ES2297516T3 - Uso de alginato polisulfatado en matrices celulares. - Google Patents
Uso de alginato polisulfatado en matrices celulares. Download PDFInfo
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Abstract
Método in vitro / in vivo para el cultivo de células de tejido conjuntivo o células precursoras de las mismas, que comprende la etapa de poner en contacto dichas células con una matriz que comprende alginato polisulfatado.
Description
Uso de alginato polisulfatado en matrices
celulares.
La presente invención se refiere a matrices, más
particularmente, a matrices para reparar defectos
osteocartilaginosos, así como productos farmacéuticos que
comprenden dichas matrices.
Durante los últimos quince años se ha estudiado
ampliamente el uso terapéutico de polisacáridos polisulfatados.
Tras la sulfatación de los grupos hidroxilo, los polisacáridos
presentan una actividad biológica muy interesante.
Se ha observado que las ciclodextrinas
polisulfatadas reducen o bloquean los efectos de sustancias
teratógenas sobre el desarrollo fetal (WO 91/16905), que favorecen
la cicatrización de tejidos (WO 93/09790), que reducen la
multiplicación retrovírica (VIH) (EP 447171) e inhiben la
angiogénesis (WO 89/06536).
Se ha demostrado que la inulina polisulfatada
constituye un inhibidor eficiente del sistema de complemento
(patente US n.° 4.021.545; Immunol., 1965, 8:29;
Pharmacology 1973, 9:74) y presenta propiedades
antilipémicas (Arch. Int. Pharmacodyn., 1954, XCIX:
334).
Se ha demostrado que el sulfato ácido algínico
presenta unas propiedades anticoagulantes (patentes US n.°
3.766.167 y 4.331.697) y se ha propuesto su uso como una composición de resina antitrombótica en combinación con resinas sintéticas (patente US n.° 4.822.615). Se ha observado que el sulfato de ácido algínico inhibe retrovirus y se ha propuesto su uso como una sustancia de limpieza tópica del cuerpo humano (patente US n.° 5.100.879) y en un método para el tratamiento de enfermedades (infecciones de linfocitos T) causadas por retrovirus (patente US n.° 4.840.941).
3.766.167 y 4.331.697) y se ha propuesto su uso como una composición de resina antitrombótica en combinación con resinas sintéticas (patente US n.° 4.822.615). Se ha observado que el sulfato de ácido algínico inhibe retrovirus y se ha propuesto su uso como una sustancia de limpieza tópica del cuerpo humano (patente US n.° 5.100.879) y en un método para el tratamiento de enfermedades (infecciones de linfocitos T) causadas por retrovirus (patente US n.° 4.840.941).
Se ha utilizado el ácido pectínico sulfatado
como polisacárido sulfatado sintético no absorbible con el fin de
disminuir la absorción de colesterol y de ácidos grasos (patente US
n.° 5.616.570 y 5.063.210) y se descubrió que inhibía la colesterol
esterasa pancreática (patente US n.° 5.484.777).
Se ha descubierto que los glicosaminoglucanos
polisulfatados, como el polisulfato de condroitina, estimulan la
producción de macromoléculas matriciales extracelulares
(hialuronano, proteoglicano sulfato de condroitina) mediante
células de tejido conjuntivo (células sinoviales, fibroblastos,
condrocitos articulares) (Acta Rheumatol., 1977, 1:75; J.
Rheumatol., 1979, 6:554; J. Rheumatol., 1999,
26:1663).
Los condrocitos no son capaces de reparar
lesiones endocondrales de cartílago articular y estas lesiones
implican inevitablemente la aparición de artrosis. Los intentos
realizados en la reparación de lesiones endocondrales de cartílago
articular mediante la implantación de condrocitos autógenos han
tenido un éxito limitado (N. Engl. J. Med., 1994, 331:889).
Se ha demostrado que la implantación de condrocitos humanos en
injertos de hidrogel biocompatible y biodegradable aumenta las
posibilidades de reparar dichas lesiones de cartílago articular
(PNAS, 2002, 99:9996-10001; Ann NY Acad. Sci.,
2002, 961:118-122).
Se ha descrito recientemente una técnica de
cultivo de condrocitos en microesferas de alginato pegadas entre sí
con gel de fibrina (Ann. Rheum. Dis., 2001, 60,
781-790). En estas condiciones de cultivo, los
condrocitos colonizan todo el hidrogel de alginato/fibrina y forman
un tejido cartilaginoso seudohialino.
La presente invención se basa en la observación
de que el alginato polisulfatado presenta, cuando se encuentra en
una matriz, un efecto beneficioso en la proliferación y la
producción de componentes matriciales extracelulares mediante
células de tejido conjuntivo. La presente invención se refiere por
tanto al uso de alginato polisulfatado como componente matricial
en el tratamiento o en la prevención de defectos
osteocartilaginosos.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a una matriz que comprende alginatos polisulfatados y sirve
para reparar defectos osteocartilaginosos. La matriz puede
comprender además otro u otros componentes como, por ejemplo,
agentes gelificantes, nutrientes y antibióticos. Más en particular,
dicha matriz puede comprender además un agente quimiotáctico que
atrae las células de tejido conjuntivo hacia la matriz.
Una forma de realización particular de la
presente invención se refiere a una matriz que comprende alginatos
polisulfatados y además un gel de polisacáridos no sulfatados. En
una forma de realización más particular, el polisacárido no
sulfatado es alginato. Las formas de realización específicas de la
presente invención se refieren a una matriz que comprende un gel de
alginato y además entre aproximadamente 0,5 mg y 100 mg de alginato
polisulfatado por cada gramo de alginato no sulfatado.
\newpage
Se ha observado además que las matrices
artificiales que comprenden alginato polisulfatado son apropiadas
para el cultivo celular, más particularmente, de condrocitos
articulares humanos. Además, la presencia de alginato polisulfatado
en la matriz artificial favorece considerablemente la producción de
componentes de la matriz extracelular (ECM) mediante
condrocitos.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere por tanto al uso de alginato polisulfatado como un
componente de matriz para el cultivo o como un excipiente para
células humanas o de animales, más particularmente, para células de
tejido conjuntivo o células precursoras de dichas células,
particularmente, células osteocartilaginosas. El alginato
polisulfatado se utiliza en particular como componente de matriz
para células condrogénicas, más particularmente, células de
cartílago articular (condrocitos).
Una forma de realización particular de la
presente invención se refiere al uso de alginato polisulfatado
como un componente de matriz para células humanas o de animales a
implantar en un cuerpo humano o de un animal. Más particularmente,
el alginato polisulfatado se utiliza en matrices para células a
implantar en el contexto de reparaciones o remodelaciones del
cuerpo humano o de animales.
Un aspecto particular de la presente invención
se refiere al uso de alginato polisulfatado como un componente de
matriz y/o excipiente para células de animales o humanas a
implantar en un cuerpo de un animal o humano en el contexto de
reparaciones de defectos osteocartilaginosos. Las células
osteocartilaginosas incluidas en dichas matrices artificiales que
comprenden alginatos polisulfatados se utilizan en la reparación de
lesiones superficiales de cartílago artrósico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método in vitro para el cultivo de células de tejido
conjuntivo o precursores de las mismas (células precursoras
mesenquimatosas), comprendiendo la etapa de poner dichas células en
contacto con una matriz que comprende alginato polisulfatado.
Además, la presente invención se refiere a un
método in vitro para estimular la síntesis de agrecano
mediante células osteocartilaginosas o progenitoras, comprendiendo
dicho método la puesta en contacto de dichas células con alginato
polisulfatado.
La presente invención se refiere por tanto a una
composición farmacéutica que contiene una matriz que comprende
alginato polisulfatado para la reparación de defectos
osteocartilaginosos. La composición farmacéutica puede comprender
además otros componentes como células de tejido conjuntivo o
precursores de dichas células, tales como las células precursoras
mesenquimatosas, pero más particularmente, células
osteocartilaginosas y mucho más particularmente, células
condrogénicas.
El alginato polisulfatado puede administrarse en
forma de un gel inyectable, estéril y sin endotoxinas, preparado
para el transplante de condrocitos articulares humanos o de
animales o el de otras células de tejido conjuntivo humano o de
animales.
Según una forma de realización particular, la
composición farmacéutica comprende una matriz que comprende una
concentración de alginato polisulfatado comprendida entre
aproximadamente 100 ng/ml y aproximadamente 500 \mug/ml.
La presente invención se refiere además al uso
de alginato polisulfatado en la producción de un medicamento para
el tratamiento o la prevención de defectos osteocartilaginosos. Más
particularmente, el medicamento se presenta en forma de una matriz
que puede comprender otros componentes como células de tejido
conjuntivo o precursores de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido algínico es un heteropolisacárido
lineal que se encuentra de forma natural en algas y algunas
bacterias. Es un copolímero de bloques con unidades repetidas de
ácido
\beta(1-4)D-manurónico
(M) y ácido
\alpha(1-4)L-gulurónico
(G). El o los "alginatos" utilizados en la presente invención
se refieren a una o varias sales (y/o esteres) de dicho
polisacárido. La proporción entre los dos monómeros así como su
distribución determinan ampliamente las propiedades fisicoquímicas
del alginato. Los residuos M y G se unen entre sí en forma de
bloques. Esto implica que se pueden encontrar tres tipos de
bloques, bloques M homopoliméricos
(M-M-M), bloques G homopoliméricos
(G-G-G) y bloques MG
heteropoliméricos con secuencias alternantes
(G-M-G-M). El
alginato forma un gel con la mayoría de los cationes divalente y
multivalentes. Los cationes monovalentes y los iones Mg^{2+} no
dan lugar a ninguna gelificación, mientras que los iones como
Ba^{2+} y Sr^{2+} producen geles de alginato más consistentes
que los iones Ca^{2+}. La consistencia del gel depende del
contenido gulurónico y también del número medio de unidades G en
los bloques G. Se puede por tanto ajustar la composición de ácido
algínico o alginatos en función de la rigidez o flexibilidad que se
pretenda que presente la estructura. Se conocen en la técnica
modificaciones de polisacáridos obtenidos por derivación de los
grupos funcionales OH. El término alginato incluye derivados como,
por ejemplo, el alginato dialdehídico, derivados del ácido
carboxamida algínico (como el
6-O-[(N-2-desoxi-D-glucosa)]carboxamida
alginato), derivados del ácido metilamina algínico (como el ácido
6-metilamina algínico; derivados del ácido
2,3-di-(metilamina)algínico), derivados del
ácido diaminoalgínico (como el ácido
2,3-di-(amino)algínico, derivados del ácido
dodecanodiaminoalgínico, derivados del ácido
6-hexanodiaminoalgínico, derivados del ácido
2,3-di-(hexanodiamino)algínico),
e-N-maleimidopropionatoalginato;
N-morfolinalginamida, polietilenglicolalginato,
succinimidilalginato, tioetilaminalginato y tiocarbohidracida
alginato.
El alginato polisulfatado puede obtenerse a
partir de ácido algínico utilizando ácido clorosulfónico como
agente de sulfatación del ácido algínico según el procedimiento
descrito por T. Astrup et al. (Acta Phys. Scand.,
1944, 8: 215-226), tal como se describe en el
presente documento. No obstante, se sobreentiende que en el
contexto de la presente invención pueda utilizarse también alginato
polisulfatado obtenido mediante cualquier otro método de
fabricación.
La presente invención se refiere al uso de
alginato polisulfatado en una matriz para células humanas o de
animales. Según un primer aspecto de la presente invención, el
alginato polisulfatado se utiliza como un componente matricial.
La matriz utilizada según la presente invención
es apropiada para células humanas y/o de animales. Esto significa
que la matriz debe presentar las características fisicoquímicas que
permitan la supervivencia de células humanas y/o de animales y, si
fuera pertinente, su multiplicación en la matriz. El término
"cultivo" se utiliza en el presente documento para hacer
referencia al mantenimiento de células en un estado viable (p. ej.,
con una función de excipiente) y/o a una estimulación activa de la
multiplicación de células (p. ej., por tránsitos repetidos).
La matriz según la presente invención consiste
en una matriz biocompatible, atóxica y aceptable farmacológica y
biológicamente. Puede ser además opcionalmente una biomatriz
biodegradable o biorreabsorbible. La matriz de la presente
invención puede tener una forma indefinida y ser de un material no
sólido, como un gel, o puede consistir en una lámina o presentar
una forma ahusada.
La matriz puede comprender cualquier material
apropiado, incluso materiales poliméricos sintéticos o sustancias
molidas. Unos ejemplos de materiales de matriz son el sulfato
cálcico biodegradable y definido químicamente, el fosfato
tricálcico, el hidroxiapatito, la fibra de vidrio, RTM, el yeso de
París, la \beta-whitlockita, los polímeros
biodegradables, incluyendo homopolímeros (p.ej., poliparadioxanona,
polilisina o ácido poliglicólico) y copolímeros (p.ej., ácido
poliláctico y ácido poliglicólico) y combinaciones de los mismos.
Otros materiales posibles son biodegrables y bien definidos
biológicamente, tales como hueso o colágeno dérmico, alginato,
pectina, agarosa y fibrinógeno. Otros materiales de matriz posibles
son materiales definidos químicamente pero no biodegradables, como
hidroxiapatito aglutinado, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas.
Las matrices pueden consistir también en cualquier combinación de
los tipos de materiales mencionados anteriormente. Un resumen de
biomateriales y sus propiedades correspondientes puede encontrarse
en Biomateríals, Alpha Science International Ltd.,
Pangbourne, England.
La matriz puede ser, según la aplicación, de
material entrecruzado o no. En el documento US 6.514.514 se
describen ejemplos de matrices. Según una forma de realización
particular de la presente invención, la matriz permite la
administración de uno o varios fármacos en un gradiente según el
tipo de defecto osteocartilaginoso. Dicho gradiente puede
corresponder al grado variable de reparación que necesite el
defecto y/o a la transición de cartílago (baja concentración) a
hueso (alta concentración).
Una ventaja de la matriz de la presente
invención es que el alginato polisulfatado da lugar a una
estimulación mucho mayor del metabolismo de las células del tejido
conjuntivo que el sulfato de condroitina polisulfatada o el
xilosano polisulfatado o la condroitina sulfatada natural. Se
prevén diferentes concentraciones de alginato polisulfatado en la
matriz, pudiendo depender las mismas de la aplicación concreta.
Según una forma de realización particular, el alginato
polisulfatado se encuentra en la matriz en una concentración
comprendida entre 100 ng/ml y 500 \mug/ml y más particularmente
en una concentración comprendida entre 1 \mug/ml y 100 \mug/ml
de matriz.
Otra ventaja de la matriz de la presente
invención es que los alginatos (incluyendo los alginatos
polisulfatados) presentan una mayor capacidad para formar un gel
que otros polisacáridos y polisacáridos polisulfatados. Según una
forma de realización particular de la presente invención, la matriz
comprende, además del alginato polisulfatado, uno o más
componentes de estructura similar a la del alginato polisulfatado,
permitiéndose una distribución homogénea de los mismos en la
matriz. En particular, la matriz comprende además un polisacárido
de elevado peso molecular, más particularmente, un alginato no
sulfatado (p.ej., sódico) que puede mezclarse homogéneamente con el
alginato polisulfatado. El alginato sódico forma un gel
biodegradable cuando se entrecruza con cationes divalentes y se ha
descrito ampliamente su idoneidad como sustrato para la
multiplicación celular en la manipulación histológica, pudiéndose
influir en la multiplicación mediante su composición (véase Wang
et al., 2003, Biomaterials 24:
3475-3481). La relación en peso entre alginato
polisulfatado y alginato puede variar entre aproximadamente 1:1 y
aproximadamente 1:100 o más, siendo en una forma de realización
particular la relación de alginato polisulfatado a alginato de
1:20. En una forma de realización particular, el porcentaje en
peso de alginato polisulfatado con respecto al alginato está
comprendido entre 0,005 y 10% o la relación por cociente de
alginato polisulfatado a alginato está comprendida entre 1/200 y
1/150, entre 1/150 y 1/100, entre 1/100 y 1/50, entre 1/50 y 1/25 o
entre 1/25 y 1/10. En una forma de realización particular, la
concentración de alginatos polisulfatados en la matriz de la
presente invención es inferior a 500 microgramos/ml.
La matriz según la presente invención presenta
opcionalmente una estructura particular con la que se dirige el
crecimiento de las células según un patrón particular. Más
particularmente, el gel de polisacáridos de peso molecular elevado
y que comprende el alginato polisulfatado de la presente invención
puede diseñarse de tal forma que incluya canales de tal modo que se
hacen proliferar células en columnas dentro de la matriz (tal como
describen Aydelotte et al, 1998, In Vitro
Cell Devel. Biol. -Animal 34:123-130). Esto
puede ser de interés en situaciones en las que el crecimiento de
células según un patrón organizado resulta beneficioso.
La matriz de la presente invención puede
comprender también opcionalmente otros polisacáridos
polisulfatados, como ciclodextrina polisulfatada y/o inulina
polisulfatada, u otros componentes capaces de estimular la
producción de matrices extracelulares de células de tejido
conjuntivo.
Además, la matriz de la presente invención puede
comprender también opcionalmente medios nutritivos como, por
ejemplo, MEM, MEM modificado de Dulbecco, F12 de HAM, una solución
salina equilibrada de Hank o mezclas de los mismos.
La matriz de la presente invención puede
comprender también opcionalmente factores de crecimiento que
inducen o estimulan el crecimiento de determinadas células. El tipo
de factor de crecimiento incluido dependerá del tipo de célula para
el que se haya previsto la matriz. Por ejemplo, en el caso de
células osteocartilaginosas, la matriz puede comprender
opcionalmente uno o varios factores de crecimiento tales como los
factores de crecimiento derivados de los trombocitos (PDGF),
factores transformadores de crecimiento
(TGF-\beta), factores de crecimiento insulinoide
(IGF), factores de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de
crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de células
endoteliales humanas (ECGF), factor de estimulación de colonias de
macrófagos granulocitos (GM-CSF), factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteína morfogenética
cartilaginosa (CDMP), proteínas morfogenéticas óseas (BMP) tales
como OP-1, OP-2, BMP2, BMP3, BMP4,
BMP9, BMP11-14, DPP, Vg-1, 60A y
Vgr-1.
La matriz de la presente invención puede
comprender también opcionalmente factores adicionales que influyen
sobre el crecimiento y/o la actividad de determinadas células. Por
ejemplo, en el caso de los condrocitos, se puede agregar a la
matriz un factor como una condroitinasa, que estimula la producción
de cartílago mediante condrocitos, a fin de mantener los
condrocitos en un estado hipertrófico (como se describe en el
documento US 20020122790).
Según la presente invención, la presencia de
alginatos polisulfatados en una matriz aumenta la actividad y/o
crecimiento del tipo de células que se encuentran en la proximidad
inmediata de la matriz o incluidas en la misma. La matriz que
comprende alginato polisulfatado según la presente invención sirve
de excipiente o para la conservación y/o el cultivo de células
in vitro o in vivo.
Una forma de realización particular de la
presente invención se refiere al uso, en una matriz, de alginato
polisulfatado como excipiente y/o para el cultivo de células de
tejido conjuntivo o de células precursoras de las mismas. El
término "tejido conjuntivo" se utiliza en la presente memoria
para hacer referencia a cualquier tejido de una serie de tejidos
estructurales en mamíferos, incluyéndose entre ellos, y no
exclusivamente, hueso, cartílago, ligamento, tendón, menisco,
dermis, hiperdermis, músculo, tejido adiposo y cápsula
articular.
Más específicamente, se ha encontrado que el
alginato polisulfatado aumenta la síntesis de agrecano y
especialmente la síntesis de agregados de agrecano mediante células
osteocartilaginosas como las células humanas de cartílago
articular. El término "células osteocartilaginosas" se utiliza
aquí para hacer referencia a células que pertenecen a estirpes
condrogénicas o osteogénicas o que pueden presentar una
diferenciación evolucionando hacia estirpes condrogénicas o
osteogénicas, en función de las señales ambientales. Este potencial
puede probarse in vitro o in vivo (De Bari et
al., 2001, Arthritis Rheum.,
44(1):85-95; Pittenger et al., 1999,
Science, 284 (5411):143-147; Dell'Acio et
al., 2003, Exp. Cell Res.,
287(1):16-27). Un aspecto particular de la
presente invención se refiere por tanto al uso de alginato
polisulfatado en una matriz para células osteocartilaginosas, más
particularmente, células condrogénicas, es decir, células capaces
de producir cartílago o células que se diferencian por sí mismas
transformándose en células que producen cartílago, incluyendo
condrocitos y células que se diferencian por sí mismas
transformándose en condrocitos (es decir, células precursoras de
condrocitos).
Según un aspecto de la presente invención, se
utiliza una matriz que comprende alginatos polisulfatados en la
generación (y opcionalmente implantación) de dispositivos
protésicos tales como, por ejemplo, los dispositivos protésicos
para la reparación de cartílago. Por ejemplo, los condrocitos
pueden cultivarse en una estructura muy porosa, biodegradable y
biocompatible, formada por polímeros como ácido poliglicólico, ácido
poliláctico, gel de agarosa u otros polímeros que se degradan con
el tiempo, comprendiendo la estructura los alginatos
polisulfatados de la presente invención. Según la presente
invención resulta especialmente apropiado un gel de alginato sódico
que comprende alginato polisulfatado. Las matrices se diseñan de
forma que permiten el aporte de nutrientes y gas para las células
hasta la realización del trasplante. Las células pueden cultivarse
opcionalmente in vitro (o ex vivo) hasta que se
alcancen el volumen y la densidad de células adecuados para la
implantación de las células. Otra posibilidad consiste en implantar
directamente en el cuerpo la matriz con las células. Las matrices
pueden moldearse individualmente para dotarlas de la forma deseada
de tal modo que el producto final se asemeje al máximo a la propia
oreja o nariz del paciente (por ejemplo); o se pueden utilizar
matrices flexibles que pueden manipularse durante la implantación,
como en una articulación.
La presente invención es particularmente útil
para el tratamiento de defectos osteocartilaginosos en una
diartrosis como la rodilla, el tobillo, el codo, la cadera, la
muñeca, el nudillo de un dedo de la mano o del pie, o una
articulación temperomaxilar. Dichos defectos osteocartilaginosos
pueden deberse a una lesión traumática (p.ej., una lesión deportiva
o una lesión por desgaste excesivo) o a una enfermedad como la
artrosis. Una forma de realización particular se refiere al uso de
la matriz de la presente invención en el tratamiento o en la
prevención de lesiones superficiales del cartílago artrósico.
Además, la presente invención sirve para el tratamiento o la
prevención de defectos osteocartilaginosos debidos al
envejecimiento u originados durante el parto. En el contexto de la
presente invención, los defectos osteocartilaginosos incluyen
también aquellas condiciones en las que se requiere una reparación
del cartílago y/o hueso en el contexto de una intervención
quirúrgica, como, por ejemplo, una intervención de cirugía estética
(de la nariz, oreja). Dichos defectos pueden darse por tanto en
cualquier lugar del cuerpo en el que se haya dañado o lesionado el
cartílago o la formación ósea o en el que éstos falten debido a una
anomalía genética.
Un aspecto de la presente invención se refiere
por tanto a una composición farmacéutica que contiene una matriz
que comprende alginato polisulfatado. Dicha composición
farmacéutica es particularmente útil para el tratamiento o la
prevención de defectos del tejido conjuntivo, más particularmente,
defectos osteocartilaginosos. La aplicación de la matriz en el lugar
del defecto osteocartilaginoso tiene un efecto estimulante sobre
la proliferación y producción de matrices extracelulares mediante
las células osteocartilaginosas que se encuentran en el lugar de
dicho defecto. La matriz puede comprender además opcionalmente
agentes que atraen las células osteocartilaginosas.
Según la presente invención, la composición
farmacéutica, que comprende una matriz que comprende alginato
polisulfatado, comprende opcionalmente células, más particularmente,
células de tejido conjuntivo o células precursoras de las mismas.
Las células que pueden utilizarse en la composición farmacéutica
de la presente invención pueden ser autógenas (donante y receptor
coinciden) o alógenas, pudiéndose aislarse estas últimas de un
familiar (donante emparentado) o de uno o varios donantes no
emparentados. Dichas células pueden haberse aislado recientemente,
cultivado o pasado de un medio a otro. Dichas células pueden
seleccionarse y/o purificarse opcionalmente según la expresión de
las proteínas concretas de interés (como se describe en los
documentos WO 01/24833, WO 01/25402 o WO 96/41620 en el caso de
células de tejido conjuntivo). Dichas células pueden proceder de
orígenes distintos, incluyendo éstos a título de ejemplo no
limitativo el cartílago preexistente y el hueso subcondral, tejido
pericondral, la membrana sinovial y médula ósea.
Como se ha indicado anteriormente, las células
apropiadas para la composición farmacéutica de la presente
invención incluyen células precursoras o progenitoras de células de
tejido conjuntivo. Dichas células incluyen células obtenidas
directamente o indirectamente de células estromatosas de la médula
ósea o células progenitoras mesenquimatosas, pero pueden haberse
obtenido también de otros tejidos como el de un músculo, el corazón
o un granuloma.
Las células descritas anteriormente pueden
encontrarse en distintas concentraciones en la composición
farmacéutica de la presente invención. Por ejemplo, en una matriz
tipo gel que comprende alginato polisulfatado pueden mezclarse
células en una concentración de 1-50 x 10^{6}
células por ml.
Los siguientes ejemplos, que se presentan sin la
intención de limitar la presente invención a las formas de
realización específicas descritas en el presente documento, pueden
apreciarse más claramente junto con la figura adjunta en la
que:
Figura 1: Agrecanos ^{35}sulfatados
sintetizados recientemente mediante condrocitos en cultivo tras
incubación con distintas concentraciones de alginato polisulfatado.
(A) cantidad de agrecano ^{35}sulfatado y ADN determinadas
independientemente; (B) cantidad de agrecano ^{35}sulfatado
representada en función de la cantidad de ADN medida.
Se agrega gota a gota un vol. de ácido
clorosulfónico a 6,6 vol. de piridina enfriada con hielo. Se añaden
aprox. 300 mg del alginato a 5 ml de la mezcla de ácido
clorosulfónico y piridina. La solución se mantiene a continuación a
100°C durante 5 horas. Tras dejarla enfriar, se agregan 25 ml de
agua destilada. A la solución se agregan seguidamente 100 ml de
acetato sódico diluido al 10% en metanol a fin de precipitar los
ácidos de polisacáridos polisulfúricos. Se lava 2 veces el
precipitado con metanol y se procede a disolverlo en una cantidad
apropiada de agua destilada libre de pirógenos a fin de extraer el
ácido clorosulfónico, la piridina y sales tampón residuales. Se
procede a liofilizar el precipitado que contiene el alginato
polisulfatado. El alginato polisulfatado se recupera en forma de un
polvo blanco seco.
El grado de sulfatación y la pureza del alginato
así como el contenido de pirógeno se determinaron mediante métodos
químicos y biológicos convencionales. En las condiciones
utilizadas, se encontró que la sulfatación del alginato era
completa.
Se aislaron condrocitos articulares humanos
según el procedimiento descrito por W. T. Green Jr. (Clin.
Orthop., 1971, 75:248-260) y K. E. Kuettner
et al. (J. Cell. Biol., 1982, 93:
743-750) y realizando algunas modificaciones (M.
Cornelissen et al., J. Tiss. Cult. Meth., 1993,
15:139-146).
Las células de cartílago articular se cultivaron
en alginato gelificado según el procedimiento descrito por P. D.
Benya et al. (Cell, 1982, 30:215-224).
Los alginatos contenían distintas concentraciones de alginato
polisulfatado preparado según el ejemplo 1.
La síntesis de agrecanos se analizó utilizando
Na_{2}^{35}SO_{4} como precursor radioactivo del agrecano
^{35}sulfatado y sintetizado recientemente mediante los
condrocitos en cultivo.
Después de un periodo de cultivo de dos semanas,
se incluyeron 10 \muCi/ml del marcador en el medio de incubación
durante 48 horas. Los ^{35}S-agrecanos
sintetizados se acumulaban parcialmente en la matriz artificial
intercelular de agarosa. Otra parte de estas macromoléculas de
^{35}S escaparon del medio de incubación. A continuación, se
solubilizó el alginato en la placa de cultivo utilizando 3,0 ml de
una solución 55 mM de citrato trisódico en presencia de
inhibidores de proteinasa a 40°C durante toda la noche. Se
centrifugó la suspensión resultante. El sobrenadante, que contenía
los ^{35}S-agrecanos de matriz interterritorial,
y el medio de incubación, que contenía los metabolitos de
^{35}S-agrecano que escaparon de la matriz
extracelular, se mezclaron por separado para las subsiguientes
pruebas cromatográficas.
Se trató durante 48 horas el sedimento celular,
que contenía las células y los ^{35}S-agrecanos
asociados a las células, con 1 ml de una solución de cloruro de
guanidinio 4,0 M en acetato de sodio 0,05 M, que presentaba un pH
de 5,8 y que contenía inhibidores de proteinasa, a fin de extraer
los ^{35}S-agrecanos asociados a las células. A
continuación, se centrifugó la solución resultante para descartar
las células y se guardó el sobrenadante para pruebas
cromatográficas.
Después de la centrifugación, se desalaron
alícuotas de medio nutriente, digeridos de alginato y extractos de
matriz pericelular utilizando geles de Sephadex G25 de
cromatografía en fosfato 0,067 M, que presentaban un pH de 6,8 y
contenían 0,01 M Na_{2}SO_{4}, a fin de separar los
^{35}S-agrecanos marcados de los ^{35}S libres.
Las fracciones macromoleculares eluidas se analizaron con un
contador para determinar su radioactividad. La radioactividad bajo
las curvas (volumen hueco) está relacionada con la incorporación
total de ^{35}S en los agrecanos mediante los cultivos
correspondientes. Teniendo en cuenta la cantidad de medio de
cultivo mezclado que se analizó finalmente tras la cromatografía,
la cantidad específica de medio de incubación, la desintegración
del ^{35}S, los periodos de marcado en horas y el número de
células por cultivo, se expresó la incorporación del sulfato como
pg de SO4 incorporado por cada 1.10^{6} condrocitos y por hora (G.
Verbruggen et al., Osteoarthritis Cart., 2000,
8:170-179).
Se desalaron mezclas de medio combinado y
digeridos de agarosa mediante geles de cromatografía a fin de
separar los ^{35}S-agrecanos marcados de los
^{35}sulfato libres. Se mezclaron fracciones eluidas con gel
Sephadex G25 y que contenían las macromoléculas marcadas con
^{35}S y se utilizaron las mezclas para la cromatografía de
permeación de gel con sefarosa CI-2B en el mismo
tampón. Se encontró que las macromoléculas marcadas con ^{35}S se
eluían en tres fracciones: monómeros y agregados de
^{35}S-agrecanos separados entre sí en los dos
primeros picos; algo de materia de bajo peso molecular (productos
de degradación; subpoblaciones de agrecano de pequeño tamaño
hidrodinámico) eluida en la tercera fracción residual. La
radioactividad determinada bajo las dos primeras curvas permitió
calcular las proporciones de monómeros y agregados de
^{35}S-agrecano.
Después de la proliferación en alginato se
procedió a medir el contenido de ADN en los cultivos. El contenido
de ADN se analizó utilizando el incremento que se produce en la
fluorescencia de trisbencimidazol (Hoechst 33258) cuando este se
une al ADN de dos hebras (C. Lebarca. K. Paigen ..., 1980, Anal.
Biochem. 102:344-52). Se licuaron para ello los
cultivos de alginato mediante sonicación de 1 minuto de duración
(MSE ultrasonicator, tipo 5.65; potencia ajustada a 100 vatios. Se
agregaron 50 \mul del alginato licuado a 2 ml de la solución de
colorante de Hoechst (0,1 \mug/ml en 10 mM TrisHCl, pH 7, 4, 1 mM
EDTA y 0,2 M NaCl) y se midió la fluorescencia con un fluorómetro
Hoefer dynaquant 200 utilizando como patrón ADN de dos hebras de
timo de ternera en alginato licuado.
Tal como puede apreciarse en la tabla 1, la
presencia de polisulfato alginato en concentraciones de
1-10 \mug/ml en el medio de cultivo de condrocitos
hizo que aumentase notablemente la síntesis y la acumulación de
agrecanos en la matriz pericelular asociada a las células y en la
matriz interterritorial de los condrocitos.
La figura 1 demuestra además que el aumento en
la síntesis de agrecanos se debe a una mayor expresión de
agrecanos por las células condrogénicas, ya que la cantidad total
de ADN medida no ha aumentado con la mayor concentración de
alginatos polisulfatados utilizada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de una formulación de 100 ml de gel que
contiene alginato polisulfatado y sirve como matriz en el
trasplante de condrocitos humanos:
\vskip1.000000\baselineskip
| Alginato polisulfatado (sal sódica) | 100 \mug |
| Alginato | 1 g |
| Antibióticos DMEM doblemente concentrados | 100 ml |
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se investiga la reparación de
anomalías estándar de cartílago mediante la implantación de
condrocitos autógenos incluidos en una matriz que comprende
alginato polisulfatado.
Para el trasplante autógeno de condrocitos se
utilizaron cabras de Saanen adultas, no lactantes ni preñadas.
Todas las cabras tenían 3 o más años y procedían de criaderos con
certificación de ausencia de ACVE (Artritis Caprina y Virus de la
Encefalitis).
Se digirieron enzimáticamente lascas de
cartílago de cabra [hialuronidasa (0,25% en DM) durante 1 h,
pronasa (0,25% en DM) durante 1 hora, durante la noche en DM (DM=
DMEM LG + antibióticos + L-glutamina) + 10% de
suero autógeno, colagenasa (0,2% en DM + 10% de suero autógeno)
durante 3-4 h] a fin de obtener una suspensión
unicelular. Después de su lavado se determinó la viabilidad de las
células aisladas realizando una prueba de exclusión con tripán
azul. Todas las poblaciones de células presentaban una viabilidad
superior al 95%.
Se diluyeron células hasta obtener una
concentración final de 5 x 10^{6} células/ml de solución de
alginato polisulfatado. Utilizando una aguja de calibre G25, se
agregó gota a gota esta suspensión de células a una solución de
CaCl_{2} 102 mM para la polimerización (10 min). Después de un
lavado con NaCl al 0,9%, se cultivaron perlas con alginato
polisulfatado en DMEM+AB+L-glut.+10% de suero
autógeno hasta justo antes de la implantación. Concentración final
por perla: aproximadamente 30.000 células/perla.
El día de la implantación, se desechó el medio
de cultivo y se disolvieron las perlas en 2 ml de una solución de
nacitrato 55 mM. Después de aprox. 2 minutos, se agregaron 10 ml de
PBS y se procedió a centrifugar la solución a 1600 rpm durante 10
min para lavar. Se desechó el sobrenadante y se volvieron a
suspender las bolitas de células en
DMEM+AB+L-glut.+10% de suero autógeno hasta
alcanzar una concentración final de células de 5 min/ml. Se
comprobó la viabilidad de las células mediante una prueba de
exclusión con tripán azul y se encontró que era > 95%.
Se llenó un volumen estándar de un defecto de
cartílago (6 mm de diámetro). Se tapó el defecto con un colgajo
perióstico de 8-10 mm de diámetro y se selló con
pegamento de fibrina (Quixil® - Omrix Biopharma).
Después de unas 13 semanas, se analizaron los
cóndilos de fémur izquierdo y derecho. La membrana sinovial estaba
teñida con tinción de hematoxilina y eosina. Los cóndilos estaban
teñidos con tinción de hematoxilina y eosina, azul de toluidina y
safranina O.
El análisis microscópico de la reparación del
cartílago se resume en la tabla 3:
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 9116905 A [00031
- \bullet US 4840941 A [0005]
- \bullet WO 9309790 A [0003]
- \bullet US 5616570 A [0006]
- \bullet EP 447171 A [0003]
- \bullet US 5063210 A [0006]
- \bullet WO 8906536 A [0003]
- \bullet US 5484777 A [0006]
- \bullet US 4021545 A [0004]
- \bullet US 6514514 B [0029]
- \bullet US 3768167 A[00051
- \bullet US 20020122790 A [0036]
- \bullet US 4331697 A [0005]
- \bullet WO 0124833 A [0043]
- \bullet US 4822615 A [0005]
- \bullet WO 0125402 A [0043]
- \bullet US 5100879 A [0005]
- \bullet WO 9641620 A [0043]
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\bulletLEBARCA C; PAIGEN K.
Anal Biochem., 1980, vol. 102, 344-52
[0056]
Claims (20)
1. Método in vitro / in vivo para
el cultivo de células de tejido conjuntivo o células precursoras de
las mismas, que comprende la etapa de poner en contacto dichas
células con una matriz que comprende alginato polisulfatado.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha matriz es apropiada para la implantación en el cuerpo humano
o de un animal.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicha matriz comprende además un medio nutritivo.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha matriz comprende además
alginato no sulfatado.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho alginato polisulfatado y
dicho alginato no sulfatado se encuentran en una relación en peso
comprendida entre 1:10 y 1:100.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células son células de
tejido conjuntivo.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células son
condrogénicas.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dichas células son células precursoras de condrocitos.
9. Matriz que comprende alginato polisulfatado y
células de tejido conjuntivo de mamífero o células progenitoras de
las mismas.
10. Matriz según la reivindicación 9, en la que
dichas células son células osteocartilaginosas.
11. Matriz según la reivindicación 10, en la que
dichas células son células condrogénicas.
12. Matriz según la reivindicación 9, en la que
dichas células son células precursoras mesenquimatosas.
13. Matriz según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12 que comprende además un medio
nutritivo.
14. Matriz según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, en la que dicho alginato polisulfatado se
encuentra en una concentración comprendida entre 100 ng/ml y 500
\mug/ml.
15. Matriz según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14 que comprende además alginato no
sulfatado.
16. Composición farmacéutica que comprende la
matriz de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15.
17. Uso de una matriz que comprende alginato
polisulfatado en la producción de un medicamento para el
tratamiento o la prevención de defectos osteocartilaginosos.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que
dicha matriz comprende además células condrogénicas.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que
dichas células condrogénicas son células de tejido conjuntivo o
células precursoras de las mismas.
20. Uso según la reivindicación 18, en el que
dichas células condrogénicas son células precursoras
mesenquimatosas.
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