ES2297886T3 - Sistema de interaccion para la presentacion y retirada de sustancias. - Google Patents

Sistema de interaccion para la presentacion y retirada de sustancias. Download PDF

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Abstract

Un sistema de interacción que comprende: (a) una superficie de un plástico basado en monómeros, que contienen al menos un elemento estructural (A) derivado de un ácido carboxílico, donde el plástico es un poli(met)acrilato, un éster de polivinilo o un polímero mixto o una mezcla de los mismos con otras sustancias polimerizables; y (b) un enlazador con una sustancia fisiológicamente y/o farmacológicamente activa acoplada al mismo, donde el enlazador se selecciona de (poli)alquilenglicoles, (poli)alquileniminas, (poli)alquilenaminas, (poli) alquilensulfuros y polioxazolinas y al menos un elemento estructural (B) que es capaz de formar puentes de hidrógeno; en el que existe una interacción estable mediante enlaces por puentes de hidrógeno entre el elemento estructural (A) de la superficie y el elemento estructural (B) del enlazador, que no se puede anular por valores de pH en el intervalo de 2 a 13 o temperaturas hasta 60ºC.

Description

Sistema de interacción para la presentación y retirada de sustancias.
La presente invención se refiere a sistemas de interacción para la presentación y retirada de sustancias en líquidos. La invención se refiere adicionalmente a dispositivos producidos con estos sistemas de interacción como, a modo de ejemplo, sistemas de tubos capilares, material fibroso para la filtración de líquidos fisiológicos, almohadillas filtrantes, prótesis articulares o vasculares, etc.
Para los propósitos mas diversos, a menudo se requiere retirar de forma dirigida sustancias de un líquido o presentar sustancias en un líquido.
A modo de ejemplo, a menudo, para aumentar el peso molecular y, por tanto, para mejorar la farmacocinética en el cuerpo se acoplan sustancias activas fisiológicas con polialquilenglicoles, por ejemplo, polietilenglicol (compárese, por ejemplo, Trombosis and Haemostasis, 77 (1), 168-73 (1997), Peptide Research, Vol. 8, Nº 2 (1995)). Tales sustancias tienen actualmente un amplio uso terapéutico. Hasta ahora, para tales sustancias no se dispone de antídotos funcionales eficaces o del efecto de sistemas neutralizantes, es decir, sistemas para la retirada de estas sustancias.
En enfermedades graves se secretan a la sangre muy a menudo sustancias de señalización celular de una función alterada, por lo que estos factores de señalización celulares se pueden distribuir rápidamente hasta cualquier punto del cuerpo. De este modo se pueden producir respuestas razonables, sin embargo, a menudo también patológicas del organismo a señales de este tipo. Por la neutralización o el bloqueo de esos factores patogenéticos se puede interrumpir una enfermedad o se puede detener un avance, de tal forma que los propios mecanismos de reparación del cuerpo tienen la ocasión de intervenir en la causa.
Son ejemplos típicos de tales agentes de señalización los mensajeros celulares de las células endoteliales y en circulación de la sangre como, por ejemplo, CD1, CD2, CD6, CD8, CD16, factor de necrosis tumoral (TNF), etc. También proteínas inducidas, patogenéticamente significativas como, por ejemplo, la proteína de unión a lipoproteína LBP son responsables del desarrollo de las complicaciones más graves en pacientes de choque séptico.
Sería importante poder retirar de forma cuidadosa tales sustancias mediante un sistema terapéutico extracorpóreo sin someter el organismo a otras sustancias. Adicionalmente sería ventajosa la terapia de determinadas enfermedades con sistemas para la presentación de anticuerpos monoclonales o fragmentos de estos anticuerpos monoclonales. Actualmente solamente se puede aplicar temporalmente una terapia de este tipo, ya que las células inmunocompetentes del organismo producen anticuerpos humanos contra estas proteínas extrañas muy rápidamente. Se puede usar una presentación local de tales anticuerpos monoclonales en la circulación sanguínea sin radiactividad inmune durante un tiempo prolongado para la neutralización de antígenos en la sangre.
Adicionalmente, a menudo es deseable poder retirar determinados ingredientes alimenticios como, a modo de ejemplo, colesterol, determinados ácidos grasos, alcohol, contaminaciones de tipo microbiano y bacteriano de forma cuidadosa y sencilla, por ejemplo, para poder producir de forma dirigida alimentos para requerimientos dietéticos especiales.
Por tanto, la presente invención tiene el objetivo de proporcionar un sistema sencillo, económico y aplicable universalmente para la retirada o presentación de sustancias en líquidos. El sistema debe poder adaptarse de forma sencilla a los respectivos requerimientos en la práctica. Adicionalmente, el sistema no debe modificar de forma desventajosa el líquido que se tiene que tratar o el entorno y se tiene que poder retirar del mismo de forma sencilla. En la medida en la que el sistema se usa con propósitos diagnósticos y terapéuticos se debe poder usar de forma cuidadosa y no debe cargar el cuerpo.
El objetivo se resuelve de acuerdo con la invención mediante un sistema de interacción que comprende:
(a)
una superficie de un plástico basado en monómeros, que contienen al menos un elemento estructural (A) derivado de un ácido carboxílico, donde el plástico es un poli(met)acrilato, un éster de polivinilo o un polímero mixto o una mezcla de los mismos con otras sustancias polimerizables; y
(b)
un enlazador con una sustancia fisiológicamente y/o farmacológicamente activa acoplada al mismo, donde el enlazador se selecciona de (poli)alquilenglicoles, (poli)alquileniminas, (poli)alquilenaminas, (poli)alquilensulfuros y polioxazolinas y al menos un elemento estructural (B) que es capaz de formar puentes de hidrógeno;
en el que existe, por enlaces por puentes de hidrógeno, una interacción estable entre el elemento estructural (A) de la superficie y el elemento estructural (B) de enlazador, que no se puede anular por valores de pH en el intervalo de 2 a 13 o temperaturas hasta 60ºC.
Preferiblemente, el elemento estructural derivado de un ácido carboxílico se encuentra en la cadena lateral del monómero. De forma particularmente preferida, el plástico comprende el elemento estructural
1
en el que los restos R pueden ser iguales o diferentes y se refieren a cualquier resto alquilo o arilo o un átomo de hidrógeno. El resto X es facultativo y se refiere a O, N o -CH_{2}.
Sorprendentemente, en ensayos con respecto a la capacidad de unión de estructuras superficiales se ha observado que las superficies de un plástico basado en monómeros, que contienen al menos un elemento estructural (A) derivado de un ácido carboxílico, establecen una interacción muy estable con enlazadores con al menos un elemento estructural capaz de formar enlaces por puentes de hidrógeno. Una interacción de este tipo es extraordinariamente estable y no se puede anular, a modo de ejemplo, por valores de pH de 2 a 13 o tampones con una gran fuerza iónica o temperaturas hasta +60ºC. Esta interacción, a continuación, se puede utilizar para el acoplamiento de las más diversas sustancias, acoplando las respectivas sustancias a este enlazador y estableciendo las mismas después una interacción correspondiente con el plástico. A partir de plásticos de este tipo se pueden producir superficies activas, es decir, superficies en las que se produce una interacción correspondiente y reacción posterior de la sustancia unida con un compañero de reacción. Esta superficie puede presentarse en cualquier forma y tamaño. Preferiblemente es una membrana, una micropartícula porosa o sólida, una micropartícula magnética, un material tejido o un recubrimiento sobre una sustancia natural o sintética. También son posibles combinaciones. De este modo, por ejemplo, se pueden tejer micropartículas en material fibroso o asociarlas con el mismo. De este modo se obtiene una estructura de red/armazón, por lo que se evita un hundimiento o una compresión de las micropartículas, por ejemplo, en columnas de cromatografía. Esta superficie activa se puede introducir en diferentes formas, a modo de ejemplo, en sistemas como sistemas de tubos capilares, filtros para líquidos fisiológicos, hemodializadores, líquidos de reemplazo fisiológicos, sistemas de suministro enzimático, prótesis articulares o vasculares u órganos artificiales. De este modo se pueden aplicar, a modo de ejemplo, micropartículas porosas como superficie activa en sistemas convencionales de tubos y filtros. De este modo se puede formar cualquier número de sistemas aplicables universalmente. Por la posibilidad de la sencilla imprimación se pueden aplicar de forma sencilla sobre las superficies correspondientes sustancias a menudo difícilmente acoplables mediante un enlace covalente. Esto es particularmente ventajoso cuando se tienen que esterilizar objetos del equipo correspondientemente complejos. A menudo es difícil esterilizar sustancias unidas covalentemente sin dañarlas. De acuerdo con la invención se puede esterilizar la superficie de plástico y paralelamente a esto, el compuesto acoplado a un enlazador, y después se puede hacer de forma sencilla que ambos componentes estériles interaccionen de nuevo entre sí en condiciones estériles.
