ES2299725T3 - Empleo de los derivados anfifilos del acido nucleosido fosfonoformico para el tratamiento de enfermedades infecciosas viricas. - Google Patents

Empleo de los derivados anfifilos del acido nucleosido fosfonoformico para el tratamiento de enfermedades infecciosas viricas. Download PDF

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Abstract

Empleo de un fosfonato nucleosido-(5''- 2)-1-0-alquilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo) a modo de sustancia activa para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas que fueron causadas por virus patógenos humanos, caracterizado porque el medicamento para el tratamiento de las enfermedades infecciosas, causadas por virus se seleccionan entre el Adenovirus, el virus Citomegalo humano y el virus Epstein-Barr.

Description

Empleo de los derivados anfífilos del ácido nucleosido fosfonofórmico para el tratamiento de enfermedades infecciosas víricas.
El invento se refiere a la utilización de los derivados anfífilos del ácido nucleosido fosfonofórmico para la elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades infecciosas virales, desencadenadas por adenovirus, citomegalovirus humano y virus Epstain-Barr.
Las infecciones virales y las enfermedades relacionadas con ellas presentan, especialmente en pacientes con inmunosupresión complicaciones de carácter cada vez más grave. Una Inmunosupresión tiene lugar por ejemplo en trasplantes de órganos sólidos y en trasplantes de cédulas madre o de tuétano de los huesos a fin de evitar que se desencadenen reacciones de rechazo. Las enfermedades virales presentan además, especialmente en pacientes con enfermedades relacionadas con la inmunidad como por ejemplo el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA=AIDS) de gravedad creciente.
El desarrollo de fármacos antivirales es según se ha demostrado extraordinariamente difícil. Esto se debe entre otras causas a que los virus solo se multiplican en cédulas huésped y además a modo de parásitos intracelulares junto con las enzimas virales que también utilizan huésped. Debido a la compleja cooperación de los genomas víricos y del cambio de sustancia de la cédula huésped es prácticamente imposible detener la replicación del virus, sin dañar la cédula huésped. Además muchas infecciones causadas por virus solo se manifiestan clínicamente cuando a consecuencia de un ataque por virus las células huésped ya han sido dañadas irreversiblemente.
A parte del virus humano de inmunodeficiencia (HIV) juegan un importante papel unos miembros de la familia Herpesviridae en enfermedades infecciosas, entre otras, de pacientes inmunosupridos. A este grupo pertenecen por ejemplo los virus Herpes simplex, el virus Varicella zoster (VZV), el virus Epstein-Barr (EPV) y el virus Cytomegalo humano (HCMV).
El virus Cytomegalo humano (HCMV) persiste tras una infección así como también los otros virus Herpes de por vida en el huésped. En el caso de los inmunocompetentes el virus Cytomegalo humano produce, por regla general, un cuadro infeccioso similar como la fiebre de Adenoma Pfeiffersche. Heiniger et al., informan que por ejemplo, puede aparecer en pacientes inmunosuprimidos por la medicina intensiva quirúrgica e infecciones sintomáticas HCMV graves en el sentido de una enfermedad orgánica. Solo un sistema completamente inmune funcionalmente capaz puede impedir una enfermedad HCMV a consecuencia de una infección HCMV.
Para la quimioterapia en infecciones producidas por virus puede emplearse inhibidores de la síntesis del ácido nucléico y de las proteínas. Un problema principal lo constituye además la toxicidad por influencia así mismo del mecanismo celular.
Actualmente se dispone solo de tres sustancias activas antivirales, con autorización para la terapia en una infección HCMV en seres humanos: Ganciclovir (GCV), Foscarnet (Ácido Sódico-Fosfonofórmico, PFA) además Cidofovir (CDV). Ganciclovir es un análogo acíclico de Guanosina, Cidofovir (CVD) es un análogo acíclico del Monofosfato de Desoxi Citidina (DCMP). Foscarnet se distingue de estos análogos nucleósidos-nucleótidos estructuralmente como sal del ácido fosfonofórmico.
Estas tres sustancias activas impiden en último término la síntesis viral del DNA por inhibición de la Polimerasa HCMV-DNA. La Guanin 9-(1,3-Dihidroxi-2 propoximetilo)(Ganciclovir) debe desarrollar como producto para desplegar su actividad antivírica, antes de ser fosforilado pasando a trifosfato de Ganciclovir. A parte de esto en una primera fase se someterá fosforilado por una transferasa de fosforo codificada HCMV (UL97) transformándose en monofosfato de gancicloviro fosforilado. A continuación se Fosforiliran las kinasas de la cédula madre de este monofosfato en trifosfato pasando por difosfato. El trifosfato de Ganciclovir se incorporan mediante síntesis viral DNA a modo análogo dGTP en el naciente ramal, lo que conduce a la rotura de la cadena de la réplica HCMV-DNA.
