ES2299276T3 - Polipeptidos env del vih modificados. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido codificante de un polipéptido Env del VIH modificado en el que el polipéptido tiene al menos un aminoácido eliminado o reemplazado en comparación con el tipo salvaje de la región correspondiente a los residuos 420 a 436 numerados en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

Description

Polipéptidos Env del VIH modificados.

Campo técnico

La invención se refiere en general a polipéptidos de la envoltura (Env) del VIH modificados que son útiles como agentes inmunizantes o para generar una respuesta inmune en un sujeto, por ejemplo, una respuesta inmune celular o una respuesta inmune protectora. Más concretamente, la invención se refiere a polipéptidos Env tales como gp120, gp140 o gp160, en los que se ha modificado al menos una de las configuraciones nativas de la lámina \beta. La invención también se refiere a procedimientos de uso de estos polipéptidos para provocar una respuesta inmune contra una amplia variedad de subtipos del VIH.

Antecedentes de la invención

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1, también denominado HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV) es el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y los trastornos relacionados (véase, p. ej., Barre-Sinoussi, et al., (1983) Science 220: 868-871; Gallo et al. (1984) Science 224: 500-503; Levy et al., (1984) Science 225: 840-842; Siegal et al., (1981) N. Engl. J. Med. 305: 1439-1444). Los pacientes de SIDA, habitualmente, tienen un prolongado período asintomático seguido por la degeneración progresiva del sistema inmunológico y del sistema nervioso central. La replicación del virus está altamente regulada, y tanto la infección latente como la lítica del subconjunto auxiliar positivo CD4 de los linfocitos T tienen lugar en cultivo tisular (Zagury et al., (1986) Science 231: 850-853). Los estudios moleculares del VIH-1 muestran que codifica un número de genes (Ratner et al., (1985) Nature 313: 277-284; Sanchez-Pescador et al., (1985) Science 227: 484- 492), que incluye tres genes estructurales (gag, pol y env) que son comunes en todos los retrovirus. Las secuencias de nucleótidos de los genomas víricos de otros retrovirus, particularmente del VIH-2 y el virus de la inmunodeficiencia del simio, VIS (anteriormente denominado STLV-III), también contienen estos genes estructurales. (Guyader et al., (1987) Nature 326: 662-669; Chakrabarti et al., (1987) Nature).

La proteína de la envoltura del VIH-1, VIH-2 y VIS es una glicoproteína de aproximadamente 160 kD (gp160). Durante la infección vírica de la célula huésped, la gp160 es escindida por las proteasas de la célula huésped para formar la gp120 y la proteína de la membrana integral, la gp41. La parte de la gp41 es anclada a la bicapa membranosa del virión, mientras que el segmento de la gp120 sobresale hacia el medio de alrededor. La gp120 y la gp41 están asociadas más covalentemente, pudiéndose liberar gp120 de la superficie de los viriones y las células infectadas.

Según lo representado en la figura 1, estudios cristalográficos del polipéptido del núcleo gp120 indican que este polipéptido está plegado en dos dominios principales que tienen ciertas estructuras emanantes. El dominio interior (interior con respecto a los terminales N y C) presenta un paquete bicatenario de dos hélices con un pequeño sándwich \beta de cinco cadenas en su extremo terminal-proximal y una proyección en el extremo distal desde el que emana el tallo V1/V2. El dominio exterior es un cilindro doble atado tendido al lado del dominio interno de manera que los ejes del cilindro exterior y del paquete interior son aproximadamente paralelos. Entre el dominio interior distal y el dominio exterior distal hay una lámina de unión de cuatro cadenas que sujeta un peculiar minidominio en contacto con el, pero distinto del, dominio interior, del dominio exterior y del dominio V1/V2. La lámina de unión está compuesta de cuatro estructuras de cadena \beta (\beta-3, \beta-2, \beta-21, \beta-20 mostradas en la figura 1). La región de unión se puede observar en la figura 1, empaquetándose fundamentalmente sobre el dominio interior, aunque hay algunos residuos superficiales del dominio exterior, tales como Phe 382, que alcanzan la lámina de unión para formar parte de su núcleo hidrófobo.

La unidad básica de la configuración de lámina \beta de la región de la lámina de unión es la cadena \beta, que existe como una hélice menos enrollada con 2,0 residuos por vuelta. La configuración de la cadena \beta sólo es estable cuando está incorporada en una lámina \beta en la que se forman enlaces de hidrógeno con una geometría casi óptima entre los grupos peptídicos de las cadenas \beta adyacentes; los momentos dipolares de las cadenas también están alineados favorablemente. Las cadenas laterales de los residuos adyacentes de la misma cadena sobresalen por los lados opuestos de la lámina y no interactúan entre sí, pero tienen significativas interacciones con el eje central y con las cadenas laterales de las cadenas vecinas. Para una descripción general de las láminas \beta, véase, p. ej., T. E. Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Properties" (W. H. Freeman and Company, 1993); y A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975).

El polipéptido gp120 juega un papel decisivo en la mediación de la entrada a la célula huésped. Estudios recientes han indicado que la unión de CD4 a gp120 induce a un cambio en la configuración de Env que permite la unión a un co-receptor (p. ej., un receptor de la quimioquina) y a la entrada posterior del virus en la célula. (Wyatt, R., et al., (1998) Nature 393: 705-711; Kwong, P., et al., (1998) Nature 393: 648-659). Haciendo referencia de nuevo a la figura 1, CD4 está unido en una depresión formada en el punto de contacto del dominio exterior, el dominio interior y la lámina de unión de la gp120.

También se ha estudiado la inmunogenicidad del polipéptido gp120. Por ejemplo, los individuos infectados por el VIH-1 suelen desarrollar anticuerpos que pueden neutralizar el virus en análisis in vitro, y esta respuesta está fundamentalmente dirigida contra determinantes neutralizantes lineales del tercer bucle variable de la glicoproteína gp120 (Javaherian, K., et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6786-6772; Matsushita, M., et al. (1988) J. Virol. 62: 2107-2144; Putney, S., et al., (1986) Science 234: 1392-1395; Rushe, J. R., et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 3198-3202). Sin embargo, estos anticuerpos generalmente presentan la capacidad de neutralizar únicamente un número limitado de cadenas de VIH-1 (Matthews, T. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83: 9709- 9713; Nara, P. L., et al., (1988) J. Virol., 62: 2622-2628; Palker, T. J., et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 1932-1936). Más tarde durante la infección por VIH en seres humanos, aparecen los anticuerpos capaces de neutralizar una mayor variedad de aislados del VIH-1 (Barre-Sinoussi, F., et al., (1983) Science 220: 868-871; Robert-Guroff, M., et al., (1985) Nature (Londres) 316: 72-74; Weis, R., et al., (1985) Nature (Londres) 316: 69-72; Weis, R., et al., (1986) Nature (Londres) 324: 572-575).

Un trabajo reciente realizado por Stamatatos et al, (1998) "AIDS Res Hum Retroviruses" 14 (13): 1129-39, muestra que una eliminación de la región variable 2 de un virus VIH-1_{SF162}, que utiliza el co-receptor CCR-5 para la entrada vírica, vuelve al virus altamente susceptible a la neutralización mediada por el suero. Este virus con la V2 eliminada también fue neutralizado por el suero obtenido en pacientes infectados no sólo por aislados del subtipo B del VIH-1, sino también por aislados de los subtipos A, C, D y F del VIH-1. Sin embargo, la eliminación de la región variable 1 no tiene ningún efecto. La eliminación de las regiones variables 1 y 2 de un aislado de LAI VIH-1_{IIIB} también aumentó la susceptibilidad a la neutralización por anticuerpos monoclonales cuyos epitopes se localizan en el bucle V3, el sitio de unión a CD4 y las regiones de gp120 conservadas (Wyatt, R., et al. (1995) J Virol., 69: 5723-5733). Estudios de inmunogenicidad en conejos realizados con virus del VIH-1 con eliminaciones en las regiones V1/V2 y V3 de la cepa LAI, que usa el co-receptor CXCR4 para la entrada vírica, no muestran ninguna mejoría en la capacidad de Env para aumentar los anticuerpos neutralizantes (Leu et al. (1998) "AIDS Res. and Human Retroviruses". 14: 151-155).

Además, un subconjunto de los anticuerpos ampliamente reactivos encontrado en la mayoría de los individuos infectados interfiere en la unión de gp120 y CD4 (Kang, C.-Y., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 6171-6175; McDougal, J. S., et al., (1986) J. Immunol. 137: 2937- 2944). Se cree que otros anticuerpos se unen a la región de unión a los receptores de quimioquinas una vez que CD4 se ha unido a Env (Thali et al., (1993) J. Virol. 67: 3978-3988). El hecho de que los anticuerpos neutralizantes generados durante la infección por VIH no proporcionen un efecto antivírico permanente puede deberse en parte a la generación de mutantes del virus que "se escapan de la neutralización" y al descenso general del sistema inmunológico del huésped asociado con la patogénesis. Por el contrario, la presencia de anticuerpos neutralizantes ya existentes tras la exposición inicial al VIH-1 tendrá probablemente un efecto protector.

Comúnmente, se cree que una vacuna satisfactoria debería ser capaz de provocar una potente respuesta de anticuerpos ampliamente neutralizantes contra las diversas cepas del VIH-1 (Montefiori y Evans (1999) AIDS Res. Hum. Ret. 15 (8): 689-698; Bolognesi, D., P., et al. (1994) Ann. Int. Med., 8: 603-611; Haynes, B., F., et al., (1996) Science; 271: 324-328). Los anticuerpos neutralizantes, mediante su unión a los viriones entrantes, pueden reducir o incluso prevenir su infectividad hacia las células diana y prevenir la propagación entre las células del virus en cultivo tisular (Hu et al., (1992) Science 255: 456- 459; Burton, D., R. y Montefiori, D. (1997) AIDS 11 (supl. A): 587-598). Sin embargo, según lo descrito anteriormente, los anticuerpos dirigidos contra gp120 generalmente no muestran respuestas amplias de los anticuerpos contra las diferentes cepas del VIH.

Actualmente, el foco del desarrollo de la vacuna, desde la perspectiva de la inmunidad humoral, está en la neutralización de los aislados primarios que utilizan el co-receptor de quimioquinas CCR5 de quien se cree que tiene importancia en la entrada vírica (Zhu, T., et al., (1993) Science 261: 1179- 1181; Fiore, J., et al., (1994) Virology; 204: 297-303). Estos virus son generalmente mucho más resistentes a la neutralización de los anticuerpos que las cepas adaptadas a la línea de células T que usan el co-receptor CXCR4, aunque ambos pueden ser neutralizados in vitro por ciertos anticuerpos monoclonales de actuación amplia y potente, tales como IgG1b12, 2G12 and 2F5 (Trkola, A., et al. (1995) J. Virol. 69: 6609-6617; D'Sousa PM., et al (1997) J Infect. Dis. 175: 1062-1075). Estos anticuerpos monoclonales se dirigen al sitio de unión a CD4, un sitio de glicosilación y al dominio de fusión a gp41, respectivamente. Sin embargo, queda el problema de que no se sabe cómo producir los anticuerpos de la especificidad apropiada mediante la vacuna. Los anticuerpos generados por la glicoproteína gp120 desde un aislado dado, habitualmente, sólo son capaces de neutralizar virus cercanos, generalmente, de un subtipo del VIH-1 similar, y habitualmente, del mismo subtipo.

