ES2300156A1 - Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del cancer de pancreas y para el desarrollo de farmacos contra el cancer de pancreas. - Google Patents
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Abstract
Métodos para el diagnóstico in vitro y pronóstico in vitro del cáncer de páncreas y para el desarrollo de fármacos contra el cáncer de páncreas. La presente invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer; a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia de dicho cáncer, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína GOLPH-2, y/o los efectos de esta expresión.
Description
Métodos para el diagnóstico in vitro y
pronóstico in vitro del cáncer de páncreas y para el
desarrollo de fármacos contra el cáncer de páncreas.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para detectar la presencia del cáncer de páncreas
en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicho
cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia
administrada a un individuo que presente dicho cáncer; a la
búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de
compuestos para terapia de dicho cáncer, con el fin de desarrollar
nuevos medicamentos; así como a agentes que inhiben la expresión
y/o la actividad de la proteína GOLPH-2, y/o los
efectos de esta expresión.
El cáncer de páncreas fue la causa de más de
220.000 muertes en el mundo, y de más de 3.600 en España, durante
el año 2.000 (GLOBOCAN). El comportamiento clínico del cáncer de
páncreas es homogéneo y siempre infausto, sin diferencias notables
en la supervivencia según el estadio. El número de pacientes con
cáncer de páncreas de buen pronóstico es insignificante. Una
posible explicación es que incluso en pacientes con tumores
pequeños, encuadrados en el estadio I, la enfermedad está
diseminada. Su diagnóstico en una fase inicial, salvo en casos
fortuitos, es difícil; un 75% de los pacientes diagnosticados
presentan enfermedad avanzada (Estadios III y IV). Se trata de una
neoplasia muy agresiva, resistente a los tratamientos citostáticos y
sólo entre un 1 y un 4% de los casos permanecen vivos a los cinco
años del diagnóstico, siempre que el tumor esté localizado y haya
podido ser extirpado en su totalidad (Warshaw A.L., and Fernándes
del Castillo C., N. Eng. J. Med., 1992,
326:455-465; Ahlgren J.D., Semin. Oncol. 1996,
23:241-250). Es por todo ello que en el caso del
cáncer de páncreas, tanto el desarrollo de sistemas de diagnóstico
precoz como el de terapias eficaces, resultan cruciales para el
control de la enfermedad (Byungwoo R., et al., Cancer Res.,
2002, 62:819-826).
Muchos de los genes y proteínas implicados en la
progresión de estos carcinomas son todavía desconocidos; la
identificación de genes y proteínas expresados diferencialmente en
asociación con el proceso de invasividad tumoral, podría conducir a
la identificación de marcadores biológicos y dianas terapéuticas,
que podrían tener un gran valor para el diagnóstico, el pronóstico
y el tratamiento de esta enfermedad.
La Fosfoproteína 2 de Golgi (Golgi
phosphoprotein 2, GP73 o GOLPH-2) es una proteína
transmembrana que se localiza en el aparato de Golgi.
GOLPH-2 se expresa preferentemente en células
epiteliales, en diferentes tejidos humanos (Kladney R.D., et
al., 2000, Gene, 249:53-65). Las proteínas del
aparato de Golgi, como GOLPH-2, están implicadas en
el procesamiento de las proteínas sintetizadas en el retículo
endoplásmico rugoso, y en el transporte de proteínas a través del
aparato de Golgi. La función biológica de GOLPH-2
es desconocida; se ha demostrado que su expresión es muy alta en
hepatocitos de pacientes afectados de hepatitis viral y que estos
elevados niveles de expresión están inducidos por la infección
viral (Kladney R.D., et al., 2002, Virology,
301:236-246; Kladney R.D., et al., 2002,
Hepatology, 35:1431-1440). Por otro lado, se han
solicitado patentes de composiciones, kits y métodos para detectar,
caracterizar, prevenir y tratar cánceres humanos de mama
(US20030124128) y cáncer de próstata (US20030108963), basados
técnicamente en la sobreexpresión del gen golph2 en estos tumores;
pero no se ha demostrado previamente que el gen
golph-2, o la proteína GOLPH- 2 que codifica, estén
sobreexpresados en muestras de tejido tumoral procedentes de
individuos afectados de adenocarcinoma ductal de páncreas.
Inesperadamente, los autores de la presente
invención han descubierto, tras laboriosa investigación y empleando
diferentes técnicas (DNA-chips y
RT-PCR cuantitativa para medir los niveles de
expresión génica y Western-blot para medir los
niveles de expresión proteica), que la expresión génica de
golph-2 está incrementada en el carcinoma de
páncreas, en especial en el adenocarcinoma ductal de páncreas, al
compararla con la expresión en tejido no tumoral procedente de los
mismos individuos o de individuos afectados de pancreatitis. Los
autores de la presente invención han descubierto que también la
concentración de la proteína GOLPH-2 es muy elevada
en el carcinoma de páncreas, especialmente en el adenocarcinoma
ductal de páncreas, al compararla con la expresión en tejido no
tumoral procedente de los mismos individuos, de individuos sanos, o
de individuos afectados de pancreatitis. Estas evidencias convierten
a GOLPH-2 en una útil diana para el desarrollo de
nuevos métodos in vitro de diagnóstico y pronóstico, y para
la identificación y desarrollo de compuestos para terapia del
cáncer de páncreas, en especial de adenocarcinomas ductales de
páncreas.
La presente invención proporciona por tanto un
método in vitro para detectar la presencia del cáncer de
páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, para
determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada
a un individuo que presente dicho cáncer, basado en la detección
y/o cuantificación de la proteína GOLPH-2, del mRNA
del gen golph-2 o el correspondiente cDNA en una
muestra de dicho individuo. Asimismo, la presente invención
proporciona dianas o herramientas para la búsqueda, identificación,
desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia
del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de
páncreas. Finalmente, la invención proporciona agentes
caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la
proteína GOLPH-2 para el tratamiento del cáncer de
páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas.