El Citosin-dihidrato 1-(S)-3-Hidroxi-2-(Fosfonometoxi)propilo(Cidofovir) es un monofosfonato nucleósido acíclico, que mediante kinasas celulares se fosforilará formándose en trifosfato para pasar a ser una forma activa. El fosforilado es llevado a cabo por enzimas huésped y por ello es independiente de las kinasas virus codificadas. La estructura del trifosfato de (CDV-TP) en el nuevo ramal viral DNA configurado conduce como la incorporación del trifosfato (CDV-TP) provoca en el nuevo ramal viral DNA, tal como en el caso del trifosfato GCV – la rotura de la cadena de replicación viral DNA.
Foscarnet ( Ácido sódico fosfonofórmico ) es un análogo sódico pirofosfato, que no precisa de ninguna activación inicial intracelular. Esta sustancia activa bloquea directamente el punto de unión del pirofosfato de la Polimerasa DNA viral, inhibiendo con ello la disociación de pirofosfato a partir del dNTPs.
Las mencionadas sustancias presentan en parte considerables efectos secundarios. En la publicación de Crumpacker CS., "Ganciclovir", N. Engl. J. Med. 1996, 335: 721-731, se relacionan en síntesis por los efectos secundarios de estos medicamentos.
La dosis de Ganciclovir provoca concretamente una reducción del número de los glóbulos blancos de la sangre y frecuentemente también de los trombocitos. En el caso de una administración continuada durante largo tiempo también puede llegar a causar una anemia. La administración de Ganciclovir en dosis máximas en combinación con otros fármacos mielotóxicos pueden llegar a ser una amenaza para la vida debido a su toxicidad hematológica.
Cidofovir posee una nefrotoxicidad en función de la dosis. Esta sustancia provocará un desequilibrio entre la admisión rápida en las cédulas túbulos próximas y el flujo más lento en la orina, lo que lleva a una acumulación en los riñones.
Foscarnet presenta una considerable toxicidad renal y metabólica. La nefrotoxicidad se basa en el daño directo a los capilares de los riñones. Una situación especialmente crítica con respecto a la intervención exitosa terapéutica resulta en la manifestación de una multiresistencia contra Ganciclovir, Foscarnet y Cidofovir en el caso de una infección HCMV. El desarrollo de la resistencia es un problema clínico de creciente gravedad que puede, especialmente conducir a la muerte por una multi-resistencia. En la Prä-HAART-Ära (Hihly active antiretroviral-terapia antiviral de acta actividad) se vieron afectados por el desarrollo de cepas resistentes al GCV, básicamente pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS) con Retinitis HCMV.
Para la certificación de una infección HCMV con resistencia al Ganciclovir se emplea actualmente Foscarnet como medicación alternativa. Un inconveniente a esta forma de proceder consiste sin embargo, en que se precisa de una dosis efectiva, relativamente elevada de Foscarnet, para conseguir un efecto eficaz anti-viral. Una alta dosis efectiva lleva de nuevo consigo efectos secundarios tóxicos. Al producirse una infección HCM multiresistente ya no se dispone de ningún otro agente antiviral.
Otro inconveniente con respecto a los viroestáticos actualmente disponibles, proviene de su insuficiente disponibilidad bio-oral lo que obliga a recurrir a la aplicación por vía oral intravenosa. Esto unido al eventual caso de una terapia de cierta duración con aplicación de catéteres en las venas pueden llegar a producir una sepsis.
Además resulta problemática la difusión limitada de los virostaticos altamente polares por las barreras hemocerebrales en el espacio líquido. Eckle et al., "Drug-resistant human cytomegalovirus infection in children after allogenic stem cell transplantation may have different clinical outcomes". La infección humana citomegalo virus resistente a las drogas en niños después del trasplante de células madre a allogénicas tener diferentes resultados clínicos, Blood 2000, 96 (9): 3286-3289, demostraron que, encefalitis HCMV- desencadenada por una cepa HCMV multiresistente, tras un trasplante de médula ósea podía verse influida ya sea por Ganciclovir intravenoso o intratecal, así como Foscarnet o Cidofovir.
Por el documento WO/034202 se han dado a conocer conjugados lipofilos de los ácidos fosfono-Nucleósidos, que poseen una actividad antiviral.
Las combinaciones dadas a conocer en esta publicación comprenden conjugados Nucleósidos- ácido fosfonofórmico, en donde los conjugados como mínimo tienen un grupo lipófilo y como mínimo un grupo nucleósido.
El presente invento tiene como objeto preparar una sustancia para la elaboración de un medicamento con el que se puedan tratar las enfermedades infecciosas, que se han desencadenado por virus patógenos humanos, y que también ante cepas y virus resistentes y multiresistentes presenten una alta efectividad de ahí que pueda emplearse en dosis mínimas.