A pesar de los enfoques anteriores, sigue existiendo la necesidad de antígenos de Env que puedan provocar una respuesta inmune (p. ej., anticuerpos neutralizantes y/o protectores) en un sujeto contra las múltiples cepas y subtipos del VIH, por ejemplo, cuando se administran como vacuna. La presente invención resuelve éstos y otros problemas proporcionando polipéptidos Env modificados (p. ej., gp120) para dejar al descubierto los epitopes en o cerca del sitio de unión a CD4.

\vskip1.000000\baselineskip

Resumen de la invención

Según la presente invención, se proporcionan polipéptidos Env del VIH modificados. En concreto, se hacen eliminaciones y/o mutaciones en una o más de las 4 láminas de unión antiparalelas \beta del polipéptido Env del VIH. De este modo, se deja suficiente estructura como para permitir el pliegue correcto del polipéptido, por ejemplo, de gp120, aunque se elimina suficiente lámina de unión como para poner al descubierto el surco de CD4, permitiendo la generación de una respuesta inmune contra los epitopes en o cerca del sitio de unión a CD4 del polipéptido Env (p. ej., gp120).

En un aspecto, la invención incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido Env del VIH modificado, teniendo el polipéptido al menos un residuo de aminoácido modificado (p. ej., borrado o reemplazado) borrado en la región correspondiente a los residuos 421 a 436 en relación con HXB-2, por ejemplo, los constructos representados en las figuras 6-29 (SEQ ID NO: 3 a 26). En ciertas realizaciones, el polinucleótido también tiene la región correspondiente a los residuos 124-198 del polipéptido HXB-2 (p. ej., V1/V2) borrada y al menos un aminoácido borrado o reemplazado en las regiones correspondientes a los residuos 119 a 123 y 199 a 210 en relación con el HXB-2. En otras realizaciones, estos polinucleótidos codifican polipéptidos Env que tienen al menos un aminoácido del bucle pequeño de la lámina de unión (p. ej., los residuos de aminoácido 427 a 429 en relación con HXB-2) borrado o reemplazado. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos modificados codificados por los polinucleótidos de la presente invención pueden estar basadas en cualquier variante del VIH, por ejemplo, en SF162.

En otro aspecto, la invención incluye polipéptidos Env del VIH modificados inmunogénicos que tienen al menos un residuo de aminoácido modificado (p. ej., borrado o reemplazado) borrado en la región correspondiente a los residuos 421 a 436 en relación con HXB-2, por ejemplo, una eliminación o un reemplazo de los aminoácidos de la región del bucle pequeño (p. ej., los residuos de aminoácido 427 a 429 en relación con HXB-2). Estos polipéptidos pueden tener modificaciones (p. ej., una eliminación o un reemplazo) de al menos un aminoácido entre aproximadamente el residuo de aminoácido 420 y el residuo de aminoácido 436 en relación con HXB-2, y, opcionalmente, pueden tener eliminaciones o truncamientos de las regiones V1 y/o V2. Los polipéptidos modificados inmunogénicos de la presente invención pueden estar basados en cualquier variante del VIH, por ejemplo, en SF162.

En otro aspecto, la invención incluye una composición vacunal que comprende cualquiera de los polinucleótidos codificantes de los polipéptidos Env modificados descritos anteriormente. Las composiciones vacunales que comprenden los polipéptidos Env modificados y, opcionalmente, un adyuvante también se incluyen en la invención.

En otro aspecto más, la invención incluye un procedimiento para provocar una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar uno o más de los polinucleótidos o los constructos descritos anteriormente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune en el sujeto. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además administrar un adyuvante al sujeto.

En otro aspecto, la invención incluye un procedimiento para provocar una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos Env modificados descritos anteriormente y un adyuvante. La composición se administra en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune en el sujeto.

En otro aspecto, la invención incluye un procedimiento para provocar una respuesta inmune en un sujeto que comprende:

(a)

administrar una primera composición que comprende cualquiera de los polinucleótidos anteriormente descritos en una etapa de cebado y

(b)

administrar una segunda composición que comprende cualquiera de los polipéptidos Env modificados descritos anteriormente, como un refuerzo, en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune en el sujeto. En ciertas realizaciones, la primera composición, la segunda composición o ambas, la primera y la segunda composición, comprenden además un adyuvante.

Estas y otras realizaciones de la presente invención tendrán lugar fácilmente para los expertos en la técnica a la luz de la revelación de la presente memoria.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación esquemática de la estructura terciaria del polipéptido gp120 Env del VIH-1_{HXB-2}, según lo determinado por estudios cristalográficos.

Las figuras 2A-C representan el alineamiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido gp160 Env del VIH-1_{HXB-2} de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) con la secuencia de aminoácidos de las variantes del VIH SF162 (mostradas como "162" (SEQ ID NO: 2), SF2, CM236 y US4. Las flechas indican las regiones que están eliminadas o reemplazadas de los polipéptidos modificados. Los puntos negros indican los residuos de cisteína conservados. El asterisco indica la posición del último aminoácido en gp120.

Las figuras 3A-J representan el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos Env modificados que tienen eliminaciones de V1/V2. Los residuos de aminoácido sin modificar codificados por estas secuencias corresponden a los residuos de SF162 de tipo salvaje, pero están numerados en relación con HXB-2.

Las figuras 4A-M representan el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos Env modificados que tienen eliminaciones o reemplazos en el bucle pequeño. Los residuos de aminoácido sin modificar codificados por estas secuencias corresponden a los residuos de SF162 de tipo salvaje, pero están numerados en relación con HXB-2.

Las figuras 5A-N representan el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos Env modificados que tienen eliminaciones de ambas V1/V2 y, además, eliminaciones o reemplazos en el bucle pequeño. Los residuos de aminoácido sin modificar codificados por estas secuencias corresponden a los residuos de SF162 de tipo salvaje, pero están numerados en relación con HXB-2.

La figura 6 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val120-Ala204 (SEQ ID NO: 3).

La figura 7 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por VaI120-Ile201 (SEQ ID NO: 4).

La figura 8 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val120-Ile201B (SEQ ID NO: 5).

La figura 9 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Lys121-Val200 (SEQ ID NO: 6).

La figura 10 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Leu122-Ser199 (SEQ ID NO: 7).

La figura 11 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val120-Thr202 (SEQ ID NO: 8).

La figura 12 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Trp427-Gly431 (SEQ ID NO: 9).

La figura 13 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Arg426-Gly431 (SEQ ID NO: 10).

La figura 14 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Arg426- Gly431B (SEQ ID NO: 11).

La figura 15 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Arg426-Lys432 (SEQ ID NO: 12).

La figura 16 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Asn425-Lys432 (SEQ ID NO: 13).

La figura 17 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Ile424-Ala433 (SEQ ID NO: 14).

La figura 18 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Ile423-Met434 (SEQ ID NO: 15).

La figura 19 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Gin422-Tyr435 (SEQ ID NO: 16).

La figura 20 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Gin422-Tyr435B (SEQ ID NO: 17).

La figura 21 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Leu122- Ser199; Arg426-Gly431 (SEQ ID NO: 18).

La figura 22 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Leu122- Ser199; Arg426-Lys432 (SEQ ID NO: 19).

La figura 23 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Leu122-Ser199; Trp427-Gly431 (SEQ ID NO: 20).

La figura 24 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Lys121-Val200; Asn425-Lys432 (SEQ ID NO: 21).

La figura 25 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val120-Ile201; Ile424-Ala433 (SEQ ID NO: 22).

La figura 26 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val120- Ile201B; Ile424-Ala433 (SEQ ID NO: 23).

La figura 27 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val120-Thr202; Ile424-Ala433 (SEQ ID NO: 24).

La figura 28 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val127-Asn195 (SEQ ID NO: 25).

La figura 29 representa la secuencia de nucleótidos del constructo designado por Val127- Asn195; Arg426-Gly431 (SEQ ID NO: 26).

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química de proteínas, inmunología vírica, biología molecular y técnicas de ADN recombinante pertenecientes al alcance de la técnica. Tales técnicas están completamente explicadas en la bibliografía. Véase, p. ej., T. E. Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Properties" (W. H. Freeman and Company, 1993); Nelson L. M. y Jerome H. K. "HIV Protocols in Methods in Molecular Medicine", vol. 17, 1999; Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); F. M. Ausubel et al. "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates & Wiley Interscience New York; y Lipkowitz y Boyd, "Reviews in Computational Chemistry", volúmenes 1-presente (Wiley-VCH, Nueva York, Nueva York, 1999).

Debe indicarse que, como se usan en esta memoria y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de los artículos definidos e indefinidos incluyen los referentes en plural, a no ser que el contenido indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una mezcla de dos o más polipéptidos, y similares.

\vskip1.000000\baselineskip

Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, estando destinados a ser definidos según lo indicado a continuación.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria para denotar cualquier polímero de residuos de aminoácido. Los términos engloban péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares. Tales polipéptidos pueden tener un origen natural, o pueden estar sintetizados o producidos recombinantemente. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, etc.

Un polipéptido según lo definido en la presente memoria está generalmente formado por los 20 aminoácidos naturales Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) y Val (V), y también puede incluir cualquiera de los diversos análogos de aminoácido conocidos, análogos tanto naturales como sintetizados, tales como, pero sin limitarse a, homoisoleucina, asaleucina, 2-(metilenciclopropil)glicina, S-metilcisteína, S-(prop-1-enil)cisteína, homoserina, ornitina, norleucina, norvalina, homoarginina, 3-(3-carboxifenil)alanina, ciclohexilalanina, mimosina, ácido pipecólico, ácido 4-metilglutámico, canavanina, ácido 2,3-diaminopropiónico, y similares. Más adelante, se exponen otros ejemplos de agentes polipeptídicos que encontrarán un uso en la presente invención.

"Geometría" o "estructura terciaria" de un polipéptido o una proteína pretende significar la configuración tridimensional global de la proteína. Según lo descrito en la presente memoria, la geometría puede ser determinada, por ejemplo, mediante estudios cristalográficos o usando diversos programas o algoritmos que predigan la geometría en base a las interacciones entre los aminoácidos que constituyen las estructuras primaria y secundaria.

Polipéptido, agente polipeptídico o fármaco polipeptídico de "tipo salvaje" pretende significar una secuencia polipeptídica natural y su correspondiente estructura secundaria. Una proteína o un polipéptido "aislado" o "purificado" es una proteína que está separada y diferenciada de un organismo entero con el que la proteína está normalmente asociada en la naturaleza. Resulta evidente que el término denota proteínas de diversos niveles de pureza. Comúnmente, una composición que contenga una proteína purificada será una en la que al menos aproximadamente el 35%, preferiblemente, al menos aproximadamente el 40-50%, más preferiblemente, al menos aproximadamente el 75-85%, y lo más preferible, al menos aproximadamente el 90% o más, de la proteína total de la composición sea la proteína en cuestión.

