ES2299635T3 - Antibioticos factores a, b, b1 de ge81112, composiciones y sales farmaceuticamente aceptables y su uso. - Google Patents
Antibioticos factores a, b, b1 de ge81112, composiciones y sales farmaceuticamente aceptables y su uso. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2299635T3 ES2299635T3 ES02803759T ES02803759T ES2299635T3 ES 2299635 T3 ES2299635 T3 ES 2299635T3 ES 02803759 T ES02803759 T ES 02803759T ES 02803759 T ES02803759 T ES 02803759T ES 2299635 T3 ES2299635 T3 ES 2299635T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibiotic
- recorded
- growth
- following
- antibiotics
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Antibiótico de Factor A de GE 81112, que se obtiene cultivando la cepa Streptomyces sp. DSMZ 14386 en condiciones aerobias en un medio nutriente acuoso que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas, y que tiene las siguientes características: A) Espectro de masas registrado a partir de una disolución de 0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 que proporciona un ion monoprotonado a 644 m/z en un instrumento Thermofinnigan LCQ deca en las siguientes condiciones de electropulverización: Voltaje de Pulverización: 4,7 kV; Temperatura Capilar: 250ºC; Voltaje Capilar: 9 V; Modo de infusión 5 µL/min; B) Espectro de infrarrojo (Figura 2) registrado como mull de nujol con un espectrofotómetro de Transformada de Fourier IFS-48 que muestra las siguientes bandas principales (cm ¿1 ): 3356; 2956; 2855; 2256; 2128; 1663; 1596; 1455; 1378; 1345; 1123; 1050; 1026; 1002; 825; 764; C) Espectro de RMN de 1 H (Figura 3) registrado a 600 MHz a 25ºC en DMSO-d 6 y ácido trifluoroacético (gotas) que muestras las siguientes señales de 1 H: (Ver tabla) D) Espectro de RMN de 13 C (Figura 4) registrado a 150 MHz, a 25ºC en DMSO-d6 y ácido trifluoroacético (gotas) que muestra las siguientes señales de 13 C: (Ver tabla) E) Tiempo de retención de 14,1 minutos, determinado usando un HPLC analítico Shimadzu LC10-AS, equipado con una columna ¿Altima¿ RP18, 5 µm, 250 x 4,6 mm d.i.; elución isocrática llevada a cabo con un caudal de 1 mL/min, con tampón de formato amónico 40 mM, llevado a pH 4,5 mediante adición de ácido fórmico; detección de UV a 230 nm; F) Posee funciones ácidas y básicas; G) Inhibe el crecimiento de Moraxella catarrhalis; inhibe el crecimiento de Escherichia coli y de Bacillus subtilis cuando dichas bacterias se cultivan en medio mínimo; muestra actividad marginal contra Streptococcus pneumoniae; no inhibe el crecimiento de Candida albicans; y sus sales con ácidos y bases.
Description
Amtibióticos factores A, B, B1 de GE 81112,
composiciones y sales farmacéuticamente aceptables y su uso.
La presente invención se refiere a una sustancia
antibiótica de origen microbiano, denominada arbitrariamente factor
A de GE 81112, factor B de GE 81112 y factor B1 de GE 81112, una
mezcla de dichos factores en cualquier proporción, las sales y
composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, y su uso
como agente antibacteriano.
Otro objetivo de la presente invención es un
proceso para preparar factor A de GE 81112, factor B de GE 81112 y
factor B1 de GE 81112, una mezcla de dichos factores en cualquier
proporción, denominados en la presente memoria compuestos de GE
81112 o antibióticos de GE 81112.
El género Streptomyces es un género productor de
antibióticos bien conocido (WATVE M.G. y col.: "How many
antibiotics are produced by the genus Streptomyces?" ARCHIVES OF
MICROBIOLOGY 25/09/2001 176: 386-390).
Se aisló Streptomyces sp. DSMZ 14386
designado originalmente con el código interno GE 81112 a partir de
una muestra de suelo y se depositó el 16/07/2001, con el DSMZ,
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania),
bajo las condiciones del Tratado de Budapest. A la cepa se le
asignó el número de acceso DSMZ 14386.
La producción de compuestos de GE 81112 se logra
cultivando una cepa de Streptomyces que sea capaz de producirlos, es
decir Streptomyces sp. DSMZ 14386 o una variante o un mutante
de la misma que mantenga la capacidad genética de producir dichos
compuestos de GE 81112; aislando el antibiótico resultante del caldo
de cultivo; purificando el antibiótico aislado; y separando los
tres factores del antibiótico, A, B y B1, o su mezcla, mediante
medios cromatográficos. En cualquier caso, se prefiere producir
compuestos de GE 81112 en condiciones aeróbicas en un medio
nutriente acuoso que contenga fuentes asimilables de carbono,
nitrógeno y sales inorgánicas, purificando los compuestos
resultantes por medio de técnicas cromatográficas. Se pueden usar
muchos de los medios de nutrientes empleados habitualmente en el
campo de la fermentación, sin embargo se prefieren determinados
medios.
Las fuentes de carbono preferidas son glucosa,
xilosa, almidón, fructosa, glicerol, y similares. Las fuentes de
nitrógeno preferidas son harina de semilla de soja, peptona,
extracto de harina, extracto de levadura, triptona, aminoácidos,
caseína hidrolizada, y similares. Entre las sales inorgánicas que
pueden incorporarse al medio de cultivo se encuentran las sales
solubles habituales capaces de producir iones de sodio, potasio,
hierro, zinc, cobalto, magnesio, calcio, amonio, cloruro, carbonato,
sulfato, fosfato, nitrato, y similares.
Preferiblemente, la cepa que produce los
compuestos de GE 81112 se cultiva previamente en un tubo de
fermentación o en un matraz agitado, a continuación el cultivo se
usa para inocular fermentadores de jarra para la producción de
cantidades sustanciales de sustancias. El medio usado para el
pre-cultivo puede ser el mismo que el empleado para
las fermentaciones mayores, aunque también puede emplearse otro
medio. La cepa que produce los compuestos de GE 81112 puede
cultivarse a una temperatura entre 20ºC y 40ºC, preferiblemente
entre 22ºC y 37ºC. No se observa crecimiento a una temperatura
superior a 44ºC.
Durante la fermentación, se pueden monitorizar
los factores de GE 81112 mediante bioensayo con microorganismos
susceptibles y/o mediante análisis de HPLC. La producción máxima de
compuestos de GE 81112 se produce generalmente después de
aproximadamente 20 horas y antes de las 80 horas de
fermentación.
Los compuestos de GE 81112 se producen
cultivando Streptomyces sp. DSMZ 14386 o una variante o un
mutante del mismo que produzca compuestos de GE 81112, y se
encuentran en los caldos de cultivo.
La Streptomyces sp. DSMZ 14386 crece bien
en muchos medios sólidos estándares. Se realizó un examen
microscópico y se midieron las dimensiones celulares usando el
cultivo generado en medio de ácido húmico con una fuerza de un
décimo (H. Nonomura, 1984 - Design of a new medium for isolation of
soil actinomycetes. The Actinomycetes 18,
206-209).
En cultivo líquido (medio V6, véase el Ejemplo 1
para la composición) no se observó fragmentación del micelio
después de 2 días de cultivo a 28ºC.
El examen microscópico sobre agar HV/2 tras 15
días de incubación a 28ºC reveló un micelio vegetativo no
extensivamente ramificado y no fragmentado. El micelio aéreo
tampoco estaba extensivamente ramificado. Las hifas aéreas que
generan cadenas de más de 10 esporas (la mayoría > 20); se
encontraban dispuestas en espirales sencillas, no muy compactas, de
3 a 5 giros. Las formas de las esporas oscilaban entre globosas
(diámetro medio de aproximadamente 0,9 \mum) y ovoides o
cilíndricas (de 0,8 a 0,9 por 1,1 a 1,3 \mum).
La Streptomyces sp. DSMZ 14386 se cultivó
durante dos días en medio líquido V6 (véase el Ejemplo 1 para la
composición del medio). Se recolecto el micelio mediante
centrifugación y se lavó tres veces con disolución salina
esterilizada, y a continuación se diluyó para proporcionar un
inóculo adecuado. Se separaron alícuotas de la suspensión de un modo
cruzado en varios medios recomendados por Shirling y Gottlieb (E.B.
Shirling y D. Gottlieb, 1966 - Method for Characterization of
Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacterid., 16,
313-340) y varios medios recomendados por Waksman
(Waksman S. A., 1961 - The Actinomycetes - The Williams and Wilkins
Co., Baltimore. Vol. 2, pág. 328-334).
Se determinó la capacidad para usar una serie de
carbohidratos como fuente de carbono y de energía en medio ISP8
(Shirling y Gottlieb, ver anterior) que contenía la fuente de
carbono en una concentración final del 1% (p/v). Se determinó la
tolerancia a NaCl así como la capacidad para crecer a diferentes
temperaturas en medio ISP2. Todos los medios fueron incubados a
28ºC durante 21 días; las descripciones están referidas a 14 días a
menos que se especifique lo contrario. Se determinó el color a la
luz natural del día, usando el Colour Atlas de Maerz y Paul (A.
