ES2299493T3

ES2299493T3 - Composiciones y metodos para tratar la enfermedad neoplasica usando sensibilizadores a la radiacion y a la quimioterapia.

Info

Publication number: ES2299493T3
Application number: ES01948255T
Authority: ES
Inventors: Bin Wu; Todd W. Seeley; Lewis T. Williams
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2021-05-30
Also published as: US20020049180A1; EP1292289A2; CA2410516A1; ATE387909T1; JP2003534786A; DE60133104D1; US20050282766A1; PT1292289E; US6974867B2; WO2001091739A2; DE60133104T2; EP1292289B1; AU2001269726A1; WO2001091739A3

Abstract

El uso de una molécula antisentido dirigida a KIAA0175 (ID. SEC. nº 9) para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar la quimiosensibilidad y/o la radiosensibilidad de una célula de mamífero.

Description

Composiciones y métodos para tratar la enfermedad neoplásica usando sensibilizadores a la radiación y a la quimioterapia.

Campo técnico

Este invento se refiere, en general, a la regulación del ciclo celular y la muerte celular tras la exposición a agentes que causan daño al DNA. Más específicamente, el presente invento proporciona composiciones y métodos para inhibir la expresión génica y/o la actividad biológica de KIAA0175 así como para reducir la expresión y/o la activación de las proteínas p53, p21 o proteínas relacionadas. Dichas composiciones y dichos métodos son útiles como sensibilizadores a la quimioterapia y la radiación y, como consecuencia, resultan útiles en el tratamiento de la enfermedad neoplásica.

Antecedentes del invento

La quimioterapia y la radioterapia tradicionales para el tratamiento de tumores tienen una utilidad limitada por la ausencia de una especificidad de diana. Para mejorar la especificidad biológica, se han intentado metodologías en que se emplea una radioterapia específica en la cual se conjugan radioisótopos con agentes buscadores de tumores. Desafortunadamente, se dispone de muy pocos agentes selectivos para los muchos tipos tumorales y, cuando existen agentes selectivos, la ventaja terapéutica ha resultado mínima. Metodologías recientes para tratar enfermedades neoplásicas intentan mejorar la especificidad empleando una clase de moléculas llamadas "sensibilizadores" que aumentan la sensibilidad de las células tratadas a, por ejemplo, la quimioterapia y la irradiación \gamma. Por ejemplo, se ha intentado la administración de fármacos tales como 5-fluorouracilo y wortmanina con objeto de aumentar la sensibilidad celular a la radiación. Sin embargo, debido a la naturaleza inespecífica de estos y otros "sensibilizadores" actualmente disponibles, las células normales, no neoplásicas, son sometidas a una sensibilidad aumentada a la quimioterapia y la radiación, lo que da lugar a un nivel elevado de toxicidad celular. Lo que se necesita urgentemente son sensibilizadores a la quimioterapia y la radiación que presenten una especificidad mejorada que permita una sensibilidad preferente de las células neoplásicas en comparación con la de las células normales. Los inhibidores de KIAA0175 del presente invento satisfacen éstas y otras necesidades relacionadas.

Sumario del invento

En una realización, el presente invento proporciona inhibidores de KIAA0175. Los inhibidores del invento incluyen, pero no se limitan a, moléculas antisentido, ribozimas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, proteínas o polipéptidos, así como moléculas pequeñas. Las moléculas antisentido ejemplares comprenden al menos 16, 17, 20 ó 25 nucleótidos consecutivos del ácido nucleico de la ID. SEC. nº 9 o se hibridan bajo condiciones rigurosas con dicho ácido nucleico. Son más preferidas las moléculas antisentido que comprenden al menos 25 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ID. SEC. nº 9 o que se hibridan bajo condiciones rigurosas con dicha secuencia. Las moléculas antisentido representativas se proporcionan aquí como ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3 e ID. SEC. nº 5.

En otras realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden uno o más inhibidores de KIAA0175 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Realizaciones adicionales proporcionan métodos para disminuir la expresión génica o la actividad biológica de KIAA0175.

Aún otras realizaciones proporcionan métodos para disminuir la expresión de p53 y métodos para disminuir la expresión de p21.

Otras realizaciones proporcionan métodos para aumentar la quimiosensibilidad y/o radiosensibilidad de una célula de mamífero, métodos para reducir los efectos secundarios de la terapia para el cáncer y de otros tipos de estreses asociados con la inducción de p53, y métodos para tratar la enfermedad neoplásica.

Cada uno de los métodos del presente invento tiene en común la administración de uno o más inhibidores de KIAA0175 del invento a una célula de mamífero.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama de diversas construcciones cebo de dos híbiridos de KIAA0175 en el vector plasmídico pBTM116/LexA y el vector plasmídico pAS2-1/Gal4BD.

Descripción detallada del invento

Como se indicó anteriormente, el presente invento se dirige, en general, a la regulación del ciclo celular y la muerte celular tras la exposición a agentes que causan daño al DNA. Más específicamente, el invento aquí descrito proporciona inhibidores de KIAA0175, incluyendo polinucleótidos antisentido y ribozimas, proteínas o polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, y moléculas pequeñas; composiciones que comprenden inhibidores de KIAA0175; métodos para reducir la activación y/o la expresión génica de p53 y/o p21; métodos para aumentar la sensibilidad de una célula de mamífero a la quimioterapia y/o la radiación; métodos para reducir los efectos secundarios de la terapia para el cáncer, así como métodos para tratar la enfermedad neoplásica. Cada uno de estos métodos tiene en común la administración de uno o más inhibidores de KIAA0175 a una célula de mamífero.

El supresor tumoral p53 es el gen más comúnmente mutado en el cáncer humano. En células normales bajo condiciones fisiológicas, p53 se expresa con niveles bajos y presenta una corta semivida. Cuando las células son estimuladas por cualquiera de una diversidad de estímulos que inducen estrés, tal como daño al DNA, hipoxia, pérdida de nucleótidos, infección vírica, activación de oncogenes, o factores que inducen la detención del ciclo celular y la muerte celular, p53 se estabiliza y se activa. Bajo tales condiciones, p53 actúa como "el guardián del genoma" al facilitar la estabilidad genómica que se alcanza por medio del frenado del crecimiento y la división celulares en una diversidad de puntos de control del ciclo celular.

Los eucariontes, desde la levadura hasta el hombre, han desarrollado mecanismos de vigilancia que responden al daño al DNA. En los mamíferos, este mecanismo de vigilancia incluye un punto de control, que afecta al gen mutado de la ataxia-telangiectasia (ATM; del inglés, ataxia telangiectasia mutated) y a los genes p53 y p21, que detiene a las células en la fase G1. Por ejemplo, cuando se exponen células a irradiación \gamma, p53 se vuelve un factor de transcripción activo que participa en la expresión de diversos genes, incluyendo el p21, que son importantes en la regulación del ciclo celular en el punto de control de las fases G1 a S [W. S. El-Deiry, Cancer Biology 8: 345-357 (1998); L. S. Cox et al., Bioessays 17: 501 (1995); C. J. Sherr, Science 274: 1672 (1996)].

La ataxia-telangiectasia (A-T) es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por ataxia cerebelosa progresiva, degeneración neuronal, hipersensibilidad a la radiación ionizante (IR; del inglés, ionizing radiation), y un elevado riesgo de cáncer. Los individuos aquejados de A-T presentan una sensibilidad aguda a la radiación ionizante y a productos químicos radiomiméticos, y sus puntos de control del ciclo celular no resultan activados después del tratamiento con estos agentes [K. Sadvitsky et al., Science 268: 1749 (1995)]. De este modo, por ejemplo, cuando se utiliza la supervivencia celular como un punto final, los fibroblastos y linfoblastos de pacientes aquejados de A-T son 3-4 veces más sensibles a la radiación ionizante que los de testigos de tipo silvestre [P. C. Chen et al., Nature 274: 484-486 (1978), y A. R. Lehman et al. en "Ataxia-Telangiectasia - A Cellular and Molecular Link between Cancer, Neurophathology and Immune Deficiency", páginas 347-353 (compilado por B. A. Bridges y D. G. Harnden, Wiley, New York, EE.UU., 1982]. Similarmente, las células de pacientes aquejados de A-T son también hipersensibles a agentes radiomiméticos tales como la neocarcinostatina y la bleomicina.

La A-T es causada por un defecto en el gen ATM, cuyo producto ha sido implicado tanto en la activación postraduccional como en la expresión aumentada de p53 [Banin et al., Science 281: 1674-1677 (1998); Canman et al., Science 281: 1677-1679 (1.998)]. ATM tiene un dominio relacionado con fosfoinositida 3-quinasa y una actividad proteína quinasa sensible a wortmanina [C. T. Keith et al., Science 270: 50 (1995)] y fosforila a p53 en un único resto de aminoácido, la serina 15, en respuesta a la irradiación \gamma. Las células de pacientes aquejados de A-T, como resultado de la ausencia de ATM, presentan una activación reducida y retardada de p53 en respuesta al daño al DNA, como es evidenciado por una fosforilación disminuida de p53 [M. B. Kastan et al., Cell 71: 587 (1992); X. Lu et al., Cell 75: 765 (1993); J. D. Siliciano et al., Genes Dev. 11: 3471 (1997); y S.-Y. Shieh et al., Cell 91: 325 (1997)]. La mutación de p53 en la serina 15 reduce la capacidad de p53 para detener el desarrollo celular [M. Fiscella et al., Oncogene 8: 1519 (1993)].

En su estado normal, no fosforilado, p53 se asocia con la proteína MDM2, que actúa como un regulador negativo de la estabilidad de p53 al dirigirla a la proteolisis [M. H. G. Kubbutat et al., Nature 387: 299-303 (1997); Y. Haupt et al., Nature 387: 296-299 (1997); y M. H. G. Kubbutat et al., Mol. Cell. Biol. 18: 5690-5698 (1998)]. La unión de MDM2 oculta además el dominio de transactivación de p53, bloqueando por ello los efectos dependientes de p53 en la inhibición del ciclo celular y en la apoptosis. Bajo condiciones de estrés celular, tal como la estimulación con irradiación \gamma, la fosforilación de la serina 15 reduce la afinidad ligante de p53 por MDM2, lo que evita la inhibición, mediada por MDM2, de la transcripción específica de p53 así como la degradación de p53 mediada por proteosomas. Ésta es la razón de que se haya sugerido que la fosforilación de p53 en la serina 15 es importante para la estabilidad genómica [J. Momand et al., Cell 69: 1237 (1992); J. D. Oliner et al., Nature 362: 857 (1993); Y. Haupt et al., Nature 387: 286 (1997); y M. H. G. Kubbutat et al., Nature 387: 299 (1997)].

La detención del ciclo celular en la fase G1 se produce, en parte, a través de la activación transcripcional de p21, un inhibidor intensamente ligante de quinasas dependientes de ciclina (Cdks; del inglés, cyclin-dependent kinases) que controlan la entrada en la fase S [J. Elledge et al., Trends Cell Biol. 6: 388 (1996)]. Se ha mostrado que la ausencia de actividad de p21 aumenta la sensibilidad celular a la radiación ionizante y retrasa el inicio de linfomas en ratones deficientes en ATM [Y. A. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 14.590-14.595 (1997)].

La transducción de señales de los puntos de control fue originalmente descrita en la levadura Saccharomyces cerevisiae [T. A. Weinert et al., Science 241: 317 (1988)]. Dos genes, MEC1 y RAD53, son esenciales en la regulación del punto de control de la levadura. Mec1 es un miembro de la superfamilia de la fosfatidilinositol quinasa y se cree que actúa como una proteína quinasa. Rad53 es una proteína quinasa que es fosforilada y activada en respuesta al daño al DNA. La fosforilación de Rad53 depende, inter alia, de Mec1, lo que indica que Rad53 actúa cadena abajo de Mec1 para transducir la señal del daño al DNA.

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La proteína Chk2 quinasa, reguladora del ciclo celular, ha sido identificada como el verdadero compuesto homólogo de Rad53 de Saccharomyces cerevisiae en mamíferos [S. Matsuoka et al., Science 282: 1893-1897 (1998)]. Como parte del presente invento, se halló que Rad53 es también homóloga de una secuencia de cDNA identificada por vez primera por T. Nagase et al. y a la que se hace referencia como KIAA0175 [DNA Research 3: 17-24 (1996)]. Estos autores observaron que KIAA0175 contiene una región de homología con la familia de serina-treonina proteína quinasas, en particular con la proteína quinasa p69Eg3 de Xenopus laevis.

Como aquí se describe, el gen KIAA0175 se expresa en una diversidad de tejidos, incluyendo el testículo, el timo, el colon, la placenta y el bazo. También se expresa KIAA0175 en diversas líneas de células cancerosas, tales como MOLT-4, HeLa, S3, K562, SW480, HL-60 y células Raji; véanse el Ejemplo 1 y las Figuras 1A-C.

El presente invento también describe que el producto proteico del gen KIAA0175 posee actividad de autofosforilación, actividad que depende, inter alia, de una resto de lisina en la posición 40 de los aminoácidos. De esta manera, por ejemplo, células Cos7 transfectadas con una construcción plasmídica que comprende KIAA0175 de tipo silvestre o KIAA0175 con una sustitución de lisina por alanina en la posición 40 (es decir, K40A), marcadas con HA, expresan la proteína KIAA0175 pero sólo la proteína de tipo silvestre conserva la actividad de autofosforilación según se determina por la incorporación de ^{32}P cuando la proteína inmunoprecipitada es incubada en presencia de \gamma-^{32}P-ATP; véanse el Ejemplo 2 y las Figuras 2A-B. También se observa que, después de la exposición de las células a irradiación \gamma o a hidroxiurea, aumentan los niveles tanto de la proteína KIAA0175 endógenamente expresada como de la proteína KIAA0175 recombinante (Figuras 3 y 4).