Según el invento el objeto se alcanzará mediante la utilización de un fosfonato nucleósido- de glycerina-(hidroxi-
calcarbonilo) a modo de sustancia activa para la elaboración de un medicamento para enfermedades infecciosas virales, que han sido causadas por virus patógenos humanos, que se han seleccionados entre los Adenovirus, los Citomegalo virus humano, el virus Epstein-Barr.
Este tipo de derivados nucleósidos-del ácido fosfonofórmico se describen en el documento WO 00/334298.
Con esta publicación se ha dado a conocer, la elaboración del nucleotido de Glicerilo, que representa estos preparados combinados, y que por la metabolización de dos sustancias activas pueden liberarse simultáneamente. En este caso se unen ya sea dos derivados nucleosidos terapéuticamente activos o bien un derivado nucleosido con el ácido fosfonofórmico o con su presentación en forma de sal (Foscarnet) unido covalentemente por una estructura lípida de Glicerina.
Se preferirá que como sustancia activa se emplee un fosfonato nucleósido-(5'\rightarrow2)-1-0 alquil-rac-glicerina-3-(hidroxicarbonilo)), en donde el alquilo es un resto saturado de cadena lineal o ramificada con más de 6 átomos de carbono.
Algunos de los nucleotidos glicerina descritos en el documento WO/34298 serán propuestos para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas. El efecto de un fosfonato nucleósido(5'\rightarrow2)-1-0-alquil-rac-glicerina-3-hidroxicarbonilo) en enfermedades infecciosas causadas por virus patógenos humanos, sin embargo no se describen.
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Los grupos nucleósidos a emplear según el invento provienen de nucleósidos no tratándose especialmente de grupos nucleósidos de origen natural, que presentan o poseen un resto heterocíclico que está unido glicosídicamente con un resto azúcar.
Como sustancia activa preferente, se empleará especialmente el fosfonato-3'-Azido-2',3'-didesoxi-timidililo-(5'\rightarrow 2)-1-0-octadecilo-rac-glicerina-3-(hidroxicarbonilo). Esta sustancia activa ya fue descrita en el documento de WO 00/34298, sin embargo no se trató de su efecto ni se propuso de forma especial su empleo.
Los inventores pudieron demostrar mediante ensayos propios, como el fosfonato 3'-Ázido-2'-3'-didesoxitimidilo-(5'\rightarrow2)-1-0 octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo) (en adelante bien denominado como "N3") presenta una actividad antiviral. La siguiente fórmula I muestra la estructura del N3:
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Esta sustancia activa puede emplearse para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas causados por retrovirus, especialmente por el virus HI.
Los seres humanos infectados con HIV corren debido a la debilidad inmunológica causada por el virus, riesgos concretos de coinfecciones graves con virus, que los sistemas inmunológicos de las personas sanas pueden controlar normalmente. Mediante la utilización de las sustancias activas a las que se refiere el invento puede evitarse por su efecto sobre infecciones inducidas por el virus HI con otros virus, de forma más eficaz.
Por otra parte pueden emplearse las sustancias activas para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, que han sido causadas por los virus de Hepatitis-B- y/o Hepatitis-C-.
En otra aplicación se emplean estas sustancias activas para la elaboración de medicamentos para tratamiento de enfermedades infecciosas, que han sido provocadas por Adenovirus.
Los Adenovirus causan diversos síndromes, como por ejemplo infecciones de vías respiratorias, de ojos y del tracto intestinal, que especialmente en niños pueden tener graves consecuencias.
Por otra parte estas sustancias activas para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas pueden emplearse así mismo para aquellas causadas por los virus Gamma Herpes y/o Beta humanos, especialmente por los virus Epstein y/o el virus Citomegalo humano(HCMV).
Los pacientes con riesgo especial en cuanto enfermedades HCMV graves son pacientes infectados HIV, los que la función del sistema inmunológico ha sido dañada. Pacientes que precisan después de un trasplante de órganos sólidos una inmunosupresión medicamentosa, resultan especialmente perjudicados así mismo durante los primeros tres meses. Por otra parte los receptores de trasplante de médula y células madre presentan un alto riesgo, de sufrir una enfermedad muscular HCMV, hasta que el sistema inmunológico transferido con la operación de trasplante haya recuperado su completa funcionalidad. Particularmente las infecciones nuevas con HCMV o debidas a una reactivación pueden acarrear en pacientes con un sistema inmunológico suprimido graves infecciones generalizadas con desenlace letal. Es por ello que la utilización de estas sustancias activas por ejemplo es ventajosa en pacientes con un síndrome de inmunodeficiencia adquirida por una infección de HCMV, dado que con ello pueden ser atacados dos agentes patógenos simultáneamente.