"Polipéptido Env" pretende significar una molécula derivada de una proteína de la envoltura, preferiblemente, de la envoltura del VIH. La proteína de la envoltura del VIH-1 es una glicoproteína de aproximadamente 160 kD (gp160). Durante la infección vírica de la célula huésped, la gp160 es escindida por las proteasas de la célula huésped para formar la gp120 y la proteína de la membrana integral, la gp41. La parte de la gp41 está anclada a (y se extiende sobre) la bicapa membranosa del virión, mientras que el segmento de la gp120 sobresale hacia el medio de alrededor. Como no existe un enlace covalente entre la gp120 y la gp41, se libera gp120 de la superficie de los viriones y las células infectadas. Los polipéptidos Env también pueden incluir polipéptidos gp140. Los polipéptidos Env pueden existir como monómeros, dímeros y multímeros.

"Polipéptido gp120" pretende significar una molécula derivada de una región gp120 del polipéptido Env. Preferiblemente, el polipéptido gp120 deriva de Env del VIH. La secuencia primaria de aminoácidos de gp120 es de aproximadamente 511 aminoácidos, con un núcleo polipeptídico de aproximadamente 60.000 daltons. El polipéptido es ampliamente modificado mediante glicosilación ligada a N para aumentar el peso molecular aparente de la molécula hasta 120.000 daltons. La secuencia de aminoácidos de gp120 contiene cinco dominios relativamente conservados intercalados con cinco dominios hipervariables. Las posiciones de los 18 residuos de cisteína de la secuencia primaria de gp120 de la cepa VIH-1_{HXB-2} (en lo sucesivo, "HXB-2") y las posiciones de 13 de los aproximadamente 24 sitios de glicosilación ligados a N de la secuencia de gp120 son comunes en la mayoría, si no en todas, las secuencias de gp120. Los dominios hipervariables contienen extensas sustituciones, inserciones y eliminaciones de aminoácidos. A pesar de esta variación, la mayoría, si no todas, las secuencias de gp120 conservan la capacidad del virus de unirse al receptor vírico CD4. Un "polipéptido gp120" incluye tanto subunidades simples como
multímeros.

Los polipéptidos Env (p. ej., gp120, gp140 y gp160) incluyen una "lámina de unión" comprendida por 4 cadenas anti-paralelas (\beta-2, \beta-3, \beta-20 y \beta-21) que forman una lámina \beta. Extrudiendo de un par de cadenas \beta (\beta-2 y \beta-3) hay dos bucles, V1 y V2. La lámina \beta-2 tiene lugar aproximadamente del residuo de aminoácido 119 (Cys) al residuo de aminoácido 123 (Thr), mientras que la \beta-3 tiene lugar aproximadamente del residuo de aminoácido 199 (Ser) al residuo de aminoácido 201 (IIe), en relación con HXB-2. La "región V1/V2" tiene lugar aproximadamente de las posiciones de aminoácido 126 (Cys) al residuo 196 (Cys), en relación con HXB-2). (Véase, p. ej., Wyatt et al., (1995) J. Virol. 69: 5723-5733; Stamatatos et al., (1998) J. Virol. 72: 7840-7845). Extrudiendo del segundo par de cadenas \beta (\beta-20 y \beta-21) hay una estructura de "pequeño bucle", también denominada en la presente memoria "bucle pequeño de la lámina de unión". En HXB-2, \beta-20 se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 422 (Gln) hasta el residuo de aminoácido 426 (Met), mientras que la \beta-21 se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 430 (Val) hasta el residuo de aminoácido 435 (Tyr). En la variante SF162, Met-426 es un residuo de Arg (R). El "bucle pequeño" se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 427 (Trp) hasta 429 (Lys) en relación con HXB-2. En la figura 1, se muestra un diagrama representativo de gp120 que muestra la lámina de unión, el bucle pequeño y V1/V2. Además, en las figuras 2A-C se muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos del polipéptido Env gp160 de las variantes seleccionadas, en relación con HXB-2.

Además, un "polipéptido Env" o un "polipéptido gp120", según lo definido en la presente memoria, no se limita a un polipéptido que tenga la secuencia exacta descrita en la presente memoria. De hecho, el genoma del VIH está en un estado de flujo constante y contiene varios dominios variables que presentan grados relativamente elevados de variabilidad entre los aislados. Resulta evidente que los términos engloban polipéptidos Env (p. ej., gp120) de cualquiera de los aislados del VIH identificados, así como de los aislados recién identificados y los subtipos de estos aislados. En la presente memoria, se ofrecen descripciones de las características estructurales con referencia a HXB-2. Cualquier experto habitual en la técnica, en vista de las enseñanzas de la presente revelación y de la técnica, puede determinar las regiones correspondientes de otras variantes del VIH (p. ej., aislados VIH_{IIIb}, VIH_{SF2}, VIH-1_{SF162}, VIH-1_{SF170}, VIH_{LAV}, VIH_{LA1}, VIH_{MN}, VIH-1_{CM235''}, VIH_{US4}, otras cepas de VIH-1 de los diversos subtipos (p. ej., los subtipos de A a G y O), cepas del VIH-2 y los diversos subtipos (p. ej., HN-2_{UC1} y VIH-2_{UC2}) y virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS). (Véase, p. ej., "Virology", 3ª Edición (W. K. Joklik ed. 1988); "Fundamental Virology", 2ª Edición (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds. 1991); "Virology", 3ª Edición (Fields, BN, DM Knipe, PM Howley, Editores, 1996, Lippincott-Raven, Filadelfia, PA) para una descripción de éstos y de otros virus relacionados), usando, por ejemplo, programas de comparación secuencial (p. ej., BLAST y otros descritos en la presente memoria) o la identificación y el alineamiento de características estructurales (p. ej., un programa tal como el programa "ALB" descrito en la presente memoria que puede identificar regiones de lámina \beta). Las secuencias de aminoácidos reales de los polipéptidos Env pueden estar basadas en cualquier variante del VIH.

Además, el término "polipéptido Env" (p. ej., "polipéptido gp120" engloba proteínas que incluyen otras modificaciones en la secuencia nativa, tales como otras eliminaciones, adiciones y sustituciones internas. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis de sitio dirigida, o pueden ser accidentales, tal como a través de hechos mutacionales naturales. De este modo, por ejemplo, si se va a usar el polipéptido Env en composiciones vacunales, las modificaciones deben ser tales que no se pierda la actividad inmunológica (i.e., la capacidad de provocar una respuesta de los anticuerpos hacia el polipéptido). De manera similar, si se van a usar los polipéptidos a efectos de diagnóstico, se debe conservar tal capacidad.

Por lo tanto, un "polipéptido Env modificado" es un polipéptido Env (p. ej., gp120 según lo definido anteriormente), que ha sido manipulado para eliminar o reemplazar toda o una parte de la porción de lámina de unión y, opcionalmente, las regiones variables V1 y V2. Generalmente, los polipéptidos Env modificados (p. ej., gp120) tienen suficiente lámina de unión eliminada como para dejar al descubierto el sitio de unión a CD4, pero dejar suficiente estructura como para permitir el correcto plegamiento (p. ej., la geometría correcta). De este modo, se prefieren las modificaciones de las regiones de \beta-20 y \beta-21 (entre aproximadamente los residuos de aminoácido 420 y 435 en relación con HXB-2). Además, también se pueden hacer modificaciones en las regiones de \beta-2 y \beta-3 (entre aproximadamente los residuos de aminoácido 119 (Cys) y 201 (IIe)) y modificaciones (p. ej., truncamientos) en las regiones del bucle V1 y V2. Aunque no se ejemplifican en la presente memoria todas las modificaciones posibles de la lámina \beta y V1-V2, se entenderá que también quedan englobadas por la presente invención otras modificaciones perturbadoras.

Normalmente, tal polipéptido modificado es capaz de secretarse en el medio de crecimiento en el que se cultive un organismo que exprese la proteína. Sin embargo, a efectos de la presente invención, también es posible recuperar tales polipéptidos intracelularmente. La secreción en medios de crecimiento se determina fácilmente usando un número de técnicas de detección, incluyendo, p. ej., la electroforesis sobre gel de poliacrilamida y similares, así como técnicas inmunológicas tales como la transferencia Western y los análisis de inmunoprecipitación según lo descrito en, p. ej., la publicación internacional n.º WO 96/04301, publicada el 15 de febrero de 1996.

Un gp120 u otro polipéptido Env se produce "intracelularmente" cuando se encuentra dentro de la célula, bien asociado con componentes de la célula, tal como en asociación con el retículo endoplasmático (RE) o el aparato de Golgi, o cuando está presente en la fracción celular soluble. El gp120 y otros polipéptidos Env de la presente invención también pueden ser secretados en medio de crecimiento siempre y cuando queden presentes suficientes cantidades de polipéptidos dentro de la célula tal que puedan purificarse a partir de lisados celulares usando técnicas descritas en la presente memoria.

Una gp120 u otra proteína Env "inmunogénica" es una molécula que incluye al menos un epitope tal que la molécula es capaz bien de provocar una reacción inmunológica en un individuo al que se administra la proteína o, en un contexto de diagnóstico, es capaz de reaccionar con anticuerpos dirigidos contra el VIH en cuestión.

"Epitope" pretende significar un sitio en un antígeno al que responden células B y/o células T específicas, convirtiendo a la molécula, incluyendo tal epitope, en capaz de provocar una reacción inmunológica o capaz de reaccionar con anticuerpos de VIH presentes en una muestra biológica. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Un epitope puede comprender 3 o más aminoácidos en una configuración espacial única para el epitope. Generalmente, un epitope está constituido por al menos 5 de tales aminoácidos y, más habitualmente, está constituido por al menos 8-10 de tales aminoácidos. Los procedimientos para determinar la configuración espacial de los aminoácidos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía por rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, la identificación de los epitopes en una proteína dada se realiza fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica, tales como mediante el uso de estudios de hidrofobicidad y serología de sitio dirigida. Véase, también, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1984) 81: 3998-4002 (procedimiento general para sintetizar rápidamente péptidos destinados a determinar la localización de epitopes inmunogénicos en un antígeno dado); la patente estadounidense n.º: 4.708.871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epitopes de antígenos); y Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 23: 709-715 (técnica para identificar péptidos con una afinidad elevada por un anticuerpo dado). Los anticuerpos que reconocen el mismo epitope pueden ser identificados en un simple inmunoanálisis que muestre la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

Una "respuesta inmunológica" o una "respuesta inmune", como se usan en la presente memoria, es el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular hacia el polipéptido Env (p. ej., gp120) cuando el polipéptido está presente en una composición vacunal. Estos anticuerpos también pueden neutralizar la infectividad y/o mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo-complemento o de los anticuerpos para proporcionar una protección a un huésped inmunizado. Es posible determinar la reactividad inmunológica en inmunoanálisis estándar tales como los análisis de competición, conocidos en la técnica.

