ES2300817T3 - Tratamiento de enfermedades fibroticas. - Google Patents

Abstract

Uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, en que dicho polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 10; b) la forma de etiqueta histidínica de los polipéptidos cuyas secuencias se exponen en la ID. SEC. nº 2 (ID. SEC. nº 3) o ID. SEC. nº 5 (ID. SEC. nº 6) o ID. SEC. nº 7 (ID. SEC. nº 8) o ID. SEC. nº 10 (ID. SEC. nº 11); c) un polipéptido que comprende cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11; d) una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 40% o 50% o 60% o 70% u 80% o 90% de identidad con respecto a al menos una de las secuencias de (a) a (c); e) una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de (a) a (c); y f) una sal o una isoforma, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o derivado circularmente permutado de cualquiera de (a) a (e).

Description

Tratamiento de enfermedades fibróticas.

Campo del invento

El presente invento pertenece al campo de las enfermedades fibróticas y los trastornos del tejido conjuntivo. Más específicamente, el invento se refiere al uso de INSP035 para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas, en particular la esclerodermia. Dentro del presente invento también hay combinaciones de INSP035 con un interferón, un antagonista del TNF u otro agente antifibrótico tal como OPG o SARP-1.

Antecedentes del invento

La fibrosis es un estado caracterizado por el depósito de componentes de la matriz extracelular en los órganos internos, incluyendo los riñones, el corazón, los pulmones, el hígado, la piel y las articulaciones.

La fibrosis pulmonar es una de las enfermedades fibróticas predominantes. La fibrosis pulmonar idiopática (IPF; del inglés, idiopathic pulmonary fibrosis) se caracteriza por inflamación crónica de las paredes alveolares con fibrosis progresiva, y es de etiología desconocida. La IPF, o alveolitis fibrosante criptogénica, representa del 50 al 60% de los casos de enfermedad pulmonar intersticial idiopática [para revisiones sobre la IPF, véanse N. Khalil y O'Connor (2004) y Selman et al. (2004)].

La neumonía intersticial usual (UIP; del inglés, usual interstitial pneumonia), un patrón histopatológico específico de neumonía intersticial, es el clásico patrón hallado en las biopsias pulmonares de afectados por IPF. Con baja ampliación, el tejido aparece heterogéneo, con áreas alternas de pulmón normal, inflamación intersticial, fibrosis y lesiones en forma de panal (honeycombing). La inflamación intersticial consiste en una infiltración septal alveolar de linfocitos, células plasmáticas e histiocitos asociada con hiperplasia de neumocitos de tipo II. Las zonas fibróticas están compuestas principalmente de colágeno acelular denso, aunque también se pueden ver focos dispersos de fibroblastos proliferantes (focos fibroblásticos), que son los sitios de la enfermedad precoz y activa, normalmente en una posición intraalveolar. Las áreas de lesiones en forma de panal están compuestas de espacios aéreos fibróticos quísticos, frecuentemente cubiertos de epitelio bronquiolar y llenos de moco. Se pueden reunir neutrófilos en el moco. A menudo aparece hiperplasia de músculo liso en las áreas de fibrosis y lesiones en forma de panal. Las distribuciones subpleural y paraseptal, el carácter desigual y la heterogeneidad temporal son los los rasgos más útiles para identificar la UIP.

En los trastornos vasculares del colágeno [por ejemplo, artritis reumatoide (RA; del inglés, rheumatoid arthritis), lupus eritematoso sistémico (SLE; del inglés, systemic lupus erythematosus), esclerosis sistémica progresiva, enfermedad mixta del tejido conjuntivo y diabetes mellitus], las neumoconiosis (por ejemplo, la asbestosis), las lesiones por radiación y ciertas enfermedades pulmonares provocadas por fármacos (por ejemplo, por nitrofurantoína), aparece un patrón idéntico de inflamación intersticial y fibrosis.

El curso clínico de la IPF es progresivo; la supervivencia mediana después del diagnóstico es de 4 a 6 años. La prednisona es el tratamiento habitual en el caso de IPF. La respuesta al tratamiento es variable, aunque parece más probable que los pacientes con enfermedad precoz, en una fase más celular antes de que predomine la cicatrización, mejoren con una terapia por corticosteroides o agentes citotóxicos. El tratamiento auxiliar y paliativo incluye O_{2} en elevadas concentraciones para aliviar la hipoxemia y, si aparece una infección bacteriana, antibióticos. El trasplante de pulmón ha resultado exitoso en pacientes con enfermedad pulmonar de fase final.

La fibrosis del hígado tiene que ver con una acumulación de tejido conjuntivo en el hígado, que da lugar a un desequilibrio entre la producción y la degradación de la matriz extracelular y resulta acentuada por el colapso y la condensación de fibras preexistentes [para revisiones, véanse N. H. Afdhal y D. Nunes (2004), Kershenobich y Weissbrod (2003), y Pinzani y Rombouts (2004)].

La fibrosis hepática es una respuesta común a una lesión o necrosis hepatocelular, que puede ser provocada por una gran variedad de agentes, tales como, por ejemplo, cualquier proceso que altera la homeostasis hepática (especialmente una inflamación, una lesión por tóxicos o un flujo sanguíneo hepático alterado) e infecciones del hígado (víricas, bacterianas, fúngicas y parasíticas). Numerosos trastornos de almacenamiento que resultan de errores congénitos del metabolismo están frecuentemente asociados con fibrosis, incluyendo anormalidades lipídicas (enfermedad de Gaucher); enfermedades del almacenamiento de glucógeno (especialmente los tipos III, IV, VI, IX y X); déficit de \alpha_{1}-antitripsina; almacenamiento de sustancias exógenas, como se ve en los síndromes de sobrecarga de hierro (hemocromatosis) y enfermedades del almacenamiento de cobre (enfermedad de Wilson); acumulación de metabolitos tóxicos (como en la tirosinemia, fructosemia y galactosemia); y trastornos peroxisomales (síndrome de Zellweger). Numerosos fármacos y productos químicos causan fibrosis, especialmente el alcohol, el metotrexato, la isoniazida, la oxifenisatina, la metildopa, la clorpromazina, la tolbutamida y la amiodarona. Las alteraciones de la circulación hepática (por ejemplo, insuficiencia cardíaca crónica, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad venooclusiva y trombosis de la vena porta) y la obstrucción crónica del flujo biliar pueden conducir a fibrosis. Finalmente, la fibrosis hepática congénita es una malformación autosómica recesiva.

El hígado normal está compuesto de hepatocitos y sinusoides distribuidos dentro de una matriz extracelular compuesta de colágeno (predominantemente de los tipos I, III y IV) y proteínas no colágenas, incluyendo glicoproteínas (por ejemplo, fibronectina y laminina) y varios proteoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, e hialuronato). Los fibroblastos, normalmente sólo hallados en los tractos portales, pueden producir colágeno, glicoproteínas grandes y proteoglicanos.

Otras células hepáticas (particularmente hepatocitos y células almacenadoras de grasa, de Kupffer y endoteliales) también pueden producir componentes de la matriz extracelular. Las células almacenadoras de grasa, situadas debajo del endotelio sinusoidal en el espacio de Disse, son precursores de fibroblastos, capaces de proliferar y producir un exceso de matriz extracelular. El desarrollo de fibrosis a partir del depósito activo de colágeno es una consecuencia de un daño en las células hepáticas, particularmente una necrosis, y de células inflamatorias. No se conocen los factores exactos liberados por estas células, pero es probable que haya una o más citocinas o productos de peroxidación lipídica. Las células de Kupffer y los macrófagos activados producen citocinas inflamatorias. Se forman nuevos fibroblastos alrededor de las células hepáticas necróticas; la síntesis de colágeno aumentada conduce a cicatrizaciones. La fibrosis puede proceder de una fibrogénesis activa y de una degradación deteriorada de colágeno normal o alterado. Las células almacenadoras de grasa, las células de Kupffer y las células endoteliales son importantes en el aclaramiento del colágeno de tipo I, diversos proteoglicanos, y colágenos desnaturalizados. Cambios en las actividades de estas células pueden modificar el grado de fibrosis. Para el histopatólogo, el tejido fibroso puede llegar a ser más evidente a partir del colapso pasivo y la condensación de fibras preexistentes.