En los propios ensayos realizados por los inventores se evidenció además, en primer lugar que una sustancia empleada según el invento presentó contra cepas HCMV sensibles al Ganciclovir una actividad antiviral similar al Ganciclovir.
Además esta sustancia activa se mostró una alta actividad contra las cepas CMV resistentes al Ganciclovir.
Esto es especialmente ventajoso, cuando existe una infección con cepas HCMV, que son resistentes contra GCV puesto que también aquí no es preciso administrar una dosis mayor de sustancia activa en comparación con la aplicación a emplear con HCMV sensibles a GCV.
En comparación con Foscarnet esta sustancia activa presentó en otros ensayos posteriores, una actividad antiviral aproximadamente 40 veces superior incluso contra cepas HCMV resistentes al Ganciclovir.
Esto es especialmente ventajoso, dado que hasta la fecha era ciertamente posible, influir con Foscarnet la replicación de la cepa HCMV resistente al Ganciclovir en vitro y en vivo, sin embargo no con una concentración molar tan baja como cuando se emplea N3. Aquí es especialmente ventajoso que debido a los acentuados efectos secundarios, especialmente la nefrotoxicidad causados por la administración prolongada de Foscarnet pueda reducirse. En la utilización de los derivados Nucleósidos del ácido-fosfonofórmico para la elaboración de medicamentos es también ventajoso, que el efecto aditivo mielotóxico del Ganciclovir y de la acidotimicina podrá superarse a causa de las posibilidades terapéuticas restrictivas.
En otras aplicaciones preferentes se emplea esta sustancia activa para enfermedades causadas por las cepas HCMV multiresistentes.
Tal fue descrito por ejemplo Eckle et al.,(La infección por Citomegalovirus humano resistente a fármacos en niños después de las operaciones de trasplante de células madre alogénicas puede tener diferentes resultados clínicos, Blood, 2000, 96 (9): 3286-3289, una cepa HCMV que desarrolló una multiresistencia contra Ganciclovir, Foscarnet y Citovir.
Dado que hasta la fecha todavía no pudo encontrarse ninguna sustancia activa contra las cepas HCMV multiresistentes que presente una menor toxicidad si bien la misma efectividad como por ejemplo la exhibida por Foscarnet, los derivados nucleósidos - del ácido fosfonofórmico representan sustancias extraordinariamente eficaces para a la lucha contra las cepas HCMV multiresistentes.
Los derivados nucleósidos- del ácido fosfonofórnico pueden emplearse para enfermedades causadas por HCMV como la Neumonía, la Hepatitis, la Colitis, la Retinitis y la Encefalitis. Estas enfermedades representan un gran peligro para los pacientes con inmunidad debilitada.
En una forma de realización se administra el medicamento conteniendo esta sustancia activa por vía oral y/o parenteral.
A parte de esto la sustancia activa puede administrarse junto con uno o varios excipientes farmacéuticos idóneos.
Por "Excipientes" o sustancias auxiliares se entiende aquellas sustancias que se emplean generalmente en la elaboración de medicamentos tales como los agentes diluyentes, ligantes, agentes para suspensión, lubricantes, estabilizantes etc, ya sea en forma de disolución o como sustancias sólidas. Entre estas cuentan, si bien esto no significa ninguna limitación, por ejemplo, el agua,las soluciones salinas, los alcoholes, los aceites vegetales, los polietileglicoles, las gelatinas, la lactosa, la glucosa, la amilosa, la celulosa, el glicerol, el estearato de magnesio, la albumina, los monogliceridos, los triglicéridos, la polivinil, pirrolidona etc. Una serie de otras sustancias idóneas se relacionan en el manual de A. Kibbe, Handbook of pharmaceutical excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press.
La preparación farmacéutica puede, si se desea, ser esterilizada y puede además contener productos conservantes, agentes estabilizantes, y/o dispersantes, emulsionantes, soluciones tampón, colorantes, sustancias gustativas, etc que no interfieren con la composición activa.
Las administraciones orales pueden realizarse en forma de tabletas por ejemplo, cápsulas, pastillas o a modo de preparados líquidos a modo de jarabes que se preparan por ejemplo por procedimientos conocidos con adición de ligantes de hidratos de carbono como el almidón de maíz etc. Para la administración parenteral la sustancia puede formularse a modo de inyección o bien de infusión siempre según procedimientos conocidos.
La sustancia activa puede incorporarse aquí también por ejemplo en liposomas y/o en nanopartículas, en donde los restos lipófilos introducidos siempre influirán decisivamente en la magnitud y estabilidad de los liposomas.
