ES2298276T3

ES2298276T3 - Gen b5 de citicromo y proteina de candida tropicalis y procedimientos correspondientes.

Info

Publication number: ES2298276T3
Application number: ES01984336T
Authority: ES
Inventors: David L. Craft; Krishna M. Madduri; John C. Loper
Original assignee: Cognis IP Management GmbH
Current assignee: Cognis IP Management GmbH
Priority date: 2000-07-26
Filing date: 2001-07-25
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2021-07-25
Also published as: DE60132091D1; EP1303595B1; EP1303595A2; WO2002008413A3; WO2002008413A2; DE60132091T2; US6503734B1; ATE382086T1; AU2002224554A1; DK1303595T3

Abstract

Una célula anfitriona transformada con un ácido nucleico que codifica la proteína CYTb5 (citocromo b5) que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ. ID. NO. 2 en donde todos los anfitriones contienen una interrupción del la ruta a-oxidación

Description

Gen b5 de citicromo y proteína de Candida tropicalis y procedimientos correspondientes.

Antecedentes Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad para la solicitud provisional U.S. No. de serie 60/220, 958 presentada en Julio 26, 2000.

1. Campo de la invención

Esta invención se relaciona con procesos y composiciones involucrados en la producción de ácido dicarboxílico en levadura. Más particularmente, la invención se relaciona con un anfitrión todo transformado con un ácido nucleico que codifica una proteína b5 de citocromo.

2. Descripción de la técnica relacionada

Los ácidos alifáticos diódicos son intermedios químicos versátiles útiles como materia prima para la preparación de perfumes, polímeros, adhesivos y antibióticos macrolida. Mientras varias rutas químicas para la síntesis de ácidos \alpha, \omega-dicarboxílicos de cadena largas están disponibles, la síntesis no es fácil y la mayoría de métodos resulta en mezclas que contienen longitudes de cadenas más cortas. Como un resultado, son necesarias etapas de purificación extensas. Mientras se sabe que los ácidos dióicos de cadena larga también se pueden producir por transformación microbiana de alcanos, ácidos grasos o ésteres de estos, la síntesis química ha permanecido en la mayoría de la ruta disponible comercialmente, debido a limitaciones con los actuales enfoques biológicos.

Varias cepas de levadura se conocen por excretar ácidos \alpha, \omega-dicarboxílicos como un sub-producto cuando se cultiva sobre alcanos o ácidos grasos como la fuente de carbono. En particular, el almidón pertenece al género cándida, tal como C. albicans, C. cloacae, C. guillermondil, C. intermedia, C. lipolytica, C. maltosa, C. parapsilosis y C. zeylwnoides se conocen por producir tales ácidos dicarboxílicos (Agr. Biol Chem. 35:2033-2042 (1971)). También, varias cepas de C. tropicalis se conocen por producir ácidos dicarboxílicos que varían en longitudes de cadena de C_{11} a C_{18} (Okino et al., BM Lawrence, BD Mookherjee y BJ Willis (Eds), in flavors and fragences: A World Perspectiva. Preceedings de the 10th Internacional Conference de Essential oils, Flavors and Fragantes: Elsevier Sciencie Publishers BV Amsterdan. (1988)), y son la base de varias patentes como se revisó por Bühler y Schindler, en Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology, H. J. Rehm and G. Reed (eds), vol. 169, Verlag Chemie, Weinheim (1984).

Estudios de los procesos bioquímicos mediante los cuales las levaduras metabolizan alcanos y ácidos grasos han revelados tres tipos de reacciones de oxidación: \alpha-oxidación de alcanos a alcoholes, \omega-oxidación de ácidos grasos a ácidos \alpha, \omega-dicarboxílicos y la \beta-oxidación degradante de ácidos grasos a CO_{2} y agua. Los primeros dos tipos de oxidaciones se catalizan mediante enzimas microsómicas mientras que el último tipo tiene lugar en las peroxisomas. En C. Tropicalis, la primera etapa en la ruta de la \omega-oxidación se cataliza mediante un complejo de enzima unido a membrana (complejo M-hidroxilasa) que incluye una monooxigenasa P450 citocromo y una reductasa citocromo NADPH. Este complejo hidroxilasa es responsable de la oxidación primaria del grupo metilo terminal en alcanos y ácidos grasos como se describe, por ejemplo, en Gilewicz et al., Can. J. Microbiol 25:201 (1979). Los genes que codifican el citocromo P450 y los componentes reductasa NADPH del complejo se han identificado previamente como P450 ALK y P450 RED respectivamente, y también se han clonado y secuenciado como se describe, por ejemplo, en Sanglard et al., Gene 76: 121-136 (1989). El P450ALK también ha sido designado P450ALK1. Más recientemente, los genes ALK se han designado por el símbolo CYP y los genes RED se han designado CPR. Ver, por ejemplo, Nelson, Pharmacogenetics 6(1). 1-42 (1996). Ver también Ohkuma et al., DNA and Cell Biology 14:163-173 (1995). Seghezzi et al., DNA and Cell Biology, 11:767-780 (1992) and Kargel et al., Yeast 12:333-348 (1996). Por ejemplo, el P450ALK también se designa CYP52 de acuerdo con la nomenclatura de Nelson, supra. Los ácidos grasos se forman finalmente a partir de alcanos después de dos etapas adicionales de oxidación, se cataliza mediante oxidasa alcohol como se describe, por ejemplo, en Kemp et al., Appl. Microbiol. And Biotechnol. 28:370-374 (1988), y deshidrogenasa aldehído. Los ácidos grasos se pueden oxidar adicionalmente a través de la misma ruta o ruta similar al ácido dicarboxílico correspondiente. La \omega-oxidación de ácidos grasos procede por vía del ácido graso, \omega-hidroxi y su derivado aldehído, con el ácido dicarboxílico correspondiente sin el requerimiento de la activación COA. Sin embargo, ambos ácidos grasos y ácidos dicarboxílicos se pueden degradar, después de activación con el correspondiente éster acil-COA a través de la ruta de \beta oxidación en las peroxisomas, que conduce a un acortamiento de cadena. En sistemas de mamíferos, los productos de ácido dicarboxílico y ácidos grasos de M-oxidación se activan con sus COA-ésteres en proporciones iguales y son sustratos para la \beta-oxidación peroxisómica y mitocondrial (J. Biochem102: 225-234 (1987)). En levadura, la \beta-oxidación tiene lugar únicamente en las peroxisomas (Agr. Biol. Chem. 49:1821-1828 (1985)).

La producción de ácidos dicarboxílicos mediante fermentación de ácidos monocarboxílicos C14-C16 insaturados que utilizan una cepa de las especies C. tropicalis se describe en la patente U.S. 4,474,882. Los ácidos dicarboxílicos insaturados corresponden a los materiales de partida en el número y posición de los enlaces dobles. Procesos similares en los que se utilizan otros microorganismos especiales se describe en las patentes 3,975, 234 y 4,339,536, en la descripción de patente Británica 1,405,026 y en las publicaciones de patente alemanas 21 64 626, 28 53 847, 29 37 292, 29 51 177 y 21 40 133.

La US 5,620,878 describe un proceso para producir ácidos \alpha, \omega-dicarboxílicos que comprenden cultivar una cepa C. tropicalis que tiene todos los cuatro genes POX alterados y que tienen un número de copia incrementado de por lo menos un gen P450ALK, por lo menos un gen P450RED, o una combinación de dichos genes en un medio de cultivo que contiene una fuente de nitrógeno, un sustrato orgánico y un co-sustrato.

Las mono-oxigenasas P450 citocromo (P450S) son mono-oxidasas terminales de un sistema de enzima multi componente que incluye P450 y CPR. En algunos casos, un segundo portador de electrones, citocromo b5 (CYTb5) y su reductasa asociada están involucrados como se describe adelante en Morgan, et al., Drug Metab. Dispensador. 12:358-364, 1984. El P450s comprende una super familia de proteínas que existe ampliamente en la naturaleza que han sido aisladas de una variedad de organismos como se describen en, Nelson, Supra. Estos organismos incluyen varios mamíferos, peces, invertebrados, plantas, moluscos, crustáceos, eucariotes inferiores y bacterias (Nelson, Supra). El primero se descubrió en microsomas de hígado de roedor como un pigmento de unión de monóxido de carbono como se describió, por ejemplo, en Garfinkel. Arch. Biochem: Biophys, 77:493-509 (1958), los P450s son denominados después con base en su absorción en 450 mn en un espectro de diferencia acoplado de CO reducido como se describe, por ejemplo, en Omura et al. Biol. Chem. 239:2370-2378 (1964).

Los P450s catalizan el metabolismo de una variedad de compuestos endógenos y exógenos como se describió, por ejemplo, en Nelson, supra, y Nerbert et al., Supra). Los compuestos endógenos incluyen esteróides, prostanóides, eicosanoides, vitaminas solubles en grasa, ácidos grasos, alcaloides de mamíferos, leucotrinas, aminas biogénicas y fitolexinas (Nelson, supra and Nebert et al., supra). El metabolismo P450 involucra tales reacciones tales como epoxidación, hidroxilacióin, desalquilación, hidroxilación, sulfoxidación, desulfuración y deshalogenación reductora. Estas reacciones hacen generalmente que el compuesto sea más soluble, que sea conductor para excreción, y sea más electrófilo. Estos productos electrófilos pueden tener efectos dañinos si ellos reaccionan con el ADN u otros constituyentes celulares. Sin embargo, ellos pueden reaccionar a través de la conjugación de sustancias hidrófilas de bajo peso molecular que resultan en glucoronidación, sulfación, conjugación de aminoácidos o conjugación de glutationa que conduce típicamente a inactivación y eliminación como se describió, por ejemplo, en Klaassen et al., toxicology, 3rd ed, Macmillan, New York, 14986.

Los P450s son proteínas hemo tiolato que consiste de una porción hemo unida a una cadena de polipéptido sencilla de 45000 a 55000 da. El hierro del grupo hemo prostético se ubica en el centro de un anillo protoporfirino. Cuatro ligandos del hemo hierro se pueden atribuir al anillo porfirino. El quinto ligando es un anión de tiolato de un residuo cisteinilo del polipéptido. El sexto ligando es probablemente un grupo hidroxilo de un residuo de aminoácido, o una porción con una resistencia de campo similar tal como una molécula de agua como se describe, por ejemplo, en Goeptar et al., Critical Reviews in toxicology 25(1):25-65 (1995).

Las reacciones de mono-oxigenación catalizadas por citocromos P450 en un sistema de membrana unida eucariótico requiere la transferencia de electrones de NADPH a P450 por vía de reductasa P450 NADPH-citocromo (CPR) como se describe, por ejemplo, en Taniguchi et al., Arch. Biochem. Byophis. 232:585 (1984). Los genes CPR se refieren ahora como genes NSP. Ver, por ejemplo, Debacker et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45:1660 (2001). El CPR es una flavoproteína de aproximadamente 78000 Da que contiene 1 mol de dinucleótido adenina flavina (FAD) y 1 mol de mono-nucleótido de flavina (FMN) por mol de enzima como se describe, por ejemplo, en Potter et al., J. Biol, Chem, 258:6906 (1983). La porción FAD de CPR es el sitio de entrada de electrones en la enzima, mientras el FMN es el sitio donante de electrones para el P450 como se describe, por ejemplo, en Vernillon et al., J. Biol. Chem. 253:8812 (1978). La reacción general es como sigue:

H^{+} + RH + HADPH + O_{2} \rightarrow ROH + NAD^{+} + H_{2}O

Posterior a la transferencia del primer electrón, el O_{2} se une al complejo del sustrato Fe_{2}^{+}-P450 para formar el complejo del sustrato Fe_{3}^{+}-P450. Este complejo se reduce luego mediante un segundo electrón del CPR, o, en algunos casos, NADH por vía de un segundo portador de electrones, b5 citocromo (CYTb5) y su reductasa b5 citocromo NADH asociada como se describe, por ejemplo, en Guengerich et al., Arch. Biochem. Biophys. 205:365 (1980), and Morgan, supra. La mayoría de estudios mencionados anteriormente implican al CYTb2 por estar involucrado en la ruta solo para la transferencia del segundo electrón. Un átomo de este oxígeno reactivo se introduce en el sustrato, mientras que el otro se reduce a agua. El sustrato oxigenado se disocia luego, regenerando la forma oxidada del P450 citocromo como se describe, por ejemplo, en Klassen., Amdur and Doull, Casarett and Doull's Toxicology, Macmillan, New York (1986).

Con respecto al CYTb5, se han propuesto otros varios modelos del papel de esta proteína en la expresión P450 a pesar de su papel como un portador de electrones. Otro modelo del papel CYTb5 en la expresión P450 se basa en los efectos de las interacciones de proteína como se describe, por ejemplo, en Tamburini et al., Proc. Natal. Acad. Sci. 8A:11-15 (1986). Mediante este modelo, la unión del CYTb5 con P450 resulta en un complejo con alto contenido incrementado de espin. Este complejo luego tiene una mayor afinidad para el CPR. A través de esta interacción, el CYTb5 no proporciona actualmente el segundo electrón, pero reduce el tiempo entre la primera y segunda transferencia de electrones. Estas conclusiones se hacen en base en el trabajo con conejos CYP2b4. Adicionalmente, el CYTb5 no evita la interacción del conejo CYP2b4 con CPR. Por lo tanto, se propone que los dominios de unión de P450 para el CYTb5 y el CPR sena diferentes. Esto puede explicar posiblemente porque solo ciertos 0P450 interactúan con CYTb5. Se sabe que el CYTb5 se puede reducir mediante reductasa b5 citocromo o CPR como se describe, por ejemplo, en Enoch et al., J. Biol. Chem, 254:8976-8981, (1979). Sin embargo, en por lo menos un caso interesante, la adición de la reductasa b5 citocromo a un sistema reconstituido que contiene CYTb5 no resulta en una oxidación de sustrato incrementada como se describe, por ejemplo, en Sugiyama et al., J. Biochem. 87:1457-1467 (1979).

Varios otros estudios también han indicado que el CYTb5 puede regular la fosforilación del P450 citocromo mediante varias proteínas quinasa, por ejemplo, la quinasa proteína dependiente de cAMP y la quinasa proteína C como se describe, por ejemplo, en Jansson et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:441-448 (1987), Epstein et al., Arch. Biochem. Biophys. 271(2):424-432(1989) and Lobanov et al. Biokhimiia 58(10):1529-1537 (1993).

Independiente el mecanismo, numerosos estudios indican que el involucramiento del CYTb5 es ventajoso en algunas reacciones mediadas por P450. Un papel obligatorio del CYTb5 se ha mostrado en varios sistemas P450 reconstituidos como se describe, por ejemplo, en Sugiyama et al., supra, Sugiyama et al. Biochem. and Biophys. Res. Comm., 90:715-720 (1979), Canova-Davis et al, J. Biol. Chem. 259:2541-254b,1983, Kuwahara et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 96:1562-1568 (1980), and Sasame et al., Life Sciences 14:35-46 (1974). En todos estos casos, la actividad es abolida luego de la omisión del CYTb5 agregado exógenamente o su inactivación mediante la adición del anticuerpo CYTb5. Como se anotó anteriormente, el CYTb5 también está involucrado en la ruta del segundo electrón en ciertas reacciones mediadas por P450 como se describe, por ejemplo, en Hrycay et al., Archv. Bioch. 165:331-339 (1974), Imai et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 75:420-426 (1977), and Imai, J. Biochem. 89:351-362 (1980), así como también la reducción del oxi-citocromo P450 para el complejo de oxígeno como se describe, por ejemplo, en Noshiro et al., J. Biochem. 116:521-526 (1981).

