ES2299242T3

ES2299242T3 - Antagonistas de los receptores copulados a proteina g.

Info

Publication number: ES2299242T3
Application number: ES99908589T
Authority: ES
Inventors: Nadya I. Tarasova; Christopher J. Michejda
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: ATE382058T1; CA2321962C; DE69937822D1; AU760208B2; DE69937822T2; CA2321962A1; EP1056778A1; WO1999043711A1; EP1056778B1; AU2798499A

Abstract

Una molécula moduladora de los receptores copulados a proteína G (GPCR) aislada consistente en un péptido o peptidomimético de 5 a 50 aminoácidos que es un análogo estructural de un dominio de transmembrana de un GPCR, donde dicha molécula tiene un extremo N y un extremo C y dicha molécula tiene un extremo extracelular que está negativamente cargado y un extremo intracelular que tiene carga neutra en condiciones fisiológicas, y donde dicha molécula tiene un grupo carboxilo C-terminal amidado cuando dicho extremo C tiene carga neutra, y, cuando dicho extremo intracelular es dicho extremo N, dicho péptido o peptidomimético incluye al menos cuatro de los cinco primeros aminoácidos N-terminales que tienen cadenas laterales de aminoácidos de carga neutra en condiciones fisiológicas; dicha molécula se inserta espontáneamente en una membrana en la misma orientación que el dominio GPCR de transmembrana del que deriva; y dicha molécula modula una propiedad o actividad biológica de dicho GPCR alterando la estructura o la organización de dicho GPCR.

Description

Antagonistas de los receptores copulados a proteína G.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con la modulación, especialmente la inhibición, de las actividades biológicas de los receptores copulados a proteína G (GPCR) por exposición de los GPCR a moléculas que interfieren con la correcta organización de los receptores. En particular, la invención se relaciona con péptidos aislados del dominio de transmembrana de los GPCR que inhiben la transducción de señal mediada por GPCR.

Antecedentes de la invención

Muchos fenómenos fisiológicamente importantes están mediados por la unión de proteínas reguladoras de la unión a nucleótidos de guanina (proteínas G) a receptores copulados a proteína G (GPCR). Estos fenómenos incluyen vasodilatación, estimulación o reducción del ritmo cardíaco, broncodilatación, estimulación de las secreciones endocrinas y aumento de la peristalsis intestinal, desarrollo, mitogénesis, proliferación celular y oncogénesis.

Las proteínas G son una superfamilia diversa de proteínas que se unen a nucleótidos de guanina y que tienen un papel central en la transducción de señal y en la regulación del metabolismo celular. Están generalmente constituidas por tres subunidades: una subunidad alfa que se une a guanil-nucleótidos, una subunidad beta y una subunidad gamma. (Para una revisión, véase Conklin y col., Cell 73, 631-641, (1993)). Las proteínas G cambian comúnmente entre dos formas, dependiendo de si se une GDP o GTP a la subunidad alfa. Cuando se une GDP, la proteína G existe como un heterotrímero, el complejo alfa-beta-gamma G. Cuando un complejo alfa-beta-gamma se asocia operativamente con un GPCR activado por ligando en una membrana celular, la velocidad de intercambio de GTP por GDP unido aumenta y la subunidad alfa G se disocia del complejo beta-gamma G. La subunidad alfa G libre y el complejo beta-gamma G son capaces de transmitir una señal a elementos secuencia abajo de una variedad de rutas de transducción de señal, por ejemplo por unión a, y activación de, la adenil-ciclasa. Este esquema fundamental de fenómenos forma la base para una multiplicidad de diferentes fenómenos de señalización celular.

Recientes estudios han sugerido que todos los miembros de la superfamilia GPCR tienen una estructura conservada. Comparaciones de los ADNc de receptores beta-adrenérgicos aviares y de mamíferos (Yarden y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6795-6799, 1986; Dixon y col., Nature 321:75-79, 1986; y Kobilka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:46-50, 1987), un ADNc de rodopsina bovina (Nathans y Hogness, Cell 34:807-814, 1983), un receptor alfa-2-adrenérgico (Kobilka y col., Science 238:650-656, 1987), un ADNc de receptor de angiotensina (Young y col., Cell 45:711-719, 1986; Jackson y col., Nature 335:437-439, 1988), un receptor de substancia K bovino (Masu y col., Nature 329:836-838, 1987) y un ADNc de receptor de acetilcolina muscarínico (Kubo y col., Nature 323:411-416, 1986) predicen que todos los GPCR comparten una presencia altamente conservada de siete dominios de transmembrana hidrofóbicos que se sugiere son hélices de transmembrana de 20-30 aminoácidos conectadas por bucles extracelulares o citoplásmicos. Kobilka y col., Science 240: 1310 (1988); Maggio y col., FEBS Lett. 319: 195 (1993); Maggio y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3103 (1993); Ridge y col., Proc. Natl. Sci USA 91, 3204 (1995); Schonenberg y col., J. Biol. Chem. 270: 18000 (1995); Huang y col., J. Biol. Chem. 256: 3802 (1981); Popot y col., J. Mol. Biol. 198: 655 (1987); Kahn y Engelman, Biochemistry 31: 6144 (1992); Schoneberg y col., EMBO J. 15: 1283 (1996); Wong y col., J. Biol. Chem. 265: 6219 (1990); Monnot y col., J. Biol. Chem. 271: 1507 (1996); Gudermann y col., Annu. Rev. Neurosci. 20: 399 (1997); Osuga y col., J. Biol. Chem. 272: 25006 (1997); Lefkowitz y col., J. Biol. Chem. 263:4993-4996, 1988; Panayotou y Waterfield, Curr. Opinion Cell Biol. 1:167-176, 1989. Estos dominios de transmembrana de receptores copulados a proteína G designados como TM1, TM2, TM3, TM4, TMS, TM6 y TM7, TM4, TM5, TM6 y TM7 son los más altamente conservados y se postula que proporcionan secuencias que imparten actividad biológica a los GPCR. TM3 está también implicado en la transducción de señal.

Se dice que la copulación de GPCR a moléculas de señalización intracelular tales como la adenilato ciclasa (Anand-Srivastava y col., J. Biol. Chem. 271: 19324-19329 (1996)) y las proteínas G (Merkouris y col., Mol. Pharmacol. 50: 985-993 (1996)) está inhibida por péptidos correspondientes a los bucles intracelulares de los receptores. Esos estudios fueron realizados primariamente para obtener una comprensión de los mecanismos moleculares de la función de los receptores y no podrían ser directamente aplicados al diseño de fármacos, por las dificultades en la administración intracelular de los inhibidores.

WO 94/05695 y la Patente EE.UU. Nº 5.508.384 exponen secuencias de regiones de transmembrana para 74 GPCR. La publicación de patente WO 94/05695 describe y reivindica polipéptidos correspondientes a fragmentos o secuencias homólogas de GPCR que pueden unirse a un ligando GPCR o que pueden modular la unión de ligando. Ambas referencias describen que un fragmento que se expande por la membrana del tercer dominio TM del receptor de dopamina D2 se unía específicamente a un ligando del receptor intacto en un modelo de pequeñas vesículas unilamelares simples. El fragmento usado acababa en una lisina (que está positivamente cargada a pH fisiológico) en un extremo y en un ácido aspártico (que está negativamente cargado a pH fisiológico) en el otro. No se esperaría que este péptido se insertara fácilmente en una membrana biológica.

Resumen de la invención

La invención comprende, en general, compuestos peptídicos o peptidomiméticos que modulan, y preferiblemente inhiben, las propiedades y actividades biológicas de los GPCR abordando porciones de transmembrana de estos receptores. Los antagonistas de GPCR pueden ser usados para alterar la función de los GPCR.

Se describe aquí el uso de tecnología de ADN química o recombinante para obtener polipéptidos GPCR, que preferiblemente son lo más pequeños posible conservando a pesar de ello una afinidad suficientemente alta para unirse o asociarse a GPCR. Como ejemplos no limitativos de polipéptidos GPCR, se incluyen fragmentos de 10 a 50 aminoácidos correspondientes a al menos un dominio de transmembrana de los dominios 1-7. Los siguientes son ejemplos no limitativos de péptidos GPCR con propiedades antagonistas.

Del GPCR CXCR4

: F-2-2: LLFVITLPFWAVDAVANWYFGNDD

: F-2-5: LLFVITLPFWAVDAVANDD-OH

: F-4-2: VYVGVWIPALLLTIPDFIFANDD-OH

: F-6-1: VILILAFFACWLPYYIGISID-OH

: F-7-3: DDEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2}

: F-7-4: DDSITEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2}

Del GPCR CCR5

: CCR5-TM-2-2: LFFL LTVPFWAHYAAAQWDFGDD

: CCRS-TM-4-1: FGVVTSVITWWAVFASLPGIIFTSSDD

: CCRS-TM-6-1: LIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQED

Del GPCR CCR2

: CCR2-TM-2-1: IYLLNLAISDLLFLITLPLWADD-OH

: CCR2-TM-2-2: LLFLITLPLWAH SAANEWVFGNDD-OH

: CCR2-TM-4-1: FGVVTSVITWLVAVF ASVPGIIFTDD

: CCR2-TM-6-1: VIFTIMIVYFLFWTPYN IVILLNTFQED

Del GPCR CCR3

: CCR3-TM-2-1: LLFLVTLPFW IHYVRGHNWVFGDDD

: CCR3-TM-4-1: FGVITSIVTWGLAVLAALPEFI FYETED

: CCR3-TM-6-1: IFVIMAVFFI FWTPYNVAILLSSYQSDD

Del GPCR CCKAR

: CCKAR-TN-2-1: FLLSLAVSDLMLCLFCMPFNLP

: CCKAR-TM-2-2: FLLSLAVSDLMLCLFCM PFNLIDD

: CCKAR-TM-6-4: IVVLFFLCWMPIFSANAWRAYDTVDD

Una realización de la invención es una molécula moduladora del receptor copulado a proteína G (GPCR) aislada que tiene un péptido o peptidomimético de 5 a 50 aminoácidos que es un análogo estructural de una porción de un dominio de transmembrana de un GPCR, donde dicha molécula tiene un extremo N y un extremo C y dicha molécula tiene un extremo extracelular que está negativamente cargado y un extremo intracelular que tiene una carga neutra en condiciones fisiológicas, y donde dicha molécula tiene un grupo carboxilo C-terminal amidado cuando dicho extremo N tiene una carga neutra, y, cuando dicho extremo intracelular es dicho extremo N, dicho péptido o peptidomimético incluye al menos cuatro de los primeros cinco aminoácidos N-terminales que tienen cadenas laterales de aminoácidos de carga neutra en condiciones fisiológicas; dicha molécula se inserta espontáneamente en una membrana en la misma orientación que el dominio GPCR de transmembrana del que deriva; y dicha molécula modula una propiedad o actividad biológica de dicho GPCR alterando la estructura u organización de dicho GPCR.

En una realización particular, las moléculas contienen un grupo de cabeza no peptídico hidrofílico negativamente cargado y una cola no cargada, que asegura la correcta orientación de la molécula en la membrana celular. En otra realización, el grupo de cabeza negativamente cargado es uno o más aminoácidos ácidos.

Otra realización es una molécula moduladora de GPCR aislada que tiene un péptido o peptidomimético que es un análogo estructural de una porción de un dominio de transmembrana de CXCR4, donde dicha porción de dicho dominio de transmembrana tiene una secuencia seleccionada entre:

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LLFVITLPFWAVDAVANWYGNDD,

LLFVITLPFWAVDAVANDD-OH,

VYVGVWIPALLLTIPDFIFANDD-OH,

VILILAFFACWLPYYIGISID-OH,

DDEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2} y

DDSITEALAFFHCCLNPIL Y AFL-NH_{2},

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y donde dicha molécula modula una actividad biológica de dicho CXCR4. La actividad CXCR4 modulada por dicho péptido incluye la inhibición de la liberación de Ca^{2+} intracelular mediada por CXCR4 y la inhibición de la infección por VIH mediada por CXCR4.

La invención también incluye las moléculas de la invención para uso en un método terapéutico consistente en modular una actividad biológica de un GPCR de interés por contacto de una célula que expresa dicho GPCR con una molécula de la invención. En un método, el GPCR de interés es CXCR4, CCR5 o CCR2 y la actividad biológica modulada es la inhibición de la infección por VIH mediada por GPCR. En otro método, el GPCR de interés es CXCR4 y la actividad biológica modulada es la inhibición de la liberación de Ca^{2+} intracelular mediada por CXCR4.

Otra realización es el uso de una molécula moduladora de GPCR de la invención para la fabricación de un medicamento para inhibir la infección por VIH-1, donde el contacto de una célula que expresa el GPCR con dicha molécula inhibe la infección por VIH-1. El péptido o peptidomimético puede ser un análogo estructural de una porción de un dominio de transmembrana de CXCR4 o CCR5. El péptido correspondiente a regiones TM o CXCR4, un GPCR que funciona como correceptor durante la entrada en la célula del VIH, fue diseñado y estudiado en células y dio una potente inhibición de la entrada del VIH sin aparente toxicidad para las células.

Se demuestra la utilidad de este uso abordando especialmente el CXCR4 que funciona como correceptor durante la entrada en la célula de cepas trópicas de células T de VIH-1. Los péptidos que contenían 20-25 residuos de aminoácidos inhibían la señalización de receptores y la infección por VIH-1 in vitro a concentraciones de tan sólo 0,2 micromolar.

En una realización, las moléculas de la presente invención imitan un dominio de transmembrana del receptor seleccionado y bloquean la autoorganización de ese receptor, posiblemente por inhibición competitiva con el dominio TM nativo. Bloquean o inhiben así la transducción de señal en la célula afectada.

La invención también incluye análogos peptídicos peptidomiméticos que poseen propiedades beneficiosas tales como una mayor vida media, falta de inmunogenicidad y capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica.

Los análogos peptídicos de la invención median en los efectos químicos y/o biológicos de agonistas/antagonistas de hormonas u otros péptidos. Se cree que son útiles para el desarrollo de técnicas farmacéuticas, terapéuticas y diagnósticas. En consecuencia, los análogos son usados en métodos para producir una respuesta profiláctica o terapéutica en un mamífero por administración al mamífero de una cantidad farmacéuticamente efectiva de uno o más análogos peptídicos de la invención. En realizaciones preferidas, se usan los análogos en métodos para producir tales respuestas por modulación de la actividad de al menos un receptor unido a proteína G de mamífero administrando una cantidad efectiva de uno o más análogos peptídicos de la invención.

En otra realización, un péptido de la invención puede modular la actividad biológica de más de un GPCR. En otra realización, se administran más de un péptido de la invención como un cóctel para modular la actividad biológica de más de un GPCR.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Eficacia anti-VIH y toxicidad del ensayo F-2-2. Se infectaron células CEM-SS con la cepa LAV de VIH-1.

Figura 2. Eficacia anti-VIH y toxicidad de F-4-2 en citoprotección. Se infectaron células CEM-SS con la cepa RF de VIH-1, que causa la muerte celular si el inhibidor de la infección no está presente.

Figura 3. El modelo propuesto de acción de los antagonistas de transmembrana.

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Definiciones

Una "proteína G" es cualquier miembro de la superfamilia de proteínas de unión a nucleótidos de guanina de transducción de señal.

Un "receptor copulado a proteína G" es cualquier miembro de una superfamilia de receptores que media en la transducción de señal copulándose con una proteína G. Como ejemplos de tales receptores, se incluyen, aunque sin limitación: el receptor de quimiokina CC 5 (CCR5), el receptor de quimiokina CXC (CXCR4), el receptor de tipo A de colecistokinina (CCKAR), los receptores de adenosina, los receptores de somatostatina, los receptores de dopamina, los receptores colinérgicos muscarínicos, los receptores alfa-adrenérgicos, los receptores beta-adrenérgicos, los receptores de opiáceos, los receptores de cannabinoides, el factor de liberación de la hormona del crecimiento, el glucagón, los receptores de AMPc, los receptores de serotonina (5-HT), los receptores de histamina H2, los receptores de trombina, los receptores de quinina, los receptores de la hormona estimulante del folículo, las opsinas y rodopsinas, los receptores odoríferos, los GPCR de citomegalovirus, los receptores de histamina H2, los receptores de octopanmina, los receptores de N-formilo, los receptores de anafilatoxina, los receptores del tromboxano, los receptores de IL-8, los receptores del factor activador de plaquetas, los receptores de endotelinas, el receptor del péptido liberador de bombesina gastrina, los receptores de bombesina que prefieren neuromedina B, los receptores del péptido intestinal vasoactivo, los receptores de neurotensina, los receptores de bradiquinina, los receptores de la hormona liberadora de tirotropina, los receptores de la substancia P, los receptores de neuromedina K, los receptores de tipo I de la angiotensina II renal, los receptores del oncogén mas (angiotensina), los receptores de lutropina-coriogonadotropina, los receptores de tirotropina, los receptores de la hormona estimulante del folículo, los receptores de cannabinoides, los receptores inducidos por glucocorticoides, los GPCR de las células endoteliales, los GPCR del testículo y los GPCR de la aorta torácica, y homólogos de los mismos que tienen una homología de al menos un 80% con al menos uno de los dominios de transmembrana 1-7, como se describe aquí. Véase, v.g., Probst y col., DNA and Cell Biology 11: 1-20 (1992), aquí incorporado en su totalidad como referencia. El término abarca además subtipos de los receptores nombrados y mutantes y homólogos de los mismos, junto con las secuencias de ADN que los codifican.