La presente invención tiene como objeto
principal el desarrollo de un método in vitro para detectar
la presencia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma
ductal de páncreas, para determinar el estadio o la severidad de
dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer.
Un segundo objeto de la presente invención es un
método in vitro para buscar, identificar, desarrollar y
evaluar la eficacia de compuestos para la terapia del cáncer de
páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas.
Un objeto adicional de la invención reside en el
uso de secuencias derivadas del gen golph-2 para el
diagnóstico y pronóstico in vitro del cáncer de páncreas, en
especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, así como para la
búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de
compuestos para la terapia de dicho cáncer.
Otro objeto de la presente invención consiste en
proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o
la actividad de la proteína GOLPH-2, para el
tratamiento del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma
ductal de páncreas.
Por último, es también objeto de la invención
una composición farmacéutica que comprenda uno o varios agentes
terapéuticos junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable,
para el tratamiento del cáncer de páncreas, en especial del
adenocarcinoma ductal de páncreas.
Figura 1: Curva de desnaturalización del
producto de la PCR del gen diana, golph-2 (Tm =
82ºC) y del gen de referencia, ribl10 (Tm=84ºC), en experimentos de
medida de la expresión génica por RT-PCR
cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.
Figura 2: Cálculo de la eficiencia de
amplificación de las reacciones de PCR de golph-2,
en experimentos de medida de la expresión génica por
RT-PCR cuantitativa en tiempo real, en muestras de
páncreas.
Figura 3: Cálculo de la eficiencia de
amplificación de las reacciones de PCR de ribl10, en experimentos
de medida de la expresión génica por RT-PCR
cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.
Para facilitar la comprensión de la presente
solicitud de patente, exponemos a continuación el significado de
algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:
Los términos "sujeto" o "individuo" se
refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye,
pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el
sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de
cualquier edad o raza.
El término "cáncer" se refiere a la
enfermedad que se caracteriza por una proliferación descontrolada
de células anormales capaces de invadir tejidos adyacentes y
diseminarse a órganos lejanos.
El término "carcinoma" se refiere al tejido
que resulta del crecimiento celular anormal o descontrolado.
El término "cáncer de páncreas" o "cáncer
en el páncreas" o "carcinoma de páncreas" se refiere a
cualquier desorden proliferativo maligno de células del
páncreas.
El término "adenocarcinoma ductal de
páncreas" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno
de células ductales del páncreas.
El término "tumor" se refiere a cualquier
masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno
(no canceroso) o maligno (canceroso).
El término "gen" se refiere a una cadena
molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.
El término "DNA" se refiere al ácido
desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de
desoxirribonucleótidos.
El término "cDNA" se refiere a una
secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de
mRNA.
El término "RNA" se refiere al ácido
ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de
ribonucleótidos.
El término "mRNA" se refiere al ácido
ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se
traduce a proteínas.
La frase "mRNA transcrito de" se refiere a
la transcripción del gen (DNA) en mRNA, como primer paso para que
el gen se exprese y traduzca a proteína.
El término "secuencia de nucleótidos" o
"secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una
secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos
(DNA).
El término "proteína" se refiere a una
cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no
covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones
post-traduccionales, por ejemplo glicosilación,
fosforilación o acetilación.
Los términos "péptido" y "polipéptido"
se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un
fragmento proteico. Los términos "proteína" y "péptido",
se usan indistintamente.
El término "anticuerpo" se refiere a una
glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una
proteína particular, a la que se denomina "antígeno". El
término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o
anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e
incluye anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. Los
"anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de
anticuerpos, altamente específicos, que están dirigidos contra un
único sitio o "determinante" antigénico. Los "anticuerpos
policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos,
que están dirigidos contra diferentes determinantes
antigénicos.
El término "epítopo", tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico
de una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína
que un anticuerpo específico reconoce.
El término "fase sólida", tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a una matriz no acuosa
a la que se puede unir el anticuerpo. Ejemplos de materiales para
fase sólida incluyen vidrio, polisacáridos, por ejemplo agarosa,
poliacrilamida, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas.
Ejemplos de formas de fase sólida son el pocillo de una placa de
ensayo o una columna de purificación.
El término "oligonucleótido cebador", tal
como se utiliza en la presente invención, se refiere a una
secuencia nucleotídica, que es complementaria de una secuencia
nucleotídica del gen golph-2. Cada cebador hibrida
con su secuencia nucleotídica diana y actúa como un sitio de inicio
para la polimerización del DNA.
El término "sonda", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica
complementaria de una secuencia nucleotídica derivada del gen
golph-2, que se puede utilizar para detectar esa
secuencia nucleotídica derivada del gen
golph-2.
El término "diana terapéutica" se refiere a
secuencias nucleotídicas o peptídicas, contra las que se puede
diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto
terapéutico.
El término "antagonista" se refiere a
cualquier molécula que inhiba la actividad biológica de la molécula
antagonizada. Ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, entre
otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos
naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular
inferior a 500 daltons).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que tanto la expresión génica de
golph-2, como la concentración de la proteína
GOLPH-2 se ve incrementada en el cáncer de
páncreas, en particular en el adenocarcinoma ductal de páncreas de
un individuo.
En este sentido, la presente invención
proporciona, en primer lugar, un método in vitro para
detectar la presencia de un cáncer en el páncreas de un individuo,
en especial de un adenocarcinoma ductal de páncreas, para
determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a
un individuo que presente dicho cáncer, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la
proteína GOLPH-2, del mRNA del gen golph- 2 o del
correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de proteína
GOLPH-2, de la cantidad de mRNA del gen
golph-2 o de la cantidad del correspondiente cDNA
detectada en una muestra de un individuo, con la cantidad de
proteína GOLPH-2, con la cantidad del mRNA del gen
golph-2 o con la cantidad del correspondiente cDNA
detectada en las muestras de individuos control o en muestras
anteriores del mismo individuo o con los valores normales de
referencia.
