ES2300105T3 - Vectores adenoviricos para terapia genica. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION ACTUAL SE REFIERE A NUEVOS ADENOVIRUS VECTORES PARA USO EN TERAPIA GENICA QUE HAN SIDO DISEÑADOS PARA EVITAR LA GENERACION DE ADENOVIRUS CON REPLICACION COMPETENTE (RCA) DURANTE SU PROPAGACION IN VITRO Y SU USO CLINICO. LA INVENCION TAMBIEN APORTA LOS METODOS PARA LA PRODUCCION DE ESTOS NUEVOS VIRUS VECTORES. ESTOS VECTORES AUMENTAN AL MAXIMO LA SEGURIDAD DE LAS APLICACIONES CLINICAS EN LAS QUE SE USAN ADENOVIRUS VECTORES PARA TRANSFERIR GENES AL INTERIOR DE CELULAS RECEPTORAS DE TERAPIA GENICA.
Description
Vectores adenovíricos para terapia génica.
La presente invención se refiere a vectores
adenovíricos novedosos para uso en terapia génica que se diseñan
para evitar la generación de adenovirus competentes de replicación
(RCA) durante la propagación in vitro y el uso clínico. La
invención proporciona también métodos para la producción de los
vectores víricos novedosos. Estos vectores maximizan la seguridad
para aplicaciones clínicas en las que se utilizan vectores
adenovíricos para transferir genes a células receptoras para terapia
génica.
Las previsiones de que la terapia génica corrija
enfermedades genéticas o suministre moléculas terapéuticas dependen
del desarrollo de vehículos de transferencia génica que puedan
suministrar con seguridad ácido nucleico exógeno a una célula
receptora. Hasta la fecha, la mayoría de los esfuerzos se han
centrado en el uso de vectores derivados de virus que portan un gen
heterólogo (transgén) para explotar la capacidad natural de un virus
de suministrar contenido genómico a una célula diana.
La mayoría de los intentos de utilizar vectores
víricos para terapia génica se han basado en vectores retrovíricos,
principalmente debido a su capacidad de integrarse en el genoma
celular. Sin embargo, las desventajas de los vectores retrovíricos
se están haciendo cada vez más claras, incluyendo su tropismo sólo
por células en división, la posibilidad de mutagénesis de inserción
tras la integración en el genoma celular, la expresión reducida del
transgén frente al tiempo, la rápida inactivación por el complemento
sérico, y la posibilidad de generación de retrovirus competentes de
replicación (Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1:
51-64, 1994; Hodgson, C.P., Bio Technology
13: 222-225, 1995).
El adenovirus es un virus de ADN nuclear con un
genoma de aproximadamente 36 kb, que se ha caracterizado bien
mediante estudios de genética clásica y biología molecular (Horwitz,
M.S., "Adenoviridae and Their Replication" en "Virology",
2ª edición, Fields, B.N. et al., ed., Raven Press, Nueva
York, 1990). El genoma se clasifica en unidades transcripcionales
tempranas (conocidas como E1-E4) y tardías
(conocidas como L1-L5), que designan la generación
de dos clases temporales de proteínas víricas. La separación entre
estos eventos es la replicación de ADN vírico.
Los vectores basados en adenovirus ofrecen
varias ventajas únicas, incluyendo tropismo tanto por células en
división como no en división, potencial patogénico mínimo, capacidad
de replicar a alto título para la preparación de provisiones de
vector y potencial de portar insertos grandes (Berkner, K.L.,
Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39-66, 1992;
Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1: 51-64,
1994). La capacidad de clonación de un vector adenovírico es de
aproximadamente 8 kb, resultante de la deleción de ciertas regiones
del genoma vírico innecesarias para el crecimiento vírico, por
ejemplo E3, deleciones de regiones cuya función se restaura en
trans a partir de una estirpe celular de empaquetamiento,
por ejemplo E1, y su complementación por células 293 (Graham, F.L.,
J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977), así como el
límite superior para empaquetamiento óptimo, que es de
aproximadamente un 105%-108% de la longitud de tipo silvestre.
Los genes que se han expresado hasta la fecha
por vectores adenovíricos incluyen p53 (Wills et al.,
Human Gene Therapy 5: 1079-188, 1994);
distrofina (Vincent et al., Nature Genetics 5:
130-134, 1993; eritropoyetina (Descamps et
al., Human Gene Therapy 5: 979-985, 1994;
ornitina transcarbamilasa (Stratford-Perricaudet
et al., Human Gene Therapy 1: 241-256,
1990); adenosina desaminasa (Mitani et al., Human Gene
Therapy 5: 941-948, 1994);
interleucina-2 (Haddada et al., Human Gene
Therapy 4: 703-711, 1993) y
\alpha-antitripsina (Jaffe et al.,
Nature Genetics 1: 372-378, 1992).
El tropismo de los adenovirus por células del
tracto respiratorio tiene relevancia particular para el uso de
adenovirus en la terapia génica para fibrosis quística (FQ), que es
la enfermedad recesiva autosómica más común en blancos, que causa
disfunción pulmonar debido a mutaciones en el gen regulador de la
conductancia transmembrana (CFTR) que afectan al canal de Cl^{-}
regulado por AMPc en el epitelio de las vías respiratorias (Zabner,
J. et al., Nature Genetics 6: 75-83,
1994). Se han desarrollado vectores adenovíricos modificados por
ingeniería genética para portar el gen CFTR (Rich, D. et al.,
Human Gene Therapy 4: 461-476, 1993) y
estudios han mostrado la capacidad de estos vectores de suministrar
CFTR al epitelio nasal de pacientes de FQ (Zabner, J. et al.,
Cell 75: 207-216, 1993), al epitelio de las
vías respiratorias de ratas del algodón y primates (Zabner, J. et
al., Nature Genetics 6: 75-83, 1994) y al
epitelio respiratorio de pacientes de FQ (Crystal, R.G. et
al., Nature Genetics 8: 42-51, 1994).
Uno de los asuntos críticos que permanecen en el
desarrollo de vectores víricos seguros es evitar la generación de
virus competentes de replicación durante la producción de vector en
una estirpe celular de empaquetamiento o durante el tratamiento de
terapia génica de un individuo. La generación de estos virus
competentes de replicación plantea la amenaza de una infección
vírica involuntaria con las consecuencias patológicas acompañantes
para el paciente.
La presencia de adenovirus de tipo silvestre en
las células receptoras de candidatos humanos a terapia génica
presenta la posibilidad de generación de un adenovirus competente de
replicación (RCA) debido a las secuencias de ADN homólogo presentes
en el vector y las células receptoras (Jolly, D., Cancer Gene
Therapy 1: 51-64, 1994). Además, la generación
de nuevos virus que portan un transgén puede interferir con los
requisitos de dosificación para una terapia génica óptima a medida
que pueden producirse copias extra del gen por nuevos virus que
portan el transgén. Por lo tanto, es crítico desarrollar vectores
que sean no sólo defectivos de replicación, sino que se diseñen para
minimizar el potencial recombinogénico, así como para limitar los
efectos dañinos de un evento de recombinación, mediante
autodestrucción.
Esta invención proporciona vectores de terapia
génica que son eficaces para suministrar genes útiles a pacientes y
que se construyen para minimizar las consecuencias tóxicas o
inmunológicas para el paciente.