El término "membrana" se refiere en general a una bicapa lipídica. Preferiblemente, la bicapa lipídica es la membrana plasmática que delimita una célula, pero puede ser cualquier membrana celular. El término membrana incluye también estructuras de bicapa, tales como liposomas artificiales.

El término "polipéptido GPCR" incluye polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde substancialmente a al menos un fragmento de 10 a 50 (v.g., 10, 20, 25 ó 30 residuos) aminoácidos y/o una secuencia homóloga de un GPCR conocido o grupo de GPCR, donde el polipéptido GPCR tiene homología de al menos un 80%, tal como un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% de homología, manteniendo actividad moduladora de GPCR, donde un polipéptido GPCR de la presente invención no es de origen natural o es de origen natural, pero está en forma purificada o aislada que no aparece en la naturaleza.

Preferiblemente, un polipéptido GPCR de la presente invención corresponde substancialmente a un dominio de transmembrana de un GPCR. También se prefieren polipéptidos GPCR en los que la secuencia de aminoácidos del GPCR tiene una longitud de 5-10 a 50 aminoácidos, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 aminoácidos, o cualquier rango dentro de éste.

El término "se inserta espontáneamente en una membrana" significa que un péptido que se pone en contacto con una membrana se autoorganizará, en condiciones fisiológicas, en la bicapa lipídica de tal forma que la porción hidrofóbica del péptido esté dentro de la membrana y cualquier extremo cargado quede expuesto a cualquiera de las superficies de una membrana. Preferiblemente, las moléculas de la presente invención que tienen una carga neta negativa en un extremo se orientarán de tal forma que el extremo cargado dé a la superficie extracelular de la célula.

El término "célula tumoral" o "célula cancerosa" o "célula neoplásica" denota una célula que demuestra una proliferación no regulada inapropiada. Se dice que una línea celular es "maligna" si, cuando se inyecta la línea celular en un animal hospedador, el animal hospedador desarrolla tumores o cánceres que son anaplásicos, invasivos y/o metastáticos. Un tumor "humano" está constituido por células que tienen cromosomas humanos. Dichos tumores incluyen los de un paciente humano y tumores resultantes de la introducción de una línea celular maligna humana en un animal no humano si las células de dichos tumores tienen cromosomas humanos.

Los términos "tratamiento del cáncer", "terapia del cáncer" y similares significan generalmente un tratamiento que causa cualquier mejoría en un mamífero que tiene un cáncer, donde la mejoría se debe al tratamiento con un péptido de la invención. La mejoría puede ser subjetiva u objetiva. Por ejemplo, si el mamífero es humano, el paciente puede notar un mayor vigor o vitalidad o un menor dolor como síntomas subjetivos de mejoría o respuesta a la terapia. Alternativamente, el clínico puede observar una disminución en el tamaño del tumor o en la carga tumoral en base al examen físico, a los parámetros de laboratorio, a los marcadores tumorales o a los hallazgos radiográficos.

La expresión "inhibición del crecimiento tumoral [o celular]" significa generalmente que la velocidad de aumento en la masa, el tamaño, el número y/o el metabolismo de las células y/o tumores tratados es más lenta como resultado del tratamiento que la de las células y/o tumores no tratados. El crecimiento de una línea celular o tumor se dice que es "inhibido" por un tratamiento si, cuando se estudia por medios tales como la incorporación de radioisótopos a las células, las células tratadas aumentan en número a un ritmo menor que la velocidad de proliferación de las células control no tratadas, y preferiblemente menor de aproximadamente el 50% de la velocidad de proliferación de las células no tratadas. Más preferiblemente, la velocidad de crecimiento se inhibe en al menos un 80%. Si se estudia el crecimiento por un medio tal como plaqueo en metilcelulosa, se dice que el crecimiento de una línea celular resulta "inhibido" si las células tratadas dan lugar a menos que el número de colonias que crecen a partir de un número similar de células no tratadas. Preferiblemente, el número de colonias procedentes de células tratadas es menor de aproximadamente el 70% del número procedente de células no tratadas. Más preferiblemente, el número de colonias se reduce en al menos un 50%. "Inhibición del crecimiento celular" también incluye el crecimiento cero y, lo que es más importante, la consiguiente muerte de las células tumorales y la erradicación del tumor. Cuando se mide in vivo, la "inhibición del crecimiento tumoral" abarca menos tumores o más pequeños (por ejemplo, de menor diámetro) en comparación con los animales control o los pacientes no tratados. La progresión de un tumor se refiere a fenómenos distintos del crecimiento, tales como cambios morfológicos y fisiológicos y cambios en la expresión génica y proteica.

Se puede evaluar la inhibición por cualquier método aceptado para medir si el crecimiento o el tamaño del tumor y/o el aumento de células cancerosas o tumorales se han enlentecido, detenido o revertido. Esto incluye la observación directa y la evaluación indirecta, tal como síntomas subjetivos o signos objetivos. El clínico puede observar una reducción del tamaño tumoral o de la carga tumoral (número de tumores) en base al examen físico, a los parámetros de laboratorio, a los marcadores tumorales o a los hallazgos radiográficos. Alternativamente, si el mamífero es un humano, el paciente puede observar un mayor vigor o vitalidad o un menor dolor como síntomas subjetivos de mejoría o respuesta a la terapia. Algunos signos de laboratorio que el clínico puede observar como respuesta a la terapia incluyen la normalización de pruebas tales como el recuento de células blancas de la sangre, el recuento de células rojas de la sangre, el recuento de plaquetas, la velocidad de sedimentación de los eritrocitos y diversos niveles enzimáticos tales como las transaminasas y las hidrogenasas. Adicionalmente, el clínico puede observar una reducción en un marcador tumoral detectable tal como el antígeno específico prostático (PSA) o el antígeno corioembrionario (CEA). Alternativamente, se pueden usar otras pruebas para evaluar la mejoría objetiva, tales como sonogramas, barridos de tomografía axial computerizada, barridos de resonancia magnética nuclear y pruebas de emisión de positrones.

El término "péptido de transmembrana GPCR" puede incluir un fragmento de dominio de transmembrana GPCR y/o un péptido homólogo del mismo, de al menos 5-50, y preferiblemente de 5-30, y preferiblemente de al menos 10-30 aminoácidos de longitud, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 aminoácidos, o cualquier rango dentro de éste o cualquier secuencia correspondiente que tenga substituciones conservadoras de aminoácidos. Como muestras de péptidos de transmembrana de la invención, se incluyen, aunque sin limitación, los péptidos enlistados en la Tabla I de la presente descripción. Un péptido de transmembrana preferido de la presente invención, cuando contacta con una estructura celular o de membrana (v.g., liposoma) que contiene un GPCR biológicamente activo, modula la actividad biológica de dicho GPCR in vitro, in vivo o in situ. La concentración del péptido en una solución que contacta con la célula in vivo (v.g., plasma sanguíneo o fluido intersticial) o in vitro (v.g., medio de cultivo) es de entre 1 nanomolar y 50 micromolar, preferiblemente de entre 1 nanomolar y 1 micromolar y más preferiblemente menor de 5 micromolar.

El término "residuo" se refiere a un aminoácido o mimético de aminoácido incorporado en un oligopéptido por un enlace amida o un mimético de enlace de amida.

"Cargado negativamente" se refiere a aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, miméticos de aminoácidos y restos químicos que están cargados negativamente a pH fisiológico. Como aminoácidos cargados negativamente, se incluyen, por ejemplo, Asp y Glu. Un residuo "ácido" es un residuo que está cargado negativamente a pH fisiológico.

"Cargado positivamente" se refiere a aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, miméticos de aminoácidos y restos químicos que están cargados positivamente a pH fisiológico. Como aminoácidos cargados positivamente, se incluyen, por ejemplo, Lys y Arg. Un "residuo básico" es un residuo que está positivamente cargado a pH fisiológico.

"Neutro" se refiere a aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, miméticos de aminoácidos y restos químicos que no están cargados ni positiva ni negativamente a pH fisiológico.

Secuencia "consenso" se refiere a péptidos que son distintos de las secuencias GPCR conocidas en cuanto a características estructurales críticas, pero que derivan de secuencias consenso de los dominios de transmembrana de GPCR 1-7 homólogos. Dichos péptidos consenso pueden ser derivados por modelado molecular, eventualmente combinado con análisis de hidrofobicidad y/o ajuste a hélices modelo, como ejemplos no limitativos. Dicho modelado puede ser realizado según etapas de métodos conocidos usando algoritmos de modelado conocidos, tales como, aunque sin limitación, ECEPP, INSIGHT, DISCOVER, CHEM-DRAW, AMBER, FRODO y CHEM-X. Dichos algoritmos comparan dominios de transmembrana entre receptores copulados a proteína G relacionados, determinan probables estructuras con energía minimizada y definen fragmentos polipeptídicos consenso alternativos.

Se dice que una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de un polipéptido GPCR de la presente invención "se corresponde substancialmente" con otra secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, respectivamente, si la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico en ambas moléculas proporciona polipéptidos que tienen actividad biológica que es substancialmente similar, cualitativa o cuantitativamente, a la del correspondiente fragmento de al menos un dominio de transmembrana GPCR, o que pueden ser sinérgicos cuando dos o más dominios de transmembrana, secuencias consenso u homólogos de los mismos están presentes.

Adicional o alternativamente, dichas secuencias "substancialmente correspondientes" de polipéptidos GPCR incluyen substituciones conservadoras de aminoácidos o nucleótidos o substituciones de codones de nucleótidos degenerativas, donde las substituciones individuales de aminoácidos o nucleótidos son bien conocidas en la técnica.

El término "modula una propiedad o actividad biológica" significa que, en presencia de un péptido de transmembrana de ensayo, un parámetro o fenómeno biológico mensurable aumenta o disminuye en relación a un control en ausencia de dicho péptido. Como ejemplos de propiedad o actividad biológica, se incluyen: la conformación del GPCR, la asociación del GPCR con otras moléculas, la transducción de señal, la secreción extracelular de proteínas celulares, los cambios conformacionales en proteínas, los cambios en la actividad enzimática, los cambios en la actividad metabólica, los cambios en la afinidad por un ligando, los cambios en los niveles de infección vírica, los cambios en la vasodilatación, la modulación del ritmo cardíaco, la modulación de la broncodilatación, la modulación de las secreciones endocrinas y la modulación del peristaltismo intestinal. Obsérvese que la actividad biológica del GPCR no necesita ser una que esté limitada al papel preciso in vivo desempeñado por el GPCR. El término también cubre las propiedades del GPCR, tales como la unión a proteínas víricas, que no son parte del papel biológico in vivo del GPCR. También cubre las propiedades intrínsecas de los GPCR que son sólo desentrañadas por manipulación experimental en el laboratorio, tales como la capacidad de los GPCR en bicapas artificiales (v.g., liposomas) para interaccionar con ligandos de GPCR.

"Transducción de señal" es el proceso mediante el cual se traduce la unión de un ligando a un receptor en un cambio fisiológico. En general, la unión de un ligando a un receptor provoca un cambio en una propiedad física del receptor, por ejemplo un cambio en su conformación, o en su orientación, o en su capacidad para unirse a otros ligandos. Este cambio en una propiedad física puede dar lugar, directa o indirectamente, a mayores o menores flujos de iones, a mayor o menor actividad enzimática, a mayor o menor desfosforilación, a mayor o menor translocación del receptor o de cualquier molécula (v.g., un resto de inositol o una subunidad de proteína G) de un compartimento celular a otro.

"Ligandos GPCR" se refiere a moléculas biológicas que se unen a los GPCR in vitro, in situ o in vivo y pueden incluir hormonas, neurotransmisores, virus o dominios de unión a receptores de los mismos, proteínas G, opsinas, rodopsinas, nucleósidos, nucleótidos, factores de la cascada de coagulación, odorizantes o feromonas, toxinas, factores estimulantes de colonias, factores de activación plaquetaria, péptidos neuroactivos, neurohumor o cualquier compuesto biológicamente activo, tal como fármacos o compuestos sintéticos o de origen natural.

La expresión "inhibe la infección por VIH" significa que un péptido de la invención inhibe la unión de un VIH a un GPCR o inhibe una actividad biológica del GPCR que media en la entrada y en la reproducción exitosa de un virus VIH en una célula que expresa GPCR.

El término "cantidad efectiva" significa una dosificación suficiente para producir un resultado deseado. El resultado deseado puede consistir en cambios subjetivos u objetivos en la actividad biológica de un GPCR, especialmente la transducción de señal. Las cantidades efectivas del polipéptido o composición GPCR, que pueden también incluir un derivado funcional del mismo, son de aproximadamente 0,01 microgramos a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, y preferiblemente de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, tal como 0,05, 0,07, 0,09, 0,1, 0,5, 0,7, 0,9, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 45 ó 50 mg/kg.

Una "substitución conservadora", cuando se describe una proteína, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos de la proteína que no altera substancialmente la actividad de la proteína. Así, "variaciones conservadoramente modificadas" de una secuencia de aminoácidos particular se refiere a substituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína o a substitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (v.g., ácidos, básicos, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.), de tal forma que las substituciones incluso de aminoácidos críticos no alteran substancialmente la actividad. Se conocen bien en la técnica tablas de substituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Dichas substituciones son preferiblemente realizadas según la lista siguiente, cuyas substituciones pueden ser determinadas por experimentación rutinaria y proporcionan propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula polipeptídica sintetizada, manteniendo al mismo tiempo la unión a receptores, o inhibiendo o imitando la actividad biológica, según se determina mediante ensayos conocidos de actividad de los receptores GPCR.

1000

Dicho de manera diferente, los seis grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son substituciones conservadoras entre sí:

1): Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2): Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3): Asparragina (N), Glutamina (Q);

4): Arginina (R), Lisina (K);

5): Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V), y

6): Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Véase también Creighton (1984) PROTEINS, W.H. Freeman and Company. Además, las substituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o suprimen un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son también "variaciones conservadoramente modificadas".

El término "identidad substancial" o "similitud substancial" en el contexto de un polipéptido indica que un polipéptido tiene una secuencia que puede tener una identidad de secuencia del 40% con una secuencia de referencia, o preferiblemente del 70%, o más preferiblemente una identidad de secuencia del 85% con la secuencia de referencia, o más preferiblemente una identidad del 90% sobre una ventana de comparación de aproximadamente 10-20 residuos de aminoácido. "Porcentaje de identidad de aminoácidos" o "porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos" se refiere a una comparación de los aminoácidos de dos polipéptidos que, cuando se alinean óptimamente, tienen aproximadamente el porcentaje designado de los mismos aminoácidos. Por ejemplo, "un 95% de identidad de aminoácidos" se refiere a una comparación de los aminoácidos de dos polipéptidos que, cuando se alinean óptimamente, tienen un 95% de identidad de aminoácidos. Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticos difieren por substituciones conservadoras de aminoácidos. Como los aminoácidos substituidos tienen propiedades similares, las substituciones no cambian las propiedades funcionales de los polipéptidos. Una indicación de que dos secuencias polipeptídicas son substancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos producidos contra el segundo péptido. Así, un polipéptido es substancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo por una substitución conservadora. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son substancialmente idénticas es que el polipéptido al que codifica el primer ácido nucleico presenta reacción inmunológicamente cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son substancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones estrictas.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de ensayo en relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados.

Se puede realizar la alineación óptima de secuencias para comparación, v.g., por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Programas de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase, en general, Ausubel y col., antes citado).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas por pares para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También representa un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El método empleado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo es luego alineado con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionadas. Dos grupos de secuencias son alineados por una extensión simple de la alineación por pares de dos secuencias individuales. Se consigue la alineación final por una serie de alineaciones progresivas por pares. Se desarrolla el programa designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, se puede comparar una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencia utilizando los siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos de extremos pesados.

Otro ejemplo de algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y de similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa para realizar análisis BLAST es de disponibilidad pública a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo conlleva la identificación primeramente de pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que o bien se correspondan o bien satisfagan alguna puntuación de umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntuación de palabras de la vecindad (Altschul y col., antes citado). Estos aciertos de palabras de la vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contienen. Los aciertos de palabras son entonces prolongados en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se puede aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Se detiene la prolongación de los aciertos de palabras en cada dirección cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae en la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos que puntúan negativamente; o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como defectos una longitud de palabras (W) de 11, alineaciones de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, v.g., Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la cual se produciría una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos por azar. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

El término "ácido nucleico" se refiere a deoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de éstos en forma de una sola o de doble hebra. A menos que se limite específicamente, el término incluye ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de forma similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique en contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes de la misma conservadoramente modificadas (v.g. substituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Concretamente, se pueden conseguir sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o de todos) está substituida con residuos de bases mixtas y/o desoxiinosina (Batzer y col., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka y col., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Cassol y col., 1992; Rossolini y col., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). Se usa el término ácido nucleico indistintamente con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.

La expresión "una secuencia de ácido nucleico codificante" se refiere a un ácido nucleico que contiene información de secuencia para un ARN estructural tal como ARNr, un ARNt o la secuencia primaria de aminoácidos de una proteína o péptido específicos, o un sitio de unión para un agente regulador de trans-acción. Esta expresión incluye específicamente codones degenerados (es decir, diferentes codones que codifican para un solo aminoácido) de la secuencia o secuencias nativas que pueden ser introducidos para conformarse a la preferencia de codones en una célula huésped específica.

"Sondas de ácido nucleico" pueden ser fragmentos de ADN o de ARN. Se pueden preparar fragmentos de ADN, por ejemplo, digiriendo ADN plasmídico, o usando PCR, o se pueden sintetizar por el método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981), o por el método de los triésteres según Matteucci, y col., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981), ambos aquí incorporados como referencia. Se puede obtener entonces un fragmento de doble hebra, si se desea, hibridando las hebras simples químicamente sintetizadas entre sí en condiciones apropiadas o sintetizando la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada. Cuando se da una secuencia específica para una sonda de ácido nucleico, se entiende que también se identifica e incluye la hebra complementaria. La hebra complementaria funcionará igual de bien en situaciones en las que el objetivo es un ácido nucleico de doble hebra.

Los términos "identidad substancial" o "identidad de secuencia substancial", aplicados a secuencias de ácidos nucleicos y tal como se usan aquí, denotan una característica de una secuencia polinucleotídica, donde el polinucleótido tiene una secuencia que tiene al menos un 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos de un 90 a un 95 por ciento de identidad de secuencia y más preferiblemente al menos un 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones nucleotídicas, frecuentemente en una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, donde el porcentaje de identidad de secuencia es calculado comparando la secuencia de referencia con la secuencia polinucleotídica, que puede incluir deleciones o adiciones que totalicen un 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor.

La expresión "se une específicamente a un anticuerpo" o "específicamente inmunorreactivo con", cuando hace referencia a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinativa de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y de otros productos biológicos. Así, en las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular y no se unen en cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Se pueden usar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se usan rutinariamente inmunoensayos de ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lane (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de formatos de inmunoensayo y de condiciones que se pueden usar para determinar la inmunorreactividad específica.

Descripción detallada

Todas las referencias aquí citadas, incluyendo los artículos de revistas o resúmenes, solicitudes de patente EE.UU. o extranjeras publicadas o correspondientes, patentes EE.UU. o extranjeras concedidas o cualquier otra referencia, quedan incluidas aquí en su totalidad, incluyendo todos los datos, tablas, figuras y texto presentados en las referencias citadas. Adicionalmente, los contenidos de las referencias citadas en las referencias aquí citadas quedan también incorporados en su totalidad a modo de referencia.

La presente invención se basa parcialmente en evidencias de que los dominios de transmembrana (TM) de los GPCR interaccionan de una forma específica en el montaje de las moléculas de los receptores. Estas interacciones no conducen a una estructura rígida, ya que se requiere algo de flexibilidad para permitir hacer cambios conformacionales después de la unión de ligandos para obtener la capacidad de la molécula para dar una señal desde la superficie celular hasta las partes intracelulares. También se demostró para varios GPCR que los dominios de transmembrana están implicados en la unión de ligandos y por ello contienen aberturas que permiten la penetración de los ligandos. Informes de que la expresión de dominios de transmembrana ausentes rescata receptores truncados inactivos de vasopresina V2, beta-adrenérgicos y muscarínicos M3 (Schoneberg y col., EMBO J. 15: 1283 (1996); Wong y col., J. Biol. Chem. 265: 6219 (1990); Monnot y col., J. Biol. Chem. 271: 1507 (1996); Gudermann y col., Annu. Rev. Neurosci. 20: 399 (1997); Osuga y col., J. Biol. Chem. 272: 25006 (1997)) sugirieron que el péptido derivado del sexto dominio de transmembrana del receptor P2-adrenérgico resultaba inhibir la activación y dimerización de receptores (Hebert y col., J. Biol. Chem., 271 (27): 16384-92 (1996)). Todas estas observaciones nos sugerían que dirigirse a las interacciones de transmembrana de los GPCR puede regular específicamente la función de los GPCR.

La naturaleza hidrofóbica de los péptidos de transmembrana hace altamente probables sus penetraciones en la bicapa. La orientación dentro de la membrana puede ser controlada por adición de residuos cargados al extremo que se supone que es extracelular.

1. Péptidos GPCR

Los polipéptidos GPCR de la presente invención, o los ácidos nucleicos que los codifican, incluyen un grupo finito de secuencias substancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de substitución que pueden ser rutinariamente obtenidos por alguien con conocimientos ordinarios en la técnica, sin excesiva experimentación, en base a las enseñanzas y a las directrices que aquí se presentan. Para una descripción detallada de la química y estructura de las proteínas, véase Schulz y col., PRINCIPLES OF PROTEIN STRUCTURE, Springer-Verlag, New York, 1978, y Creighton, T. E., PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983. Para una presentación de substituciones de secuencias nucleotídicas, tales como preferencias de codones, véase Ausubel y col., antes citado, en las secciones A.1.1-A.1.24, y Sambrook y col., antes citado, en los Apéndices C y D.

Los polipéptidos GPCR incluyen secuencias homólogas y/o fragmentos de al menos uno de los dominios de transmembrana 1-7 de uno o más GPCR u homólogos de los mismos, cuyos polipéptidos GPCR no son de origen natural y/o se presentan en forma aislada y/o purificada que no se encuentra en la naturaleza.

Sin embargo, en el contexto de la presente invención, se prefieren polipéptidos GPCR de más de 15-20 aminoácidos para que los polipéptidos GPCR sean capaces de extenderse por la bicapa lipídica.

Se prefiere en particular seleccionar los péptidos de la invención o modificarlos de tal forma que un extremo esté cargado y el otro sea neutro en condiciones fisiológicas. Esto es para que el péptido se inserte espontáneamente en una membrana. Es particularmente importante que el péptido se inserte en la misma orientación que el dominio de GPCR de transmembrana del que deriva.

Los péptidos de la invención pueden derivar de cualquiera de los 7 dominios de TM. Como ejemplos ilustrativos no limitativos de dominios de transmembrana TM1 y TM2 de GPCR que se usan para generar moléculas de la presente invención, se incluyen los siguientes:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Se obtuvieron las secuencias anteriores de una base de datos pública. Se incluyen ejemplos de secuencias de dominios de transmembrana TM3 y TM5 en WO 94/05695 y se incorporan como referencia. Los ejemplos de secuencias de dominios de transmembrana TM4, TM6 y TM7 pueden ser obtenidos de forma similar de fuentes públicas.

2. Síntesis de péptidos

Los péptidos o fragmentos de GPCR pueden ser aislados de una fuente natural, químicamente sintetizados o producidos recombinantemente, para obtener polipéptidos GPCR que imitan, modulan o inhiben la unión de ligandos a receptores copulados a proteína G.

a. Síntesis química de péptidos de transmembrana GPCR

Los péptidos de transmembrana de la presente invención son producidos usando procedimientos bien conocidos de síntesis peptídica, como se describe en, v.g., Merrifield, Science 232: 341-347 (1986), Barany y Merrifield, THE PEPTIDES, Gross y Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); y Stewart y Young, SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS (Rockford, III., Pierce), 2ª Ed. (1984), aquí incorporados como referencia.

Los péptidos fueron sintetizados por una síntesis peptídica en fase sólida de flujo a través en un Sintetizador Peptídico de Applied Biosystems 432A utilizando derivados Fmoc de aminoácidos. Para vencer la agregación que frecuentemente aparece durante la síntesis de péptidos hidrofóbicos y da lugar al bloqueo de la cadena peptídica en crecimiento, se introdujeron derivados FmocHmb de Ala, Val y Leu en las diferentes secuencias, pero no más de dos derivados de cada tipo por péptido para evitar el bloqueo estérico durante la síntesis. Se prolongó la copulación en la etapa después del aminoácido FmocHmb a 90 min., ya que este grupo protector provoca un enlentecimiento de la siguiente etapa de copulación debido a bloqueo estérico (T. Johnson, M. Quibell, Tetrahedron Lett. 35:463 (1994)). La pureza de los péptidos fue valorada por HPLC de fase invertida y las estructuras fueron confirmadas por espectrometría de masas con desorción de láser asistida por matriz.

b. Producción recombinante de péptidos de transmembrana GPCR

Se pueden obtener ácidos nucleicos que codifican péptidos de transmembrana GPCR por sintetización, aislamiento u obtención de una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína GPCR y subclonación de una región de la secuencia que codifica un péptido de transmembrana deseado.

i. Síntesis química de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos usados en la presente invención, incluyendo secuencias que codifican péptidos de transmembrana, son eventualmente sintetizados químicamente usando el método de triéster de fosforamidita en fase sólida de Beaucage y Carruthers, Tetrahedron Lett., 22(20): 1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado como se describe en Needham-VanDevanter y col., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 (1984). Se purifican entonces los oligonucleótidos químicamente sintetizados por electroforesis en gel de acrilamida nativa o por HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson y Regnier, J. Chrom., 255: 137-149 (1983). Se verifica la secuencia del oligonucleótido sintético, por ejemplo usando el método de degradación química de Maxam y Gilbert en Grossman, L. y Moldave, D., eds. Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499-560 (1980).

Se pueden modificar (es decir, mutar) las secuencias de ADN codificantes de los péptidos y proteínas de transmembrana GPCR para preparar diversas mutaciones. Dichas mutaciones pueden ser degenerativas, es decir, que la mutación no cambia la secuencia de aminoácidos codificada por el codon mutado, o no degenerativas, es decir, que la mutación cambia la secuencia de aminoácidos codificada por el codon mutado. Estas secuencias de ADN modificadas pueden ser preparadas, por ejemplo, mutando secuencias conocidas de tal forma que la mutación dé lugar a la deleción, substitución, inserción, inversión o adición de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado usando diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear los métodos de mutagénesis dirigida a sitio descritos en Taylor y col., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985), y Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985). Además, se pueden comprar kits para mutagénesis dirigida a sitio a vendedores comerciales. Por ejemplo, se puede comprar un kit para realizar mutagénesis dirigida a sitio a Amersham Corp. (Arlington Heights, III.). Tanto las mutaciones degenerativas como las no degenerativas pueden ser ventajosas en la producción o el uso de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, estas mutaciones pueden permitir mayores niveles de producción o una más fácil purificación, o proporcionar sitios adicionales de reconocimiento de endonucleasas de restricción. Todos estos ADN modificados (y las moléculas polipeptídicas codificadas) están incluidos en el alcance de la presente invención.

ii. Aislamiento recombinante de ácidos nucleicos codificantes de péptidos de transmembrana GPCR

Se pueden aislar ácidos nucleicos que codifican GPCR a partir de librerías genómicas o de ADNc, subclonando la librería en vectores de expresión, marcando sondas, hibridación de ADN y similares, como se describe en Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL (2ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se hace aquí referencia en adelante a este manual como "Sambrook y col." y se incorpora aquí como referencia.

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También se pueden usar varios métodos de amplificación de secuencias de interés, tales como la reacción en cadena de polimerisa (PCR), para preparar ADN codificante de péptidos de transmembrana GPCR o de un fragmento peptídico de los mismos. En las técnicas de PCR, se sintetizan cebadores oligonucleotídicos complementarios a los dos extremos 3' de la región de ADN que se ha de amplificar. Se lleva a cabo entonces la reacción en cadena de polimerasa usando dos cebadores. Véase PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. y White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990). Se pueden seleccionar cebadores para amplificar la totalidad de las regiones codificantes de un péptido de transmembrana GPCR de longitud completa o para amplificar segmentos de ADN de menor tamaño, según se desee. Una vez se amplifican por PCR las secuencias seleccionadas, se pueden preparar sondas oligonucleotídicas a partir de la secuencia obtenida. Se pueden usar luego estas sondas para aislar ADN codificantes de péptidos de transmembrana GPCR o de un fragmento peptídico de los mismos.

iii. Expresión recombinante de ácidos nucleicos codificantes de péptidos de transmembrana

Una vez se aísla y clona un ácido nucleico codificante de un péptido de transmembrana GPCR o de un fragmento peptídico del mismo, el ácido nucleico es expresado en una variedad de células sometidas a ingeniería recombinante para determinar que el ácido nucleico aislado realmente codifica los péptidos de transmembrana GPCR deseados o un fragmento de los mismos. Se consigue típicamente la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos uniendo operativamente un ácido nucleico de interés a un promotor (que es constitutivo o inducible), incorporando la construcción a un vector de expresión e introduciendo el vector en una célula huésped adecuada. Los vectores típicos contienen finalizadores de la transcripción y de la traducción, secuencias de iniciación de la transcripción y de la traducción y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico particular. Los vectores incluyen eventualmente cassettes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia finalizadora independiente, secuencias que permiten la replicación del cassette en eucariotas o procariotas o ambos (v.g., vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procarióticos como eucarióticos. Los vectores son adecuados para replicación e integración en procariotas, eucariotas o preferiblemente ambos. Véanse Giliman y Smith (1979), Gene, 8: 81-97; Roberts y col., (1987), Nature, 328:731-734; Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook y col., (1989), MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL (2ª ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (Sambrook); y F.M. Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1994) (Ausubel). La información del producto de fabricantes de reactivos biológicos y equipo experimental también proporciona información útil sobre métodos biológicos conocidos. Dichos fabricantes incluyen la compañía química SIGMA (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem. Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza) y Applied Biosystems (Foster City, CA), así como otras muchas fuentes comerciales conocidas para un experto.

Los ácidos nucleicos (v.g., secuencias codificantes, promotores y vectores) usados en el presente método pueden ser aislados de fuentes naturales, obtenidos de fuentes tales como librerías ATCC o GenBank o preparados por métodos sintéticos. Los ácidos nucleicos sintéticos pueden ser preparados por una variedad de métodos en solución o en fase sólida. Hay una amplia disponibilidad de descripciones detalladas de los procedimientos para la síntesis en fase sólida de ácidos nucleicos por química de fosfitos-triésteres, fosfotriésteres y H-fosfonatos. Véanse, por ejemplo, Itakura, Patente EE.UU. Nº 4.401.796; Caruthers y col., Patentes EE.UU. Nº 4.458.066 y 4.500.707; Beaucage y col. (1981), Tetrahedron Lett., 22:1859-1862; Matteucci (1981) y col., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191; Caruthers, y col. (1982), Genetic Engineering, 4:1-17; Jones, capítulo 2, Atkinson y col., capítulo 3, y Sproat y col., capítulo 4, en OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, Gait (ed.), IRL Press, Washington D.C. (1984); Froehler y col. (1986), Tetrahedron Lett., 27:469-472; Froehler y col. (1986), Nucleic Acids Res., 14:5399-5407; Sinha y col. (1983), Tetrahedron Lett., 24:5843-5846; y Sinha y col. (1984), Nucl. Acids Res., 12:4539-4557, aquí incorporadas como referencia.

3. Péptidos y peptidomiméticos derivatizados

Es bien conocido el diseño de péptidos y miméticos de péptidos químicamente modificados que son resistentes a la degradación por enzimas proteolíticas o tienen una mejor solubilidad o propiedades de unión.

Los aminoácidos modificados o derivados químicos de péptidos GPCR según la presente invención pueden contener restos químicos adicionales o aminoácidos modificados que normalmente no forman parte de una proteína. Se incluyen así modificaciones covalentes del péptido en el alcance de la presente invención. Dichas modificaciones pueden ser introducidas en un polipéptido GPCR por reacción de residuos de aminoácidos deseados del polipéptido con un agente derivatizante orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Los siguientes ejemplos de derivados químicos son facilitados a modo de ilustración y no a modo de limitación.

El diseño de miméticos de péptidos resistentes a la degradación por enzimas proteolíticas es bien conocido, tanto para el diseño de agonistas/antagonistas de hormonas como para el de inhibidores enzimáticos. Véanse, v.g., Sawyer, en STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN, P. Verapandia, Ed., NY 1997; Patente EE.UU. Nº 5.552.534; y Patente EE.UU. Nº 5.550.251, todas ellas incorporadas como referencia.

Históricamente, el foco principal del diseño de peptidomiméticos ha evolucionado a partir de la investigación para el descubrimiento de fármacos dirigidos a receptores y no ha sufrido un impacto directo de una estructura tridimensional experimentalmente determinada de la proteína de interés. No obstante, una aproximación jerárquica de diseño molecular péptido\rightarrowpeptidomimético y modificación química ha evolucionado a lo largo de las dos últimas décadas, en base a la transformación sistemática de un ligando peptídico y al análisis iterativo de las relaciones estructura-actividad y estructura-conformación de análogos de "segunda generación". Dicho trabajo ha integrado típicamente técnicas biofísicas (cristalografía de rayos x y/o espectroscopía de RMN) y modelación molecular asistida por ordenador con pruebas biológicas para avanzar el diseño de fármacos peptidomiméticos.

Las propiedades de estructura tridimensional de péptidos se definen en términos de ángulos de torsión (\psi, \phi, \omega, \chi) entre el nitrógeno de la amina del esqueleto (N^{\alpha}), el carbono del carbonilo del esqueleto (C^{1}), el carbono de la metionina del esqueleto (C^{\alpha}) y la funcionalización del hidrocarburo de cadena lateral (v.g., C^{\beta}, C^{\lambda}, C^{\delta}, C^{\varepsilon} de Lys) derivado de la secuencia de aminoácidos. Un gráfico de Ramachandran (\psi frente a \phi) puede definir las combinaciones preferidas de ángulos de torsión para estructuras secundarias ordenadas (conformaciones), tales como la \alpha-hélice, el giro \beta, el giro \gamma o la lámina \beta. La flexibilidad molecular está directamente relacionada con interacciones de unión covalente y/o no covalente en un péptido particular. Incluso modificaciones químicas modestas por N^{\alpha}-metilo, C^{\alpha}-metilo o C^{\beta}-metilo pueden tener consecuencias significativas sobre la conformación resultante.

El andamiaje N^{\alpha}-C^{\alpha}-C' puede ser transformado por introducción de substitución de olefina (v.g., C^{\alpha}-C^{\beta}\rightarrow C = C o deshidroaminoácido o por inserción (v.g., C^{\alpha}-C' \rightarrow C^{\alpha}-C=C-C' o aminoácido vinílogo. También se puede substituir el carbono C\beta para avanzar el diseño de así llamados aminoácidos "quiméricos". Finalmente, con respecto a amidas N-substituidas, merece también la pena mencionar la interesante aproximación de substituir el andamiaje tradicional del péptido por bloques de construcción de glicina N-substituida. Globalmente, dichas modificaciones del andamiaje N^{\alpha}-C^{\alpha}-C o de la cadena lateral C^{\alpha}-C^{\beta} expanden la diversidad molecular basada en péptidos (es decir, así llamadas librerías "de peptoides"), así como nuestro conocimiento estructural 3-D el espacio \phi-\Psi-\chi tradicional.

En una aproximación, tal como describen Sherman y Spatola, J. Am. Chem. Soc. 112: 433 (1990), se substituyen uno o más enlaces amida en de un modo esencialmente isoestérico por una variedad de grupos químicos funcionales. Por ejemplo, se puede substituir cualquier unión amida en cualquiera de los polipéptidos GPCR por un resto de cetometileno, v.g. (-C(=O)-CH_{2}-) para (-(C=O)-NH-). Unas cuantas de las substituciones de enlaces amida conocidas incluyen: aminometileno o \psi[CH_{2}NH]; cetometileno o \psi[COCH_{2}]; etileno o \psi[CH_{2}CH_{2}]; olefina o \psi[CH=CH]; éter o \psi[CH_{2}O]; tioéter o \psi[CH_{2}S]; tetrazol o \psi[CN_{4}]; tiazol o \psi[thz]; retroamida o \psi[NHCO]; tioamida o \psi[CSNH]; y éster o \psi[CO_{2}]. Estos substitutos de enlaces amida alteran las propiedades conformacionales y de uniones de H que pueden ser necesarias para el reconocimiento molecular peptídico y/o la actividad biológica en blancos de receptores. Más aún, dichas substituciones en el esqueleto pueden impartir estabilidad metabólica hacia la escisión con peptidasas en relación al péptido parental. El descubrimiento de aún otro isóstero de enlaces amida no hidrolizable ha tenido un impacto particular en el diseño de inhibidores de proteasas y éstos incluyen: hidroximetileno o \psi[CH(OH)]; hidroxietileno o \psi[CH(OH)CH_{2}] y \psi[CH_{2}CH(OH)]; dihidroxietileno o (\psi[CH(OH)CH(OH)], hidroxietilamina o \psi[CH(OH)CH_{2}N], dihidroxietileno e hidroximetileno simétrico C_{2}. Dichas modificaciones en el esqueleto han resultado extremadamente efectivas, ya que pueden representar miméticos de estado de transición o bioisoésteres del intermediario tetraédrico hipotético (v.g., \psi[C(OH)_{2}NH]) para esta clase de enzimas proteolíticas. Se espera que dichos derivados tengan la propiedad de una mayor estabilidad a la degradación enzimática y que, por lo tanto, posean ventajas para la formulación de compuestos que pueden tener mayores vidas medias in vivo, al ser administrados por vía oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, tópica, rectal, intraocular u otras vías.

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Tanto las modificaciones en el esqueleto peptídico como en la cadena lateral pueden proporcionar extremos prototípicos para el diseño de miméticos de estructura secundaria, como sugiere típicamente el hecho de que la substitución de D-aminoácidos, N^{\alpha}-Me-aminoácidos, C^{\alpha}-Me-aminoácidos y/o deshidroaminoácidos en un extremo peptídico puede inducir o estabilizar conformaciones regioespecíficas de giro \beta, giro \gamma, lámina \beta o \alpha-hélice. Hasta la fecha, se han diseñado una variedad de miméticos de estructura secundaria y se incorporado a péptidos o peptidomiméticos. El giro \beta ha tenido un interés particular en el área del descubrimiento de fármacos peptidomiméticos dirigidos a receptores. Esta unidad estructural secundaria existe en una secuencia tetrapeptídica en la cual el primer y cuarto átomo de C^{\alpha} están separados en \leq 7 \ring{A} y se caracterizan además por aparecer en una región no helicoidal de la secuencia peptídica y poseer un enlace de H intramolecular de diez miembros entre los residuos de aminoácidos i y i\rightarrow4. Una de las aproximaciones iniciales de significación para el diseño de miméticos de giro \beta era la plantilla basada en dipéptidos monocíclica que emplea una restricción de cadena lateral a esqueleto en los sitios i + 1 e i + 2. A lo largo de la pasada década, se han desarrollado una variedad de otras plantillas monocíclicas o bicíclicas como miméticos de giro \beta. Se han descrito miméticos de giro \beta monocíclicos que ilustran la oportunidad potencial para diseñar andamiajes que pueden incorporar cada una de las cadenas laterales (posiciones i, i+1, i+2 e i+3), así como cinco de las ocho funcionalidades NH o C=O, en la secuencia tetrapeptídica parental, secuencia tetrapeptídica modelada en conformaciones de giro \beta de tipos I-IV. De forma similar, una plantilla de benzodiazepina ha mostrado utilidad como andamiaje de mimético de giro \beta que también puede estar multisubstituido para simular funcionalización de cadena lateral, particularmente en las posiciones i e i + 3 de la secuencia tetrapeptídica correspondiente modelada en conformaciones de giro \beta de tipo I-VI. Un mimético de giro \gamma recientemente descrito ilustra una aproximación innovadora para incorporar un substituto de retroamida entre los residuos de aminoácidos i e i\rightarrow1 con un puente de etileno entre los átomos N^{1} (es decir, nitrógeno que substituye al C' del carbonilo) y N de las posiciones i e i+2, y esta plantilla permite la posibilidad de las tres cadenas laterales de la secuencia tripeptídica parental. Finalmente, el diseño de un mimético de lámina \beta proporciona una plantilla atractiva para restringir el esqueleto de un péptido al que simula una conformación extendida. La lámina \beta es de interés particular en el área del descubrimiento de fármacos peptidomiméticos dirigidos a
proteasas.

Los aminoácidos aromáticos pueden estar substituidos con D- o L-naftilalanina, D- o L-fenilglicina, D- o L-2-tienilalanina, D- o L-1-, 2-, 3- o 4-pirenilala-nina, D- o L-3-tienilalanina, D- o L-(2-piridinil)ala-nina, D- o L-(3-piridinil)alanina, D- o L-(2-pirazinil)-alanina, D- o L-(4-isopropil)fenilglicina, D-(trifluoro-metil)fenilglicina, D-(trifluorometil)fenilalanina, D-p-fluorofenilalanina, D- o L-p-bifenilfenilalanina, D- o L-p-metoxibifenilfenilalanina, D- o L-2-indol(alquil)alani-nas y D- o L-alquilaininas, donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, isopentilo o aminoácidos no ácidos de C_{1}-C_{20} substituidos o sin substituir.

Los aminoácidos ácidos pueden estar substituidos con aminoácidos no carboxilados, manteniendo aún una carga negativa, y derivados o análogos de los mismos, tales como los ejemplos no limitativos de (fosfono)alanina, glicina, leucina, isoleucina, treonina o serina; o sulfatados (v.g., -SO_{3}H), como treonina, serina o tirosina.

Otras substituciones pueden incluir aminoácidos hidroxilados no naturales producidos combinando "alquilo" (según se define aquí y ejemplifica) con cualquier aminoácido natural. Los aminoácidos básicos pueden estar substituidos con grupos alquilo en cualquier posición de los aminoácidos naturales lisina, arginina, ornitina, citrulina o ácido (guanidino)acético, u otros ácidos (guanidino)alquilacéticos, donde "alquilo" se define como antes. Los derivados de nitrilo (v.g., que contienen el resto CN en lugar de COOH) pueden también substituir a la asparragina o a la glutamina y el sulfóxido de metionina puede substituir a la metionina. Los métodos de preparación de dichos derivados peptídicos son bien conocidos para un experto en la técnica.

Además, cualquier aminoácido de dichos péptidos puede estar substituido por el mismo aminoácido, pero de quiralidad opuesta. Así, cualquier aminoácido natural en la configuración L (a la que también puede hacerse referencia como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede estar substituido con un aminoácido del mismo tipo estructural químico, pero de "caroled" opuesto, al que generalmente se hace referencia como aminoácido D, pero al que se puede hacer adicionalmente referencia como R o S, dependiendo de su composición y configuración química. Dichos derivados tienen la propiedad de una estabilidad mucho mayor a la degradación enzimática y, por lo tanto, son ventajosos en la formulación de compuestos que pueden tener vidas medias in vivo más prolongadas, cuando se administran por vía oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, tópica, rectal, intraocular u otras.

Como modificaciones de aminoácidos adicionales de aminoácidos de polipéptidos GPCR de la presente invención, se pueden incluir los siguientes: pueden reaccionar residuos de cisteína con alfa-haloacetatos (y correspondientes aminas), tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados carboximetílicos o carboxiamidometílicos. También se pueden derivatizar residuos de cisteinilo por reacción con compuestos tales como bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Se pueden derivatizar los residuos de histidilo por reacción con compuestos tales como procarbonato de dietilo, v.g., a pH 5,5-7,0, ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo, y también se puede usar bromuro de para-bromofenacilo; v.g., cuando la reacción es preferiblemente llevada a cabo en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos terminales de lisinilo y amino pueden reaccionar con compuestos tales como anhídrido de ácido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. Se espera que la derivatización con estos agentes tenga un efecto de reversión de la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen compuestos tales como imidoésteres, v.g., como picolinimidato de metilo, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4 pentanodiona y la reacción catalizada con transaminasas con glioxilato.

Los residuos de arginilo pueden ser modificados por reacción con uno o más reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina según etapas de método conocidas. La derivatización de los residuos de arginina requiere llevar a cabo la reacción en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Más aún, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de la lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

Los residuos de tirosilo pueden ser modificados por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Se pueden usar N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies O-acetiltirosilo y 3-nitroderivados, respectivamente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden ser selectivamente modificados por reacción con carbodiimidas (R'-NC-N-R') tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Más aún, los residuos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos de asparraginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

Los residuos de glutaminilo y asparraginilo pueden ser desamidados a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos pueden ser desamidados en condiciones débilmente ácidas. Cualquier forma de estos residuos entra dentro del alcance de la presente invención.

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La derivatización con agentes bifuncionales es útil para el entrecruzamiento del péptido con ciertos restos químicos. Como agentes entrecruzantes comúnmente usados, se incluyen, v.g., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato dan intermediarios fotoactivables capaces de formar entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente, se pueden usar matrices insolubles en agua, tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los substratos reactivos descritos en las Patentes EE.UU. Nº 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 y 4.330.440 (aquí incorporadas en su totalidad como referencia), para la inmovilización de proteínas.

Otras modificaciones de los polipéptidos GPCR de la presente invención pueden incluir la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal, la metilación de los residuos de amida de la cadena principal (o substitución con N-metilaminoácidos) y, en algunos casos, la amidación de los grupos carboxilo C-terminales, según etapas de método conocidas.

Dichos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la absorción, la permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica, la vida media biológica y similares. Dichos restos o modificaciones de los polipéptidos GPCR pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier posible efecto colateral no deseable de la proteína y similares. Se describen restos capaces de mediar en dichos efectos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980).

Dichos derivados químicos de los polipéptidos GPCR pueden proporcionar también unión a soportes sólidos, incluyendo, aunque sin limitación, agarosa, celulosa, fibras huecas u otros carbohidratos poliméricos tales como agarosa y celulosa, tal como para la purificación, la generación de anticuerpos o la clonación; o para obtener propiedades físicas alteradas, tales como resistencia a la degradación enzimática o una mayor afinidad de unión o modulación para los GPCR, que se desea para composiciones terapéuticas que contengan polipéptidos GPCR, anticuerpos para los mismos o fragmentos de éstos. Dichos derivados peptídicos son bien conocidos en la técnica, así como las etapas de los métodos para producir dichos derivados usando carbodiimidas, ésteres activos de N-hidroxisuccinimida o anhídridos mixtos, como ejemplos no limitativos.

La variación sobre las secuencias de polipéptidos GPCR de la presente invención puede incluir también: la adición de uno o más (v.g., dos, tres, cuatro o cinco) residuos de lisina, arginina u otros residuos básicos o uno o más (v.g., dos, tres, cuatro o cinco) residuos de glutamato o aspartato u otros residuos ácidos en un extremo del péptido, donde "ácido" y "básico" son como aquí se define. Se pueden introducir también cargas negativas por adición de grupos carboxilo, fosfato, borato, sulfonato o sulfato. Dichas modificaciones pueden aumentar el contenido en alfa-hélice del péptido por el "efecto dipolo de la hélice". También pueden aportar una mayor solubilidad acuosa del péptido y permitir la correcta inserción de péptidos en una estructura de membrana.

En otra aproximación, se han usado una variedad de aminoácidos no codificados o modificados tales como D-aminoácidos y N-metilaminoácidos para modificar péptidos de mamíferos. Alternativamente, se ha estabilizado una presunta conformación bioactiva por medio de una modificación covalente, tal como ciclación, o por incorporación de gamma-lactama o de otros tipos de puentes. Véanse, v.g., Veber y Hirschmann, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978 75 2636, y Thorsett, y col., Biochem Biophys. Res. Comm., 1983 111 166. El objetivo primario de tales manipulaciones no ha sido evitar el metabolismo o aumentar la biodisponibilidad oral, sino más bien restringir una conformación bioactiva para aumentar la potencia o para inducir una mayor especificidad para un subtipo de receptor.

Los anteriores ejemplos de agonistas o antagonistas peptidomiméticos basados en andamiaje peptídico o plantilla no peptídica ilustran diversas estrategias para elaborar modelos de conformación bioactiva y/o de farmacóforos de ligandos peptídicos en sus receptores. En muchos casos, también se ha conseguido selectividad de los subtipos de receptores pro modificaciones estructurales sistemáticas de extremos prototípicos de peptidomiméticos. Así, aunque las estructuras 3D de los GPCR siguen siendo difíciles de encontrar (excepto para modelos construidos a partir de estructuras 3D de baja resolución basadas en homología de bacteriorrodopsina o rodopsina, véase lo que antecede), el desarrollo de modelos de farmacóforos utilizando la aproximación jerárquica en el diseño de fármacos basado en la estructura de péptidos \rightarrow peptidomiméticos es prometedor.

4. Purificación de péptidos de transmembrana GPCR

Los polipéptidos de esta invención pueden ser purificados hasta una pureza substancial por técnicas estándar, incluyendo la precipitación selectiva con substancias tales como sulfato de amonio, la cromatografía en columna, los métodos de inmunopurificación y otros. Véase, por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York (1982), aquí incorporado como referencia. Por ejemplo, los péptidos y proteínas de transmembrana GPCR y los polipéptidos producidos por tecnología de ADN recombinante son purificados por una combinación de lisis celular (v.g., sonicación) y cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para péptidos de transmembrana GPCR o un fragmento peptídico de éstos. Para los productos de fusión, la digestión posterior de la proteína de fusión con una enzima proteolítica apropiada libera el polipéptido deseado. Las proteínas pueden ser entonces además purificadas por técnicas de química proteica estándar. Una proteína purificada exhibe preferiblemente una sola banda en un gel electroforético. Se recuerda a los expertos en la técnica que los métodos deben tener en cuenta la naturaleza hidrofóbica de los péptidos.

5. Detección de productos génicos de péptidos de transmembrana GPCR

Los péptidos de transmembrana GPCR o un fragmento peptídico de los mismos pueden ser detectados o cuantificados por una variedad de métodos. Los métodos preferidos incluyen el uso de anticuerpos específicos.

a. Detección de péptidos de transmembrana GPCR por inmunoensayo i. Producción de anticuerpos

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos para los expertos en la técnica. Véanse, v.g., Coligan (1991), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; y Harlow and Lane (1989), ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, NY; Stites y col., (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias allí citadas; Goding (1986), MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2ª ed.) Academic Press, New York, NY; y Kohler y Milstein (1975), Nature, 256:495-497. Dichas técnicas incluyen la preparación de anticuerpos por selección de anticuerpos a partir de librerías de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares. Véanse Huse y col., (1989), Science, 246:1275-1281; y Ward y col. (1989) Nature, 341:544-546. Por ejemplo, para producir antisueros para uso como inmunoensayo, se aísla un polipéptido como se describe aquí. Por ejemplo, se produce proteína recombinante en una línea celular transformada. Se inmuniza una cepa endogámica de ratones o conejos con el péptido usando un adyuvante estándar, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización estándar. Alternativamente, se puede usar un péptido sintético derivado de las secuencias aquí descritas y conjugado a una proteína de soporte como inmunógeno.

Se pueden usar una serie de inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con péptidos de transmembrana GPCR o con un fragmento peptídico de los mismos. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. También se puede usar proteína natural en forma pura o impura. También se pueden usar péptidos sintéticos producidos usando los péptidos de transmembrana GPCR o un fragmento peptídico de los mismos de las secuencias aquí descritas como inmunógeno para la producción de anticuerpos para la proteína. La proteína recombinante puede expresarse en células eucarióticas o procarióticas, como se ha descrito anteriormente, y ser purificada como se ha descrito antes en general. El producto es entonces inyectado en un animal capaz de producir anticuerpos. Se pueden generar anticuerpos monoclonales o policlonales para posterior uso en inmunoensayos para medir la proteína.

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales son conocidos para los expertos en la técnica. Resumiendo, se mezcla un inmunógeno, preferiblemente una proteína purificada tal como péptidos de transmembrana GPCR o un fragmento peptídico de los mismos, con un adyuvante y se inyecta en un animal de elección (v.g., un ratón, una rata, un conejo, un cerdo, una cabra, una vaca, un caballo, pollos, etc.) a intervalos de 1-4 semanas. Se puede conjugar el inmunógeno a una proteína de soporte y puede servir de inmunógeno. Se monitoriza la respuesta inmune del animal a la preparación de inmunógeno tomando muestras de ensayo de sangre y determinando el título de reactividad con los péptidos de transmembrana GPCR o un fragmento peptídico de éstos. Cuando se obtienen títulos apropiadamente altos de anticuerpo para el inmunógeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Se puede hacer aún una fraccionación de los antisueros para enriquecer en anticuerpos reactivos con la proteína si se desea. (Véase Harlow y Lane, antes citado).

Se recogen los sueros policlonales y se titulan frente a la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Se seleccionan los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o superior y se comprueba su reactividad cruzada frente a péptidos de transmembrana no-GPCR o incluso péptidos de transmembrana GPCR de otros tipos celulares u otras especies o un fragmento peptídico de los mismos, usando un inmunoensayo de unión competitiva (véase, v.g., Harlow y Lane, antes citado, en las páginas 570-573). Los anticuerpos y antisueros monoclonales y policlonales específicos normalmente se unirán con una K_{D} de al menos aproximadamente 0,1 mM, más normalmente de al menos aproximadamente 1 \muM, preferiblemente de al menos aproximadamente 0,1 \muM o mayor, y más preferiblemente de 0,01 \muM o mayor.

Se pueden obtener anticuerpos monoclonales por diversas técnicas con las que los expertos en este campo están familiarizados. Resumiendo, se inmortalizan células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente por fusión con una célula de mieloma (véase Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976), aquí incorporado como referencia). Como métodos alternativos de inmortalización, se incluyen la transformación con Virus Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Se hace un rastreo de colonias que surgen de células inmortalizadas simples en cuanto a la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antígeno y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede aumentar gracias a varias técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Alternativamente, se pueden aislar secuencias de ADN que codifiquen un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo rastreando una librería de ADN de células B humanas según el protocolo general señalado por Huse y col., (1989) Science 246:1275-1281.

ii. Inmunoensayos

Se puede medir una proteína particular por una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo en general, véase BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 7ª Edición (D. Stites y A. Terr, eds.) 1991. Más aún, los inmunoensayos de la presente invención pueden ser llevados a cabo en cualquiera de varias configuraciones, que están ampliamente revisadas en ENZYME IMMUNOASSAY, E.T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, en LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam (1985); y Harlow y Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, antes citado, cada una de las cuales es aquí incorporada como referencia.

Los inmunoensayos para péptidos o peptidomiméticos de transmembrana GPCR o subfragmentos de los mismos pueden usar un antisuero policlonal producido contra un péptido o peptidomimético de la invención. Este antisuero es seleccionado para tener una baja reactividad cruzada frente a otros péptidos (distintos de los péptidos de transmembrana no-GPCR u otros péptidos de transmembrana GPCR) y cualquier reactividad cruzada de este tipo es eliminada por inmunoabsorción antes de su uso en el inmunoensayo.

Se pueden usar inmunoensayos en el formato de unión competitiva para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, se puede inmovilizar un antígeno peptídico de referencia de la invención en un soporte sólido. Se mide la capacidad de otras moléculas (distintas de los péptidos de transmembrana no-GPCR, o desconocidas) para competir con la unión de antisueros que reconocen el antígeno peptídico de referencia inmovilizado. Se compara la capacidad de tales moléculas para competir con la unión de un antisuero o anticuerpo al péptido de referencia inmovilizado con una molécula estándar, tal como el propio antígeno peptídico de referencia. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada usando cálculos estándar. Se seleccionan antisueros con menos de un 10% de reactividad cruzada para moléculas que tienen reactividad cruzada y se reúnen. Se elimina eventualmente cualquier anticuerpo que tenga reactividad cruzada de los sueros reunidos por inmunoabsorción con moléculas que tienen reactividad cruzada.

Se usan entonces los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos en un inmunoensayo de unión competitiva para comparar la unión de una segunda proteína con la del antígeno peptídico de referencia. Para hacer esta comparación, cada una de las dos moléculas en un amplio rango de concentraciones y se determina la cantidad de cada molécula requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros al antígeno peptídico de referencia inmovilizado. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es menor de 10 veces la cantidad del péptido de referencia usado para producir el anticuerpo, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para el antígeno peptídico de referencia.

La presencia de un polipéptido deseado (incluyendo péptido, producto de traducción o producto de digestión enzimática) en una muestra puede ser detectada y cuantificada usando análisis Western blot. La técnica consiste, en general, en separar los productos de la muestra por electroforesis en gel en base al peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nilón o un filtro de nilón derivatizado) e incubar la muestra con anticuerpos de marcaje que se unen específicamente a la proteína analito. Los anticuerpos de marcaje se unen específicamente al analito sobre el soporte sólido. Estos anticuerpos son marcados directamente, o alternativamente se detectan después usando agentes de marcaje tales como anticuerpos (v.g., anticuerpos de oveja anti-ratón marcados donde el anticuerpo para un analito es un anticuerpo murino) que se unen específicamente al anticuerpo de marcaje.

6. Detección de secuencias de péptidos de transmembrana GPCR, péptidos y peptidomiméticos que inhiben óptimamente las propiedades y funciones biológicas de los GPCR

Los péptidos o variantes peptídicas de la invención que modulan la actividad biológica de los GPCR son generalmente identificados como sigue. Se seleccionan secuencias peptídicas a partir de los dominios de transmembrana del GPCR que se ha de abordar. Los dominios de transmembrana son fácilmente determinados por aplicación de modelos de ordenador a secuencias conocidas. También se utilizan modelado por ordenador y comparación con secuencias de péptidos de transmembrana conocidas para definir la orientación de la secuencia peptídica en la membrana, permitiendo así la determinación del extremo de la secuencia peptídica que se encuentra hacia el aspecto extracelular de la membrana plasmática. La selección de un dominio de transmembrana preferido para abordarlo es en gran medida empírica. Hemos visto que péptidos derivados del dominio de transmembrana 2 son inhibidores particularmente efectivos de la función GPCR. Alternativamente, secuencias peptídicas seleccionadas a partir del dominio de transmembrana 4 también han resultado ser antagonistas efectivos.

Al seleccionar una secuencia peptídica, se sintetiza una secuencia de transmembrana de referencia y se modifica sistemáticamente para identificar variantes (o análogos) que tengan propiedades mejoradas. Las modificaciones introducen una carga negativa en el extremo extracelular de la secuencia peptídica. Se pueden añadir cargas negativas en forma de residuos de aminoácidos ácidos tales como Asp o Glu. El número de residuos ácidos añadidos es típicamente de 1 a 3 dependiendo de la hidrofobicidad de la secuencia peptídica y de la posterior necesidad de aumentar la solubilidad del péptido. Además, los péptidos preferibles tienen una carga neutra en el extremo del péptido que se orienta hacia el aspecto intracelular de la membrana plasmática. Así, la naturaleza hidrofóbica global de dicho péptido de transmembrana dará lugar a inserción en una membrana y la carga negativa en el extremo extracelular dará lugar a que el péptido tenga la misma orientación que el dominio GPCR de transmembrana del que deriva. Se puede estudiar la inserción en la membrana por microscopía fluorescente de análogos peptídicos marcados usando una metodología conocida para los expertos en la técnica, como se ilustra aquí en el Ejemplo 3.

En general, se determina la capacidad del péptido o de las variantes peptídicas para modular la actividad del GPCR de interés estudiando la capacidad del péptido para inhibir la activación inducida por un ligando natural del GPCR de interés. La activación de la mayoría de los GPCR da lugar a un aumento en el AMPc o a la liberación de calcio intracelular. Así, si la activación del GPCR de interés aumenta el AMPc, se determina la actividad inhibitoria del péptido midiendo los niveles de AMPc mediante métodos conocidos para los expertos en la técnica (véase, v.g., C. Nordstedt y B.B. Fredholm Anal. Chem. 189: 231-234 (1990). De forma similar, si la activación del GPCR de interés libera calcio intracelular, se determina la actividad inhibitoria del péptido midiendo los niveles de calcio intracelular como se ilustra en los ejemplos que se dan a continuación.

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Los péptidos pueden ser estudiados para otras propiedades, incluyendo las siguientes:

- mayor capacidad para modular la actividad GPCR;

- mayor resistencia a la proteolisis;

- mejor solubilidad;

- vida media más larga o más corta, particularmente en medio de cultivo o en un fluido biológico tal como plasma o sangre entera;

- mejor capacidad para insertarse en un compartimento de membrana, especialmente en una orientación particular, por medios conocidos en la técnica.

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También se pueden sintetizar variantes peptídicas que tengan una o más de las siguientes modificaciones:

- substitución conservadora o no conservadora de cualquiera de los residuos de aminoácidos;

- deleción o adición de residuos en cualquier posición;

- modificación química de cualquier residuo;

- análogos peptidomiméticos del péptido de referencia.

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Se pueden diseñar y/o rastrear variantes peptídicas racionalmente para usar metodologías de rastreo de alto rendimiento aplicadas a librerías combinatorias. Los métodos de generación de librarías combinatorias y de rastreo de tales librerías usando métodos de alto rendimiento son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, v.g., Baum, C&EN (7 de Febrero de 1994): 20-26, y las referencias allí citadas).

Estas variantes peptídicas son también estudiadas en cuanto a cualquiera de las propiedades antes enumeradas. En general, se considera que una variante peptídica tiene mejores propiedades en relación al péptido de referencia si una propiedad o parámetro mensurables dados tienen un valor que es al menos un 10%, preferiblemente al menos un 30%, más preferiblemente al menos un 75% y más preferiblemente al menos un 95% mejor que el valor para el péptido de referencia.

La capacidad relativa de los péptidos modificados (en comparación con el péptido de referencia) para modular una actividad biológica GPCR es estudiada como sigue. Se expone una línea celular que expresa un GPCR y exhibe una actividad biológica mediada por GPCR al péptido de referencia o al modificado en condiciones idénticas y se mide la propiedad biológica del GPCR en ausencia o presencia de cualquiera de los péptidos. Como ejemplos de líneas celulares, GPCR expresados por la línea celular y propiedades reguladas por GPCR medidas, se incluyen los siguientes:

- cualquier célula que expresa de manera estable CXCR4, especialmente células unidas, incluyendo células que están sometidas a ingeniería genética para expresar CXCR4, incluyendo células HeLa; CXCR4; flujo de calcio inducido por el factor I derivado de células del estroma;

- cualquier célula que exprese establemente CXCR4, especialmente células unidas, incluyendo células que están sometidas a ingeniería genética para expresar CXCR4, incluyendo células CM; CXCR4; infección por VIH-1;

- cualquier célula que exprese de forma estable CCKAR, especialmente células unidas, incluyendo células que están sometidas a ingeniería genética para expresar CCKAR, tales como células CHO; CCKAR; liberación de calcio inducida por colecistoquinina;

- cualquier que exprese de forma estable CCR5 humano. Especialmente células unidas, incluyendo células que están sometidas a ingeniería genética para expresar CCR5, incluyendo células HEK; CCR5; liberación de calcio inducida por RANTES.

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Se mide la actividad inhibitoria exponiendo células que expresan GPCR a un rango de concentraciones de un antagonista de ensayo y midiendo una propiedad o actividad biológica asociada a ese GPCR. Las concentraciones de ensayo pueden variar de 1 nanomolar a 100 micromolar, dependiendo de la solubilidad y afinidad del péptido. Se realiza el rastreo inicial usando diluciones de factor 10, tales como 50, 5, 0,5 y 0,05 micromolar. Se reduce entonces la menor concentración activa en decrementos del 10% para determinar la menor concentración efectiva. La propiedad medida puede ser la unión a un ligando (por ejemplo, unión del octapéptido de colecistoquinina a CCKAR) o la producción de una respuesta metabólica mensurable (v.g., flujo alterado de iones o translocación, fosforilación alterada, síntesis o degradación de proteínas alterada, morfología celular alterada, secreción alterada, producción alterada de componentes particulares, tales como fosfatos de inositol solubles, unión de un virus y posterior infección, crecimiento tumoral, quimiotaxis, respuesta mitogénica, activación del crecimiento celular, secreción, contracción muscular, actividad vasopresora y vasodepresora, transmisión sináptica y liberación de calcio intracelular, etc.)

Se ha descrito que los siguientes GPCR tienen un papel en la infección por VIH:

STRL33: Solicitud Provisional EE.UU. Nº 60/042.880;

CCRR5: Solicitud de Patente EE.UU. Nº 60/042.880;

CCR8:: Solicitud Provisional EE.UU. Nº 60/054.094;

CCR2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 2752-2756 (1994)

\quad: J. Biol. Chem. 270: 29671-29675 (1995)

CCR3:: J. Biol. Chem. 270: 16491-16494 (1995)

CX3CR1:: DNA Cell Biol. 14: 673-680 (1995)

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La siguiente es una lista de péptidos de transmembrana que tienen propiedades antagonistas de GPCR:

Del GPCR CXCR4

: F-2-2: LLFVITLPFWAVDAVANWYFGNDD

: F-2-5: LLFVITLPFWAVDAVANDD-OH

: F-4-2: VYVGVWIPALLLTIPDFIFANDD-OH

: F-6-1: VILILAFFACWLPYYIGISID-OH

: F-7-3: DDEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2}

: F-7-4: DDSITEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2}

Del G PCR CCR5

: CCR5-TM-2-2: LFFL LTVPFWAHYAAAQWDFGDD

: CCR5-TM-4-1; FGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTSSDD

: CCR5-TM-6-1: LIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQED

: CCRS-TM-7-1: DDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFV (no un péptido de la invención)

Del GPCR CCR2

: CCR2-TM-2-1: IYLLNLAISDLLFLITLPLWADD-OH

: CCR2-TM-2-2: LLFLITLPLWAH SAANEWVFGNDD-OH

: CCR2-TM-4-1: FGVVTSVITWLVAVF ASVPGIIFTDD

: CCR2-TM-6-1: VIFTIMIVYFLFWTPYN IVILLNTFQED

: CCR2-TM-7-1: DDATQVT ETLGMTHCCINPIIYAFV (no un péptido de la invención)

Del GPCR CCR3

: CCR3-TM-2-1: LLFLVTLPFW IHYVRGHNWVFGDDD

: CCR3-TM-4-1: FGVITSIVTWGLAVLAALPEFI FYETED

: CCR3-TM-6-1: IFVIMAVFFI FWTPYNVAILLSSYQSDD

: CCR3-TM-7-1: DDLVMLVTEVIAYSHCCMNPVIYAFV (no un péptido de la invención)

Del GPCR CCKAR

: CCKAR-TM-1-6: DDEWQSALQILLYSIIFLLSVLGNTLVITV (no un péptido de la invención)

: CCKAR-TN-2-1: FLLSLAVSDLMLCLFCMPFNLP

: CCKAR-TM-2-2: FLLSLAVSDLMLCLFCM PFNLIDD

: CCKAR-TM-6-4: IVVLFFLCWMPIFSANAWRAYDTVDD

7. Realizaciones de tratamiento

Las composiciones que contienen los presentes péptidos de transmembrana GPCR, o un cóctel de los mismos (es decir, con otras moléculas, incluyendo otros péptidos de la invención), pueden ser administradas para tratamientos terapéuticos. Las moléculas de la presente invención son usadas para proteger a un paciente de patologías asociadas a GPCR, modulando las actividades biológicas asociadas al GPCR. "Protección" frente a la infección o la enfermedad, tal como se usa aquí, pretende abarcar "prevención" o "tratamiento." "Tratamiento" incluye la administración de la composición protectora a un paciente que exhibe síntomas de una patología asociada a GPCR (por ejemplo, infección por VIH-1), para reducir o suprimir los síntomas de la patología. Otros ejemplos de condiciones asociadas a GPCR que pueden ser tratadas con los péptidos de la invención incluyen:

-: cáncer. Por ejemplo, se sabe que el receptor del péptido intestinal vasoactivo (VIP) se sobreexpresa en el cáncer de mama y el cáncer de pulmón y se sabe que los antagonistas del VIP inhiben el crecimiento tumoral. Así, un péptido de la invención es probablemente efectivo en la inhibición de tales cánceres;

-: antagonistas de los receptores de quimiokinas como fármacos antiinflamatorios y antiasmáticos;

-: rechazo de tejidos;

-: antagonistas del receptor del neuropéptido Y como fármacos antiobesidad;

-: antagonistas del receptor de dopamina D4 como fármacos para el tratamiento de la depresión, del trastorno de hiperactividad con déficit de atención y de la esquizofrenia;

-: antagonistas del Receptor del Factor Liberador de Corticotropina para el tratamiento de trastornos relacionados con la depresión y la ansiedad;

-: antagonistas del receptor de angiotensina como medio de control de la presión sanguínea;

-: antagonistas del receptor del péptido liberador de gastrina y de los receptores de somatostatina y gastrina como agentes antineoplásicos que enlentecen el crecimiento de tumores endocrinos;

-: antagonistas de los receptores de opioides como aniquiladores del dolor.

a. Composiciones farmacéuticas

Las composiciones para administración pueden estar en forma de solución, suspensión, tabletas, píldoras, cápsulas, polvo, gel, crema, loción, ungüento, aerosol o similares. En una realización preferida, las composiciones para administración consisten en una solución de los péptidos de transmembrana GPCR disueltos en un soporte farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un soporte acuoso. Se puede usar una variedad de soportes acuosos, v.g., solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de materia indeseable. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. En algunas realizaciones, los péptidos de transmembrana GPCR son presentados en forma de polvo.

Se pueden combinar los péptidos de transmembrana GPCR y análogos con excipientes convencionales, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para el ajuste del pH y tamponantes, agentes para el ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración del GPCR en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará primariamente en base a los volúmenes de fluidos, a las viscosidades, al peso corporal y similares según el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente.

b. Administración y dosificación

Se administra la composición o el medio farmacéutico que contiene un péptido de transmembrana GPCR por vía oral, parenteral, enteral, gástrica, tópica, subcutánea, rectal, local o sistémica. Por ejemplo, los compuestos pueden ser inyectados en el torrente sanguíneo usando una cánula o un catéter; se selecciona la vena o arteria para maximizar la administración al/a los tejido(s) afectado(s). Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o aparentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980). Se reconoce que los péptidos y polipéptidos de transmembrana GPCR y compuestos relacionados antes descritos, cuando se administran oralmente, deben ser protegidos de la digestión. Se consigue esto típicamente acomplejando la proteína con una composición para hacerla resistente a la hidrólisis ácida y enzimática o empaquetando la proteína en un soporte apropiadamente resistente, tal como un liposoma. Se conocen bien la técnica medios de protección de proteínas frente a la digestión.

En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un paciente que sufre de una enfermedad o condición en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad o condiciones y sus complicaciones. Se define una cantidad adecuada para conseguirlo como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de las condiciones que se han de tratar y del estado general de salud del paciente.

En general, la dosificación que se ha de administrar es la cantidad necesaria para modular una actividad biológica GPCR. Se entiende que la dosificación de un polipéptido GPCR de la presente invención dependerá de la edad, del sexo, de la salud y del peso del receptor, del tipo de tratamiento concurrente, de haberlo, de la frecuencia de tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado. Los rangos de dosis efectivas aquí proporcionados no pretenden limitar a los inventores y representan rangos preferidos de dosis. La dosificación más preferida será adaptada al sujeto individual, como entiende y puede determinar un experto en la técnica, sin excesiva experimentación. Se contempla que los compuestos serán administrados bajo la guía de un médico, quien determinará las dosificaciones exactas, monitorizará el progreso del tratamiento y determinará si una administración dada es eficaz y suficiente, o si se necesitan posteriores administraciones.

La concentración de compuestos que se ha de administrar en un tiempo dado y a un paciente dado variarán de 0,1 \mug a 100 mg y preferiblemente de 0,1 a 10 mg al día por paciente. La dosificación y el modo de administración pueden ser seleccionados para conseguir y eventualmente mantener una concentración local en los fluidos que contactan con las células diana de aproximadamente 0,001-50 \mug/ml, preferiblemente de 0,1-10 \mug/ml. Se pueden usar dosificaciones de 0,1 a aproximadamente 100 mg por paciente al día, particularmente cuando se administra el fármaco a un sitio apartado y no al torrente sanguíneo, tal como a una cavidad corporal o un lumen de un órgano. Son posibles dosificaciones substancialmente mayores en administración tópica.

Pueden ser necesarias administraciones únicas o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosificación y de la frecuencia requeridas y toleradas por el paciente. En cualquier caso, la composición debe aportar una cantidad suficiente de los péptidos de esta invención para tratar con efectividad al paciente.

c. Terapia génica

La presente invención describe ácidos nucleicos codificantes de péptidos de transmembrana GPCR empaquetables para la transformación de células in vitro e in vivo. Estos ácidos nucleicos empaquetables pueden ser insertados en cualquiera de una serie de vectores bien conocidos para la transfección y transformación de células y organismos diana.

Los ácidos nucleicos son transfectados en células, ex vivo o in vivo, a través de la interacción del vector y de la célula diana. El ácido nucleico codificante del péptido de transmembrana GPCR, bajo el control de un promotor, expresa entonces el péptido de transmembrana GPCR, modulando así la actividad biológica de un GPCR diana.

Se han usado dichos procedimientos de terapia génica para corregir defectos genéticos adquiridos y heredados, el cáncer y la infección vírica en una serie de contextos. La capacidad para expresar genes artificiales en humanos facilita la prevención y/o la cura de muchas enfermedades humanas importantes, incluyendo muchas enfermedades que no pueden ser llevadas a tratamiento mediante otras terapias. Como ejemplo, la expresión in vivo de genes reguladores del colesterol, genes que bloquean selectivamente la replicación del VIH y genes supresores de tumores en pacientes humanos mejora dramáticamente el tratamiento de la enfermedad cardíaca, del SIDA y del cáncer, respectivamente. Para una revisión de procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science (1992) 256:808-813; Nabel y Felgner (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani y Caskey (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer y Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31-44; Haddada y col., (1995), en CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, Doerfler Böhm (eds.) Springer-Verlag, Heidelberg, Alemania; y Yu y col., GENE THERAPY (1994) 1:13-26.

La administración del gen o del material génico a la célula es la primera etapa crítica en el tratamiento con terapia génica de la enfermedad. Un gran número de métodos de administración son bien conocidos para los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, administración de genes basada en liposomas (Debs y Zhu (1993), WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988), BioTechniques 6(7): 682-691; Rose, Pat. EE.UU. Nº 5.279.833; Brigham (1991), WO 91/06309; y Felgner y col., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414) y vectores retrovíricos defectivos en cuanto a replicación que albergan una secuencia polinucleotídica terapéutica como parte del genoma retrovírico (véanse, v.g., Miller y col. (1990), Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992), J. NIH Res. 4:43, y Cornetta y col., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)). Como vectores retrovíricos ampliamente usados, se incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia de monos gibones (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones. Véanse, v.g., Buchscher y col., (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann y col. (1992) J. Virol. 66 (5):1635-1640 (1992); Sommerfelt y col., (1990) Virol. 176:58- 59; Wilson y col., (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller y col., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal y col., PCT/US94/05700, y Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental Immunology, Tercera Edición, Paul (ed.) Raven Press, Ltd., New York y las referencias allí citadas e Y. y col., GENE THERAPY (1994), antes citado).

También se usan vectores basados en AAV para transducir células con ácidos nucleicos diana, v.g., en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos y en procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo. Véanse West y col., (1987) Virology 160: 38- 47; Carter y col., (1989), Patente EE.UU. Nº 4.797.368; Carter y col., WO 93/24641 (1993); Kotin (1994), Human Gene Therapy 5:793- 801; Muzyczka (1994), J. Clin. Invest. 94:1351, y Samulski (antes citado) para una revisión de vectores AAV. Se describe la construcción de vectores AAV recombinantes en una serie de publicaciones, incluyendo Lebkowski, Pat. EE.UU. Nº 5.173.414; Tratschin y col., (1985), Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin y col., (1984), Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081; Hermonat y Muzyczka (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; McLaughlin y col., (1988), y Samulski y col. (1989), J. Virol., 63:03822-3828. Como líneas celulares que pueden ser transformadas por rAAV, se incluyen las descritas en Lebkowski y col. (1988), Mol. Cell. Biol., 8:3988-3996.

i. Transferencia génica in vitro

Se espera que los expertos en la técnica tengan conocimientos de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de ADN codificante de péptidos de transmembrana GPCR o de un fragmento peptídico de los mismos. No se hace aquí intento alguno de describir con detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariontes o eucariontes.

Existen varios métodos bien conocidos de introducción de ácidos nucleicos en células bacterianas y animales, cualquiera de los cuales puede ser usado en la presente invención. Estos incluyen: precipitación con fosfato de calcio, fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, tratamiento de las células receptoras con liposomas que contienen el ADN, DEAE-dextrano, endocitosis mediada por receptores, electroporación, microinyección del ADN directamente en las células, infección con vectores víricos, etc.

Para aplicaciones in vitro, se puede realizar la administración de ácidos nucleicos a cualquier célula crecida en cultivo, ya sea de origen bacteriano, vegetal o animal, de vertebrados o invertebrados, y de cualquier tejido o tipo. El contacto entre las células y las construcciones de ácidos nucleicos de ingeniería genética, cuando se realiza in vitro, tiene lugar en un medio biológicamente compatible. La concentración de ácido nucleico varía ampliamente dependiendo de la aplicación particular, pero es generalmente de entre aproximadamente 1 \mumol y aproximadamente 10 mmol. El tratamiento de las células con el ácido nucleico es generalmente llevado a cabo a temperaturas fisiológicas (aproximadamente 37ºC) durante períodos de tiempo de aproximadamente 1 a 48 horas, preferiblemente de aproximadamente 2 a 4 horas.

En un grupo de realizaciones, se añade un ácido nucleico a células plaqueadas con una confluencia de un 60-80% que tienen una densidad celular de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{5} células/mL, más preferiblemente de aproximadamente 2 x 10^{4} células/mL. La concentración de la suspensión añadida a las células es preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 0,2 \mug/mL, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mug/mL.

ii. Transferencia génica in vivo

Alternativamente, los ácidos nucleicos codificantes de los péptidos de transmembrana GPCR pueden ser también introducidos en células diana in vivo, usando métodos recombinantes bien conocidos para los expertos en la técnica. La inserción de genes en células con el fin de una terapia medicinal es un campo de rápido crecimiento en medicina que tiene un enorme potencial clínico. La investigación en terapia génica ha experimentado un avance durante varios años y ha entrado en pruebas clínicas en humanos. Zhu y col., Science, 261:209-211 (1993), aquí incorporada como referencia, describe la administración intravenosa del plásmido de expresión de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de citomegalovirus (CMV) usando complejos DOTMA-DOPE. Hyde y col., Nature, 362:250-256 (1993), aquí incorporada como referencia, describe la administración del gen regulador de la conductancia de transmembrana en la fibrosis quística (CFTR) a los epitelios de las vías aéreas y a los alvéolos del pulmón de ratones usando liposomas. Brigham y col., Am. J. Med. Sci., 298:278-281 (1989), aquí incorporada como referencia, describe la transfección in vivo de pulmones de ratones con un gen procariótico funcional codificante de la enzima intracelular cloranfenicol acetiltransferasa (CAT).

Como formulaciones adecuadas para administración, se incluyen soluciones para inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del pretendido receptor, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, que pueden incluir agentes suspensores, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. Las formulaciones de ácido nucleico empaquetado pueden ser presentadas en recipientes sellados de dosis unitaria o de dosis múltiple, tales como ampollas y viales. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección a partir de polvos, gránulos, y tabletas estériles del tipo antes descrito.

Para administración in vivo, se administran preferiblemente composiciones farmacéuticas que contienen ácidos nucleicos codificantes de péptidos de transmembrana GPCR por vía parenteral, es decir, intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscularmente. Más preferiblemente, las composiciones farmacéuticas son administradas intravenosa o intraperitonealmente mediante una inyección en bolo. Por ejemplo, véase Stadler y col., Patente EE.UU. Nº 5.286.634, aquí incorporada como referencia. También se ha discutido la administración intracelular de ácidos nucleicos en Straubringer y col., Methods in Enzymology, Academic Press, New York, 101:512-527 (1983); Mannino y col., Biotechniques, 6:682-690 (1988); Nicolau y col., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239-271 (1989), y Behr, Acc. Chem. Res., 26:274-278 (1993). Se describen aún otros métodos de administración de agentes terapéuticos en, por ejemplo, Rahman y col., Patente EE.UU. Nº 3.993.754; Sears, Patente EE.UU. Nº 4.145.410; Papahadjopoulos y col., Patente EE.UU. Nº 4.235.871; Schneider, Patente EE.UU. Nº 4.224.179; Lenk y col., Patente EE.UU. Nº 4.522.803; y Fountain y col., Patente EE.UU. Nº 4.588.578.

En realizaciones preferidas, las preparaciones farmacéuticas pueden ponerse en contacto con el tejido diana por aplicación directa de la preparación al tejido. Se puede hacer la aplicación por procedimientos tópicos "abiertos" o "cerrados". Por "tópico", se quiere decir la aplicación directa de la preparación farmacéutica a un tejido expuesto al ambiente, tal como la piel, la orofaringe, el canal auditivo externo y similares. Procedimientos "abiertos" son aquellos procedimientos que incluyen la incisión de la piel de un paciente y la visualización directa del tejido subyacente al que se aplican las preparaciones farmacéuticas. Se hace esto generalmente por un procedimiento quirúrgico, tal como una toracotomía para acceder a los pulmones, una laparotomía abdominal para acceder a las vísceras abdominales u otra aproximación quirúrgica directa al tejido diana. Los procedimientos "cerrados" son procedimientos invasivos en los que no se visualizan directamente los tejidos diana internos, sino que se accede a ellos insertando instrumentos a través de pequeñas heridas en la piel. Por ejemplo, se pueden administrar las preparaciones al peritoneo mediante lavado con aguja. De igual modo, se pueden administrar las preparaciones a través de dispositivos endoscópicos.

El ácido nucleico puede ser también administrado en un aerosol inhalado por los pulmones (véase Brigham y col., Am. J. Sci., 298(4):278-281 (1989)) o por inyección directa en el sitio de la enfermedad (Culver, Human Gene Therapy, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71 (1994)).

Las dosis efectivas de las composiciones variarán dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente y otras medicaciones administradas. Así, las dosificaciones de tratamiento necesitarán ser tituladas para optimizar la seguridad y la eficacia. Al determinar la cantidad efectiva del vector que se ha de administrar, el médico evalúa el ácido nucleico particular usado, el estado de la enfermedad diagnosticada, la edad, el peso y la condición del paciente, los niveles de plasma circulante, las toxicidades del vector, la progresión de la enfermedad y la producción de anticuerpos anti-vector. El tamaño de la dosis será también determinado por la existencia, la naturaleza y el alcance de los efectos colaterales que acompañan a la administración de un vector particular. Son típicas dosis de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 \mug a 10 mg o 30-300 \mug de ADN por paciente. Las dosis varían generalmente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10^{8}-10^{10} o 10^{12} partículas por inyección. En general el equivalente de dosis de un ácido nucleico desnudo de un vector es de aproximadamente 1 \mug a 100 \mug para un paciente típico de 70 kilogramos y las dosis de vectores que incluyen una partícula retrovírica son calculadas para obtener una cantidad equivalente de ácido nucleico inhibidor.

Antes de la infusión, se obtienen muestras de sangre y se guardan para su análisis. Se infunden entre 10^{8} y 1 X 10^{12} vectores intravenosamente a lo largo de 60-200 minutos. Se monitorizan estrechamente los signos vitales y la saturación de oxígeno por oximetría de pulso. Se obtienen muestras de sangre 5 minutos y 1 hora tras la infusión y se guardan para su posterior análisis. A discreción del médico, se repite la reinfusión cada 2 a 3 meses por un total de 4 a 6 tratamientos en un período de un año. Tras el primer tratamiento, se pueden realizar infusiones en régimen de pacientes externos a discreción del clínico. Si se da la reinfusión como paciente externo, se monitoriza al participante durante al menos 4, y preferiblemente 8, horas después de la terapia.

Si un/una paciente que experimenta infusión de un vector o célula transducida desarrolla fiebre, escalofríos o dolores musculares, éste/ésta recibe la dosis apropiada de aspirina, ibuprofeno o acetaminofeno. Los pacientes que experimentan reacciones a la infusión, tales como fiebre, dolores musculares y escalofríos son premedicados 30 minutos antes de las infusiones futuras con aspirina, acetaminofeno o difenhidramina. Se usa meperidina para los escalofríos y dolores musculares más graves que no responden rápidamente a antipiréticos y antihistamínicos. Se enlentece o interrumpe la infusión del vector dependiendo de la gravedad de la reacción.

Se puede practicar la transferencia génica in vivo en una variedad de hospedadores. Como hospedadores preferidos, se incluyen especies de mamíferos, tales como humanos, primates no humanos, perros, gatos, vacas, caballos, ovejas y similares.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son simplemente realizaciones de la invención y no pretenden limitar la invención. Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica puede modificar y/o adaptar la invención para diversas aplicaciones sin excesiva experimentación, sin desviarse del concepto genérico de la presente invención. Por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones quedan dentro del alcance y rango de la presente invención.

Ejemplo 1

El Ejemplo 1 ilustra que los péptidos derivados de regiones de transmembrana de CXCR4 inhiben los flujos de calcio mediados por CXCR4.

Se sintetizaron péptidos que tenían las secuencias seleccionadas por síntesis de péptidos en fase sólida de flujo a través en un Sintetizador de Péptidos 432A de Applied Biosystems utilizando derivados de aminoácidos Fmoc. Para resolver la agregación que con frecuencia se produce durante la síntesis de péptidos hidrofóbicos y da lugar al bloqueo de la cadena peptídica en crecimiento, se introdujeron derivados FmocHmb de Ala, Val y Leu en las secuencias difíciles. Se añadieron residuos cargados a los extremos de los péptidos para asegurar una orientación apropiada de los péptidos durante la penetración en la membrana celular y para mejorar la solubilidad de los péptidos altamente hidrofóbicos.

Se valoró la pureza de los péptidos por HPLC de fase invertida y se confirmaron las estructuras por espectrometría de masas de desorción de láser con tiempo de vuelo asistida por matriz (MALDI-TOF) (Tarasova y col., (1998), Ad. Exp. Med. Biol., Plenum Press, NY, pp. 201-206).

Los péptidos usados en este ejemplo están indicados en las Tablas 1, 2 y 3.

Se estudió el efecto de los péptidos sobre los flujos de calcio mediados por CXCR4 en células HeLa que expresan de forma natural el receptor CXCR4 y células U87 que expresan de forma estable el receptor CXCR4 como sigue. Se incubaron células cultivadas en portaobjetos con cámara de vidrio con cubierta Nunc con Fura-2/AM 1 micromolar durante 20 min. en una incubadora de CO_{2}, se lavaron con PBS y se montaron en la pletina de un microscopio invertido Zeiss Axiovert. Se realizaron las mediciones de la [Ca^{2+}]_{i} usando un sistema de imagen digital Attofluor (Atto Instruments, Rockville, MD). Se excitó la fluorescencia de Fura a una longitud de onda alternante de 340 y 380 nm. Se monitorizó la fluorescencia mediante una cámara CCD intensificada usando un filtro de corte 505. Se realizaron las calibraciones de la [Ca^{2+}]_{i} usando patrones de Ca^{2+} que contenían Fura 1 micromolar. Se estudiaron los antagonistas CXCR4 en células HeLa y células U87. Se usó factor-1\alpha derivado de estroma (SDF-1\alpha) como agonista CXCR4 específico.

Los antagonistas CCR5, que fueron usados en estudios de selectividad como se describe a continuación, fueron estudiados en células HEK (carcinoma renal humano) que expresaban de forma estable el receptor CCR5, y se usó RANTES como agonista. Se evaluó la actividad antagonista de los péptidos midiendo la inhibición de la liberación de Ca^{2+}i intracelular evocada por agonistas. Estas mediciones fueron llevadas a cabo en células tratadas con Fura-2/AM, utilizando un sistema de imagen digital Attofluor como se ha descrito antes. El agonista fue SDF-1\alpha.

En el cribado preliminar, se vio que los péptidos correspondientes al segundo y sexto dominios de transmembrana abolían la señalización inducida por SDF-1\alpha a través del receptor CXCR4 (Tabla 1). Otros estudios de optimización y de estructura-actividad permitieron obtener antagonistas derivados de todos menos del tercer y quinto dominios de transmembrana (Tabla 2).

TABLA 1 Actividad de péptidos sintéticos correspondientes a dominios de transmembrana predichos de CXCR4 en la inhibición de la liberación de calcio intracelular inducida por SDF-1\alpha

7

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TABLA 2 Actividad biológica de antagonistas CXCR4 derivados de diferentes dominios de transmembrana. Se determinó la actividad anti-señalización en la inhibición de la liberación del calcio intracelular inducido por SDF-1\alpha. Se valoró la actividad anti-VIH-1 en un ensayo de citoprotección utilizando células CEM-SS infectadas con VIH-1_{RF}

8

Para entender aún más los requerimientos estructurales para un antagonista eficaz, se realizaron estudios de estructura-actividad sobre los péptidos derivados del segundo dominio de transmembrana de CXCR4 (Tabla 3). El antagonista más potente, un péptido de 24 residuos de aminoácido F-2-2, bloqueó por completo la transducción de señal a 0,2 micromoles. La adición de residuos cargados negativamente a los extremos pareció ser importante para la actividad. La eliminación de las cargas negativas añadidas aportadas por dos residuos de Asp C-terminales (F-2-1) disminuyó la potencia antagonista más de diez veces. Consistentemente con estos hallazgos, La substitución de residuos de aspartato cargados negativamente con lisinas cargadas positivamente (F-2-3) dio lugar a una reducción de 100 veces en la actividad antagonista. La deleción de cinco residuos que preceden a los aspartatos C-terminales (F-2-4) redujo la potencia 20 veces. La truncación de la porción de transmembrana por tres residuos N-terminales Leu-Leu-Phe volvió al péptido inactivo.

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TABLA 3 Relaciones estructura-actividad en péptidos derivados del segundo dominio de transmembrana de CXCR4: ...HLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCK... (la porción predicha de intramembrana está subrayada)

9

Se observaron también resultados similares para péptidos derivados de regiones de transmembrana adicionales. Por ejemplo, en el caso de péptidos correspondientes al cuarto dominio de transmembrana, el posicionamiento del residuo cargado en el extremo intracelular del péptido (F-4-1, Tabla 1) en lugar del extremo extracelular (F-4-2, Tabla 2) abolió la actividad antagonista. Además, la substitución de aspartatos extracelulares con lisinas también abolió la actividad antagonista (datos no mostrados).

La especificidad de la interacción del dominio de transmembrana quedó demostrada por el hecho de que todos los péptidos derivados de CXCR4 mostraban selectividad por ese receptor y no tenían influencia sobre la señalización del otro receptor de quimiokina, CCR5. De forma similar, un péptido derivado del segundo dominio de transmembrana de CCR5, LFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGDD, abolía por completo la señalización inducida por agonistas del receptor en células U87 a concentraciones 500 nM, pero no tenía efecto sobre la señalización de CXCR4.

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Se observó además que una mezcla equimolar de dos péptidos, F-6-1 y F-7-3, era un orden de magnitud más potente que el más activo de los dos péptidos. Este efecto sinérgico producido por los derivados de la sexta y séptima regiones de transmembrana puede ser un fenómeno general. Así, parejas de análogos TM en combinaciones optimizadas pueden actuar como antagonistas muy potentes.

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Ejemplo 2

El Ejemplo 2 ilustra que péptidos sintéticos correspondientes a los dominios de transmembrana de CXCR4 inhiben la infección por VIH mediada por CXCR4.

Se cree que CCR5 y CXCR4 son los principales correceptores para la entrada en la célula de VIH-1 (Broder y col. (1997), J. Leukoc. Biol. 62:2029; Doranz y col. (1997), Immunol. Res. 16: 1528; Premack and Schall (1996), Nat. Med. 2:11741178), aunque otros receptores de quimiokinas parecen mediar en la infección también (Michael y col., (1997) Nat. Med. 3_(10):11602).

Se estudió la capacidad de péptidos derivados de CXCR4 sintéticos de la Tabla 1 para inhibir la infección por VIH-I de células CEM-SS usando una cepa LAV del virus que se sabe utiliza CXCR4 como correceptor. Anti-HIV-1 assay, Buckheit y col. (1993), Antiviral Research 21:247. Se mantuvieron las células CEM-SS en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero bovino fetal. Se pusieron las células en cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos hasta una densidad de 5 x 10^{3} células por pocillo. Se infectaron las células con virus VIH-1 a una multiplicidad de infección (MDI) previamente determinada para producir un nivel máximo de producción vírica a los 6 días de la infección (MDI de 0,01).

Se añadieron diluciones medio log seriadas de los compuestos de ensayo a los pocillos apropiados por triplicado para evaluar su capacidad para inhibir la infección por VIH-1. Se usó AZT paralelamente como control positivo. Después de 6 días de incubación a 37ºC, se determinó la presencia y la abundancia relativa de proteína p24 vírica por ELISA en sobrenadantes libres de células derivados de cada pocillo de la placa de microtitulación. Se compró el kit ELISA p24 al AIDS Vaccine Program, NCI, FCRDC (Frederick, MD) y se realizó el ensayo según las instrucciones del fabricante.

La mayoría de los péptidos de la Tabla 1 mostraron alguna actividad antivírica (datos no mostrados). Sin embargo, los péptidos correspondientes al segundo y sexto dominios de transmembrana eran los más potentes en la inhibición de la entrada del VIH. El compuesto F-2-2 inhibió por completo la infección a una concentración 5 micromolar (Fig. 1).

Se usaron los péptidos correspondientes a los dominios de transmembrana del receptor de tipo A de colecistokinina (CCKAR) como controles negativos y no afectaron a la función CXCR4, confirmando así la especificidad del efecto.

Los péptidos no mostraron toxicidad celular a concentraciones de hasta 100 micromolar (no se pudieron estudiar concentraciones mayores por problemas de solubilidad).

Se estudió adicionalmente la capacidad de los péptidos sintéticos para inhibir la infección por VIH-1 por un ensayo de citoprotección usando la cepa altamente citopática de VIH-1 RF (Rice y col. (1995), Adv. Pharmacol. 33:389) (Tabla 2). El péptido más potente, F-4-2, inhibía por completo la infección a una concentración 1 micromolar (Fig. 2). Los péptidos usados como controles negativos, que corresponden a los dominios de transmembrana del receptor de colecistokinina tipo A, no afectaron las funciones de los receptores de quimiokinas.

Los anteriores resultados demuestran, en general, la capacidad de moléculas externamente añadidas para competir por la interacción entre los dominios de transmembrana de los GPCR y así alterar la función de os receptores (Figura 3). Además, es importante observar que los péptidos de la invención inhiben la infección por VIH dirigiéndose a una molécula y una función celular más que a una molécula y una función vírica. Las proteínas víricas tienen una tasa de mutación relativamente alta, que con frecuencia permite a los virus hacerse resistentes a un tratamiento dado. Dado que las proteínas celulares mutan a un ritmo mucho más lento, la probabilidad de que un virus pueda desarrollar una resistencia está muy reducida.

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Ejemplo 3

El Ejemplo 3 muestra que los péptidos de la invención se reparten entre la membrana plasmática y otros compartimentos de membrana.

Se sintetizó un derivado fluorescente de CXCR4 TM2, rodamina-F-2, por síntesis en fase sólida en un Sintetizador de Péptidos 432A de Applied Biosystems utilizando derivados de aminoácidos Fmoc. Se cargó rodamina B (Fluka) en la columna de aminoácidos del instrumento. Se valoró la pureza del péptido por HPLC de fase invertida y se confirmaron las estructuras por espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz.

\newpage

Se usó una proteína quimérica consistente en el CXCR4 y la proteína fluorescente verde (GFP) para estudiar la localización, la internalización y el reciclado de receptores en células vivas en tiempo real. Se hizo esta construcción y se expresó de forma estable en células HeLa como se describe en Tarasova y col. (1997), J. Biol. Chem. 272:14817-14824. La fusión del extremo C del CXCR4 con el extremo N de la GFP no parecía alterar la afinidad de unión receptor-ligando, la transducción de señal o el patrón de expresión y distribución en superficie de los recepto-
res.

Se cultivaron células HeLa transfectadas que expresaban CXCR4-GFP en placas de fondo de vidrio con cubierta de 50 mm revestidas (MatTek, MA) en medio sin rojo fenol. Se expusieron entonces las células a péptido 1 micromolar en medio DMEM durante 30 min. en una incubadora de CO_{2}. Se determinó la distribución de marcaje fluorescente por microscopía de barrido láser confocal en un microscopio confocal de barrido láser LSM 410 invertido Zeiss. Se excitó la fluorescencia de la GFP usando un láser de argón/kriptón de 488 nm; se detectó la fluorescencia emitida con un filtro de 515-540 nm de pase de banda. Para el rojo de rodamina, se usó un láser de helio/neón de 568 nm para la excitación y se detectó la fluorescencia con un filtro de 590-640 nm de pase de banda.

Los resultados demostraron que el péptido rodaminado se colocalizaba con el CXCR4-GFP y estaba presente en la membrana celular en cuestión de minutos tras la aplicación y saturaba los endosomas y el retículo endoplásmico después de 15 minutos de incubación. Esto confirmaba la capacidad de los péptidos para concentrarse en las membranas celulares y sugería que los péptidos interaccionaban con las moléculas del receptor.

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Ejemplo 4

El Ejemplo 4 muestra que los péptidos correspondientes a dominios de transmembrana del receptor de colecistokinina de tipo A (CCKAR) inhiben la liberación de calcio intracelular evocada por agonistas con una potencia similar a los compuestos CXCR4.

Para mayor ilustración de la presente invención, hemos sintetizado péptidos derivados de los dominios de transmembrana del receptor de colecistokinina de tipo A (CCKAR) de la rata. Aunque CCKAR pertenece a la misma familia de rodopsinas de los GPCR que CSCR4, su secuencia es sólo idéntica en un 15% a la de CXCR4, cuando se alinean usando el programa Dialign 2 (Morgenstern y col. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12098) y el grado de identidad en las regiones de transmembrana es sólo del 27%.

La actividad de los péptidos del dominio de transmembrana CCKAR fue estudiada en células CHO transfectadas que expresan establemente CCKAR de rata (Tarasova y col. (1997), J. Biol. Chem. 272: 14817-14824). El agonista CCKAR era el octapéptido de colecistokinina sulfatado. Se realizó la determinación de la liberación de calcio intracelular como se ha descrito en el ejemplo 1 anterior. En la Tabla 4 se muestran los resultados.

Ninguno de los péptidos derivados de CCKAR sirvió como antagonista de los receptores de quimiokina y ninguno pudo inhibir la infección por VIH-1. La actividad de los antagonistas en la inhibición de la señalización a través del receptor fue comparada con la capacidad para prevenir la unión de agonistas (Tabla 4). Se valoró la inhibición de la señalización en la liberación de calcio intracelular evocada con CCK-8 en células CHO tratadas con FURA-2/AM transfectadas de forma estable con CCKAR de rata (Tarasova y col. (1997), J. Biol. Chem. 272:14817). Se midió la inhibición de la unión de ligandos usando un agonista fluorescente, el verde de rodamina CCK-8 (RG-CCK-8) y microscopía de barrido láser confocal cuantitativo (Tarasova y col. (1997), J. Biol. Chem. 272:14817). Los péptidos derivados del primer, segundo y sexto dominios de transmembrana inhibían la señalización inducida por CCK a través del receptor CCKAR. Los péptidos derivados del primer y segundo dominios de transmembrana, CCKAR-1-1 y CCKAR-2-1, tenían potencias comparables con respecto a la inhibición de la señalización y unión de ligandos. Un péptido derivado del sexto dominio de transmembrana, CCKAR-6-1, era activo en la inhibición de la señalización, pero tenía una muy baja actividad en la inhibición de la unión de RG-CCK-8.

TABLA 4 La actividad de péptidos TM derivados de CCKAR en la inhibición de la liberación de calcio intracelular inducida por CCK-8 y la unión de RG-CCK-8

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<110> Tarasova, Nadya I.

\hskip1.1cmMichejda, Christopher J.

\hskip1.1cmEl Gobierno de los Estados Unidos de América representado por el Secretario del Ministerio de Salud y Servicios Humanos

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<120> Antagonistas de receptores copulados a proteína G

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<130> 015280-337100PC

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<140> WO PCT/US99/04438

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<141> 26-02-1999

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EE.UU. 60/076.105

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 27-02-1998

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<160> 363

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> F-2-2 GPCR CXCR4

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<400> 1

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11

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<210> 2

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> F-2-5 GPCR CXCR4

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<400> 2

12

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<210> 3

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> F-4-2 GPCR CXCR4

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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13

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<210> 4

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> F-6-1 GPCR CXCR4

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

14

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<210> 5

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-7-3 GPCR CXCR4

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)...(20)

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<223> Xaa = leucinamida

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<400> 5

15

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<210> 6

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> F-7-4 GPCR CXCR4

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<221> MOD_RES

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<222> (23)...(23)

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<223> Xaa = leucinamida

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<400> 6

16

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<210> 7

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> CCR5-TM-2-2 GPCR CCR5

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR5-TM-4-1 GPCR CCR5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR5-TM-6-1 GPCR CCR5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR5-TM-7-1 GPCR CCR5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR2-TM-2-1 GPCR CCR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR2-TM-2-2 GPCR CCR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR2-TM-4-1 GPCR CCR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR2-TM-6-1 GPCR CCR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR2-TM-7-1 GPCR CCR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR3-TM-2-1 GPCR CCR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR3-TM-4-1 GPCR CCR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR3-TM-6-1 GPCR CCR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCR3-TM-7-1 GPCR CCR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCKAR-TM-1-6 GPCR CCKAR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCKAR-TM-2-1 GPCR CCKAR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCKAR-TM-2-2 GPCR CCKAR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCKAR-TM-6-4 GPCR CCKAR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GPCRAelegans GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GRH GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TRH GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FSHprec GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TSHprec GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LH_CGprec GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGE_EP1 GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGE_EP2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGE_EP3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGF GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGI GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TXA2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PAF GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M4 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M5 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> H1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> H2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1B GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1D GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1E GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1F GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT2A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT2B GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT2C GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT5A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT5Brat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT6rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT7 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha1A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha1B GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha1C GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha2A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha2B GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha2C1 y alpha2C2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

71

\hskip0.5cm710

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta4turkey GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D1A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D4 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D5 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A2a GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A2b GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OCdrome GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ACTH GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MSH GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MC3 GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MC4 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MC5 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> melatonina GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oxitocina GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> conopressinLs GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> V1A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> V1B GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> V2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCK_A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCK_B GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NPY1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NTR GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NK1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NK2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NK3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> blueops GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> greenops GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> redops GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rodopsina GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> violetopsGg GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> opsin_crab GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ET_Aprec GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ET_Bprec GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ET_Cfrog GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> galanina GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NMB GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GRP GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BRS3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> deltaOP GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> kappaOP GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> muOP GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OPRX GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CB1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CB2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR4 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR5 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IL8A GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IL8B GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AT1 Y AT1brat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AT2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

131

\hskip0.6cm132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BK1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

133

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BK2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

134

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y7 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

135

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y6 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y5 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

137

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y4 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y3chick GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

139

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

141

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> THRprec GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

142

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C5a GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

143

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GP01mouse GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

144

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> R334rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

145

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GP21mouse GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GCRCmouse GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

147

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TXKR GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

148

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> G10Drat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

149

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RDC1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

150

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BLR1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

151

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CL5 Y LCR1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

152

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> EBI1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

153

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RBS1rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

154

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> EBI2 GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

155

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GCRTchick GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

156

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> APJ GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

157

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RTArat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

158

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> UHRrat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FMRL1N GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FMRL2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fMLP GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF1catfish GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF3catfish GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF8catfish GPCR TM1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

165

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF32Acatfish GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

166

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF32Bcatfish, OLF32Ccatfish Y OLF32Dcatfish GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

167

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF47catfish GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

168

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF202catfish GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

169

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR1chicken GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

170

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR2chicken GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

171

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR3chicken Y OLFCOR4chicken GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

172

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR5chicken GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

173

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR6chicken GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

174

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFdog GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

175

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF07E GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

176

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF07I GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

177

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF07J GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

178

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFOR3mouse GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

179

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFrat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

180

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF3rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

181

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF5rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

182

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF6rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

183

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF12rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

184

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI3rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

185

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI7rat GPCR TM1

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = aminoácido desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

186

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI8rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

187

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI9rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

188

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI14rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

189

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI15rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

190

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFOR17_40 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

191

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GUST27rat GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

192

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RPE GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

193

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HHRF1 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

194

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HHRF2 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

195

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HHRF3 GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

196

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MCP-1A Y MCP-1B GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PPR1bovine GPCR TM1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GPCRAelegans GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

199

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GRH GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TRH GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FSHprec GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TSHprec GPCR TM2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

203

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LH_CGprec GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGE_EP1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

205

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGE_EP2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

206

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGE_EP3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

207

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGF GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

208

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PGI GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

209

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TXA2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

210

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PAF GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

211

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M4 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> M5 GPCR TM2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

216

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> H1 GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

217

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<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> H2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

218

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1A GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

219

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1B GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

220

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1D GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1E GPCR TM2

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<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT1F GPCR TM2

\newpage

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<400> 212

223

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<210> 213

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT2A GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

224

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

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<211> 44

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT2B GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

225

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT2C GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

226

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT5A GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

227

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT5Brat GPCR TM2

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<400> 217

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228

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<210> 218

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<211> 43

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT6rat GPCR TM2

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229

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<210> 219

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<211> 44

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5HT7 GPCR TM2

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<400> 219

230

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<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha1A GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

231

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha1B GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

232

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha1C GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

233

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha2A GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

234

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha2B GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> alpha2C1 Y alpha2C2 GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta1 GPCR TM2

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<400> 226

237

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<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

238

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 228

239

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta4turkey GPCR TM2

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<400> 229

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240

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<210> 230

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<211> 42

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D1A GPCR TM2

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<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

241

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<210> 231

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<211> 43

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D2 GPCR TM2

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<400> 231

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242

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<210> 232

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<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D3 GPCR TM2

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<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

243

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

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<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D4 GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\vskip1.000000\baselineskip

244

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D5 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\vskip1.000000\baselineskip

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A2a GPCR TM2

\newpage

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<400> 236

247

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A2b GPCR TM2

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<400> 237

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<210> 238

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A3 GPCR TM2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

249

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<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OCdrome GPCR TM2

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<400> 239

250

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<210> 240

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<211> 49

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ACTH GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 240

251

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

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<211> 49

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MSH GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

252

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MC3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

253

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MC4 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

254

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MC5 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

255

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> melatonina GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

256

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oxitocina GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

257

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> conopressinLs GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

258

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> V1A GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

259

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> V1B GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

260

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> V2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCK_A GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCK_B GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NPY1 GPCR TM2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

264

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NTR GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

265

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NK1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

266

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211>43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NK2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

267

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NK3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> blueops GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> greenops GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> redops GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

271

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rodopsina GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

272

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> violetopsGg GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

273

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> opsin_crab GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

274

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ET_Aprec GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

275

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ET_Bprec GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

276

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ET_Cfrog GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

277

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> galatina GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

278

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NMBGPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

279

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GRP GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\vskip1.000000\baselineskip

280

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BRS3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

281

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> deltaOP GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\vskip1.000000\baselineskip

282

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> kappaOP GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\vskip1.000000\baselineskip

283

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> muOP GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\vskip1.000000\baselineskip

284

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OPRX GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

285

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CB1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

286

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CB2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

287

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

288

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\vskip1.000000\baselineskip

289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\vskip1.000000\baselineskip

290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR4 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\vskip1.000000\baselineskip

291

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SSTR5 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\vskip1.000000\baselineskip

292

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IL8A e IL8B GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\vskip1.000000\baselineskip

293

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AT1a GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\vskip1.000000\baselineskip

294

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AT1brat GPCR TM2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

295

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AT2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

296

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BK1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

297

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BK2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

298

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y7 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\vskip1.000000\baselineskip

299

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y6 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\vskip1.000000\baselineskip

300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y5 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\vskip1.000000\baselineskip

301

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y4 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

302

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y3chick GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

303

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

304

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P2Y1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

305

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> THRprec GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 295

306

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C5a GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 296

307

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GP01mouse Y R334rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 297

308

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GP21mouse GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 298

309

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GCRCmouse GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 299

\vskip1.000000\baselineskip

310

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TXKR GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 300

\vskip1.000000\baselineskip

311

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> G10Drat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 301

312

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RDC1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 302

\vskip1.000000\baselineskip

313

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BLR1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 303

\vskip1.000000\baselineskip

314

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CL5 y LCR1GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 304

\vskip1.000000\baselineskip

315

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> EBI1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 305

316

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RBS1rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 306

317

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> EBI2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 307

318

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GCRTchick GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 308

319

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> APJ GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 309

\vskip1.000000\baselineskip

320

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RTArat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 310

\vskip1.000000\baselineskip

321

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> UHRrat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 311

322

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FMRL1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 312

\vskip1.000000\baselineskip

323

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FMRL2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 313

\vskip1.000000\baselineskip

324

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fMLP GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 314

\vskip1.000000\baselineskip

325

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF1catfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 315

326

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF3catfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 316

\vskip1.000000\baselineskip

327

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 317

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF8catfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 317

\vskip1.000000\baselineskip

328

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF32Acatfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 318

\vskip1.000000\baselineskip

329

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF32Bcatfish y OLF32Dcatfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 319

330

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF32Ccatfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 320

331

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF47catfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 321

332

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF202catfish GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 322

333

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR1chicken, OLFCOR3chicken Y OLFCOR4chicken GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 323

\vskip1.000000\baselineskip

334

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR2chicken y OLFCOR5chicken GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 324

\vskip1.000000\baselineskip

335

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFCOR6chicken GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 325

\vskip1.000000\baselineskip

336

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 326

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFdog GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 326

337

338

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF07E GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 327

339

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF07I GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 328

\vskip1.000000\baselineskip

340

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLF07J GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 329

\vskip1.000000\baselineskip

341

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFOR3mouse GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 330

\vskip1.000000\baselineskip

342

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFrat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 331

\vskip1.000000\baselineskip

343

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF3rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 332

\vskip1.000000\baselineskip

344

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF5rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 333

345

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF6rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 334

\vskip1.000000\baselineskip

346

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFF12rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 335

\vskip1.000000\baselineskip

347

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI3rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 336

348

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI7rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 337

\vskip1.000000\baselineskip

350

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI8rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 338

\vskip1.000000\baselineskip

351

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI9rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 339

\vskip1.000000\baselineskip

352

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI14rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 340

353

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFI15rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 341

354

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OLFOR17_40 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 342

355

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GUST27rat GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 343

356

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RPE GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 344

\vskip1.000000\baselineskip

357

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HHRF1 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 345

\vskip1.000000\baselineskip

358

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HHRF2 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 346

\vskip1.000000\baselineskip

359

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 347

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HHRF3 GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 347

360

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MCP-1A y MCP-1B GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 348

\vskip1.000000\baselineskip

361

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PPR1bovine GPCR TM2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 349

\vskip1.000000\baselineskip

362

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 350

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-1-5 GPCR CXCR4

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = valinamida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 350

363

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 351

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-2-1 GPCR CXCR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 351

\vskip1.000000\baselineskip

364

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-3-1 GPCR CXCR4

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (23)...(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = leucinamida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 352

\vskip1.000000\baselineskip

365

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-4-1 GPCR CXCR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 353

366

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-5-1 GPCR CXCR4

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = isoleucinamida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 354

367

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 355

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-7-1 GPCR CXCR4

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = lisinamida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 355

368

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segundo dominio de transmembrana de CXCR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 356

369

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-2-8 GPCR CXCR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 357

370

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-2-4 GPCR CXCR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 358

371

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> AcF-2-5 GPCR CXCR4

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1) ... (1)

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<223> Xaa = Leu acetilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 359

372

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> F-2-6 GPCR CXCR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 360

373

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 361

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Rhod-AcF-2-2 GPCR CXCR4

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu acetilada

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (26)...(26)

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<223> Xaa = rodamina unida a Lys

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 361

374

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CCKAR-TM-4-2 (#71) GPCR CCKAR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 362

375

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 363

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<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> CCKAR-TM-5-3 (#45) GPCR CCKAR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 363

376

Claims

1. Una molécula moduladora de los receptores copulados a proteína G (GPCR) aislada consistente en un péptido o peptidomimético de 5 a 50 aminoácidos que es un análogo estructural de un dominio de transmembrana de un GPCR, donde

dicha molécula tiene un extremo N y un extremo C y dicha molécula tiene un extremo extracelular que está negativamente cargado y un extremo intracelular que tiene carga neutra en condiciones fisiológicas, y donde

dicha molécula tiene un grupo carboxilo C-terminal amidado cuando dicho extremo C tiene carga neutra, y, cuando

dicho extremo intracelular es dicho extremo N, dicho péptido o peptidomimético incluye al menos cuatro de los cinco primeros aminoácidos N-terminales que tienen cadenas laterales de aminoácidos de carga neutra en condiciones fisiológicas;

dicha molécula se inserta espontáneamente en una membrana en la misma orientación que el dominio GPCR de transmembrana del que deriva; y

dicha molécula modula una propiedad o actividad biológica de dicho GPCR alterando la estructura o la organización de dicho GPCR.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Una molécula de la Reivindicación 1, donde la carga negativa del extremo extracelular de la molécula es aportada por de uno a tres residuos de ácido que son ácidos en condiciones fisiológicas.

3. Una molécula de la Reivindicación 1, donde la carga negativa del extremo extracelular de la molécula es aportada por un grupo carboxilo, fosfato, borato, sulfonato o sulfato.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Una molécula moduladora de los receptores copulados a proteína G (GPCR) aislada consistente en un péptido o peptidomimético que es un análogo estructural de una porción de un dominio de transmembrana de CXCR4,

donde dicha porción de dicho dominio de transmembrana tiene una secuencia seleccionada entre:

\vskip1.000000\baselineskip

LLFVITLPFWAVDAVANWYFGNDD,

LLFVITLPFWAVDAVANDD-OH,

VYVGVWIPALLLTEPDFEFANDD-OH,

VILILAFFACWLPYYIGISID-OH,

DDEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2},

y

DDSITEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2},

\vskip1.000000\baselineskip

y donde dicha molécula modula una actividad biológica de dicho CXCR4.

\vskip1.000000\baselineskip

5. Una molécula moduladora de los receptores copulados a proteína G (GPCR) de la Reivindicación 4, donde la actividad CXCR4 modulada por dicho péptido es la inhibición de la liberación de Ca^{2+} intracelular mediada por CXCR4 o la inhibición de la infección por VIH mediada por CXCR4.

6. Una molécula de la Reivindicación 1, 2 ó 3 para uso en un método terapéutico consistente en modular una actividad biológica de un GPCR diana por contacto de una célula que expresa dicho GPCR con dicha molécula.

7. Una molécula de la Reivindicación 6, donde la concentración de la molécula es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 micromolar.

8. Una molécula de la Reivindicación 1, 6 ó 7, donde la molécula inhibe una propiedad o actividad biológica del GPCR.

\newpage

9. Una molécula de la Reivindicación 8, que consiste en un péptido o peptidomimético que es un análogo estructural de una porción de un dominio de transmembrana de un GPCR, seleccionado entre:

del GPCR CXCR4:

: F-2-2: LLFVITLPFWAVDAVANWYFGNDD,

: F-2-5: LLFVITLPFWAVDAVANDD-OH,

: F-4-2: VYVGVWIPALLLTIPDFIFANDD-OH,

: F-6-1: VILILAFFACWLPYYIGISID-OH,

: F-7-3: DDEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2} y

: F-7-4: DDSITEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2};

del GPCR CCR5:

: CCR5-TM-2-2: LFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGDD,

: CCR5-TM-4-1: FGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTSSDD y

: CCR5-TM-6-1: LIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQED;

del GPCR CCR2:

: CCR2-TM-2-1: IYLLNLAISDLLFLITLPLWADD-OH,

: CCR2-TM-2-2: LLFLITLPLWAHSAANEWVFGNDD-OH,

: CCR2-TM-4-1: FGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTDD y

: CCR2-TM-6-1: VIFTI1VIIVYFLFWTPYNIVILLNTFQED;

del GPCR CCR3:

: CCR3-TM-2-1: LLFLVTLPFWIHYVRGHNWVFGDDD,

: CCR3-TM-4-1: FGVITSNTWGLAVLAALPEFIFYETED y

: CCR3-TM-6-1: IFVIMAVFFIFWTPYNVAILLSSYQSDD;

del GPCR CCKAR:

: CCKAR-TM-2-2: FLLSLAVSDLMLCLFCMPFNLIDD y

: CCKAR-TM-6-4: IVVLFFLCWMPIFSANAWRAYDTVDD.

10. Una molécula de la Reivindicación 8 ó 9, donde la actividad biológica inhibida es el flujo de iones o la translocación, la fosforilación, la síntesis o degradación de proteínas, la morfología celular, la secreción, la producción de componentes particulares tales como fosfatos solubles de inositol, la unión de un virus y posterior infección, el crecimiento tumoral, la quimiotaxis, la respuesta mitogénica, la activación del crecimiento celular, la contracción muscular, la actividad vasopresora y vasodepresora, la transmisión sináptica o la liberación de calcio intracelular.

11. Una molécula de la Reivindicación 4 para uso en una terapia consistente en modular la actividad biológica de un GPCR por contacto de una célula que expresa dicho GPCR con dicha molécula.

12. Una molécula de la Reivindicación 11, donde la concentración de la molécula es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 10 micromolar.

13. Una molécula de la Reivindicación 11, donde el GPCR diana es CXCR4 y la actividad biológica modulada es la inhibición de la infección por VIH mediada por CXCR4 o la inhibición de la liberación de Ca^{2+} intracelular mediada por CXCR4.

14. Una molécula de la Reivindicación 6, donde el GPCR es CCR5 y la actividad biológica modulada es la inhibición de la infección por VIH mediada por CCR5 o la inhibición de liberación de Ca^{2+} intracelular mediada por CCR5.

15. Una molécula de la Reivindicación 6, donde el GPCR diana es CCKAR y la actividad biológica modulada es la inhibición de la liberación de Ca^{2+} intracelular mediada por CCKAR o la inhibición del crecimiento o progresión tumoral.

16. Uso de una molécula moduladora de GPCR de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inhibir la infección por VIH-1, donde el contacto de una célula que expresa el GPCR con dicha molécula inhibe la infección por VIH-1.

17. Un uso de la Reivindicación 16, donde el péptido o peptidomimético es un análogo estructural de una porción de un dominio de transmembrana de CXCR4, CCR2, CCR3 o CCR5.

18. Un uso de la Reivindicación 17, donde se pone en contacto una célula que expresa CXCR4 con una molécula que contiene un péptido de transmembrana CXCR4 que tiene una secuencia seleccionada entre:

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LLFVITLPFWAVDAVANWYFGNDD,

LLFVITLPFWAVDAVANDD-OH,

VYVGVWIPALLLTIPDFIFANDD-OH,

VILILAFFACWLPYYIGISID-OH,

DDEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2},

y

DDSITEALAFFHCCLNPILYAFL-NH_{2},

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y donde dicha molécula es efectiva en la inhibición de la infección mediada por CXCR4 de células que expresan CXCR4 con dicha infección por VIH.

19. Uso de una molécula según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para un tratamiento terapéutico que consiste en modular un GPCR.