En otros estudios, que utilizan sistemas reconstituidos, el CYTb5 agregado exógenamente incrementa la actividad del CYP2B4 de conejo como se describe, por ejemplo, en Sugiyama et al., J. Biochem., 92:1793-1803 (1982), and Chiang, Archv. Bioch. Biophy., 211:662-673 (1981), como se describe, por ejemplo, en Vatsis et al., J. Biol. Chem. 257:11221-11229 (1982), perros CYP2B11 y ratas CYP2B1 como se describe, por ejemplo, en Duignan et al., Arch. Bioch. Biophy. 267:294-304 (1988), y una reacción de hidroxilación de clorobenceno de rata P450 como se describe, por ejemplo, en Lu et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 61:1348:1355 (1974).

El CYP51, desmetilasa 14\alpha lanosterol, desarrollan una reacción esencial en la biosíntesis del ergosterol, la mayor membrana esterol de Saccharomyces cerevisiae (Sc) como se describe, por ejemplo, en Parks, CRC Crit. Rev. Microbiol., 6:301-341 (1978). Las cepas Sc que sintetizan el ergosterol no utilizan ergosterol, sino que aquellas se bloquean en las etapas pre-esterol o en la hemo biosíntesis que puede tomar y utilizar esterol exógeno como se describe, por ejemplo, en Parks, supra. El crecimiento anaeróbico del Sc no puede sintetizar esteroles pero utilizan ergoesterol exógeno. La interrupción del CYP51 produce cepas Sc que continúan produciendo esteroles 14\alpha-metilo, no producen ergosterol detectable y son incapaces del crecimiento aeróbico como se describe, por ejemplo, en Kalb et al., DNA, 6:529-537 (1987). A diferencia ellos son anaerobios estrictos, una condición en donde ellos acumulan ergoesterol exógeno.

El CPR funciona como el donante de electrones para su reacción desmetilasa como se describe, por ejemplo, en Aoyama et al., J. Biol. Chem. 259:1661-1666 (1984). Si el CPR es el único donante de electrones de CYP51 en Sc, mutantes completos CPR (cprl) deben semejar fenotípicamente las cepas CYP51 incompletas (cyp51). Sin embargo, un mutante completo cprl Sc no es estrictamente anaeróbico, y produce ergosterol como se describe, por ejemplo, en Sutter and Loper, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 160:1257-1266 (1989). La producción de ergosterol muestra que algunos CYP51 son todavía funcionales. Los genes responsables para esta recuperación de un mutante completo cpr1 se muestra por ser aquel que codifica el CYTb5. lo que muestra que en este sistema, el CYTb5 es capaz de imitar el CPR funcionalmente cuando está presente en un alto número de copia como se describe, por ejemplo, en Truan et al., Gene, 142(1):123-7 (1994).

La expresión del mamífero P450s en Sc se ha logrado con resultados variantes como se describe, por ejemplo, en Renaud et al., J. Biochem. 194:889-896 (1990), Urban et al., Biochimie 72:463-472 (1990), and Pompon et al., Molecular Endocrinology 3:1477-1487 (1989). Estudios han mostrado que la actividad por P450s de varios mamíferos expresado en Sc han sido mejorados luego de la adición de CYTb5 para aislar microsomas de estas cepas. Específicamente, la actividad Cyp1a-1 de ratón y CYP3A4 humana microsómica Sc se incrementan luego de la adición de CYTb5 de conejo como se describe, por ejemplo, en Renaud et al., supra, and Urban et al., supra.

Adicionalmente a sus efectos positivos, un estudio que involucra el Sc sugiere que el CYTb5 puede actuar negativamente como se describe, por ejemplo, en Pompon et al., supra. La adición de CYTb5 de conejo para aislar microsomas de un CYP19 humano que expresa Sc resulta en una reducción en la actividad aromatasa.

Los ácidos dicarboxílicos alifáticos (\leqC12) de cadena corta (diácidos) son intermedios industriales importantes en la fabricación de diésteres y polímeros, y encuentran aplicación como termoplásticos, agentes plastificantes, lubricantes, fluidos hidráulicos, químicos agrícolas, farmacéuticos, tintes, tensoactivos, y adhesivos. El alto precio y disponibilidad limitada de los diácidos de cadena corta se debe a las restricciones impuestas por la síntesis química existente.

Los diácidos de cadena larga (ácidos \alpha, \omega-dicarboxílicos alifáticos con números de carbono de 12 o más, también referidos de aquí en adelante como diácidos) (HOOC-(CH_{2})_{n}-COOH) son una familia versátil de químicos con utilidad potencial y demostrada en una variedad de productos químicos que incluyen plásticos, adhesivos, y fragancias. Desafortunadamente, el mercado potencial completo de diácidos no se ha realizado debido a que los procesos químicos producen solo un rango limitado de estos materiales en un precio relativamente alto. Adicionalmente, los procesos químicos para la producción de diácidos tienen un número de limitaciones y desventajas. Todos los procesos químicos se restringen a la producción de diácidos de longitud de cadena de cadenas de carbono específicas. Por ejemplo, el proceso del ácido dodecanodióico inicia con butadieno. Los diácidos de producto resultante se limitan a múltiples longitudes de 4 carbonos y, en la práctica, solo se hace el ácido dodecanóico. Los procesos dodecanóicos se basan en materia prima petroquímica no renovable. Los procesos de conversión multi reacción producen sub-productos indeseados, que pueden resultar en pérdidas de producto, polución NO_{x} y desprecios de metales
pesados.

Los diácidos de cadena larga ofrecen desventajas potenciales sobre los diácidos de cadenas mas cortos, pero su alto precio de venta y disponibilidad comercial limitada evitan el creciente desperdicio en muchas de estas aplicaciones. Los biocatalizadores ofrecen una forma innovadora de superar estas limitaciones con un proceso que produce un amplio rango de productos diácidos de materias primas renovables. Sin embargo, no existen bioprocesos viables comercialmente para producir diácidos de cadena larga a partir de recursos renovables.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una célula anfitriona transformada con un ácido nucleico que codifica la proteína CYTb5 (SEQ. ID. NO. 2), en donde todos los anfitriones contienen una interrupción de la ruta de \beta-oxidación.

Un método para incrementar la producción de ácido dicarboxílico se proporciona el cual incluye suministrar una célula anfitriona que tiene ninguno, uno o más genes CYTb5; que incrementa, en la célula anfitriona, el número de genes CYTb5 que codifica una proteína CYTb5 que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ. ID NO. 2 en donde todos los anfitriones contienen una interrupción de la ruta de \beta-oxidación; y cultivar la célula anfitriona en medio que contiene un sustrato orgánico que induce la expresión del gen CYTb5, para efectuar la producción incrementada de ácido dicarboxílico.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1C describe la secuencia de nucleótido del gen CYTb5 (SEQ. ID. NO. 1) y la secuencia de aminoácido de la proteína CYTb5 (SEQ. ID. NO. 2).

Las figuras 2A-2B describen la secuencia de nucleótido del gen CPRA (SEQ. ID. NO. 3).

Las figuras 3A-3C describen la secuencia de aminoácido de la proteína CPRA (SEQ. ID. NO. 4).

Las figuras 4A-4B describen la secuencia de nucleótido del gen CPRB (SEQ. ID. NO. 5).

Las figuras 5A-5C describen la secuencia de aminoácido de la proteína CPRB (SEQ. ID. NO. 6).

Las figuras 6A-6C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A1A (SEQ. ID. NO. 7).

Las figuras 7A-7B describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A2A (SEQ. ID. NO. 8).

Las figuras 8A-8C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A2B (SEQ. ID. NO. 9).

Las figuras 9A-9C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A3A (SEQ, ID. NO. 10).

Las figuras 10A-10C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A3B (SEQ. ID.NO. 11).

Las figuras 11A-11C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52D4A (SEQ. ID. NO. 12).

Las figuras 12A-12C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A5A (SEQ. ID. NO. 13).

Las figuras 13A-13C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A5B (SEQ. ID. NO. 14).

Las figuras 14A-14B describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A8A (SEQ. ID. NO. 15).

Las figuras 15A-15C describen la secuencia de nucleótido del gen CYP52A8B (SEQ. ID. NO. 16).

La figura 16 es una representación esquemática del vector de clonación pTrip1Ex disponible de Clontech^{TM} Laboratories, Inc. Se muestran Los sitios de restricción seleccionados dentro del sitio de clonación múltiple.

La figura 17A es un mapa del vector ZAP Express^{TM}.

La figura 17B es una representación esquemática de un fagémido de clonación, vector pBK-CMV.

La figura 18 es una descripción esquemática de un procedimiento para extraer y analizar diácidos y monoácidos a partir de cultivos de fermentación.

La figura 19 es una representación esquemática del plásmido pCR2.1^{TM} disponible de Invitrogen. Las secuencias de ácido nucleico para los sitios de restricción seleccionados y otras características se describen (SEQ. ID. NO. 43 y hebra complementaria SEQ. ID. NO. 44).

La figura 20 es una representación esquemática del vector de expresión de S. cerevisiae pYES 2.0 disponible de Invitrogen. Se indican los sitios de restricción seleccionados.

La figura 21 es una representación esquemática de ciertas porciones conservadas de ciertos genes CPR.

La figura 22 es una representación esquemática del plásmido pHKM1. Los sitios de restricción seleccionados se indican así como también la posición del gen CPRA.

La figura 23 es una representación esquemática del plásmido pHKM4. Los sitios de restricción seleccionados se indican así como también la posición del gen CPRA.

La figura 24 es una representación esquemática del plásmido pHKM9. Los sitios de restricción seleccionados se indican así como también la posición del gen CPRB.

La figura 25 es una descripción gráfica de la proporción Log del producto desconocido (u) al competidor (c) versus la concentración de competidor de ARN en las reacciones QC-RT-PCR que se relacionan con CYTb5.

La figura 26 es una descripción esquemática de un procedimiento para regenerar un genotipo URA3A por vía de la recombinación homóloga que involucra los genes CYTb5 y/o CPR.

La figura 27 es una descripción esquemática de la recombinación homóloga que involucra una división del gen URA3A y la incorporación de los genes CPR y/o CYTb5.

La figura 28 describe la secuencia de nucleótidos del gen URA3A. (SEQ. ID. NO. 45).

La figura 29 es una descripción esquemática del plásmido pNEB193 disponible de New England Biolabs. Se indican los sitios de restricción seleccionados.

La figura 30 es una descripción esquemática del vector de integración pURAin que contiene URA3A modificado en el plásmido pNEB193.

Descripción de las modalidades preferidas

La productividad diácido se mejora de acuerdo con la presente invención al incrementar selectivamente una proteína que es importante para la oxidación de sustratos orgánicos tal como ácidos grasos que componen el alimento deseado. Un gen CYTb5 único de C. tropicalis 20336 se ha identificado y caracterizado que está involucrado en las reacciones P450.

La secuencia de nucleótido (2710bp) del gen CYTb5 de longitud completa incluye una región reguladora y una región de codificación de proteína definida por nucleótidos 1109-1495 como se muestra en LAS Figuras 1A-1C. La secuencia de aminoácido (129 aminoácidos) de la proteína CYTb5 también se muestra en LAS Figuras 1A-1C.

La amplificación del gen CYTb5 en células anfitrionas, por ejemplo, levadura, que excreta ácidos dicarboxílicos, particularmente ácidos \alpha, \omega-dicarboxílicos. La expresión del gen CYTb5 de C. tropicalis y su inducción por alcanos o ácidos grasos de puede medir en células aisladas durante el curso de bioconversiones de fermentación utilizándole ensayo de reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa competitivo cuantitativo (QC RT-PCR) como se describe adelante (ejemplos 11 y 14).

Adicionalmente, la modificación de los promotores existentes y/o el aislamiento de promotores alternos proporciona expresión incrementada del gen CYTb5. Los promotores fuertes se obtienen de por lo menos cuatro fuentes: modificaciones específicas o aleatorias del promotor CYTb5, la selección de un promotor fuerte de los genes de \beta-oxidación de Cándida tal como POX4 y POX5, o la selección de otro promotor Cándida adecuado.

La fuerza del promotor se mide utilizando QT-RT-PCR para medir la expresión del gen CYTb5 en levadura, por ejemplo, células Cándida, aisladas de fermentadores. Los ensayos enzimáticos y los anticuerpos específicos para la proteína CYTb5 se utilizan para verificar que la fuerza del promotor incrementada se refleja mediante la síntesis incrementada de la proteína correspondiente. Una vez se ha identificado un promotor adecuado, este se fusiona para seleccionar un gen CYTb5 e introducirlo en Cándida para la construcción de una nueva cepa producida mejorada. Se contempla que la región de codificación del gen CYTb5 se puede fusionar a promotores adecuados u otras secuencias reguladoras que se conocen por aquellos expertos en la técnica.

La productividad diácida se mejora así mediante la integración selectiva, amplificación, y sobre expresión del gen CYTb5 en el anfitrión de producción de C. tropicalis.

Se debe entender que las células anfitrionas dentro de las cuales una o más copias del gen CYTb5 deseado se han introducido se pueden hacer para incluir tal un gen median te una técnica conocida por aquellos expertos en el arte. Por ejemplo, las células anfitrionas adecuadas incluyen procariotes tal como Bacillus sp., Pseudomous sp., Actinomycetes sp., Eschericia sp., Mycobacterium sp., y eucariotes tales como levadura, algas, células de insectos, células de plantas y hongos filamentosos. Las células anfitrionas adecuadas son células de levadura preferiblemente tal como Yarrowia, Bebaromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Lipomyces, Rhodasporidium, Rhodotorula, Trichosporan Cryptococcus, Endomyces, Galactomyces, Williopsis, Waltomyces, y más preferiblemente aquellas del género Cándida. Especies preferidas de Cándida son tropicalis, maltosa, apicola, paratropicalis, albicans, cloacae, guillermondii, intermedia, lipolitica, parapsilosis y zeilenoides. Particularmente los anfitriones preferidos incluyen cepas C. tropicalis que se han modificado genéticamente de tal manera que uno o más del POX4A cromosómico, POX4B y ambos genes POX5 se han interrumpido como se describe por ejemplo en la patente U.S. Nos. 5,254,466 y 5,620,878. Las interrupciones del gen POX4 y POX5 bloquean efectivamente la ruta \beta-oxidación en su primera reacción (que se cataliza mediante oxidasa acil-CoA) en una cepa de anfitrión C. tropicalis. Los genes POX4A y POX5 codifican distintas subunidades de oxidasa acil-CoA de cadena larga que son los polipéptidos peroxisomales (PXPs) designados PXP-4 y PXP-5, respectivamente. La interrupción de uno o más de estos genes resulta en una inactivación parcial o completa de la ruta de \beta-oxidación permitiendo así rendimientos mejorados del ácido dicarboxílico al redirigir el sustrato hacia la ruta \omega-oxidación y también evita la reutilización de productos de ácido dicarboxílico a través de la ruta de \beta-oxidación.

Ejemplos de cepas de C. tropicalis que son beta-oxidación parcialmente bloqueados incluyen, H41, H41B, H51, H45, H43, H53, H534, H534B y H435 como se describe en la Patente U.S. mencionada anteriormente No. 5,254,466. Un Ejemplo de una cepa de beta-oxidación completamente bloqueada de C. tropicalis en donde todos los cuatro genes POX4 y POX5 se interrumpen por el marcador seleccionable URA3, es H5343 (ATCC 20962) como se describe en la patente U.S. No. 5,254,466.