Maerz y M. R. Paul, 1950 - A Dictionary of Colour, 2ª edición,
McGraw-Hill Book Co. Inc., Nueva York). La capacidad
para reducir nitratos a nitritos se evaluó en Caldo de Nitrato
(medio ISP8) después de una incubación de una noche a 28ºC en
condiciones aerobias usando Tiras de Ensayo
Bacto-Nitrite (Difco), siguiendo el protocolo
sugerido por el fabricante.
El crecimiento, la apariencia de la colonia, el
color del sustrato y el color del micelio aéreo, y la producción de
pigmento, correspondientes a la cepa Streptomyces sp. DSMZ
14386 se registran en la Tabla I. El crecimiento estuvo presente en
todos los medios usados excepto en agar G1, que es el único que
tiene una fuente de nitrógeno inorgánica. No se produjo ninguna
pigmentación característica en ningún medio usado. Las
características fisiológicas de la cepa se presentan en la Tabla
II. La Streptomyces sp. DSMZ 14 386 mostró la capacidad de
crecer hasta con un 7% (p/v) de NaCl; con una concentración de NaCl
del 1% (p/v) y superior la cepa no diferenció micelio aéreo.
Después de 7 días de crecimiento se detectó débilmente una
licuefacción de gelatina y una peptonización láctea. La capacidad
para utilizar diversos carbohidratos para el crecimiento se muestra
en la Tabla III. En el medio basal sin la adición de fuente de
carbono alguna, se observó un escaso crecimiento de micelio
vegetativo y aéreo. Se produjo micelio aéreo blanco en todas las
fuentes de carbono usadas excepto en el caso de la Glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se cultivó Streptomyces sp. DSMZ 14386 en
medio de Sauton durante cuatro semanas y a continuación se recolectó
el micelio, se lavó tres veces con agua destilada esterilizada y
posteriormente fue secado por congelación. La forma
estereoisomérica del ácido diaminopimélico (DAP) se determinó de
acuerdo con el método de Staneck y Roberts, (J.L. Staneck y G.D.
Roberts, Simplified approach to identification of aerobic
actinomycetes by thin-layer chromatography, Appl.
Microbiol. 28, 226-231, 1974).
Para la extracción de ácidos grasos, se extrajo
la biomasa húmeda usando modificaciones menores (L.D.
Kuykendall, M. A. Roy, J. J. O'Neill y T. E. Devine, Fatty acid, antibiotic resistance, and deoxyribonucleic acid homology groups of Bradyrhizobium japonicium, Int. J. System. Bact. 38, 351-361, 1988) del método de Miller (L. T. Miller, A single derivatization method for bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids, J. Clin. Microbiol. 16, 584-586, 1982). Los análisis se llevaron a cabo como describe R. M. Kroppenstedt (R. M. Kroppenstedt, E. Stackebrandt y M. Goodfellow, Taxonomic revision of the actinomycete genera Actinomadura and Microtetraspora, System. Appl. Microbiol. 13, 148-160, 1990) y los datos se examinaron usando el Sistema de Identificación Microbiano (L. T. Miller, ver anterior).
Kuykendall, M. A. Roy, J. J. O'Neill y T. E. Devine, Fatty acid, antibiotic resistance, and deoxyribonucleic acid homology groups of Bradyrhizobium japonicium, Int. J. System. Bact. 38, 351-361, 1988) del método de Miller (L. T. Miller, A single derivatization method for bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids, J. Clin. Microbiol. 16, 584-586, 1982). Los análisis se llevaron a cabo como describe R. M. Kroppenstedt (R. M. Kroppenstedt, E. Stackebrandt y M. Goodfellow, Taxonomic revision of the actinomycete genera Actinomadura and Microtetraspora, System. Appl. Microbiol. 13, 148-160, 1990) y los datos se examinaron usando el Sistema de Identificación Microbiano (L. T. Miller, ver anterior).
La cepa Streptomyces sp. DSMZ 14386
contiene ácido LL-diaminopimélico en el
peptidoglicano. No hay ácidos micólicos presentes. Hay ácidos
grasos de tipo iso- y anteiso-ramificado, aunque no
se pueden detectar ácidos grasos hidroxi o ácidos grasos
ramificados en el metilo 10, es decir ácido graso de tipo 2c de tipo
Streptomyces.
La cepa que produce compuestos de GE 81112 se
asigna al género Streptomyces debido a las siguientes
características morfológicas y químicas:
- -
- la formación de un micelio vegetativo no fragmentado ramificado. Hifas aéreas que generan cadenas de más de 10 artrosporas (la mayoría > 20);
- -
- la presencia de ácido LL-diaminopimélico en la pared celular, y el perfil de ácidos grasos de tipo 2c de acuerdo con Kroppenstedt (R. M. Kroppenstedt, Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms, pág.173-199, en: Chemical Methods in bacterial Systematics, M. Goodfellow y D.E. Minnikin, editores; Londres, Accademic Press, 1985).
Como con otros microorganismos, las
características de la cepa que produce los compuestos de GE 81112
están sujetas a variación. Por ejemplo, se pueden obtener variantes
artificiales y mutantes de la cepa mediante tratamiento con
diversos mutágenos conocidos, tales como rayos U.V. y productos
químicos tales como ácido nitroso,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
y muchos otros. Todas las variantes naturales y artificiales y los
mutantes de la cepa de Streptomyces sp. DSMZ 14386 que
mantengan la capacidad genética de producir compuestos de GE 81112
son consideradas equivalentes a la misma para el propósito de esta
invención, y por tanto se encuentran dentro del alcance de la
invención.
El antibiótico puede recuperarse de la fracción
de sobrenadante del caldo fermentado.
La recuperación de compuestos de GE 81112 de los
caldos de fermentación del microorganismo productor se lleva a cabo
de acuerdo con técnicas conocidas tales como extracción con
disolventes, en presencia de adyuvantes, precipitación por adición
de no solventes, sales, o mediante cambio del pH de la disolución,
cromatografía de partición, cromatografía de partición de fase
inversa, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
exclusión molecular, y similares.
Un procedimiento para recuperar la sustancia
antibiótica de la invención del caldo de fermentación incluye la
extracción de la mezcla de GE 81112 mediante cromatografía de
intercambio iónico. De acuerdo con este procedimiento, el caldo de
fermentación filtrado puede ponerse en contacto con una resina de
intercambio iónico. La elución puede llevarse a cabo mediante una
variación de pH o de fuerza iónica. Los ejemplos de resinas de
intercambio iónico que pueden usarse de forma conveniente para la
recuperación de los compuestos de la invención son resinas de
intercambio tanto aniónicas como catiónicas, es decir, resinas que
consisten en una matriz de, por ejemplo, polímeros sintéticos (por
ejemplo, poliestireno, polímeros acrílicos) o polímeros naturales
(por ejemplo, celulosa, polímeros de sefarosa, sílice) que son
derivatizados introduciendo funciones ácidas (por ejemplo, COOH,
-SO_{3}H) o básicas (por ejemplo,
-N(CH_{3})_{2},
-N^{+}(CH_{3})_{3}).
Ejemplos de las anteriores resinas: resina Dowex
50 W (Dow Chemical Co.), Amberlite IR-200 e
IR-120 (Rohm & Haas), PL-SCX-
1000 y APL-SCX 4000 A (Polymer Laboratories),
Isolute SCX 1ST (International Sorbent Technology), SP Sepharose de
flujo rápido y SP Sephadex G25 (Pharmacia Biotech).
Un procedimiento alternativo para recuperar las
sustancias antibióticas incluye la adsorción sobre una matriz
apropiada seguida de la elución con un disolvente polar miscible en
agua o con una mezcla, la concentración hasta residuo de agua a
presión reducida, y la precipitación con un agente de precipitación
del tipo ya mencionado anteriormente. El pH puede ajustarse a un
valor apropiado. Los ejemplos de matrices de adsorción que pueden
ser usadas de forma conveniente para la recuperación de los
compuestos de la invención, son carbón activado (por ejemplo, Darco
G60,-Norit CGI), resinas de poliestireno o mixtas de
poliestireno-divinilbenceno (por ejemplo, Diaion HP
20, Mitsubishi Chemicals, M112 o S112, Dow Chemical Co.; Amberlite
XAD2 o XAD4, Rohm & Haas), resinas acrílicas (por ejemplo, XAD7
o XAD8, Rohm & Haas), adsorbentes fenólicos (por ejemplo,
Durolite XAD761, Rohm & Haas), resinas de poliamida tales como
policaprolactamas, nylons y polivinilpirrolidonas reticuladas (por
ejemplo, Poliamida-CC 6,
Poliamida-SC 6, Poliamida-CC 6.6,
Poliamida-CC 6AC y Poliamida-SC 6AC,
Macherey-Nagel & Co., Alemania Occidental; PA
400, M. Woelm AG, Alemania Occidental PVP-CL,
Aldrich Chemie GmbH & Co., KG, Alemania Occidental), dextranos
reticulados de poro controlado (por ejemplo, Sephadex
LH-20, Pharmacia Fine Chemicals, AB). Habitualmente
se emplean carbones y/o resinas de poliestireno, siendo
particularmente preferida la resina Diaion HP 20 (Mitsubishi
Chemicals).