La sustancia activa puede además también emplearse en combinación con otras sustancias activas o medicamentos en una aplicación terapéutica como por ejemplo Reverse-Transkriptase-Hemmer, Portease-Hemmer, Interferon oder Interleukin II, o bien en terapias inmunomodulares como en los trasplantes de tuétano de hueso o de células madre/trasplantes de órganos sólidos, o bien con sustancias activas que incrementan el número de linfocitos. También pueden incrementarse simultáneamente por ejemplo, varios derivados nucleósidos del Ácido fosfonofórmico en una formulación.
Una dosificación exacta depende en este caso de la vía de administración, del estado de salud a tratar, de la gravedad de la enfermedad, del peso y de la edad del paciente en tratamiento.
Se entiende que, las características anteriormente descritas y las siguientes por aclarar no solo son utilizables en la combinación dada en cada caso, si no también en otras combinaciones o incluso en forma de preparado individual, sin abandonar el ámbito del presente invento.
Otras ventajas podrán extraerse de los ejemplos.
Ejemplos Preparación del fosfonato 3'-Ázido-2',3'-didexoxitimidilo-(5'\rightarrow 2')-1-0-octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo) esterificado y sin esterificar
Partiendo de la base de la síntesis descrita en el documento WO/34298 se elaboró el fosfonato 3-Ázido-2',3'-didesoxitimidililo-(5'\rightarrow2)-1-0 octadecilo-rac-glycerol-3-(hidroxicarbonilo) (en adelante denominado N3), en tres pasos.
1. Primer Paso
Se disolvieron 15,8 g (23 mmol) de 2-fosfonato de 2-hidrógeno 3-0-(4-monometoxitritilo (-1-0-octadecilo-rac-glicerol) con 8 g (30 mmol) de 3'-didexotimidina 3'Azido-2' en 70 ml de pirinina exenta de agua. A continuación esta solución se dejó enfriar hasta 10ºC y se mezcló con 18 ml (148 mmol) de cloruro de pivaloilo con exclusión de humedad y se agitó durante 7 min a temperatura ambiente. La mezcla enfriada a 0ºC a continuación se mezcló con 18 ml de agua y 105 ml de una solución de 0,2M de yodo en THF (tetrairofurano) y sin enfriar se agitó durante una hora. Antes de la concentración de la preparación reactiva en el evaporador rotativo para transformarla en un jarabe se procedió a reducir el yodo remanente por adición de sulfito de hidrógeno sódico sólido. Al jarabe se agregaron 150 ml de cloroformo y se extrajeron tres veces 450 ml de una mezcla de agua/metanol/cloruro sódico saturado 1:2:1 (v/v/v). Esta fase orgánica fue de nuevo concentrada transformándose en un jarabe, que todavía se expuso tres veces a una coevaporación cada vez con 200 ml de tolueno. Para cambiar el hidrógeno por el grupo 4-Monometoxitrilino se disolvió el jarabe en 150 ml de Ácido Acético/agua en proporción 4:1 (v/v), calentándose durante 15 min a la temperatura de 50º C y a continuación de nuevo se concentró dando lugar a un jarabe en el evaporador rotativo. Mediante la coevaporación de tolueno bajo condiciones al vacío en bomba de aceite se separó el ácido acético, el jarabe obtenido en este caso se disolvió a continuación en 100 ml de cloroformo/metanol (95:5) (v/v) y se procedió a su depuración en una columna de gel de sílice con gradiente cromatográfico de cloroformo/metanol. De las fracciones conteniendo producto depurado quedó una sustancia sólida tras el centrifugado del agente disolvente una sustancia sólida que por cristalización a -25ºC se transformó en metanol con lo cual se obtuvieron como primer paso de la sustancia activa 10,5 g (15,6 mmol) de 3'-Azido-2',3'-didexositimidinilo-(5'\rightarrow 2)-1-0 octadecilo-rac-glicerol. Este primer paso presentó en la placa de capa fina de gel de Sílice en el sistema circulante de cloroformo/metanol 7:7 (v/v), un valor Rf- de 0,5.
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2. Segundo Paso
2,3 g (12 mmol)de dicloruro del ácido fosfórico (etoxicarbonilo) se disolvieron en 30 ml de fosfato de trimetilo y se enfriaron hasta aproximadamente 0ºC agitando en un baño de hielo. A continuación se agregaron, continuando agitando, 4,0 g (6 mmol) de 3'-Azido-2',3' didesoxitimidililo-(5'\rightarrow 2)-1-0 octadecilo-rac-glicerol, para primero continuar otras 5 h en baño de hielo a (0ºC), luego durante la noche a temperatura ambiente seguir agitando hasta eliminar la humedad. La mezcla reactiva se disuelve luego en 120 ml de éter dietílico y se extraen dos veces respectivamente 100 ml de agua. La fase acuosa ácida se ajusta a pH 6,5 en el baño de hielo con 2 M de sosa caustica, concentrando y finalmente coevaporando una vez con tolueno. El residuo se suspendió en 100 ml de éter dietilico y se reservó para su cristalización a 4ºC. La precipitación obtenida fue succionada, lavada con éter dietílico frío y secada. La lejía madre se concentró para la reprecipitación aproximadamente hasta alcanzar 1/3 del volumen original y la nueva precipitación resultante se trató de la misma forma que se acaba de describir. Todo el precipitado reunido (producto en bruto) se disolvió en 0,05 M acetato de amonio/metanol (2:8) (v/v) y se depuró en una fase inversa (Columna RP18) en un gradiente cromatográfico de acetato de amonio/metanol. Las fracciones reunidas conteniendo el producto se concentraron aproximadamente a ¼ de volumen original y a continuación se liofilizaron. Así se obtuvieron 3,2 g de ester etílico del fosfonato 3'-Azido 2',3'-didesoxitimidililo-(5'\rightarrow2)-1-0-octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo).
Este producto corresponde a la forma esterificada del N3 que en adelante se denominará como N4.
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3. Tercer Paso
2 g del ester etílico del fosfonato 3'-azido-2',3'-didesoxitimidililo-(5'\rightarrow2)-1-0-octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxi-
carbonilo) (abreviadamente N4) se disolvieron en 50 ml de agua y se mezclaron con 107 ml de 1 M lejía de sosa para proceder a su neutralizado a pH7 tras 10 min de agitación a temperatura ambiente con un intercambiador catiónico. La solución extraída por aspiración se ajustó con lejía sódica a Ph 7,5 8 y a continuación se liofilizó. El producto liofilizado se depuró en un fase inversa (Columna RP18) en un gradiente cromatográfico de acetato de amonio/metanol, resultando 1,5 g fosfonato de 3'-Ázido-2',3'-didesoxitimidililo-(5'\rightarrow2)-1-0-octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo) abreviadamente (N3) en forma de un polvo incoloro que presentó sobre la capa fina del gel de silicio en sistema del agente portante cloroformo/metanol 6:4 (v/v) un valor Rf de 0,1.
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Certificación de la actividad antiviral específica HCMV
Para certificar la actividad antiviral específica del N3 contra HCMV se realizó un ensayo de reducción de placas modificado y adaptado a la células. Para ello se emplearon co-cultivos de fibroblastos HFF de prepucio humano infectados y no infectados.
En Prix et al. se describe por primera vez la realización de ensayos que a continuación se presentarán esquematizados. El primero es un ensayo simplificado aplicando un método empírico para la investigación biológica (screening) de la resistencia a los fármacos por de los daños por esfuerzos excesivos sufridos por las células relacionados con el virus citomegalo, publicado en Journal of Clinical Virology 1998, 11: 29-37, y el segundo Prix et al. análisis sobre la restricción global de la región UL97 permitiendo la pronta detección de un virus humano citomegalo resistente al ganciclovir en un niño puesto en peligro immunológicamente, publicado en Journal of infectious deseases 1999, 180: 491-495,.
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Preparación de la células HFF
El aislado primario del HCMV sobre células HFF, en un cultivo en capilar se trasladó a pequeñas botellas para cultivo celular (25 cm^{2}) formando praderas tupidas de células HFF. Tras alcanzar un efecto (CPE) citoplástico aproximadamente de 20-40% se procedió al lavado de las células con una solución de sal del cocina (PBS)con solución tampón de fosfato y la pradera celular se sometió a un destripsinizado. Tras la activación con Tripcinina se recogió el aglomerado en el medio esencial mínimo de Eagles (MEM)-10% FCS (suero fetal de becerro) y se filtró cuidadosamente para separar los agregados celulares.
Paralelamente las células HFF no infectadas se cultivaron cubetas de 175 cm^{2}, procediéndose a su lavado y se destripsinizaron siendo posteriormente recogidas tras otros pasos de depuración en MEM-10% FCS.
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Elaboración de los Cocultivos
Para la elaboración de cocultivos se mezclaron las células infectadas con las no infectadas del modo siguiente: 2,5x10(4)de células no infectadas/100 \mul se mezclaron en dos distintas proporciones, con 500 y 1000 células infectadas/100 \mul. De cada uno de estos pasos de dilución se aportaron, en cada caso 100 \mul en una determinación por triplicado sobre una placa de título micrométrico de onda 96. Para la determinación de la adherencia de la célula sobre la base de la placa de título micrométrico las coculturas se incubaron como mínimo durante 4 h, antes de separar cuidadosamente el medio.