Las técnicas para determinar la "similitud" entre secuencias de aminoácidos son conocidas en la técnica. En general, "similitud" significa la comparación exacta de aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en un lugar apropiado, en la que los aminoácidos son idénticos o poseen propiedades químicas y/o físicas similares tales como la carga o la hidrofobicidad. Entonces es posible determinar el denominado "porcentaje de similitud" entre las secuencias de polipéptidos comparadas. Las técnicas para determinar la identidad entre secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos también son conocidas en la técnica e incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para ese gen (habitualmente, mediante un producto intermedio de ADNc) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada por la misma, así como comparar ésta con una segunda secuencia de aminoácidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente.

Se pueden comparar dos o más secuencias de polinucleótidos determinando su "porcentaje de identidad". Asimismo, se pueden comparar dos o más secuencias de aminoácidos determinando su "porcentaje de identidad". El porcentaje de identidad de dos secuencias, bien secuencias de ácidos nucleicos o de péptidos, se describe generalmente como el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. El algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman, "Advances in Applied Mathematics" 2: 482-489 (1981), proporciona un alineamiento aproximado para las secuencias de ácidos nucleicos. El uso de este algoritmo puede extenderse a las secuencias peptídicas usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, "Atlas of Protein Sequences and Structure", M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU., y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6): 6745-6763 (1986). El grupo Genetics Computer Group (Madison, WI) en su aplicación de utilidad BestFit proporciona la puesta en práctica de este algoritmo para secuencias de ácidos nucleicos y de péptidos. Los parámetros por defecto para este procedimiento están descritos en el manual "Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual", versión 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI). Hay otros programas igualmente adecuados para calcular el porcentaje de identidad y la similitud entre secuencias que son generalmente conocidos en la técnica.

Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad de una determinada secuencia de nucleótidos con una secuencia de referencia usando el algoritmo de homologías de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por hueco de seis posiciones de nucleótido. Otro procedimiento para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención consiste en usar el paquete de programas MPSRCH cuyos derechos están registrados por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de este juego de paquetes, se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman en el que se usan los parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, una penalización por apertura de hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor de "coincidencia" refleja la "identidad secuencial". En general, se conocen otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre secuencias, tales como el programa de alineamiento BLAST, que puede ser usado con los parámetros por defecto. Por ejemplo, el BLASTN y el PLASTP se pueden usar con los siguientes parámetros por defecto: código genético = patrón; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias; clasificado por = HIGH SCORE; bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Se puede encontrar información sobre estos programas en la siguiente dirección de Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente los parámetros de búsqueda adecuados para usarlos para una secuencia dada en los programas anteriores. Por ejemplo, los parámetros de búsqueda pueden variar en base al tamaño de la secuencia en cuestión. De este modo, por ejemplo, una realización representativa de la presente invención incluiría un polinucleótido aislado que tuviera X nucleótidos contiguos, en el que (i) los X nucleótidos contiguos tuvieran una identidad de al menos aproximadamente el 50% con Y nucleótidos contiguos derivados de cualquiera de las secuencias descritas en la presente memoria; (ii) X fuera igual a Y; y (iii) X fuera mayor de o igual a 6 nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, preferiblemente, mayor de o igual a 8 nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, más preferiblemente, 10-12 nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, y todavía más preferiblemente, 15-20 nucleótidos, hasta el número de nucleótidos presente en las secuencias de longitud completa descritas en la presente memoria (p. ej., véanse el listado secuencial y las reivindicaciones), incluyendo todos los valores enteros pertenecientes a los intervalos anteriormente descritos.

Los casetes de expresión sintéticos (y los polinucleótidos purificados) de la presente invención incluyen secuencias de polinucleótidos relacionadas que tienen aproximadamente del 80% al 100%, más del 80-85%, preferiblemente, más del 90-92%, más preferiblemente más del 95%, y lo más preferible, más del 98% de identidad secuencial (incluyendo todos los valores enteros pertenecientes a estos intervalos descritos) con las secuencias de los casetes de expresión sintéticos reveladas en la presente memoria (por ejemplo, con las secuencias reivindicadas u otras secuencias de la presente invención) cuando se usan las secuencias de la presente invención como la secuencia problema.

También hay programas informáticos disponibles para determinar la probabilidad de que ciertos polipéptidos formen estructuras tales como láminas \beta. Uno de tales programas, descrito en la presente memoria, es el programa "ALB" para el cálculo y la predicción de estructuras secundarias de proteínas y polipéptidos. Además, se puede predecir la estructura proteica secundaria a partir de la secuencia primaria de aminoácidos, por ejemplo, usando la estructura cristalina de la proteína y alineando la secuencia proteica relacionada con la estructura cristalina (p. ej., usando programas MOE (Molecular Operating Environment) disponibles en Chemical Computing Group Inc., Montreal, P. Q., Canadá). En, por ejemplo, Garnier et al., (1996) Methods Enzymol. 266: 540-553; Geourjon et al. (1995) Comput. Applic. Biosci. 11: 681-684; Levin (1997) Protein Eng. 10: 771-776; y Rost et al., (1993) J. Molec. Biol. 232: 584-599, se describen otros procedimientos para predecir las estructuras secundarias.

También es posible determinar la homología mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones que formen dúplex estables entre las regiones homólogas, seguida por la digestión con nucleasa o nucleasas específicas monocatenarias y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de ADN o dos secuencias polipeptídicas son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias muestran al menos aproximadamente del 80-85%, preferiblemente, al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferible, al menos aproximadamente el 95-98% de identidad secuencial en una longitud definida de las moléculas, determinada usando los procedimientos anteriores. Como se usa en la presente memoria, sustancialmente homólogas también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con la secuencia de ADN o polipeptídica especificada. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación Southern en, por ejemplo, condiciones restrictivas, según lo definido para el sistema en concreto. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas pertenece al alcance del experto en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra; "DNA Cloning", supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra.

Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado es una secuencia de ácidos nucleicos que es transcrita (en el caso de ADN) y traducida (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Las fronteras de la secuencia codificante están determinadas por un codón de iniciación en el terminal (amino) 5' y un codón de terminación de la traducción en el terminal (carboxilo) 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADNc de secuencias de nucleótidos víricos, así como secuencias de ADN sintético y semisintético, y secuencias que incluyen análogos básicos. Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar localizada en 3' con respecto a la secuencia codificante.

Los "elementos de control" se refieren colectivamente a secuencias promotoras, sitios de unión a ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores secuencia arriba, potenciadotes y similares que proporcionan colectivamente la transcripción y la traducción de una secuencia codificante en una célula huésped. No todos estos elementos de control tienen que estar siempre presentes siempre y cuando el gen deseado sea capaz de ser transcrito y traducido.

Un "elemento de control" dirige la transcripción de una secuencia codificante de una célula cuando la ARN polimerasa se vaya a unir a la secuencia promotora y transcribir la secuencia codificante en ARNm, que luego es traducido en el polipéptido codificado por la secuencia codificante.

"Ligados operativamente" se refiere a una disposición de los elementos en la que los componentes así descritos están configurados para que realicen su función habitual. Así, los elementos de control que están ligados operativamente a una secuencia codificante son capaces de afectar a la expresión de la secuencia codificante cuando la ARN polimerasa esté presente. Los elementos de control no necesitan estar contiguos a la secuencia codificante, siempre y cuando funcionen para dirigir la expresión de la misma. De este modo, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias no traducidas aunque transcritas intercaladas entre, p. ej., la secuencia promotora y la secuencia codificante, y la secuencia promotora puede seguir siendo considerada "ligada operativamente" a la secuencia codificante.

"Recombinante" como se usa en la presente memoria para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una parte del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; y/o (2) está ligado a un polinucleótido distinto del que está ligado en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o un polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. Los términos de "células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos tales que denotan microorganismos procariotas o líneas celulares eucariotas cultivados como entidades unicelulares se usan indistintamente y se refieren a células que pueden ser, o han sido, usadas como receptores de vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN total o genómico al padre original, debido a mutaciones accidentales o deliberadas. La progenie de la célula parental que es suficientemente similar al padre que será caracterizada por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido deseado, está incluida en la progenie englobada por esta definición y está cubierta por los términos
anteriores.

"Sujeto vertebrado" pretende significar cualquier miembro del subfilum cordata, incluyendo sin limitación, seres humanos u otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés u otros simios y especies de monos; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cerdos de guinea; aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y similares. El término no denota una edad en concreto. De ese modo, se pretende cubrir tanto individuos adultos como recién nacidos.

Como se usa en la presente memoria, "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o de fluido aislada de un individuo, incluyendo pero no limitándose a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, muestras de piel, secreciones externas de la piel, de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, muestras derivadas del epitelio gástrico y la mucosa gástrica, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro, incluyendo pero no limitándose a medios acondicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, p. ej., células recombinantes y componentes celulares.

Los términos "etiqueta" y "etiqueta detectable" se refieren a una molécula que se puede detectar, incluyendo, pero no limitándose a, isótopos radiactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (p. ej., biotina o haptenos) y similares. El término "fluorescente" se refiere a una sustancia o una porción de la misma que es capaz de presentar fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos particulares de etiquetas que pueden ser usadas con la invención incluyen, pero no se limitan a, la fluoresceína, rodamina, dansil, umbeliferona, rojo Texas, luminol, ésteres de acradimum, NADPH, \alpha-\beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante, glucosa-oxidasa, fosfatasa alcalina y ureasa.

\vskip1.000000\baselineskip

Perspectiva general

La presente invención se refiere a moléculas de polipéptido Env modificado (p. ej., glicoproteína ("gp")120. Sin quedar vinculados a ninguna teoría en particular, parece que ha sido difícil generar respuestas inmunológicas contra Env, porque el sitio de unión a CD4 está enterrado entre el dominio exterior, el dominio interior y los dominios V1/V2. Por lo tanto, aunque la eliminación del dominio V1/V2 puede volver al virus más susceptible a la neutralización por un anticuerpo monoclonal dirigido al sitio de CD4, la lámina de unión que cubre la mayoría del dominio de unión a CD4 puede evitar una respuesta de los anticuerpos. De este modo, la presente invención proporciona polipéptidos Env que siguen mantienen su estructura global general aún dejando al descubierto el dominio de unión a CD4. Esto permite la generación de una respuesta inmune (p. ej., una respuesta de los anticuerpo) a epitopes en o cerca del sitio de unión a CD4.

Se pueden combinar diversas formas de las diferentes realizaciones de la invención descritas en la presente memoria.

\vskip1.000000\baselineskip

Configuraciones de lámina \beta

En la presente invención, se identificaron la localización de las estructuras de lámina \beta en relación con la estructura (cristalina) tridimensional de una proteína Env cristalizada de HXB-2 (véase el ejemplo 1A). En base a esta estructura, se diseñaron constructos codificantes de polipéptidos que tenían reemplazos y/o escisiones que mantenían la geometría global a la vez que dejaban al descubierto el sitio de unión a CD4. En concreto, la estructura cristalina de HXB-2 fue descargada de la base de datos Brookhaven. Usando los parámetros por defecto de la opción de Búsqueda de bucles del módulo Biopolímero del paquete de modelización molecular Sybyl, se determinaron la homología y el ajuste de los aminoácidos que podrían reemplazar a los bucles nativos entre las láminas \beta aún manteniendo la estructura terciaria global. Entonces se diseñaron los constructos codificantes de los polipéptidos Env modificados (ejemplo 1.B).