La absorción sobre una matriz de adsorción del
tipo mencionado anteriormente puede emplearse también como un
procedimiento para purificar el producto bruto recuperado del caldo
de fermentación, por ejemplo, por medio de cromatografía de
intercambio iónico (por ejemplo, catiónico).
El disolvente preferido para eluir los
compuestos de GE 81112 de la matriz de adsorción depende de la fase
estacionaria específica. En el caso del carbón la elución se logra
cambiando a un pH ácido el tampón de lución, que habitualmente
contiene un disolvente miscible en agua, por ejemplo, una cetona
inferior tal como acetona o un alcohol inferior tal como metanol.
Por consiguiente, la mezcla acuosa se ajusta al valor de pH
apropiado. En el caso de resinas de poliestireno, resinas de
poliestireno-divinilbenceno, resinas acrílicas o
resina de poliamida, un eluyente preferido es un disolvente
miscible en agua o sus mezclas con agua, por ejemplo una mezcla de
agua y un alcanol (C_{1}-C_{3}).
El término "disolvente miscible en agua"
tal como se usa en esta solicitud, si no se especifica lo contrario,
pretende tener el significado que actualmente se le proporciona en
la técnica y se refiere a disolventes que, en las condiciones de
uso, son miscibles con agua en un intervalo de concentraciones
razonablemente elevado, adecuado para el uso pretendido. Los
ejemplos de disolventes orgánicos miscibles en agua que pueden
usarse en la elución de los compuestos de la invención son:
alcanoles inferiores, por ejemplo alcanoles
(C_{1}-C_{3}) tales como metanol, etanol y
propanol; alcanoles (C_{1}-C_{3}) de fenilo
tales como alcohol bencílico; cetonas inferiores, por ejemplo
cetonas (C_{3}-C_{4}) tales como acetona y etil
metil cetona; éteres cíclicos tales como tetrahidrofurano y
dioxano; glicoles y sus productos de eterificación parcial tales
como etilénglicol, propilénglicol y etilénglicol monometil éter,
amidas inferiores tales como dimetilformamida y dietilformamida;
ácido acético, dimetilsulfóxido y acetonitrilo.
Un método alternativo para recuperar compuestos
de GE 81112 del caldo de fermentación es la extracción de
compuestos de GE 81112 o de sus sales, con disolventes orgánicos
miscibles en agua, ajustando el pH a un valor apropiado, y/o
salinizando y/o añadiendo una sal orgánica apropiada que forme un
par iónico con el antibiótico que sea soluble en el disolvente de
extracción. A continuación el antibiótico puede ser precipitado de
los extractos concentrados, por ejemplo añadiendo un agente de
precipitación.
El término "disolvente inmiscible en agua"
tal como se usa en esta solicitud, pretende tener el significado que
actualmente se le proporciona en la técnica, y se refiere a
disolventes que, en las condiciones de uso, son ligeramente
miscibles o prácticamente inmiscibles con agua. Los ejemplos de
disolventes orgánicos inmiscibles en agua que pueden usarse en la
extracción de los compuestos de la invención del caldo de
fermentación son: alcanoles de al menos cuatro átomos de carbono
que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos, tales como
n-butanol, 1-pentanol,
2-pentanol, 3-pentanol,
1-hexanol, 2-hexanol,
3-hexanol,
3,3-dimetil-1-butanol,
4-metil-1-pentanol,
3-metil-1-pentanol,
2,2-dimetil-3-pentanol,
2,4-dimetil-3-pentanol,
4,4-dimetil-2-pentanol,
5-metil-2-hexanol,
1-heptanol, 2-heptanol,
5-metil-1-hexanol,
2-etil-1-hexanol,
2-metil-3-hexanol,
1-octanol, 2-octanol, ciclopentanol,
2-ciclopentiletanol,
3-ciclopentil-1-propanol,
ciclohexanol, cicloheptanol, ciclooctanol,
2,3-dimetilciclohexanol,
4-etilciclohexanol,
ciclo-octilmetanol,
6-metil-5-hepten-2-ol,
1-nonanol, 2-nonanol,
1-decanol, 2-decanol y
3-decanol; cetonas de al menos cinco átomos de
carbono tales como metilisopropilcetona, metilisobutilcetona,
metil-n-amilcetona,
metilisoamilcetona y mezclas de las mismas.
Los ejemplos de pares iónicos convenientes con
los compuestos de GE 81112 se obtienen mediante adición de ácidos,
tales como ácidos sulfónicos representados por los ácidos
p-toluensulfónico, pentan-, esan-,
eptan-sulfónico, y similares, o ácidos carboxílicos
representados por los ácidos esanoico, eptanoico, benzoico, y
similares, al pH apropiado. Alternativamente, se pueden generar
pares iónicos añadiendo cationes tales como trietilamonio,
tetrabutilamonio y similares, al pH apropiado.
La purificación de los compuestos de GE 81112
brutos puede llevarse a cabo empleando cualquiera de las técnicas
conocidas, pero preferiblemente se realiza mediante procedimientos
cromatográficos. Convenientemente, también se puede emplear la
técnica denominada cromatografía de exclusión estérica con buenos
resultados. En particular, en esta técnica se emplean con éxito
dextranos reticulados de poro controlado en los que la mayoría de
los grupos hidroxilo están alquilados, por ejemplo Sephadex
LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, AB).
Por ejemplo, se pueden emplear sistemas de
separación cromatográfica líquida de media presión, usando
cromatografía de fase inversa sobre gel de sílice funcionalizada
RP-8 o RP-18, eluyendo con una
disolución de formato de amonio. El producto bruto aislado del
caldo de cultivo, así como el producto purificado, habitualmente
contienen una mezcla de los factores individuales de GE 81112, A,
B1 y B, en una proporción variable, dependiendo tanto de las
condiciones de fermentación como de las de purificación.
La separación y la purificación de factores
individuales A, B y B1 puede llevarse a cabo de forma conveniente
mediante HPLC semipreparativo de una preparación que contiene una
mezcla de compuestos de GE 81112.
Una técnica de HPLC preparativo preferida para
el aislamiento de factores A, B1 y B de GE 81112 puros se lleva a
cabo en un instrumento de HPLC semipreparativo
(Shimadzu-LC8A) equipado con una columna Hibar
Lichrosorb (Merck) de 25 x 250 mm RP8 (tamaño de partícula 7
\mum) que se eluye con un caudal de 35 mL/minuto con formato
amónico 40 mM llevado a pH 4,5 con ácido fórmico. Los eluatos de
varios experimentos cromatográficos repetidos que contienen los
factores de GE 81112 separados se juntan según su contenido, y son
concentrados a presión reducida hasta disoluciones acuosas, que son
secadas por congelación dando lugar a los factores A, B1 y B de GE
81112 purificados.
Como es habitual en este campo, la etapa de
producción, así como las de recuperación y purificación, pueden
monitorizarse empleando una variedad de procedimientos analíticos
que incluyen bioensayo con microorganismos susceptibles y/o
procedimientos de HPLC. Una técnica analítica preferida de HPLC se
lleva a cabo en un instrumento Shimadzu LC10 equipado con una
columna de 250 x 4,6 mm empaquetada con fase estacionaria C18 de 5
\mum de tamaño de partícula Symmetry (Waters) o Altima (Alltech),
eluyendo con un caudal de 1 mL/minuto con formato amónico 40 mM
llevado a pH 4,5 con ácido fórmico. La detección se realizó a 230
nm. En estas condiciones, los Factores A, B1 y B mostraron
típicamente tiempos de retención de 13, 18 y 21 minutos,
respectivamente.
Puesto que las sustancias antibióticas de la
invención poseen funciones ácidas y básicas, pueden existir también
en forma de sales internas o de zwitteriones a los valores de pH
apropiados. Además, pueden formar sales de acuerdo con los
procedimientos convencionales. Las sales de adición ácida adecuadas
y representativas de los compuestos de la invención incluyen las
sales formadas por reacción estándar tanto con ácidos orgánicos como
inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, bromhídrico,
sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, tricloroacético,
succínico, cítrico, ascórbico, láctico, maleico, fumárico,
palmítico, cólico, pamoico, múcico, glutámico, canfórico,
glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, laurico, esteárico,
salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico,
benzoico, cinámico, y similares.
Los ejemplos representativos de las bases que
pueden formar sales de adición con los compuestos de GE 81112 son:
hidróxidos de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos tales
como hidróxido sódico, potásico y cálcico; amoniaco y aminas
orgánicas alifáticas, alicíclicas o aromáticas, tales como
metilamina, dimetilamina, trimetilamina y picolina.
La transformación de un compuesto libre o
zwitteriónico de la invención en la correspondiente sal, y la
inversa, es decir, la transformación de una sal de un compuesto de
la invención en la forma del compuesto libre o zwitteriónica, se
encuentran al alcance del especialista en la técnica y son abarcadas
por la presente invención.
Por ejemplo, un compuesto de la invención puede
ser transformado en la correspondiente sal de adición ácida o básica
disolviendo la forma no salina en un disolvente acuoso y añadiendo
un ligero exceso molar del ácido o base seleccionado. La disolución
o suspensión resultante es liofilizada a continuación para recuperar
la sal deseada.