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La aportación de los Virostáticos
Inmediatamente después de retirar el medio las soluciones MEM virostáticas ya previamente preparadas en porciones crecientes por onda de Ganciclovir-(GCV), Foscarnet-(PFA) o bien fosfonato 3'-Ázido-2',3'-didesoxitimidililo-(5'\rightarrow2')-1-0-octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo)(en adelante denominado N3) en concentración de 200 \mul aplicaron sobre las placas de título micrométrico.
Luego los cultivos se incubaron durante 4 días de modo que los virus de las células individuales infectadas pudiesen propagarse por infección de las células vecinas formando placas.
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Certificación HCMV mediante ELISA in situ
A Continuación de los 4 días de incubación el medio fue cuidadosamente trasegado y los microcultivos se permeabilizaron y fijaron con 200 \mul de metanol congelado (-20ºC). Tras 20 min se retiró el metanol y las células se sometieron a un lavado doble con PBS.
Después de esto se aplicó el anticuerpo primario (anti-IE1-pp72, E13 Klon, Paesel & Lorei, Alemania) que está orientado contra el HCMV Immediate Early ANTIGEN (UL123) del HCMV. Tras una hora de incubación se procedió al lavado de las células y con el anticuerpo secundario (Meerrettich-Peroxidase conjugado Maus-HMCV-IgG-ANTIKOTPER; Dinamarca) se incubó durante una hora. Tras la adición del sustrato Peroxidase/H_{2} O2 se certificó por la coloración marrón in situ el Immediate Early Antigen de HCMV en los núcleos de los fibroplastos infectados observando en el microscopio. El resultado fue documentado fotográficamente en ejemplos seleccionados.
Con GCV se documentaron las concentraciones 0 5 \mu M (serie de medición de 0 a 50 \mum), para PFA 0 a 300 \mu M (150-500 \mu m)para N3 6,25 \mu M (3-50 \mu M). Así mismo se emplearon 6,25 \muM de idéntica estructura a la combinación N4 esterificada de etilo.
Resultados Cepa HCMV resistente a GCV y sensible al PFA/CDV
Para este ensayo se emplearon 500 células/microcultivos HFF infectados por HCMV. Mediante 6,25 \muM N3 dio lugar en comparación con 5 \muM GCV a una intensa reducción de placas. También la comparación del número de placas/microcultivo promedio para (GCV: 19,5; N3 :5,7) mostró que el compuesto N3, tanto su número de placas como también su dimensión se redujo eficazmente de forma extraordinaria (los resultados no se muestran). En una comparación del efecto de N3 para PFA en la reducción de placas se evidenció claramente, que tanto PFA (número de placas:5) como también N3 (7,5) en comparación con el control negativo con 0 \mu M PFA (37,9) el número de placas y su tamaño se redujeron claramente, sin embargo fue necesario emplear una concentración significativamente superior en PFA, para obtener una efectividad comparable con N3 (300 \mu M PFA en comparación con 6,25 \mu M N3).
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La cepa HCMV multiresistente
La cepa HCMV empleada fue la resistente GCV-/PFA-/CDV-(= cepa HCMV multiresistente, ckle et al., Drug-resistant human citmegalovirus infection in children after allogenic stem cell transplantation may have different clinical outcomes, (la infección por el virus citomegalo humano resistente a las drogas en niños tras un trasplante en células madre alogénicas puede tener diferentes resistentes resultados clínicos) Blood 2000, 96 (9): 3286-3289). Para el co cultivo se emplearon en este caso 1500 células/microcultivos HFF infectados/HCMV.
Mediante la comparación del número de placas promedio se aclaró que N3 es altamente activo contra las cepas HCMV multiresistentes(20,5 para PFA en comparación con 2,3 para N3).
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Valoración
Para una correcta valoración de las placas se admite que una placa en una estructura de células debería consistir como mínimo de 10 células individuales para tenerse en consideración en el recuento. El valor ID50 se basa en el número de placas promedio que calcularon por análisis de regresión no lineal mediante análisis Probit (statistical software package SPSS, München), a cuyo fin se determinó la concentración de la mezcla que es para necesaria reducir el número de placas alrededor del 50% (valor ID50).
En una investigación empírica previa se puso en evidencia que un fosfoto nucleosido-(5'\rightarrow2)-1-0-octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo) por esterificación del grupo fosfonato hidroxicarbonilo (=N4) en vitro presentaba un efecto antiviral claramente reducido.
La siguiente tabla 1 presenta los resultados recogidos correspondientes a la obtención de los valores ID50 así como del intervalo de confianza del 95% de las series de análisis facilitadas en cada caso contra una cepa HCMV, sensible al GCV (columna 1) y frente a una cepa HCMV resistente al GCV (columna 2) con respecto al empleo de GCV y N3.