Vectores tales como plásmidos, fagémidos, fagos, cósmicos, cromosomas de levadura artificial, plásmidos de levadura episódicos, plásmidos de levadura replicados, y similares se pueden utilizar para transformar o transfectar adecuadamente células anfitrionas. Las células anfitrionas también se pueden transformar al introducirlas en una célula de vector de ADN lineal que contienen la secuencia de gen deseado, es decir CYTb5. Tal ADN lineal puede ser ventajoso cuando es deseable evitar la introducción de ADN no nativo (externo) dentro de la célula. Por ejemplo, el ADN que consiste de CYTb5 flanqueado por secuencias de ADN que son nativas a la célula originaria se pueden introducir en la célula anfitriona por electroporación, transformación de acetato de litio, esferoplastia y similares. Las secuencias de ADN pueden incluir marcadores seleccionables y/o otras herramientas para ingeniería genética. Las células se levadura se pueden transformar con cualquiera de los vectores de expresión descritos aquí. El término "vector de expresión" se utiliza ampliamente aquí y está destinado a abarcar cualquier medio que puede ser utilizado para transformar una célula objetivo. El vector de expresión abarca todos los ejemplos de vectores listados aquí, que incluyen, por ejemplo, vectores de integración.

En una modalidad particularmente útil un vector que incluye el gen CYTb5 también puede incluir una o más copias de un gen CPR (reductasa P450 NADPH-citocromo). El gen CPR de la cepa de levadura, por ejemplo, C. tropicalis, que codifica el componente reductasa P450 NADPH-citocromo del complejo \omega-hidroxilasa se ha clonado y secuenciado como se describe, por ejemplo, en Sanglard et al., supra. Las cepas C. tropicalis que tienen un mayor número de genes CPR que la cepa tipo silvestre han mostrado productividad incrementada de ácidos dicarboxílicos como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. mencionada anteriormente No. 5,620,878.

Ejemplos específicos de genes CPR incluyen los genes CPRA y CPRB de C. tropicalis 20336 como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. No. 6,331,420 y WO 00/20566 A2. Las regiones de codificación y reguladoras completas para el gen CPRA de C. tropicalis 20336 y su secuencia de aminoácidos se muestran en LAS Figuras 2A-2B y 3A-3C, respectivamente. Las regiones de codificación y regulación completas para el gen CPRB de C. tropicalis 20336 y su secuencia de aminoácidos se muestra en LAS Figuras 4A-4B y 5A-5C, respectivamente. Se debe notar que hay alguna evidencia que, en C. tropicalis, el codón CTG no se traduzca como leucina de acuerdo con el "código genético universal", sino como serina. Ver, por ejemplo, Ueda et al., Biochemie (1994) 76, 1217-1222. Sin embargo, esta proposición no se ha probado de forma concluyente. De acuerdo con esto, en razón a que el codón CTG en la posición 1180-1182 de La figura 4A se puede traducir como una leucina o una serina, el aminoácido 50 mostrado en La figura 5A se designa "X" en donde "X" puede ser leucina o serina, de la misma manera, en razón a que el codón CTG en la posición 1153-1156 de La Figura, 2A se puede traducir como leucina o serina, el aminoácido 50 mostrado en La figura 3A se designa "X", en donde "X" puede ser leucina o serina. Se debe mantener en mente que otras secuencias de ADN que incorporan el codón CTG que codifica una proteína como se describe aquí, puede tener similitud si aún no se designa con una "X".

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Un ejemplo de una cepa C. tropicalis que contiene copias adicionales de los genes CYTb5 y CPR de C. tropicalis 20336 es la cepan HDC11 (ver Tabla 2, Ejemplos 2 y 15).

El vector mencionado anteriormente incluye el gen CYTb5 que también puede incluir una o más copias de un gen CYP (monooxigenasa P450 citocromo). Genes CYP adecuados de levadura, por ejemplo, la cepa C. tropicalis 20336, incluye, pero no se limita a, CYP52A1A (LAS Figuras 6A-6C), CYP52A2A (LAS Figuras 7A-7B), CYP52A2B (LAS Figuras 8A-8C), CYP52A3A (LAS Figuras 9A-9C), CYP52A3B (LAS Figuras 10A-10C), CYP52D4A (LAS Figuras 11A-11C), CYP52A5A (LAS Figuras 12A-12C), CYP52A5B (LAS Figuras 13A-13C), CYP52A8A (LAS Figuras 14A-14B) y CYP52A8B (LAS Figuras 15A-15C), como se describe en la solicitud U.S. No. de serie No. 09/302,620 y la solicitud internacional No. PCT/US9920797.

Se proporciona un método para incrementar la producción de una proteína CYTb5 en una célula anfitriona. El método incluye (a) transformar la célula anfitriona que tiene un número de ocurrencia natural de los genes CYTb5 con por lo menos un gen CYTb5 que codifica una proteína CYTb5 que tiene la secuencia de aminoácido como se establece en LAS Figuras 1A-1C, y (b) cultivar la célula anfitriona transformada y por lo tanto incrementar la expresión de la proteína CYTb5 comparada con aquella de la célula anfitriona que contiene el número de la copia de ocurrencia natural de los genes CYTb5. Las células anfitrionas adecuadas incluyen aquellas descritas anteriormente. Preferiblemente, la célula anfitriona es una célula cándida, y más preferiblemente la cepa de cándida es una cepa C. tropicalis como se describió anteriormente. Se debe entender que una célula anfitriona que tiene un número de ocurrencia natural de los genes CYTb5 significa que abarca las células en donde ese número es cero (0).

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para incrementar la producción de un ácido dicarboxílico en una célula anfitriona. El método comprende (a) proporcionar la célula anfitriona que tiene ninguno, uno o más de los genes CYTb5; (b) incrementar, en la célula anfitriona, el número de genes CYTb5 que codifican una proteína CYTb5 que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en LAS Figuras 1A-1C en donde todos los anfitriones contienen una interrupción de la ruta de \beta-oxidación; y (c) cultivar la célula anfitriona en medio que contiene un sustrato orgánico que induce la expresión del gen CYTb5 para efectuar la producción incrementada de ácido dicarboxílico. Las células anfitrionas adecuadas incluyen aquellas como se describió anteriormente.

La célula anfitriona mencionada anteriormente utilizada para incrementar la producción de un ácido dicarboxílico también puede incluir un número incrementado de genes CPR o GYP comparados con la célula anfitriona tipo silvestre. Tales genes se han clonado y caracterizado como se describe en la patente U.S. No. 6,331,420 y WO 00/20566 A2 como se describió anteriormente. El cultivo de la célula anfitriona en medio que contiene un sustrato orgánico sobre regula el gen CPR, que resulta en producción incrementada de ácido dicarboxílico.

De acuerdo con lo anterior, la productividad (gramos de ácido dicarboxílico/litro/hr) de ácidos \alpha, \omega-dicarboxílicos sustancialmente puros, se incrementa significativamente al cultivar una célula anfitriona, por ejemplo, una cepa C. tropicalis, que tiene un mayor número de genes CPR y/o CYTb5 del tipo silvestre, y en los cuales los genes cromosómicos POX4A, POX4B y POX5 también se pueden interrumpir.

Un sustrato orgánico adecuado aquí puede ser cualquier compuesto orgánico que sea bio-oxidable con un ácido mono o poli-carboxílico. Tal un compuesto puede ser cualquier compuesto alifático saturado o insaturado o cualquier compuesto aromático carbocíclico o heterocíclico que tiene por lo menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal que se puede oxidar con un grupo carboxilo por bio-oxidación. Un grupo funcional terminal que se deriva de un grupo carboxilo puede estar presente en la molécula de sustrato y se puede convertir a un grupo carboxilo mediante una reacción diferente de bio-oxidación. Por ejemplo, si el grupo terminal es un éster que ni el C. tropicalis tipo silvestre ni las modificaciones genéticas descritas aquí permitirían la hidrólisis de la funcionalidad éster a un grupo carboxilo, entonces se puede agregar una lipasa durante la etapa de fermentación para liberar los ácidos grasos. Los sustratos orgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcanos, alquenos, alquinos, y combinaciones de estos.

Los alcanos son un tipo de sustratos orgánicos saturados que son particularmente útiles aquí. Los alcanos pueden ser lineales o cíclicos, ramificados o de cadena recta, sustituidos o no sustituidos. Los alcanos particularmente preferidos son aquellos que tienen de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 átomos de carbono, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, butano, hexano, octano, nonano, dodecano, tridecano, tetradecano, hexadecano, octadecano y similares.

Ejemplos de sustratos orgánicos insaturados que se pueden utilizar aquí incluyen, pero no se limitan a, olefinas internas tal como 2-penteno, 2-hexeno, 3-hexeno, 9-octadeceno y similares; ácidos carboxílicos insaturados tales como ácido 2-hexenóico y ésteres de estos, ácido oléico y ésteres de estos que incluyen ésteres de triglicerilo que tienen un contenido de ácido oléico relativamente alto, ácido erúsico y ésteres de este que incluyen ésteres de triglicerilo que tienen un contenido de ácido erúsico relativamente alto, ácido risinoléico y ésteres de este que incluyen ésteres de triglicerilo que tienen un contenido de ácido risinoléico relativamente alto, ácido linoléico, y ésteres de este que incluyen ésteres de triglicerilo que tienen un contenido de ácido linoléico relativamente alto; alcoholes insaturados tal como 3-hexen-1-ol, 9-octadecen-1-ol y similares; Aldehídos insaturados tal como 3-hexen-1-al, 9-octadecen-1-al y similares. Adicionalmente, un sustrato orgánico que se puede utilizar aquí incluye compuestos alicíclicos que tienen por lo menos un doble enlace interno carbono-carbono y por lo menos un grupo terminal metilo, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal que se puede oxidar con un grupo carboxilo mediante bio-oxidación. Ejemplos de tales compuestos incluyen pero no se limitan a, 3,6-dimetilo, 1,4-ciclohexadieno, 3-metilociclohexeno, 3-metilo-1, 4-ciclohexadieno y similares.

Ejemplos de los compuestos aromáticos que se pueden utilizar aquí incluyen pero no se limitan a, arenos tal como o-, m-, p-xileno; o-, m-, ácido p-metil benzoico; piridinio dimetilo; esteroles y similares. El sustrato orgánico también puede contener otros grupos funcionales que son bio-oxidables con grupos carboxilo tal como un aldehído o un grupo alcohol. El sustrato orgánico también puede contener otros grupos funcionales que son bio-oxidables con grupos carboxilo y no interfieren con la bio-oxidación tal como halógenos, éteres, y similares.

Ejemplos de ácidos grasos saturados que se pueden aplicar a células que incorporan los genes CPR, CYP y/o CYTb5 de acuerdo con la presente invención incluyen ácidos caproico, enantico, caprílico, pelargónico, cáprico, undecílico, laurico, mirístico, pentadecanoico, palmítico, margarico, esteárico, araquídico, behenico y combinaciones de estos. Ejemplos de ácidos grasos insaturados que se pueden aplicar a las células que incorporan los presentes genes CPR y/o CYTb5 incluyen ácidos palmitoléicos, oléico, erúcico, linoleico, linolenico y combinaciones de estos. Alcanos y fracciones de alcanos se pueden aplicar que incluyen enlaces de cadena de C12 a C24 en cualquier combinación. Un ejemplo de mezclas de ácidos grasos preferidos son Emersol®, Tallow y HOSFFA (aceite de girasol altamente oléico, es decir, mezcla de ácido graso que contiene aproximadamente 80% de ácido oléico disponible comercialmente como Edenor®) cada uno completamente disponible de Cognis Corp., Cincinnati, OH, la composición de ácido típicamente graso de Emersol® y Tallow es como sigue:

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Los siguientes ejemplos ilustran pero no limitan la invención. Todas las cepas microbianas relevantes se describen en la tabla 1 y 2, respectivamente. Tabla 1 lista de las Cepas Escherichia coli y Candida tropicalis.

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TABLA 2 Lista de plásmidos aislados de librerías genómicas y construidas para uso en integraciones de gen

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Ejemplo 1

Purificación de ADN genómico a partir de Candida tropicalis ATCC 20336 A. Construcción de librerías genómicas

50 ml de caldo de cultivo YEPD (ver apéndice) se inocula con una colonia única de C. tropicalis 20336 de Placa agar YEPD y se hace crecer durante la noche a 30ºC. 5 ml del cultivo se inocula en 100 ml de caldo de cultivo YEPD fresco y se incuba a 30ºC durante 4 a 5 hr con agitación. Las células se cosechan mediante centrifugación, se lavan dos veces con agua destilada estéril y se resuspenden en 4 ml de amortiguador de esferoplasto (1 M Sorbitol, 50 mM EDTA, 14 mM mercaptoetanol) se incuba durante 30 min a 37ºC con agitación gentil. 0.5 ml de 2 mg/ml zimoliasa (ICN Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA) se agrega y se incuba a 37ºC con agitación gentil durante 30 a 60 min. La formación de esferoplastos se monitorea mediante Lisis SDS. Los esferoplastos se cosechan por centrifugación breve (4,000 rpm, 3 min) y se lavan una vez con amortiguador de esferoplasto sin mercaptoetanol. Los esferoplastos cosechados se suspenden luego en 4 ml de amortiguador de lisis (0.2 M Tris/pH 8.0, 50 mM EDTA, 1% SDS) que contiene 100 mg/ml de RNasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) se incuba a 37ºC durante 30 a 60 min.

Las proteínas se desnaturan y se extraen dos veces son un volumen igual de alcohol cloroformo/isoamilo (24:1) mediante agitación gentil de las dos fases por inversión manual. Las dos fases se separan por centrifugación a 10,000 rpm durante 10 min y la fase acuosa que contiene el ADN de alto peso molecular se recupera. Para la capa acuosa de NaCl se agrega una concentración final de 0.2 M y el ADN se precipita al agregar 2 vol de etanol. El ADN precipitado se agita con una vara de vidrio limpia y se resuspende en amortiguador TE r (1Q mM Tris/pH 8.0, 1 mM EDTA) y se le permite disolver durante la noche a 4ºC. Al ADN disuelto, la RNasa libre de cualquier actividad DNasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) se agrega a una concentración final de 50 mg/ml se incuba a 37ºC durante 30 min. Luego la proteasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) se agrega a una concentración final de 100 mg/ml se incuba a 55 a 60ºC durante 30 min. La solución se extrae una vez con un volumen igual de alcohol fenol/cloroformo/isoamilo (25:24:1) y una vez con volumen igual de alcohol de cloroformo/isoamilo (24:1). A la fase acuosa 0.1 vol de 3 M acetato de sodio y 2 volúmenes de etanol enfriado con hielo (prueba 200) se agregan y el ADN de alto peso molecular se agita con una vara de vidrio se disuelve en 1 a 2 ml de amortiguador TE.

B. Preparación de ADN genómico para PCR Amplificación de los genes CYTb5 y CPR

Cinco 5 ml de Medio YPD se inocula con una colonia única y se hace crecer a 30ºC durante la noche. El cultivo se centrifuga durante minutos a 1200 x g. El super nadante se remueve por aspiración y 0.5 ml de una solución de sorbitol (0.9 M sorbitol, 0.1 M Tris-Cl pH 8.0, 0.1 M EDTA) se agrega al gránulo. El gránulo se resuspende al centrifugar y se agrega 1 ml de 2-mercaptoetanol y 50 ml de solución de zimoliasa 10 mg/ml a la mezcla. El tubo se incuba a 37ºC durante 1 hr en un agitador rotatorio (200 rpm). El tubo se centrifuga luego durante 5 min a 1200 x g y el super nadante se remueve por aspiración. El gránulo del protoplasto se resuspende en 0.5 ml 1x TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA) y se transfiere a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Los protoplastos se lisan mediante la adición de 50 ml. 10% SDS seguido por incubación a 65ºC durante 20 min. Luego, 200 ml de 5M de acetato de potasio se agregan y después de mezcla, el tubo se incuba en hielo durante por lo menos 30 min. Los residuos celulares se remueven mediante centrifugación a 13,000 x g durante 5 min. El super nadante se remueve cuidadosamente y se transfiere un nuevo tubo micrófugo. El ADN se precipita por la adición de 1 ml 100% (200 prueba) de etanol seguido por centrifugación durante 5 min a 13,000 x g. El gránulo de ADN se lava con 1 ml 70% etanol seguido por centrifugación durante 5 min a 13,000 x g. Después de secar parcialmente el ADN bajo vacío, se resuspende en 200 ml de lx TE. La concentración de ADN se determina mediante la proporción de la absorbancia en 260 nm/280 nm (A_{260/280}).