En caso de que la forma salina final sea
insoluble en un disolvente en el que la forma no salina es soluble,
se recupera mediante filtración de la disolución.
La forma no salina puede prepararse a partir de
una sal ácida o básica correspondiente disuelta en un disolvente
acuoso cuando se neutraliza la liberar la forma no salina.
Cuando después de la neutralización es necesaria
una desalación, se puede emplear un procedimiento de desalación
común. Por ejemplo, se puede usar de forma conveniente cromatografía
de columna sobre gel de sílice, poliestireno no funcionalizado,
resinas acrílicas y de polidextrano de poro controlado (tal como
Sephadex LH 20) o carbón activado. Después de eluir las sales no
deseadas con una disolución acuosa, el producto deseado es eluido
por medio de un gradiente lineal o un gradiente de escalón de una
mezcla de agua y un disolvente orgánico polar o apolar, tal como
acetonitrilo/agua, de 50:50 a aproximadamente 100% de
acetonitrilo.
Tal como se conoce en la técnica, la formación
de sales de adición con ácidos (o bases) farmacéuticamente
aceptables o con ácidos (o bases) no aceptables farmacéuticamente,
puede usarse como una técnica de purificación conveniente. Después
de la formación y aislamiento, la forma de sal de adición de los
compuestos de GE 81112 puede transformarse en la correspondiente
forma libre zwitteriónica o en una sal de adición farmacéuticamente
aceptable diferente.
\vskip1.000000\baselineskip
El factor A de GE 81112 proporciona un ion
monoprotonado a m/z = 644 en los experimentos de MS en un
instrumento Thermofinnigan LCQ deca ajustado con una fuente de
electropulverización, usando una mezcla de calibración
Thermofinnigan. Las condiciones de electropulverización fueron:
Voltaje de Pulverización: 4,7 kV; Temperatura Capilar: 250ºC;
Voltaje Capilar: 9 V; Modo de infusión 5 \muL/min. Se registraron
los espectros de una disolución
0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v).
0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v).
La Figura 1 muestra un espectro
MS-MS típico de factor A de GE 81112 después de
fragmentación del ion monoprotonado a m/z = 644 con una energía de
colisión normalizada del 25%. El factor A de GE 81112 proporciona
una masa exacta del ion monoprotonado a m/z = 644,2186 en
experimentos con un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, de 4,7
Teslas, ajustado con una fuente de electropulverización. Las
condiciones de FTMS fueron: Electropulverización: Fuente Analítica,
Pulverización fuera de Eje, 60 \muL/h; Gas de Secado 200ºC;
Voltaje Capilar: 70 V; Voltaje de Rejilla: 10 V; Acumulación: 40
Escaneos; Modo de Banda Ancha: Resolución 20.000.
\vskip1.000000\baselineskip
El espectro de infrarrojos de factor A de GE
81112 se muestra en la Figura 2. El espectro se registró como mull
de nujol con un espectrofotómetro de Transformada de Fourier
IFS-48. Se observaron las siguientes bandas de
absorción principales (cm^{-1}): 3356; 2956; 2855; 2256; 2128;
1663; 1596; 1455; 1378; 1345; 1123; 1050; 1026; 1002; 825; 764.
El espectro de RMN de ^{1}H a 600 MHz (Figura
3) y el espectro de RMN de ^{13}C a 150 MHz (Figura 4) de factor A
de GE 81112, fueron registrados a 25ºC en
DMSO-d_{6} tras adición de ácido trifluoroacético
(TFA). En ambos espectros se detectaron las señales debidas a
formato, procedentes del proceso de purificación (desplazamiento
químico de ^{1}H a 8,13 y 7,07-7,25 ppm;
desplazamiento químico de ^{13}C a 163,0 ppm)
La Tabla IV y la Tabla V presentan las señales
de RMN de ^{1}H y de ^{13}C observadas para el factor A.
\vskip1.000000\baselineskip
El factor B de GE 81112 proporciona un ion
monoprotonado a m/z = 659 en los experimentos de MS en un
instrumento Thermofinnigan LCQ deca ajustado con una fuente de
electropulverización, usando una mezcla de calibración
Thermofinnigan. Las condiciones de electropulverización fueron:
Voltaje de Pulverización: 4,7 kV; Temperatura Capilar: 250ºC;
Voltaje Capilar: 9 V; Modo de infusión 5 uL/min. Se registraron los
espectros de una disolución
0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v). La Figura 5 muestra un espectro MS-MS típico de factor B de GE 81112 después de fragmentación del ion monoprotonado a m/z = 659 con una energía de colisión normalizada del 28%. El factor B de GE 81112 proporciona una masa exacta del ion monoprotonado a m/z = 659,2295 en experimentos con un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, de 4,7 Teslas, ajustado con una fuente de electropulverización. Las condiciones de FTMS fueron: Electropulverización: Fuente Analítica, Pulverización fuera de Eje, 60 \muL/h; Gas de Secado Gas 200º C; Voltaje Capilar: 70 V; Voltaje de Rejilla: 10 V; Acumulación: 40 Escaneos; Modo de Banda Ancha: Resolución 20.000.
0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v). La Figura 5 muestra un espectro MS-MS típico de factor B de GE 81112 después de fragmentación del ion monoprotonado a m/z = 659 con una energía de colisión normalizada del 28%. El factor B de GE 81112 proporciona una masa exacta del ion monoprotonado a m/z = 659,2295 en experimentos con un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, de 4,7 Teslas, ajustado con una fuente de electropulverización. Las condiciones de FTMS fueron: Electropulverización: Fuente Analítica, Pulverización fuera de Eje, 60 \muL/h; Gas de Secado Gas 200º C; Voltaje Capilar: 70 V; Voltaje de Rejilla: 10 V; Acumulación: 40 Escaneos; Modo de Banda Ancha: Resolución 20.000.
\vskip1.000000\baselineskip
El espectro de infrarrojos de factor B de GE
81112 se muestra en la Figura 6. El espectro se registró en KBr con
un espectrofotómetro de Transformada de Fourier
IFS-48. Se observaron las siguientes bandas de
absorción principales (cm^{-1}): 3359; 2958; 2852; 2258; 2129;
1681; 1591; 1450; 1385; 1347; 1122; 1072; 1025; 998; 765.
C) RMN de ^{1}H y RMN de ^{13}C El espectro
de RMN de ^{1}H a 600 MHz (Figura 7) y el espectro de RMN de
^{13}C a 150 MHz (Figura 8) de factor B de GE 81112, fueron
registrados a 25ºC en DMSO-d_{6} tras adición de
ácido trifluoroacético (TFA). En ambos espectros se detectaron las
señales debidas a formato, procedentes del proceso de purificación
(desplazamiento químico de ^{1}H a 8,13 y
7,07-7,25 ppm; desplazamiento químico de ^{13}C a
163,0 ppm).
La Tabla VI y la Tabla VII presentan las señales
de RMN de ^{1}H y de ^{13}C observadas para el factor B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El factor B1 de GE 81112 proporciona un ion
monoprotonado a m/z = 658 en los experimentos de MS en un
instrumento Thermofinnigan LCQ deca ajustado con una fuente de
electropulverización, usando una mezcla de calibración
Thermofinnigan. Las condiciones de electropulverización fueron:
Voltaje de Pulverización: 4,7 kV; Temperatura Capilar: 250ºC;
Voltaje Capilar: 9 V; Modo de infusión 5 \muL/min. Se registraron
los espectros de una disolución
0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v). La Figura 9 muestra un espectro MS-MS típico de factor B1 de GE 81112 después de fragmentación del ion monoprotonado a m/z = 658 con una energía de colisión normalizada del 25%.
0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v). La Figura 9 muestra un espectro MS-MS típico de factor B1 de GE 81112 después de fragmentación del ion monoprotonado a m/z = 658 con una energía de colisión normalizada del 25%.
El factor B1 de GE 81112 proporciona una masa
exacta del ion monoprotonado a m/z = 658,2459 en experimentos con un
espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, de 4,7 Teslas, ajustado con
una fuente de electropulverización. Las condiciones de FTMS fueron:
Electropulverización: Fuente Analítica, Pulverización fuera de Eje,
60 \muL/h; Gas de Secado Gas 200º C; Voltaje Capilar: 70 V;
Voltaje de Rejilla: 10 V; Acumulación: 40 Escaneos; Modo de Banda
Ancha: Resolución 20.000.
\vskip1.000000\baselineskip
El espectro de RMN de ^{1}H a 600 MHz (Figura
10) y el espectro de RMN de ^{13}C a 150 MHz (Figura 11) de factor
B1 de GE 81112, fueron registrados a 25ºC en
DMSO-d_{6}. En ambos espectros se detectaron las
señales debidas a formato, procedentes del proceso de purificación
(desplazamiento químico de ^{1}H a 8,32 ppm; desplazamiento
químico de ^{13}C a 165,28 ppm).
\newpage
La Tabla VIII y la Tabla IX presentan las
señales de RMN de ^{1}H y de ^{13}C observadas para el factor
B1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad antimicrobiana de los factores A, B
y B1 de GE 81112 se determinó usando un método de microdilución con
placas de 96 pocillos de fondo en U estándares, de acuerdo con The
National Committee for Clinical Laboratory Standards (Methods for
Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow
Aerobically- Tercera Edición; Patrón Aprobado. Documento NCCLS
M7-A3 Vol.13 Nº 25). Los resultados se exponen en la
Tabla 10.