De ese modo, los polipéptidos Env modificados tienen suficiente lámina de unión eliminada como para dejar al descubierto el surco de CD4, pero tienen suficiente estructura como para permitir el correcto plegamiento de la glicoproteína Env. A continuación, se describen ejemplos de los constructos.

Producción de polipéptidos

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser producidos en cualquier número de procedimientos que sean conocidos en la técnica.

En una realización, se generan los polipéptidos usando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. A este respecto, se pueden crear sondas de oligonucleótido basadas en las secuencias conocidas del genoma del polipéptido Env (p. ej., gp120), y usarlas para sondar genotecas genómicas o de ADNc para los genes Env. Entonces se puede aislar más el gen usando técnicas estándar y, p. ej., enzimas de restricción empleadas para truncar el gen en las porciones deseadas de la secuencia de longitud completa. De manera similar, el gen o los genes Env pueden ser aislados directamente a partir de células y tejidos que contengan los mismos, usando técnicas conocidas, tales como la extracción con fenol, pudiéndose manipular más la secuencia para producir los truncamientos deseados. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra, para una descripción de las técnicas usadas para obtener un ADN aislado.

Los genes codificantes de los polipéptidos modificados (p. ej., truncados y/o sustituidos) pueden producirse sintéticamente, en base a secuencias conocidas. Se puede diseñar la secuencia de nucleótidos con los codones apropiados para una secuencia de aminoácidos concreta deseada. Generalmente, se ensambla la secuencia completa desde los oligonucléotidos solapantes preparados mediante procedimientos estándar, y se ensambla en una secuencia codificante completa. Véase, p. ej., Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al., (1984) Science 223: 1299; Jay et al., (1984) J. Biol. Chem., 259: 6311; Stemmer et al., (1995) Gene 164: 49-53.

Las técnicas recombinantes se usan fácilmente para clonar un gen codificante de un gen de un polipéptido Env que luego puede ser sometido a mutagénesis in vitro mediante el reemplazo del par o de los pares de bases apropiados para dar como resultado el codón para el aminoácido deseado. Tal cambio puede incluir tan poco como un par de bases, efectuando un cambio en un único aminoácido, o puede englobar cambios en varios pares de bases. Alternativamente, las mutaciones pueden efectuarse usando un cebador no emparejado que se hibride a una secuencia de nucleótidos padre (generalmente, ADNc correspondiente a la secuencia de ARN), a una temperatura menor de la temperatura de fusión del dúplex no emparejado. Se puede hacer específico el cebador manteniendo la longitud del cebador y la composición de las bases dentro de unos límites relativamente reducidos y manteniendo la base mutante localizada en el centro. Véase, p. ej., Innis et al, (1990) "PCR Applications: Protocols for Functional Genomics"; Zoller y Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. La ampliación del cebador se efectúa usando ADN polimerasa, el producto clonado y los clones que contienen el ADN mutado, derivado mediante la segregación de la cadena ampliada del cebador, seleccionado. Se puede realizar la selección usando el cebador mutante como una sonda de hibridación. La técnica también es aplicable a la generación de múltiples mutaciones puntuales. Véase, p. ej., Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl., Acad. Sci EE.UU. (1982) 79: 6409.

Una vez aisladas o sintetizadas las secuencias codificantes para las proteínas deseadas, éstas pueden ser clonadas en cualquier vector o replicón adecuado para su expresión. Como resultará evidente a partir de las enseñanzas de la presente memoria, es posible generar una gran variedad de vectores codificantes de polipéptidos modificados mediante la creación de constructos de expresión que liguen operativamente, en diversas combinaciones, polinucleótidos codificantes de los polipéptidos Env que tengan eliminaciones o mutaciones en los mismos. De ese modo, es posible ligar operativamente polinucleótidos codificantes de una determinada región V1/V2 eliminada con polinucleótidos codificantes de polipéptidos que tengan eliminaciones o reemplazos en la región del bucle pequeño y el constructo introducido en una célula huésped para la expresión de polipéptidos. En los ejemplo, se tratan ejemplos no restrictivos de tales combinaciones.

Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación, dejando a su elección la selección de un vector de clonación apropiado. Los ejemplos de vectores de ADN recombinante para la clonación y de las células huésped que éstos pueden transformar incluyen el bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacteria Gram-negativa), pGV1106 (bacteria Gram-negativa), pLAFR1 (bacteria Gram-negativa), pME290 (bacteria Gram-negativa no E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y el virus del papiloma bovino (células de mamífero). Véase, en general, "DNA Cloning": Vol. I y II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal, supra.

También se pueden usar sistemas de expresión de células de insectos, tales como sistemas de baculovirus, y son conocidos por los expertos en la técnica, estando descritos en, p. ej., Summers y Smith, "Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555" (1987). Los materiales y los procedimientos para los sistemas de expresión de células de baculovirus/insectos se encuentran disponibles comercialmente en un equipo de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (equipo "MaxBac").

También es posible usar sistemas de expresión de plantas para producir las proteínas Env modificadas. En general, tales sistemas usan vectores basados en virus para transfectar las células vegetales con genes heterólogos. Para una descripción de tales sistemas, véase, p. ej., Porta et al., Mol. Biotech. (1996) 5: 209-221; y Hackland et al., Arch. Virol. (1994) 139: 1-22.

Los sistemas víricos, tales como un sistema de infección/transfección vacunal, según lo descrito en Tomei et al., J. Virol. (1993) 67: 4017-4026 y Selby et al., J. Gen. Virol., (1993) 74: 1103-1113, también encontrarán un uso en la presente invención. En estos sistemas, primero se transfectan las células in vitro con un recombinante de virus vacunal que codifique la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Esta polimerasa manifiesta una exquisita especificidad, pues sólo transcribe moldes que llevan promotores T7. Tras la infección, las células son transfectadas con el ADN de interés, acción conducida por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma procedente del recombinante de virus vacunal transcribe el ADN transfectado en ARN, que luego es traducido a proteína mediante la maquinaria de traducción del huésped. El procedimiento proporciona una producción citoplasmática transitoria de alto nivel de grandes cantidades de ARN y su producto o productos de traducción.

Se puede colocar el gen bajo el control de un promotor, del sitio de unión al ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, de un operador (conjuntamente denominados en la presente memoria elementos de "control"), de manera que se transcriba la secuencia de ADN codificante del polipéptido Env deseado en ARN en la célula huésped transformada por un vector que contenga esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede o no contener un péptido señal o una secuencia líder. Con la presente invención, se pueden usar tanto los péptidos señal naturales como las secuencias heterólogas. El huésped puede eliminar las secuencias líder en un procesamiento post-traducional. Véanse, p. ej., las patentes estadounidenses n.º: 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397. Tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, líder de TPA, así como la secuencia señal de la melitina de la abeja.

También se pueden desear otras secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias proteicas relativas al crecimiento de la célula huésped. Tales secuencias reguladores son conocidas por los expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen aquéllas que hacen que la expresión de un gen sea activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.

Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden ser ligadas a la secuencia codificante antes de su inserción en un vector. Alternativamente, se puede clonar la secuencia coficante directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias control y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia codificante para que pueda ser unida a las secuencias control con la orientación apropiada, i.e., para mantener el marco de lectura adecuado. Se pueden preparar mutantes o análogos mediante la eliminación de una parte de la secuencia codificante de la proteína, mediante la inserción de una secuencia y/o mediante la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como la mutagénesis de sitio dirigida, son conocidas por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra; "DNA Cloning", Vol. I y II, supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra.

Entonces se usa el vector de expresión para transformar una célula huésped apropiada. Hay un número de líneas celulares de mamíferos conocidas en la técnica, e incluyen las líneas celulares inmortalizadas de la colección americana de cultivos tipo (ATCC), tales como, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de cachorro de hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células Vero293, así como otras. De manera similar, los huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., encontrarán un uso con los presentes constructos de expresión. Los huéspedes de levadura útiles en la presente invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para su uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otras, Aedes aegypti, Autographe californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodopterafrugiperda y Trichoplusia ni.

En función del sistema de expresión y del huésped seleccionados, las proteínas de la presente invención son producidas mediante el cultivo de células huésped transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente en condiciones mediante las que se exprese la proteína de interés. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas pertenece al alcance de la técnica.

En una realización, las células transformadas secretan el producto polipeptídico en el medio circundante. Se pueden incluir ciertas secuencias reguladores en el vector para aumentar la secreción del producto proteico, por ejemplo, usando una secuencia líder de activador de plasminogenes titulares (TPA), una secuencia señal de interferón \gamma u otras secuencias peptídicas señal procedentes de proteínas secretoras conocidas. Se puede aislar entonces el producto polipeptídico secretado mediante diversas técnicas descritas en la presente memoria, por ejemplo, usando técnicas de purificación estándar tales como, pero sin limitarse a, resinas de hidroxiapatita, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, CLAR, técnicas de inmunoadsorbencia, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y similares.

Alternativamente, se interrumpen las células transformadas usando procedimientos químicos, físicos o mecánicos, que lisan las células aún manteniendo los polipéptidos Env sustancialmente intactos. También se pueden obtener proteínas intracelulares eliminando los componentes de la pared o la membrana celular, p. ej., mediante el uso de detergentes o disolventes orgánicos, tal que se produzca la fuga de los polipéptidos Env. Tales procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica y están descritos en, p. ej., "Protein Purification Applications: A Practical Approach", (E. L. V. Harris y S. Angal, Eds., 1990).

Por ejemplo, los procedimientos para interrumpir células para su uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a: sonicación o ultrasonicación; agitación; extrusión de líquidos o sólidos; tratamiento térmico; congelación-descongelación; desecación; descompresión con explosivos; choque osmótico; tratamiento con enzimas líticas incluyendo proteasas tales como la tripsina, la neuraminidasa y la lisozima; tratamiento alcalino; y el uso de detergentes y disolventes tales como sales biliares, dodecilsulfato de sodio, Tritón, NP40 y CHAPS. La técnica concreta usada para interrumpir las células es en gran medida una cuestión de gusto, y dependerá del tipo de la célula en la que se exprese el polipéptido, de las condiciones de cultivo y del pretratamiento usado.

Tras la interrupción de las células, se retiran los residuos celulares, generalmente, mediante centrifugación, y se purifican en mayor profundidad los polipéptidos Env producidos intracelularmente usando técnicas de purificación estándar tales como, pero sin limitarse a, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, CLAR, técnicas de inmunoadsorbencia, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y similares.

Por ejemplo, un procedimiento para obtener los polipéptidos Env intracelularmente de la presente invención supone la purificación por afinidad, tal como mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos contra Env, o mediante cromatografía de afinidad a la lectina. Las resinas de lectina particularmente preferidas son aquéllas que reconocen restos de manosa tales como, pero sin limitarse a, las resinas derivadas de aglutinina Galanthus nivalis (GNA), aglutinina Lens culinaris (LCA o lectina de lenteja), aglutinina Pisum sativum (PSA o lectina de guisante), aglutinina Narcissus pseudonarcissus (NPA) y aglutinina Allium ursinum (AUA). La elección de una resina de afinidad adecuada pertenece al alcance de la técnica. Tras la purificación por afinidad, se pueden purificar en mayor profundidad los polipéptidos Env usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mediante cualquiera de las técnicas anteriormente descritas.