De esta manera, una síntesis aumentada o una degradación reducida de colágeno da lugar al depósito activo de tejido conjuntivo en exceso, lo que afecta a la función hepática: (1) la fibrosis pericelular daña la nutrición celular y da lugar a atrofia hepatocelular; (2) dentro del espacio de Disse, el tejido fibroso se acumula alrededor de los sinusoides y obstruye el paso libre de sustancias desde la sangre hasta los hepatocitos; y (3) la fibrosis alrededor de las vénulas hepáticas y los tractos portales altera el flujo de la sangre hepática. La resistencia venosa a través del hígado aumenta desde las ramificaciones de la vena porta a los sinuosides y finalmente a las venas hepáticas. Pueden estar afectadas las tres vías.

Las bandas fibrosas que unen los tractos portales con las venas centrales también activan canales anastomóticos: la sangre arterial, apartándose de los hepatocitos normales, es desviada a venas hepáticas eferentes, lo que daña más la función hepática y puede acentuar la necrosis hepatocelular. El grado en que están presentes estos procesos determina la magnitud de la disfunción hepática; por ejemplo, en la fibrosis hepática congénita, grandes bandas fibrosas afectan predominantemente a las regiones portales aunque normalmente respetan el parénquima hepático. De esta manera, la fibrosis hepática congénita se presenta como hipertensión portal con función hepatocelular conservada.

La esclerodermia es una enfermedad del tejido conjuntivo caracterizada por fibrosis de la piel y órganos internos, lo que conduce a una insuficiencia orgánica y a la muerte (Black et al., 1998; y Clements y Furst, 1996; para revisiones, véanse J. Varga, 2004; Chung y Utz, 2004; y Rhew y Barr, 2004). La esclerodermia presenta un espectro de manifestaciones y una diversidad de implicaciones terapéuticas. Comprende esclerodermia localizada, esclerosis sistémica, trastornos de tipo esclerodérmico y esclerodermia Sin (Smith, 2000). Mientras que la esclerodermia localizada es una rara enfermedad dermatológica asociada con fibrosis y con manifestaciones limitadas a la piel, la esclerosis sistémica es una enfermedad multisistémica con riesgo variable en cuanto a la afectación de órganos internos y a la variación en el grado de enfermedad cutánea. La esclerosis sistémica puede ser difusa o limitada. La esclerosis sistémica limitada es también llamada CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, disfunción esofágica, esclerodactilia y telangiectasia). Se cree que los trastornos de tipo esclerodérmico están relacionados con la exposición a ambientes industriales. En la enfermedad Sin, hay afectación de órganos internos sin cambios cutáneos.

Las principales manifestaciones de la esclerodermia y, en particular, de la esclerosis sistémica son una síntesis y un depósito excesivos e inapropiados de colágeno, disfunción endotelial, espasmo, colapso y obliteración por fi-
brosis.

La esclerodermia es una enfermedad rara con una incidencia estable de aproximadamente 19 casos por millón de personas. Se desconoce la causa de la esclerodermia; sin embargo, la predisposición genética es importante. Las anormalidades ocasionan autoinmunidad y alteración de la función de las células endoteliales y los fibroblastos. En realidad, la esclerosis sistémica es probablemente la más grave de las enfermedades autoinmunes, con una mortalidad comunicada de 50% en 5 años tras el diagnóstico (Silman, 1991).

En términos de diagnóstico, un parámetro clínico importante es el engrosamiento cutáneo próximo a las articulaciones metacarpofalángicas. El fenómeno de Raynaud es un componente frecuente, casi universal, de la esclerodermia. Se diagnostica por cambios en el color de la piel tras una exposición a frío. Isquemia y engrosamiento cutáneo son síntomas de la enfermedad de Raynaud.

Diversos procesos biológicos subyacentes están implicados en el inicio, la gravedad y el progreso de la enfermedad, e incluyen disfunción vascular, activación y daño de células endoteliales, acumulación de leucocitos, producción de autoanticuerpos y, crucialmente, una respuesta fibrótica incontrolada que puede conducir a la muerte (Clements y Furst, 1996). Los fibroblastos tienen un papel esencial en la patogénesis de esta enfermedad. Fibroblastos primarios obtenidos de pacientes con esclerodermia presentan muchas de las propiedades características de la enfermedad vistas in vivo, una síntesis y un depósito notablemente aumentados de matriz extracelular, notablemente de colágeno y fibronectina, y una producción alterada de factores de crecimiento y citocinas, tales como TGF-\beta y CTGF (Strehlow y Korn, 1998; y LeRoy, 1974).

No hay tratamiento curativo para la esclerodermia. Una terapia innovadora, aunque de alto riesgo, propuso el trasplante de células madre autólogas (Martini et al., 1999). En particular, no hay actualmente tratamientos para la esclerodermia que se dirijan al proceso fibrótico (Wigley y Boling, 2000).

La identificación de los genes asociados con el riesgo de enfermedad y el progreso de la esclerodermia puede conducir al desarrollo de estrategias eficaces para la intervención en diversas fases de la enfermedad.

En el Documento WO03/054012, la proteína secretada INSP035 fue clasificada en el subconjunto de citocinas de haces de cuatro hélices \alpha, que es subdividido en citocinas de cadenas cortas y de cadenas largas ya que sus hélices comprenden aproximadamente 15 y 25 residuos, respectivamente. Se han determinado las estructuras cristalinas de las citocinas de haces de cuatro hélices \alpha de cadenas largas: LIF, IL-6, CNTF, GH, factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF; del inglés, granulocyte-colony stimulating factor), y leptina. Aunque sólo presentan un bajo grado de homología en sus estructuras primarias, muestran una elevada homología en sus estructuras terciarias y en sus epítopos receptores funcionales. INSP035 fue identificada como un miembro de la familia de citocinas de cadenas largas y, más particularmente, como una leptina. En la bibliografía se han descrito secuencias similares a las de INSP035 y sus variantes (ID. SEC. nº 31196 e ID. SEC. nº 42492 en el Documento WO01/75067; ID. SEC. nº 13 en el Documento WO02/074961; SwissProt, nº de acceso Q9BTA0). Sin embargo, los datos experimentales proporcionados hasta ahora no muestran implicación alguna de estas secuencias en enfermedades fibróticas.

La osteoprotegerina (OPG) fue identificada por vez primera en 1997 como una nueva citocina soluble secretada por fibroblastos (Simonet et al., 1997). La OPG es un miembro de la familia de receptores de TNF (Morinaga et al., 1998; Yasuda et al., 1998), y comprende cuatro dominios de tipo TNFR, ricos en cisteína, en su porción N-terminal (Simonet et al., 1997). Se ha mostrado que la OPG desempeña un papel en el desarrollo del hueso, y los ratones que carecían del gen OPG tenían un fenotipo osteoporótico e importantes anormalidades esqueléticas (Min et al., 2000).