El método proporcionado por la presente
invención es de alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que
sujetos o individuos diagnosticados de cáncer de páncreas, en
especial de adenocarcinoma ductal de páncreas, presentan niveles
elevados de mRNA transcrito del gen golph-2
(niveles elevados de expresión del gen
golph-2), o concentraciones elevadas de la
proteína codificada por el gen golph-2 (proteína
GOLPH-2), en comparación con los
correspondientes niveles en muestras procedentes de sujetos sin
historial clínico de estos cánceres.
El presente método comprende una etapa de
obtención de la muestra del individuo. Se puede trabajar con
distintas muestras fluidas como, por ejemplo: orina, sangre, plasma,
suero, líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial, bilis,
semen, exudado de flujo gástrico o líquido cefalorraquídeo. La
muestra también puede ser tejido de páncreas, que se puede obtener
por cualquier método convencional, preferiblemente resección
quirúrgica.
Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos
previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de un determinado
tipo de carcinoma; o también de un sujeto en tratamiento, o que ha
sido tratado previamente contra un cáncer, en particular contra el
cáncer de páncreas.
El presente método comprende además una etapa de
extracción de la muestra, ya sea para obtener el extracto de
proteínas de ésta, o bien para obtener el extracto de RNA total.
Uno de estos dos extractos representa el material de trabajo para la
siguiente fase. Los protocolos de extracción de la proteína total o
del RNA total son bien conocidos por el experto en la materia
(Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156;
Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532).
Cualquier ensayo convencional se puede utilizar
en el marco de la invención para detectar un cáncer, siempre que
mida in vitro los niveles de mRNA transcrito del gen
golph-2 o su cDNA complementario, o la concentración
de proteína GOLPH-2, en muestras recogidas de los
individuos a analizar y de individuos control.
Así pues, esta invención proporciona un método
para detectar la presencia del cáncer de páncreas, en especial del
adenocarcinoma ductal de páncreas, en un individuo, para determinar
el estadio o la severidad de dichos cánceres en el individuo, o para
monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que
presente dicho cáncer, basado bien en la medida de la concentración
de la proteína GOLPH-2, o bien en la medida del
nivel de expresión del gen golph-2.
En el caso de que lo que se pretenda detectar
sea la proteína GOLPH-2, el método de la invención
comprende una primera etapa de puesta en contacto del extracto de
proteínas de la muestra con una composición de uno o más anticuerpos
específicos contra uno o más epítopos de la proteína
GOLPH-2, y una segunda etapa de cuantificación de
los complejos formados por anticuerpos y la proteína
GOLPH-2.
Existe una amplia variedad de ensayos
inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación
de complejos específicos antígeno-anticuerpo;
numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no
competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de
estos ensayos está disponible comercialmente.
Así, la proteína GOLPH-2 se
puede cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo: anticuerpos
monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de
ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos,
específicos contra la Proteína GOLPH-2; siendo
estos anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. Los
anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o
no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de
aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una
amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden
utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos,
enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos
enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas,
colorantes y derivados.
Existe una amplia variedad de ensayos bien
conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que
utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y
anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas
se incluyen el Western-blot o transferencia
Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o
ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay
o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody sandwich-ELISA o ensayo ELISA
sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o
ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como
dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la
proteína GOLPH-2, incluyen técnicas de
cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de
unión a
lectina.
lectina.
El inmunoensayo preferido en el método de la
invención es un ensayo ELISA sándwich con doble anticuerpo
(DAS-ELISA). En este inmunoensayo se puede
utilizar cualquier anticuerpo o combinación de anticuerpos,
específicos contra uno o más epítopos de la proteína
GOLPH-2. Como ejemplo de uno de los muchos posibles
formatos de este ensayo, un anticuerpo, monoclonal o policlonal, o
un fragmento de este anticuerpo, o una combinación de anticuerpos,
que recubren una fase sólida, se ponen en contacto con la muestra a
analizar, y se incuban durante un tiempo y en condiciones apropiados
para formar los complejos antígeno-anticuerpo.
Después de un lavado en condiciones apropiadas para eliminar los
complejos no específicos, se incuba con los complejos
antígeno-anticuerpo, en condiciones y tiempo
apropiados, un reactivo indicador, que comprende un anticuerpo
monoclonal o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una
combinación de estos anticuerpos, unidos a un compuesto generador de
una señal. La presencia de la proteína GOLPH-2 en
la muestra a analizar, se detecta y cuantifica, en caso de que
exista, midiendo la señal generada. La cantidad de proteína
GOLPH-2 presente en la muestra analizar es
proporcional a esa señal.
En el caso de que se pretenda detectar el mRNA o
el cDNA correspondiente al gen golph-2, y no la
proteína, el método de la invención para detectar in vitro el
carcinoma posee etapas diferentes. Así, una vez obtenida la muestra
y extraído el RNA total, según el método de la invención se realiza
la detección del mRNA o del correspondiente cDNA del gen
golph-2, que comprende una primera etapa de
amplificación del extracto de RNA total o del correspondiente cDNA
sintetizado por transcripción inversa del mRNA, y una segunda etapa
de cuantificación del producto de la amplificación del mRNA o del
cDNA del gen golph-2.