Junto con la sustancia acoplada a un enlazador con al menos un elemento estructural capaz de formar enlaces por puentes de hidrógeno se obtiene un sistema de interacción presente como unidad de reacción. La superficie activa también se puede hilar hasta formar fibras huecas, hilos, placas comprimidas, almohadillas filtrantes, telas no tejidas o similares. Cuando la superficie activa está presente en forma de micropartículas, las mismas pueden adoptar cualquier forma, por ejemplo, forma de esfera, forma de losange, forma de haltera, forma de rombo, etc. Sin embargo, preferiblemente son esféricas con un diámetro de 0,5 a 500 \mum, preferiblemente de 1 a 300 \mum, mucho más preferiblemente de 1 a 250 \mum. Preferiblemente, las micropartículas son porosas y poseen de este modo una mayor superficie.
De acuerdo con la invención, el plástico comprende al menos el elemento estructural (A)
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2
Este elemento estructural es, a modo de ejemplo, parte de un polímero de la fórmula general (I)
3
en la que R se refiere a un resto alquilo o arilo o un átomo de hidrógeno, y n tiene el valor de 10 a 10.000. El resto X es facultativo y se refiere a O, En o -CH_{2}.
El resto alquilo puede ser cualquier resto alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada, en un caso dado, sustituido. Se prefiere un resto alquilo C_{1-8} de cadena lineal o ramificada, en un caso dado sustituido como, a modo de ejemplo, un grupo metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, s-butilo o t-butilo. Los ejemplos de sustituyentes en un caso dado presentes comprenden uno o varios átomo(s) de halógeno, por ejemplo, átomos de flúor, cloro, bromo o yodo o grupo(s) hidroxilo, restos alquilo como restos alquilo C_{1-6} o restos alcoxi como, por ejemplo, restos alcoxi C_{1-6}, por ejemplo, alcoxi C_{1-3}, como grupos metoxi o etoxi o grupos tiol como, a modo de ejemplo, grupos alquiltiol C_{1-6}, por ejemplo, grupos alquiltio C_{1-3}, como grupos metiltio o etiltio. El resto arilo puede ser un resto arilo monocíclico o bicíclico, en un caso dado sustituido, que puede contener, en un caso dado, uno o varios heteroátomos. Son ejemplos de esto los restos fenilo, 1- o 2-naftilo, indenilo o isoindenilo. En un caso dado, los restos arilo también pueden estar sustituidos. Son ejemplos de restos arilo que contienen heteroátomos un resto heteroarilo C_{1-9}, a modo de ejemplo, un resto heteroarilo C_{3-9}, en un caso dado, sustituido, que contiene, a modo de ejemplo, 1, 2, 3 o varios heteroátomos seleccionados entre átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno. Los restos heteroarilo monocíclicos comprenden, a modo de ejemplo, grupos pirolilo, furilo, tienilo, imidazolilo, N-metilimidazolilo, N-etilimidazolilo, oxazolilo, disoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, pirazolilo, 1,2,3-triazolilo, benzofurilo, isobenzofurilo, benzotienilo, isobenzotienilo, indolilo, isoindolilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, quinazolinilo, naftilpiridinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrazolilo.
La tacticidad del polímero obtenido de este modo puede ser aleatoria, a modo de ejemplo, isotáctica, hetertáctica o sindiotáctica.
El enlazador contiene al menos un elemento estructural (B) capaz de formar enlaces por puentes de hidrógeno. Este elemento estructural puede ser cualquier átomo de hidrógeno polar como se presenta, a modo de ejemplo, en enlaces OH, SH, NH, o PH. El enlazador puede tener cualquier longitud de cadena. Preferiblemente, el enlazador es un (poli)alquilenglicol, particularmente preferiblemente polietilenglicol. Además, preferiblemente es una (poli)alquilenimina, una (poli)alquilenamina, un (poli)alquilensulfuro o una polioxazilina. El enlazador también puede contener varios de los elementos estructurales (B).
El acoplamiento de las sustancias al enlazador se produce de acuerdo con métodos conocidos. Para ello se pueden usar derivados reactivos como, a modo de ejemplo, succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, nitrofenilcarbonato, tresilato, epóxidos, aldehídos, isocianatos, maleimidas y similares. En este contexto se hace referencia al catalogo de la empresa Shearwater Polymers, Inc., 2307 Spring Branch Rd., Huntsville, AL 35801 (EE. UU.).
El plástico es preferiblemente un polimetacrilato, preferiblemente un plástico polialquil(met)acrilato (PAMA) o un polímero mixto de polialquil(met)acrilato. Particularmente preferiblemente, el plástico es polimetil(met)acrilato (PMMA), polietil(met)acrilato (PEMA), polipropil(met)acrilato, polibutil(met)acrilato (PBMA), polipentil(met)acrilato, acetato de polivinilo, policiclohexil(met)acrilato o polifenil(met)acrilato.
También se prefieren mezclas de cualquier cantidad de los polialquil(met)acrilatos que se han mencionado anteriormente y uno o varios componentes poliméricos adicionales, a modo de ejemplo, poliestireno, poliacrinitrilo, policarbonato o polisulfona. Son ejemplos de mezclas preferidas polimetilmetacrilato + poliestireno, polimetilmetacrilato + poliacrilnitrilo + metacrilato, polimetilmetacrilato + poliacrilnitrilo + metalilsulfonato, polimetilmetacrilato + polietilenpolivinilalcohol, polimetilmetacrilato + poliamida, polimetilmetacrilato + polisulfona. Preferiblemente, la cantidad de polimetilmetcrilato en los polímeros mixtos comprende al menos un 20%, más preferiblemente un 40% o un 60% del plástico se compone de polimetilmetacrilato. También se pueden producir polímeros mixtos a partir de los componentes poliméricos mencionados a modo ilustrativo.
Estos polímeros mixtos se pueden producir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En el polímero se pueden introducir componentes adicionales, por ejemplo, compuestos inorgánicos como, por ejemplo, compuestos de hierro o hierro magnéticos o paramagnéticos o sustancias con actividad superficial como, por ejemplo, compuestos que liberan NO como, por ejemplo, nitroprusiato sódico. Además también es posible una dotación con átomos de metal como, por ejemplo, níquel, cinc, gadolinio, etc. De este modo, el sistema se puede adaptar de forma dirigida a los respectivos requerimientos analíticos, terapéuticos o diagnósticos.
Si el sistema de interacción se utiliza con propósitos terapéuticos o diagnósticos se tienen que tener en cuenta que el plástico sea fisiológicamente compatible, es decir, que no establezca interacciones desventajosas con los líquidos fisiológicos. Si el sistema de interacción se utiliza en el ámbito de los alimentos, cosméticos u artículos de consumo (término legal de la ley alemana LBFG) también se tiene que tener en cuenta una correspondiente compatibilidad. Además, el sistema de interacción también se puede empaquetar en medios de transporte adecuados, por ejemplo, microsomas, liposomas, nanopartículas, etc. para introducirlo de forma más sencilla en el organismo.
Al enlazador se puede acoplar cualquier sustancia farmacológicamente activa o fisiológicamente activa. Las sustancias acopladas pueden ser iguales o diferentes. También se pueden acoplar varias sustancias de diferente tipo a diferentes enlazadores. Son ejemplos de esto proteínas, ácidos nucleicos, sustancias de señalización celulares, compañeros de afinidad biológica o fisiológica como, por ejemplo, ADN/proteína de unión a ADN, ADN/ADN complementario, ARN/ARN complementario, antígeno/anticuerpo, estreptavidina/biotina, Strep-TAG/péptido artificial, lectina/hidrato de carbono o marcador para una sustancia biológica/sustancia biológica. De forma particularmente preferida, la proteína es una enzima, por ejemplo, una lipasa, una esterasa, una transferasa, un antígeno, un anticuerpo, un marcador tumoral, un antígeno de superficie, un ligando, un receptor, un fragmento celular con actividad superficial de bacterias o virus o un mensajero inmune como por ejemplo citocinas, interleucinas, factores de crecimiento, factores formadores de colonias, factores de necrosis tumoral, proteínas inductoras de apoptosis o sus anticuerpos específicos o compuestos terapéuticos. El marcador es, a modo de ejemplo, una sustancia fluorescente o quimioluminiscente, un EST (Expression Sequence Tag; código de secuencia de expresión) o una enzima. La sustancia farmacológicamente activa es, a modo de ejemplo, un inhibidor de la coagulación, una enzima con actividad metabólica o un principio activo sintético como, a modo de ejemplo, un antibiótico, un agente antitumoral o un inhibidor enzimático. Adicionalmente también se pueden acoplar sustancias que reaccionan con iones inorgánicos como, a modo de ejemplo, níquel, cinc, gadolinio, lantano u oro. Son ejemplos de esto los correspondientes formadores de complejos. Las sustancias acopladas a un enlazador poseen adicionalmente la ventaja de que es posible su excreción del organismo.
Un sistema de interacción de este tipo permite ahora una pluralidad de posibilidades de aplicación. Es particularmente adecuado para la presentación de sustancias acopladas al enlazador en un líquido, donde la sustancia diana correspondiente se une, se disocia o se modifica de otro modo, o para la retirada de sustancias acopladas al enlazador de un líquido. Un ámbito de aplicación preferido es la comprobación del diagnóstico o la terapia de enfermedades metabólicas, alteraciones de la coagulación, infecciones virales, bacterianas, micóticas o parasitarias o enfermedades malignas. A partir de tales sistemas de interacción se pueden componer kits listos para usar para usos especiales y dispositivos en cubiertas correspondientes y con un equipamiento correspondientemente complejo.
A pesar de que hasta ahora no se ha investigado el principio molecular de la interacción entre el elemento estructural (A) y el enlazador, a partir de la interacción de polialquilenglicol y polialquil(met)acrilato se propone el siguiente mecanismo hipotético de unión, el cual, sin embargo, no pretende limitar la invención en ningún modo. El oxígeno del carbonilo en las cadenas laterales de poli(met)acrilato tiene carga fuertemente negativa debido a la distribución de carga de las estructuras de las cadenas de hidrocarburo. Este oxígeno, por tanto, puede establecer los correspondientes enlaces por puente de hidrógeno o interacciones electrónicas con la cadena de polialquilenglicol. Las interacciones también se pueden referir al oxigeno del polialquilenglicol, que está cargado ligeramente positivo por la configuración -C-O-C-. Con una gran probabilidad se produce una interacción entre estas dos especies de oxígeno con diferente carga en el poli(met)acrilato y el polialquilenglicol, de forma que la cadena de PEG se une a lo largo de un cierto tramo de varios elementos de cadena C-C-O-C-C-O a la superficie de PMMA.
En este contexto se hace referencia al espectro de IR adjunto de la Figura 1. Esta figura muestra el espectro de IR de polimetilmetacrilato, polietilenglicol (5000) y partículas de interacción PMMA-PEG.
A partir de la figura representada se puede observar que mediante una adición ponderada a partir de los espectros de PMMA y PEG no es posible una identidad con los espectros individuales. Es particularmente notable la disminución de la intensidad de las vibraciones de valencia simétrica de CH_{2} y CH_{3} por debajo de 2900 cm^{-1} con respecto al PMMA libre. Esto indica que por la adsorción de PEG y PMMA se ha forzado una nueva conformación determinada. Como la interacción más probable a partir de la interacción de PMMA y PEG se asumen:
1. Grupo éster (PMMA)..H-O-H..éter (PEG)
2. Grupo éster (PMMA)..H-C (grupo metileno, PEG)
3. Grupo carboxilo (PMMA) C-O-H..grupo éter (PEG) (pocos grupos)
4. Grupo terminal (PEG) C-O-H..grupo éster (PMMA).
Estas asignaciones están conformes con todas las vibraciones de valencia de OH que se presentan en los complejos de PEG-PMMA.
El principio observado de la sorprendente unión de sustancias acopladas a un enlazador con un elemento estructural capaz de la formación de enlaces por puentes de hidrógeno a superficies con el elemento estructural (A) permite ahora diferentes posibilidades prácticas de aplicación. Por un lado, tales superficies se pueden utilizar como antídoto funcional de sustancias activas especiales. Por otro lado, tales superficies se pueden recubrir de forma muy sencilla con sustancias activas acopladas y usarse, por ejemplo, para la purificación de sangre in vivo o el tratamiento de plasma. Sin embargo, es de esencial importancia que este principio de interacción se pueda preparar de forma separada (esterilización, filtración a esterilidad, entre otros) y solamente se agrupe después. Estas estructuras superficiales pueden ser componentes de un sistema terapéutico extracorpóreo. Adicionalmente, las sustancias activas acopladas, después de su reacción en el organismo, preferiblemente en la sangre, se pueden volver a retirar del organismo de forma cuidadosa con ayuda de una superficie de este tipo. De este modo se pueden antagonizar, por ejemplo, niveles sanguíneos peligrosamente elevados de PEG-hirudina, sin embargo, también anticuerpos pegilados o sustancias activas proteicas pegiladas que se han usado durante un tiempo definido en la sangre, pueden volver a retirarse cuantitativamente (uso de sustancia activa con limitación temporal). Además, por ejemplo, se pueden tratar localmente con anticoagulante dializadores capilares de PMMA mediante hirudina acoplada a polietilenglicol u otras antitrombinas directas (por ejemplo, argatrobán) (los pacientes no necesitan entonces ningún anticoagulante sistémico), sin embargo, también mediante el recubrimiento de los correspondientes dializadores capilares con antígenos PEG o anticuerpos PEG o sustancias activas PEG se pueden capacitar para la interacción específica con componentes sanguíneos o productos metabólicos tóxicos o desencadenantes de enfermedad o promotores de enfermedad.
Adicionalmente, el plástico capaz de interactuar también puede ser parte de superficies de placas de microtitulación, cubetas, lentes de contacto. Adicionalmente también es posible usar el enlazador como tal sin sustancia acoplada para la saturación de sitios de unión correspondientes libres en el plástico capaz de interactuar.
Para un gran número de medicamentos sería ventajoso que actuaran exclusivamente en la circulación sanguínea. Para esto, el peso molecular de las sustancias se debería aumentar de tal forma que no pudieran alcanzar los espacios intersticiales en el exterior de los vasos sanguíneos. Sin embargo, estas sustancias de peso molecular aumentado no son utilizables en la medicina práctica, porque entonces ya no es posible la eliminación de estas sustancias del cuerpo a través de las vías de excreción renal. El "umbral renal" está en un intervalo de peso molecular que se sitúa por debajo del tamaño de esas sustancias, que evita una distribución fuera de la circulación sanguínea. La acción exclusiva de medicamentos en la circulación sanguínea es por tanto un problema importante que hasta ahora no se ha resuelto. Solamente la posibilidad de la extracción de sustancias activas acopladas a PEG (estado de la técnica) en un intervalo de peso molecular definido con ayuda de, por ejemplo, estructuras de superficie de polimetilmetacrilato hacen posible usar por primera vez tales medicamentos en la medicina práctica.
Preferiblemente, la superficie activa posee una estructura de superficie aumentada determinada, por ejemplo, poros que se pueden producir mediante el proceso de hilado. En este documento, al polimerizado calentado se añaden, por ejemplo, "partes de sustancia extraña", por ejemplo, glicerina, que no se puede mezclar con los polímeros líquidos calentados. Se producen gotas o sitios de alteración en el hilado de fibra hueca, que se pueden extraer después por lavado con disolventes adecuados, bien agua o bien sustancias orgánicas, de la estructura de membrana. De este modo se producen las porosidades ventajosas de las membranas. Para las micro- y macropartículas que son adecuadas para una forma de uso adicional, esta porosidad, la gran superficie "interna" de las partículas, se genera de forma muy similar. También en este caso generan estructuras tridimensionales por la introducción de estructuras extrañas, por ejemplo, glicerina, y después se eliminan las correspondientes sustancias introducidas de acuerdo con métodos de polimerización por gota o pulverización conocidos. La estructura polimérica se relaja y modifica de este modo de forma característica. Esta porosidad, la "superficie interna" de las membranas o partículas, es de esencial importancia para la unión de sustancias acopladas.
Las figuras adjuntas explican la invención con más detalle.
La Figura 1 muestra espectros de IR de polimetilmetacrilato, polietilenglicol (5000) y partículas de interacción de PMMA-PEG.
La Figura 2 muestra la unión de polietilenglicol_{10000}-hirudina a micropartículas de diferentes polialquilmetacrilatos.
La Figura 3 muestra la unión de trombina a un dializador de PMMA cargado con inhibidor de trombina-PEG_{10kDa} sintético durante circulaciones repetidas de soluciones de trombina. A partir de esta figura se puede observar que la trombina se une durante la recirculación al inhibidor de trombina acoplado y desaparece de forma correspondientemente rápida de la solución de recirculación.
La Figura 4 muestra la unión superficial de un inhibidor de trombina sintético de bajo peso molecular que se ha producido con polietilenglicol (10 kDa) de acuerdo con las instrucciones de W. Stüber et al., (Peptide Research 8 (2) 1995, págs. 78-85) como inhibidor pegilado. El principio de inhibidor de trombina activo es la sustancia Mtr-Asn-D-Adf-Pip, que se ha observado en anteriores investigaciones (Dickneite G. et al. Trombosis Research 77, págs. 537-568) como inhibidor de alta especificidad y altamente eficaz de la trombina.
La invención se explicará a continuación con más detalle mediante sustancias activas acopladas a polialquilenglicol en superficies de poli(met)acrilato.
1) Sistemas de tubos
Los dializadores de polimetilmetacrilato disponibles en el mercado, por ejemplo, de la empresa Toray, preferiblemente sistemas de High-Flux, por ejemplo, de la serie BK, o dializadores de Low-Flux, por ejemplo, de la Serie B2, se abren en los dos lados terminales, y se aíslan los haces de tubos capilares (n=60). Después del corte de tres haces de fibras hasta de 12,7 cm de longitud, los mismos se introducen en un tubo de polietileno de 1,4 cm de diámetro. Entre los haces de dializador capilar que sobresalen aproximadamente medio centímetro por los dos lados terminales abiertos se introduce a presión silicona (A-Sil 2002) de tal forma que la masa vertida de 8-10 mm de grosor genera un cierre completamente impermeable de los extremos abiertos. Después de la polimerización y el endurecimiento de la masa vertida se cortan los tubos capilares que sobresalen de forma enrasada con un bisturí afilado, y los dos extremos del sistema de tubos se unen respectivamente con material de catéter de polietileno, por lo que se posibilita un lavado accionado por bomba correspondiente de los tramos capilares. Los sistemas se llenan completamente y sin burbujas de aire con solución salina. De este modo se tienen que almacenar y usar estos sistemas de tubos capilares a 4ºC durante semanas.
2) Filtros sanguíneos
En material de tubo de polietileno de 0,7 cm de diámetro con pared más gruesa se troquelan discos de material de filtro de gases sanguíneos de sistemas de infusión y se adhieren los mismos con una masa adhesiva termoplástica sobre la abertura inferior de trozos de tubo de 3 cm de longitud. Los cartuchos se llenan con partículas de PMMA porosas con el tamaño de clasificación preferido entre 80 y 120 \mum e igualmente se adhiere sobre la abertura superior el material de filtración de sangre. Después se aplican de forma tensa tubos de caucho de silicona elásticos y se unen con el material mediante adhesión termoplástica y se conectan a tubos de soporte. De acuerdo con la misma disposición también se pueden construir microfiltros sanguíneos que se componen de tubos de PE de 0,2 mm de diámetro y 2 cm de longitud. El volumen que se tiene que llenar con micropartículas, entonces, se reduce de este modo hasta una centésima parte. Estos sistemas de tubos también son adecuados para un uso intravascular debido al tamaño y el rendimiento
superficial.
Para el uso, estos módulos fabricados microcapilares o de microcolumna se pueden esterilizar mediante OET o rayos \gamma. También es posible una esterilización por vapor para este material. Las sustancias activas acopladas a polialquilenglicol solamente se aplican justo antes del uso del correspondiente sistema sobre la superficie de las estructuras de poli(met)acrilato. El procedimiento es del siguiente modo: los módulos de soporte de poli(met)acrilato se lavan antes del uso durante aproximadamente 10 min con solución salina fisiológica estéril para extraer por lavado productos tóxicos que se han producido durante el proceso de producción o esterilización, de los sistemas (técnica convencional en todos los sistemas de terapia externa como hemodializadores u oxigenadores en medicina). Después de este proceso de purificación se aplican las sustancias que se tienen que aplicar, por ejemplo, acopladas a PEG, en un módulo de recirculación sobre la superficie de los módulos imprimando los sistemas durante 5-10 min con la solución de sustancia activa-PEG. Es posible aplicar, debido a la gran capacidad de unión, varias sustancias activas diferentes acopladas a PEG de forma sucesiva o mezcladas entre sí sobre la estructura de poli(met)acrilato. En los ensayos se pudo aclarar sin ninguna duda que no existe comportamiento competitivo de las sustancias entre sí debido a estructuras químicas particulares con respecto a la superficie de poli(met)acrilato. Después de finalizar el proceso de imprimación, los filtros se vuelven a lavar con solución salina durante 1-2 min, para retirar del sistema restos de las sustancias activas de PEG no unidas completamente. Después, el sistema terapéutico externo se acopla con ayuda de la técnica con una o dos agujas de forma veno-venosa o arterio-venosa. La aplicación pasiva veno-venosa tiene la ventaja de que con ayuda de las bombas sanguíneas en miniatura que también se introducen en la circulación extracorpórea se puede garantizar un control exacto del flujo sanguíneo por el sistema. La eficacia de la "captación" de sustrato específica se comprueba mediante la desaparición de los patógenos diana. Para esto existen los correspondientes métodos de comprobación para casi cualquier sustancia activa usada.
Los kits de uso los de sistemas terapéuticos externos son tales que están disponibles diferentes tamaños de filtros sanguíneos para adaptar los mismos a la cantidad necesaria de sustancia imprimada. Para esto existe una medida de cálculo que se conoce a partir de la comprobación preclínica de tales sistemas. El médico a cargo del caso puede componer a modo de un "principio modular", a partir de una reserva de las más diversas sustancias activas pegiladas y los más diversos filtros sanguíneos, el principio terapéutico requerido de forma individual por su paciente con respecto al componente terapéutico que se tiene que utilizar y el tamaño del sistema. Tales kits contienen, en un caso dado, reactivos adecuados, soluciones tampón, matraces de reacción y similares. El kit también puede presentarse en un envase adecuado.
Tales kits de uso se pueden estructurar del mismo modo también como sistemas de purificación bioquímicos. El tamaño del módulo se adapta en el correspondiente uso preparativo. Para los enfoques preparativos bioquímicos, para ensayos in vitro, no solamente se puede usar el método de columna, sino también el método discontinuo. Las correspondientes micro- o macropartículas se mezclan de forma intensa en un volumen "batch" y después de la imprimación con las sustancias activas polialquiladas y la centrifugación del sobrenadante, estas partículas cargadas se lavan dos veces con solución salina y se mezclan después con la correspondiente solución de preparación. Por la captación del compañero de reacción "adecuado" se puede realizar después una separación entre antígenos y anticuerpos o sustancias que interaccionan químicamente, y de este modo es posible, por ejemplo, una purificación por afinidad preparativa con prácticamente un 100% de eficacia.
A continuación se indica una lista ilustrativa de posibilidades de aplicación de los sistemas que se han mencionado anteriormente.
A) Retirada de sustancias de la sangre
1.
Para el uso de reacciones de antígeno-anticuerpo específicas, los anticuerpos presentes monoclonales o policlonales se acoplan con polietilenglicol y estos anticuerpos con PEG se aplican después sobre la superficie de PMMA. El reconocimiento lo más específico posible de los epítopos de la sustancia que se tiene que retirar es de gran importancia para la unión rápida y firme a la superficie preparada. De acuerdo con el método que se ha descrito anteriormente, los anticuerpos con PEG se impriman sobre el filtro sanguíneo del tamaño seleccionado, y por la adición de una antitrombina pegilada, por ejemplo, hirudina-PEG, se pretende respectivamente una anticoagulación local de los sistemas. La ventaja de la acción anticoagulante local con ayuda de antitrombinas pegiladas consiste sobre todo en que el paciente que se tiene que tratar no se tiene que anticoagular sistémicamente durante el tratamiento con los sistemas terapéuticos externos.
2.
Para el tratamiento de hemofilia con inhibidores, una grave enfermedad autoinmune, se acopla el factor VIII humano (globulina antihemofílica) con los métodos conocidos a polietilenglicol y después se imprime sobre un soporte de polialquilacrilato de tamaño adecuado. Los módulos de hemofilia con inhibidores producidos de acuerdo con este método se usan a intervalos regulares en los pacientes afectados como sistema terapéutico externo. Los intervalos tumorales de este tratamiento se orientan de acuerdo con el "consumo" medible de factor VIII en el paciente. El nivel de factor VIII no debe caer por debajo del 25-30% del valor normal. Entre los intervalos de aplicación, los pacientes carecen de riesgo de hemorragia o tendencia a hemorragia, de manera que esta forma de terapia se puede denominar una terapia causal.
3.
Posibilidades de tratamiento antimicrobiano: Con los métodos de la medicina molecular es posible producir anticuerpos monoclonales o policlonales contra prácticamente cualquier virus que tenga envuelta proteica, contra bacterias, sin embargo, también contra hongos. Estos anticuerpos dirigidos contra proteínas microbianas específicas se pueden imprimir después del acoplamiento con polietilenglicol del tamaño adecuado (preferiblemente de 5-10 kDa) sobre el soporte de la sustancia activa de polialquilacrilato. Por el tratamiento de los pacientes con tales sistemas terapéuticos externos es posible una retirada de los gérmenes desencadenantes y promotores de enfermedad de la circulación sanguínea. Especialmente, este método es excelentemente adecuado para tratar, por ejemplo, incluso malaria. Por la utilización cíclica de soportes específicos de sustancia activa se puede interrumpir la enfermedad y se puede conseguir una curación rápida del paciente.
4.
Producción de sistemas de hemodiálisis y hemofiltración anticoagulantes localmente: con el uso de hemodializadores o módulos de hemofiltración de polimetilmetacrilato (productos de la empresa Toray, Japón), antes de la utilización, después del lavado de los sistemas, estos módulos se tratan con solución de polietilenglicol-hirudina. Por la recirculación de hirudina-PEG se puede conseguir un efecto anticoagulante en la superficie de la membrana. Los sistemas se tienen que tratar dependiendo de la duración de la aplicación con cantidades variables de hirudina-PEG (5-50 mg).
5.
Producción de sistemas de tubos sanguíneos anticoagulados localmente: por el uso de sistemas de tubos sanguíneos habituales (PS, PE, PP, entre otros), durante cuya producción se añadió al menos un 20%, mejor un 50% de polialquilmetacrilato, preferiblemente polibutilmetacrilato, es posible una imprimación con hirudina-PEG o inhibidores de trombina sintéticos acoplados a PEG. De este modo también es posible una anticoagulación local en todo el recorrido de los sistemas de tubos sanguíneos, tanto arterial como venoso.
B) Aplicación de enzimas que influyen en determinados componentes sanguíneos o proteínas
En este caso se consideran, por ejemplo, las siguientes sustancias: 1. Enzimas que se incluyen directamente o indirectamente en mecanismos de control del cuerpo, por ejemplo, que activan o inhiben factores especiales de la coagulación. Por el acoplamiento a PEG de, por ejemplo, Protac, una enzima de veneno de serpiente que activa con alta especificidad la proteína Con, se podría ofrecer una vía completamente nueva de la profilaxis contra trombosis a largo plazo sin tendencia a hemorragia u otros efectos secundarios en vista de las sustancias usadas terapéuticamente hasta ahora. La enzima Protac activa la proteína C hasta la proteína C_{A}, que interviene en la coagulación por inhibición de los factores activados V y VIII. Ambos factores se activan por trombina y tienen un mecanismo de retroalimentación positivo sobre la propia activación de trombina, de forma que a partir de esto se configura una circulación de potenciación que se puede interrumpir bruscamente por la inhibición de estos dos factores aceleradores (son equivalentes clínicos estados de carencia de proteína C con enfermedades tromboembólicas graves). Sin embargo, también enzimas reguladoras del nivel de glucosa sanguínea como la glucosa deshidrogenasa y otras enzimas podrían regular en la sangre modificaciones patológicas o fisiopatológicas desde el punto de vista de una enfermedad metabólica (hipercolesterolemia, hiperlipidemia, diabetes mellitus tipo II o determinadas enfermedades de almacenamiento). La influencia de trastornos metabólicos de origen endocrino es una posible forma de aplicación en este caso.
C) Aplicación de sustancias importantes para funciones vitales 1) Sangre artificial
También existe la posibilidad de proporcionar "glóbulos rojos" artificiales. Una hemoglobina-PEG que se obtiene, por ejemplo, a partir de sangre de bovino, está actualmente como "componente de sangre artificial" en el ensayo clínico ("oxiglobina"). Las hemoglobinas-PEG se deben aplicar sobre partículas de polimetilmetacrilato o polialquilmetacrilato paramagnéticas clasificadas por tamaño correspondientes y usarse después de forma correspondiente. De forma ideal, las partículas tienen el mismo peso específico que la sangre. Preferiblemente, por lo tanto, se usan copolímeros de polialquilmetacrilato-poliestireno en una proporción de mezcla de 50/50, más preferiblemente en una proporción de mezcla de 30/70. Para esto se imprimen, por ejemplo, 1 g de partículas de polimetilmetacrilato porosas monodispersas (o PMMA-poliestireno) (d = 6 \mum) con 250 mg de hemoglobina acoplada a PEG (por ejemplo, preparado de ensayo de la empresa Enzon). La indicación de peso se refiere a la parte de hemoglobina. Las partículas de polimetilmetacrilato usadas para esto (PMMA-poliestireno) se han preparado de forma especial introduciendo en el proceso de producción durante la polimerización Fe_{2}O_{3} en forma muy dispersa en la masa de polimerización. Estas partículas que contienen Fe_{2}O_{3} son paramagnéticas y se pueden volver a retirar de la circulación del modo que se ha descrito anteriormente. Tales partículas magnéticamente activas son adecuadas en una pluralidad de formas para un uso directo en la circulación en la sangre. Además de la hemoglobina-PEG que se ha descrito anteriormente, también se pueden unir donadores de NO (inhibición específica de la activación de las plaquetas), sin embargo, también compañeros de interacción específicas para células, preferiblemente células tumorales. Durante el tratamiento de tumores se puede realizar una "fijación" de las partículas que llevan sustancia activa antitumoral mediante campos magnéticos en la zona del tumor. Las partículas de hemoglobina tienen una gran función de unión a oxígeno y pueden asumir el transporte de oxígeno en toda la circulación sanguínea de forma similar como es la función de los glóbulos rojos. Por este motivo, estas micropartículas de hemoglobina son adecuadas para la medicina de catástrofes como sistemas universales portadores de oxígeno. Es de particular importancia que el transporte de oxígeno se reestablezca como la función vital alterada más esencial después de grandes pérdidas de sangre. Al final del tratamiento durante varios días, cuando el organismo afectado ha resintetizado los correspondientes glóbulos rojos, se pueden retirar las partículas de forma cuantitativa de la circulación con ayuda de sistemas de retención magnética. Estos sistemas de retención magnética son, por ejemplo, ETS microcapilares que están rodeados de un anillo de imán permanente. Las partículas magnéticas se retiran de la circulación por adhesión a las fibras huecas del ETS.
2) Factores de crecimiento celular
El principio básico descrito de la adhesión de sustancias activas sobre materiales poliméricos específicos también es adecuado para el recubrimiento de otras superficies de plástico, de separadores celulares o materiales de cultivo celular, en los que se consigue una mayor aceleración del crecimiento haciendo posible, por la adhesión de capas delgadas de micropartículas finas de PMMA, una aplicación de factores de crecimiento celular (por ejemplo, BMP-2 o BMP-4 pegilado). Sin embargo, esto también se puede utilizar para recubrir prótesis vasculares con factores de crecimiento de tal forma que células endoteliales colonizan el lado sanguíneo de las prótesis vasculares de forma muy rápida e intensa y provocan en este lugar una naturalización ("endotelialización") de la prótesis vascular. Por la dotación específica del lado tisular con el propósito del crecimiento de células de tejido conjuntivo y células de músculo liso, por ejemplo, por la aplicación del factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) también es posible una naturalización de todo el material de la prótesis. El recubrimiento del material de la prótesis articular con rBMP-2 o rBMP-4 pegilado, dos factores de crecimiento osteoblástico producidos de forma recombinante, o la adición por mezcla de micropartículas porosas de PAMA con rBMP-2 o rBMP-4 en cementos óseos, permite acortar en gran medida la fase de crecimiento. De este modo se consiguen resultados de fijación muy mejorados.
D) Técnicas de separación de micropartículas para virus y bacterias o sus productos metabólicos en donaciones de sangre y plasma
Por el tratamiento del plasma con anticuerpos de PMMA-PEG específicos contra proteínas de la envuelta o el ADN de virus es posible purificar de forma muy cuidadosa muestras humanas de plasma. Una retirada cuantitativa es posible sobre todo para virus con proteínas específicas (proteína E1 y E2 del virus de la Hepatitis B y proteínas del virus del SIDA). Esto puede suceder tanto en el método discontinuo como en el de columna.
E) Uso de partículas de PMMA-PEG para la retirada de sustancias no deseadas de alimentos, a modo de ejemplo, para la desalcoholización de bebidas alcohólicas como cerveza, vino, etc., presentación de lipasas o enzimas especiales que degradan el exceso de grasas alimenticias hasta derivados no reabsorbibles o unen compuestos correspondientes a su superficie, retirada de colesterol, retirada dirigida de determinados componentes proteicos en determinadas enfermedades metabólicas (por ejemplo, gluten en enfermedad celiaca), retirada de carbohidratos especiales en diabetes, etc.). Sobre esta base se pueden producir alimentos de diseño y productos dietéticos para determinadas particularidades de alimentación, añadiendo al producto micropartículas de acuerdo con la invención recubiertas de forma correspondiente, o tratando el producto anteriormente de forma correspondiente. También es posible ingerir las micropartículas correspondientes de forma separada antes, durante y después de degustar las correspondientes comidas. Con este propósito, las micropartículas se pueden confeccionar en comprimidos o cápsulas resistentes a jugos gástricos o jugos intestinales.
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F) Instalación de microfiltros sanguíneos en la circulación sanguínea con ayuda de la denominada técnica de "filtros de tipo paraguas" para venas, como ya se usa actualmente en trombosis profundas de venas femoral el iliaca mediante radiología invasiva. Para esto se abre un denominado paraguas de cava, que tiene la forma de una jaula de alambre, y se instala en la vena cava para impedir que masas trombóticas de mayor tamaño fluyan hasta la circulación pulmonar. Esta técnica de paraguas de cava también se podría usar como sujeción o material de soporte para microfiltros sanguíneos. Se usan los mismos materiales de recubrimiento que se han descrito anteriormente. Sin embargo, un sistema correspondiente en este caso debe tener más bien la forma de un filtro sanguíneo plano con la mayor superficie de intercambio posible.
G) Uso oral de soportes de sustancia activa particulados
En este caso se obtienen dos posibilidades diferentes:
1) Sustitución de funciones de digestión alteradas
De forma similar a los sistemas de suministro que se encuentran en desarrollo para enzimas digestivas también se pueden usar determinadas partículas de acuerdo con la invención que adquieren un recubrimiento permanente de enzimas digestivas. Estas partículas pueden asumir funciones digestivas esenciales durante su paso por el tracto gastrointestinal. Es posible una instilación permanente de sondas intestinales que fomentan la digestión cuando en una estructura correspondiente fibrilar o similar se usan las enzimas en el intestino delgado sobre una matriz determinada de polialquilacrilato. Una sonda gástrica permanente en forma de una jaula de plástico estructurada se equipa, por ejemplo, con estructuras filamentosas de PMMA sobre las que se aplican a lo largo de un tramo de 30-50 cm las enzimas de forma permanente mediante el acoplamiento PMMA-PEG. Se introducen con el bolo alimenticio en el intestino delgado y por un extremo todavía tienen contacto fijo con la sujeción gástrica. Las enzimas correspondientes podrían imitar durante un tiempo prolongado la función digestiva en el tracto gastrointestinal, empiezan a actuar cuando los correspondientes componentes del alimento pasan por las estructuras fibrilares.
2)
Soportes enzimáticos corpusculares o particulados que metabolizan partes especiales o determinados componentes del alimento, con el objetivo de que los mismos se modifiquen hasta un derivado químico no reabsorbible. Para esto son adecuadas enzimas vegetales que son capaces de modificar colesterol y otros compuestos de los alimentos ricos en grasas y energía. También es una vía posible una unión de colesterol y ácidos biliares que reabsorben grasas a correspondientes compañeros de unión en la superficie de estas partículas gastrointestinales. Para un uso especial también son adecuadas partículas de acuerdo con la invención con elevada concentración de alcohol deshidrogenasa para degradar cantidades no deseadas de alcohol incluso en el tracto gastrointestinal.
Un uso especial es, a modo de ejemplo, el uso de anticuerpos monoclonales pegilados contra el factor de necrosis tumoral (TNF). El anticuerpo monoclonal contra el factor de necrosis tumoral (MAK-195) es un preparado de ensayo de la empresa Knoll y actualmente se está evaluando con respecto a su eficacia clínica en estudios clínicos con pacientes de choque. Este anticuerpo monoclonal se puede acoplar sin problemas a PEG y aplicar sobre una estructura correspondiente de PMMA. De este modo, el anticuerpo monoclonal está unido a fase sólida y se une con alta especificidad a un epítopo del factor de necrosis tumoral. De este modo se pueden disminuir niveles de TNF elevados y perjudiciales fisiopatológicamente para la evolución posterior de una reacción de choque. De forma correspondiente se pueden acoplar anticuerpos monoclonales o policlonales contra proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP). Esta proteína sirve para el transporte de productos metabólicos bacterianos de los lipopolisacáridos (endotoxinas, lípido A) en la sangre y su presentación a las células. Si se disminuye el nivel de la proteína de unión a lipopolisacárido, de este modo se puede bloquear completamente la absorción de endotoxinas desde el tracto gastrointestinal, sin embargo, también de focos sépticos.
Además, también es posible, a modo de ejemplo, pegilar fracciones de globulina \gamma humana específicas y aplicarlas como recubrimientos sobre la membrana de PMMA para inhibir directamente las bacterias o los virus y retirarlos del organismo mediante el sistema terapéutico extracorporal temporal.
Adicionalmente también se pueden usar inhibidores para factores de coagulación activados, por ejemplo, el TFPI recombinante, un inhibidor natural del complejo de factor tisular-factor VII, el mecanismo más importante de inicio de la coagulación sanguínea. Los mismos se pueden unir sobre la membrana en forma correspondientemente pegilada para inhibir de este modo completamente la coagulación sanguínea en los primeros mecanismos de activación sin influir de este modo sobre el potencial normal de coagulación del organismo. En principio se puede modificar cualquier mecanismo patológico del organismo que utilice la vía sanguínea para su transmisión de señal mediante un sistema terapéutico extracorpóreo de este tipo.
La capacidad de unión de tales dializadores capilares dotados en la superficie es sorprendentemente grande; se puede unir hasta 1 g de estructuras pegiladas sobre 1 m^{2} de superficie. Con ayuda de ensayos de lavado se pudo demostrar sin duda que la unión que se puede explicar físicoquímicamente entre la sustancia activa pegilada y la membrana de PAMA es muy estable y no es posible un desprendimiento de la membrana por un lavado con solución salina ni con lavado con plasma o con sangre entera.
A partir de la inmunología molecular se conoce una serie de antígenos tumorales específicos en superficies celulares de células tumorales, para los que también están disponibles con propósitos diagnósticos anticuerpos correspondientes para ensayos in vitro. Sin embargo, sus estructuras de proteína extraña impiden un uso en pacientes. De acuerdo con la invención, ahora estos anticuerpos unidos a enlazadores-PEG en la superficie de una membrana de PMMA, pueden realizar una interacción específica con células tumorales de la sangre y retirar las mismas de forma similar a la hemofiltración específicamente de la circulación. De este modo se proporciona por primera vez una disposición con la que es posible, con el material de superficie presente, que es biocompatible y está autorizado, una interacción específica en la sangre entre células o partes de células del organismo y compuestos específicos unidos a fase sólida.
Los sistemas de interacción de acuerdo con la invención se pueden usar para muchos usos terapéuticos adicionales, particularmente para la purificación de plasma in vivo. A modo de ejemplo se pueden utilizar membranas de ultrafiltración de tipo PMMA sobre las que se aplican enzimas especiales acopladas a PEG para la purificación en pacientes con enfermedad renal. Adicionalmente, por la aplicación de ureasa acoplada a PEG sobre membranas de PMMA se pueden disminuir valores aumentados de urea en sangre o, por la aplicación de enzimas metabolizantes de creatinina acopladas a PEG, se puede provocar una disminución de otros productos de nitrógeno que se eliminan por vía urinaria.
Se prefiere el uso de los sistemas de interacción de acuerdo con la invención, preferiblemente de membranas de PMMA en dializadores capilares. El único fabricante de dializadores capilares de PMMA es la empresa Toray, Japón. Antes de su uso en el ser humano, los módulos del dializador capilar se lavan en el lado del dializado y en el lado de la sangre de forma intensa, en el lado de la sangre con solución salina fisiológica, en el lado del dializado con líquido para dializado (solución salina) para eliminar por lavado productos y sustancias tóxicas que se han puesto en contacto con el sistema durante el proceso de producción, del dializador capilar. Al final de este proceso de lavado continuo, en el que se desecha el líquido de lavado a ambos lados, se cierra el lado del dializado por tapón ciego para la preparación del sistema terapéutico externo; en el lado de la sangre se conecta una recirculación, donde en la muestra de aproximadamente 200 ml está disuelta la sustancia de aplicación pegilada. Por un proceso sencillo de recirculación, en el que en la salida del dializador por un bomba de rodillos se vuelve a bombear la solución al depósito de solución, se recubre la membrana en el intervalo de 5-10 minutos con la sustancia pegilada. Las membranas de PMMA asimilan, independientemente de su límite (cutoff) (número de medida del tamaño de los poros en la membrana) hasta
200 mg de la sustancia que se tiene que aplicar (= 1 g de la sustancia activa pegilada) por m^{2} de superficie capilar. Es importante que los sitios de unión correspondientes sobre la membrana de PMMA estén ocupados completamente por las sustancias activas pegiladas. Si solamente se tienen que aplicar cantidades menores de estas sustancias activas, al final del proceso de lavado se debería realizar un lavado posterior con solución salina PEG para saturar todos los sitios de unión de PEG de la membrana. De este modo se garantiza que ya no se produzca un recubrimiento adicional con proteínas plasmáticas de la sangre en los sitios de unión y de este modo no suceda ninguna interacción entre proteínas plasmáticas y las sustancias activas presentadas (imprimación).
La invención se describe a continuación con más detalle mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Producción de anticuerpos de cabra de hirudina modificada con PEG 1) Preparación de SC-PEG
Método de acuerdo con T. Miron y M. Wilchek
(Bibl.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569)
Materiales:
Acetona
Sin agua
Dietiléter
Sin agua
1,4-dioxano
Sin agua
Tamiz molecular
4A, perlas tamiz 8-12
Tampón fosfato
0,05 mol/l; pH 7,0
Polietilenglicol 6000
PM 5000-7000; 1 mmol
N,N'-disuccinimidilcarbonato
5 mmol
4-(dimetilamino)piridina
5 mmol
\global\parskip1.000000\baselineskip
Realización:
En 25 ml de dioxano sin agua (por tamiz molecular) se disuelve PEG 1 mmol en baño de agua caliente. Después del enfriamiento hasta temperatura ambiente se añade el N,N'-disuccinimidilcarbonato, disuelto en 10 ml de acetona. A continuación se añaden con agitación lentamente los 10 ml de acetona con 4-(dimetilamino)piridina 5 mmol. A temperatura ambiente, la mezcla se activa durante 6 horas (agitador magnético). El PEG activado se separa por precipitación en esta solución directamente con dietiléter. Por una frita G3 se filtra por succión el precipitado blanco voluminoso. La retirada completa del éter se realiza en el desecador evacuado. Almacenamiento: en seco a 4ºC.
Eficacia: 85% (con respecto a PEG)
\vskip1.000000\baselineskip
2) Acoplamiento de SC-PEG a proteína a) Preparación de hirudina modificada con PEG
Materiales:
Tampón borato pH 9,5
Tampón fosfato pH 7,0; 0,05 mol/l
Hirudina; recombinante
SC-PEG
Realización:
150 mg de PEG y 27 mg de hirudina se disolvieron conjuntamente en 25 ml de tampón borato y se incubaron con agitación durante 3 horas a 4ºC. El PEG y la hirudina no unidos se retiran por ultrafiltración (AMICON; membrana YM 10) con un volumen de un factor 6 a 10 de tampón fosfato. El producto retenido se liofilizó y se almacenó en el desecador a 4ºC. Las etapas individuales de preparación se probaron por SDS-PAGE, ensayos de coagulación (ECT), determinación de PEG y ensayo animal.
b) Preparación de anticuerpo de cabra de hirudina modificada con PEG
Materiales:
Tampón fosfato pH 7,0; 0,05 mol/l
SC-PEG
Anticuerpo de cabra de hirudina (Hi-ZAK (Ziegenantikörper))
Realización:
Se disuelven 500 mg de PEG en 20 ml de Hi-ZAK (presente en tampón fosfato) y se incuban durante 48 horas a 4ºC con agitación. El PEG y el Hi-ZAK no unidos se retiran por ultrafiltración (AMICON; membrana YM 10) con un volumen de un factor de 6 a 10 de tampón fosfato. El almacenamiento del preparado se realizó como solución a 4ºC.
Estos anticuerpos de cabra de hirudina modificada con PEG pueden aplicarse sobre una membrana de PMMA y de este modo se pueden disminuir de forma cuidadosa niveles elevados de hirudina durante el uso en un sistema terapéutico extracorpóreo.
Ejemplo 2 Producción y uso de un anticuerpo monoclonal acoplado a polietilenglicol (20000) contra el factor de necrosis tumoral (MAK 195)
Se disuelven 100 mg de MAK 195 en 50 ml de tampón borato 0,1 molar (pH 8) y se mezclan con 200 mg de metoxipolietilenglicol (20000)-4-nitrofenilcarbonato y se incuban durante 3 horas a 25ºC. La reacción de acoplamiento se detiene con un exceso molar de un factor 500 de TRIS, se dializa contra TRIS-HCl 20 mM y se aplica sobre una columna de HP-Q-Sepharose (Pharmacia) con un gradiente lineal de NaCl (de NaCl 0-400 mM) en TRIS-HCl 20 mM (pH 8). El conjugado de PEG-MAK 195 eluye aproximadamente a NaCl 200-250 mMol. La capacidad de unión del anticuerpo monoclonal se ensaya con un TNF-\alpha humano recombinante con ayuda de un ELISA de TNF-\alpha. No se puede comprobar una pérdida de efectividad del anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal pegilado contra TNF se aplica sobre un modulo de dializador capilar de PMMA experimental con 50 cm^{2} de superficie. La capacidad de unión comprendía, para 50 cm^{2} de superficie, 4 mg, con respecto al contenido proteico del MAK 195-PEG. En plasma humano al que se añadió TNF (100 ng/ml) no se pudo observar factor de necrosis tumoral incluso después de 10 min en el líquido de recirculación.
A partir de este ensayo se pudo demostrar sin ninguna duda que el anticuerpo monoclonal pegilado, en este documento, el anticuerpo de TNF MAK 195 (Knoll), se puede aplicar como recubrimiento específicamente sobre la membrana del dializador capilar de PMMA. En ese lugar es capaz de unirse cuantitativamente a TNF\alpha humano.
Ejemplo 3 Uso de una enzima acoplada a PEG
Como enzima modelo se usa la ureasa (EC 3.5.1.5, disponible en Sigma, Nº de pedido U 1500). Preparación de un preparado de ureasa acoplada a PEG: se disuelven 100 mg de ureasa (tipo III, actividad específica de 20.000 a 30.000 U/g) en 80 ml de tampón borato 0,1 Molar (pH 8) y se mezclan con 250 mg de metoxipolietilenglicol (25.000)-4-nitrofenilcarbonato y se incuban durante 24 h a 5ºC. La reacción se detiene con un exceso molar varios factores mayor de TRIS, se dializa contra TRIS-HCl (pH 8) y se desarrolla en una columna de HP-Q-Sepharose con un gradiente lineal de NaCl (pH 8). El conjugado de PEG-ureasa eluye con NaCl de 180 a 200 mM. El rendimiento del conjugado de PEG-ureasa se sitúa entre el 30-40%. La actividad enzimática se mide con un ensayo de urea. La actividad de escisión se sigue mediante mediación por titulación de pH y se compara con ureasa no conjugada. La pegilación de la ureasa tiene una ligera influencia de aumento de la actividad sobre la actividad de escisión de urea de la enzima. La ureasa acoplada a polietilenglicol de 25 kDa se aplica con una concentración de 2 mg (con respecto al contenido proteico del conjugado) sobre un dializador capilar experimental miniaturizado con 50 cm^{2} de superficie. Incluso después de la primera circulación, más del 90% de la ureasa está fijada a la superficie. Hasta el quinto ciclo de recirculación, la ureasa-PEG se instala de forma fija sobre la superficie de la membrana. Un lavado mediante lavado durante media hora con una solución salina con albúmina no produjo ninguna pérdida de actividad o aparición de actividad de ureasa libre en el líquido de lavado. Sobre el sistema de dializador capilar de PMMA dorado de urea se aplica una solución de plasma sanguíneo (50 ml que contienen 30 mg de urea). En el eluato de la membrana experimental de PMMA- ureasa-PEG se comprueban después de 5, 10, 20 y 30 min las cantidades restantes de urea mediante un ensayo enzimático. Se pudo demostrar que en el intervalo de los primeros 10 min, la concentración de urea en el plasma sanguíneo disminuye rápidamente. Después de 30 min ya no se puede comprobar urea libre. La prueba de amoniaco en sangre es positiva durante los últimos 25 min del ensayo. A partir de las investigaciones se puede deducir sin duda que una enzima pegilada unida sobre la membrana de PMMA desarrolla una actividad enzimática local y puede producir interacciones específicas correspondientes con su sustrato en la sangre en circulación.
Ejemplo 4 Producción y uso de micropartículas de polialquilenmetacrilato
Se pudo comprobar en ensayos posteriores que incluso micropartículas a partir de polialquilmetacrilato (PAMA) son capaces de unir estas sustancias acopladas a polietilenglicol en su superficie. Las micropartículas de PAMA se producen de forma conocida y se recubren con las respectivas sustancias activas. Se investigaron diferentes tamaños de partícula. Las micropartículas de polialquilmetacrilato entre 0,5 \mum y 250 \mum de diámetro se unen a grandes cantidades de sustancias activas PEG. Estas partículas se pueden usar de muchas maneras:
1) Partículas con el tamaño de hasta 20 \mum \diameter:
Estas partículas se pueden aplicar por vía intravasal después de la dotación específica con sustancia activa PEG y permanecen entonces durante un tiempo prolongado en la circulación sanguínea. Existe la posibilidad de volver a excluir esas partículas del cuerpo cuando contienen compuestos que se pueden estimular magnéticamente (por ejemplo, Fe_{2}O_{3}). Por un tratamiento externo específico de la sangre con sistemas de retención magnéticos se pueden volver a retirar estas partículas al final de la terapia de la circulación sanguínea. En este caso se podrían llevar profármacos (sustancias que se transforman en la forma activa en la sangre por las enzimas presentes en la misma), por ejemplo, hasta determinados órganos o focos de enfermedad en el organismo para estar disponibles entonces en elevada concentración para la terapia.
1.1 Vehículo de transporte de oxígeno
Por la imprimación de estas partículas de PAMA con hemoglobina acoplada a polietilenglicol se producen eritrocitos "artificiales" con gran capacidad de transporte de oxígeno específico y tiempos de permanencia suficientemente grandes en el organismo.
1.2 Partículas antivirales
Sobre las partículas de PAMA se imprimen anticuerpos específicos policlonales o monoclonales contra proteínas de envuelta (sitios de reconocimiento de alta especificidad) de los virus. Las partículas son capaces de "captar" los virus cuantitativamente y retirarlos del organismo.
1.3 Partículas que llevan anticuerpos monoclonales (MAB)
Las partículas con MAB contra el factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha) se pueden usar en la sepsis, sin embargo, también en enfermedades infecciosas graves. Las partículas con MAB "encuentran" el TNF-\alpha producido por las células infectadas que se libera en elevadas concentraciones en determinadas infecciones incluso después del contacto con endotoxina.
1.4 Sólidos y tejidos recubiertos con partículas 1.4.1 Material de prótesis de sustitución articular y ósea
Se unen partículas monodispersas con el tamaño preferido de 1 \mum, 5 \mum o 10 \mum con cinta adhesiva adecuada ("adhesivo de PAMA") con el material de sustitución. Después del endurecimiento de la unión adhesiva, los materiales recubiertos con partículas de PAMA se imprimen con factores de crecimiento acoplados a polialquilglicol para células óseas, de tejido conjuntivo o musculares (por ejemplo, rBMP-2 o rBMP-4, bFGF, entre otros) y después se introducen en el cuerpo. De este modo es posible conseguir por primera vez uniones de sujeción firmes entre material protésico y músculos (traumatología reparadora).
1.4.2 Prótesis vasculares
Prótesis vasculares de Goretex o Dacron se unen por adhesión con una capa de partículas de PAMA (\diameter 0,5 \mum) y se imprimen antes del uso con factor de crecimiento endotelial pegilado. Por el uso adicional de factor de crecimiento fibroblástico básico que anteriormente se acopla a PEG es posible una mejor vitalización por inducción del crecimiento de tejido conjuntivo y microcapilar.
1.4.3 Órganos artificiales
Se imprimen capas de tejido biocompatibles de materiales de plástico, que se unen por adhesión con partículas de PAMA monodispersas, o copolímeros con PAMA como material base, con factores de crecimiento celulares pegilados específicos de órganos. De este modo es posible un recubrimiento rápido y dirigido de los materiales de sustitución de órganos. Ámbitos de aplicación: Sustitución de hígado, sustitución de medula ósea, sustitución de tejido conjuntivo.
1.4.4 Contactos célula-chip
Biosensores, como por ejemplo, chips de silicio y otros materiales de circuito de control electrónicos se pueden recubrir localmente con partículas de PAMA monodispersas (preferiblemente de 0,5 a 5 \mum \diameter). Por la imprimación con factores de crecimiento celular pegilados es posible un crecimiento de terminaciones celulares especiales. Mediante esta técnica se puede conseguir un intercambio de información entre tejidos, preferiblemente tejido nervioso y circuitos de conmutación inteligentes.
2) Partículas en el intervalo de 30 a 80 \mum \diameter
Estas partículas se pueden imprimar con una pluralidad de sustancias activas, enzimas, anticuerpos, antitrombóticos (directos e indirectos) como hirudina, inhibidores de trombina sintéticos de bajo peso molecular, venenos de serpiente que activan la Proteína C, sin embargo, también trombolíticos como fibrinolasa, tPA, complejo estreptoquinasa-activador, entre otros. Estas partículas se usan en "columnas de tubos" miniaturizadas directamente en una derivación venovenosa (pasiva) o arteriovenosa (activa).
El tamaño de las partículas se dimensiona de tal modo que los componentes corpusculares de la sangre pueden pasar sin impedimentos. La superficie interna de estos módulos es tan grande que incluso son posibles sistemas "intravasales" temporales.
Por la imprimación "múltiple" de superficies de PAMA es posible inducir reacciones enzimáticas específicas en la sangre. Para esto también se podrían modificar de forma específica leucocitos, monocitos, glóbulos blancos polimorfonucleares en la superficie de los ETS (por ejemplo, escisión de determinantes específicos de inflamación).
3) Partículas en el intervalo de 80 a 150 \mum de \diameter
Estas partículas son particularmente adecuadas para el tracto gastrointestinal o la aplicación oral. Por la gran superficie interna y el uso sin problemas para la modificación dirigida de procesos digestivos se puede modificar el colesterol, por ejemplo, incluso antes de la reabsorción de forma metabólica-química de tal forma que ya no se pueda reabsorber o solamente en una cantidad muy reducida. De este modo se interrumpe la circulación entero-hepática del colesterol.
El uso de alcoholdeshidrogenasas unidas a superficie es una importante indicación adicional para disminuir el nivel de alcohol en sangre.
4) Partículas en el intervalo de 120 a 280 \mum \diameter
Este tamaño de partículas es preferiblemente adecuado para la aplicación oral de sustancias activas dietéticas. Por la gran superficie interna de las partículas es posible una ocupación intensa con enzimas modificadoras de la digestión (enzimas que degradan grasas y colesterol o estructuras de unión a los mismas). La unión de alcoholdeshidrogenasa pegilada puede disminuir la ingestión de alcohol en el tracto gastrointestinal.

Claims (18)

1. Un sistema de interacción que comprende:
(a)
una superficie de un plástico basado en monómeros, que contienen al menos un elemento estructural (A) derivado de un ácido carboxílico, donde el plástico es un poli(met)acrilato, un éster de polivinilo o un polímero mixto o una mezcla de los mismos con otras sustancias polimerizables; y
(b)
un enlazador con una sustancia fisiológicamente y/o farmacológicamente activa acoplada al mismo, donde el enlazador se selecciona de (poli)alquilenglicoles, (poli)alquileniminas, (poli)alquilenaminas, (poli)alquilensulfuros y polioxazolinas y al menos un elemento estructural (B) que es capaz de formar puentes de hidrógeno;
en el que existe una interacción estable mediante enlaces por puentes de hidrógeno entre el elemento estructural (A) de la superficie y el elemento estructural (B) del enlazador, que no se puede anular por valores de pH en el intervalo de 2 a 13 o temperaturas hasta 60ºC.
2. El sistema de interacción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la superficie activa es una membrana, una micropartícula porosa o sólida, una micropartícula magnética, una almohadilla de filtración, un material fibroso, un material hilado o una combinación de los mismos, o un recubrimiento sobre una sustancia natural o sintética.
3. El sistema de interacción de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el sistema está presente en forma de un sistema de tubo capilar, un filtro para líquidos fisiológicos, un dializador, un líquido de reemplazo fisiológico, un sistema de suministro enzimático, una prótesis articular o vascular o un órgano artificial.
4. El sistema de interacción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sustancia activa es una proteína, un ácido nucleico, una sustancia de señalización celular, un compañero de una pareja de afinidad biológica o fisiológica, un complejo sintético de Ni-NTA, un fármaco producido de forma sintética o una sustancia activa producida de forma sintética o un marcador para una sustancia biológica o sintética.
5. El sistema de interacción de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la proteína se selecciona a partir de enzimas, antígenos, anticuerpos, marcadores tumorales, antígenos de superficie, ligandos, receptores, fragmentos celulares con actividad de superficie de bacterias o virus o sustancias mensajeras inmunológicas.
6. El sistema de interacción de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el marcador es una sustancia fluorescente o quimioluminiscente, un EST (código de secuencia de expresión) o una enzima.
7. El sistema de interacción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sustancia activa es un inhibidor de la coagulación, una enzima con actividad metabólica, un antibiótico o un medicamento sintético.
8. El sistema de interacción de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el plástico es poli(met)acrilato o un polímero mixto de poli(met)acrilato, el enlazador es polietilenglicol y la sustancia acoplada es un anticoagulante seleccionado a partir de heparina, hirudina, antitrombinas de acción directa o protrombina.
9. El sistema de interacción de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el plástico es poli(met)acrilato o un polímero mixto de poli(met)acrilato, el enlazador es polietilenglicol y la sustancia acoplada es una enzima o un fármaco.
10. Un uso de un sistema de interacción de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 como un sistema para la presentación de sustancias acopladas al enlazador en un líquido, donde la respectiva sustancia diana se une, escinde o se modifica de otro modo por la sustancia acoplada.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el líquido es un líquido biológico, seleccionado de sangre entera, plasma, suero, orina, linfa, líquido orgánico, biopsia de órgano, contenido intestinal o esperma.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el líquido es un alimento o un componente de un alimento.
13. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 u 11 como sistema terapéutico o diana extracorpóreo.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13 para el diagnóstico y la terapia de enfermedades metabólicas, trastornos de la coagulación, infecciones virales, bacterianas, micóticas o parasitarias o enfermedades malignas.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 para la producción de alimentos dietéticos o alimentos de diseño.
16. El uso de un sistema de interacción de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para la producción de sistemas de comprobación.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 para la producción de columnas de afinidad, placas de microtitulación, placas de ensayo ELISA, microbarras, barras diagnósticas, fibras huecas o formaciones planas.
18. El uso de un sistema de interacción de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para la producción de una sustancia para el tratamiento de enfermedades metabólicas, trastornos de la coagulación, infecciones virales, bacterianas, micóticas o parasitarias o enfermedades malignas.
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