La osteoprotegerina, que es producida por osteoblastos y por células estromales de médula ósea, carece de un dominio transmembranal y actúa como un receptor señuelo secretado que no tiene capacidad de señalización directa. La OPG actúa uniéndose a su ligando natural, el ligando de osteoprotegerina (OPGL; del inglés, osteoprotegerin ligand), que es también conocido como ligando del receptor activador del factor nuclear kappaB (RANKL; del inglés, receptor activator of nuclear factor kappaB ligand). La unión entre OPG y OPGL evita que OPGL active su receptor afín, RANK, que es el receptor osteoclástico vital para la diferenciación, activación y supervivencia del osteoclasto. La supresión de OPGL o RANK también produce una osteopetrosis profunda, lo que indica el importante papel fisiológico de estas proteínas en la regulación de la reabsorción ósea. La secreción de OPG y OPGL por osteoblastos y células estromales es regulada por numerosas hormonas y citocinas, a menudo de un modo recíproco. Por consiguiente, la OPG podría representar una opción terapéutica eficaz para enfermedades asociadas con una excesiva actividad osteoclástica (Kostenuik y Shalhoub, 2001). También se mostró que, in vitro, la OPG se unía a otro miembro de la familia del TNF, es decir, al ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF/ligando de Apo2 (TRAIL/Apo2L; del inglés, TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo2 ligand), con alta afinidad, comparable a la de la unión por el receptor (R) 2 de TRAIL (J. Emery et al., 1998; H. Walczak et al., 1997). Además, en un estudio sobre mieloma múltiple, Shipman y Croucher (C. M. Shipman y Croucher, 2003) mostraron que TRAIL/Apo2L provocaba apoptosis en células de mieloma y que esto podía ser evitado con la adición de OPG recombinante (rOPG). TRAIL provoca apoptosis por entrecruzamiento de los dos receptores de TRAIL que contienen un dominio de muerte, TRAIL-R1 y TRAIL-R2. TRAIL-R3 y TRAIL-R4 son receptores que no transmiten una señal apoptótica.

En el Documento WO03/084560, la administración de osteoprotegerina daba lugar a una mejora significativa de la enfermedad en un modelo animal establecido de fibrosis pulmonar. La fibrosis pulmonar es una de las manifestaciones de la esclerodermia. Por lo tanto, se sugirió usar osteoprotegerina para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas, en particular la esclerodermia. Además, Hasel et al., al determinar la expresión de TRAIL y sus receptores en páncreas normal y pancreatitis crónica, mostraron que los cambios en la expresión del receptor de TRAIL eran muy acusados en las zonas de infiltración inflamatoria y fibrosis activa, y que células similares a fibroblastos (FLC; del inglés, fibroblast-like cells) expresaban TRAIL en zonas de fibrosis activa (C. Hasel et al., 2003). Taimr et al. proponen que los antagonistas de TRAIL-R2 pueden ser útiles para reducir la fibrosis al provocar la apoptosis de células estrelladas porque los hepatocitos no expresan TRAIL-R2 (P. Taimr et al., 2003). Esto se basa en la observación de que la apoptosis representa un mecanismo importante para reducir los números de células estrelladas activadas, durante la fase de resolución de la fibrosis hepática. Además, Yurovsky mostró que tanto el nivel de mRNA del colágeno alfa-2 (I) como la secreción total de colágeno soluble por fibroblastos pulmonares humanos normales resultaban aumentados tras la estimulación con TRAIL en bajas concentraciones, mientras que se halló que elevadas concentraciones de TRAIL provocaban la muerte apoptótica de esas células. Sugirió también que TRAIL potencia la síntesis de matriz extracelular al desencadenar la producción de TGF-\beta, que actúa de un modo autocrino (V. V. Yurovsky, 2003).

En el Documento WO 03/054012 se describen usos terapéuticos para polipéptidos/polinucleótidos INSP035, incluyendo la cicatrización de heridas, la artritis reumatoide y la insuficiencia cardíaca.

Sumario del invento

El invento se basa en el hallazgo de que INSP035 es un potente inhibidor de TRAIL en un ensayo in vitro diseñado para seleccionar moléculas antiapoptóticas en fibroblastos, con osteoprotegerina (OPG) como testigo. Por lo tanto, como OPG, INSP035 es capaz de contrarrestar el efecto apoptótico de TRAIL recombinante humano soluble sobre los fibroblastos, lo que reduce consistentemente la apoptosis de fibroblastos.

Por lo tanto, un primer objeto del invento es utilizar INSP035 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas, en particular la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar y la esclerodermia. Un segundo objeto del invento es utilizar una célula que exprese INSP035, o un vector de expresión que comprenda la secuencia de codificación de INSP035, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad fibrótica, en particular la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia. También se describen aquí composiciones farmacéuticas que comprenden INSP035 y otros fármacos antifibróticos, tales como halofuginona, OPG y SARP-1, y métodos de tratamiento que comprenden administrar INSP035 al cuerpo humano.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Forma de Longitud Media, modificada con His, de INSP035 (ID. SEC. nº 8) en el ensayo de TRAIL. El eje Y representa el porcentaje de inhibición de TRAIL. El eje X representa el logaritmo decimal (log) de la dilución de la forma media modificada de INSP035. Se obtuvieron curvas similares con la ID. SEC. nº 3 (Forma Larga de INSP035-His) y la ID. SEC. nº 6 (Forma Media de INSP035-His).

Figura 2 LEPTINA en el ensayo de TRAIL. El eje Y representa la densidad óptica. El eje X representa los diferentes ensayos llevados a cabo, comenzando con el testigo negativo y siguiendo luego con TRAIL recombinante, osteoprotegerina y finalmente leptina en diversas concentraciones (10 ng/ml, 100 ng/ml y 1000 ng/ml).

Figura 3 Efecto de INSP035 sobre OPG de ratón 24 horas (A) y 48 horas (B) después de la adición de INSP035. En cada una de las figuras, el eje Y representa la densidad óptica y el eje X representa los diferentes ensayos llevados a cabo, empezando con los testigos negativo y positivo y siguiendo con las diversas formas de INSP035 analizadas, subdivididos en dos categorías dependiendo de la cantidad de INSP035 añadida (18 \mul y 2 \mul, respectivamente).

Descripción del invento

El invento se basa en el hallazgo de que INSP035 es un potente inhibidor de TRAIL en un ensayo in vitro diseñado para seleccionar moléculas antiapoptóticas en fibroblastos, con osteoprotegerina (OPG) como testigo. Por lo tanto, como OPG, INSP035 es capaz de contrarrestar el efecto apoptótico de TRAIL recombinante humano soluble sobre los fibroblastos, lo que reduce consistentemente la apoptosis de los fibroblastos (véase la Figura 1). En el mismo ensayo, la proteína leptina no afectó a la apoptosis mediada por TRAIL, no mostrando efecto alguno en absoluto (véase la Figura 2).

En el Documento WO03/084560, se muestra que la administración de osteoprotegerina daba lugar a una mejora significativa de la fibrosis en un modelo animal establecido de fibrosis pulmonar (véanse también Hasel et al. y Taim et al. en la sección "Antecedentes del invento". Basándose en que OPG e INSP035 comparten funciones comunes y en los hallazgos relativos a que TRAIL estimula la producción de colágeno (V. V. Yurovsky, 2003), se sugiere que INSP035 es útil en el tratamiento de la fibrosis. Aunque sin pretender respaldos teóricos, se propone una hipótesis sobre el mecanismo de acción de INSP035 basándose en los presentes resultados, en el que INSP035, como un inhibidor de TRAIL, podría reducir la cantidad de TGF-\beta presente las células, lo cual, a su vez, reduciría la síntesis de colágeno, de la cual se sabe que es deletérea en la patogénesis de la fibrosis.

Por lo tanto, el invento se refiere al uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste en:

a)

un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 10;

b)

la forma de etiqueta histidínica de los polipéptidos cuyas secuencias se exponen en la ID. SEC. nº 2 (ID. SEC. nº 3) o ID. SEC. nº 5 (ID. SEC. nº 6) o ID. SEC. nº 7 (ID. SEC. nº 8) o ID. SEC. nº 10 (ID. SEC. nº 11);

c)

un polipéptido que comprende cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11;

d)

una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 40% o 50% o 60% o 70% u 80% o 90% de identidad con respecto a al menos una de las secuencias de (a) a (c);

\newpage

e)

una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de (a) a (c); y

f)

una sal o una isoforma, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o derivado circularmente permutado de cualquiera de (a) a (e).

El invento se refiere además al uso de una molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11, y que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a)

una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 4 e ID. SEC. nº 9;

b)

una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con el complemento de la secuencia de ácido nucleico de (a) bajo condiciones moderadamente rigurosas o bajo condiciones muy rigurosas; y

c)

una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) y (b), en que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tiene sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11.