Las cepas usadas fueron elementos aislados
clínicos o de la American Type Culture Collection (ATCC). Los
factores de GE 81112 fueron disueltos en DMSO; dicha disolución se
diluyó nuevamente con agua destilada.
Los medios usados fueron caldo de Mueller Hinton
de cationes ajustados (CAMHB) para Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Entezococcus
faecalis; caldo de Todd Hewitt (THB) para
Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae;
medio antibiótico Nº 3 (AM3) y Caldo de Davis Mingioli de Medio Base
+ 2% (p/v) de glucosa + 100 \mug/mL de asparagina (MM),
Bacillus subtilis; Caldo de Davis Mingioli + 2% (p/v) de
glucosa (MM) para Escherichia coli; RPMI 1640 (RPMI) y
Minimal 40 + 0,1% de vitaminas (MM) para Candida albicans. A
menos que se indique lo contrario los inóculos fueron de 10^{4}
CFU/mL. Todas las cepas fueron incubadas a 35ºC en aire. El tiempo
de incubación fue de 18-24 horas. Se llevaron a cabo
lecturas visuales tras la incubación y se definió la MIC como la
menor concentración que inhibía por completo el crecimiento de los
microorganismos evaluados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los factores A, B y B1 de GE 81112 inhiben el
crecimiento de Moraxella catarrhalis, con una MIC en el intervalo de
1-2 \mug/mL.
La cepa usada es un elemento aislado
clínico.
Los factores A, B y B1 también muestran una
actividad marginal (MIC de 64 \mug/mL) contra
Streptococcus pneumoniae, elemento aislado clínico.
Además, los factores A y B presentan una MIC de 32 \mug/mL contra
Enterococcus faecalis resistente a Vancomicina (VanA),
mientras que el factor B1 no es activo hasta una concentración de
512 \mug/mL.
M. catarrhalis y S. pneumoniae son
dos patógenos de humanos reconocidos importantes. Son una causa
común de infecciones del tracto respiratorio, particularmente de
otitis en niños y de infecciones del tracto respiratorio inferior
en mayores. M. catarrhalisy S. pneumoniae han sido
aceptados recientemente como los patógenos más comunes del tracto
respiratorio (M.C. Enright y H. McKenzy, Moraxella (Branhamella)
catarrhalis - Clinical and molecular aspect of a rediscovered
pathogen, J. Med. Microbiol. 46, 360-71,
1997).
Los Enterococos resistentes a la vancomicina
(VRE) están surgiendo como importantes patógenos adquiridos en
hospitales responsables de infecciones humanas graves (tal como
endocarditis, meningitis y septicemia), lo que supone un creciente
desafío terapéutico (Y.Cetinkaya, P.Falk, C.G.Mayhall,
Vancomycin-resistant enterococci, Clin. Microbiol.
Rev. 13, 686-707, 2000; L. B. Rice Emergence
of vancomycin-resistant enterococci, Emerg. Infec.
Dis. 7, 183-1, 2001).
Los factores A, B y B1 de GE 81112 también
inhiben a concentraciones muy bajas, definitivamente inferiores
a
1 \mug/mL, el crecimiento de E. coli y B. subtilis cuando estas bacterias se cultivan en medio mínimo (MM). Las MICs de los factores A, B y B1 se encuentran en el intervalo de 256-512 \mug/mL o superior cuando las mismas bacterias se cultivan en medio rico.
1 \mug/mL, el crecimiento de E. coli y B. subtilis cuando estas bacterias se cultivan en medio mínimo (MM). Las MICs de los factores A, B y B1 se encuentran en el intervalo de 256-512 \mug/mL o superior cuando las mismas bacterias se cultivan en medio rico.
Los factores A, B y B1 de GE 81112 no inhibieron
el crecimiento de Candida albicans ni en medio mínimo ni en
medio rico.
\newpage
El comportamiento diferencial de los factores A,
B y B1 de GE 81112 con bacterias como E. coli y B.
subtilis frente a un organismo eucariótico tal como C.
albicans sugiere que el mecanismo de acción de los compuestos
de GE 81112 es específico de organismos procarióticos.
De acuerdo con tendencias recientes en la
terapia antimicrobiana, la sustitución de agentes con actividad de
amplio espectro por agentes con un espectro antimicrobiano más
estrecho que (sea) sean activos selectivamente contra el
patógeno(s) aislado, se ve favorecida debido a que reduce la
presión selectiva a desarrollar resistencia (J. C. Gyssens:
"Quality Measures of Antimicrobial Drug Use" en Int. J.
Antimicrobial Agents, 17, 2001, 9-19; J. Chopra
"Research and Development of Antibacterial Agents" en Current
Opinion in Microbiology, 1998, 1, 495-501). Por
tanto, los compuestos de GE 81112 de esta invención son
particularmente adecuados para su uso como agentes selectivos para
el tratamiento de infecciones del tracto respiratorio debido a M.
catarrhalis.
Los compuestos de la invención se pueden
administrar como una composición farmacéuticamente aceptable, como
tales o mezclados con vehículos farmacéuticamente aceptables, y
también pueden administrarse en combinación con otros agentes
antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas,
aminoglicósidos y glicopéptidos. De este modo, la terapia combinada
incluye la administración secuencial, simultánea y separada del
compuesto activo de modo que los efectos terapéuticos de la
administración del primer compuesto no hayan desaparecido por
completo cuando se produzca la administración del segundo
compuesto.
Por consiguiente, los compuestos de la invención
también pueden usarse como medicamentos; los factores individuales
A, B y B1 pueden utilizarse por sí solos o como una mezcla de dos o
más de ellos, en cualquier proporción. Dicha mezcla puede obtenerse
mezclando cantidades predeterminadas de dos o más factores.
Alternativamente, las mezclas de factores se pueden obtener
directamente a partir del aislamiento del producto de fermentación
de Streptomyces sp. DSMZ 14386 de acuerdo con el proceso
anteriormente descrito.
Preferiblemente, los compuestos de la invención
se formulan en formulaciones adecuadas para administración
parenteral y/u oral y/o tópica, según procedimientos conocidos en la
técnica y documentados en libros de referencia.
Para la administración i.v. en el tratamiento de
cualquier infección que implique un microorganismo susceptible al
antibiótico, una formulación farmacéutica es, por ejemplo, en agua
con un agente solubilizante adecuado tal como polipropilénglicol o
dimetilacetamida y un agente tensioactivo tal como monooleato de
sorbitán de poliosietileno o aceite de ricino polietoxilado en agua
esterilizada para inyección. Preferiblemente, una formulación para
inyección debería tener un pH en el intervalo de 7\pm0,5. Si es
necesario, podría ser aconsejable ajustar el pH de la preparación
con un agente tamponante adecuado. De forma conveniente, se puede
usar fosfato como agente tamponante.
Alternativamente, el ingrediente activo puede
prepararse como un polvo liofilizado para reconstitución.
Opcionalmente, se puede añadir un adyuvante de liofilización común,
si es necesario, para obtener un material liofilizado en forma de
polvo.
El antibiótico también puede usarse en una forma
farmacéutica adecuada, tal como una cápsula, un comprimido o una
disolución o suspensión acuosa (por ejemplo, un jarabe) para
administración oral, o puede incorporarse a cremas o geles
convencionales para aplicaciones tópicas, o en formulaciones
líquidas adecuadas para terapia de inhalación.
La dosis de ingrediente activo depende de muchos
factores que incluyen el tipo, la edad y las condiciones del
paciente, del ingrediente activo específico y la formulación
seleccionada para la administración, del esquema de administración,
etc. En general, se emplean dosis antimicrobianas efectivas por
forma de dosis unitaria. En general se prefieren las
aplicaciones/administraciones repetidas, por ejemplo de 2 a 6 veces
al día. Una dosis eficaz puede estar normalmente en el intervalo de
0,5-50 mg/kg de peso corporal/día. Una preparación
tópica preferida es un ungüento que contiene del 1% al 10% de un
compuesto de la presente invención.
En cualquier caso, el médico que prescribe será
capaz de determinar la dosis óptima para un paciente dado en una
situación dada.
La Figura 1 representa el espectro MSMS de
factor A de GE 81112 después de fragmentación del ion monoprotonado
a m/z = 644 con una energía de colisión normalizada del 25%.
La Figura 2 representa el espectro de absorción
I.R. de antibiótico factor A de GE 81112 en mull de nujol.
La Figura 3 representa el espectro de RMN de
^{1}H de antibiótico factor A de GE 81112, medido a 600 MHz en
DMSO-d_{6} y TFA (gotas).
La Figura 4 representa el espectro de RMN de
^{13}C con protón desacoplado de antibiótico factor A de GE 81112
a 150 MHz en DMSO-d_{6} y TFA (gotas).
La Figura 5 representa el espectro MSMS de
factor B de GE 81112 después de fragmentación del ion monoprotonado
a m/z = 659 con una energía de colisión normalizada del 28%.
La Figura 6 representa el espectro de absorción
I.R. de antibiótico factor B de GE 81112 en KBr.