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Ejemplo 2

Construcción de librerías genómicas Candida tropicalis 20336

Se construyen Tres librerías genómicas de C. tropicalis, dos en Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) y una en Henkel Corporation (Cincinnati, OH).

A. Librerías Clontech

La primer librería Clontech se hace como sigue: ADN genómico, se prepara de C. tropicalis 20336 como se describió anteriormente, se digiere parcialmente con EcoRI y se fracciona en partes por electrofóresis de gel para eliminar los fragmentos más pequeños de 0.6 kb. Luego del fraccionamiento del tamaño, varias ligaciones de los fragmentos de ADN genómico Eco RI y lambda (\lambda) brazos vector TriplEx^{TM} (Figura 16) con extremos adhesivos Eco RI que se empacan en las cabezas de fago \lambda bajo condiciones diseñadas para obtener un millón de clones independientes. La segunda librería genómica se construye como sigue: el ADN genómico se digiere parcialmente con Sau3A1 y se fracciona en partes mediante electrofóresis de gel. Los fragmentos de ADN tienen extremos rombos utilizando protocolos estándar como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Cold Spring Harbor Press, USA (1989). La estrategia es llenar los restos del Sau3A1 con polimerasa Klenow (Life Technologies, Grand Island, NY) seguido por digestión con nucleasa S1 (Life Technologies, Grand Island, NY). Después de la digestión de nucleasa S1 los fragmentos se llenan una o más veces con polimerasa Klenow para obtener los fragmentos de ADN de extremo romo. Los ligadores EcoRI se ligan con estos fragmentos de ADN de extremo romo seguido por ligación en el vector \lambda TripIEx. La librería resultante contiene aproximadamente 2 X 10^{6} clones independientes con un tamaño de inserto promedio de 4.5 kb.

B. Librería Cognis

Se construye una librería genómica utilizando el vector \lambda ZAP Express^{TM} (Stratageno, La Jolla, CA) (Figura 17A). El ADN genómico se digiere parcialmente con Sau3A1 y fragmentos en el rango de 6 a 12 kb se purifican de un gel agarosa después de electrofóresis del ADN digerido. Estos fragmentos de ADN se ligan luego con brazos de vector \lambda ZAP Express^{TM} digerido Bam HI de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las tres ligaciones se establecen para obtener aproximadamente 9.8 X 10^{5} clones independientes. Las tres librerías se agrupan y amplifican de acuerdo con las instrucciones del fabricante para obtener un depósito de alto título (>10^{9} unidades que forman placa/ml) durante almacenamiento a largo plazo. El título de la librería fago empacado se comprobó después de la infección de células E. coli XL1Blue-MRF. El E. coli XL1Blue-MRF' se hace crecer durante la noche en medio LB o, NZCYM (Apéndice) que contiene 10 mM MgSO_{4} y 0.2% de maltosa a 37ºC o 30ºC, respectivamente con agitación. Las células se centrifugan luego y se resuspenden en 0.5 a 1 volumen de 10 mM de MgSO_{4}. 200 ml de este cultivo E. coli se mezclan con varias diluciones de librería fago empacadas y se incuban a 37ºC durante 15 min. A esta mezcla 2.5 ml de azarosa superior LB o azarosa superior NZCYM (mantenida 60ºC) (ver apéndice) se agregan y la placa en agar LB o agar NCZYM (ver apéndice) presente en platos petri de 82 mm. El fago se le permite propagarse durante la noche a 37ºC para obtener placas discretas y se determina el título fago.

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Ejemplo 3

Selección de librerías genómicas

Los vectores \lambda TriplEx^{TM} y \lambda ZAP Express^{TM} son vectores fagémidos que se pueden propagar como fago o plásmidos de ADN (después de conversión de fago a plásmidos). Por lo tanto, las librerías genómicas construidas en estos vectores se pueden seleccionar mediante hibridación por placa (selección de la forma lambda de la librería) o por hibridación de colonia (selección de la forma de plásmido de la librería después de conversión de fago a plásmido). Ambos vectores son capaces de expresar los genes clonados y la principal diferencia es el mecanismo de división del plásmido del fago de ADN. El sitio de clonación en \lambdaTriplEx^{TM} se ubica dentro de un plásmido que está presente en el fago y se flanquea por el sitio lox^{p} (Figura 16). Cuando el \lambdaTriplEx^{TM} se introduce en la cepa E. coli BM25.8 (suministrada por Clontech), la recombinasa Cre presente en promotores BM25.8 la división y la circulación de plásmido pTriplEx del fago \lambdaTriplEx^{TM} a en los sitios loxP. El mecanismo de división del plásmido pBK-CMV (Figura 17B) del fago \lambda ZAP Express^{TM} es diferente. Se requiere la ayuda de un fago auxiliar de tal manera que ExAssist^{TM} (Stratagene) y una cepa E. coli tal como XLOR (Stratagene). pTriplEx y pBK-CMV pueden replicar autónomamente en E. coli.

A. Selección de librerías genómicas (forma de Plásmido) 1) levantamiento de colonias

Una colonia única de E. coli BM25.8 se inocula en 5 ml de LB que contiene 50 mg/ml de canamicina, 10 mM MgSO_{4} y 0.1% de maltosa y se hace crecer durante la noche a 31ºC, 250 rpm. A 200 ml de este cultivo durante la noche e (\sim4 X 10^{8} células) 1 ml de librería fago (2 - 5 X 10^{6} unidades formadoras de placa) y 150 ml de caldo de cultivo LB se agregan y se incuban a 31ºC durante 30 min después de lo cual 400 ml de Caldo de cultivo LB se agrega y se incuba a 31ºC, 225 rpm durante 1 h. Este cultivo bacteriano se diluye y se coloca en placas LB de agar que contienen 50 mg/ml de ampicilina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y canamicina (Sigma Chemical Company) para obtener 500 a 600 colonias/placa. Las placas se incuban a 37ºC durante 6 a 7 horas hasta que las colonias llegan a ser visibles. Las placas se almacenan luego a 4ºC durante 1.5 hrs antes de colocar un disco de membrana de transferencia de hibridación Colony/Plaque Screen^{TM} (DuPont NEN Research Products, Boston, MA) sobre la placa en contacto con las colonias bacterianas. La transferencia de colonias a la membrana se permite para proceder durante 3 a 5 min. La membrana se levanta luego y se coloca en una placa LB fresco de agar (ver apéndice) que contiene 200 mg/ml de cloramfenicol con el lado expuesto a las colonias bacterianas que lo enfrentan. Las placas que contienen las membranas se incuban luego a 37ºC durante la noche con el fin de permitir el desarrollo completo de las colonias bacterianas. Las placas de agar LB de las cuales las colonias se levantan inicialmente se incuban a 37ºC durante la noche y se almacenan a 4ºC para uso futuro. A la mañana siguiente las membranas que contienen las colonias bacterianas se levantan y se colocan en dos hojas de papel Whatman 3M (Whatman, Hillsboro, OR) saturado con 0.5 N NaOH y se dejan a temperatura ambiente (RT) durante 3 a 6 min para lisar las células. El tratamiento adicional de las membranas se describe en el protocolo proporcionado por NEN Research Products.

2) Hibridaciones de ADN

Se secan membranas durante la noche antes de hibridar para sondas de oligonucleótido preparadas utilizando un sistema de detección ECL^{TM} 3'-oligoetiquetado no radioactivo de Amersham Life Sciences (Arlington Heights, IL). El etiquetado de ADN, la pre-hibridación y las hibridaciones se desarrollan de acuerdo con los protocolos del fabricante. Después de hibridación, las membranas se lavan dos veces a temperatura ambiente en 5 X SSC, 0.1% SDS (en un volumen equivalente a 2 ml/cm^{2} de membrana) durante 5 min cada uno seguido por dos lavadas a 50ºC en 1X SSC, 0.1% SDS (en un volumen equivalente a 2 ml/cm^{2} de membrana) durante 15 min cada uno. La señal de hibridación se genera y se detecta luego con el Hyperfilm ECL^{TM} (Amersham) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las membranas se alinean con placas que contienen las colonias bacterianas de las cuales las colonias que se levantan son desarrolladas y las colonias que corresponden a señales positivas en rayos X se aíslan luego y cultivan en caldo de cultivo LB. Los plásmidos de ADN se aíslan de estos cultivos y se analizan para restricción de digestión de enzima por secuenciamiento de ADN.

B. Selección de librerías genómicas (forma placa) 1) Forma de placa de librería \lambda

Se hacen crecer células de E. coli XL1Blue-MRF durante la noche en medio LB (25 ml) que contiene 10 mM MgSO_{4} y 0.2% de maltosa a 37ºC, 250 rpm. Las células se centrifugan luego (2,200 x g durante 10 min) y se resuspende en 0.5 volúmenes de 10 mM MgSO_{4}. 500 ml de este cultivo E. coli se mezcla con una suspensión de fago que contiene 25,000 partículas de fago lambda amplificadas y se incuban a 37ºC durante 15 min. A esta mezcla 6.5 ml de agarosa superior NZCYM (mantenida a 60ºC) (ver apéndice) se agrega y se coloca en placas en 80 - 100 ml de NCZYM de agar (ver apéndice) presente en un plato petri de 150 mm. Al fago se le permite propagar durante la noche a 37ºC para obtener placas discretas. Después que se hacen crecer durante la noche se almacenan las placas en un refrigerador durante 1-2 horas antes que se desarrolle el levantamiento de placa.

2) Levantamiento de placa e hibridaciones de ADN

Se colocan membranas de nylon Magna Lift^{TM} (Micron Separations, Inc., Westborough, MA) sobre la superficie de agar en contacto completo con una placa y se permite la transferencia de placas a membranas de nylon para proceder durante 5 min a RT. Después de la transferencia de placa la membrana se coloca en dos láminas de papel de filtro de Whatman 3M^{TM} (Whatman, Hillsboro, OR) saturado con 0.5 N de NaOH, 1.0 M de solución NaCl y se dejan durante 10 min a RT para desnaturalizar ADN. El exceso de solución desnaturalizante se remueve brevemente por transferencia en papel Whatman 3M. Las membranas se transfieren luego a dos hojas de papel Whatman 3M^{TM} saturadas con 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 1.5 M de NaCl y se dejan durante 5 min para neutralizar. Las membranas se lavan brevemente en 200 - 500 ml de 2 X SSC, se secan por aire y se dejan reposar durante 30 - 40 min a 80ºC. Las membranas se sondean luego con ADN etiquetado.

Las membranas se pre-lavan con una solución de 200 - 500 ml de de 5 X SSC, 0.5% SDS, 1 mM EDTA (pH 8.0) durante 1 - 2 hr a 42ºC con agitación (60 rpm) para librarse de los residuos bacterianos de las membranas. Las membranas se pre-hibridan durante 1 - 2 hrs a 42ºC con (en un volumen equivalente a 0.125 - 0.25 ml/cm^{2} de membrana) amortiguador ECL Gold^{TM} (Amersham) que contiene 0.5 M NaCl y 5% de reactivo bloqueador. Los fragmentos de ADN que se utilizan como sondas se purifican del gel azarosa utilizando un kit de extracción de gel QIAEX II^{TM} (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante y etiquetado utilizando el kit de etiquetado de ácido nucleico directo Amersham ECL^{TM} (Amersham). El etiquetado, ADN (solución de hibridación 5-10 ng/ml) se agrega a las membranas pre-hibridadas y la hibridación se permite proceder durante la noche. Al siguiente día se lavan las membranas con agitación (60 rpm) dos veces a 42ºC durante 20 min cada vez en (en un volumen equivalente a 2, ml/cm^{2} de membrana) un amortiguador que contiene 0.1 (alta restricción) o 0.5 (baja restricción) X SSC, 0.4% SDS y 360 g/l de urea. Esto es seguido por dos lavados de 5 min a temperatura ambiente en (en un volumen equivalente a 2 ml/cm^{2} de membrana) 2 X SSC. Se generan señales de hibridación utilizando reactivo de detección de ácido nucleico ECL^{TM} y se detecta utilizando Hyperfilm ECL^{TM} (Amersham).

Tapones de Agar que contienen placas que corresponden a señales positivas en la película de rayos X se toman a partir de placas maestras utilizando el extremo amplio de la pipeta Pasteur. Las placas se seleccionan al alinear las placas con la película de rayos X. En esta etapa, se toman generalmente múltiples placas. Las partículas fago se eluyen a partir de tapones de agar al enjuagar en 1 ml de amortiguador SM (Sambrook et al., supra) durante la noche. El eluado fago se diluye luego y se colocan placas con células E. coli XL1Blue-MRF que crecen frescas para obtener 100 - 500 placas por 85 mm de placa agar NCZYM. Las placas se transfieren a membranas de nylon Magna Lift como se hizo anteriormente y se sondean de nuevo utilizando la misma sonda. Las placas sencillas se aíslan bien correspondiendo a señales en películas de rayos X que se recogen al remover los tapones de agar y eluir el fago mediante enjuague durante la noche en 0.5 ml de amortiguador SM.

C. Conversión de clones \lambda a la forma de plásmido

Clones lambda aislados se convierten a la forma de plásmido para análisis adicional. La conversión de la placa a la forma de plásmido se logra al infectar las placas con la cepa E. coli strain BM25.8. La cepa E. coli se hace crecer durante la noche a 31ºC, 250 rpm en Caldo de cultivo LB que contiene 10 mM MgSO_{4 y} 0.2% de maltosa hasta que se alcanza OD_{600} de 1.1-1.4. Se remueven diez mililitros de cultivo durante la noche y se mezcla con 140 ml de 1 M de MgCl_{2}. Un volumen de 200 ml de células se remueve, se mezcla con 150 ml de suspensión de fago e incuban a 31ºC durante 30 min. El Caldo de cultivo LB (400 ml) se agrega al tubo y se continúa la incubación a 31ºC durante 1 hr con agitación, 250 rpm. 1 - 10 ml de la suspensión celular infectada se colocan placas en agar LB que contiene 100 mg/ml ampicilina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las colonias bien aisladas se recogen y se hacen crecer durante la noche en 5 ml de Caldo de cultivo LB que contiene 100 mg/ml ampicilina a 37ºC, 250 rpm. El ADN de Plásmido se aísla de estos cultivos y se analiza. Para convertir el vector \lambdaZAP Express^{TM} a la forma de plásmido se utilizan las cepas E. coli XL1Blue-MRF' y XLOR. La conversión se desarrolla de acuerdo con los protocolos del fabricante (Stratagene) para división de placa única.

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Ejemplo 4

Transformación de C. tropicalis utilizando acetato de litio

Se utiliza el siguiente protocolo para transformar C. tropicalis de acuerdo con el procedimiento descrito en Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 5, 13.7.1 (1989).