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TABLA 1 Actividad Antiviral del N3 contra GCV
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Como puede observarse en la columna 1 de la tabla, N3 presenta en una cepa HCMV sensible al GCV-/PFA-/CDV-, una actividad antiviral comparable GCV de (2,8 \mu M para GCV en comparación con 4,0 \mu M). Aquí se emplearon, en cada caso 500 celular microculturas infectados.
Contra la cepa HCMV resistente al GCV, presenta N3 una alta actividad, lo que se manifiesta en una aproximadamente 11 veces menor ID50 en comparación con GCV (14,3 para GCV en comparación con 1,3 para N3)para lo cual aquí se emplearon 1000 células/microculturas infectadas.
A continuación la tabla 2 recoge los valores obtenidos de ID50 y el intervalo de confianza del 95% de N3 en comparación con PFA incluso refiriéndose a una cepa de GCV-resistente
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TABLA 2 Actividad antiviral de N3 comparada con PFA contra una cepa HCMV resistente a GCV
3 
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Los resultados que se recogen en la tabla 2 (a partir determinaciones múltiples) muestran como N3 presenta una actividad antiviral aproximadamente 40 veces superior al PFA incluso contra una cepa HCMV-resistente a GCV/sensible a PFA (64,8 para PFA en comparación con 1,8 para N3). Esto significa que para alcanzar una efectividad antiviral para N3 debe emplearse una cantidad sensiblemente inferior en sustancia activa como la necesaria para PFA. Aquí se emplearon 1000 células HFF/microcultivos infectados.
La tabla 3 muestra a continuación los resultados para los valores ID50 y del intervalo de confianza del 95% para N3 en comparación con PFA frente a una cepa HCMV multiresistente, es decir una cepa resistente al GCV-PFA- y CDV resistente.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Actividad antiviral de N3 en comparación con PFA contra una cepa HCMV-multiresistente
4 
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En la tabla 3 se presentan los resultados de tres series de ensayos. Por estos puede verse como N3 se muestra altamente activo contra una cepa HCMV multiresistente se muestra altamente activo, exhibe un valor ID50 claramente inferior para N3 en comparación PFA, y además una elevada relación entre ID50PFA/ID50N3 (ID50PFA/ID50N3:50-200). En este caso se emplearon 1500 células/microcultivos infectados.
Con ello los inventores pudieron concluir que N3 para el tratamiento de enfermedades infecciosas víricas debido a su alta efectividad constituye una extraordinariamente eficaz alternativa en comparación con Ganciclovir, Foscarnet y Cidovir. Una combinación esterificada con etilo en el grupo fosfonato hidroxicarbonilo (= N4) que por lo demás es estructuralmente idéntico a N3 si bien no presenta ninguna actividad antiviral contra las cepas multiresistentes. Además N3 en el caso de virus parcialmente resistentes debido a su alta actividad antiviral se referirá incluso a partir de pequeñas dosis a la sustancia PFA, puesto que utilizando N3 la elevada nefrotoxicidad de PFA especialmente en la prescricción de elevadas dosis podrá ser evitada.
A parte de esto los inventores mostraron como la sustancia N3 presenta en el caso de las cepas HCMV-multiresistentes una actividad antivírica y como la utilización de esta sustancia ofrece una posibilidad de tratamiento uniforme para enfermedades causadas por cepas de virus multiresistentes.
Dado que el efecto citotóxico del N3 en vitro contra los fibroplatos humanos del prepucio en concentraciones >125 \mu M pudo ser determinado, con ello se abre también la posibilidad de un suficiente campo terapéutico para un empleo en vivo.

Claims (6)

1. Empleo de un fosfonato nucleosido-(5'\rightarrow2)-1-0-alquilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo) a modo de sustancia activa para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas que fueron causadas por virus patógenos humanos, caracterizado porque el medicamento para el tratamiento de las enfermedades infecciosas, causadas por virus se seleccionan entre el Adenovirus, el virus Citomegalo humano y el virus Epstein-Barr.
2. Empleo según la reivindicación 1, caracterizado porque como sustancia activa se emplea el fosfonato 3'-Ázido-2',3'-didesoxitimidililo-(5'\rightarrow2)-1-0-octadecilo-rac-glicerol-3-(hidroxicarbonilo).
3. Empleo según la reivindicación 1 y 2, caracterizado porque se utiliza la sustancia para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, que fueron provocadas por la cepa de Citomegalovirus humano sensible al Ganciclovir.
4. Empleo según la reivindicación 1 y 2, caracterizado porque se utiliza la sustancia para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, que fueron causadas por la cepa del Citomegalovirus humano resistente al Ganciclovir.
5. Empleo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque, se utiliza la sustancia para la elaboración de una medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas que fueron causadas por cepas HCMV multiresistentes.
6. Empleo según una de las reivindicaciones del 1 al 5, caracterizado porque el medicamento se fabrica de modo que pueda ser administrado por vía parenteral y/u oral.
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