Puede ser deseable producir complejos Env (p. ej., gp120), bien con ellos mismos o con otras proteínas. Tales complejos se producen fácilmente, p. ej., transfectando conjuntamente células huésped con constructos codificantes de los polipéptidos Env (p. ej., gp120) y/o otros polipéptidos del complejo deseado. La transfección conjunta puede realizarse bien en trans o en cis, i.e., usando vectores separados o usando un único vector que lleve tanto el gen Env como otro gen. Si se hace usando un único vector, ambos genes pueden ser transportados por un único conjunto de elementos de control o, alternativamente, los genes pueden estar presentes en el vector en casetes de expresión individuales, transportados por elementos de control individuales. Tras la expresión, las proteínas se asociarán espontáneamente. Alternativamente, es posible formar los complejos mezclando las proteínas individuales que han sido producidas por separado, bien en forma purificada o semi-purificada, o incluso mezclando los medios de cultivo en los que se hayan cultivado las células huésped que expresan las proteínas. Véase la publicación internacional n.º: WO 96/04301, publicada el 15 de febrero de 1996, para una descripción de tales complejos.

Es posible sintetizar químicamente convenientemente polipéptidos relativamente pequeños, i. e., de hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas por aquéllos expertos en la técnica de los péptidos. En general, estos procedimientos emplean la adición secuencial de uno o más aminoácidos a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, bien el grupo amino o el grupo carboxilo del primer aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado. Entonces el aminoácido protegido o derivado puede ser bien unido a un soporte sólido inerte o utilizado en solución añadiendo el siguiente aminoácido de la secuencia que tenga el grupo (amino o carboxilo) complementario adecuadamente protegido, en condiciones que permitan la formación de un enlace tipo amida. Entonces se elimina el grupo protector del resido de aminoácido recién añadido y se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y así sucesivamente. Una vez que los aminoácidos deseados han sido enlazados en la secuencia apropiada, se elimina cualquier grupo protector (y cualquier soporte sólido, si se usan técnicas de síntesis en fase sólida) consecutiva o simultáneamente para obtener el polipéptido final. Mediante la simple modificación de este procedimiento general, es posible añadir más de un aminoácido a la vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo, mediante el acoplamiento (en condiciones que no racemicen los centros quirales) de un tripéptido protegido con un dipéptido adecuadamente protegido para formar, tras la desprotección, un pentapéptido. Véase, p. ej., J. M. Stewart y J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984), y G. Barany y R. B. Merrifield, "The Peptides: Analysis. Synthesis, Biology", editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, (Academic Press, Nueva York, 1980), pp. 3-254, para las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky, "Principles of Peptide Synthesis", (Springer-Verlag, Berlín 1984), y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1, para la síntesis clásica en disolución.

Los grupos protectores típicos incluyen t-butiloxicarbonilo (Boc), 9- fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), benciloxicarbonilo (Cbz); p-toluensulfonilo (Tx); 2,4-dinitrofenilo; bencilo (Bzl); bifenilisopropiloxicarboxi-carbonilo, t- amiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, o-bromobenciloxicarbonilo, ciclohexilo, isopropilo, acetilo, o-nitrofenilsulfonilo y similares.

Los soportes sólidos son soportes poliméricos entrecruzados. Éstos pueden incluir polímeros basados estireno entrecruzado con divinilbenceno, por ejemplo, copolímeros de divinilbenceno-hidroximetilestireno, copolímeros de divinilbenceno-clorometilestireno y copolímeros de divinilbenceno-benzhidrilaminopoliestireno.

Los análogos de polipéptido de la presente invención también pueden ser preparados químicamente mediante otros procedimientos tales como mediante el procedimiento de síntesis simultánea de múltiples péptidos. Véase, p. ej., Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1985) 82: 5131-5135; Patente estadounidense n.º: 4.631.211.

Aplicaciones diagnósticas y vacunales

Es posible usar los polipéptidos Env producidos intracelularmente de la presente invención, los complejos de los mismos o los polinucleótidos codificantes de los mismos para un número de objetos diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, se pueden usar las proteínas y los polinucleótidos, o los anticuerpos generados contra los mismos, en un variedad de análisis para determinar la presencia de anticuerpos reactivos y/o proteínas Env en una muestra biológica con el fin de ayudar en el diagnóstico de la infección por o el estado patológico del VIH, o como medida de la respuesta a la inmunización.

La presencia de anticuerpos reactivos con los polipéptidos Env (p. ej., gp120) y, a la inversa, de antígenos reactivos con los anticuerpos generados para los mismos, puede ser detectada usando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnóstico estándar, incluyendo inmunoanálisis tales como análisis de tipo competición, reacción directa o sándwich. Tales análisis incluyen, pero no se limitan a, transferencias Western; análisis de aglutinación; inmunoanálisis marcados con o mediados por enzimas, tales como ELISA; análisis de tipo biotina/avidina; radioinmunoanálisis; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones incluyen generalmente etiquetas reveladoras tales como etiquetas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o enzimáticas, o moléculas de tinte, u otros procedimientos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo, o de anticuerpos reaccionados con los mismos.

Se pueden usar soportes sólidos en los análisis tales como nitrocelulosa, en forma de membrana o de pozos de microvaloración; polivinilcloruro, en láminas o en pozos de microvaloración; látex de poliestireno, en perlas o en placas de microvaloración; fluoruro de polivinilideno; papel diazotizado; membranas de nylon; perlas activadas y similares.

Comúnmente, primero se hace reaccionar el soporte sólido con la muestra biológica (o las proteínas gp120), se lava y luego se aplican los anticuerpos (o una muestra sospechosa de contener anticuerpos). Tras el lavado para eliminar cualquier ligando no enlazado, se añade un resto aglutinante secundario en condiciones de unión adecuadas, tales que el aglutinante secundario sea capaz de asociarse selectivamente con el ligando unido. La presencia del aglutinante secundario puede ser entonces detectada usando técnicas conocidas en la técnica. Comúnmente, el aglutinante secundario comprenderá un anticuerpo dirigido contra los ligandos de anticuerpo. Hay un número de moléculas de inmunoglobulina (Ig) anti-humana que son conocidas en la técnica (p. ej., Ig anti-humana de cabra o Ig anti-humana de conejo disponibles comercialmente). Las moléculas de Ig para su uso en la presente memoria serán preferiblemente del tipo IgG o IgA, sin embargo, la IgM también puede ser apropiada en algunos casos. Las moléculas de Ig pueden ser fácilmente conjugadas con una etiqueta enzimática detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, glucosa-oxidasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y ureasa, entre otras, usando procedimientos conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Entonces se usa un sustrato enzimático apropiado para generar una señal detectable.

Alternativamente, se puede usar un análisis de "sándwich de dos anticuerpos" para detectar las proteínas de la presente invención. En esta técnica, se hace reaccionar primero el soporte sólido con uno o más de los anticuerpos dirigidos contra Env (p. ej., gp120), se lava y luego se expone a la muestra de análisis. Se vuelven a añadir los anticuerpos y se visualiza la reacción usando bien una reacción de color directo o usando un segundo anticuerpo marcado, tal como anti-inmunoglobulina marcada con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o ureasa.

También es posible realizar los análisis en disolución, tal que las proteínas víricas y los anticuerpos de las mismas formen complejos en condiciones de precipitación. Entonces se pueden separar los complejos precipitados de la muestra de análisis, por ejemplo, mediante centrifugación. Se puede analizar la mezcla de reacción para determinar la presencia o la ausencia de complejos anticuerpo-antígeno usando cualquiera de entre un número de procedimientos estándar, tales como aquellos procedimientos de inmunodiagnóstico descritos anteriormente.

Se pueden proporcionar las proteínas Env modificadas, producidas según lo descrito anteriormente, o los anticuerpos contra las proteínas en equipos con las instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin de realizar los inmunoanálisis según lo descrito anteriormente. El equipo también puede contener, en función del inmunoanálisis usado en concreto, etiquetas adecuadas, y otros reactivos y materiales envasados (i. e., tampones de lavado y similares). Con el uso de estos equipos se pueden realizar inmunoanálisis estándar, tales como los descritos anteriormente.

También se pueden usar los polipéptidos y los polinucleótidos Env codificantes de los polipéptidos en composiciones vacunales, individualmente o en combinación, en p. ej., vacunas profilácticas (i. e., para prevenir la infección) o vacunas terapéuticas (para tratar el VIH tras la infección). Las vacunas pueden comprender mezclas de una o más proteínas Env modificadas (o secuencias de nucleótidos codificantes de las proteínas), tales como proteínas Env (p. ej., gp120) derivadas de más de un aislado vírico. También es posible administrar la vacuna en combinación con otros antígenos y agentes inmunorreguladores, por ejemplo, inmunoglobulinas, citoquinas, linfoquinas y quimioquinas, incluyendo, pero no limitándose a, IL-2, IL-2 modificada (cys125-ser125), GM-CSF, IL-12, \gamma-interferón, IP-10, MIP1\beta y RANTES. Las vacunas pueden ser administradas como polipéptidos o, alternativamente, como vacunas de ácidos nucleicos desnudos (p. ej., ADN), usando vectores víricos (p. ej., vectores retrovíricos, vectores adenovíricos, vectores víricos adeno-asociados) o vectores no víricos (p. ej., liposomas, partículas revestidas con ácido nucleico o proteína). Las vacunas también pueden comprender una mezcla de proteína y ácido nucleico, que a su vez puede se administrada usando el mismo o diferentes vehículos. Es posible administrar la vacuna más de una vez (p. ej., una administración "de cebado" seguida por uno o más "refuerzos") para lograr los efectos deseados. La misma composición puede ser administrada como el cebado y como uno o más refuerzos. Alternativamente, se pueden usar diferentes composiciones para el cebado y los refuerzos.

Las vacunas incluirán generalmente uno o más "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, en tales vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH y similares.

Hay un vehículo opcionalmente presente que es una molécula que por sí misma no provoca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Tales vehículos son comúnmente grandes macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como pequeñas gotas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivos. Tales vehículos son conocidos por los expertos habituales en la técnica. Además, el polipéptido Env puede estar conjugado a un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, etc.