Sensibilizadores a la radiación

Las células defectuosas en ATM así como en otros miembros de la familia de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) implicados en la regulación de puntos de control del ciclo celular dependientes del daño al DNA, tales como ATR y DNA-PK, presentan hipersensibilidad a la radiación ionizante y a otros agentes que dañan el DNA. Se ha sugerido que inhibidores de una o más de estas quinasas podrían potenciar los efectos citotóxicos de la radiación ionizante o de fármacos quimioterapéuticos para el cáncer que dañan el DNA, al sensibilizar las células con respecto a estos agentes [J. N. Sarkaria et al., Cancer Res. 58: 4375-4382 (1998), e Y. Hosoi et al., Int. J. Cancer 78: 642-647 (1998)]. Esta sugerencia viene apoyada por la observación de que la wortmanina, un metabolito fúngico de tipo esterol, es un radiosensibilizador eficaz [S. B. Chernikova et al., Rad. Res. 151: 159-166 (1999); S. Boulton et al., Carcinogenesis (Lond.) 17: 2285-2290 (1996); B. D. Price et al., Cancer Res. 56: 246-250 (1996); y K. E. Rosenzweig et al., Clin. Cancer Res. 3: 1149-1156 (1997)]. La wortmanina inhibe irreversiblemente las actividades lípido quinasa de PI3Ks de mamífero por modificación covalente de un resto crítico de lisina en sus dominios fosfotransferasa [G. Powis et al., Cancer Res. 54: 2419-2423 (1994), y M. P. Wymann et al., Mol. Cell. Biol. 16: 1722-1733 (1996)].

Los radiosensibilizadores tradicionales, tal como el 5-fluorouracilo, al inihibir enzimas implicadas en el metabolismo, la síntesis y la reparación del DNA, o bien potencian el nivel del daño inicial causado al DNA por radiación, o bien impiden la reparación de las lesiones inducidas en el DNA por radiación (Sarkaria et al., supra). La citotoxicidad intrínseca asociada con la administración de tales fármacos limita su utilidad clínica como sensibilizadores a la radiación y a agentes quimioterapéuticos. Similarmente, puesto que la wortmanina actúa inespecíficamente al inhibir una gran variedad de proteínas relacionadas con PI3K, los riesgos asociados con los radiosensibilizadores y quimiosensibilizadores tradicionales también se pueden aplicar al uso de la wortmanina. Lo que se necesita en este campo técnico son inhibidores muy específicos de una proteína asociada con la ruta de señalización del daño al DNA y que esté implicada en la regulación del ciclo celular. El presente invento satisface esta necesidad al proporcionar inhibidores específicos de la expresión génica y/o la actividad biológica de KIAA0175. Dichos inhibidores suprimen la detención del ciclo celular y anulan la necesaria reparación del daño, dejando así las células vulnerables a la citotoxicidad de agentes perjudiciales para el DNA, tal como, por ejemplo, la radiación ionizante.

Los inhibidores de KIAA0175 son eficaces para reducir la expresión de los genes KIAA0175, p53 y p21

El presente invento proporciona inhibidores de KIAA0175. Los inhibidores del invento incluyen moléculas antisentido y ribozimas, proteínas o polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, así como moléculas pequeñas. Cada uno de estos inhibidores de KIAA0175 comparte la característica común de reducir la expresión y/o la actividad biológica de KIAA0175 y, en consecuencia, disminuir la expresión y/o la activación de p53 y/o p21. Además de los inhibidores ejemplares de KIAA0175 aquí descritos, se pueden obtener inhibidores alternativos por medio de una experimentación rutinaria en que se utilice la metodología específicamente aquí descrita o, de lo contrario, una metodología fácilmente asequible al técnico cualificado y acorde con su capacidad.

Moléculas antisentido y ribozimas

Como se discutió anteriormente, los inhibidores de KIAA0175 del presente invento incluyen moléculas antisentido que, cuando son administradas a células de mamífero, son eficaces para reducir, por ejemplo, los niveles proteicos intracelulares de p53 y/o p21. Las moléculas antisentido se unen a ácidos nucleicos, tales como mRNA o DNA, de un modo secuencialmente específico. Cuando se unen a un mRNA que tiene secuencias complementarias, las moléculas antisentido evitan la traducción del mRNA [véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.168.053, concedida a Altman et al.; la Patente de EE.UU. nº 5.190.931, concedida a Inouye; la Patente de EE.UU. nº 5.135.917, concedida a Burch; la Patente de EE.UU. nº 5.087.617, concedida a Smith; y Clusel et al., Nucl. Acids Res. 21: 3405-3411 (1993), en que se describen oligonucleótidos antisentido con forma de mancuerna].

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Se puede utilizar la tecnología antisentido para controlar la expresión génica a través de la formación de hélices triples, que activa la capacidad de la hélice doble para abrirse lo suficiente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras [véanse Gee et al. en Huber y Carr, "Molecular and Immunologic Approaches", Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, New York, EE.UU., 1994)]. Alternativamente, se puede diseñar una molécula antisentido para que se hibride con una región de control del gen KIAA0175, por ejemplo, un promotor, un potenciador o un sitio de inicio de la transcripción, y bloquee la transcripción del gen; o para bloquear la traducción al inhibir la unión de un transcrito a los ribosomas [véanse, de forma general, Hirashima et al. en Molecular Biology of RNA: New Perspectives (compilado por M. Inouye y B. S. Dudock, 1987, Academic Press, San Diego, página 401); Oligonucleotides: Anti-sense Inhibitors of Gene Expression (compilado por J. S. Cohen, 1989, MacMillan Press, Londres); Stein y Cheng, Science 261: 1004-1012 (1993); Documento WO 95/10607; Patente de EE.UU. nº 5.359.051; Documento WO 92/06693; y Documento EP-A2-612844, cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia].

En resumen, dichas moléculas se construyen para que sean complementarias de, y sean capaces de formar pares de bases de Watson-Crick con, una región de la secuencia transcrita de mRNA de KIAA0175. El ácido nucleico de doble cadena resultante interfiere en el subsiguiente procesamiento del mRNA, evitando de este modo la síntesis
proteica.

En general, para modular la expresión génica se puede utilizar una porción de una secuencia complementaria de la región de codificación de KIAA0175. La secuencia de ácido nucleico del cDNA de KIAA0175 humano es descrita por T. Nagase et al., DNA Research 3: 17-24 (1996), documento incorporado aquí por referencia, y se presenta aquí como ID. SEC. nº 9. Alternativamente, construcciones de cDNA que pueden ser transcritas en RNA antisentido pueden ser introducidas en células o tejidos para facilitar la producción de RNA antisentido. De este modo, como se utiliza aquí, la frase "moléculas antisentido" abarca, en términos generales, oligonucleótidos antisentido, sean sintetizados como moléculas de DNA o como moléculas de RNA, así como todas las construcciones plasmídicas que, cuando son introducidas en una célula de mamífero, activan la producción de moléculas de RNA antisentido. Como se describe aquí, una molécula antisentido puede ser utilizada para inhibir la expresión de los genes KIAA0175, p53 o p21 así como de cualquier otro gen que sea necesario para la expresión de KIAA0175.

Las moléculas antisentido para uso como el aquí descrito pueden ser sintetizadas mediante cualquier método conocido por quienes tienen experiencia en este campo técnico, incluyendo la síntesis química mediante, por ejemplo, la síntesis química de la fosforamidita en fase sólida (véanse, por ejemplo, el Documento WO 93/01286; la Patente de EE.UU. nº 6.043.090; la Patente de EE.UU. nº 5.218.088; la Patente de EE.UU. nº 5.175.269; y la Patente de EE.UU. nº 5.109,124, cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia). Alternativamente, se pueden generar moléculas de RNA mediante la transcripción in vitro o in vivo de secuencias de DNA que codifican el cDNA de KIAA0175, o de una porción de las mismas, con tal de que el DNA sea incorporado a un vector situado cadena abajo de un promotor adecuado de RNA polimerasa (tal como, por ejemplo, T3, T7 o SP6). Se pueden producir grandes cantidades de RNA antisentido al incubar nucleótidos marcados, en presencia de la RNA polimerasa apropiada, con un fragmento linealizado de cDNA de KIAA0175 situado cadena abajo de dicho promotor. Dichas moléculas antisentido tienen preferiblemente longitudes de al menos 16, 18 ó 20 nucleótidos, así como todas las longitudes intermedias entre ellas. Más preferiblemente, las moléculas antisentido tienen una longitud de al menos 25 nucleótidos. En otra realización del presente invento se proporcionan moléculas antisentido que tienen longitudes de al menos 30, 40, 50 ó 75 nucleótidos, así como todas las longitudes intermedias entre ellas. En ciertas realizaciones, una molécula antisentido del presente invento comprenderá una secuencia que es única con respecto a la secuencia de cDNA de KIAA0175 de ID. SEC. nº 9 o que se puede hibridar con el cDNA de ID. SEC. nº 9 bajo condiciones de alto rigor. Dentro del contexto del presente invento, "condiciones de alto rigor" significa condiciones de hibridación estándares tales como, por ejemplo, SSPE 5x y SDS al 0,5% a 65ºC, o su equivalente. Véanse, Sambrook et al., supra y Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, supra, incorporados aquí por referencia.

Los oligonucleótidos antisentido son típicamente diseñados para que resistan la degradación por enzimas nucleolíticas endógenas al utilizar enlaces tales como ésteres de fosforotioato, metilfosfonato, sulfona, sulfato, cetilo, fosforoditioato, fosforamidato, fosfato y otros enlaces similares [véanse, por ejemplo, Agrwal et al., Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrahedron Lett. 26: 2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12: 4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nuc. Acids. Res. 17 (12): 4863-4871 (1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40: 137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54: 367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14: 97-100 (1989); Stein en Oligodeoxynucleotides. Anti-sense Inhibitors of Gene Expression, compilado por Cohen, MacMillan Press, Londres, páginas 97-117 (1989); y Jager et al., Biochemistry 27: 7237-7246 (1988)]. Las posibles modificaciones adicionales o alternativas incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueadoras en los extremos 5' y/o 3' y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wibutosina, así como las formas acetílicas, metílicas y tio, y otras formas modificadas, de la adenina, la citidina, la guanina, la timina y la uridina.

Dentro de realizaciones alternas del presente invento, los inhibidores de KIAA0175 pueden ser ribozimas. Una ribozima es una molécula de RNA que escinde específicamente sustratos de RNA, tal como mRNA, para dar lugar a una inhibición o interferencia específicas con respecto a la expresión génica celular. Como se usa aquí, el término "ribozimas" incluye moléculas de RNA que contienen secuencias antisentido para reconocimiento específico, y una actividad enzimática que escinde RNA. La cadena catalítica escinde un sitio específico de un RNA diana en una concentración superior a la estequiométrica.

Dentro del contexto del presente invento se puede utilizar una gran variedad de ribozimas, incluyendo, por ejemplo, la ribozima de cabeza de martillo [como describen, por ejemplo, Forster y Symons, Cell 48: 211-220 (1987); Haseloff y Gerlach, Nature 328: 596-600 (1988); Walbot y Bruening, Nature 334: 196 (1988); y Haseloff y Gerlach, Nature 334: 585 (1988)], la ribozima de horquilla (como describen, por ejemplo, Haseloff et al., Patente de EE.UU. nº 5.254.678, concedida el 19 de Octubre de 1993, y Hempel et al., Publicación de Patente Europea nº 0.360.257, publicada el 26 de Marzo de 1990) y ribozimas basadas en RNA ribosómico de Tetrahymena (véase Cech et al., Patente de EE.UU. nº 4.987.071). Las ribozimas del presente invento consisten típicamente en RNA, pero también pueden estar compuestas de DNA, compuestos análogos de ácido nucleico (por ejemplo, fosforotioatos), o compuestos quiméricos de los mismos (por ejemplo, DNA/RNA/RNA).

Las ribozimas se pueden dirigir a cualquier transcrito de RNA y pueden escindir catalíticamente tales transcritos (véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.272.262; la Patente de EE.UU. nº 5.144.019; y las Patentes de EE.UU. números 5.168.053, 5.180.818, 5.116.742 y 5.093.246, concedidas a Cech et al.). De acuerdo con ciertas realizaciones del invento, se puede suministrar cualquiera de las citadas ribozimas específicas de mRNA de KIAA0175, o un ácido nucleico que codifica dicha ribozima, a una célula huésped para efectuar la inhibición de la expresión del gen KIAA0175. Por lo tanto, las ribozimas y demás pueden ser suministradas a las células huésped mediante un DNA que codifica la ribozima unido a un promotor eucariótico, tal como un promotor vírico eucariótico, para que, tras su introducción en el núcleo, la ribozima sea directamente transcrita.

Proteínas y Polipéptidos

Además de las ribozimas y moléculas antisentido aquí descritas supra, los inhibidores de KIAA0175 del presente invento también incluyen proteínas o polipéptidos que son eficaces en cuanto a reducir la expresión del gen KIAA0175 o a disminuir una o más de las actividades biológicas de KIAA0175. En este campo técnico se dispone fácilmente de una diversidad de métodos mediante los cuales el técnico cualificado puede, por medio de una experimentación rutinaria, identificar rápidamente dichos inhibidores de KIAA0175. El presente invento no está limitado por las siguientes metodologías ejemplares.

Como se discutió anteriormente, KIAA0175 es una proteína quinasa activa que posee actividad de autofosforilación. Por lo tanto, los inhibidores de las actividades biológicas de KIAA0175 abarcan aquellas proteínas y/o polipéptidos que interfieren en la actividad quinasa de KIAA0175. Dicha interferencia puede tener lugar a través de la interacción directa con el dominio quinasa de KIAA0175 o, indirectamente, a través de una inhibición no competitiva tal como por medio de la unión a un sitio alostérico. En consecuencia, los métodos asequibles para identificar proteínas y/o polipéptidos que se unen a KIAA0175 pueden ser empleados para identificar compuestos guía que, por medio de la metodología aquí descrita, véase infra, pueden ser caracterizados en cuanto a su actividad inhibidora de KIAA0175 y/o a su eficacia como sensibilizadores a la radiación.

El técnico cualificado dispone de una amplia recopilación bibliográfica en la que se describen métodos para detectar y analizar interacciones proteína-proteína [revisados por E. M. Phizicky et al., Microbiological Reviews 59: 94-123 (1995), documento incorporado aquí por referencia]. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, métodos físicos tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad para proteínas, transferencia de afinidad, inmunoprecipitación y entrecruzamiento, así como métodos basados en bancos, tales como, por ejemplo, sonda de proteínas, presentación en fagos y exploración de dos híbridos. Otros métodos que pueden ser empleados para identificar interacciones proteína-proteína incluyen métodos genéticos tales como el uso de supresores extragénicos, efectos letales sintéticos y falta de complementación no ligada. Los métodos ejemplares se describen más adelante con mayor detalle.

Los inhibidores de KIAA0175 del invento pueden ser identificados por medio de ensayos de exploración biológicos que se basan en la interacción directa entre la proteína KIAA0175 y un conjunto o banco de posibles proteínas inhibidoras. Por ejemplo, M. Vidal et al., Nucl. Acids Res. 27 (4): 919-929 (1999); R. M. Frederickson, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1): 90-6 (1998); R. K. Brachmann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (5): 561-568 (1997); y M. A. White, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 10.001-10.003 (1996), cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia, describen metodologías de exploración biológica que incluyen las diversas "tecnologías de n-híbridos".

La metodología de exploración de dos híbridos puede ser empleada para examinar nuevos o existentes bancos de cDNA de referencia en cuanto a proteínas ligantes de KIAA0175 que tienen propiedades inhibidoras. El sistema de dos híbridos es un método genético que detecta interacciones proteína-proteína en virtud de aumentos de la transcripción de genes informadores. El sistema se basa en el hecho de que activadores transcripcionales específicos del sitio tienen un dominio ligante de DNA y un dominio de activación transcripcional. El dominio ligante de DNA dirige el dominio de activación a los genes específicos que se van a expresar. A causa de la naturaleza modular de los activadores transcripcionales, el dominio ligante de DNA puede ser separado covalentemente del dominio de activación transcripcional sin pérdida de actividad de ningún dominio. Además, estos dos dominios pueden ser llevados en yuxtaposición por contactos proteína-proteína entre dos proteínas no relacionadas con la maquinaria transcripcional. De este modo, se construyen dos híbridos para crear un sistema funcional. El primer híbrido, es decir, el cebo, consiste en un dominio ligante de DNA activador de la transcripción, fusionado con una proteína de interés. El segundo híbrido, la diana, se crea por la fusión de un dominio de activación transcripcional con un banco de proteínas o polipéptidos. La interacción entre la proteína cebo y un miembro del banco diana da lugar a la yuxtaposición del dominio ligante de DNA y el dominio de activación transcripcional y a la consiguiente suprarregulación de la expresión de genes informadores.

El técnico cualificado dispone de una diversidad de sistemas basados en dos híbridos en que se emplean muy habitualmente el dominio ligante de DNA (BD; del inglés, binding domain) de Gal4 de levadura o LexA de E. coli y el dominio de activación transcripcional de Gal4 de levadura o VP16 del virus herpes símplex [C.-T. Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9578-9582 (1991); S. Dalton et al., Cell 68: 597-612 (1992); T. K. Durfee et al., Genes Dev. 7: 555-569 (1993); A. B. Vojtek et al., Cell 74: 205-214 (1993); y A. S. Zervos et al., Cell 72: 223-232 (1993)]. Los genes informadores habitualmente usados incluyen el gen lacZ de E. coli así como genes de levadura seleccionables tales como HIS3 y LEU2 [S. Fields et al., Nature (London) 340: 245-246 (1989); T. K. Durfee, supra; y A. S. Zervos, supra. En este campo técnico se dispone fácilmente de una gran variedad de bancos de dominios de activación, por lo que la exploración de proteínas interactivas puede ser llevada a cabo por medio de una experimentación rutinaria.

Las proteínas cebo adecuadas para la identificación de proteínas que interaccionan con KIAA0175 pueden ser diseñadas basándose en la secuencia de cDNA de KIAA0175, aquí presentada como ID. SEC. nº 9. Dichas proteínas cebo incluyen la proteína KIAA0175 de longitud completa y fragmentos de la misma. Por ejemplo, para la exploración de inhibidores que bloqueen la actividad de autofosforilación de KIAA0175, puede resultar ventajoso construir proteínas cebo que incluyan la lisina 40 y que abarquen aminoácidos flanqueadores de la misma que comprendan el dominio quinasa de la proteína. En la Figura 10 se representan proteínas cebo de KIAA0175 ejemplares, expresadas como LexA o Gal4BD. Las construcciones cebo representativas incluyen la región de codificación para el dominio quinasa de KIAA0175 (por ejemplo, las construcciones 2, 8 y 61 de LexA, así como las construcciones 24, 29 y 37 de Gal4BD). Además, cada una de las construcciones 44 y 54 de LexA y las construcciones 27 y 33 de Gal4BD lleva la sustitución de un único aminoácido en el dominio quinasa de K40A. En la Figura 10 también se representan construcciones cebo alternativas que codifican fragmentos polipeptídicos de KIAA0175 situados fuera del dominio quinasa (por ejemplo, las construcciones 14 y 19 de LexA, así como las construcciones 36 y 42 de Gal4BD).

El técnico dispone fácilmente de vectores plasmídicos, tales como, por ejemplo, pBTM116 y pAS2-1, para preparar construcciones cebo de KIAA0175 y bancos diana, vectores que pueden obtenerse de fuentes comerciales tales como, por ejemplo, Clontech (Palo Alto, California, EE.UU.), Invitrogen (Carlsbad, California, EE.UU.) y Stratagene (La Jolla, California, EE.UU.). Estos vectores plasmídicos permiten la fusión, en marco, de cDNAs con los dominios ligantes de DNA, tales como LexA y Gal4BD, respectivamente.

Los inhibidores de KIAA0175 del presente invento pueden ser alternativamente identificados por medio de uno de los métodos físicos o bioquímicos disponibles en la técnica para detectar interacciones proteína-proteína.

Por medio de la metodología de cromatografía de afinidad para proteínas, los compuestos guía que se van a examinar como posibles inhibidores de KIAA0175 pueden ser identificados en virtud de su retención específica por KIAA0175 cuando está covalente o no covalentemente copulada con una matriz sólida tal como, por ejemplo, glóbulos de Sepharose. Por ejemplo, S. Beeckmans et al., Eur. J. Biochem. 117: 527-535 (1981), y T. Formosa et al., Methods Enzymol. 208: 24-45 (1991), describen la preparación de columnas de afinidad para proteínas. Los lisados celulares que contienen el complemento completo de proteínas celulares pueden ser hechos pasar a través de la columna de afinidad de KIAA0175. Las proteínas que tienen una elevada afinidad por KIAA0175 quedarán específicamente retenidas bajo condiciones de baja salinidad, mientras que la mayoría de las proteínas celulares atravesarán la columna. Bajo condiciones de alta salinidad, con disolventes caotrópicos o con dodecilsulfato sódico (SDS; del inglés, sodium dodecyl sulfate), dichas proteínas de elevada afinidad pueden ser eluidas de la KIAA0175 inmovilizada. En ciertas realizaciones, se puede preferir radiomarcar las células antes de preparar el lisado, como una ayuda para identificar las proteínas que se unen específicamente a KIAA0175. Los métodos para radiomarcar células de mamífero son bien conocidos en la técnica y son proporcionados, por ejemplo, por M. Sopta et al., J. Biol. Chem. 260: 10.353-10.360 (1985).

Las proteínas KIAA0175 adecuadas para cromatografía de afinidad pueden ser fusionadas con una proteína o polipéptido para permitir una rápida purificación sobre una resina de afinidad apropiada. Por ejemplo, el cDNA de KIAA0175 puede ser fusionado con la región de codificación para glutatión S-transferasa (GST), lo que facilita la adsorción de proteínas de fusión a columnas de glutatión-agarosa [Smith et al., Gene 67: 31-40 (1988)]. Alternativamente, las proteínas de fusión pueden incluir proteína A, que puede ser purificada en columnas que llevan inmunoglobulina G; péptidos que contienen oligohistidina, que pueden ser purificados en columnas que llevan Ni^{2+}; la proteína ligante de maltosa, que puede ser purificada en resinas que contienen amilosa; y dihidrofolato reductasa, que puede ser purificada en columnas de metotrexato. Una etiqueta ejemplar adecuada para la preparación de proteínas de fusión de KIAA0175 que se presenta aquí es el epítopo de la hemaglutinina (HA) de influenzavirus, contra el cual se dispone fácilmente de anticuerpos monoclonales, pudiéndose preparar una columna de afinidad a partir de dichos anticuerpos.

En los casos en que los candidatos a inhibidores de KIAA0175 se dirigen contra el dominio quinasa de KIAA0175, puede resultar ventajoso fosforilar la proteína KIAA0175 antes de preparar la columna de afinidad. Como se describe en el Ejemplo 2, la KIAA0175 puede ser fosforilada cuando está inmovilizada sobre una superficie sólida. Las condiciones de fosforilación adecuadas incluyen ATP 10 \muM, DTT 1 mM, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 10 mM y Tris 50 mM, pH de 7,5.

Las proteínas que son específicamente retenidas por una columna de afinidad de KIAA0175 pueden ser identificadas tras ser sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE; del inglés, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). De esta manera, cuando las células son radiomarcadas antes de la preparación de los lisados celulares y del paso a través de la columna de afinidad de KIAA0175, las proteínas que tienen una elevada afinidad por KIAA0175 pueden ser detectadas mediante autorradiografía. La identidad de las proteínas que se unen específicamente a KIAA0175 puede ser determinada mediante técnicas de secuenciación de proteínas que son fácilmente asequibles al técnico cualificado, tales como las de C. K. Mathews et al., Biochemistry, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., páginas 166-170 (1990).

Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo

Los inhibidores de KIAA0175 del presente invento incluyen anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo que son eficaces para reducir la expresión génica y/o la actividad biológica de KIAA0175. Los anticuerpos adecuados pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o monoclonales humanizados. Los anticuerpos pueden ser obtenidos mediante una metodología convencional basada en hibridomas, a partir de antisueros aislados de animales a los que se ha inoculado KIAA0175, o por medio de la tecnología de DNA recombinante. Alternativamente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo del invento pueden ser identificados in vitro mediante el uso de uno o más de los bancos de presentación en fagos fácilmente asequibles. Aquí se describen métodos ejemplares.

En una realización del presente invento, los inhibidores de KIAA0175 son anticuerpos monoclonales que pueden ser producidos del modo siguiente. La proteína KIAA0175 puede ser producida, por ejemplo, mediante la expresión del cDNA de KIAA0175 en un sistema basado en baculovirus. Mediante este método, el cDNA de KIAA0175 o un fragmento del mismo es ligado a un vector plasmídico adecuado que es posteriormente utilizado para transfectar células Sf9 para facilitar la producción proteica. Además, puede resultar ventajoso incorporar una etiqueta epitópica u otro grupo para facilitar la purificación de la proteína KIAA0175 por afinidad. Se identifican, mediante, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay), los clones de células Sf9 que expresan KIAA0175, se preparan lisados, se purifica la proteína KIAA0175 por cromatografía de afinidad y se inyecta intraperitonealmente la proteína purificada a ratones BALB/c para provocar la producción de anticuerpos. Puede resultar ventajoso añadir un agente adyuvante, tal como el adyuvante de Freund, para aumentar la respuesta inmune resultante.

El suero es examinado en cuanto a la producción de anticuerpos específicos, y las células esplénicas de los animales que tienen un título positivo de anticuerpos específicos son utilizadas para fusiones celulares con células de mieloma, para generar clones de hibridoma. Los sobrenadantes procedentes de los clones de hibridoma son examinados en cuanto a la presencia de anticuerpos monoclonales que presentan especificidad contra KIAA0175. Para una descripción general de la metodología con anticuerpos monoclonales, véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

Además del sistema de expresión de baculovirus, se pueden emplear otros sistemas de expresión adecuados de bacterias o levaduras para la expresión de la proteína KIAA0175 o de polipéptidos del mismo. Como con el sistema de baculovirus, puede resultar ventajoso utilizar una de las etiquetas de afinidad comercialmente asequibles para facilitar la purificación antes de la inoculación a los animales. De este modo, el cDNA de KIAA0175 o un fragmento del mismo puede ser aislado mediante, por ejemplo, purificación en un gel de agarosa y ser ligado en marco con una etiqueta proteica adecuada tal como 6-His, glutatión-S-transferasa (GST) u otra de tales etiquetas de afinidad fácilmente asequibles [véase, por ejemplo, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, páginas 160-161 (compilado por B. R. Glick y J. J. Pasternak, 1998)].

En otras realizaciones del presente invento, los inhibidores de KIAA0175 son anticuerpos monoclonales anti-KIAA0175 humanizados. La frase "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo procedente de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo monoclonal de ratón. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede proceder de un anticuerpo quimérico que conserve o conserve sustancialmente las propiedades ligantes de antígeno del anticuerpo originario no humano pero que presente una inmunogenicidad disminuida con respecto al anticuerpo originario cuando se administra a seres humanos. Como se utiliza aquí, la frase "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una secuencia derivada de dos anticuerpos diferentes (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 4.816.567) que proceden típicamente de especies diferentes. Muy típicamente, los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpos humanos y murinos, generalmente regiones constantes humanas y regiones variables de ratón.

Puesto que los anticuerpos humanizados son mucho menos inmunogénicos en seres humanos que los anticuerpos monoclonales originarios de ratón, pueden ser utilizados para el tratamiento de seres humanos con mucho menos riesgo de anafilaxis. De esta manera, se pueden preferir estos anticuerpos en aplicaciones terapéuticas que impliquen la administración in vivo a un ser humano, tal como, por ejemplo, el uso como sensibilizadores a la radiación para el tratamiento de la enfermedad neoplásica o el uso en métodos para reducir los efectos secundarios de, por ejemplo, la terapia para el cáncer.

Los anticuerpos humanizados se pueden conseguir mediante una diversidad de métodos que incluyen, por ejemplo: (1) injertar las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs; del inglés, complementarity determining regions) no humanas en una región de entramado y una región constante humanas (un procedimiento al que se hace referencia en la técnica como "humanización") o, alternativamente, (2) trasplantar los dominios variables no humanos completos pero "encubriéndolos" con una superficie de tipo humano por sustitución de restos superficiales (un procedimiento al que se hace referencia en la técnica como "enchapado"). En el presente invento, los anticuerpos humanizados incluirán tanto anticuerpos "humanizados" como anticuerpos "enchapados". Estos métodos son descritos por, por ejemplo, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31 (3): 169-217 (1994); y C. A. Kettleborough et al., Protein Eng. 4 (7): 773-83 (1991), cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia.

La frase "región determinante de la complementariedad" se refiere a secuencias de aminoácidos que definen conjuntamente la afinidad y la especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio ligante inmunoglobulínico nativo; véanse, por ejemplo, Clothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); y Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Publicación del NIH nº 91-3242 (1991). La frase "región constante" se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. En el presente invento, regiones constantes de ratón son sustituidas por regiones constantes humanas. La regiones constantes de los anticuerpos humanizados objetivo proceden de inmunoglobulinas humanas. La región constante de cadena pesada puede ser seleccionada de entre cualquiera de los cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gamma y mu.

Un método para humanizar anticuerpos comprende alinear las secuencias de cadenas pesada y ligera no humanas con secuencias de cadenas pesada y ligera humanas, seleccionar y sustituir la región de entramado no humana por una región de entramado humana basándose en dicha alineación, realizar un modelado molecular para predecir la conformación de la secuencia humanizada y realizar una comparación con la conformación del anticuerpo originario. Este proceso va seguido de una retromutación repetida de restos en la región CDR que alteran la estructura de las CDRs hasta que la conformación prevista del modelo secuencial humanizado se aproxima fielmente a la conformación de las CDRs no humanas del anticuerpo no humano originario. Dichos anticuerpos humanizados pueden ser adicionalmente derivatizados para facilitar la incorporación y el aclaramiento a través de, por ejemplo, los receptores de Ashwell. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. números 5.530.101 y 5.585.089, patentes que se incorporan aquí por referencia.

Se apreciará que se pueden obtener fácilmente anticuerpos inhibidores de KIAA0175 alternativos mediante otros métodos comúnmente conocidos en la técnica. Una metodología ejemplar para identificar anticuerpos que presentan una elevada especificidad por KIAA0175 es la tecnología de presentación en fagos.

Por ejemplo, H. R. Hoogenboom et al., Immunotechnology 4 (1): 1-20 (1998); H. R. Hoogenboom, Trends Biotechnol. 15: 62-70 (1997); y B. McGuinness et al., Nature Bio. Technol. 14: 1149-1154 (1996), cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia, describen bancos de presentación en fagos para la producción de anticuerpos de alta afinidad. Entre las ventajas de la tecnología de presentación en fagos está la capacidad para aislar anticuerpos de origen humano que de otra manera no podrían ser fácilmente aislados mediante la tecnología convencional de hibridomas. Además, los anticuerpos de presentación en fagos pueden ser aislados in vitro sin depender del sistema inmune de un animal.

Pueden obtenerse bancos de presentación de anticuerpos en fagos mediante, por ejemplo, el método de McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990), que se incorpora aquí por referencia. En resumen, la secuencia de codificación de la región variable del anticuerpo es fusionada con el extremo amínico de una proteína menor (pIII) de cubierta del fago. La expresión de la construcción de fusión "región variable del anticuerpo-pIII" da lugar a la "presentación" del anticuerpo en la superficie del fago con el correspondiente material genético incluido dentro de la partícula de fago.

La proteína KIAA0175 adecuada para la exploración de un banco de fagos puede ser obtenida, por ejemplo, por expresión en células Sf9-baculovirus, como se describe supra. Alternativamente, la región de codificación de KIAA0175 puede ser multiplicada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) utilizando cebadores específicos para la región deseada de la proteína KIAA0175. Por ejemplo, cuando el inhibidor se dirige contra el dominio quinasa de KIAA0175, se pueden multiplicar fragmentos que codifican la secuencia de aminoácidos que flanquea la lisina 40 del sitio activo. Los cebadores de PCR ejemplares para la multiplicación de KIAA0175 incluyen, pero no se limitan a, los expuestos en las ID. SEC. números 7 y 8. Como se discutió anteriormente, la proteína KIAA0175 se puede expresar en E. coli o levadura como una fusión con una de las etiquetas de afinidad comercialmente asequibles.

La proteína de fusión resultante puede ser luego adsorbida por una matriz sólida, tal como, por ejemplo, una placa para cultivo tisular o un glóbulo. Los anticuerpos que se expresan en fagos y tienen las deseadas propiedades ligantes antiKIAA0175 pueden ser posteriormente aislados mediante sucesivas purificaciones por afinidad en placas de cultivo, en el caso de una matriz sólida, o mediante adsorción de afinidad a una columna con antígeno KIAA0175. El fago que tiene las deseadas actividades inhibidoras de KIAA0175 puede ser reintroducido en bacterias por infección y ser propagado mediante métodos estándares conocidos por los expertos en la técnica. Para una revisión de los métodos para explorar fagos con anticuerpos positivos-pIII, véase H. R. Hoogenboom, Trends Biotechnol., supra.

Moléculas pequeñas

El presente invento también proporciona inhibidores de KIAA0175 de molécula pequeña que pueden ser fácilmente identificados por medio de la aplicación rutinaria de metodologías de exploración de alto rendimiento (HTS; del inglés, high-throughput screening) [revisadas por A. Persidis, Nature Biotechnology 16: 488-489 (1998)]. Los métodos de HTS se refieren generalmente a aquellas tecnologías que permiten el examen rápido de compuestos guía, tales como moléculas pequeñas, en cuanto a su potencial terapéutico. En la metodología de HTS se emplean la manipulación automatizada de materiales de ensayo, la detección de señales positivas y la interpretación de datos. Dichas metodologías incluyen, por ejemplo, la tecnología de exploración automatizada usando moléculas solubles, así como sistemas de base celular tales como el sistema de dos híbridos anteriormente descrito con detalle.

Se dispone de una diversidad de métodos de HTS basados en líneas celulares, que se benefician de su facilidad de manipulación y de la relevancia clínica de las interacciones que tienen lugar en un contexto celular en lugar de en disolución. Los compuestos guía pueden ser identificados a través de la incorporación de radiactividad o por medio de ensayos ópticos que se basan en lecturas de absorbancia, fluorescencia o luminiscencia; véase, por ejemplo, J. E. Gonzalez et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9 (6): 624-631 (1998), incorporado aquí por referencia.

La metodología de HTS puede ser empleada, por ejemplo, para explorar compuestos guía que bloqueen una de las actividades biológicas de KIAA0175, tal como su actividad de autofosforilación. Mediante este método, la proteína KIAA0175 puede ser inmunoprecipitada de células que expresan la proteína y ser aplicada a los pocillos de una placa de ensayo adecuada para exploración automatizada. Se pueden poner luego los compuestos de ensayo individuales en contacto con la proteína inmunoprecipitada y se puede evaluar el efecto de cada compuesto de ensayo sobre la actividad quinasa de KIAA0175 mediante, por ejemplo, una incubación en presencia de \gamma-^{32}P-ATP en un sistema tampón adecuado (véase el Ejemplo 2) y la medición de la incorporación de ^{32}P.

Métodos para evaluar la eficacia de los inhibidores de KIAA0175

Las moléculas o compuestos guía, sean moléculas antisentido o ribozimas, proteínas y/o péptidos, anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo o moléculas pequeñas, que se identifican mediante uno de los métodos aquí descritos o, de lo contrario, por medio de técnicas que están disponibles en este campo técnico, pueden ser adicionalmente caracterizadas en cuanto a su capacidad para inhibir la expresión génica o la actividad biológica de KIAA0175, en una diversidad de sistemas de ensayo in vitro, ex vivo e in vivo con modelos animales. Como se discute con mayor detalle en los Ejemplos proporcionados más adelante, los inhibidores de KIAA0175 del presente invento son eficaces no sólo para reducir los niveles de expresión de KIAA0175 sino también, inter alia, para (1) disminuir los niveles intracelulares de la proteína p53 y/o la proteína p21 en la célula diana de mamífero; (2) reducir las transiciones de las fases del ciclo celular; y (3) aumentar el número de células para los sensibilizadores a la quimioterapia y/o la radiación. Por lo tanto, el presente invento describe además métodos que permiten al técnico cualificado evaluar el efecto de los candidatos a inhibidor sobre cada uno de estos tres parámetros.

Como se indicó anteriormente y se presenta en los Ejemplos aquí proporcionados supra, los candidatos a inhibidor de KIAA0175 pueden ser examinados mediante la administración a células que expresan KIAA0175 endógena o a las que se hace que expresen KIAA0175 por transfección de una célula de mamífero con una construcción plasmídica de KIAA0175 recombinante. Las líneas celulares adecuadas para este fin incluyen, por ejemplo, las líneas celulares HT1080 y HCT116, las cuales expresan niveles relativamente elevados de KIAA0175 endógena. Aunque aquí se describe específicamente la utilidad de estas líneas celulares, resultará evidente para quien tiene experiencia en la técnica que se pueden usar líneas celulares alternativas de acuerdo con las metodologías aquí descritas; la elección de dicha línea celular dependerá, por ejemplo, de la aplicación específica considerada.

Las moléculas inhibidoras de KIAA0175 eficaces serán eficaces para reducir los niveles de mRNA de KIAA0175, según se determinan, por ejemplo, mediante transferencia Northern o análisis por transcripción inversa-PCR. Véase el Ejemplo 4. Para una descripción general de estos procedimientos, véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989), y Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press (compilado por B. R. Glick y J. J. Pasternak, 1998), incorporados aquí por referencia. La eficacia de un candidato dado a molécula antisentido puede ser evaluada por comparación con una molécula antisentido testigo, conocida por no ejercer efecto sustancial alguno sobre la expresión de KIAA0175 cuando se administra a una célula de mamífero. Las moléculas testigo ejemplares incluyen los cebadores de AKT y FITC descritos en el Ejemplo 4.

Las supuestas moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175 pueden ser adicionalmente caracterizadas en cuanto a su efecto sobre los niveles de las proteínas p53 y p21 cuando se administran a una célula de mamífero. De este modo, por ejemplo, dichos candidatos moleculares pueden ser administrados a células HT1080 o HCT116. Después de un adecuado periodo de cultivo, las células transfectadas pueden ser adicionalmente estimuladas con irradiación \gamma. Los niveles proteicos celulares de p53 y p21 pueden ser evaluados antes de la irradiación o en diversos momentos después de la estimulación mediante, por ejemplo, un análisis Western en que se utilicen anticuerpos que tengan especificidad para cada una de estas proteínas. Véanse los Ejemplos 5 y 6 y, por ejemplo, Sambrook et al., supra. Se pueden analizar los niveles de una adecuada proteína testigo negativo, tal como Erk2, con objeto de verificar la especificidad de cada candidato a molécula antisentido inhibidora de KIAA0175. Las moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175 eficaces pueden causar una reducción en los niveles de la proteína p53 o la proteína p21, o en los de ambas. Además, las moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175 usadas como sensibilizadores a la radiación, véase infra, también reducirán el aumento de los niveles proteínicos de p53 y/o p21 inducidos por la irradiación \gamma.

En realizaciones alternativas del presente invento, el efecto de los inhibidores de KIAA0175 sobre la velocidad de síntesis de DNA después de la estimulación con una radiación o un agente quimioterapéutico puede ser evaluado, por ejemplo, mediante el método de Young y Painter [Hum. Genet. 82: 113-117 (1989)]. En resumen, células en cultivo pueden ser incubadas en presencia de ^{14}C-timidina antes de la exposición a, por ejemplo, rayos X. Inmediatamente después de la irradiación, las células son incubadas durante un corto periodo antes de la adición de ^{3}H-timidina. Las células son lavadas, tratadas con ácido perclórico y separadas por filtración (Whatman GF/C). Los filtros son enjuagados con ácido perclórico, alcohol al 70% y luego etanol al 100%. Se mide la radiactividad y se utilizan las relaciones ^{3}H/^{14}C resultantes para determinar las velocidades de síntesis de DNA.

Los inhibidores de KIAA0175 eficaces para reducir la expresión del gen KIAA0175 y/o los niveles proteicos de p21 o p53 mediante uno o más de los métodos anteriormente discutidos pueden ser adicionalmente caracterizados in vivo en cuanto a su eficacia en uno de los sistemas de modelos animales fácilmente disponibles. Los diversos sistemas de modelos animales para el estudio de genes asociados con el cáncer y la inestabilidad genética han sido recientemente sometidos a una revisión [L. A. Donehower, Cancer Surveys 29: 329-352 (1997)], incorporado aquí por referencia.

Mediante aún otras realizaciones, los inhibidores de KIAA0175 pueden ser identificados al evaluar el efecto de los candidatos a inhibidores sobre la detención del ciclo celular en respuesta a la irradiación \gamma, como aquí se describe infra en el Ejemplo 7.

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Inhibidores de KIAA0175 como sensibilizadores a la quimioterapia y la radiación

Como se discutió anteriormente, el presente invento proporciona inhibidores de KIAA0175 así como composiciones y métodos en que se emplean inhibidores de KIAA0175 que son útiles como sensibilizadores a la quimioterapia y la radiación para, inter alia, el tratamiento de la enfermedad neoplásica. Como se utiliza aquí, el término "sensibilizador" se refiere generalmente a la propiedad de una molécula o composición para provocar, en una célula, hipersensibilidad a un fármaco quimioterapéutico, a una radiación ionizante y/o a otros agentes que dañan al DNA. En los métodos ejemplares se emplean técnicas de distribución génica, como se describen con detalle infra, para administrar moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175 a células diana. Véase además el Ejemplo 8.

Los métodos aquí proporcionados comparten la característica común de que la hipersensibilización se lleva a cabo mediante la administración de uno o más inhibidores de KIAA0175. En cierta realizaciones, la hipersensibilidad a la quimioterapia y/o la radiación se alcanza mediante la administración de una molécula antisentido. En ciertas otras realizaciones, las moléculas antisentido sensibilizadoras a la quimioterapia y/o radiosensibilizadoras pueden ser ligadas a un promotor inducible por radiación, para localizar la expresión mediante haces de radiación externos. Véanse, por ejemplo, W. H. McBride et al., Nat. Med. 1: 1215-1217 (1995), y R. R. Weichselbaum et al., Cancer Res. 54: 4266-4269 (1994) (que describen la combinación de la distribución génica y la radiación como un paradigma para radioterapia). Mediante realizaciones alternas, la expresión de la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 puede ser limitada mediante el uso de un promotor específico del tejido o específico del ciclo celular [R. G. Vile et al., Cancer Res. 53: 962-967 (1993), y R. G. Vile, Semin. Cancer Biol. 5: 437-443 (1994) (que discuten la expresión génica dirigida, tumoralmente específica)]. En otras realizaciones del presente invento se emplean virus trópicos que se limitan a órganos o estructuras particulares. Cada uno de estos métodos ejemplares se incorpora aquí por referencia.

Mediante los métodos presentes se alcanzará una mejora beneficiosa de la quimioterapia y/o radioterapia a pesar de una baja eficacia de transfección y/o una expresión génica transitoria. Este será especialmente el caso cuando la metodología de distribución génica se repita a lo largo del curso de la terapia. Se espera que las eficacias de transfección sean del orden de 10% a 70%.

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Uso de inhibidores de KIAA0175 para reducir la gravedad de los efectos secundarios de la terapia para el cáncer

Los regímenes de tratamiento convencionales para el cáncer, incluyendo tanto la quimioterapia como la terapia con radiaciones, producen frecuentemente graves efectos secundarios que comprometen su eficacia. Estos efectos secundarios son el resultado, en parte, de la apoptosis de las células tratadas, mediada por p53. Por lo tanto, se ha sugerido que la supresión de la actividad de p53 puede ser eficaz para reducir la apoptosis y, como consecuencia, disminuir los graves efectos secundarios asociados con la terapia para el cáncer [P. G. Komarov et al., Science 285: 1733-1737 (1999), incorporado aquí por referencia].

Se han detectado niveles elevados de p53 en una diversidad de tejidos normales, incluyendo órganos linfoides y hematopoyéticos, epitelios intestinales, y testículos que son dañados por los tratamientos contra el cáncer [A. Rogel et al., Mol. Cell. Biol. 5: 2851 (1985); P. Schmidt et al., Development 113: 857 (1991); D. Schwartz et al., Oncogene 8: 1487 (1993); y E. A. Komarova et al., EMBO J. 16: 1391 (1997)]. Además, en estos tejidos sensibles tiene lugar una apoptosis dependiente de p53 poco después de la irradiación \gamma [Komarova, id.; J. H. Hendry et al., Int. J. Radiat. Biol. 70: 677 (1996); y V. A. Tron et al., Am. J. Pathol. 153: 579 (1998)]. Por lo tanto, se ha propuesto que p53 puede ser un objetivo apropiado para supresión terapéutica, reduciendo con ello el daño a las células normales [E. A. Komarova et al., Semin. Cancer Biol. 8: 389 (1998)].

Se ha descubierto, como parte del presente invento, que los inhibidores de KIAA0175 son eficaces para reducir los niveles intracelulares de la proteína p53. En consecuencia, los inhibidores de KIAA0175 pueden ser eficaces como fármacos para reducir los efectos secundarios de la terapia para el cáncer y de otros tipos de estrés asociados con la inducción de p53.

Mediante los métodos aquí proporcionados o mediante otros métodos adecuados asequibles en la técnica, se pueden identificar compuestos guía que sean eficaces para reducir los niveles de la proteína p53 cuando se administran a una célula de mamífero. Por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 5, se pueden administrar inhibidores de KIAA0175 a células HT1080 o HCT116 y se pueden evaluar los niveles resultantes de p53 mediante análisis Western utilizando anticuerpos específicos para p53. Los inhibidores de KIAA0175 que son eficaces para reducir los niveles de expresión de p53 pueden ser adicionalmente examinados, mediante el método de P. G. Komarov et al., supra, en un modelo convencional de apoptosis dependiente de p53, tal como la línea celular C8 de ratón [S. W. Lowe et al., Cell 74: 957 (1993), incorporado aquí por referencia (que describe la línea celular C8 como un fibroblasto embrionario de ratón, transformado con Ela+ras, que experimenta una rápida apoptosis dependiente de p53 en respuesta a una diversidad de tratamientos)].

La eficacia in vivo de los inhibidores de KIAA0175 que se han hallado activos a la hora de reducir la apoptosis celular mediada por p53 puede ser adicionalmente caracterizada en un adecuado sistema de modelo animal. Por ejemplo, se pueden tratar dos razas diferentes de ratón, es decir, C57BL y Balb/c, con dosis letales y subletales de irradiación \gamma al cuerpo entero después de la administración de uno o más inhibidores de KIAA0175 (véase P. G. Komarov et al., supra).

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Administración de inhibidores de KIAA0175 y composiciones de los mismos

El presente invento proporciona inhibidores de KIAA0175 y composiciones que comprenden uno o más inhibidores de KIAA0175, así como métodos mediante los que se emplean estos inhibidores del invento en aplicaciones in vivo, ex vivo e in vitro en que es ventajoso reducir o eliminar la expresión o actividad de KIAA0175 o de una molécula situada funcionalmente aguas abajo tal como p53 o p21. Como se indicó anteriormente, las composiciones basadas en inhibidores de KIAA0175 resultarán útiles en el tratamiento de la enfermedad neoplásica y de estados relacionados cuyos regímenes de tratamiento resultan mejorados por la hipersensibilidad de las células tumorales a la radiación. Alternativamente, los inhibidores de KIAA0175 pueden resultar útiles como fármacos para reducir los efectos secundarios de, por ejemplo, la terapéutica para el cáncer y de otros agentes que causan estrés celular y apoptosis mediadas por p53.

Para un tratamiento terapéutico, las composiciones se pueden administrar parenteral, tópica, oral o localmente. Preferiblemente, las composiciones se administran oral o parenteralmente, es decir, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica o intramuscularmente.

Las composiciones del invento incluirán uno o más inhibidores de KIAA0175 y pueden comprender además un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Se puede utilizar una diversidad de vehículos acuosos, tales como, por ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,4%, glicocola al 0,3% y similares, vehículos que pueden incluir otras proteínas para potenciar la estabilidad, tales como albúmina, lipoproteína, globulina, etc., sometidas a suaves modificaciones químicas o similares.

Los inhibidores del presente invento pueden ser combinados con inhibidores adicionales o alternativos de, por ejemplo, ATM, DNA-PK o ATR, para conseguir unos niveles aún mayores de hipersensibilidad a la radiación. Véase, por ejemplo, Westpahl et al., Nat. Genet. 16: 397 (1997), incorporado aquí por referencia.

Los inhibidores de KIAA0175 útiles como sensibilizadores a la radiación o, de lo contrario, útiles en el tratamiento de enfermedades de mamíferos a menudo se prepararán sustancialmente exentos de otras inmunoglobulinas presentes en la naturaleza u otras moléculas biológicas. Los inhibidores de KIAA0175 preferidos también presentarán una toxicidad mínima cuando se administren a un mamífero.

Las composiciones del invento pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las disoluciones resultantes pueden ser envasadas para su uso o ser filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, combinándose la preparación liofilizada con una disolución estéril antes de la administración. Si es preciso, para que se aproximen a las condiciones fisiológicas, las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tales como agentes para ajustar y tamponar el pH, agentes para ajustar la tonicidad, y similares, tales como, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico y estabilizadores (por ejemplo, maltosa al 1-20%, etc.).

La selección del método apropiado para administrar inhibidores de KIAA0175 del presente invento dependerá de la naturaleza de la aplicación concebida así como de la naturaleza del inhibidor de KIAA0175. De este modo, por ejemplo, la metodología precisa para administrar un inhibidor de KIAA0175 dependerá de si es una molécula antisentido, una proteína y/o un péptido, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, o una molécula pequeña. Otras consideraciones incluyen, por ejemplo, si el inhibidor de KIAA0175 será utilizado para aumentar la hipersensibilidad a la radiación o para reducir los efectos secundarios de la terapéutica para el cáncer.

En la técnica se dispone de una diversidad de métodos para la administración de moléculas antisentido. Los métodos ejemplares incluyen técnicas de distribución génica, incluyendo métodos de base vírica y base no vírica, así como métodos de distribución mediada por liposomas.

Las metodologías de distribución génica serán eficaces, por ejemplo, para sensibilizar las células tumorales a la irradiación y/o los fármacos quimioterapéuticos. Véase T. E. Wheldon et al., Radiother. Oncol. 48 (1): 5-13 (1998) (metodologías de distribución génica para potenciación de la radioterapia fraccionada). Mediante estas metodologías, se puede alcanzar un sustancial beneficio terapéutico a pesar de eficacias de transfección significativamente inferiores al 100%, retención transitoria del inhibidor transfectado y/o existencia de una subpoblación de células diana refractarias a la terapia.

Como se discutió anteriormente, la limitación de la radioterapia convencional es que su especificidad tumoral es baja. Esta limitación puede ser superada mediante el enfoque directo de la expresión de inhibidores de KIAA0175 antisentido a células tumorales. Esto puede ser llevado a cabo, por ejemplo, uniendo el gen del inhibidor de KIAA0175 a un promotor inducible por radiación para que la terapia génica pueda ser localizada mediante haces de radiación externos [W. H. McBride et al., Nat. Med. 1: 1215-1217 (1995), y R. R. Weichselbaum et al., Lancet Suppl. II: S10-S12 (1997), cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia].

Alternativamente, se puede utilizar la metodología de distribución génica para eliminar directamente la KIAA0175 endógena de las células tumorales, haciendo por ello que las células tumorales sean hipersensibles a la radiación y a los fármacos quimioterapéuticos. Por ejemplo, el gen KIAA0175 puede ser focalizado por transfección con un vector para distribución génica que lleva un inhibidor de KIAA0175. La transfección preferente de, o la expresión preferente en, las células tumorales puede ser llevada a cabo por medio del uso de un promotor específico del tejido o específico del ciclo celular, tal como, por ejemplo, promotores para el antígeno específico de la próstata o para genes inmunoglobulínicos [R. G. Vile et al., Cancer Res. 53: 962-967 (1993), y R. G. Vile, Semin. Cancer Biol. 5: 437-443 (1994)], o por medio del uso de virus trópicos que se limitan a órganos o estructuras particulares, tal como, por ejemplo, una replicación selectiva y un virus neurotrópico que sólo puede infectar células en proliferación del sistema nervioso central.

De este modo, para conseguir un beneficio terapéutico, se debería inhibir preferentemente la KIAA0175 de las células tumorales. Esto puede ser llevado a cabo transfectando con un gen que expresa un inhibidor de KIAA0175, una molécula antisentido de KIAA0175, un represor específico del gen KIAA0175, o un inhibidor del producto proteico del gen KIAA0175.

Como se usa aquí, la frase "vector para distribución génica" se refiere generalmente a una construcción de ácido nucleico que lleva y, en ciertas realizaciones, es capaz de dirigir la expresión de, una molécula antisentido de interés, como se describe en, por ejemplo, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, Capítulo 21, páginas 555-590 (compilado por B. P. Glick y J. J. Pasternak, 2ª edición, 1998); Jolly, Cancer Gene Ther. 1: 51-64 (1994); Kimura, Human Gene Ther. 5: 845-852 (1994); Conelly, Human Gene Ther. 6: 185-193 (1995); y Kaplitt, Nat. Gen. 6: 148-153 (1994).

Se ha descrito un número de sistemas de vectores para distribución génica basados en virus y no basados en virus, que son adecuados para la administración de inhibidores de KIAA0175. Los sistemas para distribución génica basados en virus incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina de Moloney, espumavirus y lentivirus; adenovirus; virus adenoasociados; y sistemas de vectores de virus herpes símplex. Los virus de cada tipo son fácilmente asequibles de depósitos o colecciones tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo [ATCC (del inglés, American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU.)] o pueden ser aislados de fuentes conocidas utilizando materiales y técnicas comúnmente asequibles.

Para los sistemas de vectores para distribución génica del presente invento se hallarán aplicaciones en regímenes terapéuticos tanto in vivo como ex vivo. Cada una de estas aplicaciones se describe más adelante con mayor detalle.

1. Sistemas de vectores retrovíricos para distribución génica

En un aspecto del presente invento, se proporcionan vectores retrovíricos para distribución génica que se construyen para que lleven o expresen una molécula antisentido inhibidora de KIAA0175. Como se usa aquí, la expresión "molécula antisentido inhibidora de KIAA0175" se refiere generalmente a una secuencia de ácido nucleico que tiene actividad inhibidora de KIAA0175. Más específicamente, dichas moléculas antisentido reducirán la expresión del gen KIAA0175 así como los niveles proteicos de p53 y/o p21. Los vectores retrovíricos para distribución génica del presente invento pueden ser fácilmente construidos a partir de una gran variedad de retrovirus, incluyendo, por ejemplo, los retrovirus de los tipos B, C y D así como espumavirus y lentivirus. Véase RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory (2ª edición, 1985).

Cualquiera de los anteriores retrovirus puede ser fácilmente usado con objeto de ensamblar o construir vectores retrovíricos para distribución génica utilizando la descripción aquí proporcionada y técnicas de DNA recombinante estándares. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2ª edición, 1989), y Kunkle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488 (1985). Además, en ciertas realizaciones del invento, porciones de los vectores retrovíricos para distribución génica pueden proceder de retrovirus diferentes.

Un vector retrovírico adecuado para la expresión de una molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 debe incluir al menos un promotor/potenciador transcripcional o un locus que defina elemento(s), u otros elementos que controlen la expresión génica por otros medios, tales como corte y empalme ("splicing") alternativos, exportación de RNA nuclear, modificación postraduccional del mensajero, o modificación postranscripcional de la proteína. Dichas construcciones vectoriales deben también incluir una señal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTRs; del inglés, long terminal repeat) o porciones de las mismas, y sitios ligantes de cebadores de cadenas positivas y negativas apropiados para el retrovirus utilizado (si estos no están ya presentes en el vector retrovírico). Opcionalmente, el vector retrovírico puede incluir además una señal que dirija la poliadenilación, marcadores seleccionables tales como resistencia a la neomicina, TK, resistencia a la higromicina, resistencia a la fleomicina, resistencia al histidinol, o DHFR, así como uno o más sitios de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. En un aspecto del presente invento, se proporcionan construcciones vectoriales retrovíricas para distribución génica que comprenden una LTR 5', un sitio de unión a tRNA, una señal de empaquetamiento, una o más secuencias heterólogas, un origen de síntesis del DNA de la segunda cadena, y una LTR 3', contrucción vectorial que carece de las secuencias de codificación de gag/pol o env.