Dicha sustancia puede ser la propia INSP035 o cualquier fragmento de INSP035 capaz de inhibir a TRAIL.

El cDNA de longitud completa de la INSP035 humana (Forma Larga de INSP035) ha sido clonado y se representa como ID. SEC. nº 1 en la lista de secuencias adjunta. La correspondiente secuencia de aminoácidos se proporciona como ID. SEC. nº 2 en la lista de secuencias adjunta. El cDNA de la INSP035 humana comenzando en la segunda metionina (Forma Media de INSP035) de la Forma Larga de INSP035 ha sido clonado y se representa como ID. SEC. nº 4 en la lista de secuencias adjunta. La correspondiente secuencia de aminoácidos se proporciona como ID. SEC. nº 5 en la lista de secuencias adjunta. Se ha generado una Forma Media de INSP035 modificada con una sustitución por isoleucina en la posición 1 (Met - -> Ile), con la secuencia de aminoácidos proporcionada como ID. SEC. nº 7. El cDNA de la INSP035 humana comenzando en la tercera metionina (Forma Corta de INSP035) de la Forma Larga de INSP035 ha sido clonado y se representa como ID. SEC. nº 9 en la lista de secuencias adjunta. La correspondiente secuencia de aminoácidos se proporciona como ID. SEC. nº 10 en la lista de secuencias adjunta.

La expresión "tratamiento y/o prevención", como se usa aquí, abarca toda atenuación, reducción o prevención o bloqueo parcial, sustancial o completo de la formación, desarrollo o progreso de la enfermedad o de la formación, desarrollo o progreso de uno cualquiera o de varios o todos los síntomas de la enfermedad.

La expresión "enfermedad fibrótica", como se usa aquí, se refiere a enfermedades que acarrean fibrosis, que puede ser debida, por ejemplo, a una inflamación crónica o a reparación y reorganización de tejidos. La fibrosis puede afectar al pulmón o al hígado. Por lo tanto, el invento se refiere al tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas tales como la fibrosis hepática y la fibrosis pulmonar. Otras enfermedades y trastornos tratables con INSP035 comprenden la cicatrización de heridas en el pulmón, que comprende inflamación crónica del pulmón y finalmente fibrosis de superficies pulmonares. Los trastornos que ocasionan inflamación del pulmón comprenden, por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, displasia broncopulmonar y ARDS fibroproliferativa, así como manifestaciones pulmonares o enfermedades sistémicas tales como la artritis reumatoide (Krein et al., 2001).

La fibrosis implica generalmente generación o proliferación de tejido conjuntivo, el cual sustituye a tejido especializado funcional de un órgano dado. Por lo tanto, en una realización preferida del presente invento, la enfermedad fibrótica es una enfermedad del tejido conjuntivo, es decir, esclerodermia.

El término "esclerodermia", como se usa aquí, se refiere a una enfermedad también llamada esclerosis sistémica o esclerodermia sistémica. Estas expresiones se utilizan sinónimamente en la presente solicitud de patente. La esclerosis sistémica es una enfermedad crónica de causa desconocida, caracterizada por fibrosis difusa, cambios degenerativos y anormalidades vasculares en la piel, estructuras articulares y órganos internos (especialmente el esófago, el tracto gastrointestinal, el pulmón, el corazón y el riñón, por ejemplo). Puede ser localizada, o mixta, sistémica, limitada o difusa.

El término "esclerodermia" se refiere preferiblemente a las esclerodermias localizada, sistémica, limitada y difusa, así como a los síndromes de solapamiento.

La esclerodermia localizada afecta principalmente a la piel, pero también puede afectar a los huesos y músculos subyacentes. Sin embargo, no afecta generalmente a los órganos internos. La esclerodermia localizada es relativamente benigna y puede estar relacionada con la esclerodermia sistémica en términos de síntomas superficiales similares, tal como el aspecto de biopsias cutáneas bajo el microscopio.

La esclerodermia sistémica comprende varios tipos de síntomas o grupos de síntomas, tal como CREST, limitada y difusa. También se puede hacer referencia a ella como esclerosis sistémica progresiva o esclerosis sistémica progresiva familiar. La esclerodermia sistémica puede afectar, por ejemplo, a la piel, los vasos sanguíneos y/u los órganos internos. Cuando afecta a la piel, puede causar el endurecimiento de la piel, muy corrientemente en las manos y/o la cara. Cuando afecta a los vasos sanguíneos, puede causar la enfermedad de Raynaud. En las formas más graves de esclerosis sistémica están afectados los órganos internos, lo que puede causar incapacidad e incluso la muerte. La esclerosis sistémica comprende, entre otros procesos: enfermedad pulmonar por esclerodermia, crisis renal esclerodérmica, manifestaciones cardíacas, debilidad muscular incluyendo fatiga y CREST limitada, espasmo y dismotilidad gastrointestinales, y anormalidades en los sistemas nerviosos central, periférico y autónomo. Con respecto a las anormalidades del sistema nervioso, lo más común es el síndrome del túnel carpiano seguido de la neuralgia del trigémino.

La esclerodermia limitada puede limitarse, por ejemplo, a las manos, aunque también pueden estar afectadas la cara y el cuello.

La esclerodermia difusa comprende tirantez de la piel y también se presenta encima de las muñecas (o codos). Hay varias subcategorías de esclerosis sistémica difusa, tales como la "esclerodermia sin esclerodermia", en la que hay fibrosis de órganos internos pero no tirantez de la piel, y la esclerosis sistémica progresiva familiar, una forma rara que se presenta en familias.

Se hace referencia a síndromes de solapamiento cuando un paciente con esclerodermia también tiene otra enfermedad autoinmune (tal como lupus, artritis reumatoide, etc.), tal como, por ejemplo, en la esclerodermia difusa que solapa con lupus. Los síntomas de esclerodermia pueden ser también parte de la enfermedad mixta del tejido conjuntivo (MCTD; del inglés, mixed connective tissue disease) o la enfermedad indiferenciada del tejido conjuntivo (UCTD; del inglés, undifferentiated connective tissue disease).

El término "INSP035", como se usa aquí, se refiere a una proteína que comprende toda, o una porción de, la secuencia de la ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 4, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 9, ID. SEC. nº 10 o ID. SEC. nº 11 (todas humanas) de la lista de secuencias adjunta, así como a sales, isoformas, muteínas, fracciones activas, derivados funcionales y derivados circularmente permutados de las mismas. Se puede utilizar una INSP035 de una especie que no sea la humana, tal como de ratón o rata, de acuerdo con el presente invento con tal de que haya una identidad suficiente entre las proteínas que permita que la proteína presente su actividad biológica y no genere una respuesta inmune sustancial en un ser humano.

El término "INSP035", como se usa aquí, se refiere además a cualquier fragmento, porción, dominio o subdominio de la ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 4, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 9, ID. SEC. nº 10 o ID. SEC. nº 11 que muestra la actividad deseada en la esclerodermia u otras enfermedades fibróticas. Se pueden utilizar fragmentos proteínicos, isoformas, formas diferentemente glicosiladas o sialiladas o uno o más dominios de la proteína de acuerdo con el invento con tal de que presenten cualquier efecto beneficioso sobre la enfermedad fibrótica, preferiblemente un efecto que sea al menos comparable al de la proteína de longitud completa. El efecto beneficioso puede ser medido en uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos más adelante en los ejemplos, o en cualquier otro ensayo adecuado para demostrar un efecto en enfermedades fibróticas, en particular en la esclerodermia.

De acuerdo con el presente invento, INSP035 puede ser una proteína presente en la naturaleza, es decir, nativa, o una proteína recombinante. La producción recombinante puede ser llevada a cabo en células eucarióticas, tales como células de levadura o células de mamífero, preferiblemente en células CHO, en células de riñón embrionario humano (HEK; del inglés, human embryonic kidney) o en fibroblastos humanos o líneas celulares de fibroblasto humano. Además, puede ser llevada a cabo en células procarióticas tales como E. coli.