También se pueden usar adyuvantes para aumentar la eficacia de las vacunas. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsiones de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase más adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo (a) MF59 (Publicación internacional n.º. WO 90/14837), que contiene Squalene al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE [véase más adelante], aunque no sean necesarias), formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene Squalene al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero en bloques de Pluronic al 5% L121 y thr-MDP (véase más adelante), bien microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a turbulencias para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula y (c) sistema de adyuvantes Ribi® (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Squalene al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana procedentes del grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (EPC), preferiblemente, MPL + EPC (Detox®); (3) se pueden usar adyuvantes de saponina, tales como Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas por los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) adyuvante de Freunds Completo (AFC) y Adyuvante de Freunds Incompleto (AFI); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (IL-1, IL-2, etc.), factor estimulante de colonias de macrófagos (FEC-M), factor de necrosis tumoral (FNT), etc.; (6) mutantes destoxificados de una toxina ribosilante del ADP bacteriano tal como una toxina del cólera (TC), toxina de la tosferina (TP) o toxina lábil al calor de E. coli (TL), particularmente, LT-K63 (en la que la lisina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 63) LT-R72 (en la que la arginina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 72), CT-S 109 (en la que la serina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 109) y PT-K9/G129 (en la que la lisina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 9 y la glicina está sustituida en la posición 129) (véase, p. ej., las publicaciones internacionales n.º: W093/13202 y W092/19265); y (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para aumentar la eficacia de la composición.

Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nomuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-
2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Comúnmente, las composiciones vacunales se preparan como inyectables, bien como soluciones o como suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para su disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su inyección. La preparación también puede ser emulsionada o encapsulada en liposomas para un mayor efecto adyuvante, según lo tratado anteriormente.

Las vacunas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de proteínas Env modificadas, o de complejos de las proteínas o de secuencias de nucleótidos codificantes de las mismas, y cualquier otro de los componentes anteriormente mencionados, según lo necesario. "Cantidad terapéuticamente eficaz" pretende significar una cantidad de una proteína Env modificada (p. ej., gp120) que provoque una respuesta inmune protectora en el individuo sin infectar, infectado o no expuesto al que se le administra. Tal respuesta generalmente dará como resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune secretora, celular y/o mediada por anticuerpos hacia la vacuna. Habitualmente, tal respuesta incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos; la producción de anticuerpos de cualquiera de las clases inmunológicas, tales como inmunoglobulinas A, D, E, G o M; la proliferación de linfocitos B y T; el suministro de señales de activación, de crecimiento y de diferenciación hacia células inmunológicas; la expansión de la célula T auxiliar, de la célula T supresora y/o de la célula T citotóxica.

Preferiblemente, la cantidad eficaz es suficiente para llevar a cabo el tratamiento o la prevención de los síntomas de la enfermedad. La cantidad exacta necesaria variará en función del sujeto que esté siendo tratado; de la edad y del estado general del individuo que se vaya a tratar; de la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar los anticuerpos; del grado de protección deseado; de la gravedad de la condición que esté siendo tratada; del polipéptido Env concreto seleccionado y de su modo de administración, entre otros factores. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad eficaz apropiada. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias.

Una vez formuladas, las vacunas de ácido nucleico pueden ser realizadas con o sin vectores víricos, según lo descrito anteriormente, mediante inyección usando bien una jeringa convencional o una pistola de genes, tal como el sistema de administración de genes Accell® (PowderJect Technologies, Inc., Oxford, Inglaterra). La administración del ADN en células de la epidermis es particularmente preferible, pues este procedimiento de administración proporciona acceso a las células linfoides asociadas con la piel y proporciona una presencia transitoria del ADN en el receptor. Tanto los ácidos nucleicos como los péptidos pueden ser inyectados bien subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramucosa, tal como nasal, rectal y vaginalmente, intraperitoneal, intravenosa, oral o intramuscularmente. Otros procedimientos de administración incluyen la administración oral o pulmonar, la aplicación de supositorios, de inyección sin aguja, transcutánea y transdérmica. El tratamiento posológico puede ser un régimen posológico simple o un régimen posológico múltiple. La administración de ácidos nucleicos puede ser además combinada con la administración de péptidos u otras sustancias.

Aunque la invención haya sido descrita en combinación con las realizaciones específicas preferidas de la misma, se entenderá que la descripción precedente, así como los ejemplos que figuran a continuación, pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Hay otros aspectos, ventajas y modificaciones pertenecientes al ámbito de la invención que resultarán evidentes para aquéllos expertos en la técnica a la que pertenece la invención.

Apartado experimental

A continuación, se presentan ejemplos de las realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Estos ejemplos se ofrecen únicamente a efectos ilustrativos y no están, en ningún modo, destinados a limitar el ámbito de la presente invención.

Se han hecho esfuerzos por garantizar la exactitud respecto a los números usados (p. ej., las cantidades, las temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se deberían permitir algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1 A.1. Búsquedas del mejor ajuste y de la homología

La estructura cristalina de la gp120 de HXB-2 fue descargada de la base de datos Brookhaven. (COMPLEJO (PROTEÍNA DE LA ENVOLTURA DEL VIH/CD4/FAB) 15-JUN-98 1GC1 TÍTULO: NÚCLEO DE LA GP120 DEL VIH-1 COMPLEJADO CON CD4 Y UN ANTICUERPO HUMANO NEUTRALIZANTE). Las cadenas beta 3, 2, 21 y 20 de gp120 forman una lámina cerca del sitio de unión a CD4. Las cadenas \beta-3 y \beta-2 están conectadas por el bucle V1/V2. Las cadenas \beta-21 y \beta-20 están conectadas por otro bucle pequeño. Los enlaces de tipo H del punto de unión entre las cadenas \beta-2 y \beta-21 son la única conexión entre los dominios de la mitad "inferior" de la proteína (hélice de unión alfa 1 al sitio de unión a CD4). Esta lámina beta y estos bucles ocultan algunos antígenos (p. ej., antígenos que pueden generar anticuerpos neutralizantes) que sólo quedan al descubierto durante la unión a CD4.

Se diseñaron constructos que eliminan suficiente lámina beta como para dejar al descubierto los antígenos en el sitio de unión a CD4, aún dejando la suficiente proteína como para permitir su correcto plegamiento. Se dirigieron específicamente modificaciones en el bucle pequeño y la eliminación opcional de los bucles V1/V2. Se diseñaron tres tipos diferentes de constructos: (1) constructos codificantes de los polipéptidos que dejan intacto el número de residuos que constituyen la lámina beta entera de 4 cadenas, pero reemplazan uno o más residuos; (2) constructos que codifican el polipéptido que tiene al menos un residuo de al menos una cadena beta escindido o (3) constructos codificantes de polipéptidos que tienen al menos dos residuos de al menos una cadena beta escindidos. De ese modo, se necesitó un total de 6 vueltas diferentes para volver a unir los extremos de las cadenas.

Inicialmente, se modificaron los residuos del bucle pequeño (residuos 427-430, en relación con HXB-2) y las cadenas beta conectadas (\beta-20 y \beta-21) para que contuvieran Gly y Pro (comunes en las vueltas beta). Entonces se usaron estas secuencias como diana para el ajuste en cada búsqueda. Se ajustó la geometría de la diana con proteínas conocidas del banco de datos de proteínas de Brookhaven. En concreto, se buscaron en las bases de datos vueltas de 5 residuos (incluyendo un residuo simple solapante del terminal N, la vuelta diana de 2 residuos y 2 residuos solapantes del terminal C). En otras palabras, estos bucles modificados añaden una vuelta de 2 residuos que debería ser capaz de soportar una geometría que mantuviera la estructura de lámina beta de la proteína de tipo salvaje. Los cálculos fueron realizados usando los parámetros por defecto de la opción de Búsqueda de bucles del módulo Biopolímero del paquete de modelización molecular Sybyl. En cada caso, sólo se revisaron los 25 mejores ajustes basados en la geometría y, de ésos, se seleccionaron varios para la homología y el ajuste.

Además, también se determinaron las modificaciones que se podrían hacer para eliminar la mayor parte del bucle V1/V2 (residuos 124-198, relativos a HXB-2) aún dejando la geometría de la proteína intacta. Como con el bucle pequeño, también se diseñaron constructos que escindían uno o más residuos de la cadena \beta-2 (residuos 119-123 de HXB-2), de la cadena \beta-3 (residuos 199-201 de HXB-2) o de \beta-2 y \beta-3. Para estos constructos, se buscaron bucles conocidos para hacerlos coincidir con la geometría de un pentámero (incluyendo dos residuos restantes del lado del terminal N, una vuelta de dos residuos y un residuo del terminal C). Para estas búsquedas, se prefirió Gly-Gly como el inserto junto al menos una sustitución del terminal C.

A.2. Reemplazos del bucle pequeño

En un aspecto, se reemplazó la secuencia nativa con residuos que dejaron al descubierto el sitio de unión a CD4, pero dejando la geometría global de la proteína relativamente intacta. Para los reemplazos del bucle pequeño, la diana a la que ajustarse fue: ASN425-MET426-GLY427-GLY428-GLY431. En la tabla 1, se resumen los resultados de la búsqueda.

TABLA 1 Búsqueda del bucle pequeño (de Asn425 a Gly431)

1

En base a estos resultados, se recomendaron los constructos codificantes de Gly-Gly (n.º 7), Gly-Ser (n.º 12) o Gly-Gly-Asn (n.º 7).

Como también son opcionalmente eliminados V1/V2 y uno o más residuos de \beta-1 y \beta-3 en los polipéptidos modificados de la invención, también se buscaron bucles conocidos para ajustarlos a la geometría del bucle V1/V2. El bucle V1/V2, la diana a la que ajustarse fue: Lys121-Leu-122-Gly123-Gly124-Ser199. En la tabla 2, se muestran algunas coincidencias notables:

TABLA 2 Búsqueda del bucle V1/V2 (de Lys121 a Ser199)

3

En base a estas búsquedas, se recomendaron los constructos codificantes de Gly-Asn en lugar de V1/V2.

A.3. Una escisión de residuo más

Para un bucle pequeño ligeramente truncado, se recortó otro residuo más de cada cadena beta para acortar ligeramente la lámina beta. La diana a la que ajustarse fue: ILE424-ASN425-GLY426-GLY427-LYS432. En la tabla 3, se muestran los resultados.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Búsqueda de lámina beta acortada en un residuo (de IIe424 a Lys432)

4

Aunque estas búsquedas mostraron más variación y peores ajustes que el truncamiento anterior, los constructos codificantes de Pro-Val o Pro-Leu fueron muy similares. Por consiguiente, se recomendaron los constructos codificantes de Ala-Pro.

También se buscaron las secuencias codificantes de los polipéptidos gp120 que tenían V1/V2 eliminada y un resido más de \beta-2 o \beta-3 escindido. El bucle V1/V2, la diana a la que ajustarse fue: VAL120-LYS121-GLY122-GLY123-VAL200. En la tabla 4, se muestran algunas coincidencias notables.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Búsqueda del bucle V1/V2 (de Val120 a Val200)

5

Se recomendó el constructo codificante de Ala-Pro (p. ej., n.º: 7).

\vskip1.000000\baselineskip

A.4. Otras escisiones

En otro truncamiento más, se recortó otro residuo de las cadenas \beta-20 y \beta-21 para acortar más la lámina beta. La diana a la que ajustarse fue ILE423-ILE424-GLY425- GLY426-ALA433. En la figura 5, se muestran las coincidencias notables.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Búsqueda de lámina beta acortada en dos residuos (de IIe423 a Ala433)

6

Se recomendó un constructo codificante de Gly-Gly (p. ej., n.º: 3), que tiene una homología del 100%.