5 ml de YEPD se inocula con C. tropicalis H5343 ura de materia prima congelada y se incuba durante la noche en un agitador New Brunswick a 30ºC y 170 rpm. Al siguiente día, 10 \mul del cultivo se inocula en 50 ml YEPD y se hace crecer y se continúa a 30ºC, 170 rpm. Al siguiente día las células se cosechan en un OD_{600} de 1.0. El cultivo se transfiere un tubo de polipropileno de 50 ml y se centrifuga a 1000 X g durante 10 min. El gránulo celular se resuspende en 10 ml estéril TE (10 mM Tris-Cl and 1 mM EDTA, pH 8.0). Las células se centrifugan de nuevo en 1000 X g durante 10 min y el gránulo celular se resuspende en 10 ml de una solución de acetato de litio estéril [LiAc (0.1 M de acetato de litio, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA)]. Luego de centrifugación a 1000 X g durante 10 min., el gránulo se resuspende en 0.5 ml LiAc. Esta solución se incuba durante 1 hr a 30ºC mientras se agita gentilmente a 50 rpm. Una alícuota de 0.1 ml de esta suspensión se incuba con 5 \mug de ADN transformante a 30ºC sin agitación durante 30 min. 0.7 ml de solución PEG (40% p/v de polietilenglicol 3340, 0,1 M de acetato de litio, 10 mM de Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA) se agrega se incuba a 30ºC durante 45 min. Los tubos luego se colocan a 42ºC durante 5 min. Una alícuota de 0.2 ml se coloca en medio completo sintético menos uracilo (SC - uracilo) (Kaiser et al. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. 1994). El crecimiento de los transformantes se monitorea durante 5 días. Después de tres días, varios transformantes se recogen y se transfieren a placas SC-uracilo para preparación de ADN genómico y selección.

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Ejemplo 5

Aislamiento de ADN de Plásmido

El ADN del Plásmido se aísla de cultivos de E. coli utilizando el kit de aislamiento de plásmido Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 6

Secuenciamiento de ADN y análisis

Se desarrolla el secuenciamiento de ADN en Sequetech Corporation (Mountain View, CA) utilizando el secuenciador automatizado Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, CA). Las secuencias de ADN se analizan con los paquetes de software MacVector y Gene Works (Oxford Molecular Group, Campbell, CA).

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Ejemplo 7

Protocolos PCR

Se lleva a cabo amplificación PCR en un termociclizador Perkin Elmer utilizando el kit de enzima Ampli Taq Gold (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La siguiente amplificación exitosa, en algunos casos, los productos se digieren con las enzimas apropiadas y se purifican con gel utilizando QiaexII (Qiagen, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. En casos específicos la polimerasa Ultma Taq (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) o la polimerasa Expand Hi-Fi Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) se utilizan según las recomendaciones del fabricante o como se define en la tabla 3.

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TABLA 3 Condiciones de amplificación PCR utilizadas con diferentes combinaciones de cebador

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La Tabla 4 más adelante contiene una lista de cebadores utilizados para la amplificación PCR para construir vectores de integración de gen o para generar sondas para detección y aislamiento de gen.

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Ejemplo 8

Procedimiento PCR para colonia de levadura para confirmación de integración de gen en el genoma de C. tropicalis

Las colonias de levadura únicas se remueven de la superficie de placas de transformación, se suspenden en 50 \mul de amortiguador de esferoplasto (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.0 mg/ml Zimoliasa, 5% de glicerol) se incuba a 37ºC durante 30 min. Luego de incubación, la solución se calienta durante 10 min a 95ºC para lisar las células. Cinco \mul de esta solución se utiliza como una plantilla en PCR. La polimerasa Hi-Fi Taq expandida (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) se utiliza en PCR acoplada con un cebador específico de gen (gen a ser integrado) y un cebador URA3. Si no ocurre la integración, la amplificación produciría un producto PCR de tamaño predicho que confirma la presencia de un gen integrado.

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Ejemplo 9

Métodos de fermentación para estudios de inducción de gen

Se carga un fermentador con un medio de crecimiento semi sintético que tiene la composición 75 g/l de glucosa (anhidra), 6.7 g/l de base de nitrógeno de levadura (Difco Laboratories), 3 g/l de extracto de levadura, 3 g/l de sulfato de amonio sulfate, 2 g/l de fosfato monopotásico, 0.5 g/l de cloruro de sodio. Los Componentes se hacen como soluciones concentradas para autoclave luego de agregar el fermentador después de enfriamiento: pH final aproximadamente 5.2. Esta carga se inocula con 5-10% de un cultivo durante la noche de C. tropicalis ATCC 20962 preparado en medio YM (Difco Laboratories) como se describe en los métodos de los ejemplos 17 y 20 de la patente U.S. No. 5,254,466. El C. tropicalis ATCC 20962 es un POX 4 y POX 5 interrumpido de C. tropicalis ATCC 20336. Se suspende el aire y la agitación suministrada para mantener y disolver el oxígeno en más de aproximadamente 40% de saturación versus aire. El pH se mantiene en aproximadamente 5.0 a 8.5 por la adición de 5N soda cáustica en pH de control. una corriente de alimentación de ácido graso (ácido oleico comercial en este ejemplo) que tiene una composición típica: 2.4% C_{14}; 0.7% C_{14:1}; 4.6% C_{16}; 5.7% C_{16:1}; 5.7% C_{17:1}; 1.0% C_{18}; 69.9% C_{18:1}; 8.8% C_{18:2}; 0.30% C_{18:3}; 0.90% C_{20:1} y una carga de co-sustrato de glucosa se agregan en un modo de tanda de alimentación que comienza cerca del final del crecimiento exponencial. El cáustico se agrega sobre control de pH durante la bio-conversión de ácidos grasos a diácidos para mantener el pH en el rango deseado. Típicamente, las muestras para estudios de inducción de gen se recolectan justo antes del inicio de la admisión de ácidos grasos y durante las primeras diez horas de bio-conversión. La determinación de ácido graso y contenido de diácido se determina mediante un protocolo de metil éster estándar utilizando cromatografía líquida de gas (GLC) (ver Ejemplo 12). Se mide la inducción de gen utilizando el protocolo QC-RT-PCR descrito en esta solicitud.

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Ejemplo 10

Preparación de ARN

La primera etapa de este protocolo involucra el aislamiento del ARN celular total de cultivos de C. tropicalis. El ARN celular se aísla utilizando el mini kit Qiagen RNeasy (Qiagen Inc., Chatsworkh, CA) como sigue: se recolectan muestras de 2 ml de C. tropicalis del fermentador en tubos de estilo Eppendorf de tapa rosca de 2 ml estándar en varios momentos antes y después de la adición del ácido graso o sustrato alcano. Las muestras celulares se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido o un baño de hielo/alcohol después de su cosecha del fermentador. Para aislar el ARN total de las muestras, se le permite a los tubos congelarse en hielo y las células granuladas por centrifugación en una micro fuga durante 5 min a 4ºC y el super nadante se descarta mientras se mantiene el gránulo frío en hielo. Los tubos de microfuga se llenan 2/3, con glóbulos de Zirconia/Sílice enfriados con hielo (0.5 nun de diámetro, Biospec Products, Bartlesville, OK) y el tubo se llena en la parte superior con amortiguador de lisis RLT* enfriado con hielo (* amortiguador incluido con el mini kit Qiagen RNeasy). La ruptura celular se logra al colocar las muestras en un mezclador de mini glóbulo (Biospec Products, Bartlesville, OK) e inmediatamente homogenizado a velocidad completa durante 2.5 min. Las muestras se les permite enfriar en un baño de agua con hielo durante 1 min y el proceso de homogenización/enfriamiento se repite dos veces más durante un total de 7.5 min de homogenización en un mezclador de glóbulos. Las muestras celulares homogenizadas se microfugan a velocidad completa durante 10 min y 700 ml del super nadante que contiene ARN removido y transferido a un nuevo tubo eppendorf. Se agrega 700 ml de 70% etanol a cada muestra seguido por mezcla por inversión. Esta y todas las etapas posteriores se desarrollan a temperatura ambiente. Setecientos microlitros de cada muestra tratada con etanol se transfieren a una columna de spin Qiagen RNeasy, seguido por centrifugación a 8,000 x g durante 15 seg. El flujo se descarta y la columna se recarga con la muestra restante (700 ml) y se re-centrifuga a 8,000 x g durante 15 seg. La columna se lava una vez con 700 ml de amortiguador RW1*, y se centrifuga a 8,000 x g durante 15 seg. Y se descarta el flujo. La columna se coloca en un nuevo tubo de recolección de 2 ml y se lava con 500 ml de amortiguador RPE* y se descarta el flujo. El lavado RPE* se repite con centrifugación en 8,000 x g durante 2 min y se descarta el flujo. La columna spin se transfiere a un nuevo tubo de recolección de 1.5 ml y 100 ml de RNasa libre de agua se agrega a la columna seguido por centrifugación a 8,000 x g durante 15 segundos. Se agrega un adicional de 75 ml de agua libre de RNasa a la columna seguido por centrifugación en 8,000 x g durante 2 min. El ARN eluido en el flujo de agua se recolecta para purificación
adicional.

El eluado de ARN se trata luego para remover el ADN contaminante. Veinte microlitros de amortiguador de 10X DNasa I (0.5 M tris (pH 7.5), 50 mM CaCl_{2}, 100 mM MgCl_{2}), 10 ml de DNasa libre de RNasa 1 (2 Unidades/ml, Ambion Inc., Austin, Texas) y 40 unidades des Rnasin (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) se agregan a la muestra de ARN. La mezcla se incuba luego a 37ºC durante 15 a 30 min. Las muestras se colocan en hielo y se agrega 250 ml de Amortiguador de lisis RLT* y 250 ml etanol (200 prueba). Las muestras se mezclan luego por inversión. Las muestras se transfieren a columnas spin Qiagen RNeasy y se centrifugan a 8,000 x g durante 15 seg. Y se descarta el flujo. Las columnas se colocan en tubos de recolección nuevos de 2 ml y se lavan dos veces con 500 ml de amortiguador de lavado RPE* y se descarta el flujo. Las columnas se transfieren a tubos de 1.5 ml eppendorf nuevos y se elue el ARN mediante la adición de 100 ml de agua tratada con DEPC seguido por centrifugación a 8,000 x g durante 15 seg. El ARN Residual se recolecta al agregar 50 ml adicional de agua libre de RNasa a la columna spin seguido por centrifugación a velocidad completa durante 2 min. 10 ml de la prelación de ARN se remueve y se cuantifica mediante el método (A_{260/280}). El ARN se almacena a - 70ºC. Se encuentra que los rendimientos son de 30-100 mg de ARN por 2.0 ml de caldo de cultivo de fermentación.

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Ejemplo 11

Protocolo de reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa competitiva cuantitativa (QC-RT-PCR)

El QC-RT-PCR es una técnica utilizada para cuantificar la cantidad de una ARN específico en una muestra de ARN. Esta técnica emplea la síntesis de una molécula de ADN específica que es complementaria con una molécula de ARN en la muestra original mediante transcripción inversa y su posterior amplificación por reacción de cadena polimerasa. Mediante la adición de varias cantidades de una molécula de ARN competidor con la muestra uno puede determinar la concentración de la molécula de ARN de interés (por ejemplo, la transcripción mARN del gen CYTb5). Los niveles de transcripciones de mARN específicos se ensayan durante el tiempo en respuesta a la adición de ácido graso o sustratos alcano para el medio de crecimiento de cultivos C. tropicalis de crecimiento de fermentación para la identificación y caracterización de los genes involucrados en la oxidación de estos sustratos. Este enfoque se utiliza para identificar el gen CYTb5 involucrado en la oxidación de cualquier sustrato dado con base en su regulación transcrip-
cional.

A. Diseño de cebador

El primer requerimiento para el QC-RT-PCR es el diseño de los pares cebador a ser utilizados en la transcripción inversa y la posterior reacción PCR. Estos cebadores necesitan ser únicos y específicos para el gen de interés. Los cebadores utilizados para medir la expresión del gen CYTb5 de C. tropicalis 20336 que utilizan el protocolo QC-RT-PCR se listan en la tabla 5.

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TABLA 5 Cebadores utilizados para medir la expresión del gen C. tropicalis CYTB5 en las reacciones QC-RT-PCR

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B. Diseño y síntesis de la plantilla de ADN competidor

El ARN competidor se sintetiza in Vitro a partir de una plantilla de ADN competidor que tiene el promotor de polimerasa T7 y lleva preferiblemente una pequeña eliminación de por ejemplo, aproximadamente 10 a 25 nucleótidos con relación a la secuencia ARN objetivo nativa. La plantilla de ADN para la síntesis in vitro del competidor de ARN se sintetiza utilizando cebadores PCR que están entre 42 y 46 nucleótidos de longitud. En este ejemplo, los pares de cebador para la síntesis del ADN competidos CYTb 5 se muestran en la tabla 6.

TABLA 6 Cebadores Delantero e inverso utilizado para sintetizar la plantilla de ARN competidor para la medición de QC-RT-PCR de la expresión del gen CYTb5

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El cebador delantero se utiliza con el cebador inverso correspondiente para sintetizar la plantilla de ADN competidor. Los pares cebadores se combinan en una reacción PCR de polimerasa Taq Gold estándar de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA). La mezcla de reacción contiene una concentración final de 250 nM de cada cebador y 10 ng de ADN cromosómico de C. tropicalis para la plantilla. La mezcla de reacción se coloca en un termociclizador durante 25 a 35 ciclos utilizando la mayor temperatura de hibridación posible durante las reacciones PCR para asegurar un producto PCR homogéneo (en este caso 62ºC). Los productos PCR son purificados ya sea con gel o filtrados purificados para remover los nucleótidos no incorporados y cebadores. La plantilla de ADN competidor se cuantifica luego utilizando el método (A_{260/280}).

C. Síntesis del ARN competidor

El ADN de plantilla competidor se transcribe in vitro para hacer el ARN competidor utilizando el kit Megascript T7 De Ambion Biosciences (Ambion Inc., Austin, Texas). 250 nanogramos (ng) de plantilla de ADN competidor y los reactivos de transcripción in vitro se mezclan de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. La mezcla de reacción se incuba durante 4 horas a 37ºC. Las preparaciones de ARN resultantes se revisan luego mediante electrofóresis de gel para las condiciones dado los mayores rendimientos y calidad del ARN competidor. Esto requiere frecuentemente optimización de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La plantilla de ADN se remueve luego utilizando DNasa I como se describe en el kit Ambion. El competidor ARN se cuantifica luego mediante le método (A_{260/280}). Diluciones en serie del ARN (1 ng/ml a 1 femtograma (fg)/ml) se hacen para uso en las reacciones QC-RT-PCR y se almacenan la materia prima original a -70ºC.