La Figura 7 representa el espectro de RMN de
^{1}H de antibiótico factor B de GE 81112, medido a 600 MHz en
DMSO-d_{6} y TFA (gotas).
La Figura 8 representa el espectro de RMN de
^{13}C con protón desacoplado de antibiótico factor B de GE 81112
a 150 MHz en DMSO-d_{6} y TFA (gotas).
La Figura 9 representa el espectro MSMS de
factor B1 de GE 81112 después de fragmentación del ion monoprotonado
a m/z = 658 con una energía de colisión normalizada del 25%.
La Figura 10 representa el espectro de RMN de
^{1}H de antibiótico factor B1 de GE 81112, medido a 600 MHz en
DMSO-d_{6}.
La Figura 11 representa el espectro de RMN de
^{13}C de protón desacoplado de antibiótico factor B1 de GE 81112
a 150 MHz en DMSO-d_{6}.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar más detalladamente la invención sin limitarla.
El cultivo sembrado, almacenado a -80ºC en
viales, se usó para inocular un matraz Erlenmeyer de 500 mL que
contiene 100 mL de medio V6 (V6) que tiene la siguiente composición
(g/L): glucosa 20, extracto de carne 5, extracto de levadura 5,
peptona 5, caseína hidrolizada 3 y NaCl 1,5. El medio se preparó con
agua destilada y se ajustó el pH a 7,5 con NaOH antes de
esterilización a 120ºC durante 20 minutos. El matraz inoculado se
incubó durante 40-48 horas a 28ºC en un agitador
rotatorio a 200 rpm y a continuación se usó para inocular un
biorreactor de 4 litros que contiene 3 litros de medio V6. El
cultivo se desarrolló a una temperatura de 27ºC durante las
primeras 30 horas y a continuación a 24ºC las siguientes 18 horas
hasta el tiempo de inoculación. La agitación se mantuvo a 700 rpm,
con un caudal de aire de 0,5 v/v/min. Este cultivo (1,5 litros) se
inoculó en un fermentador de 300 litros que contiene 200 litros de
medio de producción que tiene la siguiente composición (g/L):
glicerol 30, harina de semilla de soja 15, carbonato cálcico 5 y
cloruro sódico 2. El medio se preparó con agua desionizada y se
ajustó el pH a 7,3 con NaOH. Se añadieron 30 mL de Hodag
AFM-5 como agente antiespumante. Este cultivo se
fermentó durante 62 horas a 28ºC, con un caudal de aire de 60 L/min
durante las primeras 18 horas y a continuación se incrementó hasta
100 L/min
(0,5 v/v/min) hasta el tiempo de recolección. La agitación fue de 180 rpm.
(0,5 v/v/min) hasta el tiempo de recolección. La agitación fue de 180 rpm.
A continuación se diluyó el caldo recolectado
hasta 200 L con agua destilada y se filtró tras adición de un
adyuvante de filtración Hyflo. El micelio se descargó y se llevó el
filtrado a pH 3,5 mediante la adición de aproximadamente
600 mL de HCl 3,25 M. La mezcla antibiótica de GE 81112 se adsorbió entonces sobre 2,5 L de resina de intercambio catiónico Dowex 50 W x 2 en forma ácida (The Dow Chemical Company). Después de agitar la carga durante una noche, se recuperó la resina mediante filtración y se descargó el caldo. Se procesaron dos fermentadores en paralelo tal como se ha descrito anteriormente y a continuación se reunieron las resinas Dowex procedentes de los ensayos individuales. La resina (5 L) se cargó en una columna (12,5 cm de diámetro; 45 cm de altura de lecho), y se lavó con un caudal de 90 mL/min con 6 L de tampón de pH 3,5 de fosfato sódico 20 mM; a continuación con 10 L de tampón de pH 3,5 de fosfato sódico 20 mM: metanol 8:2 (v/v) mezclados. Entonces se llevó a cabo la elución con amoníaco
257 mM tamponado a pH 10 con ácido fosfórico. Se recogieron fracciones de un litro que fueron llevadas inmediatamente a aproximadamente pH 6 mediante adición de ácido fosfórico. Se evaluó el contenido en antibiótico de cada fracción mediante bioensayo, es decir, inhibición del crecimiento de E. coli y de S. subtilis cultivados en Medio Mínimo (MM) y mediante HPLC analítico, según el método descrito en el Ejemplo 2. Las fracciones 5-10 eluidas de la resina Dowex fueron reunidas dando lugar a 5,8 L de disolución enriquecida de mezcla de compuestos de GE 81112. Se concentró una muestra (50 mL) de dicha disolución a vacío y a continuación se liofilizó dando lugar a 1,48 g de preparación de compuestos de GE 81112 sin purificar.
600 mL de HCl 3,25 M. La mezcla antibiótica de GE 81112 se adsorbió entonces sobre 2,5 L de resina de intercambio catiónico Dowex 50 W x 2 en forma ácida (The Dow Chemical Company). Después de agitar la carga durante una noche, se recuperó la resina mediante filtración y se descargó el caldo. Se procesaron dos fermentadores en paralelo tal como se ha descrito anteriormente y a continuación se reunieron las resinas Dowex procedentes de los ensayos individuales. La resina (5 L) se cargó en una columna (12,5 cm de diámetro; 45 cm de altura de lecho), y se lavó con un caudal de 90 mL/min con 6 L de tampón de pH 3,5 de fosfato sódico 20 mM; a continuación con 10 L de tampón de pH 3,5 de fosfato sódico 20 mM: metanol 8:2 (v/v) mezclados. Entonces se llevó a cabo la elución con amoníaco
257 mM tamponado a pH 10 con ácido fosfórico. Se recogieron fracciones de un litro que fueron llevadas inmediatamente a aproximadamente pH 6 mediante adición de ácido fosfórico. Se evaluó el contenido en antibiótico de cada fracción mediante bioensayo, es decir, inhibición del crecimiento de E. coli y de S. subtilis cultivados en Medio Mínimo (MM) y mediante HPLC analítico, según el método descrito en el Ejemplo 2. Las fracciones 5-10 eluidas de la resina Dowex fueron reunidas dando lugar a 5,8 L de disolución enriquecida de mezcla de compuestos de GE 81112. Se concentró una muestra (50 mL) de dicha disolución a vacío y a continuación se liofilizó dando lugar a 1,48 g de preparación de compuestos de GE 81112 sin purificar.
La disolución obtenida como en el Ejemplo 1 se
agitó durante la noche con 1,2 L de resina poliestirénica HP20
(Mitsubishi Chemicals Co.). A continuación se recuperó la resina
mediante filtración y se cargó en una columna de 7,5 cm de diámetro
por 27 cm de altura de lecho. Entonces se eluyó la columna con un
caudal de 40 mL/min con
6 L de una mezcla 1:9 (v/v) de metanol: agua destilada, y entonces con 4 L de una mezcla 3:7 (v/v). Se recolectaron fracciones de un litro y se analizaron mediante HPLC. Las primeras tres fracciones contenían una mezcla de factores de GE 81112 enriquecida en factor A y se juntaron. Las siguientes tres fracciones estaban enriquecidas en los factores B1 y B y también se juntaron. Los dos conjuntos fueron concentrados a vacío hasta un volumen pequeño y a continuación se liofilizaron, dando lugar a 3,8 g y a 1,7 g de sólidos enriquecidos en factor A y en los factores B1 más B, respectivamente.
6 L de una mezcla 1:9 (v/v) de metanol: agua destilada, y entonces con 4 L de una mezcla 3:7 (v/v). Se recolectaron fracciones de un litro y se analizaron mediante HPLC. Las primeras tres fracciones contenían una mezcla de factores de GE 81112 enriquecida en factor A y se juntaron. Las siguientes tres fracciones estaban enriquecidas en los factores B1 y B y también se juntaron. Los dos conjuntos fueron concentrados a vacío hasta un volumen pequeño y a continuación se liofilizaron, dando lugar a 3,8 g y a 1,7 g de sólidos enriquecidos en factor A y en los factores B1 más B, respectivamente.
Los factores puros individuales fueron obtenidos
entonces mediante HPLC preparativo (Shimadzu-LC8A)
en una columna Hibar Lichrosorb (Merck) de 25 x 250 mm RP8 (tamaño
de partícula, 7 \mum) que se eluyó con un caudal de 3,5 mL/min
con formato amónico 40 mM llevado a pH 4,5 con ácido fórmico. Se
disolvieron aproximadamente 100 mg de las anteriores preparaciones
de antibióticos en 350 \mum de fase eluyente, y se procesaron
mediante ensayo cromatográfico. Los factores A, B1 y B fueron
eluidos típicamente después de aproximadamente 9,5; 12,4 y 13,4
minutos, respectivamente. Las fracciones de ensayos cromatográficos
repetidos que mostraron un contenido en antibióticos homogéneo
fueron reunidas y se concentraron a vacío hasta residuo de agua. A
continuación las disoluciones fueron liofilizadas, se disolvieron
de nuevo en 40 mL de agua destilada y se volvieron a liofilizar para
dar lugar a 116, 13 y 10 mg de antibiótico de factor A, B1 y B de GE
81112, respectivamente.