La invención está dirigida a vectores
adenovíricos novedosos que se inactivan por la aparición de un
evento de recombinación en una célula de empaquetamiento o una
célula receptora, y por lo tanto evitan la generación de adenovirus
competentes de replicación (RCA). La inactivación puede aparecer
mediante la pérdida de un gen esencial o mediante la generación de
un genoma de vector que no pueda empaquetarse.
La invención está dirigida también a vectores
que minimizan la aparición de un evento de recombinación en células
de empaquetamiento o células receptoras mediante reordenaciones del
genoma de vector que reducen la homología con secuencias víricas que
pueden estar presentes en una célula de empaquetamiento o una célula
receptora para evitar la generación de RCA.
Estos diseños de vector aumentan la seguridad de
los vectores adenovíricos recombinantes para uso como vehículos de
transferencia génica en aplicaciones de terapia génica.
Por tanto, en un aspecto, la invención
proporciona una secuencia nucleotídica que contiene elementos de un
genoma adenovírico, así como un gen heterólogo de origen mamífero
que está bajo el control de un promotor transcripcional
eucariótico. Esta secuencia nucleotídica es capaz de funcionar como
un vector que permite la expresión del gen heterólogo anteriormente
mencionado cuando el vector se dispone en una célula de un
individuo. Dicha secuencia nucleotídica se caracteriza
adicionalmente por la ausencia de la secuencia de un primer elemento
del genoma adenovírico que es esencial para la replicación o
empaquetamiento del adenovirus en una célula de mamífero anfitriona
y por la disposición de un segundo elemento del genoma adenovírico
que es esencial por sí mismo para la replicación o empaquetamiento
del adenovirus en una célula de mamífero anfitriona en la secuencia
nucleotídica en, o directamente adyacente a, la localización de la
secuencia nucleotídica ocupada de otro modo por el primer
elemento.
Es un aspecto adicional de la invención una
secuencia nucleotídica en la que el primer elemento es la región
E1a-E1b del genoma adenovírico y el segundo elemento
puede ser una cualquiera de la región E4 de adenovirus, la región
E2A, la proteína terminal de codificación génica o proteínas
estructurales adenovíricas tales como L5 de fibra.
Otro aspecto adicional proporciona una secuencia
nucleotídica que contiene elementos de un genoma adenovírico y un
gen heterólogo de origen mamífero que está bajo el control de un
promotor transcripcional eucariótico, en la que la región
E1a-E1b del genoma adenovírico está ausente y en la
que se ha insertado una secuencia de relleno en la secuencia
nucleotídica en una localización distinta de la del gen heterólogo
de origen mamífero. Se caracteriza adicionalmente un vector que
contiene esta secuencia porque la recombinación legítima de la
secuencia con un elemento que está presente en una célula auxiliar
utilizada para replicar o empaquetar la secuencia, o con un
elemento que está presente en una célula de un individuo y que tiene
homología con la región E1a-E1b, conduce a la
producción de una secuencia nucleotídica alargada que es
sustancialmente menos eficaz que una secuencia nucleotídica no
modificada para empaquetarse en la célula auxiliar o en una célula
de dicho individuo.
La invención proporciona también una secuencia
nucleotídica, como anteriormente, que incluye el gen de la proteína
adenovírica IX y un gen heterólogo de origen mamífero que está bajo
el control de un promotor transcripcional eucariótico. Esta última
secuencia nucleotídica se caracteriza porque la región
E1a-E1b del genoma adenovírico está ausente y porque
el gen que codifica la proteína IX se ha recolocado en una
localización que se desvía de su localización normal en el genoma
adenovírico de tipo silvestre.
La invención proporciona adicionalmente una
secuencia nucleotídica, como anteriormente, con deleción del gen de
la proteína adenovírica IX e incluye un gen heterólogo de origen
mamífero que está bajo el control de un promotor transcripcional
eucariótico. Esta secuencia nucleotídica se caracteriza también
porque la región E1a-E1b del genoma adenovírico está
ausente, y porque la secuencia no supera aproximadamente un 90% de
la longitud del genoma adenovírico.
La invención proporciona también un método para
minimizar la exposición de un individuo que experimenta terapia
génica, utilizando un vector vírico para suministrar un gen
heterólogo, a virus competentes de replicación, que comprende la
etapa de tratar dicho individuo con una composición de terapia
génica que comprende por sí misma un portador farmacéuticamente
aceptable y alguno de los vectores que tienen las secuencias
nucleotídicas descritas anteriormente.
Fig. 1 Diagrama esquemático de constructos de
vector actuales y representación de un evento de recombinación en
células 293. Se representan nuevos constructos que producen un
vector incompetente de replicación mediante la deleción de un gen
esencial después de la recombinación.
Fig. 2 Se representa un vector novedoso de la
invención que, tras recombinación con virus de tipo silvestre,
produce vectores incompetentes de replicación con deleción de un gen
o segmento esencial.
Fig. 3 Se representa el extremo 3' de un vector
novedoso, en el que la proteína IX está recolocada en la región con
deleción de E4 para minimizar la recombinación entre un vector y
células 293.
Fig. 4A-D Comparación de las
secuencias de ADN de serotipos 2 y 5 de adenovirus de los
nucleótidos 1-600 (adenovirus de tipo 2: SEC ID Nº 1
y adenovirus de tipo 5: SEC ID Nº 3) y 3041-4847
(adenovirus de tipo 2: SEC ID Nº 2 y adenovirus de tipo 5: SEC ID Nº
4). La secuencia de adenovirus 2 se muestra en la línea superior y
la secuencia de adenovirus 5 se muestra en la línea inferior.
Fig. 5 Diagrama esquemático de diversos vectores
adenovíricos con deleción de la región E1 y que contienen el gen
CFTR clonado en el sitio E1 en el genoma adenovírico. El gen CFTR
está bajo el control de un promotor transcripcional eucariótico
específico y el sitio poliA como se ilustra en cada vector. Se
muestran las alteraciones adicionales del genoma adenovírico en cada
vector.
Fig. 6 Análisis de la enzima de restricción BclI
de serotipos 2 y 5 de adenovirus de tipo silvestre y de los vectores
adenovíricos mostrados en la Figura 5. Se muestra el patrón de
enzima de restricción de RCA generado durante la producción de
vector en células 293 debajo de cada vector.
Fig. 7 Diagrama esquemático de RCA generado
durante la producción de vector en células 293. Se muestra la
estructura del RCA con referencia a los límites nucleotídicos
específicos del sitio de recombinación y a la fuente de serotipo de
la región E1 y del gen de la proteína IX.
Fig. 8A-B Diagrama esquemático
de la construcción de pAd2/E1ACFTRsvdra-.
Fig. 9 Diagrama esquemático de la construcción
de pAdE4ORF6\DeltaE3B.
Fig. 10 Diagrama esquemático de las etapas de
recombinación in vivo utilizadas para producir
Ad2/CFTR-7.
Fig. 11 Diagrama esquemático de experimentos
para ensayar la generación de RCA durante pases múltiples de
vectores adenovíricos en células 293. El esquema de pases se muestra
junto con el bioensayo de RCA realizado después de los pases 3, 6, 9
y 12. HA designa las células HeLa y A549 utilizadas secuencialmente
en el ensayo; los dos números después indican el número de días,
respectivamente, de infección en cada estirpe celular. Se muestra la
dosis infecciosa utilizada en el ensayo de RCA, en la que E=
exponente, y se expresa en unidades infecciosas (UI).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención está dirigida a vectores
adenovíricos que se inactivan por la aparición de un evento de
recombinación legítima en una célula de empaquetamiento o una célula
receptora, y por lo tanto evitan la generación de adenovirus
competentes de replicación (RCA). La recombinación legítima es
aquella que depende del apareamiento de bases específico y normal en
secuencias reconocidas por tener homología entre sí. La inactivación
puede aparecer por la pérdida de un gen esencial o por la generación
de un genoma de vector que no pueda empaquetarse.