D. Reacciones QC-RT-PCR

Las reacciones QC-RT-PCR se desarrollan utilizando la polimerasa rTth de Perkin-Elmer(Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. La reacción de transcripción inversa se desarrolla en un volumen de 10 ml con una concentración final de 200 mM de cada uno de los dNTP, 1.25 unidades de Ruth de polimerasa, 1.0 mM de MnCl_{2}, 1X del amortiguador 10X suministrado con la enzima del fabricante, 100 ng de un ARN total aislado de un cultivo de crecimiento de fermentador de C. tropicalis y 1.25 mM del cebador inverso apropiado. Para cuantificar la expresión CYTb5 en C. tropicalis un cebador inverso apropiado es 5' CTTCCGTGCTGAACGACTGCG 3' (3740-179C). Varias mezclas de reacción se preparan para cada muestra de ARN caracterizada. Para cuantificar la expresión CYTb5 una serie de 8 a 12 de las mezclas de reacción QC-RT-PCR descritas anteriormente se dividen en alícuotas para diferentes tubos de reacción. Cada tubo de reacción de 1 ml de una dilución en serie contiene 100 pg a 100 fg del ARN competidor CYTb5 por ml que se agrega al llevar las mezclas de reacción final hasta el volumen final de 10 \mul. Las mezclas de reacción QC-RT-PCR se mezclan y se incuba, a 70ºC durante 15 min de acuerdo con los tiempos recomendados por el fabricante para que ocurra la transcripción inversa. En la terminación de la incubación de 15 minutos, la temperatura de la muestra se reduce a 4ºC para detener la reacción y 40 \mul de la mezcla de reacción PCR se agrega a la reacción para llevar el volumen total hasta 50 \mul. La mezcla de reacción PCR consiste de una solución acuosa que contiene 0.3125 mM del cebador delantero 5' CACACCACCCAC
GACGACTTGTG 3' (3740-179A), 3.125 mM MgCl_{2} y 1X de amortiguador quelante suministrado con la enzima de Perkin-Elmer. Las mezclas de reacción se colocan en un termociclizador (Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) y se desarrolla el siguiente ciclo PCR: 94ºC durante 1 min. seguido por 94ºC- durante 10 segundos seguido por 58ºC durante 40 segundos durante 17 a 22 ciclos. La reacción PCR se completa con una incubación final a 58ºC durante 2 min seguido por 4ºC. En algunas reacciones en donde los productos PCR no se detectan se producen las muestras que se regresan al termociclizador para ciclos adicionales, este proceso se repite hasta que se produce suficientes productos PCR para cuantificar utilizando HPLC: El número de ciclos necesarios para producir suficiente producto PCR es una función de la cantidad del objetivo mARN en los 100 ng de ARN celular total. En cultivos en donde el gen CYTb5 se expresa altamente hay suficiente mensaje CYTb5 mARN presente y menos ciclos PCR (<17) que se requieren para producir cantidad cuantificable de producto PCR. Las concentraciones más bajas del mARN objetivo presentan los mayores ciclos PCR que se requieren para producir una cantidad detectable de producto.

E. Cuantificación HPLC

Luego de la terminación de las reacciones QC-RT-PCR las muestras se analizan y cuantifican por HPLC. Cinco a quince microlitros de la mezcla de reacción QC-RT-PCR se inyectan en un HPLC 625 Bio-Compatible Waters con un detector ajustable 484 Waters. El detector se configure para medir una longitud de onda de 254 nm. El HPLC contiene una columna Sarasep marca DNASep^{TM} (Sarasep, Inc., San Jose, CA) que se coloca dentro del horno y la temperatura se configura a 52ºC. La columna se instala de acuerdo con la recomendación del fabricante de tener 30 cm de tubería PEEK calentada e instalada entre el inyector y la columna. El sistema se configure con una columna Sarasep marca Guard posicionada antes del inyector. Adicionalmente, hay un disco de filtro de 0.22 mm justo antes de la columna, dentro del horno. Se utilizan dos amortiguadores para crear un gradiente de elusión para redisolver y cuantificar los productos PCR a partir de las reacciones QC-RT-PCR. El amortiguador A consiste de 0.1M acetato de trietill amonio (TEAA) y 5% acetonitrilo (volumen a volumen). Amortiguador-B que consiste de 0.1 M TEAA y25% acetonitrilo (volumen a volumen). Las muestras de QC-RT-PCR se inyectan en el HPLC y el gradiente lineal de 75% de amortiguador-A/25% amortiguador-B a 45% amortiguador-A/55% B que se corre durante6 min a una tasa de flujo de 0.85 ml por minuto. El producto QC-RT-PCR del competidor de ARN que es más pequeño se eluye de la columna HPLC antes del producto QC-RT-PCR del CYTb5 mARN (U). La cantidad de los productos QC-RT-PCR se grafican y se cuantifican con el módulo de datos 745 de Waters Corporation adjunto. Las proporciones log de la cantidad de producto CYTb5 mRNA QC-RT-PCR (U) a producto QC-RT-PCR competidor (C), según se mide por áreas pico, se grafican y la cantidad de ARN competidor requerido para igualar la cantidad de productos de CYTb5 mRNA determinado.

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Ejemplo 12

Evaluación de nuevas Cepas en Frascos de Agitación

Las cepas CYTb5 y CPR amplificadas tales como las cepas HDC11-1 y HDC11-2 yH5343 se evalúan para la producción diácido en frascos de agitación. La producción diácido de las cepas CYTb5 y CPR también se compara con la producción diácido de varias cepas modificadas genéticamente de C. tropicales 20336 [(HDC1-que contienen copias adicionales del gen CYP52A2A (Figuras 7A-7B); El HDC 10-2-contiene copias adicionales del gen CPRB gene (Figuras 4A-4B); HDC-15-contiene copias adicionales del gen CYP52A5A (Figuras 12A-12C); HDC16-2-contiene copias adicionales del gen CPRB y del gen CYP52A5A (Figuras 4A-4B y 12A-12C, respectivamente); y HDC23-3-contiene copias adicionales del gen CPRB y CYP55A2A (Figuras 4A-4B y7A-7B, respectivamente) que se construyen de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente U. S. No. 6,331,420 y WO 00/20566 A2.

A. Protocolo Estándar para Frasco de Agitación

Se inocula 100 ml de YEPD (Apéndice) con 1 ml de materia prima de glicerol preparada de C. tropicalis seguido por la adición de 1 gota de antiespumante SAG471 (dimetilopolisiloxano, disponible comercialmente de Osi Specialties, Sistersville, WV). Al cultivo se le permite crecer durante 20 hrs en un agitador a 30ºC a 300 rpm. El cultivo de 100 ml se transfiere luego al medio DCA2 (Apéndice) mediante combinación;

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La suspensión celular se divide en cinco frascos de agitación de 2000 ml seguido por la adición de una gota de SAG471. El cultivo se le permite crecer durante 30 hrs en un agitador a 30ºC a 300 rpm. El medio se transfiere a botellas plásticas de autoclave y luego las células se centrifugan a 4068 g durante 5 min. El super nadante se descarta y las células se resuspenden en DCA3 (Apéndice):

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La suspensión celular se asigna a 500 ml en frascos de agitación en cantidad de 50 ml y 10% de w/v de octadecano (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) o se agrega 3% w/v ácido oleico (Fisher Scientific Co.). La bioconversión se permite tener lugar en una incubadora de agitación a 30ºC y 300 \mum por 48 hrs. Posteriormente, los cultivos se almacenan congelados a -20ºC en el frasco de agitación. Antes del análisis los cultivos se descongelan y se calientan a 70ºC, se mezclan y se transfieren a tubos Falcon de 50 ml. Las muestras se cosechan y las concentraciones de diácido se analizan mediante el procedimiento descrito adelante. LA Figura 18 describe el esquema utilizado para la extracción y el análisis de diácidos y inonoácidos de los caldos de cultivos de las fermentaciones.

B. Protocolo de la Concentración de Biomasa 1. Muestras de Ácidos Oléico

Las muestras se calientan a 70ºC y se centrifugan para mezclar. Una alícuota de cada muestra (10 ml) se transfiere luego a un tubo Falcon de 50, seguido por la adición de 2.5 ml KOH (7%). Cada tubo Falcon se centrifuga durante 10 min a 3000 rpm y se descarta el supernadante. Luego se agrega agua (15 ml) a cada tubo Falcon que contiene células centrifugadas. Sí el super nadante es claro luego de la adición del agua a las células centrifugadas, entonces las células se secan en un horno a 80ºC hasta que dos pesos secos toman horas a parte que permanecen iguales. Sí el supernadante es turbio luego de la adición del agua a las células centrifugadas, se agrega 2.5 ml KOH (7%) luego de la adición de KOH, las células centrifugadas de cada tubo se resuspenden al centrifugar, y recentrifugar durante 10 min a 3000 rpm seguido por remoción del supernadante. Luego las células se lavan con 15 ml de agua y se resuspenden mediante centrifugación. Las células se resuspenden en agua, se recentrifugan durante 10 min a 3000 rpm y el supernadante se descarta. Las células se resuspenden en un volumen pequeño de agua, se centrifugan y se vierten en botes de aluminio seco, repesados. Cada tubo Falcon se enjuaga luego 1-2 veces con agua en botes secos. Los botes secos se secan en un horno a 80ºC hasta que dos pesos secos toman dos horas a parte que permanecen iguales.

2. Muestras de Octadecano

Las muestras se calientan a 70ºC y se centrifugan para mezclar. Una alícuota A 10 ml se transfiere a un tubo Falcon de 50 ml, seguido por la adición de 2.5 ml KOH (7%). Luego se agrega hexano (5 ml) a cada tubo Falcon y se mezcla mediante centrifugación. Cada tubo Falcon que contiene muestra se centrifuga luego durante 10 min a 3000 rpm y el supernadante se descarta. Luego se agrega agua (15 ml) a las células centrifugadas que se resuspenden mediante centrifugación. Las células resuspendidas en cada tubo se centrifugan luego durante 10 min a 3000 rpm y luego se descarta el supernadante. Las células centrifugadas se lava con 15 ml de agua, se resuspenden en el agua a centrifugar y se centrifuga a 10 min a 3000 rpm. El supernadante se descarta y las células se resuspenden en un volumen pequeño de agua, se centrifugan y se vierten en botes de aluminio pre-pesados. Cada tubo Falcon se enjuaga 1-2 veces con agua en botes secos, y luego se secan en un horno a 80ºC.

C. Protocolo de Extracción-Extracción de Caldo de Cultivo Utilizando Metil-t-butiléter

Las muestras se calientan a 70ºC. Un frasco EPA con tapa se alquitrana sobre una balanza de dos puestos. Luego se pesa un caldo de cultivo de muestra en cada frasco y se registra el peso. La balanza se alquitrana y luego se pesa un estándar interno de un gramo (C15 Monoácido en KOH [10 g/kg]). El frasco se tapa y se agita para mezclar. Las etapas mencionadas anteriormente se repiten para todas las muestras, usualmente se corren en grupos de 6 a la vez. Posteriormente se le remueve la tapa a los frascos. Se pipetea HCl (6N, 6.8 ml)en cada frasco que se tapa y se agita para mezclar. Luego se agrega Metil-t-butiléter (20 ml) a cada frasco, que se tapa y se centrifuga durante 1 min. Luego se pesa Sulfato de magnesio Anhídro (MgSO_{4}, 5 g) en un plato para peso. Cada frasco se agita luego y se agrega inmediatamente MgSO_{4} a cada frasco de agitación. Cada frasco se tapa herméticamente y se le da una agitación rápida. Posteriormente, la tapa en cada frasco se afloja cuidadosamente para aliviar la presión. La tapa en cada frasco se apreta y el frasco se centrifuga durante 1 min. Las etapas de la adición de MgSO_{4} para centrifugar el frasco tapado se repite para cada frasco. Los frascos se enfrían luego durante aproximadamente 5 min y se centrifugan durante 1 min. Los contenidos de los frascos se les permite reposa. Un frasco de 4 ml se etiqueta para cada muestra y 1 ml de solución de cada frasco EPA se pipetea en cada frasco de 4 ml etipetado.

D. Metilación de Material Extractado

Trifluoruro de Boro (1 ml) en reactivo de methanol (BF_{3}-MeOH) se agrega a cada frasco de 4 ml. Los frascos se tapan luego y se agitan para mezcla. Posteriormente, los frascos se colocan en un bloque seco de 50ºC y se dejan en el bloque seco durante un total de 20 min. Los frascos luego se remueven del bloque y se enfrían durante 5 min, seguido por la adición de 0.5 ml de hexano a cada frasco. Luego de la adición de una solución de NaCl saturado (5 ml) a cada frasco (71.5 g NaCl en 200 ml de agua destilada), los frascos se tapan luego y se agitan durante 1 min. Cada frasco se le permite reposar hasta que se separan las capas. Posteriormente, se etiqueta un frasco para cromatografía de gas (GC) para cada muestra. La mayor parte de la capa superior del frasco de 4 ml se transfiere luego al frasco GCl. La capa inferior del frasco de 4 ml no se transfiere al frasco GC. Cada frasco GC se tapa luego cuidadosamente y se coloca en la bandeja de automuestreado GC. Una vez se cargan todas las muestras del día, se inicia el GC. Durante una serie, usualmente dos blancos de methanol se emplean utilizando el método almacenado como TEMP.MET en el integrador al inicio del día para preparar el GC. Un blanco de methanol se corre después de 10 muestras y como la última muestra mantiene la columna GC limpia. Las condiciones GC son como siguen:

\bullet: HP-Innowax 30 m por 32 mm ID columna con 0.5 m de espesor de película

\bullet: Proporción de división 1:100

\bullet: Presión de cabeza de columna 13.5 psig

\bullet: Temperatura de inyector 240ºC

\bullet: Temperatura de detector FID 250ºC

\bullet: Programa de temperatura de horno:

\bullet: 90ºC rampa a 190ºC a 7ºC/min luego rampa 250ºC a 12ºC/min y se mantiene durante 30 min.

Esto se guarda en integradores como DCAME2.MET.

Los resultados de los frascos se muestran adelante en las 7-10.

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TABLA 7 Bioconversión de 3% w/v de ácido oléico mediante diferentes cepas recombinantes de Candida tropicallis

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TABLA 8 Bioconversión de 3% p/v de ácido oléico mediante cepas recombinantes de Candida tropicales

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TABLA 9 Bioconversión de octadecano mediante cepas recombinantes de Candida tropicalis

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TABLA 10 Bioconversión de octadecano mediante diferentes cepas recombinantes de Candida tropicalis

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Estos datos demuestran que la producción diácido se incrementa en cepas C. tropicalis modificadas genéticamente HDC11- y HDC11-2 que contiene un número de copia incrementada de genes CY7b5/CPRB comparado con la cepa tipo silvestre H5343. La producción de diácido también se incrementa en las cepas C. tropicalis modificadas genéticamente HDC10-2, HDC15, HDC16-2, y HDC23-3.

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Ejemplo 13

Clonación y caracterización de genes CPR y b5 citocromo C. tropicalis 20336 (CYTb5) A. Clonación del gen CYTb5 de C. tropicalis 20336

El gen CYTb5 se aisla de la tercera librería genómica utilizando un fragmento PCR como una sonda. La sonda de fragmento PCR para CYTb5 se genera después de amplificación PCR de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae con cebadores de oligonucleótido que se designan para amplificar una región que utiliza el gen CY7b5 disponible de S. cerevisiae del Centro Nacional para Información de Biotecnología. Un cebador delantero 3698-66A.

El 5' ATAAGAATCCGGCCGCTGAACGAGCCAGAACCACATCCACATCCAGGAG 3' y a cebador inverso 3698-66B 5' CCTTAATrAAGGATAACCACATCcATACGTCGC 3' se hacen basado en la secuencia de S. cerevisiae GYTb5. Estos cebadores se utilizan en combinaciones en forma de pares en una reacción de PCR con ADN polimerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. Un producto PCR de aproximadamente 1036 bp se obtiene. Este producto se purifica de gel azarosa utilizando Qiaquick (Qiageno, Chatsworth, CA) y se liga al vector pCR2.1^{TM} (LA Figura 19. Invitrogen LaJolla, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Este fragmento PCR se utiliza como una sonda en el aislamiento del homólogo C. tropicalis 20336 CYTb5. La tercer librería genómica se selecciona utilizando esta sonda CYTb5 y un clon que contiene el gen CYTb5 se obtiene de longitud completa. El clon contiene un gen que tiene regiones de codificación de proteína y regulación (LAS Figuras 1A-1 C). Un cuadro de lectura abierta de 387 nucleótidos codifican una proteína CYTb5 de 129 aminoácidos (Figuras 1A-1C).