Se realizó un análisis de HPLC en un instrumento
Shimadzu LC10-AS, equipado con un detector de
conjunto de diodos SPD-M10A y con un autoinyector
Sil-9A. La columna cromatográfica fue una
"Altima" RP18, 5 \mum,
250 x 4,6 mm d.i., comprada a Alltech. Se llevó a cabo la elución isocrática con un caudal de 1 mL/min, con tampón de formato de amonio 40 mM llevado a pH 4,5 mediante adición de ácido fórmico. La detección de UV se realizó a 230 nm.
250 x 4,6 mm d.i., comprada a Alltech. Se llevó a cabo la elución isocrática con un caudal de 1 mL/min, con tampón de formato de amonio 40 mM llevado a pH 4,5 mediante adición de ácido fórmico. La detección de UV se realizó a 230 nm.
Se evaluaron los tres factores en las
condiciones analíticas de HPLC descritas anteriormente y mostraron
los siguientes tiempos de retención: factor A, 14,1 minutos, factor
B1, 18,4 minutos y factor B, 21,6 minutos.
Claims (15)
1. Antibiótico de Factor A de GE 81112, que se
obtiene cultivando la cepa Streptomyces sp. DSMZ 14386 en
condiciones aerobias en un medio nutriente acuoso que contiene
fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas, y que
tiene las siguientes características:
- A)
- Espectro de masas registrado a partir de una disolución de 0,01 mg/mL en acetonitrilo:agua 50:50 que proporciona un ion monoprotonado a 644 m/z en un instrumento Thermofinnigan LCQ deca en las siguientes condiciones de electropulverización: Voltaje de Pulverización: 4,7 kV; Temperatura Capilar: 250ºC; Voltaje Capilar: 9 V; Modo de infusión 5 \muL/min;
- B)
- Espectro de infrarrojo (Figura 2) registrado como mull de nujol con un espectrofotómetro de Transformada de Fourier IFS-48 que muestra las siguientes bandas principales (cm^{-1}):
- 3356; 2956; 2855; 2256; 2128; 1663; 1596; 1455; 1378; 1345; 1123; 1050; 1026; 1002; 825; 764;
- C)
- Espectro de RMN de ^{1}H (Figura 3) registrado a 600 MHz a 25ºC en DMSO-d_{6} y ácido trifluoroacético (gotas) que muestras las siguientes señales de ^{1}H:
- D)
- Espectro de RMN de ^{13}C (Figura 4) registrado a 150 MHz, a 25ºC en DMSO-d_{6} y ácido trifluoroacético (gotas) que muestra las siguientes señales de ^{13}C:
- E)
- Tiempo de retención de 14,1 minutos, determinado usando un HPLC analítico Shimadzu LC10-AS, equipado con una columna "Altima" RP18, 5 \mum, 250 x 4,6 mm d.i.; elución isocrática llevada a cabo con un caudal de 1 mL/min, con tampón de formato amónico 40 mM, llevado a pH 4,5 mediante adición de ácido fórmico; detección de UV a 230 nm;
- F)
- Posee funciones ácidas y básicas;
- G)
- Inhibe el crecimiento de Moraxella catarrhalis; inhibe el crecimiento de Escherichia coli y de Bacillus subtilis cuando dichas bacterias se cultivan en medio mínimo; muestra actividad marginal contra Streptococcus pneumoniae; no inhibe el crecimiento de Candida albicans;
y sus sales con ácidos y bases.
2. Antibiótico de Factor B de GE 81112, que se
obtiene cultivando la cepa Streptomyces sp. DSMZ 14386 en
condiciones aerobias en un medio nutriente acuoso que contiene
fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas, y que
tiene las siguientes características:
- A)
- Espectro de masas registrado a partir de una disolución de 0,01 mg/mL en acetonitrilo: agua 50:50 que proporciona un ion monoprotonado a 659 m/z en un instrumento Thermofinnigan LCQ deca en las siguientes condiciones de electropulverización: Voltaje de Pulverización: 4,7 kV; Temperatura Capilar: 250ºC; Voltaje Capilar: 9 V; Modo de infusión 5 \muL/min;
- B)
- Espectro de infrarrojo (Figura 6) registrado como mull de nujol con un espectrofotómetro de Transformada de Fourier IFS-48 que muestra las siguientes bandas principales (cm^{-1}):
- 3359; 2958; 2852; 2258; 2129; 1681; 1591; 1450; 1385; 1347; 1122; 1072; 1025; 998; 765;
- C)
- Espectro de RMN de ^{1}H (Figura 7) registrado a 600 MHz a 25ºC en DMSO-d_{6} y ácido trifluoroacético (gotas) que muestras las siguientes señales de ^{1}H:
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
- D)
- Espectro de RMN de ^{13}C (Figura 8) registrado a 150 MHz, a 25ºC en DMSO-d_{6} y ácido trifluoroacético (gotas) que muestra las siguientes señales de ^{13}C:
- E)
- Tiempo de retención de 21,6 minutos, determinado usando un HPLC analítico Shimadzu LC10-AS, equipado con una columna "Altima" RP18, 5 \mum, 250 x 4,6 mm d.i.; elución isocrática llevada a cabo con un caudal de 1 mL/min, con tampón de formato amónico 40 mM, llevado a pH 4,5 mediante adición de ácido fórmico; detección de UV a 230 nm;
- F)
- Posee funciones ácidas y básicas;
- G)
- Inhibe el crecimiento de Moraxella catarrhalis; inhibe el crecimiento de Escherichia coli y de Bacillus subtilis cuando dichas bacterias se cultivan en medio mínimo; muestra actividad marginal contra Streptococcus pneumoniae; no inhibe Candida albicans;
y sus sales con ácidos y bases.
3. Antibiótico de Factor B1 de GE 81112, que se
obtiene cultivando la cepa Streptomyces sp. DSMZ 14386 en
condiciones aerobias en un medio nutriente acuoso que contiene
fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas, y
que tiene las siguientes características:
- A)
- Espectro de masas registrado a partir de una disolución de 0,01 mg/mL en acetonitrilo: agua 50:50 que proporciona un ion monoprotonado a 658 m/z en un instrumento Thermofinnigan LCQ deca en las siguientes condiciones de electropulverización: Voltaje de Pulverización: 4,7 kV; Temperatura Capilar: 250ºC; Voltaje Capilar: 9 V; Modo de infusión 5 \muL/min;
- B)
- Espectro de RMN de ^{1}H (Figura 10) registrado a 600 MHz a 25º C en DMSO-d_{6} que muestra las siguientes señales de ^{1}H:
- C)
- Espectro de RMN de ^{13}C (Figura 11) registrado a 150 MHz, a 25ºC en DMSO-d_{6} que muestra las siguientes señales de ^{13}C:
- D)
- Tiempo de retención de 18,4 minutos, determinado usando un HPLC analítico Shimadzu LC10-AS, equipado con una columna "Altima" RP18, 5 \mum, 250 x 4,6 mm d.i.; elución isocrática llevada a cabo con un caudal de 1 mL/min, con tampón de formato amónico 40 mM, llevado a pH 4,5 mediante adición de ácido fórmico; detección de UV a 230 nm;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- E)
- posee funciones ácidas y básicas;
- F)
- inhibe el crecimiento de Moraxella catarrhalis; inhibe el crecimiento de Escherichia coli y de Bacillus subtilis cuando dichas bacterias se cultivan en medio mínimo; muestra actividad marginal contra Streptococcus pneumoniae; no inhibe el crecimiento de Candida albicans;
y sus sales con ácidos y bases.
4. Un proceso para producir un antibiótico de GE
81112 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que
comprende:
- -
- cultivar Streptomyces sp. DSMZ 14386 o una variante o un mutante de la misma que mantenga la capacidad genética de producir los antibióticos de GE 81112 en condiciones aerobias en un medio nutriente acuoso que comprende fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas;
- -
- recuperar la mezcla antibiótica resultante del caldo de fermentación;
- -
- purificar la mezcla antibiótica recuperada y separar los tres antibióticos de factor A, B y B1 de GE 81112.
5. Una mezcla de dos o más antibióticos de
factores de GE 81112 de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 en
cualquier proporción, y las sales farmacéuticamente aceptables de
los mismos.
6. Una mezcla de acuerdo con la reivindicación 5
de antibióticos de factores de GE 81112 en cualquier proporción,
siendo dicha mezcla antibiótica de factores de GE 81112 la aislada
del caldo de fermentación de Streptomyces sp. DSMZ 14386, o
una variante o mutante de la misma que produzca antibióticos de GE
81112 y que mantenga la capacidad genética de producir dichos
antibióticos de GE 81112.
7. Un proceso para producir una mezcla de
antibióticos de factores de GE 81112 de acuerdo con la
reivindicación 6, que comprende:
- -
- cultivar Streptomyces sp. DSMZ 14386 o una variante o mutante de la misma que mantenga la capacidad genética de producir dichos antibióticos de GE 81112;
- -
- recuperar la mezcla antibiótica resultante de Factores de GE 81112 del caldo de cultivo; y
- -
- purificar dicha mezcla antibiótica de factores de GE 81112.
8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4 y 7, en el que se pre-cultiva
Streptomyces sp. DSMZ 14386, o una variante o mutante de la
misma que mantenga la capacidad genética de producir los
antibióticos de GE 81112.
9. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4, 7 y 8, en el que la recuperación se lleva a
cabo sobre una resina de intercambio iónico y la purificación se
lleva a cabo sobre una matriz de adsorción, preferiblemente sobre
una resina de poliestireno o mixta de
poliestireno-divinilbenceno.
10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4, 7, 8 y 9, en el que la separación de
antibióticos de Factores A, B y B1 de GE 81112 se lleva a cabo por
medio de una técnica cromatográfica.
11. Un proceso como el de la reivindicación 10,
en el que la técnica cromatográfica es una técnica de HPLC
preparativo.
12. Una composición farmacéutica que comprende
un antibiótico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, 5 y 6.
13. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 12, que comprende un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
14. El uso de un antibiótico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 y 6 para la fabricación
del medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas.
15. Un cultivo biológico puro de la cepa
Streptomyces Sp. DSMZ 14386.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01128204 | 2001-11-28 | ||
| EP01128204 | 2001-11-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2299635T3 true ES2299635T3 (es) | 2008-06-01 |
Family
ID=8179366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02803759T Expired - Lifetime ES2299635T3 (es) | 2001-11-28 | 2002-10-04 | Antibioticos factores a, b, b1 de ge81112, composiciones y sales farmaceuticamente aceptables y su uso. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7407654B2 (es) |
| EP (1) | EP1448784B1 (es) |
| JP (1) | JP4452505B2 (es) |
| KR (1) | KR20040099257A (es) |
| CN (1) | CN1596312A (es) |
| AT (1) | ATE390490T1 (es) |
| AU (2) | AU2002365433A1 (es) |
| BR (1) | BR0214494A (es) |
| CA (1) | CA2468400A1 (es) |
| DE (1) | DE60225834T2 (es) |
| ES (1) | ES2299635T3 (es) |
| HR (1) | HRP20040471A2 (es) |
| HU (1) | HUP0402383A3 (es) |
| IL (1) | IL161896A0 (es) |
| MX (1) | MXPA04005032A (es) |
| NO (1) | NO20042181L (es) |
| NZ (1) | NZ533732A (es) |
| PL (1) | PL370451A1 (es) |
| RU (1) | RU2004119432A (es) |
| WO (1) | WO2003046192A1 (es) |
| YU (1) | YU46804A (es) |
| ZA (1) | ZA200403675B (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7407654B2 (en) * | 2001-11-28 | 2008-08-05 | Vicuron Pharmaceuticals, Inc. | Antibiotics GE 81112 factors A,B,B1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof |
| EP3648740A1 (en) | 2017-07-07 | 2020-05-13 | EpicentRx, Inc. | Compositions for parenteral administration of therapeutic agents |
| KR102408301B1 (ko) * | 2020-03-16 | 2022-06-10 | 강원대학교산학협력단 | 항균 활성을 갖는 신균주 스트렙토마이세스 sbc-4 및 이의 용도 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5043353A (en) | 1989-10-10 | 1991-08-27 | Eli Lilly And Company | A80789 polyether antibiotic |
| JPH08504782A (ja) | 1992-12-22 | 1996-05-21 | グルポ・レペチツト・エス・ピー・エイ | 抗生物質ｇｅ３７４６８ａ、ｂ及びｃ |
| US5432193A (en) | 1993-05-14 | 1995-07-11 | American Cyanamid Company | Antibiotic LL-D37187α |
| US5426108A (en) * | 1993-11-10 | 1995-06-20 | American Cyanamid Company | Antibiotic 31F508 ALPHA1, ALPHA2, BETA1 and BETA2 |
| US5486630A (en) | 1994-09-14 | 1996-01-23 | Cheil Foods & Chemicals Inc. | Legionella specific antibiotic |
| US7407654B2 (en) * | 2001-11-28 | 2008-08-05 | Vicuron Pharmaceuticals, Inc. | Antibiotics GE 81112 factors A,B,B1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof |
-
2002
- 2002-10-04 US US10/496,009 patent/US7407654B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-04 PL PL02370451A patent/PL370451A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 WO PCT/EP2002/011113 patent/WO2003046192A1/en not_active Ceased
- 2002-10-04 EP EP02803759A patent/EP1448784B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-04 YU YU46804A patent/YU46804A/sh unknown
- 2002-10-04 KR KR10-2004-7008079A patent/KR20040099257A/ko not_active Withdrawn
- 2002-10-04 CN CNA02823720XA patent/CN1596312A/zh active Pending
- 2002-10-04 AU AU2002365433A patent/AU2002365433A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-04 JP JP2003547624A patent/JP4452505B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-04 AT AT02803759T patent/ATE390490T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-10-04 BR BR0214494-8A patent/BR0214494A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-10-04 IL IL16189602A patent/IL161896A0/xx unknown
- 2002-10-04 ES ES02803759T patent/ES2299635T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-04 HR HR20040471A patent/HRP20040471A2/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 DE DE60225834T patent/DE60225834T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-04 MX MXPA04005032A patent/MXPA04005032A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 CA CA002468400A patent/CA2468400A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-04 NZ NZ533732A patent/NZ533732A/en unknown
- 2002-10-04 RU RU2004119432/13A patent/RU2004119432A/ru not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 HU HU0402383A patent/HUP0402383A3/hu unknown
-
2004
- 2004-05-13 ZA ZA200403675A patent/ZA200403675B/xx unknown
- 2004-05-26 NO NO20042181A patent/NO20042181L/no not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-06-26 US US12/147,215 patent/US8007789B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-12-08 AU AU2008255202A patent/AU2008255202A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-08-05 US US13/198,754 patent/US20110286996A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60225834D1 (de) | 2008-05-08 |
| IL161896A0 (en) | 2005-11-20 |
| KR20040099257A (ko) | 2004-11-26 |
| CA2468400A1 (en) | 2003-06-05 |
| US20090023665A1 (en) | 2009-01-22 |
| US8007789B2 (en) | 2011-08-30 |
| JP4452505B2 (ja) | 2010-04-21 |
| AU2002365433A1 (en) | 2003-06-10 |
| HUP0402383A2 (hu) | 2005-02-28 |
| HRP20040471A2 (en) | 2004-10-31 |
| ATE390490T1 (de) | 2008-04-15 |
| RU2004119432A (ru) | 2006-01-10 |
| NZ533732A (en) | 2005-05-27 |
| NO20042181L (no) | 2004-08-04 |
| DE60225834T2 (de) | 2009-04-09 |
| EP1448784B1 (en) | 2008-03-26 |
| BR0214494A (pt) | 2004-10-19 |
| PL370451A1 (en) | 2005-05-30 |
| YU46804A (sh) | 2006-08-17 |
| ZA200403675B (en) | 2005-05-13 |
| US20050020514A1 (en) | 2005-01-27 |
| US20110286996A1 (en) | 2011-11-24 |
| CN1596312A (zh) | 2005-03-16 |
| HUP0402383A3 (en) | 2008-03-28 |
| WO2003046192A1 (en) | 2003-06-05 |
| JP2005510573A (ja) | 2005-04-21 |
| US7407654B2 (en) | 2008-08-05 |
| MXPA04005032A (es) | 2004-08-11 |
| EP1448784A1 (en) | 2004-08-25 |
| AU2008255202A1 (en) | 2009-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO164111B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et antibiotisk virksomta 40926-kompleks og dets rene faktorer pa, pb, a, b og bomikron. | |
| KR960010557B1 (ko) | 항생물질 a 40926 n-아실아미노글루쿠로닐 아글리콘 및 항생물질 a 40926 아글리콘 | |
| ES2281808T3 (es) | Antibiotico 107891, sus factores a1 y a2, composiciones y sales farmaceuticamente aceptables y uso del mismo. | |
| US5202241A (en) | Antibiotic GE 2270 | |
| EP0451486B1 (en) | Antibiotic GE 2270 factors B1, B2, C1, C2, D1, D2,E and T | |
| US8007789B2 (en) | Antibiotics GE 81112 factors A, B, B1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
| EP0668358B1 (en) | Antibiotic WAP-8294A, method for preparing the same and antibacterial composition | |
| EA016608B1 (ru) | Антибиотик 107891, его фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция и применение | |
| EP0359062B1 (en) | Antibiotic GE 2270 | |
| US6586393B2 (en) | Antibiotics GE 23077, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
| ES2981542T3 (es) | Complejo antibiótico FIIRV 104/18 y sus factores individuales aislados | |
| JPH07114704B2 (ja) | 抗生物質ａ４２８６７およびその付加塩 | |
| EP1213298A1 (en) | Antibiotics GE 23077, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
| EP1481986A1 (en) | Antibiotic 97518, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
| EP0356894A1 (en) | A novel glycopeptide antibiotic Decaplanin, a process for its production and its use as medicament | |
| WO2000055186A1 (en) | Antibiotic wap-2607b, process for producing the same and antibacterial agents | |
| KR20070098903A (ko) | 항생제 １０７８９１, 그의 팩터 ａ１ 및 ａ２, 제약학상허용되는 염 및 조성물, 및 그의 용도 | |
| Bombay et al. | EUROPEAN PATENT APPLICATION | |
| TW200409816A (en) | Antibiotics GE 81112 factors A,B,B1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof |