1994).
La presente invención finalmente se refiere a
una composición farmacéutica para tratar edema que comprende un
péptido como se ha descrito anteriormente. El término "una
composición farmacéutica para tratar edema" se refiere a
cualquier composición que comprende un péptido como se ha descrito
anteriormente que previene, mejora o cura el edema, en particular
edema pulmonar. Más específicamente, el término "una composición
farmacéutica para tratar edema" o "un fármaco o medicamento
para tratar edema" (ambos términos se pueden usar de manera
indistinta) se refieren a una composición que comprende un péptido
como se ha descrito anteriormente y un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable (ambos términos se pueden usar de manera
indistinta) para tratar edema. Los vehículos o excipientes
adecuados conocidos por los expertos en la técnica son solución
salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank,
aceites estables, oleato de etilo, dextrosa al 5% en solución
salina, sustancias que potencian la isotonicidad y estabilidad
química, tampones y conservantes. Otros vehículos adecuados
incluyen cualquier vehículo que no induce el mismo la producción de
anticuerpos perjudiciales para el individuo receptor de la
composición tales como proteínas, polisacáridos, ácidos
polilácticos, aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos.
El "medicamento" se puede administrar mediante cualquier
procedimiento adecuado dentro del conocimiento del experto. La vía
preferida de administración es por vía parenteral. En la
administración parenteral, el medicamento de esta invención se
formulará en una dosificación unitaria inyectable a partir de tal
solución, suspensión o emulsión, en asociación con los excipientes
farmacéuticamente aceptables como se ha descrito anteriormente. Sin
embargo, la dosificación y modo de administración dependerá del
individuo. En general, el medicamento se administra de manera que el
péptido de la presente invención se proporciona a una dosis entre 1
\mug/kg y 10 mg/kg, más preferiblemente entre10 \mug/kg y 5
mg/kg, más preferiblemente 0,1 y 2 mg/kg. Preferiblemente, se
proporciona como una dosis de bolo. La infusión continua también se
puede usar. Si es así, el medicamento se puede infundir a una dosis
entre 5 y 20 \mug/kg/minuto, más preferiblemente entre 7 y 15
\mug/kg/minuto.
La presente invención se ilustrará ahora
mediante referencia a los siguientes ejemplos de realizaciones
particularmente ventajosas.
Animales, células y reactivos. Ratones
macho CBA/J o C57BL/6, así como ratones TNF machos, ½ ^{0/0}
C57BL/6 deficientes en los receptores de TNF (Bruce et al.,
1996 ) proporcionados por H. Bluethmann, F.
Hoffmann-La Roche, Basel, Suiza, se usaron a la
edad de 8-10 semanas. Su cuidado se llevó de acuerdo
con la dierctrices institucionales. Se aislaron células del
endotelio microvasculares de ratones BA/J y se caracterizaron como
se ha descrito (Jackson et al., 1990) usando perlas
magnéticas (Dynabeads M-450, Dynal, Oslo, Noruega),
unidas de manera covalente a anticuerpo rata-anti
ratón purificado PECAM-1 (donado por B. Imhof,
Universidad de Ginebra). Se volvieron a suspender células del
endotelio de pulmón microvasculares en DMEM que contiene 2 mM
L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 10 mg/ml
estreptomicina, 20% de FCS, 40 U/ml heparina y 100 mg/ml de
suplemento de de crecimiento de células endoteliales (Brunschwig
Chemie, Basilea, Suiza). Para los experimentos de patch clamp, se
sembraron células en placas Petri de 35 x 10 mm de fijación fácil
(Beckton Dickinson, Plymouth, Reino Unido) cubiertas previamente
con gelatina al 0,2% (Sigma, Buchs, Suiza). Macrófagos peritoneales
residentes, aislados en RPMI enfriados en hielo que contiene
antibióticos y 10 U/ml de Heparina, se dejo que se adhirieran a las
placas Petri de 35 x 10 mm de fijación fácil durante 4 h, después de
lo cual las células no adherentes se retiraron. Las células se
desarrollaron en RPMI 1640 que contiene 2 mM
L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 10 mg/ml
estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (todo de Gibco). Para
patch clamp, se usaron los macrófagos después de 24 horas de
aislamiento.