También se buscaron secuencias codificantes de una región V1/V2 eliminada y al menos dos residuos escindidos de \beta-2, \beta-3 o al menos un residuo escindido de \beta-2 y \beta-3. La diana a la que ajustarse fue: CYS119-VAL120-GLY121-GLY122-ILE201. En la tabla 6, se muestran las coincidencias notables.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Búsqueda del bucle V1/V2 (de Cys119 a IIe201)

7

Se determinó que se usarían ambos constructos.

\vskip1.000000\baselineskip

B.1. Constructos codificantes de polipéptidos Env modificados

Según lo descrito anteriormente, los bucles nativos que se extrudían de 4 cadenas antiparalelas \beta fueron escindidos y reemplazos por de 1 a 3 vueltas de residuo. Los bucles fueron reemplazados para dejar las cadenas \beta enteras o escindidas recortando uno o más aminoácidos de cada lado de las cadenas conectadas. Se volvieron a unir los extremos de las cadenas con vueltas que conservan la misma geometría del eje central (p. ej., estructura terciaria de \beta-20 y \beta-21), según lo determinado por la búsqueda en el banco de datos de proteínas de Brookhaven.

La tabla 7A es un resumen de los truncamientos de las regiones variables 1 y 2 recomendados en este estudio, según lo determinado en el ejemplo 1.A. anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7A

8

Como se indica anteriormente, los polipéptidos codificados por los constructos de la presente invención están numerados en relación con HXB2, pero el residuo de aminoácido particular de los polipéptidos codificados por estos constructos ejemplares se basa en SF-162. De ese modo, por ejemplo, aunque el residuo de aminoácido 195 de HXB-2 es una serina (S), los constructos codificantes de polipéptidos que tienen entonces la secuencia SF162 salvaje tendrán una asparagina (N) en esta posición. La tabla 7B sólo muestra tres de las variaciones en la secuencia de aminoácidos entre las cadenas HXB-2 y SF162. En el alineamiento de la figura 2, se muestran las secuencias completas, incluyendo las diferencias en el número de residuo y de aminoácido de HXB-2 y SF162 (SEQ ID NO: 1 y 2).

TABLA 7B

9

También se realizaron los constructos que contenían eliminaciones en la cadena \beta-20, la cadena \beta-21 y el bucle pequeño. En la tabla 8, se muestran los constructos codificantes de los truncamientos de estas regiones. Los constructos de la tabla 8 están numerados en relación con HXB-2, pero la secuencia de aminoácidos no modificada se basa en SF162. Por lo tanto, el constructo codifica una arginina (Arg) como se encuentra en SF162 en la posición de aminoácido numerada como 426 en relación con HXB-2 (véase además la tabla 7B). Los cambios del tipo salvaje (SF162) se pueden ver en negrita en la tabla 8B.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8

10

Se realizan los constructos de eliminación mostrados en las tablas 7 y 8 de cada una de las cadenas \beta y las combinaciones de las mismas. Estas eliminaciones serán analizadas en las formas Env gp120, gp140 y gp160 de diferentes cepas de VIH como las cepas del subtipo B (p. ej., SF162, US4, SF2), las cepas del subtipo E (p. ej., CM235) y cepas del subtipo C (p. ej., AF110968 o AF110975). En la figuras, se muestran los ejemplos de constructos para SF162, que están resumidos en la tabla 9. Como se indica anteriormente en la figura 2 y en la tabla 7B, en la región de la lámina de unión, la secuencia de aminoácidos de SF162 difiere de HXB-2 en que el Met426 de HXB-2 es una Arg en SF162. En la tabla 9, V1/V2 se refiere a las eliminaciones de la región V1/V2; # bsm se refiere a una modificación del bucle pequeño de la lámina de unión.

TABLA 9

11

Las combinaciones de las eliminaciones de V1/V2 y las modificaciones del bucle pequeño de la lámina de unión además de aquéllas mostradas específicamente en la tabla 9 también pertenecen al ámbito de la presente invención. Se pueden combinar las diversas formas de las diferentes realizaciones de la invención descritas en la presente memoria.

El primer rastreo se efectuará tras la expresión transitoria en células COS-7, RD y/o 293. Las proteínas que sean expresadas serán analizadas mediante inmunotransferencia, ELISA y en cuanto a la unión a anticuerpos M dirigidos contra el sitio de unión a CD4 y otros epitopes importantes sobre gp120 para determinar la integridad de la estructura. También serán analizados en un análisis de unión a CD4 y, además, la unión de anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, usando suero del paciente o anticuerpos M 448D (dirigidos contra Glu370 y Tyr384, una región del surco de unión a CD4 que no está alterada por las eliminaciones).

Se analizará la inmunogenicidad de estas nuevas glicoproteínas Env en roedores y primates. Las estructuras serán administradas como vacunas de ADN o vacunas de proteínas con adyuvantes, o en modalidades combinadas. El objetivo de estas vacunaciones consistirá en alcanzar respuestas ampliamente reactivas de los anticuerpos neutralizantes.

<110> Chiron Corporation

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> POLIPÉPTIDOS ENV DEL VIH MODIFICADOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 1605.100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 856

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 847

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val120-Ala204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2316

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val120-IIe201

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val120-IIe201B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Lys121-Val200

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2334

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Leu122-Ser199

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2316

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val120-Thr202

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2541

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Trp427-Gly431

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2541

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Arg426-Gly431

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2541

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Arg426-Gly431B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2541

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Arg426-Lys432

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2535

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Asn425-Lys432

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2529

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: IIe424-Ala433

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2523

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: IIe423-Met434

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2517

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Gin422-Tyr435

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2517

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Gin422-Tyr435B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Leu122-Ser199; Arg426-Gly431

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Leu122-Ser199; Arg426-Lys432

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Leu122-Ser199; Trp427-Gly431

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Lys121-Val200; Asn425-Lys432

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val120-IIe201; IIe424-Ala433

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val120-IIe201B; IIe424-Ala433

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val120-Thr202; IIe424-Ala433

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val127-Asn195

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Val127-Asn195; Arg426-Gly431

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

43

Claims (27)

1. Un polinucleótido codificante de un polipéptido Env del VIH modificado en el que el polipéptido tiene al menos un aminoácido eliminado o reemplazado en comparación con el tipo salvaje de la región correspondiente a los residuos 420 a 436 numerados en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

2. El polinucleótido de la reivindicación 1 en el que además está eliminada la región correspondiente a los residuos 124-198 numerados en relación con HXB-2 en comparación con el tipo salvaje y también está eliminado o reemplazado al menos un aminoácido en comparación con el tipo salvaje de las regiones correspondientes a los residuos 119 a 123 y 199 a 210 numerados en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

3. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que al menos un aminoácido de la región correspondiente a los residuos 427 a 429 en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1) está eliminado o reemplazado en comparación con el tipo salvaje.

4. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido Env del VIH modificado se basa en la cepa SF162.

5. Un polipéptido Env del VIH modificado inmunogénico que tiene al menos un aminoácido eliminado o reemplazado en comparación con el tipo salvaje de la región correspondiente a los residuos 420 a 436, en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

6. El polipéptido de la reivindicación 5, en el que un aminoácido está eliminado en la región correspondiente a los residuos 420 a 436, en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

7. El polipéptido de la reivindicación 5, en el que más de un aminoácido está eliminado en la región correspondiente a los residuos 420 a 436, en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

8. El polipéptido de la reivindicación 5, en el que al menos un aminoácido está reemplazado en la región correspondiente a los residuos 420 a 436, en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

9. El polipéptido de la reivindicación 5, en el que al menos un residuo de aminoácido está eliminado o reemplazado en la región correspondiente a los residuos de aminoácido 427 a 429, en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).

10. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en el que las regiones V1 y V2 del polipéptido están truncadas.

11. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en el que la secuencia de aminoácidos el polipéptido Env del VIH modificado se basa en la cepa SF162.

12. Un constructo útil para estimular una respuesta inmune, comprendiendo el constructo: secuencias control que regulan la transcripción y la traducción, una secuencia codificante regulada por las secuencias control, potenciadotes, secuencias de poliadenilación, en las que la secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por: la secuencia de nucleótidos representada en la figura 6 (SEQ ID NO: 3); la secuencia de nucleótidos representada en la figura 7 (SEQ ID NO: 4), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 8 (SEQ ID NO: 5), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 9 (SEQ ID NO: 6), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 10 (SEQ ID NO: 7), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 11 (SEQ ID NO: 8), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 12 (SEQ ID NO: 9), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 13 (SEQ ID NO: 10), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 14 (SEQ ID NO: 11), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 15 (SEQ ID NO: 12), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 16 (SEQ ID NO: 13), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 17 (SEQ ID NO: 14), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 18 (SEQ ID NO: 15), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 19 (SEQ ID NO: 16), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 20 (SEQ ID NO: 17), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 21 (SEQ ID NO: 18), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 22 (SEQ ID NO: 19), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 23 (SEQ ID NO: 20), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 24 (SEQ ID NO: 21), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 25 (SEQ ID NO: 22), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 26 (SEQ ID NO: 23), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 27 (SEQ ID NO: 24), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 28 (SEQ ID NO: 25) y la secuencia de nucleótidos representada en la figura 29 (SEQ ID NO: 26).

13. Una composición vacunal que comprende un polinucleótido codificante de un polipéptido Env modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

14. Una composición vacunal que comprende un constructo de polinucleótido codificante de un polipéptido Env modificado según la reivindicación 12.

\newpage

15. Una composición vacunal que comprende un polipéptido Env modificado según cualquiera de las reivindicaciones 5-11.

16. La composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, que comprende además un adyuvante.

17. Un polinucleótido codificante de un polipéptido Env del VIH modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 5-11 para su uso en la estimulación de una respuesta inmune.

18. Un constructo de polinucleótido según la reivindicación 12 para su uso en la estimulación de una respuesta inmune.

19. Un polipéptido que comprende un polipéptido Env del VIH modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 5-11 para su uso en la estimulación de una respuesta inmune.

20. Uso de un polinucleótido o un constructo de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 12 en la preparación de un medicamento para provocar una respuesta inmune.

21. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 5-11 en la preparación de un medicamento para provocar una respuesta inmune.

22. El uso según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que el polinucleótido, el constructo de polinucleótido o el polipéptido es administrado conjuntamente con un adyuvante.

23. Uso de una composición que comprende un polinucleótido Env modificado o un constructo de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 12, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune, siendo dicho medicamento para ser administrado en una etapa de cebado y para ser seguido por una etapa de refuerzo.

24. Uso de una composición que comprende un polinucleótido Env modificado o un constructo de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 12, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune, siendo dicho medicamento para ser administrado en una etapa de refuerzo y para ser precedido por una etapa de cebado.

25. Uso de una composición que comprende un polipéptido Env modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune, siendo dicho medicamento para ser administrado en una etapa de cebado y para ser seguido por una etapa de refuerzo.

26. Uso de una composición que comprende un polipéptido Env modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune, siendo dicho medicamento para ser administrado en una etapa de refuerzo y para ser precedido por una etapa de cebado.

27. El uso de las reivindicaciones 23-26, en el que dicha composición comprende además un adyuvante.