La invención está dirigida también a vectores
que minimizan la aparición de un evento de recombinación en células
de empaquetamiento o células receptoras mediante reordenaciones del
genoma de vector que reducen la homología con las secuencias víricas
que pueden estar presentes en una célula de empaquetamiento o una
célula receptora para evitar la generación de RCA. Las células
receptoras diana para terapia génica pueden contener secuencia de
ADN adenovírico de tipo silvestre que puede recombinarse con un
vector adenovírico (Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1:
51-64, 1994).
Estos diseños de vector aumentan por lo tanto la
seguridad de los vectores adenovíricos recombinantes para uso como
vehículos de transferencia génica en aplicaciones de terapia
génica.
Por tanto, en un aspecto, la invención
proporciona una secuencia nucleotídica que contiene elementos de un
genoma adenovírico así como un gen heterólogo de origen mamífero que
está bajo el control de un promotor transcripcional eucariótico.
Esta secuencia nucleotídica es capaz de funcionar como un vector que
permite la expresión del gen heterólogo anteriormente mencionado
cuando el vector se dispone en una célula de un individuo. La
secuencia nucleotídica se caracteriza adicionalmente por la ausencia
de la secuencia de un primer elemento del genoma adenovírico que es
esencial para la replicación o el empaquetamiento del adenovirus en
una célula de mamífero anfitriona, y por la disposición de un
segundo elemento del genoma adenovírico que es por sí mismo esencial
para la replicación o empaquetamiento del adenovirus en una célula
de mamífero anfitriona en la secuencia nucleotídica en, o
directamente adyacente a, la localización de la secuencia
nucleotídica ocupada de otro modo por el primer elemento.
Se entiende, según la práctica de la invención,
que la referencia a elementos del genoma vírico (tales como primer y
segundo elementos, designados en la presente memoria) que se
denominan esenciales incluye también la referencia a elementos que
facilitan la replicación o empaquetamiento pero que no son
absolutamente esenciales para dichos procesos.
Con respecto a este aspecto de la invención, el
gen heterólogo es cualquier gen que sea reconocido como útil. Los
ejemplos representativos incluyen genes de origen mamífero que
codifican, por ejemplo, proteínas o ARN útiles; proteínas víricas
tales como timidina cinasa de herpes y toxina del cólera bacteriana
para terapia citotóxica.
Es un aspecto adicional de la invención una
secuencia nucleotídica en la que el primer elemento es la región
E1a-E1b del genoma adenovírico y el segundo elemento
puede ser una cualquiera de la región E4 de adenovirus, la región
E2A, el gen que codifica la proteína terminal o proteínas
estructurales adenovíricas tales como L5 de fibra.
Otro aspecto adicional proporciona una secuencia
nucleotídica que contiene elementos de un genoma adenovírico y un
gen heterólogo de origen mamífero que está bajo el control de un
promotor transcripcional eucariótico, en la que la región
E1a-E1b del genoma adenovírico está ausente y en la
que se ha insertado una secuencia de relleno en la secuencia
nucleotídica en una localización distinta de la del gen heterólogo
de origen mamífero. Un vector que contiene esta secuencia se
caracteriza adicionalmente porque la recombinación legítima de la
secuencia con un elemento que está presente en una célula auxiliar
utilizada para replicar o empaquetar la secuencia, o con un
elemento que está presente en una célula de un individuo y que tiene
homología con la región E1a-E1b, conduce a la
producción de una secuencia nucleotídica alargada que es
sustancialmente menos eficaz que una secuencia nucleotídica no
modificada para empaquetarse en la célula auxiliar o en una célula
de dicho individuo.
Por secuencia adicional, se quiere indicar una
secuencia inerte que no afecta adversamente la función del vector.
La longitud de la secuencia adicional se selecciona basándose en la
longitud de la deleción de secuencia. Por ejemplo, si la deleción
consiste en la región E1, es un inserto aceptable de aproximadamente
3 kb, lo que está basado en principios conocidos por los expertos en
la técnica, basándose en la consideración de la longitud de vector
para un empaquetamiento óptimo.
La invención proporciona también una secuencia
nucleotídica, como anteriormente, que incluye el gen de la proteína
adenovírica IX y un gen heterólogo de origen mamífero que está bajo
el control de un promotor transcripcional eucariótico. Esta última
secuencia nucleotídica se caracteriza porque la región
E1a-E1b del genoma adenovírico está ausente y el gen
que codifica la proteína IX se ha recolocado en una localización que
se desvía de su localización normal en el genoma adenovírico de tipo
silvestre.
Preferiblemente, se recoloca en una localización
de generalmente al menos aproximadamente 100 nucleótidos eliminados,
preferiblemente aproximadamente 500 nucleótidos eliminados, y lo más
preferiblemente, de aproximadamente 100 nucleótidos eliminados.
La invención proporciona también una secuencia
nucleotídica, como anteriormente, con deleción del gen de la
proteína adenovírica IX e incluye un gen heterólogo de origen
mamífero que está bajo el control de un promotor transcripcional
eucariótico. Esta secuencia nucleotídica se caracteriza también
porque la región E1a-E1b del genoma adenovírico está
ausente, y porque la secuencia no supera aproximadamente un 90% de
la longitud del genoma adenovírico.
La invención proporciona también un
procedimiento para minimizar la exposición de un individuo que
experimenta terapia génica, utilizando un vector vírico para
suministrar un gen heterólogo, a virus competentes de replicación,
que comprende la etapa de tratar dicho individuo con una composición
de terapia génica que comprende por sí misma un portador
farmacéuticamente aceptable y vectores que utilizan las secuencias
nucleotídicas descritas anteriormente.
Este aspecto de la invención se refiere a
vectores que evitan la generación de RCA mediante un diseño de
vector adenovírico en el que se dispone un gen o segmento genómico
esencial (la diana de deleción) en una región que está
potencialmente sujeta a recombinación debido a que una célula de
empaquetamiento o célula receptora contiene secuencias víricas
homólogas. El resultado de un evento de recombinación potencial
entre secuencias celulares y el vector es la deleción de este gen o
segmento genómico esencial tras recombinación, volviendo así al
vector vírico incompetente de replicación. Esto se consigue
reordenando el genoma de modo que la diana de deleción se mueva
desde su localización genómica original para localizarse en la
región potencialmente sujeta a recombinación. Aunque la
recombinación puede restaurar una secuencia vírica faltante, el
virus estará dañado por la pérdida de un gen esencial que está
causada por el evento de recombinación.
En una realización de la invención, este diseño
de vector es aplicable para evitar eventos de recombinación en una
estirpe celular de empaquetamiento, tal como células 293 (Graham,
F.L., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). Estas
células, que contienen una secuencia de ADN de E1 vírica contigua
intacta derivada del adenovirus 5 desde 5' ITR hasta aproximadamente
el nucleótido 4300 (la ref. para numeración es Robert, R.J., en
Adenovirus DNA, Oberfler, W., ed., Matinus Nihoft Publishing,
Boston, 1986) integrada en el genoma, son capaces de suministrar los
productos del gen E1 en trans a un vector adenovírico con
deleción de E1. La generación de RCA es posible a partir de
recombinación entre las secuencias E1 en la célula y las secuencias
restantes en el límite de E1 en el vector, tales como la proteína
IX, si está presente suficiente secuencia homóloga flanqueante para
facilitar un evento de recombinación legítima.
En una realización específica, se construye un
vector adenovírico con deleción de la región E1 y la región E4,
excepto por el gen ORF6, insertando un módulo de expresión en la
región con deleción de E4 (Fig. 1). Se mueve el gen ORF6 a la región
con deleción de E1. La región E4 de un vector adenovírico puede
eliminarse excepto por ORF6 debido a su papel en la replicación del
ADN, la acumulación de ARNm tardío y la detención de la síntesis de
proteína (Bridge, E. et al., J. Virol. 63:
631-638, 1989; Huang, M. et al., J.
Virol. 63: 2605-2615, 1989). Si aparece un
evento de recombinación entre las secuencias víricas y las células
293, se adquieren las secuencias de E1 y se elimina el gen ORF6, de
tal modo que el vector sigue siendo defectivo de replicación.
En un aspecto adicional de la invención, puede
personalizarse un vector para evitar la generación de RCA a partir
de cualquier estirpe celular de empaquetamiento. El gen o segmento
diana de deleción se introducirá por ingeniería genética en la
región del vector que tiene homología con el ADN contenido en la
estirpe celular de empaquetamiento. Por tanto, la recombinación en
esta región causará la deleción del gen o segmento diana, dando
como resultado la generación de vectores víricos incompetentes de
replicación. Los vectores en los que se inserta la diana de
deleción en las regiones E2 o E4, por ejemplo, pueden diseñarse para
sortear los eventos de recombinación en estirpes celulares de
empaquetamiento que suministran productos génicos de E2 o E4
(Klessig, D. et al., Mol. Cell. Biol. 4:
1354-1362, 1984; Weinberg, D. et al.,
PNAS 80: 5383-5386, 1983). Están dentro del
alcance de la invención constructos análogos diseñados para sortear
la recombinación en estirpes celulares de empaquetamiento
análogas.
En una realización adicional de esta invención,
puede utilizarse este diseño de vector para impedir la formación de
RCA a partir de recombinación con adenovirus de tipo silvestre que
pueden estar presentes en una célula de paciente. La presencia de
adenovirus de tipo silvestre en candidatos humanos para terapia
génica basada en adenovirus puede presentar una fuente de secuencias
de ADN vírico para eventos de recombinación que generan RCA a partir
de un vector adenovírico incompetente de replicación (Jolly, D.,
Cancer Gene Therapy 1: 51-64, 1994). Puede
conseguirse la prevención de la producción de RCA disponiendo genes
o segmentos esenciales en una o más regiones del vector que pueden
estar potencialmente sujetas a recombinación con el adenovirus de
tipo silvestre. Al disponer dianas esenciales en sitios potenciales
de recombinación, uno o más eventos de recombinación servirán para
la deleción de genes víricos esenciales, y para volver así al vector
vírico incompetente de replicación.
En otra realización, representada en la Fig. 2,
se construye un vector que, tras recombinación con virus de tipo
silvestre, se vuelve incompetente de replicación. El vector contiene
el gen ORF6 dispuesto en la región con deleción de E1, y un módulo
de expresión insertado en la región con deleción de E4. La porción
central del genoma de vector es homóloga con el adenovirus de tipo
silvestre, y tras un evento de recombinación, los genomas de vector
así generados serán incompetentes de replicación como se representa
en la Fig. 2.
Los genes o segmentos genómicos adenovíricos
esenciales que pueden disponerse para servir como dianas para
deleción tras un evento de recombinación incluyen ORF6, L5 (proteína
de fibra), la región E4 entera, la región E2A, proteína terminal o
cualquier otro gen o segmento vírico esencial.
Este aspecto de la invención se refiere a
vectores que se vuelven defectivos de empaquetamiento tras la
aparición de un evento de recombinación en una célula de
empaquetamiento o una célula receptora, evitando la generación de
RCA. Este diseño aprovecha las limitaciones que existen en la
longitud del genoma que puede empaquetarse en un virión adenovírico.
El tamaño de un genoma adenovírico que puede empaquetarse
óptimamente en nuevos viriones puede superar su longitud de tipo
silvestre hasta aproximadamente un 105-108% y seguir
empaquetándose en nuevos viriones (Berkner, K.L., Curr. Top.
Micro. Immunol. 158: 39-66, 1992). Si un evento
de recombinación genera un genoma vírico que supera el límite de
empaquetamiento, no se empaquetará y no se generarán RCA.
Pueden crearse vectores que son defectivos de
empaquetamiento después de recombinación modificando por ingeniería
genética el ADN de vector de tal modo que su longitud sea al menos
un 101% de la longitud de tipo silvestre. Esto puede conseguirse
incluso con vectores que contienen deleciones del genoma adenovírico
de tipo silvestre debido a la inserción de una secuencia de ADN
heterólogo que compensa la deleción y mantiene el genoma a una
longitud de tipo casi silvestre.
La secuencia de ADN heterólogo puede codificar
solamente un gen de interés, o como alternativa, cuando un gen
heterólogo es de pequeño tamaño, pueden añadirse secuencias de ADN
de relleno heterólogo adicionales para volver al genoma de vector de
un tamaño de al menos un 101% de la longitud de tipo silvestre.
Relleno es un término reconocido generalmente en la técnica que se
pretende que defina secuencias inertes funcionalmente que se
pretende que aumenten la longitud de la misma, tales como ciertas
porciones del bacteriófago lambda.
En otra realización de este aspecto de la
invención, se diseña un vector con deleción de la región E1, así
como de la región E4 excepto por el gen ORF6, para una deleción
total de 5 kb, y se inserta el gen CFTR en la región con deleción de
E4. Este tamaño de vector es un 101,3% de la longitud de tipo
silvestre. Después de un evento de recombinación mediado por E1 en
células 293, por ejemplo, que inserta la región E1 en el vector, el
genoma aumentará aproximadamente a un 108% de la longitud de tipo
silvestre, haciéndolo defectivo de empaquetamiento y evitando la
generación de RCA.
Se entenderá por los expertos en la técnica que
el concepto de vectores adenovíricos defectivos de empaquetamiento
dependientes de recombinación puede practicarse utilizando cualquier
número de fragmentos de ADN vírico o no vírico que estén
introducidos por ingeniería genética en cualquier número de sitios
en el vector, con el objetivo global de mantener un tamaño de vector
que supere la longitud de empaquetamiento óptima tras
recombinación.
En este aspecto de la invención, el genoma de
vector derivado de adenovirus de tipo silvestre se reordena para
alterar la ordenación lineal de las regiones de codificación
víricas. En una realización, esta "redisposición" del genoma
reduce el potencial de recombinación entre un adenovirus de tipo
silvestre que puede encontrarse en un candidato humano para terapia
génica y el vector adenovírico. Esta reducción es debida al hecho de
que se eliminan grandes tramos de secuencias de ADN homólogo entre
la célula y el vector cuando se reordenan las secuencias víricas en
el vector. La probabilidad de recombinación se reduce a medida que
las regiones homólogas se reducen en longitud. De esta manera, se
minimiza la generación de RCA. Las regiones del genoma adenovírico
que pueden redisponerse incluían, por ejemplo, la región E2A, la
región E4, ORF6, L5 (proteína de fibra), proteína terminal o
cualquier combinación de éstas y otras regiones del genoma vírico
que dan como resultado un genoma redispuesto cuya secuencia lineal
se desvía de la del tipo silvestre.
Este concepto puede aplicarse a vectores con
deleción de más de una región del adenovirus, de tal modo que la
restauración de la competencia de replicación requiere varios
eventos de recombinación, cada uno de los cuales se vuelve menos
probable a medida que se reduce la homología lineal entre el vector
y la célula por redisposición.
Este concepto puede aplicarse análogamente para
minimizar la recombinación entre un vector adenovírico y una
estirpe celular de empaquetamiento, al diseñar el vector de modo que
se alteren por reordenación los tramos de homología en la estirpe
celular, reduciendo su longitud eficaz y la probabilidad de
recombinación. En un ejemplo de esta realización de la invención,
el potencial de recombinación entre un vector adenovírico y células
293 se reduce al reordenar las secuencias de proteína IX en el
vector. Las secuencias de proteína IX se encuentran a menudo en el
límite derecho de la región con deleción de E1 en un vector. Las
secuencias de proteína IX están también contenidas en células 293
en el límite del inserto de adenovirus E1, y pueden facilitar la
recombinación entre el vector y secuencias celulares. El resultado
es que puede aparecer la restauración de secuencias E1 en el vector
mediante un evento de recombinación mediado por la proteína IX. La
relocalización o mutagénesis del límite de la proteína IX desde la
región con deleción de E1 a un vector reducirá la probabilidad de
dicho evento, y de generación de RCA. Dicho vector se describe en el
ejemplo 1, a continuación, y en la Figura 3.
Ad2/CFTR-8 es una realización
particular de este aspecto de la invención, y se muestra en la
Figura 5.
Este aspecto de la invención se refiere a
diseños de vector que evitan la generación de RCA durante la
producción de vector mediante la deleción de secuencias de ADN
recombinogénico. La generación de RCA puede aparecer durante la
producción de vector cuando existen regiones de homología entre las
secuencias de ADN vírico en un vector de deleción incompetente de
replicación y las secuencias de ADN vírico en una estirpe celular de
empaquetamiento que suministran proteínas víricas en trans.
Los vectores en esta realización de la invención se diseñan de tal
modo que las regiones de homología entre el genoma vírico y la línea
celular de empaquetamiento se minimizan adicionalmente por la
deleción de ADN vírico no esencial. Estos vectores se recortan a las
secuencias víricas mínimas necesarias para conseguir el objetivo de
transportar un gen de interés a la célula diana y presentar el gen a
la célula para expresión, pero se diseñan de modo que se consiga una
seguridad máxima al evitar la formación de RCA.
Las secuencias de ADN adenovírico que se han
eliminado en los diseños de vector hasta la fecha incluyen
secuencias de las regiones E1, E3 y E4 del genoma vírico (Berkner,
K.L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39-66,
1992). La presente invención proporciona vectores en los que se ha
eliminado la región de la proteína IX del genoma vírico para reducir
adicionalmente cualquier homología con una estirpe celular de
empaquetamiento que contiene secuencias de adenovirus. Esta deleción
es particularmente útil cuando se empaquetan vectores en una estirpe
celular que incluye secuencias de la proteína IX en el inserto
vírico en el genoma celular. Por ejemplo, la estirpe celular 293
ampliamente utilizada en la producción de vector adenovírico
contiene las regiones E1 y las secuencias de proteína IX derivadas
del serotipo adenovírico 5 (Graham, F.L., J. Gen. Virol. 36:
59-72, 1977), y es permisiva para el crecimiento de
vectores con deleción de E1.
Se construyó un vector particular de la presente
invención, Ad2/CFTR-7, para eliminar el gen vírico
que codifica la proteína IX. Este gen se encuentra en el límite
derecho de la región E1B y codifica una proteína que está implicada
en el empaquetamiento de genomas completos durante el ensamblaje de
virión (Ghosh-Choudhury, G. et al., J.
EMBO. 6: 1733-1739, 1987). La secuencia de ADN
de la proteína IX en un vector tiene el potencial de recombinación
con secuencias de proteína IX contenidas en el inserto de E1 de
adenovirus en la estirpe celular 293. Debido a que dicho evento de
recombinación puede generar RCA durante el transcurso de la
producción de vector, el vector aquí descrito proporciona un medio
para evitar esta posibilidad mediante la eliminación de las
secuencias recombinogénicas de la proteína IX.
La eliminación del gen de la proteína IX se
tolera por un diseño de vector que reduce la cantidad de ADN a
empaquetar, puesto que la proteína IX es necesaria para empaquetar
genomas que son de al menos un 90% de la longitud de tipo silvestre
(Ghosh-Choudhury, G. et al., J. EMBO.
6: 1733-1938, 1987). Esto puede conseguirse mediante
deleciones de secuencias no esenciales, o mediante la deleción de
secuencias que no son necesarias en cis, y cuyos productos
génicos pueden suministrarse en trans. Dichas secuencias
incluyen aquellas derivadas de las regiones adenovíricas E1, E3 y E4
del genoma. En Ad2/CFTR-7, se redujo la región E3
para reducir la longitud del genoma. Puede ser deseable reducir el
tamaño del genoma vírico con deleciones de E3, aunque reteniendo
algunas secuencias de E3 debido al hecho de que las proteínas E3
están implicadas en la minimización de la respuesta inmune del
anfitrión ante proteínas adenovíricas (Horwitz, M.S.,
"Adenoviridae and their replication" en "Virology", 2º
ed., Fields, B.N. et al., ed., Raven Press, Nueva York,
1990). De esta manera, pueden evitarse consecuencias indeseadas de
introducción de vector vírico en un paciente.
La capacidad de un diseño de vector adenovírico
de minimizar el potencial de generación de RCA puede evaluarse
determinando el nivel de RCA en un ciclo de producción de vector
utilizando un bioensayo. El ensayo califica el RCA generado durante
la producción de vector utilizando estirpes celulares que no son
permisivas para vectores de deleción incompetentes de replicación y
que apoyarán sólo el crecimiento de adenovirus de tipo silvestre.
Se infectan estas estirpes celulares con una provisión de vector, y
se utiliza la presencia o ausencia de un efecto citopático (CPE)
observable para calificar cualquier generación de RCA.
Cuando se ha empaquetado un vector de deleción
adenovírico que es incompetente de replicación en una estirpe
celular que contiene secuencias adenovíricas que suministran
proteínas víricas esenciales en trans, el RCA generado por
un evento de recombinación contiene una mezcla de secuencias de ADN
vírico de ambas fuentes. Dicho genoma híbrido en el RCA puede
caracterizarse cuando las secuencias víricas en la estirpe celular y
el vector derivan de diferentes serotipos víricos. De esta manera,
la heterogeneidad de secuencia entre serotipos víricos puede
utilizarse para identificar un evento de recombinación mediante
cualquier serie de técnicas conocidas por los expertos en la
técnica, tales como análisis de enzima de restricción o
secuenciación directa de ADN. La comparación de las regiones
secuenciadas en el RCA con la secuencia conocida de los serotipos
adenovíricos permite la identificación de la fuente de las
secuencias ensayadas. Por tanto, el evento de recombinación que da
lugar al RCA puede analizarse mediante análisis de secuencia.