TNF y péptidos. TNF murino recombinante
derivado de E. coli (mencionado además como TNF en el texto)
y un triple mutante de TNF (mutTNF) derivado de E. coli
(T104A-E106A-E109A) se sintetizaron
como se decline en otra parte (Lucas et al., 1997). Los
péptidos derivados de TNF se sintetizaron con el uso de protección
de grupo Fmoc-a-amino (Fields et
al. 1990), y se purificó con una columna de cromatografía
líquida de alta resolución de fase inversa C18.
Se sintetizaron los siguientes péptidos
derivados de TNF:
| Péptido de largo extremo 99-115 (LTip) GG-CGPKDTPEGAELKPWYC | (SEQ ID NO 6) |
| Péptido de extreme mutado 99-115 (mutTip) GG-CGPKDAPAGAALKPWYC | (SEQ ID NO 7) |
| Péptido de extreme revuelto (scamblTip) GG-CGTKPWELGPDEKPAYC | (SEQ ID NO 8) |
| Péptido de extreme corto (STip) CTPEGAEC | (SEQ ID NO 9) |
\vskip1.000000\baselineskip
Para retener teóricamente la conformación de TNF
original tanto como sea posible, los péptidos Ltip, MutTip y
ScamblTip se hicieron circularizados. Ser^{99} de la secuencia de
TNF se reemplazó por Cys, y Cys^{100} por Gly de manera que se
formará el puente disulfuro entre Cys^{99} y Cys^{115} en los
péptidos. El péptido STip puede no hacerse circularizado. Los
péptidos eran NH_{2}- biotinilados.
Electrofisiología. Se trataron las
células previamente durante 30 minutos con TNF, péptidos mutTNF y
tip a 37ºC en un tampón que consistía en 145 mM NaCl, 3 mM KCI, 2
mM CaCl_{2}, 2 mM MgCl_{2}, 10 mM D-glucosa, y
10 mM Hepes, y ajustado de pH con NaOH hasta el valor requerido.
Después las células se lavaron con el mismo tampon ajustado a pH a
7,3, y se realizaron experimentos usando la técnica de registro de
célula entera, sello ajustado. Se registraron las corrientes con un
amplificador Axopatch-200A (Axon Instrument Inc,
Foster City, CA, Estados Unidos), se filtraron a bajo pase a 1 kHz.
Se realizó la digitalización del análisis sin línea usando el
programa WCP (J. Dempster, Strathclyde Electrophysiology Software,
Glasgow, Reino Unido). Las pipetas de Patch eran de de vidrio de
borosilicato y pulidas al fuego para tener una resistencia libre de
3-5 MW con una solución interna que contenía 130 mM
CsCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 20 mM TEA-Cl, 10 mM
D-glucosa, 10 mM Hepes, ajustada de pH hasta 7,3
con CsOH. Las resistencias en serie se mantuvieron a 10 MW. La
compensación de capacitancia y resistencias en serie se aplicaron
para y se fijaron a, 70%. Todos los experimentos se realizaron a
temperatura ambiente. Los resultados se proporcionan como media
\pm ETM, salvo que indique otra cosa. Se realizó análisis de
varianza en los valores de las corrientes y conductancia de
membrana, con el ensayo post-hoc
Dunn-Bonferroni para la significación de las
diferencias observadas entre dos grupos. Se consideró significativo
un valor de P de 0,05.
Fluorescencia de triptófano. Se
realizaron medidas de fluoerscencia con un espectrofluorímetro PTI.
La longitud de onda de excitación era 295 mm y las anchuras de
rendija eran 5 nm y 2,5 nm para excitación y emisión
respectivamente. Para cada espectro registrado, la contribución de
dispersión se eliminó mediante la resta de un blanco de tampón.
Todos los tampones raman contenían tampón 150 mM NaCl, y 20 mM de
ácido N-[2-morfolino] etano- sulfónico (MES) al pH
deseado. Las muestras se dejaron en incubación durante 1 hora 30
minutos al pH deseado antes de medir el espectro de emisión. Las
concentraciones de TNF de tipo salvaje y mutante eran 6
\mug/ml.
Preparación de liposomas. Se prepararon
liposomas unilaminares grandes mediante evaporación de fase inversa
como la descrita previamente (Vecsey- Semjen et al., 1996).
Se prepararon los liposomas de o bien fosfatidilglicerol de huevo
al 100% (EPG) o una mezcla de EPC y EPG (1:1 p/p) en un tampón que
contiene 100 mM KCI, 20 mM ácido N-[2-Hidroxietil]
piperazina-N'-[2-etano- sulfónico]
(HELPES). pH 7,4 y 1,5 mg/ml de
6-metoxi-N-(3-
sulfopropi)quinolinio (SPQ).
Mediciones de la salida de cloruro. Todos
los experimentos de fluoerscencia se llevaron a cabo usando un
espectrofluorímetro PTI equipado con un soporte de celda con
termostato (37ºC). El tinte se excitó a 350 nm y se registró la
emisión a 422 nm, las amplitudes de banda tanto de excitación como
de emisión se establecieron a 5 nm. Se diluyeron los liposomas
hasta una concentración final de 50 \mug/ml en una solución que
contenía 100 mM KNO3 y 20 mM MES pH
6,1 ó 20 mM HEPES, pH 7,4. Se añadieron TNF de tipo salvaje y mutante hasta una concentración final de 3 \mug/ml.
6,1 ó 20 mM HEPES, pH 7,4. Se añadieron TNF de tipo salvaje y mutante hasta una concentración final de 3 \mug/ml.
Actividad proinflamatoria de los péptidos de
TNF y TNF tip. La actividad proinflamatoria de TNF y péptidos
derivados se ensayó usando un bioensayo que mide su capacidad para
inducir la regulación hacia arriba de superficie de la molécula de
adhesión intercelular (ICAM)-1 en el epitelio
alveolar de tipo II A549 (Pugin et al., 1996). En resumen,
se sembraron células A549 en confluencia en una placa de
microvaloración, y se incubaron con las diversas concentraciones de
TNF, mutTNF, y péptidos durante 18 horas a 37ºC. La regulación hacia
arriba de superficie de ICAM-1 se detectó mediante
ELISA directo en células que usan primero un anticuerpo
anti-ICAM-1 (R&D systems,
Abdington, Reino Unido), un segundo anticuerpo de burro -anti ratón
conjugado a IgG-peroxidasa - (Jackson), revelado
por o-fenilenediamina (Sigma), y se detuvo mediante
H2SO4. Se leyeron las densidades ópticas (D. O.) a 490 nm, con la
sustracción de las lecturas de D. O. a 620 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.1
Los presentes inventores primero investigaron si
TNF modificaba la corriente de célula enteras en células murinas
primarias. Una incubación previa de 30 min de macrófagos
peritoneales residentes y células de endotelio microcascular con
100 ng/ml de TNF dio como resultado un incremento significativo de
la corriente de salida y, a un grado menor, la de entrada en el
caso de células del endotelio microvascular, medida mediante patch
clamp de células enteras, cuando se compara con las células no
expuestas a TNF(células de endotelio, Fig. 1A; y macrófagos
Fig. 2). Una reducción del tiempo de preincubación (hasta 5 min) o
en la dosis de TNF (hasta 10 ng/ml) proporcionó resultados
similares (datos no mostrados). Este efecto requirió condiciones de
preincubación ácidas, ya que no se producía cuando la preincubación
se realizaba a pH 7,3 (Fig. 1). La conductancia inducida por TNF
era independiente de la tensión y mostró un potencial de inversión
de aproximadamente 0 mV en el caso de células de endotelio. Con el
fin de investigar si el incremento de la corriente de ion inducida
por TNF era dependiente del receptor de TNF, se aislaron macrófagos
peritoneales residentes de ratones deficientes tanto el receptor 1
como el 2 de TNF (TNFR1/2^{0/0}), y se ensayaron en el ensayo de
patch clamp de célula entera. El TNF indujo una corriente
dependiente de la tensión en las células que carecen de receptores
de TNF (Fig. 2B). Este experimento crítico mostró que la
conductancia inducida por TNF en células de mamífero se producía de
una manera independiente del receptor de TNF. Estos resultados
también indican que la corriente inducida por TNF no es específica
del tipo de célula.
Ya que el dominio de tipo lecitina de TNF es
distinto especial y funcionalmente de sus sitios de unión al
receptor, los inventores investigaron a continuación si estaba
implicado en el efecto de activación de canal de ion observado de
TNF en células de mamíferos. Por lo tanto, el efecto de un mutante
de TNF (mutTNF), en el que tres restos críticos para la actividad
de tipo lecitina de TNF se reemplazaron por una alanina, se comparó
con TNF en células de endotelio. Como se muestra en la Fig. 3,
mutTNF carecía completamente del efecto de activación de
conductancia de TNF, incluso a una dosis 100 veces mayor (1
\mug/ml mutTNF contra 10 ng/ml de TNF, datos no
mostrados). Por el contrario, las moléculas de TNF nativo y mutante
mostraron potenciales similares en la inducción de
ICAM-1 en las células de epitelio A549 (Fig. 4).
Esto indicó que a pesar de una actividad mediada por el receptor de
TNF, mutTNF era incapaz de incrementar la permeabilidad del ion. Con
el fin de ensayar la hipótesis de que TNF activaba un canal de
sodio, los presentes inventores realizaron experimentos adicionales
en la presencia de amilorida, un bloqueador del canal de sodio. Cien
\muM de amilorida añadidos durante el tratamiento previo a pH 6,0
revocaba el incremento inducido por TNF en la conductancia (Fig.
3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
Ya que el dominio del extremo de TNF parecía ser
crítico para su activación de la permeabilidad de ion, los
inventores a continuación ensayaron si un péptido que imita esta
región era suficiente para incrementar la conductancia de la
membrana, como se observa con TNF nativa. El tratamiento de células
del endotelio y macrófagos con el péptido de extremo de 17
aminoácidos (aa) de longitud circularizado (péptido Ltip), que imita
el dominio de tipo lectina de TNF, dio como resultado un incremento
en las corrientes exterior e interior a pH ácido en el caso de
células de endotelio microvascular. Por el contrario que TNF, el
efecto persistía a pH neutro, aunque menos pronunciado (Fig. 2A y
4A). De manera similar a TNF, el efecto se bloqueó mediante 100
\muM de amilorida (Fig. 4B). Un péptido circularizado mutante
(T104A-E106A-E109A) de 17 aa
circularizados.
17 (péptido mutTip) y un péptido circularizado
de 17 aa que contenía el mismo aa que el péptido Ltip en una
secuencia al azar (péptido scramblTip) eran inactivos con relación a
la actividad de canal de iones (Fig. 4B). Estos resultados indican
que el dominio del extremo de TNF era mediar su actividad creciente
de la conductancia de membrana, y confirmaba que los restos T104,
E106 y E109 eran esenciales para este efecto. El péptido. Ltip
también era activo en las células deficientes tanto en los
receptores 1 como 2 de TNFR (Fig. 2B). Sin embargo, un hexapéptido
de extreme corto que contiene los 3 aa críticos no inducían una
corriente dependiente de la tensión en células del endotelio
microvascular (datos no mostrados), sugiriendo que este péptido
estaba por debajo de la estructura mínima que lleva el efecto del
canal de ion. De manera importante, ninguno de los péptidos indujo
ICAM - 1 en las células A549, lo que indica que carecía de la
actividad mediada por el receptor de TNF.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.3
Se ha mostrado previamente que TNF interactuaba
con los lípidos de una manera dependiente de pH y que esta
interacción de membrana se correlacionaba con un despliegue parcial
de la proteína (Hlodan et al., 1994) (Baldwin et al.,
(1996). Por tanto los presentes inventores investigaron si la
pérdida de actividad de mutTNF en MVEC de pulmón a pH ácido era
debido a su incapacidad para experimentar despliegue y que
interactúa con membranas. La conformación de mutTNF a diversos
valores de pH siguió mediante la medida de la fluorescencia de
triptófano intrínseca de la molécula. La intensidad de la
fluorescencia cayó tras la acidificación del medio, y la máxima
emisión experimentó un desplazamiento de rojo de 318 nm a pH 6 hasta
339 nm a pH 4,6. Estas observaciones indicaron que los restos de
triptófano ocultos inicialmente se llegaron a exponer al disolvente.
Sin embargo, la proteína no estaba desplegada totalmente ya que el
espectro a pH 4,6 no estaba tan desplazado al rojo como mutTNF en 6
M GuHCl. Estos resultados muestran que mutTNF era incapaz de
experimentar despliegue ácido. El despliegue ácido de mutTNF era de
hecho más rápido y ligeramente más extendido que el TNF de tipo
salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.4
Los presentes inventores a continuación
investigaron si mutTNF era capaz de interactuar con las membranas a
pH ácido siguiendo su capacidad de inducir pérdida de cloruro de los
liposomas que contienen el tinte sensible a cloruro SPQ. Estos
experimentos se realizaron usando liposomas que contienen fosfatidil
glycerol de huevo al 100% (EPG). El TNF nativo indujo salida de
cloruro a pH 6,1, MutTNF incluso se plegó a pH 6; los presentes
inventores sin embargo mostraron previamente que el pH en la
superficie de vesículas de EPG al 100% era mucho menor que la de pH
global, y más específicamente que a un pH de 6 global, el pH de la
superficie era 4,35. Por lo tanto, mutTNF es probable que
experimente un despliegue parcial en la superficie de las vesículas
de EPG. El efecto de mutTNF sobre la fluorescencia de SPQ era
incluso más pronunciado que el de TNF de tipo salvaje, de acuerdo
con el hecho de que el despliegue ácido era más rápido que el del
TNF de tipo salvaje. Como se ha observado previamente para TNF
nativo (Baldwin et al., 1996), mutTNF no interaccionó con las
membranas a pH neutro.
Con el fin de investigar si la salida de cloruro
era debido a la unión de membrana o inserción de membrana de TNF,
los presentes inventores han analizado si los lípidos bromados eran
capaces de inactivar la fluorescencia intrínseca de TNF y mutTNF
tras la interacción de membrana. Los lípidos bromados han sido
útiles en la determinación de la topología de las proteínas de
membrana (Bolen et al., 1990) (Markello et al., 1985)
así como el estudio de interacción de membrana de toxinas que
forman poros (Gonzalez-Manas et al., 1992)
(Van der Goot et al., 1991) (Vecsey-Semjen
et al., 1997). TNF contiene dos restos de triptófano, uno en
la parte superior del dominio de unión del receptor y uno en la
parte superior del llamado dominio de extremo. Si el extremo del
trímero de TNF se insertaba en la bifase lipídica, la fluorescencia
de Trp-113 se debe inactivar tras la inserción en
los liposomas compuestos por dioleoifosfatidilglicerol que tiene
bromos unidos en las posiciones 9 y 10 de las cadenas de acilo. Los
presentes inventores de hecho han observado previamente que los
triptóganos localizados en la frontera entre los grupos de cabeza de
lípido y las cadenas acilo eran susceptibles a la inactivación por
bromo. Sin embargo, los presentes inventores eran incapaces de ver
cualquier inactivación por fluorescencia cuando se añade o bien TNf
o mutTNF a pH ácido a vesículas formadas por lípidos bromados.
Las observaciones descritas anteriormente
muestran que mutTNF experimenta despliegue parcial a pH ácido y es
después capaz de interactuar con las membranas. La pérdida de
inactivación por los lípidos de bromación sugiere, sin embargo que
la liberación de cloruro era debida a la unión de moléculas de TNF
desplegadas parcialmente en lugar de a la inserción de la molécula
en la membrana.
Los presentes inventores a continuación
ensayaron si los péptidos de extremo de TNF eran capaces de inducir
la salida de cloruro de las vesículas que contienen SPQ y si la
inactivación de triptófano se podría observar tras la interacción
con lípidos bromados. Se usaron los liposomas que contienen o bien
100% de lípidos neutros, 100% de lípidos ácidos o una mezcla 1:1 de
ambos. Para ninguna de las composiciones de lípidos y para las
concentraciones de péptido hasta 300 \mug/ml han podido los
presentes inventores observar ningún cambio en la fluorescencia de
SPQ ni ninguna inactivación por lípidos bromados, y esto con los 4
péptidos. Estos experimentos sugirieron que LTip así como los
péptidos modificados eran incapaces de interactuar con las
membranas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron pulmones de ratas hembra Whistar que
pesaban aproximadamente 300 g como se ha descrito por DeCampos
et al. (1993). Los pulmones se inyectaron por vía
intratraqueal con o bien 500 \mul de TNF murino de tipo salvaje
en 9% NaCl estéril (1 \mug/pulmón) o péptido de extremo mTNF
(Ltip, véase anteriormente; 1 mg/pulmón). Posteriormente los
pulmones se perfundieron con sangre aislada de la misma rata.