Preferiblemente, INSP035 está glicosilada en uno o más sitios. También puede estar sin glicosilar, dependiendo de las necesidades dadas y de la fuente de producción o aislamiento de la proteína.

El término "sales" se refiere aquí tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de grupos amino, por adición de ácido, de la molécula de INSP035 o de compuestos análogos de la misma. Las sales de un grupo carboxilo pueden ser formadas por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, tales como, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de zinc, y similares, y sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales por adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico y ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético y ácido oxálico. Por supuesto, dichas sales deben conservar la actividad biológica de INSP035 que es relevante para el presente invento, es decir, deben ejercer un efecto beneficioso sobre enfermedades fibróticas, en particular sobre la esclerodermia.

También se pueden utilizar isoformas o variantes de corte y empalme de INSP035 de acuerdo con el invento, con tal de que sean capaces de inhibir el progreso y/o los síntomas de esa enfermedad.

Como se usa aquí, el término "muteínas" se refiere a compuestos análogos de INSP035 en que uno o más de los residuos de aminoácido de la INSP035 natural han sido sustituidos por residuos de aminoácido diferentes o han sido suprimidos, o se han añadido uno o más residuos de aminoácido a la secuencia natural de INSP035, que tienen preferiblemente al menos la misma actividad que la INSP035 de tipo silvestre o que incluso tienen una actividad mucho más potente. La actividad biológica de INSP035 puede ser medida, por ejemplo, analizando la capacidad de INSP035 para inhibir a TRAIL. Los ensayos para evaluar interacciones proteína-proteína son bien conocidos por la persona experta en la técnica. Son ejemplos de dichos ensayos los ensayos de unión de tipo ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas; en inglés, enzyme-linked immunosorption assay), los ensayos de inmunoprecipitación, y la medición en cualquier otro sistema adecuado, tal como el sistema BIAcore. Estas muteínas son preparadas mediante conocidas técnicas de síntesis y/o de mutagénesis dirigida al sitio o mediante cualquier otra técnica conocida y adecuada para ello.

Cualquiera de dichas muteínas tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de INSP035, de modo que tiene al menos una actividad sustancialmente similar a la de INSP035. La actividad de una INSP035 mutante puede ser adicionalmente probada en los ensayos explicados más adelante en los ejemplos (Ejemplo 2) o en los ejemplos descritos en el Documento WO03/084560. La medición, por ejemplo, de la cantidad de síntesis de colágeno en fibroblastos tratados con INSP035 puede ser un ensayo adecuado para evaluar la actividad de muteínas de INSP035.

Las muteínas de acuerdo con el presente invento incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como DNA o RNA, que se hibrida con DNA o RNA que codifica INSP035, de acuerdo con el presente invento, bajo condiciones rigurosas. La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones de la hibridación y el lavado subsiguiente a las que quienes tienen experiencia normal en la técnica se refieren convencionalmente como "rigurosas". Véanse Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, New York, EE.UU., secciones 6.3 y 6.4 (1987, 1992), y Sambrook et al. [J. C. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU.].

Sin limitación, los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen condiciones de lavado 12-20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio en, por ejemplo, SSC 2x y SDS al 0,5% durante 5 minutos, SSC 2x y SDS al 0,1% durante 15 minutos, SSC 0,1x y SDS al 0,5% a 37ºC durante 30-60 minutos, y luego SSC 0,1x y SDS al 0,5% a 68ºC durante 30-60 minutos. Quienes tienen una experiencia normal en esta técnica entienden que las condiciones de rigor también dependen de la longitud de las secuencias de DNA, sondas oligonucleotídicas (tales como de 10-40 bases) o sondas oligonucleotídicas mixtas. Si se usan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC (véase Ausubel, supra).

Cualquiera de dichas muteínas tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de INSP035, de modo que tiene una actividad biológica sustancialmente similar a, o incluso mejor que, la de INSP035.

Una actividad fácilmente mensurable de INSP035 es su capacidad para reducir la síntesis de colágeno. Con tal de que la muteína tenga una sustancial actividad reductora de la síntesis de colágeno, se puede considerar que tiene una actividad sustancialmente similar a la de INSP035. De esta manera, por medio de una experimentación rutinaria a que se somete dicha muteína, se puede determinar si cualquier muteína dada tiene al menos sustancialmente la misma actividad que INSP035.

En una realización preferida, cualquiera de dichas muteínas tiene al menos un 40% de identidad u homología con respecto a la secuencia de INSP035. Más preferiblemente, tiene al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o, muy preferiblemente, al menos un 90%, de identidad u homología con respecto a aquella.

La identidad refleja una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada por comparación de las secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta, nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido, de los dos polinucleótidos o las dos secuencias polipeptídicas, respectivamente, en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

Para las secuencias en que no haya una correspondencia exacta, se puede determinar un "% de identidad". En general, las dos secuencias que se van a comparar son alineadas para obtener la máxima correlación entre las secuencias. Esto puede incluir la inserción de "huecos" en una o ambas secuencias para aumentar el grado de alineación. El % de identidad se puede determinar para la longitud completa de cada una de las secuencias que se comparan (la llamada "alineación global"), lo que es particularmente adecuado para secuencias que tienen la misma longitud o una longitud muy similar, o para longitudes definidas más cortas (la llamada "alineación local"), lo que es más adecuado para secuencias de longitud diferente.

Los métodos para comparar la identidad y la homología de dos o más secuencias son bien conocidos en la técnica. De este modo, por ejemplo, se pueden usar programas asequibles en el Winconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (J. Devereaux et al., 1984), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias polipeptídicas. BESTFIT utiliza el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la mejor región única de similitud entre dos secuencias. En la técnica también se conocen otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias, tales como, por ejemplo, la familia BLAST de programas (S. F. Altschul et al., 1990; S. F. Altschul et al., 1997, accesible a través de la página de inicio del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (W. R. Pearson, 1990; Pearson, 1988).

Las muteínas de INSP035, que pueden ser utilizadas de acuerdo con el presente invento, o los ácidos nucleicos que las codifican, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como polinucleótidos o péptidos de sustitución que pueden ser rutinariamente obtenidos por quien tiene una experiencia normal en la técnica, sin una experimentación excesiva, basándose en las enseñanzas y la orientación aquí presentadas.

Los cambios preferidos para las muteínas de acuerdo con el presente invento son los que se conocen como sustituciones "conservativas". Las sustituciones de aminoácido conservativas en los polipéptidos o proteínas INSP035 pueden incluir, dentro de un grupo, aminoácidos sinónimos que tengan propiedades fisicoquímicas suficientemente similares para que la sustitución entre miembros del grupo conserve la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Es evidente que también se pueden realizar inserciones y deleciones de aminoácidos en las secuencias anteriormente definidas sin que se altere su función, particularmente si las inserciones o deleciones sólo afectan a unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta y preferiblemente menos de diez, y sin que se eliminen ni desplacen aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, los residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas mediante dichas deleciones y/o inserciones caen dentro del alcance del presente invento.

Preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla I. Más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla II; y muy preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla III.

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TABLA I Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos

1

TABLA II Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos

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3

TABLA III Grupos muy preferidos de aminoácidos sinónimos

4

5

Los ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que se pueden usar para obtener muteínas de proteínas o polipéptidos INSP035 para uso en el presente invento incluyen cualesquier operaciones metódicas conocidas, tales como las presentadas en las Patentes de EE.UU. 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, concedidas a Mark et al.; 5.116.943, concedida a Koths et al.; 4.965.195, concedida a Namen et al.; 4.879.111, concedida a Chong et al.; y 5.017.691, concedida a Lee et al.; y las proteínas sustituidas con lisina presentadas en la Patente de EE.UU. nº 4.904.584 (Shaw et al.).

La expresión "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido que comprende INSP035, o una muteína del mismo, fusionado con otra proteína que, por ejemplo, tiene un tiempo de permanencia prolongado en los fluidos corporales. De acuerdo con el invento, se prefieren las proteínas de fusión que comprenden toda la, o una parte funcional de, INSP035 fusionada con toda, o una parte funcional de, una proteína capaz de mejorar las actividades biológicas de la molécula, tal como, por ejemplo, la semivida en el organismo humano. En una realización preferida, la proteína de fusión comprende una fusión de inmunoglobulina (Ig). Las proteínas de fusión que comprenden toda, o parte de, la INSP035 fusionada con toda, o parte de, una inmunoglobulina son muy preferidas. Pueden ser monómeras o multímeras, heteromultímeras u homomultímeras. Ventajosamente, la proteína de fusión comprende la región constante de una inmunoglobulina, en particular de la porción Fc de la inmunoglobulina. De acuerdo con el invento, se prefieren más las realizaciones en que la inmunoglobulina es del isotipo IgG1 o IgG2. Preferiblemente, la fusión es una fusión de Fc.

Por lo tanto, la INSP035 puede ser fusionada con otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. La fusión puede ser directa o por medio de un corto péptido conector que puede tener una longitud de tan sólo 1 a 3 residuos de aminoácido o más, por ejemplo, una longitud de 13 residuos de aminoácido. Dicho conector puede ser, por ejemplo, un tripéptido de secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met) o una secuencia conectora de 13 aminoácidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, introducida entre la secuencia de INSP035 y la secuencia inmunoglobulínica.

Como se usan aquí, los "derivados funcionales" abarcan derivados de INSP035 y sus muteínas y proteínas de fusión, que se pueden preparar por medios conocidos en la técnica a partir de los grupos funcionales que se encuentran como cadenas laterales en los residuos o en los grupos N- o C-terminales, y son incluidos en el invento con tal de que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la proteína que es al menos sustancialmente similar a la actividad de INSP035 y no confieran propiedades tóxicas a las composiciones que los contienen. Por lo tanto, en una realización preferida, el derivado funcional comprende al menos un resto fijado a uno o más grupos funcionales que se encuentran como una o más cadenas laterales en los residuos de aminoácido.

De acuerdo con el presente invento, las cadenas laterales de polietilenglicol (PEG) son restos muy preferidos. Las cadenas laterales de PEG pueden enmascarar sitios antigénicos y prolongar en los fluidos corporales la permanencia de la sustancia a la que están fijados. Otros derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acílicos de grupos amino libres de los residuos de aminoácido, formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico), o derivados O-acílicos de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, de residuos de serilo o treonilo) formados con restos acilo.

Las "fracciones activas" de INSP035 y sus muteínas y proteínas de fusión abarcan fragmentos o precursores de la cadena polipeptídica de la molécula proteica, solos o junto con moléculas o residuos asociados unidos a ellas, por ejemplo, residuos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula proteica o los residuos de azúcar solos, con tal de que dicha fracción activa tenga al menos una actividad sustancialmente similar a la de INSP035.

También se puede administrar INSP035 al cuerpo humano en forma de un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, el invento se refiere además al uso de un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia u otro trastorno fibrótico. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión que comprende un promotor operativamente unido a toda la secuencia de codificación de INSP035 o a parte de ella. En una realización preferida más, el vector es un vector para terapia génica. Los vectores para terapia génica son conocidos en la técnica y la mayoría de ellos son vectores víricamente derivados, tales como vectores adenovíricos o lentivíricos.

También se puede administrar INSP035 al cuerpo humano en forma de una célula que produce y/o secreta INSP035. Por lo tanto, el invento se refiere además al uso de una célula que expresa INSP035, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia o cualquier otra enfermedad fibrótica, es decir, a terapia celular para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia u otras enfermedades fibróticas. La célula puede ser una célula que produce naturalmente INSP035 y/o una célula transfectada que produce INSP035 recombinante. Se prefieren las células que expresan y secretan elevadas cantidades de la proteína, tales como células de sobreexpresión que llevan elevados números de copias de un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica INSP035.

Puesto que los fibroblastos representan la maquinaria de la fibrosis, son las células más adecuadas para una terapia antifibrótica y antiesclerodérmica. Por lo tanto, de acuerdo con el presente invento se usan preferiblemente fibroblastos que expresan INSP035.

El invento se refiere además a una célula que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica toda la INSP035 o parte de ella, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas, en particular de la esclerodermia. Dentro del alcance del presente invento está también una célula que ha sido genéticamente modificada para que produzca un polipéptido de acuerdo con el invento.

De acuerdo con el invento, también se contempla el uso de un vector de expresión para inducir y/o potenciar la producción endógena de INSP035 en una célula que es normalmente muda o que expresa cantidades insuficientes del inhibidor. Por lo tanto, en el invento se utiliza una tecnología conocida como "activación génica endógena" (EGA; del inglés, endogenous gene activation) para la producción de la proteína deseada.

También se mostró aquí que INSP035 no induce la expresión endógena de OPG, lo que indica que INSP035 no está actuando a través de OPG (Figura 3). Esto sugiere que el uso de la combinación de INSP035 y OPG podría actuar de modo aditivo o sinérgico en el tratamiento de la fibrosis. De la misma manera, se pueden combinar diversos tratamientos distintos con INSP035 para obtener un efecto aditivo o sinérgico de acuerdo con el presente invento. Por lo tanto, el medicamento del invento comprende además preferiblemente:

\bullet

Osteoprotegerina (OPG);

\bullet

Interferón, en particular interferón \beta;

\bullet

Un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNF; del inglés, tumor necrosis factor), en particular TNFRs solubles, tales p55 soluble (TBP I) y/o p75 soluble (TBP II);

\bullet

Un agente antiesclerodérmico más;

\bullet

Un agente antiesclerodérmico seleccionado del grupo que consiste en halofuginona, inhibidores de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), bloqueadores del canal del calcio, inhibidores de la bomba de protones, fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAID), tal como ibuprofeno, inhibidores de la ciclooxigenasa (COX), corticosteroides, tal como prednisona, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de la geranil-geranil transferasa, roterlina, inhibidores de la prolil-4-hidroxilasa, inhibidores de la proteinasa c, inhibidores de la lisil-oxidasa, relaxina, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina 1, óxido nítrico, inhibidores de la angiotensina II, interleucina 10, interleucina 8, leucotrieno B4, ácido ursodesoxicólico, antioxidantes y SARP-1.

SARP-1 es una proteína conocida por ejercer un efecto beneficioso en enfermedades fibróticas tales como la esclerodermia (Documento WO02/46225). De acuerdo con el presente invento, también se pueden usar fragmentos, isoformas, fracciones activas, proteínas de fusión o derivados funcionales de SARP-1, como se describen en el Documento WO02/46225, en combinación con INSP035.

Todos los tratamientos están destinados a un uso simultáneo, secuencial o independiente.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden una o más de las sustancias anteriores junto con INSP035 están dentro del alcance del presente invento.

Aunque actualmente no hay cura para la esclerodermia, se están utilizando actualmente diversos agentes o tratamientos para tratar los síntomas de la esclerodermia. Dichos agentes antiesclerodérmicos, que pueden ser usados como terapia de combinación de acuerdo con el invento, son resumidos, por ejemplo, en Leighton (2001) y Wigley y Sule (2001), que aquí se incorporan totalmente por referencia.

Los interferones son fundamentalmente conocidos por sus efectos inhibidores sobre la replicación viral y la proliferación celular. El interferón \gamma, por ejemplo, desempeña un papel importante en la activación de respuestas inmunes e inflamatorias. Se dice que el interferón \beta (IFN-\beta, un interferón de tipo I) desempeña un papel antiinflamatorio.

En aún otra realización del invento, se usa INSP035 en combinación con un antagonista de TNF. Los antagonistas de TNF ejercen su actividad de varias formas. En primer lugar, los antagonistas se pueden unir a, o secuestrar, la propia molécula de TNF con la afinidad y la especificidad suficientes para neutralizar parcial o sustancialmente el epítopo o epítopos de TNF responsables de la unión al receptor de TNF (en adelante denominados "antagonistas secuestradores"). Un antagonista secuestrador puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el TNF.

Alternativamente, los antagonistas de TNF pueden inhibir la vía de señalización de TNF activada por el receptor de la superficie celular después de la unión del TNF (en adelante denominados "antagonistas de señalización"). Los antagonistas de TNF son fácilmente identificados y evaluados mediante la exploración rutinaria de candidatos en cuanto a sus efectos sobre la actividad del TNF nativo sobre líneas celulares susceptibles in vitro, por ejemplo, células B humanas, en las cuales el TNF causa proliferación y secreción de inmunoglobulinas. El ensayo contiene la formulación de TNF en diversas diluciones del antagonista candidato, por ejemplo, de 0,1 a 100 veces la cantidad molar de TNF usada en el ensayo, y los testigos sin TNF o sólo con el antagonista (Tucci et al., 1992).

Los antagonistas secuestradores son los antagonistas de TNF preferidos para ser utilizados de acuerdo con el presente invento. Entre los antagonistas secuestradores, se prefieren los polipéptidos que se unen a TNF con elevada afinidad y poseen baja inmunogenicidad. Se prefieren particularmente moléculas receptoras solubles de TNF y anticuerpos neutralizantes hacia TNF. Por ejemplo, las formas solubles de TNF-RI (p55) y TNF-RII (p75) son útiles en el presente invento. Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelulares de los receptores o porciones funcionales de los mismos, son antagonistas más particularmente preferidos de acuerdo con el presente invento. En, por ejemplo, el Documento EP914431 se describen receptores solubles truncados de tipo I y tipo II de TNF.

Las formas truncadas de los receptores de TNF son solubles y han sido detectadas en orina y suero como proteínas ligantes e inhibidoras de TNF, de aproximadamente 30 kDa y 40 kDa, que son llamadas TBP-I y TBP-II, respectivamente (Engelmann et al., 1990). De acuerdo con el invento, se prefiere el uso simultáneo, secuencial o independiente de INSP035 con el antagonista de TNF y/o un interferón.

De acuerdo con el invento, TBP-I y TBP-II son antagonistas de TNF preferidos para ser utilizados en combinación con una INSP035. Los derivados, fragmentos, regiones, y porciones biológicamente activas de las moléculas receptoras que se parecen funcionalmente a las moléculas receptoras pueden ser también utilizados en el presente invento. Dicho equivalente o derivado biológicamente activo de la molécula receptora se refiere a la porción del polipéptido, o de la secuencia que codifica la molécula receptora, que tiene el tamaño suficiente y es capaz de unirse a TNF con una afinidad tal que la interacción con el receptor de TNF unido a la membrana resulta inhibida o bloqueada.

En una realización preferida más, TNF-RI (TBP-I) soluble humano es el antagonista de TNF que se va a utilizar de acuerdo con el invento. En las Patentes Europeas EP 308.378, EP 398.327 y EP 433.900 se han descrito las moléculas receptoras de TNF solubles naturales y recombinantes y métodos para su producción.

Aunque puede resultar beneficioso bloquear el TNF-\alpha en fases tempranas de la enfermedad, se ha discutido que, en fases posteriores, el propio TNF puede ejercer un efecto beneficioso sobre la esclerodermia (Abraham et al., 2000). Por lo tanto, el invento se refiere además a una combinación de INSP035 y TNF para el tratamiento o la prevención de la esclerodermia, en particular en fases avanzadas de la enfermedad. De acuerdo con el invento se puede utilizar
TNF-\alpha o TNF-\beta.

El invento se refiere además a una composición farmacéutica que comprende INSP035, opcionalmente junto con uno o más vehículos, agentes diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas, en particular la esclerodermia. La composición farmacéutica puede comprender además cualquiera de los componentes adicionales anteriormente identificados, y, en particular, un interferón, una proteína ligante de TNF (TBP; del inglés, TNF binding protein) o un inhibidor de COX.

La composición farmacéutica de acuerdo con el invento puede comprender también un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el invento, o una célula que expresa INSP035.

Los ingredientes activos del producto farmacéutico, es decir los polipéptidos, ácidos nucleicos o células de acuerdo con el invento, o combinaciones de los mismos, así como las combinaciones de sustancias anteriormente mencionadas, se pueden administrar a un individuo de diversas formas. Las vías de administración incluyen las vías intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural, tópica e intranasal. Se puede utilizar cualquier otra vía terapéuticamente eficaz de administración, tal como, por ejemplo, la absorción a través de tejidos epiteliales o endoteliales o mediante una terapia génica con la que se administra al paciente una molécula de DNA que codifica el agente activo (por ejemplo, a través de un vector), lo que causa que el agente activo sea expresado y secretado in vivo. Además, la(s) proteína(s) de acuerdo con el invento puede(n) ser administrada(s) junto con otros componentes de agentes biológicamente activos, tales como agente tensioactivos, excipientes, agentes diluyentes y vehículos farmacéuticamente
aceptables.

Con la definición de "farmacéuticamente aceptable" se quiere abarcar cualquier vehículo que no interfiere en la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para el huésped al que se administra. Por ejemplo, para administración parenteral, la(s) proteína(s) activa(s) puede(n) ser formulada(s) en una forma de dosificación unitaria para inyección en vehículos tales como disolución salina, disolución de dextrosa, albúmina sérica y disolución de Ringer.

Para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular), la(s) proteína(s) activa(s) puede(n) ser formulada(s) en forma de disolución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, disolución salina o disolución de dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes y tampones). La formulación es esterilizada mediante técnicas comúnmente empleadas.

La biodisponibilidad de la(s) proteína(s) activa(s) de acuerdo con el invento puede ser también mejorada al utilizar procedimientos de conjugación que aumentan la semivida de la molécula en el cuerpo humano, tal como, por ejemplo, uniendo la molécula a polietilenglicol, como se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 92/13095.

La cantidad terapéuticamente eficaz de la(s) proteína(s) activa(s) será función de muchas variables, incluyendo el tipo de receptor, la afinidad de la sustancia de acuerdo con el invento por su receptor, toda actividad citotóxica residual mostrada por ella, la vía de administración y el estado clínico del paciente.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de la sustancia de acuerdo con el invento es aquella que, cuando se administra, da lugar a un efecto beneficioso sobre el desarrollo o el progreso in vivo de la enfermedad. La dosificación correspondiente a un individuo, en forma de dosis únicas o múltiples, variará dependiendo de una diversidad de factores que incluyen las propiedades farmacocinéticas de INSP035, la vía de administración, el estado y las características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), la extensión de los síntomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos de dosificación establecidos están dentro de la capacidad de quienes tienen experiencia en la técnica.

La dosis requerida del polipéptido de acuerdo con el invento variará de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg o de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg o de aproximadamente 1 a 3 mg/kg aunque, como se indicó anteriormente, estará sometida en gran medida al juicio terapéutico. El medicamento del invento puede ser administrado diariamente, un día si y otro no, o tres veces por semana.

Las dosis diarias se administran normalmente en dosis divididas o en una forma de liberación continua, eficaz para obtener los resultados deseados. Las administraciones segundas o subsiguientes pueden ser llevadas a cabo en una dosis que sea igual, menor o mayor que la dosis inicial o previa administrada al individuo. La administración segunda o subsiguiente puede ser administrada durante la enfermedad o antes del inicio de la enfermedad.

También se describe un método para tratar y/o prevenir enfermedades fibróticas, en particular la esclerodermia, que comprende administrar una cantidad eficaz de una sustancia de acuerdo con el invento, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, a un paciente que la necesita. Alternativa o adicionalmente, se puede administrar una célula que produzca INSP035 o una molécula de ácido nucleico del invento, opcionalmente comprendida en un vector de expresión.

El vector de expresión puede ser administrado sistémicamente. El vector de expresión se administra preferiblemente mediante inyección intramuscular. Otra vía preferida de administración es por inhalación, en particular si está implicada una fibrosis pulmonar en la enfermedad. La administración tópica de un vector de expresión que comprende secuencias de INSP035, o de un polipéptido INSP035 de acuerdo con el invento, es otra vía preferida de administración, en particular si hay una afectación de la piel.