Puede mostrarse un ejemplo específico de uso del
análisis de genoma de RCA para identificar la naturaleza del evento
de recombinación utilizando vectores adenovíricos con deleción de la
región E1, y en los que el gen de interés se clona en el sitio E1.
Estos vectores se producen en células 293. Cuando el vector se
produce a partir de un serotipo adenovírico que es diferente que el
utilizado para construir la estirpe celular 293, por ejemplo,
adenovirus 2, cualquier RCA que se genere por recombinación entre
las secuencias del adenovirus 5 en la célula y las secuencias del
adenovirus 2 en el vector puede caracterizarse mediante patrones de
enzima de restricción diferentes entre los dos serotipos. Además,
puede utilizarse secuenciación de ADN para identificar variaciones
de secuencia específicas. Cuando se utilizan vectores con deleción
de E1, cualquier RCA generado por un evento de recombinación
incorporará la región E1 del inserto de adenovirus 5 en las células
293, y la presencia de estas secuencias en el RCA puede
identificarse mediante la caracterización de la región E1. La
región E1 del RCA puede cartografiarse mediante análisis de enzima
de restricción y/o secuenciarse directamente para determinar el
origen de esta secuencia. Por lo tanto, el experto puede confirmar
que el RCA contiene una mezcla de secuencias de adenovirus 2 y
adenovirus 5, indicando que apareció un evento de recombinación
entre las secuencias de ADN vírico de célula y vector.
Aunque los vectores con deleción de proteína IX
tienen una relevancia particular para la prevención de RCA durante
la producción de vector en estirpes celulares de empaquetamiento que
contienen secuencias de proteína IX, concretamente células 293,
puede entenderse por los expertos en la técnica que el concepto de
utilizar deleción génica o de secuencia puede extenderse
análogamente al diseño de vectores que minimizan o eliminan
cualquier región de secuencias víricas cuando se utilizan en
estirpes celulares que contienen secuencias víricas homólogas y por
lo tanto tienen el potencial de generar RCA.
Los vectores adenovíricos de la invención pueden
derivar del genoma de diversos serotipos adenovíricos incluyendo,
pero sin limitación, adenovirus 2, 4, 5 y 7 y, en general, serotipos
no oncogénicos.
Los vectores adenovíricos de la invención pueden
modificarse por ingeniería genética para portar cualquier gen
heterólogo para suministro y expresión a una célula diana. El gen
puede introducirse por ingeniería genética en diversos sitios en
los vectores incluyendo, pero sin limitación, la región E1, la
región E2, la región E3 y la región E4, utilizando técnicas que son
bien conocidas por los expertos en la técnica ("Current Protocols
in Molecular Biology", Ausubel, F. et al., ed., Wiley and
Sons, Nueva York, 1995). El gen heterólogo clonado en el vector
adenovírico puede modificarse por ingeniería genética en forma de
una unidad transcripcional completa, incluyendo un promotor y señal
de poliadenilación adecuados. Dichos promotores incluyen el promotor
E1 o el promotor E4 adenovíricos, por ejemplo, así como otros que
incluyen, pero sin limitación, el promotor CMV y el promotor PGK.
Las señales de poliadenilación adecuadas en el extremo 3' del gen
heterólogo incluyen, pero sin limitación, las señales de
poliadenilación de BGH y SV40. La región E3 del genoma adenovírico
puede eliminarse para aumentar la capacidad de clonación de un
vector, o puede dejarse en el constructo de vector, según las
condiciones encontradas por el practicante de la presente invención.
Se prefiere actualmente dejar al menos una porción sustancial de la
región E3 en el vector para minimizar, en algunos aspectos, la
respuesta inmune por el paciente ante el constructo de vector,
incluyendo consecuencias inflamatorias graves.
Los genes que pueden introducirse por ingeniería
genética en los vectores adenovíricos de la invención incluyen, pero
sin limitación, CFTR para FQ, \alpha1-antitripsina
para enfisema, CD4 soluble para SIDA, ADA para deficiencia de
adenosina desaminasa y cualquier otro gen que sea reconocido en la
técnica por ser útil para terapia génica.
Los vectores de la presente invención pueden
tener aplicación en terapia génica para el tratamiento de
enfermedades que requieren que un gen se transfiera a células
receptoras con el fin de corregir un gen faltante o defectivo, o con
el fin de proporcionar una molécula terapéutica para tratamiento de
una afección clínica.
Los vectores de la presente invención pueden
adaptarse para aplicaciones de terapia génica ex vivo e in
vitro.
Se entenderá que los conceptos de diseños de
vector contenidos en las secciones anteriores pueden aplicarse
análogamente a otros vectores víricos incluyendo, pero sin
limitación, retrovirs, herpesvirus, virus adenoasociados,
papovavirus, Vaccinia y otros virus de ADN y ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construye un vector adenovírico novedoso
partiendo del plásmido Ad2E4ORF6 (publicación PCT nº WO 94/12649)
con deleción de E1 y en el que las secuencias E4 se eliminan desde
el sitio ClaI en 34077 al sitio TaqI en 35597. Se inserta la
secuencia ORF6 desde 33178 a 34082 en la región E4. Se inserta la
secuencia de poliA temprana de SV40 adyacente a ORF6, que sirve
también para evitar la ultralectura a partir del gen ORF6 en las
secuencias de L5 (fibra). Se recoloca la proteína IX desde su
localización original en el genoma vírico a la región con deleción
de E4 en forma de un fragmento BamHI. El fragmento de proteína IX
contiene su propio promotor y puede clonarse en el vector en
cualquier dirección. El constructo se muestra en la Fig. 3. Se
transfecta el plásmido en células de empaquetamiento 293
produciendo una provisión de vector utilizando técnicas estándar
("Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel, F., et
al., ed., Wiley & Sons, 1995). El vector resultante es
menos sensible a un evento de recombinación con secuencias víricas
en células 293 debido a la recolocación del gen de la proteína IX,
que reduce la homología entre el vector y la célula 293.
Ad2/CFTR-8 es un ejemplo de un
vector adenovírico en el que se ha recolocado la proteína IX en la
región E4 del genoma vírico, y se muestra en la Figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la generación de RCA que surge de
recombinación entre un vector adenovírico y células 293 mediante
análisis de secuencia de virus competentes de replicación que
surgieron durante la producción de vector. Los vectores derivaban
del serotipo adenovírico 2 y tenían deleción de la región E1, pero
contenían la secuencia de proteína IX. Las células 293 contienen la
región E1 y la secuencia de proteína IX del serotipo adenovírico 5.
Se utilizó la heterogeneidad de secuencia entre los serotipos
adenovíricos 2 y 5 para identificar la fuente de las secuencias de
E1 y proteína IX que estaban contenidas en el RCA. Si la secuencia
de proteína IX en el RCA deriva del adenovirus 5, entonces puede
calificarse un evento de recombinación homóloga entre el vector y
células 293. Se muestra en las Figuras 4A-D la
heterogeneidad de secuencia entre estos serotipos adenovíricos de
los nucleótidos 1-600 (adenovirus de tipo 2: SEC ID
Nº 1 y adenovirus de tipo 5: SEC ID Nº 3) y
3041-4847 (adenovirus de tipo 2: SEC ID Nº 2 y
adenovirus de tipo 5: SEC ID Nº 4).