B. Confirmación de Función del gen CYTb5 clonado

El CYP51, lanosterol 14\alpha-desmetilasa, es el sitio de acción de la mayoría de categorías de agentes antifúngicos denominados DMI para inhibidores de desmetilasa. Agentes terapéuticos tales como ketoconazole (Kc), un agente antifúngico imidazol N-sustituido proporciona un ensayo conveniente para la actividad CYP51 basado en las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) como se describe en Vanden Bossche et al., Antimicrobial Agents Chemother. 17:922-928, 1980. Las cepas S. cerevisiae cpr deficientes en reductasa (cpr) P450 citocromo han mostrado ser hipersensibles al Kc, debido al la reducción en el flujo de electrones para CYP5T, el objetivo de Kc como se describe en Sutter y Loper, supra. La recuperación de esta hipersensibilidad se logra al clonar genes basados en la transformación de una librería genómica tipo silvestre en un vector multicopia dentro de una cepa cpr1 como se describe en Truan et al., supra. Los genes responsables para la recuperación de esta sensibilidad al Kc se muestran por ser aquellos que codifican el CYTb5 citocromo, que muestran que en este sistema, CYTb5 es capaz de imitar la funcionalidad CPR cuando está presente en altos números de copia. La inhibición del aldosterol desmetilasa mediante una cierta concentración de Kc resulta en la radiación de crecimiento de S. cerevisiae. En la ausencia de CPR, la inhibición de crecimiento es más pronunciada y ocurre en una concentración mas baja de Kc. En la ausencia de gen CPR, el gen CYTb5 puede suprimir el fenotipo a server como el donante de electrones para CYP51, a pesar de la ineficiencia, y alivia parcialmente el efecto supresor de crecimiento de Kc. Por lo tanto, el S. cerevisiae recombinante que contiene un C. tropicales CYTb5 será capaz de crecer en un medio que contiene niveles intermedios de Kc. Este ensayo se utiliza para confirmar que los genes C. tropicalis clonados codifican para CYTb5.

El gen CYTb5 se clona bajo el control de un promotor GAL presente en el vector de expresión de S. cerevisiae que contiene CpYE5 que se introduce en el mutante S. cerevisiae DC10 que contiene un gen CPR interrumpido y la cepa recombinante se coloca en placas en un medio mínimo que contiene diferentes concentraciones de Kc. La cepa DC10 que contiene el gen CPR del S. cerevisiae tipo silvestre (en el plásmido pTS20) y el gen CY7b5 de C. tropicalis (en el plásmido pYES2b5) es capaz de crecer en medio mínimo que contiene 0.078 mg/ml de Kc. De otra parte, el DC10 que lleva el pYES2.0 sin ningún inserto es capaz de crecer en concentraciones de 0.039 mg/ml de Kc. Las cepas recombinantes se prueban en cultivos líquidos para confirmar el resultado de las placas. Mientras que el DC10 contiene pYES2.0 sin ningún inserto es capaz de crecer en 0.0024 mg/ml de Kc, el DC10 que expresa b5 del promotor GAL es resistente a 0.0098 mg/ml de Kc. Esto confirma que el gen clonado codifica para la CYTb5.

C. Clonación y caracterización de los genes CPR de C. tropicalis 20336

Para clonar el CPR se utiliza una sonda heteróloga basada en la secuencia de ADN para la secuencia del gen CPR de C. tropicalis 750 para aislar el gen CPR C. tropicalis 20336

1) Clonación del alelo CPRA

Aproximadamente 25,000 partículas fago de la primera librería genómica de C. tropicalis 20336 se seleccionan con un fragmento de 1.9 kb Bam HI - Nde I del plásmido pCU3RED (Ver Picattagio et al., Bio/Tecbnology 10:894-898 (1992), que contiene la mayoría del gen CPR C. tropicalis 750. Cinco clones que hibridan la sonda se aislan y el plásmido de ADN de estos clones lambda se rescata y caracterizan por análisis de enzima de restricción. El análisis de enzima de restricción sugiere que todos los cinco clones son idénticos pero no es claro que está presente un gen CPR completo.

El análisis PCR se utilice para determinar si un gen GPR completo está presente en cualquiera de los cinco clones. Los cebadores degenerados se preparan para regiones altamente conservadas de genes CPR conocidos (Ver Sutter et al, J. Biol. Chem. 265:16428-1636,1990) (LA Figura 21). Se sintetizan dos cebadores de grasa en la región de unión FMN (FMN1 y FMN2). Un cebador se sintetiza para la región de unión PAD (FAD), y un cebador para la región de unión NADPH (NADPH) (Table 4). Esos cuatro cebadores se utilizan en experimentos de amplificación PCR utilizando como un aislado de ADN de plásmido plantilla cuatro de los cinco clones descritos anteriormente. Los cebadores FMN y FAD sirven como cebadores delanteros y el cebador NADPH como el cebador inverso de las reacciones PCR. Cuando se utilizan diferentes combinaciones de cebadores inversos y delantero, no se obtienen productos PCR de cualquiera de los plásmidos. Sin embargo, todos los productos de tamaño esperado amplificado de combinaciones de cebador con un plásmido que contiene el gen CPR C. tropicalis 750 (control positivo). Probablemente la mayor razón para la falla de los pares de cebadores para amplificar un producto, es que todos los cuatro clones contienen un gen CPR truncado. Uno de los cuatro clones (pHKM1) se secuencia utilizando los cebadores Triplex 5' y el Triplex 3' (Table 4) cuyo flanco en el inserto y en el sitio de clonación múltiple en el vector de clonación y el cebador degenerado basado en el sitio de unión NADPH descrito anteriormente. El cebador NADPH falla en producir cualquier dato de secuencia y esto es consistente con el análisis PCR. Las secuencias obtenidas con los cebadores Triplex se comparan con la secuencia CPR de C. tropicalis 750 utilizando el programa Mac vector^{TM} (Oxford Molecular Group, Campbell, CA). La secuencia obtenida con el cebador Triplex 3' mostró similitud con una secuencia interna del gen CPR C. tropicalis 750 que confirma que el pHKM1 contiene una versión truncada de un gen CPR 20336, el pHKM1 tiene un inserto de 3.8 kb el cual incluye una región de codificación 12 kb del gen CPR acompañado por 2.5 kb de ADN ascendente (Figura 22). Aproximadamente 0.85 kb del gen CPR 20336 CPR que codifica la porción C-terminal de la proteína CPR se pierde de este clon.

En razón de que la primera librería Clontech produce un gen CPR truncado, la segunda librería prepara por Clontech se selecciona para aislar un gen CPR de longitud completa. Se obtiene tres clones putativos CPR. Los tres clones, que tienen insertos en el rango de 5-7 kb, se designan pHKM2, pHKM3 y pHKM4. Todos los tres se caracterizan por PCR utilizando los cebadores degenerados descritos anteriormente. Los productos pHKM2 y pHKM4 dan productos PCR con dos conjuntos de cebadores internos. El pHKM3 da un producto PCR con los cebadores FAD y NADPH lo que sugiere que este clon probablemente contiene un gen CPR truncado. Los tres plásmidos se secuencian parcialmente utilizando los dos cebadores Triples y un tercer cebador cuya secuencia se selecciona de la secuencia de ADN cercada al extremo truncado del gen pHKM1. Este análisis confirma que el pHKM2 y 4 tienen secuencias que translapan el pHKM1 y que ambas contienen la región 3' de la región del gen CPR que desaparece de pHKM1. Las porciones de los insertos pHKM1 y pHKM4 se secuencian y el gen CPR de longitud completa se identifica. Con base en la secuencia de ADN y análisis PCR se concluye que el pHKM1 contiene el promotor putativo de la región y 1.2 kb de la secuencia que codifica una porción (5' end) de un gen CPR. El pHKM4 tiene 1.1 kb de AND que translapa el pBKM1 y contiene el restante (3' and) de un gen CPR junto con la región no traducida descendente (Figura 23). Ambos de estos dos plásmidos contienen un gen CPRA completo con una región promotora en la dirección 5'. El CPRA es de 4206 nucleótidos de longitud e incluye una región reguladora y una región de codificación de proteína (definida por los nucleótidos 1006-3042) que es de 2037 bases pares de longitud y codifican para una proteína putativa de 679 aminoácidos (Figuras 2A-2B y 3A-3C, respectivamente). La proteína CPRA, cuando se analiza mediante el programa de alineación de proteína del paquete softwaze GeneWorks^{TM} (Oxford Molecular Group, Campbell, CA), mostró homología extensiva a proteínas CPR a C. tropicalis 750 y C. maltosa.

2) Clonación del alelo CPRB

Para clonar el Segundo alelo CPR, la tercera librería genómica, preparada por Henkel, se selecciona utilizando fragmentos de ADN de pHKM1 y pHKM4 utilizados como sondas. Se obtienen cinco clones y estos se secuencian con los tres cebadores internos utilizados para secuencias CPRA. Estos cebadores se designan PRK1.F3, PRK1.F5 y PRK4.R20 (Table 4) y dos cebadores externos (M13-20 y T3 [Stratagene]) para la región de poliligador presente en el vector de clonación pBK-CMV. Los análisis de secuencias sugieren que cuatro de estos clones, designados pHKM5 to 8, contienen insertos que son idénticos al alelo CPRA aislado anterior. Todos los cuatro parecen contener ungen CPR de longitud completa. El quinto clon es muy similar al alelo CPRA, especialmente en la región de cuadro de lectura abierta en donde la identidad es muy alta. Sin embargo, hubo diferencias muy significativas en las regiones no traducidas 5' y 3'. Esto sugiere que el quinto clon es el alelo para el CPRA. El plásmido se designa pHKM9 (Figura 24) y una región de 4.14 kb de este plásmido se secuencia y el análisis de esta secuencia confirma la presencia del alelo CPRB, que incluye una región reguladora y una región de codificación de proteína (definida por nucleótidos 1033-3069) como se muestra en las Figuras 4A-4B. La secuencia de aminoácido de la proteína CPRB se muestra en las Figuras 5A-5C.

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Ejemplo 14

Identificación del Gen CYTb5 Inducido por Ácidos Grasos Seleccionados y Substratos Alcano

Los genes cuya transcripción se enciende por la presencia de ácidos grasos seleccionados o sustratos alcano se han identificado usando el ensayo QC-RT-PCR. Este ensayo se utiliza para medir la expresión del gen CYTb5 en cultivos de crecimiento en fermetador de C. tropicalis ATCC 20962. Este método involucra el aislamiento de ARN celular total de cultivos de C. tropicalis y la cuantificación de un mARN muy específico dentro de aquella muestra a través del diseño y uso de secuencia específica, cebadores QC-RT-PCR y un competidor ARN. La cuantificación se logra a través del uso de concentraciones conocidas de competidor ARN homólogos en las reacciones QC-RT-PCR. El cADN amplificado por QC-RT-PCR resultante se separa y se cuantifica a través del uso de fase inversa de HPLC de fase inversa de pares de ión. Este ensayo se utiliza para caracterizar la expresión del gen CYTb5 de C. tropicalis ATCC 20962 en respuesta al ácido graso y sustrato de alcano. Los genes que se incluyen se identifican mediante el cálculo de su concentración de mARN en varios momentos antes y después de inducción. La Figura 25 suministra un ejemplo de cómo la concentración de mARN para CYTb5 se puede calcular utilizando el ensayo QC-RT-PCR. La proporción log desconocido (U) a producto competidor (C) se grafica versus la concentración de ARN del competidor presente en las reacciones QC-RT-PCR. La concentración del competidor que resulta en una proporción log de U/C de cero, representa el punto en donde la concentración de ARN mensajero desconocida es igual a la concentración del competidor. LA Figura 25 permite el cálculo de la cantidad de mensajes CYTb5 presente en 100 ng de ARN total aislado de muestras celulares tomadas en 0, 0.5, 1, 2, y 3 horas después de la adición de Emersol® en una serie de fermentador. A partir de este análisis, es posible determinar la concentración de CYTb5 mARN presente in 100 mg de ARN celular total. En la gráfica contenida en la LA Figura 25 esta toma 113.75 pg de competidor para igualar el número de mARNs de CYTb5 en 100 ng de ARN aislado de células justo antes (tiempo 0) de la adición del sustrato, Emersol®. En muestras celulares tomadas en 0.5, 1, 2, y 3 horas después de la adición de Emersol® esta toma 293.69, 356.01, 372.24, y 264.61 pg de competidor ARN, respectivamente. Los resultados obtenidos durante esta serie de fermentación según se mide por QC-RT-PCR también se expresa como inducción relativa del gen CYTb5 como se muestra en la tabla11 adelante.

Emersol®

Estos datos demuestran que el CYTb5 se induce más de 3.0 veces dentro de una hora después de la adición de Emersol®. Este análisis demuestra claramente que la expresión CYTb5 en C. tropicalis 20962 se puede inducir por la adición de Emersol® al medio de crecimiento.

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Ejemplo 15

Integración de los genes CYTb5 y CPRB seleccionados dentro del Genoma de Candida tropicales

Con el fin de integrar los genes seleccionados dentro del cromosoma de C. tropicalis 20336 o sus descendientes, hay una secuencia de ADN objetivo, que puede o no ser un gen intacto, dentro del cual se pueden insertar los genes. También debe haber un método para seleccionar el evento de integración. En algunos casos la secuencia de ADN objetivo y el marcador seleccionable son los mismos y, sí es así, entonces debe haber también un método para obtener uso del gen objetivo como un marcador seleccionable siguiendo el evento de integración. En C. tropicalis y sus descendientes, un gen que se ajusta con estos criterios es el URA3A, que codifica orotidina-5'-fosfato descarboxilasa. Utilizando este como un objetivo para integración, las variantes URA^{-} de C. tropicalis se pueden transformar en tal una forma para regenerar un genotipo URA^{+} por vía de recombinación homóloga (Figura 26). Dependiendo del diseño del vector de integración, se pueden integrar uno o más genes dentro del genoma al mismo tiempo. Utilizando un gen URA3A de división orientado como se muestra en la Figura 27, la integración homóloga produciría por lo menos una copia del gen de interés que se inserta entre las porciones divididas del gen URA3A. Más aún, debido a la alta similitud de secuencia entre los genes URA3A y URA3B, la integración del constructor puede ocurrir en ambos lugares URA3A y URA3B. Posteriormente, un oligonucleótido diseñado con una eliminación en una porción del gen URA basado en la secuencia idéntica a través de los genes URA3A y URA3B, se puede utilizar para producir los transformantes C. tropicalis que son de nuevo una vez URA^{-} pero que todavía llevan uno o más genes de elección integrados nuevamente (Figura 26). Las variantes Ura^{-} de C. tropicalis también se pueden aislar por vía de otros métodos tal como mutagénesis clásica o mutación espontanea. Utilizando bien los protocolos establecidos, la selección de las cepas URA^{-} se puede facilitar mediante el uso de ácido 5-fluoroorotico (5-FOA) como se describe, por ejemplo, en Boeke et al, Mol. Gen. Genet. 197:345-346 (1984). La utilidad de este enfoque para la manipulación de este punto C. tropicalis se ha documentado bien como se describe, por ejemplo, en Picataggio et al., Mol. and Cell. Biol. 11:4333-4339 (1991); Rohrer et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:650-654 (1992); Picataggio et al., Biol/Technology 10:894-898 (1992); patente U.S. No. 5,648,247; patente U.S. No. 5,620,878; patente U.S. No. 5,204,252; patente U.S. No. 5,254,466.