Asimismo, dentro del contexto del presente invento se pueden utilizar otros vectores retrovíricos para distribución génica que incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos siguientes, cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia: EP 0.415.731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de EE.UU. nº 5.219.740; WO 93/11230; WO 93/10218; Vile et al., Cancer Res. 53: 3860-3864 (1993); Vile et al., Cancer Res. 53: 962-967 (1993); Ram et al., Cancer Res. 53: 83-88 (1993); Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33: 493-503 (1992); Baba et al., J. Neurosurg. 79: 729-735 (1993); Patente de EE.UU. nº 4.777.127; y Documentos GB 2.200.651; EP 0.345.242; y WO 91/02805.

Se pueden preparar fácilmente líneas celulares empaquetadoras adecuadas para uso con las construcciones vectoriales retrovíricas para distribución génica anteriormente descritas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. números 5.716.832 y 5.591.624. Estas líneas celulares empaquetadoras pueden ser usadas para crear líneas celulares productoras [también denominadas líneas celulares vectoriales o "VCLs" (del inglés, vector cell lines) para la producción de partículas vectoriales recombinantes. Puede resultar preferido utilizar líneas celulares empaquetadoras creadas a partir de líneas celulares originarias humanas (por ejemplo, células HT1080) o de visón, lo que permite la producción de retrovirus recombinantes que evitan la inactivación en el suero humano.

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2. Sistemas vectoriales de virus adenoasociados para distribución génica

Los virus adenoasociados (AAV; del inglés, adeno-associated viruses) poseen diversas cualidades que les hacen particularmente adecuados, en general, para el desarrollo de vectores para distribución génica y, en particular, para la distribución de polinucleótidos que codifican moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175. Para una revisión general de sistemas de expresión de AAV, véase Rabinowitz et al., Current Opin. Biotech. 9 (5): 470-475 (1998). El AAV es un parvovirus humano defectuoso, no patógeno, que no es infectivo sin un adenovirus o herpesvirus auxiliar. Por lo tanto, en ausencia de un virus auxiliar, el AAV llega a integrarse latentemente en el genoma del huésped. Además, el AAV tiene la ventaja con respecto a los retrovirus, anteriormente discutidos, de ser capaz de transducir una gran variedad de tipos celulares que estén tanto en división como en reposo.

Para dirigir la expresión de una o más moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175, se puede utilizar una diversidad de vectores de AAV para distribución génica. Los ejemplos representativos de dichos vectores incluyen los vectores de AAV descritos por Srivastava en el Documento WO 93/09239; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-3828 (1989); Mendelson et al., Virol. 166: 154-165 (1988); y Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22): 10.613-10.617 (1993), incorporados aquí por referencia.

En resumen, un vector de AAV para distribución génica del presente invento puede incluir, en orden, una repetición terminal invertida (ITR; del inglés, inverted terminal repeat) 5' de virus adenoasociado; un polinucleótido que codifica la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175; una secuencia operativamente ligada a la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175, que regula su expresión en un tejido, órgano o célula diana; y una repetición terminal invertida 3' de virus adenoasociado. Una secuencia reguladora adecuada para la expresión de la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 es, por ejemplo, la secuencia potenciadora/promotora de citomegalovirus (CMV). Además, el vector de AAV puede tener preferiblemente una secuencia de poliadenilación tal como la secuencia de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento (BGH; del inglés, bovine growth hormone).

Generalmente, los vectores de AAV deberían tener una copia de la ITR de AAV en cada extremo de la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175, para permitir la replicación, el empaquetamiento, la integración eficaz en el genoma de la célula huésped y el rescate a partir del cromosoma. La secuencia de la ITR 5' consiste en los nucleótidos 1 a 145 del extremo 5' del genoma de DNA del AAV, y la ITR 3' incluye los nucleótidos 4681 a 4536 del genoma del AAV. Preferiblemente, el vector de AAV también puede incluir al menos 10 nucleótidos después del extremo de la ITR (es decir, una porción de la llamada "región D").

El empaquetamiento óptimo de un vector de virus adenoasociado para distribución génica requiere que las ITRs 5' y 3' estén separadas por aproximadamente 2-5 kb. Sin embargo, resultará evidente que el espaciamiento ideal entre secuencias ITR variara dependiendo del sistema de empaquetamiento concreto utilizado. Este espaciamiento puede ser alcanzado al incorporar un fragmento polinucleotídico de "relleno" o "carga" que lleve el tamaño total de la secuencia de ácido nucleico situada entre las dos ITRs a un valor de entre 2 y 5 kb. De este modo, cuando la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 tiene un tamaño inferior a 2-5 kb, se puede incorporar un polinucleótido no codificante de relleno situado, por ejemplo, 3' con respecto a la secuencia ITR 5', y 5' con respecto a la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175. La secuencia nucleotídica exacta del fragmento de relleno no es un elemento esencial de la construcción final.

Dependiendo de la aplicación precisa considerada, en lugar de incorporar un fragmento de relleno se pueden insertar múltiples copias de la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 para, inter alia, conseguir el espaciado óptimo de las secuencias ITR. Puede resultar preferido organizar los polinucleótidos como dos o más unidades de transcripción separadas, cada una con su propio promotor y su propia señal de poliadenilación.

Se pueden generar vectores de AAV recombinantes del presente invento a partir de una diversidad de virus adenoasociados, incluyendo, por ejemplo, los serotipos 1 a 6. Por ejemplo, se espera que las ITRS de cualquier serotipo de AAV tengan estructuras y funciones similares con respecto a los mecanismos de replicación, integración, escisión y transcripción.

En ciertas realizaciones del invento, la expresión de la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 puede ser llevada a cabo por un promotor distinto (por ejemplo, un promotor vírico). A este respecto, los ejemplos representativos de promotores adecuados incluyen un promotor de CMV, un promotor de RSV, un promotor de SV40 o un promotor de MoMLV. Otros promotores que pueden ser similarmente utilizados en el contexto del presente invento incluyen promotores específicos de células o tejidos y promotores inducibles. Los promotores inducibles representativos incluyen promotores de respuesta a tetraciclina (por ejemplo, el promotor "Tet"), como describen Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 89: 5547-5551 (1992); Gossen et al., Science 268: 1766-1769 (1995); Baron et al., Nucl. Acids Res. 25: 2723-2729 (1997); Blau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 797-799 (1999); Bohl et al., Blood 92: 1512-1517 (1998); y Haberman et al., Gene Therapy 5: 1604-1611 (1998); el sistema promotor de ecdisona, como describen No et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 93: 3346-3351 (1996); y otros promotores o sistemas promotores regulados, como describen Rivera et al., Nat. Med. 2: 1028-1032 (1996).

El vector de AAV para distribución génica puede también contener secuencias adicionales de, por ejemplo, un adenovirus, que ayuden al vector a efectuar una función deseada. Dichas secuencias incluyen, por ejemplo, las que ayudan al empaquetamiento del vector de AAV para distribución génica en partículas de adenovirus.

Dadas las técnicas fácilmente disponibles, se pueden preparar rutinariamente líneas celulares empaquetadoras adecuadas para producir vectores víricos adenoasociados. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.872.005, incorporada aquí por referencia. Como mínimo, los sistemas empaquetadores adecuados para sistemas de AAV para distribución génica del presente invento incluirán los genes de la replicación y la cápsida del AAV.

Las líneas celulares empaquetadoras preferidas pueden contener tanto un virus auxiliar de AAV como un vector de AAV para distribución génica que contenga la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175. Para descripciones detalladas de sistemas representativos de líneas celulares empaquetadoras, véanse, por ejemplo, C. Holscher et al., J. Virol. 68: 7169-7177 (1994); K. R. Clark et al., Hum. Gene Ther. 6: 1329-1341 (1995); y K. Tamayosa et al., Hum. Gen. Ther. 7: 507-513 (1996), que se incorporan aquí por referencia.

Alternativamente, el empaquetamiento del AAV puede ser llevado a cabo in vitro, en un sistema exento de células, para obviar los protocolos de transfección o las líneas celulares empaquetadoras. Dichos sistemas in vitro llevan incorporado un vector de AAV para distribución génica que contiene la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 y una fuente de proteína Rep, proteína de cápsida y proteínas de adenovirus que proporcionan funciones auxiliares víricas. Las últimas proteínas se proporcionan típicamente en forma de extracto celular. L. Ding et al., Gen. Ther. 4: 1167-1172 (1997), y Z. Zhou et al., J. Virol. 72: 3241-3247 (1998), que se incorporan aquí por referencia, describen adicionalmente sistemas in vitro representativos.

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3. Otros sistemas vectoriales víricos para distribución génica

Además de los vectores retrovíricos y los vectores basados en virus adenoasociados, para la expresión de moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175 también se pueden utilizar otros numerosos sistemas vectoriales víricos para distribución génica. Por ejemplo, en una realización del invento se pueden emplear vectores adenovíricos. Los ejemplos representativos de dichos vectores incluyen los descritos, por ejemplo, por Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Documento WO 93/9191; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (1): 215-219 (1994); Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 90 (24): 11.498-502 (1993); Guzman et al., Circulation 88 (6): 2838-48 (1993); Guzman et al., Cir. Res. 73 (6): 1202-1207 (1993); Zabner et al., Cell 75 (2): 207-216 (1993); Li et al., Hum. Gene Ther. 4 (4): 403-409 (1993); Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5 (10): 1287-1291 (1993); Vincent et al., Nat. Genet. 5 (2): 130-134 (1993); Jaffe et al., Nat. Genet. 1 (5): 372-378 (1992); y Levrero et al., Gene 101 (2): 195-202 (1991); y los Documentos WO 93/07283, WO 93/06223 y WO 93/07282.

Los vectores para distribución génica del presente invento también incluyen vectores de herpesvirus. Los ejemplos representativos de dichos vectores incluyen los descritos por Kit en Adv. Exp. Med. Biol. 215: 219-236 (1989), y los descritos en la Patente de EE.UU. nº 5.288.641 y en el Documento EP 0176170 (Roizman). Vectores ejemplares adicionales del virus herpes simplex incluyen HFEM/ICP6-LacZ, descrito en el Documento WO 95/04139 (Wistar Institute); pHSVlac, descrito por Geller, Science 241: 1667-1669 (1988), y en los Documentos WO 90/09441 y WO 92/07945; HSV Us3::pgC-lacZ, descrito por Fink, Human Gene Therapy 3: 11-19 (1992); y HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4, descritos en el Documento EP 0453242 (Breakefield), y los depositados en la ATCC con los números de acceso ATCC VR-977 y ATCC VR-260.

También se pueden generar vectores para distribución génica a partir de una gran variedad de otros virus que incluyen, por ejemplo, poliovirus [Evans et al. Nature 339: 385-388 (1989); y Sabin, J. Biol. Standardization 1: 115-118 (1973)]; rinovirus; poxvirus, tal como el poxvirus del canario o el virus vaccinia [Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 317-321 (1989); Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103 (1989); Flexner et al., Vaccine 8: 17-21 (1990); Patentes de EE.UU. números 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; y Documento WO 89/01973]; SV40 [Mulligan et al., Nature 277: 108-114 (1979)]; influenzavirus [Luytjes et al., Cell 59: 1107-1113 (1989); McMicheal et al., N. Eng. J. Med. 309: 13-17 (1983); y Yap et al., Nature 273: 238-239 (1978)]; HIV [Poznansky, J. Virol. 65: 532-536 (1991)]; virus del sarampión (Documento EP O.440.219); astrovirus [Munroe et al., J. Vir. 67: 3611-3614 (1993)]; y coronavirus, así como otros sistemas víricos (por ejemplo, Documentos EP 0.440.219 y WO 92/06693, y Patente de EE.UU. nº 5.166.057).

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4. Vectores para distribución génica no víricos

Otros métodos y vectores para distribución génica que se pueden emplear para la expresión de moléculas antisentido inhibidoras de KIAA0175 incluyen, por ejemplo, vectores de expresión de ácido nucleico; DNA condensado policatiónico unido o no unido a un único adenovirus muerto [véase, por ejemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992)]; DNA unido a ligando [véase, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem. 264: 16.985-16.987 (1989)]; vectores de células eucarióticas para distribución; depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizado; pistola de partículas, de mano, para distribución génica, como se describe en la Patente de EE.UU. nº 5.149.655; radiación ionizante, como se describe en los Documentos U.S. 5.206.152 y WO 92/11033; neutralización de carga nucleica; y fusión con membranas celulares. Philip, Mol. Cell Biol. 14: 2411-2418 (1994), y Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 1581-1585 (1994), describen procedimientos adicionales.

Se puede emplear la distribución génica mediada por partículas. En resumen, la molécula antisentido inhibidora de KIAA0175 de interés puede ser insertada en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para una expresión de alto nivel y ser luego incubada con moléculas sintéticas para distribución génica tales como cationes polímeros ligantes de DNA, tales como polilisina, protamina y albúmina, unidos a ligandos que se dirigen a células, tales como asialoorosomucoide, como describen Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987), insulina, como describe Hucked, Biochem. Pharmacol. 40: 253-263 (1990), galactosa, como describe Planck, Bioconjugate Chem. 3: 533-539 (1992), lactosa y transferrina.

También se puede emplear DNA desnudo. En el Documento WO 90/11092 y la Patente de EE.UU. nº 5.580.859 se describen métodos ejemplares para la introducción de DNA desnudo. La eficacia de incorporación puede ser mejorada usando glóbulos de látex biodegradable. Los glóbulos de látex revestidos con DNA son eficazmente transportados a células tras la iniciación de la endocitosis por los glóbulos. El método puede ser adicionalmente mejorado mediante el tratamiento de los glóbulos para aumentar su hidrofobia y, de este modo, facilitar la ruptura del endosoma y la liberación del DNA en el citoplasma.

En la Patente de EE.UU. nº 5.422.120, las Publicaciones de Patente PCT números WO 95/13796, WO 94/23697 y WO 91/144445, y la Publicación de Patente Europea nº 524.968 se describen liposomas que pueden actuar como vehículos para distribución génica. Se pueden insertar secuencias de ácido nucleico en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para una expresión de alto nivel y se pueden luego incubar con moléculas sintéticas para distribución génica tales como cationes polímeros ligantes de DNA, tales como polilisina, protamina y albúmina, unidos a ligandos que se dirigen a células, tales como asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa y transferrina. Otros sistemas de distribución incluyen el uso de liposomas para encapsular un DNA que comprende el gen bajo el control de una diversidad de promotores tisularmente específicos o ubicuamente activos. Otra distribución no vírica adecuada para uso incluye sistemas de distribución mecánicos, tal como el procedimiento descrito por Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (24): 11581-11585 (1994). Además, la secuencia de codificación y el producto de expresión del mismo pueden ser distribuidos por medio del depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizado.

Los vehículos liposómicos y policatiónicos para distribución génica ejemplares son los descritos en las Patentes de EE.UU. n^{os} 5.422.120 y 4.762.915, en las Publicaciones de Patente PCT n^{os} WO 95/13796, WO 94/23697 y WO 91/14445, en la Publicación de Patente Europea nº 524.968, y por Starrier, Biochemistry, páginas 236-240 (1975), W. H. Freeman, San Francisco; Shokai, Biochem. Biophys. Acta 600: 1 (1980); Bayer, Biochem. Biophys. Acta 550: 464 (1979); Rivet, Methods Enzymol. 149: 119 (1987); Wang, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7851 (1987); y Plant, Anal. Biochem. 176: 420 (1989).

Como se utiliza aquí, "cantidad terapéuticamente eficaz" es la cantidad precisa de las composiciones del presente invento que se van a administrar, y puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, tipo y tamaño del tumor, o extensión de la metástasis, y estado del paciente. En general, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los inhibidores objetivo es terapéuticamente eficaz cuando se alcanza cualquier efecto de los inhibidores aquí descritos (por ejemplo, la inhibición de los niveles de expresión de KIAA0175, de p53, p21 u otras moléculas situadas corriente abajo de KIAA0175), cuando se alcanza la deseada sensibilización de las células tumorales a la irradiación o a fármacos quimioterapéuticos, y/o cuando se reducen los efectos secundarios de la terapéutica para el cáncer. La dosificación y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente concreto pueden ser fácilmente determinados por un experto en la técnica de la medicina controlando los signos de enfermedad o mejoría en el paciente y ajustando el tratamiento en consecuencia.

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Ejemplos

Los ejemplos experimentales siguientes se presentan a modo de ilustración, no de limitación.

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Ejemplo 1 Expresión de mRNA de KIAA0175

En este ejemplo se describe el análisis de la expresión del mRNA de KIAA0175, específica de tejido y de célula tumoral, por transferencia Northern.

Se generó una sonda de DNA específica de KIAA0175 a partir de un fragmento interno de 0,7 kb del marco de lectura abierto de KIAA0175. Este fragmento de DNA fue radiomarcado con \alpha-^{32}P-ATP mediante métodos estándares (Stratagene; La Jolla, California, EE.UU.) y fue usado para sondar transferencias comercialmente asequibles de líneas tisulares y líneas de células cancerosas, obtenidas de Clontech (7760-1, 7759-1 y 7757-1). La hibridación específica de la sonda de KIAA0175 fue detectada por autorradiografía.

De los diversos tejidos examinados mediante el análisis por transferencia Northern, el testículo expresaba el mayor nivel de mRNA de KIAA0175. El timo y el colon expresaban un nivel menor de mRNA de KIAA0175 seguidos, en orden de expresión decreciente, por la placenta y el bazo. De las diversas líneas de células cancerosas examinadas, MOLT-4 mostraba los mayores niveles de mRNA de KIAA0175 seguida de las células Hela S3, K562 y SW480, que expresaban niveles intermedios de mRNA de KIAA0175, y las células HL-60 y Raji, que expresaban niveles aún menores de mRNA de KIAA0175. En las células A549 y G361, el mRNA de KIAA0175 era apenas
perceptible.

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Ejemplo 2 Autofosforilación de la proteína KIAA0175

En este ejemplo se describe que KIAA0175 posee una actividad de autofosforilación y que esta actividad puede ser eliminada mediante la sustitución de un solo aminoácido, en lisina 40.

Se prepararon construcciones plasmídicas que expresaban el tipo silvestre de KIAA0175 y la proteína mutante K40A, quinasa inactiva. Estos plásmidos expresan ambas variantes de KIAA0175 como proteínas de fusión con hemaglutinina (HA), lo que facilita su aislamiento a través de inmunoprecipitación y su detección por medio de hibridación Western.

El vector plasmídico pcDNA3.1 (Invitrogen) contiene un sitio de clonación múltiple y un promotor de CMV para facilitar la subclonación y expresión de los cDNAs de KIAA0175 que tienen una secuencia marcadora de HA.

Se transfectaron células Cos 7 con el vector pcDNA3.1 desnudo o con el pcDNA3.1 que expresa las proteínas KIAA0175 de tipo silvestre o quinasa inactiva. Las proteínas KIAA0175 se inmunoprecipitaron con anticuerpo monoclonal anti-HA (COVANCE/Babco). Se determinó la actividad quinasa incubando las proteínas inmunoprecipitadas, en presencia de \gamma-^{32}P-ATP (370 kBq), ATP 10 mM, DTT 1 mM, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 10 mM y Tris 50 mM, pH de 7,5. Se sometieron las proteínas a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS y se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa. Se determinó la actividad quinasa midiendo la incorporación de ^{32}P, según se detecta por autorradiografía. La proteína inmunoprecipitada fue detectada mediante un análisis Western con anticuerpos
anti-HA.

Los datos revelaron que las células Cos 7 transfectadas con el vector plasmídico pcDNA3.1 desnudo no producen proteína KIAA0175 precipitable con HA. Las células Cos 7 transfectadas con el tipo silvestre o con el mutante K40A producen cantidades aproximadamente equivalentes de las respectivas proteínas KIAA0175, pero sólo la proteína de tipo silvestre presenta una significativa actividad quinasa.

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Ejemplo 3 Niveles de proteínas KIAA0175 recombinante y endógena después de la exposición de células a irradiación \gamma e hidroxiurea

En este ejemplo se describe que los niveles de proteína KIAA0175 aumentan después de la exposición de células que expresan KIAA0175 recombinante o endógena a irradiación \gamma o hidroxiurea.

Se detectaron los niveles de proteína HA-KIAA0175 recombinante en células Cos 7 sin tratamiento o después de un tratamiento con irradiación \gamma o con hidroxiurea. Se cargaron directamente los lisados en geles de poliacrilamida-SDS sin una inmunoprecipitación previa de las proteínas de fusión con HA. Las proteínas de fusión con HA se detectaron al sondar con anticuerpos anti-HA.

Similarmente, se detectaron los niveles de proteína KIAA0175 endógena en células sin tratamiento o después de un tratamiento con irradiación \gamma (células HeLa) o con hidroxiurea (células Arent). Se cargaron directamente los lisados en geles de poliacrilamida-SDS sin una inmunoprecipitación previa de las proteínas KIAA0175. Las proteínas KIAA0175 se detectaron al sondar con anticuerpos anti-KIAA0175.

En total, los datos revelaron que el tratamiento de las células Cos 7 con irradiación \gamma o hidroxiurea causaba un aumento de los niveles de proteína KIAA0175 si la proteína KIAA0175 se expresaba como una proteína recombinante de fusión con HA o se expresaba endógenamente.

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Ejemplo 4 Cinética del transcrito de KIAA0175 después de la administración de un oligonucleótido antisentido

En este ejemplo se describe que los niveles de mRNA de KIAA0175 pueden ser infrarregulados mediante la administración de un oligonucleótido antisentido de KIAA0175.

En los experimentos aquí descritos se usaron los siguientes oligonucleótidos antisentido:

1

2

Las células HT1080 expresan KIAA0175 endógena. Estas células se transfectaron con los oligonucleótidos FITC (testigo negativo) o AKT1 (testigo positivo), 1182 ó 545. En resumen, se mezclaron 100 nM de los respectivos oligonucleótidos antisentido con el reactivo de transfección "lipitoide 1" [Huang et al., Chemistry and Biology 5 (6): 346-354 (1998)] en una relación 1:3 (volumen a volumen) en medio OPTIMEM (GibcoBRL). Se añadió la mezcla a las células HT1080 en medio completo [EMEM, suero bovino fetal (FBS; del inglés, fetal bovine serum) térmicamente inactivado al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 1000 \mug/ml de estreptomicina] y se incubaron las células a 37ºC durante \sim 4-5 horas en presencia de los oligonucleótidos antisentido antes de cambiar a medio completo fresco. Se extrajo el RNA total el día 1, o 24, 48 ó 72 horas después de la transfección, y se detectaron los niveles de mRNA de KIAA0175 mediante análisis Northern. Se sometieron 20 \mug del RNA total a electroforesis en un gel de agarosa desnaturalizante. Se transfirió el RNA a nitrocelulosa y se detectó el mRNA de KIAA0175 sondando con un fragmento de cDNA de KIAA0175 de 0,7 kb, marcado con ^{32}P. Para controlar la igualdad en la carga de los carriles individuales, la transferencia fue separada de la sonda de KIAA0175 y fue vuelta a sondar con una sonda de cDNA de G3PDH marcada con ^{32}P, obtenida de Clontech.

Los datos mostraron que cualquiera de los oligonucleótidos antisentido de KIAA0175 examinados, es decir, 1182, 545 ó 736, era eficaz para reducir el nivel de expresión del mRNA de KIAA0175. Por contraste, los cebadores testigo inverso (RC1182 y RC736; del inglés, reverse control) así como los cebadores testigo AKT y FITC resultaron ineficaces para reducir la expresión del mRNA de KIAA0175.

La expresión del mRNA de KIAA0175 aumentó gradualmente a lo largo del periodo de tiempo de 24 a 72 horas tras la administración de los oligonucleótidos antisentido 545 y 1182. FITC no ejerció efecto alguno sobre la expresión del mRNA de KIAA0175 a lo largo del periodo de tiempo examinado.

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Ejemplo 5 Análisis Western de los niveles de las proteínas KIAA0175, p53, Erk2 Y p21 tras la administración de un oligonucleótido antisentido

En este ejemplo se describe el efecto de la administración de oligonucleótidos antisentido de KIAA0175 sobre los niveles de las proteínas KIAA0175, p53 y p21.

En experimentos separados, células HT1080 o HCT116 que expresan p53 y KIAA0175 endógenas fueron transfectadas con FITC, oligonucleótidos antisentido de KIAA0175 (es decir, 545 y 1182) o los correspondientes oligonucleótidos testigo inverso (RC y RC545). Se fraccionaron lisados celulares totales mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS y se transfirieron las fracciones a membranas de nitrocelulosa. Las proteínas específicas se detectaron por análisis Western utilizando anticuerpos contra KIAA0175 (antisueros policlonales de conejo), p53, Erk2 o p21, según se indica. Los anticuerpos contra p53, p21 y Erk2 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California, EE.UU.).

En las células HT1080, la administración de cualquiera de los oligonucleótidos antisentido de KIAA0175 causó una reducción tanto en el nivel proteico de p53 como en el de p21 pero no afectó al nivel proteico de Erk2. Tanto para la proteína KIAA0175 como la p53, la máxima actividad antisentido de 1182 en las células HT1080 se observó a las 48 horas. Se obtuvieron resultados similares con las células HCT116 aquí descritas, lo que sugiere además la naturaleza general del efecto del antisentido de KIAA0175 sobre una diversidad de líneas celulares.

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Ejemplo 6 Análisis Western de los niveles de las proteínas p53, Erk2 Y p21 después de la irradiación \gamma de células transfectadas con un oligonucleótido antisentido de KIAA0175

En este ejemplo se describe el efecto de un oligonucleótido antisentido de KIAA0175 sobre la suprarregulación de los niveles de las proteínas p53 y p21 inducida por irradiación \gamma.

Células HT1080 que expresan KIAA0175 endógena fueron transfectadas con el oligonucleótido antisentido de KIAA0175 (1182) y el correspondiente oligonucleótido testigo inverso (RC1182). Después de un cultivo durante 24 horas, las células transfectadas fueron tratadas con 10 Gy de irradiación \gamma. En diversos momentos después de la irradiación, se recolectaron células y se prepararon lisados que fueron sometidos a SDS-PAGE. Las proteínas p53, Erk2 y p21 se detectaron por análisis Western.

Los datos mostraron que la administración del oligonucleótido antisentido 1182 bloqueaba el aumento, inducido por la irradiación \gamma, del nivel de proteína p53 observado con el oligonucleótido RC1182. Similarmente, el oligonucleótido 1182 causaba una reducción de los niveles de la proteína p21. Como consecuencia de los niveles de expresión de p53 disminuidos, las células transfectadas con, por ejemplo, el oligonucleótido antisentido 1182 presentan un aumento de la sensibilidad a la radiación y, por lo tanto, el oligonucleótido antisentido 1182 actúa como un sensibilizador a la radiación.

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Ejemplo 7 Pérdida parcial de la detención del ciclo celular tras irradiación \gamma en células H71080 transfectadas con una molécula antisentido de KIAA0175

En este ejemplo se describe el efecto de moléculas antisentido de KIAA0175 sobre la detención del ciclo celular en respuesta a una irradiación \gamma.

Puesto que tanto p53 como p21 están implicadas en la transición de la fase G1 a la S del ciclo celular, se llevaron a cabo los experimentos siguientes con objeto de evaluar el efecto de moléculas antisentido de KIAA0175 sobre la regulación del ciclo celular.

En la Tabla 1 se describe el porcentaje de células HT1080 en cada etapa del ciclo celular, en diversos momentos después de la exposición a irradiación \gamma. En 24 horas, las células se detuvieron tanto en la fase G1 como en la G2, según se evidenció por el elevado porcentaje de células en las fases G0/G1 y G2/M en comparación con el porcentaje disminuido de células en la fase S.

TABLA 1

3

En la Tabla 2 se describe el efecto de moléculas antisentido de KIAA0175 sobre la detención del ciclo celular provocada por irradiación \gamma. En las células transfectadas con moléculas antisentido, había una reducción de la acumulación de células en la fase G1 y una reducción minimizada del número de células en la fase S en comparación con las células transfectadas con una molécula antisentido "testigo inverso" como testigo. Por contraste, el porcentaje de células presentes en la transición de fases G2/M permaneció insensible a la administración de una molécula antisentido de KIAA0175, lo que demuestra que el efecto de las moléculas antisentido de KIAA0175 en cuanto a mitigar la detención del ciclo celular provocada por irradiación \gamma es específico de la fase G1 en las células HT1080.

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TABLA 2

4

Sin limitarse a una teoría específica del presente invento, estos datos apoyan el papel esencial desempeñado por p53 en la detención del ciclo celular por daño al DNA en el punto de control de G1 y sugieren que la administración de moléculas antisentido de KIAA0175 causa una disminución de la actividad y la expresión génica de p53, mitigándose de este modo el bloqueo, provocado por irradiación \gamma, de la transición G1-S del ciclo celular.

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Ejemplo 8 Sensibilización de células HCT-116 a la irradiación \gamma y la hidroxiurea mediante la administración de moléculas antisentido de KIAA0175

En este ejemplo se describe que las moléculas antisentido de KIAA0175 son eficaces para sensibilizar células tanto a la irradiación \gamma como a la hidroxiurea.

El tratamiento por irradiación \gamma fue llevado a cabo del modo siguiente: el día uno, se transfectaron células HCT116 con la molécula antisentido de KIAA0175 nº 545 (545) o con la molécula testigo inverso (RC) 545 y se sembraron en placas para cultivo tisular. El día tres, una placa de células transfectadas con 545 y otra de células transfectadas con RC fueron tratadas con irradiación \gamma (2, 4 u 8 Gy) y cultivadas 2 horas más. Las células tratadas con irradiación \gamma así como las células HCT116 testigo no tratadas fueron hechas reaccionar con tripsina, contadas y sembradas por triplicado en placas de 6 pocillos para cultivo tisular hasta una densidad de 1000 células por pocillo. Después de 11 días de cultivo, se examinó la viabilidad de las células por tinción con cristal violeta. Luego se contaron los números totales de colonias celulares. Datos representativos mostraron que la administración de la molécula antisentido 545 aumentaba la sensibilidad de las células HCT116 a la irradiación \gamma, según se evidenciaba por una disminución del número de colonias viables que surgían de las células tratadas con 545 en comparación con las que surgían de las células tratadas con RC.

El tratamiento con hidroxiurea fue llevado a cabo del modo siguiente: el día uno, se transfectaron células HCT116 con la molécula antisentido de KIAA0175 nº 545 (545) o con la molécula testigo inverso (RC) 545 y se sembraron en placas para cultivo tisular. Al día siguiente (día dos), una placa de células transfectadas con 545 y otra de células transfectadas con RC fueron tratadas con hidroxiurea (1 mM de concentración final) y cultivadas 24 horas más. El día tres, las células tratadas con hidroxiurea así como las células HCT116 testigo no tratadas fueron hechas reaccionar con tripsina, contadas y sembradas por triplicado en placas de 6 pocillos para cultivo tisular hasta una densidad de 1000 células por pocillo. Después de 11 días de cultivo, se examinó la viabilidad de las células por tinción con cristal violeta. Luego se contaron los números totales de colonias celulares. Datos representativos mostraron que la administración de la molécula antisentido 545 aumentaba la sensibilidad de las células HCT116 a la hidroxiurea, según se evidenciaba por una disminución del número de colonias viables que surgían de las células tratadas con 545 en comparación con las que surgían de las células tratadas con RC.

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Ejemplo 9 Sensibilización de células tumorales a fármacos quimioterapéuticos mediante la administración de oligonucleótidos antisentido de KIAA0175

En este ejemplo se describe la sensibilización de células tumorales mediante la administración de moléculas antisentido de KIAA0175.

El efecto de las moléculas antisentido de KIAA0175 sobre la sensibilidad celular a fármacos quimioterapéuticos fue examinado en diversas líneas celulares utilizando el ensayo de citotoxicidad de la lactato deshidrogenasa (LDH), esencialmente del modo siguiente:

Día 1: se sembraron las células en 4 placas distintas de 96 pocillos, típicamente 5000 células/pocillo, y se incubaron a 37ºC y en CO_{2} al 5%.

Día 2: se transfectaron las células con los oligonucleótidos antisentido KIA175-1182 y KIA175-545 (ID. SEC. números 5 y 1, respectivamente) así como con los testigos de complemento inversos RC1182 y RC545 (ID. SEC. números 6 y 2, respectivamente), esencialmente del modo descrito en el Ejemplo 4, con y sin fármaco. Como testigo de siembra se dejó una placa (día 0) sin transfectar.

La transfección fue llevada a cabo utilizando un vehículo lipídico para distribución como se describe en el Documento WO 01/16306, incorporado aquí en su totalidad. En resumen, en la transfección se usaron agentes conocidos como "lipitoides" y "colesteroides", descritos, por ejemplo, en las publicaciones PCT WO 01/16306, WO 98/06437 y WO 99/08711, basadas en los números de serie US 60/023.867, 60/054.743 y 09/132.808, que se incorporan también aquí por referencia. En estas referencias se muestra que estos productos de conjugación del lípido-peptoide catiónico son reactivos eficaces para la distribución in vitro de DNA plasmídico a células. Cualquiera de los vehículos descritos en las aplicaciones anteriormente referidas es adecuado para uso en la transfección de los oligonucleótidos aquí descritos.

Estos compuestos pueden ser preparados mediante una síntesis convencional en disolución o en fase sólida. En uno de dichos procedimientos, como se describe en el Documento WO 99/08711 anteriormente citado, el extremo N de un peptoide unido a resina es acilado con un espaciador tal como ácido Fmoc-aminohexanoico o Fmoc-3-alanina. Después de la eliminación del grupo Fmoc, el grupo amino primario es hecho reaccionar con cloroformiato de colesterol para formar un enlace carbamato. El producto es luego escindido de la resina con ácido trifluoroacético y es purificado por cromatografía de alta eficacia en estado líquido y fase inversa. El lugar del grupo esteroide se puede utilizar un grupo lipídico derivado de un ácido graso, tal como un fosfolípido. El esteroide o el otro grupo lipídico puede ser también unido al grupo peptoide mediante otros enlaces, de cualquier longitud eficaz, fácilmente asequibles al profesional cualificado.

Para la transfección, dependiendo del tipo celular, se utilizaron diferentes vehículos lipídicos durante diferentes periodos de tiempo. Sin embargo, el tiempo de transfección no excedió de 24 horas. La transfección se llevó a cabo en medio completo, y la concentración final de oligonucleótido antisentido fue 300 nM por pocillo. En los pocillos con fármaco, se añadió el fármaco al cultivo al comienzo de la transfección.

Comenzando el día 3: se recuperaron las células, 1 placa/día, y se midió la liberación de LDH al sobrenadante utilizando un sistema de Roche de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Basel, Suiza) (datos marcados como días 1, 2 y 3).

Para cada muestra, los datos se expresan como la relación entre el nivel de LDH en los pocillos que contenían células transfectadas con el antisentido (AS) y el nivel de LDH en los pocillos que contenían células transfectadas con los testigos de complemento inversos (RC) (es decir, AS/RC). De esta manera, las células que resultan sensibilizadas al fármaco morirán y liberarán LDH al sobrenadante. Un aumento de la relación significa una muerte celular aumentada y, por lo tanto, mayores niveles de LDH en los medios. Una relación superior a 1,5 significa un efecto del antisentido con respecto al testigo de complemento inverso.

Los datos resumidos en la Tabla 3 demuestran que ni KIA175-1182 ni KIA175-545 ejercen efecto alguno sobre la línea 184B5 de células epiteliales normales de mama. Por contraste, la Tabla 4 muestra que KIA175-545 sensibiliza las células MDA-MB-231 de cáncer metastásico de mama a los efectos de la cisplatina y la camptotecina (CPT). No parecía que sensibilizara las células a los efectos de la doxorrubicina (doxo). Los datos de la Tabla 4 también muestran que ambas moléculas antisentido solas causaban un aumento de la muerte celular en esta línea celular de cáncer de mama, lo que sugiere que KIAA0175 puede ser focalizada directamente por inhibidores y que dichos inhibidores pueden ser utilizados terapéuticamente en ausencia de otros fármacos quimioterapéuticos.

TABLA 3 Efecto del antisentido de KIAA0175 -/+ cisplatina sobre la línea 184B5 de células epiteliales normales de mama

5

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TABLA 4 Efecto del antisentido de KIAA0175 -/+ fármaco sobre la línea celular MDA-MB-231 de cáncer de mama

6

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Ejemplo 10 Fosforilación de KIAA0175 por ATM en respuesta a la irradiación gamma

El gen mutado de la ataxia-telangiectasia (ATM) es uno de una subfamilia de quinasas de tipo PI-3 y desempeña un papel central en la respuesta al daño al DNA. Se piensa que ATM controla esencialmente la respuesta a la irradiación \gamma. Los motivos aminoácidos SQ y TQ son los sitios de fosforilación preferidos de ATM en muchos de sus sustratos declarados, incluyendo p53, Chk2, Mdm2, etc. [S. T. Kim et al., J. Biol. Chem. 274 (53): 37.538-43 (1999)]. KIAA0175 contiene 3 sitios SQ (Ser 100, Ser 125 y Ser 391).

Proteínas de fusión de GST que contenían los aminoácidos 42-182, 227-325 y 327-517 de KIAA0175 fueron expresadas y purificadas a partir de Escherichia coli y fueron examinadas en cuanto a su capacidad para actuar in vitro como un sustrato para ATM. Las proteínas fueron fosforiladas con inmunoprecipitados de ATM. Un sustrato para ATM fue una fusión que incluía los aminoácidos 327-517 que contienen S^{391}Q. Por contraste, las otras dos fusiones de KIAA0175, los aminoácidos 42-182 (que contienen S^{100}Q y S^{125}Q) y los aminoácidos 227-325 sin sitios SQ, no resultaron fosforiladas. Además, la fosforilación de KIAA0175 (327-517) era comparable a la vista con diversos sustratos conocidos de ATM incluidos en el mismo ensayo, GST-p53 (1-106), GST-Chk2 (1-222) y GST-hDM2 (330-491).

Para examinar adicionalmente si la fosforilación de KIAA0175 por ATM es regulada por el daño al DNA y mapear adicionalmente el supuesto sitio de fosforilación, la serina 391 fue mutada por alanina. El ATM inmunoprecipitado de las células tratadas con irradiación (IR) \gamma mostró una fosforilación aumentada \sim 2-3 veces sobre KIAA0175, similar a la observada con p53 o Chk2. La mutación de la serina 391 por alanina anuló completamente la fosforilación por ATM, inducida por radiación. Estos resultados demostraban que ATM puede fosforilar directamente KIAA0175 in vitro en respuesta al daño al DNA y confirmaban que el sitio primario de la fosforilación se sitúa en la serina 391.

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, sin utilizar más que una experimentación rutinaria, muchas realizaciones equivalentes a las realizaciones específicas del invento aquí descrito. Se pretende que tales realizaciones específicas y realizaciones equivalentes queden abarcadas por las reivindicaciones siguientes.

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<110> Chiron Corporation

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Wu, Bin

\hskip1cm

Seeley, Todd

\hskip1cm

Williams, Lewis T.

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<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA TRATAR LA ENFERMEDAD NEOPLÁSICA USANDO SENSIBILIZADORES A LA QUIMIOTERAPIA Y A LA RADIACIÓN

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<130> 200130.514PC/1623.003

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<140> PCT

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<141> 30-05-2001

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<160> 12

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<170> FastSEQ para Windows, Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtccctg tgagcatagc cctgg

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25

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<210> 2

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 2

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ggtcccgata cgagtgtccc tggag

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25

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<210> 3

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 3

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tgcccatgct ccaaacatct gcctc

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25

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<210> 4

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 4

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ctccgtctac aaacctcgta cccgt

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25

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<210> 5

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 5

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gggtagcact ggcttgtcca cagga

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25

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<210> 6

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 6

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aggacacctg ttcggtcacg atggg

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25

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<210> 7

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador para la multiplicación de KIAA0175 por PCR

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<400> 7

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gggtatcagg aggcagcggc ttaaggg

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27

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<210> 8

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador para la multiplicación de KIAA0175 por PCR

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<400> 8

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aggctgtatc acacccacac tcatccggca

\hfill

30

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<210> 9

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<211> 2470

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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7

8

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<210> 10

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<211> 651

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

10

11

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<210> 11

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador para la multiplicación de KIAA0175 por PCR

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<400> 11

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tctgctgctg tcgacaacga gtgtc

\hfill

25

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<210> 12

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador para la multiplicación de KIAA0175 por PCR

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<400> 12

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ccatagtgag gttgcatctg gtgcc

\hfill

25

Claims

1. El uso de una molécula antisentido dirigida a KIAA0175 (ID. SEC. nº 9) para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar la quimiosensibilidad y/o la radiosensibilidad de una célula de mamífero.

2. El método de la Reivindicación 1, en que dicha célula de mamífero es una célula tumoral.

3. El uso de la Reivindicación 1 ó 2, en que dicho aumento de quimiosensibilidad y/o radiosensibilidad es determinado mediante una medición seleccionada del grupo que consiste en medir una reducción de los niveles proteicos de p53 o p21 inducidos por irradiación \gamma o hidroxiurea, medir una reducción de la detención del ciclo celular inducida por irradiación \gamma o hidroxiurea, y medir un aumento de la sensibilización celular inducida por irradiación \gamma o hidroxiurea.

4. El uso de una molécula antisentido dirigida a KIAA0175 (ID. SEC. nº 9) para la preparación de una composición farmacéutica para reducir los efectos secundarios de la terapia para el cáncer.

5. El uso de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que la molécula antisentido dirigida a KIAA0175 (ID. SEC. nº 9) tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la ID. SEC. nº 1, la ID. SEC. nº 3 y la ID. SEC. nº 5.