Se muestran en la Figura 5 los vectores en que
se ha analizado la generación de RCA durante la producción. La
Figura 6 muestra los resultados del análisis de enzima de
restricción BclI de cada vector y del RCA generado durante la
producción de vector en células 293. Por referencia a los sitios de
restricción en los serotipos 2 y 5 de adenovirus de tipo silvestre,
el RCA puede caracterizarse con respecto a la fuente de sus
secuencias. De dicha manera, puede identificarse el evento de
recombinación entre un vector y una estirpe celular de
empaquetamiento que da lugar al RCA. La Figura 7 proporciona un
diagrama esquemático del análisis de secuencia del RCA generado
durante la producción de cada vector en células 293. Las secuencias
de adenovirus 5 contenidas en células 293, que aparecen en la parte
superior de cada esquema, están potencialmente disponibles para un
evento de recombinación con las secuencias de proteína IX en el
vector. La figura muestra los sitios de recombinación en los
extremos 5' y 3' del inserto E1 en el RCA para cada vector ensayado.
En el RCA generado durante la producción de los vectores
Ad2/CFTR-2, Ad2/CFTR-5 y
Ad2/CFTR-6, la secuencia de proteína IX en el límite
3' del fragmento E1 en el RCA deriva del adenovirus 5, indicando
que apareció un evento de recombinación entre el vector y las
células 293, mediado por la secuencia de proteína IX. Los resultados
de Ad2/CFTR-3 y Ad2/CFTR-1 eran
variables, y se detectó recombinación que no estaba mediada por
proteína IX.
Los resultados de los análisis de recombinación
de RCA demuestran que la secuencia de proteína IX en un vector
adenovírico puede servir como sitio recombinogénico para la
generación de RCA en una estirpe celular que contiene una secuencia
homóloga de proteína IX.
\vskip1.000000\baselineskip
Se requería una serie de etapas de clonación
para construir los plásmidos intermedios para la construcción final
del vector Ad2/CFTR-7. Las etapas de recombinación
in vivo para derivar Ad2/CFTR-7 se detallan a
continuación. Se utilizó un ensayo de RCA para determinar si el
diseño del vector Ad2/CFTR-7 reducía la generación
de RCA durante el pase en células 293.
Se ilustran en las Figuras 8A y 8B las etapas de
clonación y plásmidos utilizados en la construcción del plásmido
intermedio pAd2/E1aCFTRsvdra- que se describen a continuación. El
plásmido de partida, pAd2/CMV-2, contiene un
inserto de aproximadamente 7,5 kb clonado en los sitios Clal y BamHI
de pBR322 que comprende los primeros 10680 nucleótidos de Ad2,
excepto por una deleción de secuencias entre los nucleótidos 357 y
3498. Esta deleción elimina el promotor E1, E1a y la mayoría de la
región de codificación de E1b. El plásmido
pAd2/CMV-2 contiene también un promotor CMV
insertado en los sitios ClaI y SpeI en el sitio de deleción de E1 y
una secuencia de poliadenilación de SV40 (poliA) cadena abajo
(originalmente un fragmento BamHI-BclI de 197 pb)
clonado en el sitio BamHI.
La primera serie de etapas de clonación
eliminaba en primer lugar una porción del poliA de SV40 y una
porción del gen de la proteína IX, y posteriormente el resto del
gen de la proteína IX. Se digirió el plásmido
pAd2/CMV-2 con SpeI y HindIII. Se ligó el fragmento
de 3146 pb que contiene las secuencias poliA de SV40 y Ad2 en los
mismos sitios de pBluescript SK- (Stratagene), produciendo el
plásmido pBSSK/s/h. Se extrajo de este plásmido el fragmento MunI
de 656 pb que contiene 60 nucleótidos de poliA de SV40 y la mayoría
de las secuencias de proteína IX de Ad2, produciendo el plásmido
PBS-SH mun-. Se digirió este plásmido con DraI y
HindIII y se clonó el fragmento de 2210 pb en los sitios EcoRV y
HindII de pBluescript SKII- (Stratagene), dando como resultado el
plásmido pBSDra-HindIII. En esta etapa, se eliminó
el resto del gen de la proteína IX. Se clonó después el fragmento
EcoRI-HindIII (2214 pb) de este plásmido en los
sitios MunI y HindII del plásmido pBs-SHmun-,
produciendo pBS-SH.dra-. En esta etapa, se combina
el segmento del genoma de Ad2 con la deleción de proteína IX con el
segmento de poliA de SV40 truncado. El plásmido
pBS-SH.dra tiene por tanto una deleción de 60 pb de
poliA de SV40, una deleción del gen de al proteína IX y secuencias
de Ad2 de las pb 4020 a 10680. Este inserto está también rodeado por
sitios de
poliligador.
poliligador.
En la siguiente serie de etapas de clonación, se
unió el segmento de ADN producido anteriormente que contiene el
poliA de SV40 y la deleción de proteína IX con las secuencias
necesarias para completar el extremo izquierdo del genoma de Ad2. Se
digirió pBS-SH.dra- con AvrII y HindIII y se clonó
el fragmento de 2368 pb en los sitios AvrII y HindIII del plásmido
pAdElaBGH, reemplazando eficazmente las secuencias de poliA de BGH,
proteína IX y Ad2 de este plásmido, y produciendo así el plásmido
pAd2/Elasvdra-.
En la siguiente serie de etapas de clonación, se
introdujo el ADN de CFTR cadena abajo del promotor E1A en
pAd2/Elasvdra-. Para conseguir esto, se liberó un fragmento SwaI y
AvrII que contenía el ADNc de CFTR del plásmido pAdPGKCFTRsv y se
insertó en los sitios SwaI y AvrII de pAd2/Elasvdra-, produciendo el
plásmido pAd2/ElaCFTRsvdra-. Se utilizó este plásmido en la
recombinación in vivo descrita a continuación.
Se detallan en la Figura 9 las etapas de
clonación y plásmidos para preparar pAd2/ORF63\Delta1.6. El
plásmido de partida, pAdE4ORF6, se describió en la publicación PCT
nº WO 94/12649. Se construyó la deleción de 1,6 kb en la región E3
de este plásmido mediante ligamiento de tres vías de dos fragmentos
de PCR en pAdE4ORF6 cortado con MluI y EagI. Se prepararon ambos
fragmentos de PCR utilizando ADN de pAdE4ORF6, y el primer fragmento
de PCR correspondía a los nucleótidos de Ad2 27123 a 29292 (2169
pb) y estaba flanqueado por sitios EagI y RsrII, respectivamente.
El segundo fragmento de PCR correspondía a los nucleótidos de Ad2
30841 a 31176 (339 pb) y estaba flanqueado por sitios RsrII y MluI,
respectivamente. Cuando se ligó con ADN de pAdE4ORF6 cortado con
MluI y EagI, el plásmido resultante pAdORF6\Delta1.6 contenía una
deleción de los nucleótidos de Ad2 29293 a 30840 (1547 pb) o toda
E3b excepto el sitio poliA. Retenía el resto de las secuencias de
Ad2 desde 27123 a 35937 y contiene ahora también un sitio RsrII
único.