Treinta minutos después, los pulmones se inyectaron por vía
intratraqueal con 2 ml de solución de 9% de NaCl estéril que conduce
a un incremento de peso de aproximadamente 2 g (Fig. 5). Después la
evolución del peso se siguió de manera continua durante 150 min (Fig
5).
El peso de de los pulmones de control (tratados
previamente con NaCl) no disminuyó con el tiempo, mientras que, por
el contrario, los pulmones que se habían tratado previamente con o
bien wt TNF o péptido de extremo mostraron una disminución
significativa de peso de 25 a 50% después de 150 min (Fig. 5 y 6)
que corresponde a una presencia disminuida de edema hidrostático.
En el caso del péptido de extremo de TNF, la pérdida de peso comenzó
inmediatamente tras la inyección de los 2 ml de solución de NaCl
(Fig. 5).
Estos experimentos demuestran que el péptido de
extremo de mTNF, como la molécula de tipo salvaje, puede conducir a
la resorción de edema. Sin embargo, el péptido de extremo, al
contrario que wt mTNF, no interactúa con los receptores de TNF y no
conduce a un incremento de expresión de moléculas de adhesión en
células del endotelio y del epitelio. Por consiguiente, el péptido
de extremo induce menos toxicidad de pulmón comparado con wt
mTNF.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
Pro Trp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys
Pro Trp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Pro Glu Gly Ala Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu
Ala Lys Pro Trp Tyr}
\sac{Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu
Leu Lys Pro Trp Tyr}
\sac{Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Cys Gly Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly
Ala Glu Leu Lys Pro}
\sac{Trp Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Cys Gly Pro Lys Asp Ala Pro Ala Gly
Ala Ala Leu Lys Pro}
\sac{Trp Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Cys Gly Thr Lys Pro Trp Glu Leu Gly
Pro Asp Glu Lys Pro}
\sac{Ala Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Pro Glu Gly Ala Glu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa cualquier
aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) .. (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa cualquier
aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Xaa Glu Xaa Xaa Glu}
Claims (12)
1. Uso de un péptido derivado de
TNF-\alpha que comprende una cadena de
7-17 aminoácidos contiguos caracterizado
por
- una secuencia de AA que comprende el hexámero
TX_{1}EX_{2}X_{3}E en el que X_{1}, X_{2} y X_{3} puede
ser cualquier aminoácido natural o no natural y
- que no tiene no actividad de unión al receptor
de TNF
para la preparación de un medicamento para
tratar edema.
2. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que dicho hexámero tiene la secuencia
TPEGAE.
3. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 en el que dicho péptido se caracteriza
además por comprender una cadena de 7 a 17 aminoácidos contiguos
derivados de la región de TNF-\alpha humano de
Ser^{100} a Glu^{116} o de la región de
TNF-\alpha de ratón de Ser^{99} a
Glu^{115}.
4. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 3 en el que dicho péptido comprende una cadena de 11
a 16 aminoácidos contiguos.
5. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicho péptido comprende una cadena de 13
a 15 aminoácidos contiguos.
6. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicho péptido comprende una cadena de 14
aminoácidos contiguos.
7. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que dicha cadena de 14 aminoácidos contiguos
se selecciona entre el grupo constituido por las secuencias de
aminoácidos contiguos QRETPEGAEAKPWY y PKDT
PEGAELKPWY.
PEGAELKPWY.
8. Uso de un péptido de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicho péptido es un péptido
sintético.
9. Uso de un péptido de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho péptido es
circularizado.
10. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que dicho péptido es circularizado
reemplazando los aminoácidos NH2- y COOH-terminal
por cisterna, de manera que el puente disulfuro se forma entre las
últimas cisteínas.
11. Uso de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que dichos péptidos circularizados se
eligen entre el grupo constituido por los péptidos circularizados
CGQRETPEGAEAKPWYC y CGPKDTPEGAELKPWYC.
12. Uso de un péptido de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho edema es edema
pulmonar.
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