Un ejemplo de amplificación del mRNA, consiste
en retrotranscribir el mRNA en cDNA (RT), seguido de la Reacción en
Cadena de la polimerasa (PCR), usando oligonucleótidos cebadores,
siendo las secuencias de los cebadores utilizados
5'-TTCCCAGTAAGGCTCTCTAAG-3' (SEQ ID
NO 1) y 5'-CCAGCTAGATGCTCTGTAACT-3'
(SEQ ID NO 2); la PCR es una técnica de amplificación de una
determinada secuencia nucleotídica (diana) contenida en una mezcla
de secuencias nucleotídicas. En la PCR, se utiliza un exceso de una
pareja de oligonucleótidos cebadores, que hibridan con las hebras
complementarias de la secuencia nucleotídica diana. A continuación,
una enzima con actividad polimerasa (DNA Taq Polimerasa) extiende
cada cebador, utilizando como molde la secuencia nucleotídica diana.
Los productos de la extensión se convierten entonces en secuencias
dianas, tras la disociación de la hebra diana original. Nuevas
moléculas de cebador hibridan y la polimerasa las extiende; el
ciclo se repite para aumentar exponencialmente el número de
secuencias diana. Esta técnica está descrita en las patentes US
4683195 y US 4683202. Se han descrito previamente muchos métodos
para detectar y cuantificar los productos de la amplificación por
PCR, de los que cualquiera puede ser usado en esta invención. En un
método preferido de la invención, el producto amplificado se detecta
por electroforesis en gel de agarosa, de la manera siguiente: cinco
microlitros del producto de la amplificación se someten a una
separación por electroforesis en un gel de agarosa a una
concentración del 2%, en un tampón TBE 0,5x a 100 vdc, durante una
hora. Tras la electroforesis, el gel se tiñe con bromuro de etidio
y el producto de la amplificación se visualiza al iluminar el gel
con luz ultravioleta (uv); como alternativa a la tinción, y
realización preferida, se puede transferir el producto amplificado
a una membrana de nailon por técnicas de Southern blotting o
transferencia Southern, para ser detectado con una sonda
específica del cDNA del gen golph-2,
convenientemente marcada.
En otro ejemplo la detección del mRNA se realiza
transfiriendo el mRNA a una membrana de nailon, mediante técnicas
de transferencia como por ejemplo Northern-blot o
transferencia Northern, y detectándolo con sondas específicas del
mRNA o del correspondiente cDNA del gen
golph-2.
En una realización particular la amplificación y
cuantificación del mRNA correspondiente al gen
golph-2 se realiza a la vez mediante
RT-PCR cuantitativa a tiempo real
(Q-PCR).
El paso final del método de la invención para
detectar in vitro un carcinoma, en una muestra procedente de
un individuo, comprende comparar la cantidad de proteína GOLPH- 2,
la cantidad de mRNA del gen golph-2 o la cantidad
del correspondiente cDNA, detectada en una muestra de un individuo,
con la cantidad de proteína GOLPH-2, la cantidad de
mRNA del gen golph-2 o la cantidad del
correspondiente cDNA, detectada en las muestras de sujetos control
o en muestras anteriores no tumorales del mismo individuo, o con los
valores normales de referencia.
En su segundo objeto, la invención también
proporciona un método in vitro para identificar y evaluar la
eficacia de agentes para terapia del cáncer de páncreas, en especial
del adenocarcinoma ductal de páncreas que comprende:
a) poner en contacto un cultivo de células
tumorales, con el compuesto candidato, en las condiciones y durante
el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,
b) detectar y cuantificar los niveles de
expresión del gen golph-2 o la proteína
GOLPH-2, y
c) comparar dichos niveles de expresión con los
de cultivos control de células tumorales sin tratar con el
compuesto candidato.
La cuantificación de los niveles de expresión
del gen golph-2 o la proteína
GOLPH-2 se realizan de modo semejante a como se
indica en el método de la invención para detectar in vitro
la presencia de un carcinoma en un individuo.
Cuando un agente disminuye los niveles de
expresión del gen golph-2 o revierte los efectos de
la expresión elevada de dicho gen, preferiblemente disminuyendo los
niveles de proliferación celular, este agente se convierte en
candidato para la terapia del cáncer de páncreas, en especial del
adenocarcinoma ductal de páncreas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen
golph-2, en métodos de búsqueda, identificación,
desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia
del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de
páncreas. Dentro de los métodos de búsqueda, resalta la importancia
adquirida últimamente por los métodos de screening de fármacos,
basados en el binding, competitivo o no, de la molécula potencial
fármaco a la diana terapéutica.
Otro objeto adicional de la invención se refiere
al uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen
golph-2 para detectar la presencia del cáncer de
páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, para
determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a
un individuo que presente dicho cáncer.
Otro objeto de la invención consiste en
proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o
la actividad de la proteína GOLPH-2. Estos agentes,
que se pueden identificar y evaluar según la presente invención,
pueden ser seleccionados del grupo formado por:
a) un anticuerpo, o combinación de anticuerpos,
específicos contra uno o más epítopos presentes en la proteína
GOLPH-2, preferiblemente un anticuerpo monoclonal
humano o humanizado; pudiendo ser también un fragmento del
anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo
anti-idiotipo,
b) agentes citotóxicos, tales como toxinas,
moléculas con átomos radiactivos, o agentes
quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin
limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos,
fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, siRNAs, moléculas
de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o la actividad de
la Proteína GOLPH-2, y
c) compuestos antagonistas de la Proteína
GOLPH-2, que inhiben una o más de las funciones de
la Proteína GOLPH-2.
Por último, constituye también un objeto de la
presente invención una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes de los
mencionados anteriormente junto con uno o más excipientes y/o
sustancias transportadoras. Además dicha composición puede contener
cualquier otro ingrediente activo que inhiba la función de la
proteína GOLPH-2.
Los excipientes, sustancias transportadoras y
sustancias auxiliares tienen que ser farmacéuticamente y
farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados
con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan
efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones
farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas
para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea,
intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de
administración depende del estado del paciente. Las formulaciones
pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se
preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la
farmacología. Las cantidades de sustancias activas para
administrarse pueden variar en función de las particularidades de
la terapia.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Microarrays. Se utilizaron los
microarrays GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que permiten
testar la calidad del RNA, previamente al análisis de expresión con
el array GeneChip Human Genome U133A (Affymetrix, Santa Clara), que
representa 13.220 secuencias completas de genes anotados; el gen
golph-2 está representado en el microarray por el
set de sondas 217771_at de Affymetrix, que son oligonucleótidos
sentido de 25 nucleótidos de longitud, diseñados en base a la
secuencia Hs.182793 de Unigene, o AF236056 de GeneBank (Tabla
1).
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Muestras. Las muestras estudiadas
procedían de biopsias clasificadas clínicamente, obtenidas por
resección quirúrgica: Biopsias control de tejido pancreático no
tumoral, procedentes de individuos que presentaban adenocarcinoma
ductal de páncreas ("no tumoral") (n = 1); biopsias de tejido
pancreático no tumoral, pero inflamado, procedentes de individuos
sin adenocarcinoma ductal de páncreas, pero con pancreatitis
crónica ("pancreatitis crónica") (n = 1); biopsias de tejido
pancreático no tumoral, pero inflamado procedentes de individuos
que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas, y pancreatitis
("pancreatitis") (n = 1); biopsias de tejido pancreático
tumoral, procedentes de pacientes que presentaban adenocarcinoma
ductal de páncreas (n = 10) en uno de los siguientes estadios:
Estadio I, tumor limitado al páncreas, estadio III, tumor extendido
a ganglios linfáticos regionales y estadio IVB, existe metástasis
en tejidos u órganos distantes. Todas las muestras fueron
clasificadas clínica e histológicamente (grado y estadio) en el
Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde las muestras
habían sido recogidas siguiendo los preceptos de la declaración de
Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido
inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a -80ºC hasta el
momento de su análisis.
De cada tipo de tumor se recibieron los
siguientes casos:
- - Tumor estadio I:
- 7 muestras
- - Tumor estadio III:
- 1 muestra
- - Tumor estadio IV:
- 2 muestras
El análisis se llevó a cabo con RNA total
procedente de sujetos individuales. Las 13 muestras que fueron
analizadas se describen en la Tabla 2.
El RNA total de cada una de las biopsias se
obtuvo homogenizando el tejido en TRlzol® Reagent (Life
Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA
total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski
P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P.,
Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de RNA total se
usaron 10 \mug como material de partida para la síntesis de la
primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa
SuperScript^{TM} II RNase (Life Technologies), usando como
cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la
secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. La segunda
hebra de cDNA se sintetizó utilizando los enzimas DNA polimerasa I
de E. coli (Invitrogen Life Technologies), DNA ligasa de
E. coli (Invitrogen Life Technologies), Rnasa H de E.
coli (Invitrogen Life Technologies), y DNA polimerasa del fago
T4 (Invitrogen Life Technologies). El cRNA marcado con biotina se
sintetizó usando el kit ENZO BioArray^{TM} HighYield^{TM}
Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la
transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no
incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).
Se fragmentaron 15 \mug de cada cRNA
biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que
contenía 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 100 mM KOAc y
30 mM MgOAc. El cRNA fragmentado se mezcló con buffer de
hibridación (100 mM MES, 1M NaCl, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20) y se
calentó a 99º durante 5 minutos y posteriormente a 45º durante 5
minutos, para a continuación ser cargado en el array de Affymetrix.
El primer array en el que se realizó la hibridación fue el Test 3
de Affymetrix. Este array permite testar la calidad del RNA previo
al análisis de expresión en el Affymetrix® GeneChip® Human
Genome 133 A (HG-U133A).
Para la hibridación, los arrays se incubaron en
un horno rotatorio a 45º durante 16 horas y con una rotación
constante de 60 rpm.
El lavado y tinción de cada array se [levó a
cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix®. Se usó un programa
de lavado y tinción que incluía:
- 10x2 ciclos de lavado con
SSPE-T 6x (0.9 m NaCl, 60 mM NaH_{2}PO4, 6 mM
EDTA, 0.01% Tween 20) a 25º,
- 4x15 ciclos con 0.1 mM MES, 0.1M NaCl, 0.01%
Tween 20 a 50º,
- Tinción del cRNA biotinilado con un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (10 \mug/mlMolecular
Probes)
- 10x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 25º
- Tinción con un anticuerpo
anti-estreptavidina durante 10 minutos
- Tinción un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml, Molecular
Probes) durante 10 minutos
- 15x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 30º
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un
microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray
Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con
el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays,
éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.
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El análisis diferencial de la expresión del gen
golph-2 en los estadios tumorales con respecto a
los controles no tumorales, se realizó a partir de los datos de
comparación de arrays obtenidos utilizando el software de
Affymetrix. Los parámetros que se tuvieron en cuenta (en el orden
en el que aparecen en la lista) fueron: i) Detección. Indica
si el transcrito está Presente (P), Ausente (A) o Marginal (M), ii)
Cambio: Indica si la expresión de un determinado transcrito
Aumenta (I), Decrece (D), No Cambia (NC), Aumenta Marginalmente
(MI), o Decrece Marginalmente (MD), iii) Signal Loq Ratio
(SLR): Indica el nivel de cambio de expresión entre la línea base
(control) y una muestra problema. Este cambio se expresa como el
log_{2} del ratio (fold change o número de veces que la
expresión del gen está elevada o reprimida en la muestra
problema-tumoral frente a la muestra
control-sana). Se considera significativo un valor
de SLR de 1 (equivalente a un fold change de 2), para
transcritos cuya expresión aumenta frente al control y de -1, para
transcritos cuya expresión disminuye frente al control.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El análisis diferencial de la expresión del gen
golph-2 en los estadios tumorales con respecto al
control no tumoral (PA36), demostró que los niveles de expresión del
gen golph-2 estaban incrementados en todas las
biopsias de tumores de páncreas analizados, dándose los incrementos
mayores en las biopsias de adenocarcinomas ductales de estadio III
y IV, con incrementos incluso superiores a las 8 veces (SLR>3),
lo que indica un cierto grado de correlación entre el estadio de la
enfermedad y el nivel de expresión del gen (Tabla 3). Por otro
lado, el análisis de expresión diferencial del gen
golph-2 frente al control con pancreatitis crónica
(PA46), demostró que los niveles de expresión del gen
golph-2 estaban elevados más de 16 veces (SLR>4)
en todas las biopsias de tumores de páncreas analizados, dándose
los incrementos mayores en las biopsias de adenocarcinomas ductales
de estadio III y IV, con incrementos superiores a las 64 veces
(SLR>6) en todas las muestras, lo que indica un cierto grado de
correlación entre el estadio de la enfermedad y el nivel de
expresión del gen (Tabla 4).
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Estos resultados demostraron que la expresión
del gen golph-2 estaba incrementada en todas las
biopsias de tumores de páncreas analizados, tanto frente a biopsias
de tejido no tumoral, como frente a biopsias de pancreatitis; los
incrementos mayores se producían en las biopsias de adenocarcinomas
ductales de estadio III y IV, lo que indica un cierto grado de
correlación entre el estadio de la enfermedad y el nivel de
expresión del gen.
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El método empleado consiste en la transcripción
inversa del mRNA a cDNA y su posterior amplificación en un equipo
LightCycler (Roche), utilizando SYBR Green para la detección
del producto amplificado. La cuantificación se realiza en tiempo
real y permite calcular la expresión relativa de la secuencia en
diferentes muestras en la fase de amplificación lineal de la
reacción.
Muestras. Las muestras estudiadas
procedían de biopsias tipadas clínicamente, obtenidas por resección
quirúgica: Biopsias de tejido pancreático no tumoral, procedentes
de individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas
("no tumoral") (n = 1); biopsias de tejido pancreático no
tumoral, pero inflamado, procedentes de individuos control sin
adenocarcinoma ductal de páncreas, pero con pancreatitis crónica
("pancreatitis crónica") (n = 1); biopsias de tejido
pancreático tumoral, procedentes de individuos que presentaban
adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 5) en uno de los siguientes
estadios: Estadio I, tumor limitado al páncreas y estadio IVB,
existe metástasis en tejidos u órganos distantes. Todas las
muestras fueron clasificadas clínica e histológicamente (grado y
estadio) en el Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde
las muestras habían sido recogidas siguiendo los preceptos de la
declaración de Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno
líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a -80ºC
hasta el momento de su análisis.
RT-PCR Cuantitativa en Tiempo
Real. El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de
sujetos individuales. Las 7 muestras que fueron analizadas se
describen en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El RNA total de cada una de las biopsias se
obtuvo homogenizando el tejido en TRizol® Reagent (Life
Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA
total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski
P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P.,
Biotechniques, 1993, 15: 532). El RNA se cuantificó
espectrofotométricamente y se digirieron 5 \mug de RNA total con
DNasal. Se utilizó 1 \mug de RNA tratado con DNAsa como material
de partida para la síntesis de la primera hebra de cDNA con la
enzima transcriptasa inversa SuperScript^{TM} II RNase (Life
Technologies), usando como cebador un oligonucleótido
oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de
la RNA polimerasa del fago T7. Se prepararon alícuotas del cDNA
diluido a la concentración de trabajo.
El cDNA sintetizado se amplificó utilizando
cebadores específicos del gen humano golph-2
(5'-TTCCCAG
TAAGGCTCTCTAAG-3' -SEQ ID NO 1- y 5'-CCAGCTAGATGCTCT GTAACT-3' -SEQ ID NO 2-), y cebadores específicos del gen que codifica la proteína ribosomal LI 0 humana (5'-TGCGATGGCTGCACACA-3' -SEQ ID NO 13- y 5'-TCCCTTAG AGCAACCCATACAAC-3' -SEQ ID NO 14-). Las reacciones de PCR en tiempo real se prepararon utilizando el kit LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green 1 kit (Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. El programa de amplificación consistía en 1 ciclo de 95ºC durante 10 min ("hot start") seguido de 45 ciclos de 95ºC (desnaturalización) durante 10 seg, 60ºC (anillamiento) durante 5 seg, 72ºC (amplificación y adquisición de fluorescencia) durante 10 seg. El programa de análisis de curvas de desnaturalización consistía en un ciclo de un pulso de 95ºC, 65ºC durante 15 seg, y un pulso de 95ºC durante el paso de amplificación y adquisición.
TAAGGCTCTCTAAG-3' -SEQ ID NO 1- y 5'-CCAGCTAGATGCTCT GTAACT-3' -SEQ ID NO 2-), y cebadores específicos del gen que codifica la proteína ribosomal LI 0 humana (5'-TGCGATGGCTGCACACA-3' -SEQ ID NO 13- y 5'-TCCCTTAG AGCAACCCATACAAC-3' -SEQ ID NO 14-). Las reacciones de PCR en tiempo real se prepararon utilizando el kit LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green 1 kit (Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. El programa de amplificación consistía en 1 ciclo de 95ºC durante 10 min ("hot start") seguido de 45 ciclos de 95ºC (desnaturalización) durante 10 seg, 60ºC (anillamiento) durante 5 seg, 72ºC (amplificación y adquisición de fluorescencia) durante 10 seg. El programa de análisis de curvas de desnaturalización consistía en un ciclo de un pulso de 95ºC, 65ºC durante 15 seg, y un pulso de 95ºC durante el paso de amplificación y adquisición.
En primer lugar se determinó la especificidad de
los productos de PCR analizando las curvas de desnaturalización.
Posteriormente, como medida relativa de la expresión génica, se
calculó la relación entre la abundancia de mRNAs transcritos de
golph-2 y la abundancia de transcritos de ribl10 y
se comparó el dato de la relación en cada una de las muestras
tumorales con los valores de la muestra control. Para calcular la
eficiencia de las reacciones de PCR (golph-2 y
ribl10) se construyó, para cada secuencia génica, una curva patrón
realizada con diluciones seriadas de cDNA. A las concentraciones de
cDNA molde para las reacciones en la curva patrón se les dieron
valores arbitrarios 10, 5, 2.5, 1.25 y 0.625. La eficiencia se
calculó utilizando la ecuación:
donde E es la eficiencia de
amplificación y p es la pendiente de la recta
patrón.
La relación de los valores de expresión génica
se determinó utilizando la siguiente ecuación, que relaciona los
datos experimentales de la amplificación y corrige el error
originado por la diferencia de eficiencia de las reacciones de
PCR:
donde E es la eficiencia de
amplificación, Cp es el punto de corte (Crossing
point), diana es golph-2, referencia es
ribl10, control es la muestra control (sano o pancreatitis) y
muestra es la muestra
tumoral.
El análisis de los productos de PCR demostró la
amplificación específica de dos productos con temperaturas de
desnaturalización similares a las esperadas según el software
empleado para el diseño de los cebadores, Primer Express (Applied
Biosystems) (Figura 1).
De cada una de las 5 diluciones de cDNA se
amplificaron dos réplicas y los puntos de corte (Cp) de cada una de
ellas se representaron en una gráfica respecto al logaritmo de la
concentración de cDNA para construir la recta patrón (Tablas 6 y 7,
Figuras 2 y 3).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Dos réplicas de cada muestra (sana y tumoral) se
amplificaron con los cebadores específicos de
GOLPH-2 y ribl10. A partir de los puntos de corte
generados en estas amplificaciones (Tabla 8), se calcularon los
cambios de expresión del gen golph-2 en las
muestras tumorales respecto al control no tumoral y al control de
pancreatitis aplicando la ecuación anteriormente descrita (Tabla
9).
\vskip1.000000\baselineskip
- ribl10
\newpage
- golph-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados demostraron que la expresión del
gen golph2 estaba incrementada en todas las muestras tumorales
respecto a las muestras no tumorales, con un incremento medio de
13,5 veces, y respecto a las muestras con pancreatitis, con un
incremento medio de 9,5 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados confirmaron los datos obtenidos
midiendo la diferencia de expresión génica con
DNA-chips (ejemplo 1), esto es, la expresión del gen
golph-2 estaba fuertemente incrementada en las
muestras tumorales respecto a las muestras no tumorales y respecto
a las muestras con pancreatitis; confirmando por tanto que el
incremento de la expresión génica de golph2 está asociado al
adenocarcinoma ductal de páncreas.
<110> Medplant Genetics, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para el diagnóstico in
vitro y pronóstico in vitro del cáncer de páncreas y
para el desarrollo de fármacos contra el cáncer de páncreas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 200302357
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> ES 200302357
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-10-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador para la amplificación PCR
del gen GOLPH-2
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipttcccagtaa ggctctctaa g
\hfill21
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<210> 2
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador para la amplificación PCR
del gen GOLPH-2
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipccagctagat gctctgtaac t
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipaaataggctc ttaccacttg caaat
\hfill25
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<210> 4
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipacttgcaaat aactggccac atcat
\hfill25
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<210> 5
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskiptgacttccca gtaaggctct ctaag
\hfill25
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<210> 6
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatttgaga tgctaaggcc ccaga
\hfill25
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<210> 7
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptaaggcccca gagatcgttt gatcc
\hfill25
\newpage
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<210> 8
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipttgatccaac cctcttattt tcaga
\hfill25
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> sonda correspondiente al set de
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipacagagcatc tagctggtgc gctgg
\hfill25
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<210> 11
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Sonda correspondiente al set de
sondas 217771_at
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipcacagtcact gaagcaggcc ctgtt
\hfill25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Sonda correspondiente al set de
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\hfill25
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<210> 13
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<211> 17
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador para la amplificación por
PCR del gen de la proteína ribosomal X10
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<400> 13
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\hfill17
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador para la amplificación por
PCR del gen de la proteína ribosomal X10
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccttagag caacccatac aac
\hfill23
Claims (19)
1. Método in vitro para detectar la
presencia del cáncer de páncreas en un individuo, para determinar
el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para
monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que
presente dicho cáncer, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la
proteína GOLPH-2, del mRNA del gen golph- 2 o del
correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de proteína
GOLPH-2, de la cantidad de mRNA del gen
golph-2 o de la cantidad del correspondiente cDNA
detectada en una muestra de un individuo, con la cantidad de
proteína GOLPH-2, con la cantidad del mRNA del gen
golph-2 o con la cantidad del correspondiente cDNA
detectada en las muestras de individuos control o en muestras
anteriores, no tumorales, del mismo individuo o con los valores
normales de referencia.
2. Método según la reivindicación 1 en el que el
cáncer de páncreas es un adenocarcinoma ductal de páncreas
3. Método según las reivindicaciones anteriores
en el que dicha muestra es de tejido de páncreas.
4. Método según la reivindicación 3 en el que
dicha muestra de tejido de páncreas a analizar se obtiene por
cualquier método convencional, preferiblemente resección
quirúrgica.
5. Método según la reivindicación 1 en el que
dicha muestra es una muestra de orina, sangre, plasma, suero,
aspirado de jugo gástrico, bilis o semen.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que no se le
ha diagnosticado previamente un cáncer.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que se le ha
diagnosticado previamente un cáncer, preferentemente en el
páncreas.
8. Método según las reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo en tratamiento,
o que ha sido tratado previamente contra un cáncer, preferentemente
en el páncreas.
9. Método según la reivindicación 1
caracterizado porque comprende la realización de una
extracción de la muestra, bien para obtener un extracto de proteínas
o bien para obtener un extracto que consiste en el RNA total.
10. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección de la proteína
GOLPH-2 comprende una primera etapa de puesta en
contacto del extracto de proteínas de la muestra con una
composición de uno o más anticuerpos específicos contra uno o más
epítopos de la proteína GOLPH-2, y una segunda etapa
de cuantificación de los complejos formados por los anticuerpos y
la proteína GOLPH-2.
11. Método según la reivindicación 10
caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden
anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos
recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de
anticuerpos, específicos contra la proteína
GOLPH-2; siendo estos anticuerpos humanos,
humanizados o de origen no humano.
12. Método según las reivindicaciones 10 u 11
caracterizado porque para la cuantificación de los complejos
formados por los anticuerpos y la proteína GOLPH-2
se utilizan técnicas seleccionadas del grupo formado por
Western-blot, ELISA (Enzyme-Linked
Inmunosorbent Assay o ensayo de inmunosorbente ligado a enzima), RIA
(Radioinmunoassay o Radioinmunoensayo), EIA Competitivo
(Competitive Enzyme Immunoassay o Inmunoensayo Enzimático
Competitivo), DAS-ELISA (Double antibody
Sandwich-ELISA o ensayo ELISA Sándwich con Doble
Anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas,
técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de
proteínas que incluyan anticuerpos específicos, ensayos basados en
precipitación con oro coloidal en formatos tales como
dipsticks; o mediante técnicas de cromatografía de afinidad,
ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a
lectina.
lectina.
13. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección del mRNA o del
correspondiente cDNA del gen golph-2 comprende una
primera etapa de amplificación del mRNA, incluido en el extracto de
RNA total, o del correspondiente cDNA sintetizado por transcripción
inversa del mRNA, y una segunda etapa de cuantificación del producto
de la amplificación del mRNA o del cDNA del gen
golph-2.
14. Método según la reivindicación 13
caracterizado porque la amplificación se realiza de manera
cualitativa o cuantitativa, mediante RT-PCR usando
oligonucleotidos cebadores, siendo las secuencias de los cebadores
utilizados para amplificar la secuencia del gen
golph-2
5'-TTCCCAGTAAGGCTCTCTAAG-3' (SEQ ID
NO 1) y 5'-CCAGCTAGATGCTCTGTAACT-3'
(SEQ ID NO 2).
15. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección se realiza con sondas
específicas del mRNA o del correspondiente cDNA del gen
golph-2, mediante técnicas como por ejemplo
Northern-blot o transferencia Northern.
16. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección del mRNA se efectúa
mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real
(Q-PCR).
17. Uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas
derivadas del gen golph-2 para detectar in
vitro la presencia de un cáncer de en el páncreas de un
individuo, en especial de un adenocarcinoma ductal de páncreas,
para determinar in vitro el estadio o la severidad de dicho
cáncer en el individuo, o para monitorizar in vitro el efecto
de la terapia administrada a un individuo que presente dicho
cáncer.
18. Método in vitro para identificar y
evaluar la eficacia de compuestos para terapia del cáncer de
páncreas, preferiblemente de un adenocarcinoma ductal de páncreas,
que comprende:
a) poner en contacto un cultivo de células
tumorales, con el compuesto candidato, en las condiciones y durante
el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,
b) detectar y cuantificar los niveles de
expresión del gen golph-2 o la proteína
GOLPH-2, y
c) comparar dichos niveles de expresión con los
de cultivos control de células tumorales sin tratar con el
compuesto candidato.
19. Uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas
derivadas del gen golph-2, en métodos de búsqueda,
identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos
para terapia del cáncer de páncreas, preferiblemente del
adenocarcinoma ductal de páncreas.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200302357A ES2300156B1 (es) | 2003-10-10 | 2003-10-10 | Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del cancer de pancreas y para el desarrollo de farmacos contra el cancer de pancreas. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200302357A ES2300156B1 (es) | 2003-10-10 | 2003-10-10 | Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del cancer de pancreas y para el desarrollo de farmacos contra el cancer de pancreas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2300156A1 true ES2300156A1 (es) | 2008-06-01 |
| ES2300156B1 ES2300156B1 (es) | 2009-05-01 |
Family
ID=39400647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200302357A Withdrawn - After Issue ES2300156B1 (es) | 2003-10-10 | 2003-10-10 | Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del cancer de pancreas y para el desarrollo de farmacos contra el cancer de pancreas. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2300156B1 (es) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999050408A1 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | University Of Nebraska Board Of Regents | Novel gene that is amplified and overexpressed in cancer and methods of use thereof |
| US20030124128A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-07-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
-
2003
- 2003-10-10 ES ES200302357A patent/ES2300156B1/es not_active Withdrawn - After Issue
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999050408A1 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | University Of Nebraska Board Of Regents | Novel gene that is amplified and overexpressed in cancer and methods of use thereof |
| US20030124128A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-07-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GRÜTZMANN, R. et al. "Systematic Isolation of Genes Differentially Expressed in Normal and Cancerous Tissue of the Pancreas". Pancreatology . 2003, vol. 3, pp.: 169-178, página 169, resumen; página 171, tabla-1; página 173, tabla-2; página 176, tabla-2 (cont.). * |
| US 20030124128 A1. (LILLIE, J et al.) 03.07.2003, página 1, párrafos 7-8; página 2, párrafos 9-11,16-20; página 3, párrafos 29-32,42-60; página 4, párrafos 62-67; página 6, párrafos 98-104; página 7, párrafos 105-116; página 10, párrafo 143. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2300156B1 (es) | 2009-05-01 |
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