Se ilustran en la Figura 10 las etapas de
recombinación utilizadas para derivar el constructo de ADN de
Ad2/
CFTR-7.
CFTR-7.
Se introdujeron el plásmido
pAd2E4ORF6\Delta1.6 linealizado con ClaI (región de poliligador
del plásmido pasado el pb 35937 de Ad2) y ADN de Ad2 digerido con
PacI (pb 28622 de Ad2) y AseI (múltiples cortes 3' de PacI) en
células 293 utilizando transfección por CaPO_{4}. Se purificó en
placa el virus recombinante deseado resultante de esta etapa,
AdORF6\Delta1.6, y se utilizó para producir una provisión de
cultivo. A continuación, se escindió pAd2/ElaCFTRsvdra- con BstBI en
el sitio correspondiente al único sitio BstBI en 10670 de Ad2. Se
digirió el ADN genómico de Ad2/ORF6E3\Delta1.6 con PshAI, que
escinde dos veces en la región 5' del virus. Se transfectaron
después los ADN de plásmido y genómico con CaPO_{4} (Promega) en
células 293. Se purificó en placa el vector recombinante deseado
resultante de esta etapa, Ad2/CFTR-7, y se utilizó
para producir una provisión de cultivo. Se muestra
Ad2/CFTR-7 en la Figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó el vector Ad2/CFTR-7
para determinar si la generación de RCA surgía durante pases a
ciegas en comparación con otros vectores en los que se retiene la
región de la proteína IX. Se utilizó un bioensayo de RCA para
calificar el RCA. Se muestra en la Figura 11 un diagrama esquemático
del diseño de ensayo de RCA.
Se muestra en la Figura 5 un diagrama
esquemático de los vectores ensayados. Los vectores ensayados en
comparación con Ad2/CFTR-7 incluyen
Ad2/CFTR-1, Ad2/CFTR-2 y
Ad2/CFTR-6. Todos estos vectores de control
contienen el gen de la proteína IX.
Se preparó una provisión de cultivo de cada
vector mediante el crecimiento del virus en células 293, que
contienen la región E1 del adenovirus y son permisivas para la
replicación de vectores con deleción de E1. Se tituló la provisión
de cultivo en células 293.
Se realizó el pase en serie de la provisión de
cultivo en células 293. Se utilizó un inóculo de virus a una MOI
(multiplicidad de la infección) de 5-10 para
infectar las células. Se recogió cada pase cuando se observó que el
efecto citopático (CPE) era de 100%, y se preparó un lisado según
técnicas estándar.
Se ensayó el ensayo de generación de RCA en
células 293 mediante un bioensayo de virus competentes de
replicación, que se realizó utilizando células HeLa y células A549.
Estas estirpes celulares no contienen ninguna secuencia de E1
adenovírico, y por lo tanto son sólo permisivas para virus que
contienen la región E1 por diseño o porque la han adquirido mediante
un evento de recombinación. Por lo tanto, el ensayo califica
cualquier RCA generado por un evento de recombinación entre un
vector con deleción de E1 y las células 293.
Se analizaron pases seleccionados de cada vector
por células 293 mediante el ensayo de RCA. Se realizó el ensayo
infectando células HeLa con el pase de vector para ensayar a una MOI
de 20. Se dejó proceder esta infección durante 4 días, después de
lo cual se recogieron las células y se preparó un lisado mediante
técnicas estándar. Se utilizó después el lisado para infectar
células A549, y esta infección procedió durante 10 días. Se calificó
en las células la presencia o ausencia de CPE. La Tabla 1 expone
los resultados de los ensayos de RCA realizados en pases
seleccionados de cada vector ensayado. Se calificó un pase como APTO
si no se observaba RCA, y se calificó como NO APTO si se observaba
RCA, como se determina mediante cualquier observación de CPE. Se
varió la dosis de vector ensayado en el ensayo de RCA, como se
muestra.
Los resultados del ensayo de RCA muestran que el
RCA era observable en el pase 12 de los vectores
Ad2/CFTR-2 y Ad2/CFTR-6, y en el
pase 3 del vector Ad2/CFTR-1. En contraposición, no
se observó RCA en el pase 12 del vector Ad2/CFTR-7,
incluso a la dosis más alta ensayada. Este vector tiene los niveles
más bajos de RCA de los vectores ensayados. Los resultados indican
que la eliminación de las secuencias de la proteína IX ha reducido
significativamente la generación de RCA en células 293.
Se describió el plásmido pAdE4ORF6 en la
publicación PCT nº WO 04/12649, y se utilizó para construir
Ad2-ORF6/PGK-CFTR, también descrito
en la misma publicación. Contiene el gen CFTR bajo el control del
promotor PGK. Ad2/CFTR-8, mostrado en la Figura 5,
es un vector adenovírico que es equivalente a
Ad2-ORF6/PGK-CFTR.
Son un aspecto de la presente invención
modificaciones adicionales de este diseño de vector. El gen CFTR
puede disponerse como alternativa bajo el control del promotor CMV,
como se ilustra por Ad2/CFTR-5, como se muestra en
la Figura 5. Otros promotores que pueden utilizarse incluyen el
promotor tardío principal de adenovirus (MLP), como se ilustra en el
vector Ad2/CFTR-4. Los elementos poliA de BGH y SV40
pueden utilizarse en la construcción de vector, así como otros
conocidos por los expertos en la técnica.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Armentano, Donna
\hskip3.9cmRomanczuk, Helen
\hskip3.9cmWadsworth, Samuel C.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VECTORES ADENOVÍRICOS NOVEDOSOS PARA TERAPIA GÉNICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genzyme Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: One Mountain Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Framingham
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 01701-9322
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ Versión 1.5
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/540.077
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de octubre de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/409.874
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 24 de marzo de 1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Donahue, E. Victor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35.492
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: GEN5-1.1 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 508-872-8400
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- (B)
- TELEFAX: 508-872-5415
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- (C)
- TÉLEX:
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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 1:
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- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 600 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
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- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
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- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
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- (iv)
- ANTISENTIDO: No
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- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
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\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1796 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 600 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
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- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1800 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
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- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
Claims (8)
1. Un vector adenovírico recombinante que tiene
una deleción de la región E1 del genoma adenovírico, en el que se ha
insertado un gen heterólogo y en el que se ha relocalizado el gen de
la proteína IX en el genoma adenovírico en una localización del
mismo distinta de la localización en la que reside normalmente dicho
gen de la proteína IX, de tal modo que se minimiza o elimina la
generación de adenovirus competentes de replicación, en el que la
región que codifica la proteína IVa2 no se relocaliza.
2. El vector de la reivindicación 1, en el que
se eliminan uno o más de los marcos de lectura abiertos de la región
E4.
3. El vector de la reivindicación 2, en el que
se relocaliza el gen de la proteína IX en la región E4.
4. El vector de la reivindicación 2, en el que
se retiene ORF6 de la región E4.
5. El vector de la reivindicación 4, en el que
se inserta el gen de la proteína IX adyacente al gen ORF6.
6. El vector de la reivindicación 1, en el que
el gen heterólogo es un gen que codifica CFTR.
7. El vector de la reivindicación 1, en el que
el gen heterólogo está ligado operativamente a un promotor
eucariótico, para permitir la expresión del gen.
8. El vector de la reivindicación 1, en el que
el adenovirus se selecciona de entre los serotipos adenovíricos 2,
4, 5 y 7.
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