A. Construcción, de un vector de integración URA, pURAin.

Se diseñan cebadores y se sintetiza con base en la secuencia 1712 bp del gen URA3A de C. tropicalis 20336 (ver Figura 28), cebador URA3A Set #1a y #1b (Tabla 4) en PCR con cADN genómico de C. tropicalis 20336 para amplificar las secuencias URA3A entre nucleótidos 733 y 1688 como se muestra en la Figura 28. Los cebadores se diseñan para introducir los sitios de restricción 5' Asc I y 3' Pac I dentro del fragmento URA3A amplificado resultante. Los sitios Asc I y Pac I se escogen debido a que estos sitios no están presentes dentro del gen CYTb5 o CPRB. Se utiliza el cebador URA3A Set #2 en PCR de ADN genómico de C. tropicalis 20336 como una plantilla, para amplificar las secuencias URA3A entre el nucleótido 9 y 758 como se muestra en la Figura 27. Se diseña el cebador URA3A set #2a y #2b (Tabla 4) para introducir los sitios de restricción 5' Pac I y 3' Pme I únicos en el fragmento URA3A resultante. El sitio Pme I tampoco está dentro de los genes CYTb5 y CPRB. Los fragmentos PCR del gen URA3A se purifican, se restringen con enzimas de restricción Asc I, Pac I y Pme I y se ligan a un gel purificado, se digieren con Asc I - Pme I limpiado con QuiaexII de plásmido pNEB 193 (Figura 29) comprando de New England Biolabs (Beverly, MA). La ligación se desarrolla con un número equimolar de Terminal ADN en 16ºC durante 16 hr, usando ligasa de ADN T4 (New England Biolabs). Las ligaciones se transforman en células E. coli XL1-Blue (Stratageno, LaJolla, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se aislan colonias blancas, se hacen crecer, se aisla el ADN de plásmido y se digiere con Asc I - Pme I para confirmar la inserción del URA3A modificado en el pNEB193. El vector de integración base resultante se denomina PURAin (Figura 30).

B. Amplificación de CYTb5 y CPRB de ADN genómico de C. tropicalis 20336

El gen que codifica el CYTb5 se amplifica por vía de PCR usando cebadores (cebadores CYT b5#1, GGGTTAATTAACATACTTCAAGCAGTTTGG; y el cebador CYT b5 # 2, CCCTTAATTAAGGGGGGATGGAAGTGGCCG) para introducir los sitios de clonación Pac I. Ver tabla 4. Estos cebadores se diseñan con base en la secuencia de ADN determinada para CYTb5. El kit UEl ltma (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA) se utilice de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. El producto de amplificación CYTb5 PCR es de 1998 pares bases de longitud, produciendo 1088 bp de ADN en la dirección 5' del codón de inicio CYTb5 y 486 bp en la dirección 3' del codón de detención para el CYTb5 ORF. Con el fin de generar un producto PCR libre de error para clonación, un fragmento Bgl/II interno de un PCR se desplaza con un fragmento Bgl/II de un PCR diferente que no contiene mutaciones en la región. Un producto CYT b5 libre de error final se genera que contiene sitios de clonación sensibles Pac I.

El gen que codifica el CPRB de C. tropicalis 20336 se amplifica del ADN genómico por vía de PCR utilizando los cebadores (CPR B#1 y CPR B#2) con base en la secuencia de ADN determinado para CPRB (Figuras 4A-4B). Estos cebadores se diseñan para introducir sitios de clonación únicos de Pac l. El kit Expand Hi-Fi Taq PCR kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) se utiliza de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes: El producto PCR CPRB es 3266 bp en longitud, que produce 747 bp pf de ADN en la dirección 5' del codón de inicio CPRB y 493 bp en la dirección 3' del codón de parada para el CPRB ORF. Los productos PCR resultantes se aíslan por vía de electroforesis de gel de azarosa, se purifican utilizando QiaexII y se digieren con Pac I. Los fragmentos de PCR se purifican, desalinizan y se concentran utilizando un Microcon 100 (Amicon, Beverly, MA).

Los procedimientos de amplificación anteriormente descritos también se aplican al gen CPRA (Figuras 2A-2B) utilizando los cebadores indicados respectivamente (Tabla 4).

C. Clonación del gen CPRB en pURAin

La siguiente etapa es clonar el gen CPRB en el vector de integración pURAin. En un aspecto preferido de la presente invención, ningún ADN externo diferente de aquel proporcionado específicamente mediante las secuencias de sitio de restricción sintética se incorporan en el ADN que se clona en el genoma C. tropicalis, es decir, con la excepción del sitio de restricción de ADN solo las secuencias de ADN C. tropicalis nativas se incorporan en el genoma. El pURAin se digiere con Pac I, Qiaex II limpio, y se desfosforila con Fosfatasa alcalina de Camarón (SAP) (United States Biochemical, Cleveland, OH) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Aproximadamente 500 ng de Pac I linearizado pURAin fue desfosforilado durante 1 hr a 37ºC utilizando SAP, a una concentración de 0.2 Unidades de enzima por 1 pmol de ADN Terminal. La reacción se detiene mediante inactivación por 65ºC durante
20 min.

Antes de su uso, el fragmento CPRB Pac I se deriva utilizando los cebadores mostrados en la tabla 4 que se secuencia y se compara con CPRB para confirmar que el PCR no introduce cambios de pares base de ADN que pudieran resultar en cambios de aminoácidos. Luego de la confirmación, el CPRB se liga al plásmido pURAin que también se ha digerido con Pac I. El Pac I digerido con pURAin es desfosforilado, y se liga con el producto expand CPR Hi-Fi PCR como se describió previamente. La mezcla de ligación se transforma en E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagene) y se seleccionan varias colonias resistentes y se seleccionan para construcciones correctas que pudieran contener secuencia de vector, el gen URA3A invertido, y el gen CPRB amplificado (Figuras 4A-4B) de 20336. La digestión de Asc I- Pme I le confirma una construcción exitosa, pURAREDBin.

En una forma similar, a la anterior, el gen CPRA descrito aquí se clona en el pURAin. El fragmento Pac I del gen CPRA, cuya secuencia de nucleótido se da en las Figuras 2A-2B, es derivable por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

1) Construcción de Vectores Utilizado para Generar HDC11

El vector de integración previamente construido que contiene CPRB, pURAREDBin, se selecciona como el vector de inicio. Este vector se digiere parcialmente con Pac I y el fragmento linearizado se aisla con gel. El Pac l activo se destruye por tratamiento con polimerasa AND T4 y el vector se religa. El posterior aislamiento y digestión completa de este nuevo plásmido produce un vector que contiene ahora un solo sitio Pac I activo. Este fragmento es aislado con gel, desfosforilado y ligado con el fragmento Pac I CYTb5. Los vectores que contienen los genes CYTb5 y CPRB orientados en las direcciones opuestas (conectados en los extremos 5'), pURAin CPR b5 O, se generan.

D. Confirmación de Integración CYTb5 en el Genoma de C. tropicalis

Basado en la construcción del pURAin CPR b5 O, utilizado para transformar el H5343 ura-, un esquema para detectar la integración se idea. El ADN genómico de transformantes se digiere con Dra III que es una enzima que corta dentro de los genes URA3A, URA3B, CPRB y CYTb5. la digestión del ADN genómico en donde ha ocurrido una integración en el lugar URA3A se esperaría que resulte en la elucidación de un fragmento de 3.6 Kb luego de hibridación Southern con una sonda CPRB. Las hibridaciones Southern de esta digestión con fragmentos del CPRB se utilizan para selección de estos eventos de integración. La intensidad de esta señal de banda del software se utiliza como una medición del número de eventos de integración (es decir la mayoría de copias del gen CYTb5 que están presentes, la más fuerte es la señal de hibridación.

Los prototrofos URA transformados por C. tropicalis H5343 se hacen crecer a 30ºC, 170 rpm, en 10 ml de medio SC-uracilo para preparación de ADN genómico. El ADN genómico se aisla mediante los métodos descritos previamente. El ADN genómico se digiere con Dra III. Un gel de 0.95% de azarosa se utiliza para preparar una transferencia de hibridación Southern. El ADN del gel se transfiere a una membrana de filtro de nylon MagnaCharge (MSI Technologies, Westboro, MA) de acuerdo con el método de transferencia de Sambrook et al., supra. Para la hibridación Southern se utilice un fragmento de AND CPRB de 3.3 Kb como una sonda de hibridación. 300 ng de AND CPRB se etiquetan utilizando un sistema de detección y etiquetado usando ECL Direct (Amersham) y el Southern se procesa de acuerdo con las especificaciones del kit ECL. La transferencia se procesa en un volumen de 30 ml de fluido de hibridación que corresponde a 0.125 ml/cm^{2}. Luego de una prehibridación a 42ºC durante 1 hr, 300 ng de sonda CPRB se agrega y la hibridación continua durante 16 hr a 42ºC. Luego de la hibridación, las transferencias se lavan dos veces durante 20 min cada uno a 42ºC en urea de lavado contínuo. Dos lavados secundarios de 5 min se conducen seguido por detección de acuerdo con instrucciones. Las transferencias se exponen durante 16 horas (hr) como se
recomienda.

La integración se confirma por la detección de un fragmento Dra III 3.6 Kb del ADN genómico de los transformantes pero no con el control C. tropicalis 20336. Las cepas CYTb5 y CPRB integradas resultantes se denominan HDC11. Las variantes de esta cepa se designan arbitrariamente 11-1 a 11-4 basado en el número relativo de eventos de integración que ocurren.

Cuando se comparan con el H5343 pariente, HDC 11-1, HDC11-3 y HDC11-4 cada uno contiene una copia adicional única del gen CYTb5 y HDC 11-2 que contiene dos copias adicionales del gen CYTb5.

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Apéndice

18

19

<110> David, Craft L.

\hskip1cm

Madduri, Krishna

\hskip1cm

Loper, John C.

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<120> GEN b5 DE CITOCROMO Y PROTEÍNAS DE CANDIDA TROPICALIS Y PROCEDIMIENTOS CORRESPONDIENTES

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<130> M6368 (1010-35)

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<160> 45

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 2710

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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<400> 1

21

22

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<210> 2

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<211> 129

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<212> PRT

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<213> Candida Tropicalis

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<400> 2

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23

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<210> 3

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<211> 4206

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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<400> 3

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24

25

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<210> 4

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<211> 679

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<212> PRT

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<213> Candida tropicalis

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<400> 4

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26

27

28

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<210> 5

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<211> 4145

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

\newpage

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<400> 5

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29

30

31

32

33

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<210> 7

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<211> 4115

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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34

35

36

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<210> 8

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<211> 3948

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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37

38

39

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<210> 9

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<211> 3755

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

40

41

42

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<210> 10

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<211> 3900

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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43

44

45

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<210> 11

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<211> 3668

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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46

47

48

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<210> 12

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<211> 3348

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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49

50

51

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 3826

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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52

53

54

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<210> 14

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<211> 3910

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

55

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 15

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<211> 3150

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<212> ADN

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<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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58

59

60

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 3579

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<212> DNA

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<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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61

62

63

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa gaggtcgttg gttgagtttt c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa ttgataatga cgttgcggg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgcgccg gagtccaaaa agaccaacct ctg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa tacgtggata ccttcaagca agtg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa gctcacgagt tttgggattt tcgag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtttaaac cgcagaggtt ggtcttttg gactc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtttaaac

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgcgcc

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcycaaacwg gtacwgcwga a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtttgggta aytcwactta t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgttattayt ctayyycttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcmacaccrg tacctggacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccaatcg taatcagc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acttgtcttc gtttagca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacgtctgt ggtgatgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgggaagc gcgccattgt gttgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg cgaattggc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttaatta acatacttca agcagtttgg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccttaatta aggggggatg gaagtggccg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataagaatgc ggccgctgaa cgagaaccac atggaggag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa ggataaccac atccatacgt cgc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaccaccc acgacgactt gtg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccgtgct gaacgactgc g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg aggcacacca cccacgacga cttgtg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccgtgct gaacgactgc gaatcttagc gcccttcaag tt

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> vector

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> vector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1712

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> David, Craft L.

\hskip1cm

Madduri, Krishna

\hskip1cm

Loper, John C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> M6368 (1010-35 PCT)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US 01/233376

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-07-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2710

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

690

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4206

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

71

72

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 679

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 679

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (50)..(50)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = leucina o serina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3948

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3755

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3900

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

96

97

98

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3668

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

100

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3348

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

103

104

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3826

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

106

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3910

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

109

110

111

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

113

114

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3579

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

116

117

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa gaggtcgttg gttgagtttt c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa ttgataatga cgttgcggg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgcgccg gagtccaaaa agaccaacct ctg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa tacgtggata ccttcaagca agtg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa gctcacgagt tttgggattt tcgag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtttaaac cgcacaggtt ggtctttttg gactc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtttaaac

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgcgcc

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcycaaacwg gtacwgcwga a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtttgggta aytcwactta t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgttattayt cyatttcttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcmcaccrg tacctggacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccaatcg taatcagc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acttgtcttc gtttagca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacgtctgt ggtgatgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgggaagc gcgccattgt gttgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg cgaattggc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttaatta acaatacttca agcagtttgg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccttaatta aggggggatg gaagtggccg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataagaatgc ggccgctgaa cgagaaccac atccaggag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa ggataaccac atccatacgt cgc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuenciar Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaccaccc acgacgactt gtg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuenciar Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccgtgct gaacgactgc g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg aggcacacca cccacgacga cttgtg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccgtgct gaacgactgc gaatcttagc gcccttcaag tt

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1712

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida tropicalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

121

122

Claims

1. Una célula anfitriona transformada con un ácido nucleico que codifica la proteína CYTb5 (citocromo b5) que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ. ID. NO. 2 en donde todos los anfitriones contienen una interrupción del la ruta \beta-oxidación

2. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la célula anfitriona es una célula de levadura.

3. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 2 en donde la célula de levadura se selecciona del grupo que consiste de Yarrowia, Candida, Bebaromices, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, y Pichia.

4. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 3 en donde la célula anfitriona cándida se selecciona del grupo C. tropicalis, C. maltosa, C. apicola, C paratropicalis, C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. parapsilosis, y C. zeylenoides.

5. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el ácido nucleico está contenido en un vector de expresión.

6. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 5 en donde el vector de expresión se selecciona del grupo que consiste de plásmido, fagémido, fago, cósmido, cromosoma artificial de levadura, vector de ADN lineal y vector de integración.

7. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6 en donde el plásmido se selecciona del grupo que consiste plásmido episómico de levadura y plásmido replicante de levadura.

8. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el ácido nucleico que codifica la proteína CYTb5 comprende la SEQ. ID. NO. 1.

9. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el ácido nucleico que codifica la proteína CYTb5 comprende los residuos de ácido nucleico numerados 1109 a 1495 de la SEQ. ID. NO. 1.

10. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la célula anfitriona contiene una o más copias de un gen seleccionado del grupo que consiste del gen CPR (P450 RED; citocromo P450 reductasa), gen CYP (P450 ALK; citocromo P450 monooxigenasa) y combinaciones de estos.

11. Un método para incrementar la producción de ácido dicarboxílico que comprende:

Proporcionar una célula anfitriona que tiene ninguno, uno o más genes CYTb5;

Incrementar, en la célula anfitriona, el número de genes CYTb5 que codifican una proteína CYTb5 que tienen la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ. ID. NO. 2 en donde todos los anfitriones contienen una interrupción de la ruta de \beta-oxidación; y

Cultivar la célula anfitriona en un medio que contiene un sustrato orgánico que induce la expresión del gen CYTb5 para efectuar la producción incrementada de ácido dicarboxílico.

12. Un método para incrementar la producción de un ácido dicarboxílico de acuerdo con reivindicación 11 en donde la célula anfitriona es una célula de levadura.