El invento se refiere además a un método para la preparación de una composición farmacéutica, que comprende mezclar una cantidad eficaz de INSP035 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La referencia a operaciones metódicas conocidas, operaciones metódicas convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es en modo alguno una admisión de que cualquier aspecto, descripción o realización del presente invento está descrito, enseñado o sugerido en la técnica pertinente.

La precedente descripción de las realizaciones específicas revelará así totalmente la naturaleza general del invento que otros, aplicando los conocimientos propios de la experiencia de la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias aquí citadas), pueden modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones, tales como realizaciones específicas, sin una experimentación excesiva y sin apartarse del concepto general del presente invento. Por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones son consideradas como una variedad de equivalentes de las realizaciones descritas, basándose en la enseñanza y la orientación aquí presentadas. Ha de entenderse que la fraseología o terminología presente es con el fin de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente memoria descriptiva ha de ser interpretada por el técnico experto a la luz de las enseñanzas y la orientación aquí presentadas, en combinación con los conocimientos de quien tiene una experiencia normal en la técnica.

Una vez descrito el invento, será más fácilmente entendido por referencia a los ejemplos siguientes que se proporcionan a modo de ilustración y no están destinados a ser restrictivos del presente invento.

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Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión

En el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2 del Documento WO03/054012 se describen la clonación de INSP035, la construcción de plásmidos para la expresión de INSP035 en células HEK293/EBNA, la identificación de moldes/bancos de cDNA que contienen INSP035, y la expresión de INSP035-Long-6His-V1 en células de mamífero.

Ejemplo 2 Neutralización de la apoptosis en fibroblastos tratados con TRAIL recombinante humano soluble, por INSP035 2.1 Introducción

Se ha mostrado que el ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL; del inglés, TNF-related apoptosis-inducing ligand) es uno de los ligandos celulares de la osteoprotegerina (OPG). Se desarrolló un ensayo secundario que mimetizaba esta interacción fisiológica en fibroblastos. Este ensayo, la neutralización de la apoptosis en fibroblastos tratados con TRAIL recombinante humano soluble, es indicado para seleccionar receptores de TRAIL posiblemente nuevos y nuevas proteínas y pequeñas moléculas con actividad antiapoptótica.

2.2 Equipos y softwares

\quad

Placa para cultivo tisular de 96 pocillos (Ref. Costar nº 3596).

\quad

Lector de placas de 96 pocillos, con filtro de 490 nm.

\quad

Software "GraphPad Prism".

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2.3 Materiales y reactivos

\quad

Fibroblastos L929 de ratón (CCL-1) (Colección Americana de Cultivos Tipo; ATCC)

\quad

Medio DMEM (32430-027; Gibco BRL).

\quad

Suero bovino fetal estéril.

\quad

Actinomicina D (Fluka, Ref. 01817).

\quad

TRAIL/TNFS10 humano recombinante.

\quad

CytoTox 96® no radiactivo (Promega G179A).

\quad

Osteoprotegerina (testigo positivo).

\quad

INSP035.

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2.4 Cultivo celular

Se cultivaron las células hasta que alcanzaron la confluencia. Las células fueron luego tratadas con tripsina y fueron sembradas en DMEM con suero de ternera fetal (FCS; del inglés, fetal calf serum) al 2%, en una concentración de 20.000 células/pocillo. El volumen final fue 100 \mul/pocillo. La disolución fue luego incubada durante la noche a 37ºC en una cámara humidificada con CO_{2} al 5%. El medio fue cambiado por DMEM con FCS al 2% y actinomicina D en una concentración final de 1 \mug/ml. A continuación se añadieron 2 ng/ml de rTRAIL (375TEC) para inducir la apoptosis y se incubó la mezcla durante 24 horas en una cámara humidificada con CO_{2} al 5%. Luego se retiró el medio acondicionado y se tomaron muestras para el ensayo de citotoxicidad.

En el ensayo de citotoxicidad, siempre se midió la apoptosis en presencia de rTRAIL. Por lo tanto, el efector positivo fue TRAIL en una concentración de 2 ng/ml. 30 minutos antes de la adición de TRAIL, se añadió la molécula de referencia OPG (10 ng/ml), INSP035 o leptina.

2.5 Ensayo de citotoxicidad

El ensayo de citotoxicidad es un ensayo colorimétrico en el que se mide la producción de lactato deshidrogenasa.

En primer lugar, se transfirieron 50 \mul del sobrenadante a la placa. En segundo lugar, se utilizó el tampón de ensayo para reconstituir la mezcla de sustratos. Luego se añadieron 50 \mul de mezcla de sustratos reconstituida a cada pocillo del sobrenadante. A continuación, la placa fue cubierta y fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiental, protegida de la luz. Luego se añadieron 50 \mul de disolución de parada a cada pocillo y se registró la absorbancia a
490 nm.

2.6 Inmunoensayo enzimático de OPG

Para determinar si INSP035 estimula la producción endógena de OPG o no, se cultivaron células L929 en placas de 96 pocillos con diversas cantidades de variantes de INSP035 (como se describió para el ensayo de citotoxicidad). Para el ensayo de producción de OPG, se tomaron 50 \mul del medio acondicionado. Se utilizó el sistema de ELISA para OPG (BIOMEDICA, Ref. BI-20402 del catálogo) para medir la producción de OPG 24 horas y 48 horas después del tratamiento con INSP035.

2.7 Conclusión

INSP035 y sus variantes son potentes inhibidores de TRAIL en un ensayo in vitro diseñado para seleccionar moléculas antiapoptóticas en fibroblastos, con osteoprotegerina (OPG) como testigo (véase la Figura 1; se obtuvieron curvas similares con las demás variantes). Por consiguiente, como OPG, INSP035 es capaz de contrarrestar el efecto apoptótico de TRAIL recombinante humano soluble sobre los fibroblastos, reduciendo consistentemente por ello la apoptosis de fibroblastos. En el mismo ensayo, la leptina no afectó a la apoptosis mediada por TRAIL (Figura 2).

Los resultados del inmunoensayo enzimático de OPG sugieren que es que probable que INSP035, actuando a través de una vía diferente a la de OPG, actúe de un modo aditivo o sinérgico con OPG en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas.

Basándose en los hallazgos anteriores y en el hecho de que TRAIL estimula la producción de colágeno, se sugiere que INSP035 podría resultar útil en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas.

Ejemplo 3 Generación de una construcción de expresión de E. coli para INSP035

Se mutó pENTR-INSP035-6HIS, un plásmido compatible con el sistema de clonación Gateway^{TM}, por mutagénesis dirigida al sitio con objeto de insertar una secuencia de Shine-Dalgarno (5'-AAGGAGATG) cadena arriba del codón de inicio del cDNA de INSP035. El plásmido mutado resultante fue luego sometido a una reacción de recombinación con el vector de expresión pDEST14 de E. coli para crear pDEST14-SD-INSP035-6HIS.

3. Inserción de una secuencia de Shine-Dalgarno en pENTR-INSP035-6HIS por mutagénesis dirigida al sitio 3.1 Cebadores de clonación génicamente específicos para mutagénesis dirigida al sitio

Se diseñó un par de cebadores para PCR, INSP035-MF e INSP035-MR (Tabla 4), de modo que los cebadores se hibridaran con cadenas opuestas de la secuencia del plásmido pENTR-INSP035-6HIS y cada cebador se hibridara con 15-25 bases de cada lado de la región que se iba a insertar. Los cebadores para PCR fueron optimizados para que tuvieran una Tm superior o igual a 78ºC, un contenido mínimo de GC de 40%, y una G o una C como base 3'-terminal. Los cebadores fueron diseñados y optimizados usando el "Primer Designer Software" (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, EE.UU.). Los cebadores fueron purificados por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; del inglés, polyacrylamide gel electrophoresis).

3.2 Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida al sitio fue llevada a cabo utilizando el sistema QuickChange® (Stratagene) para mutagénesis dirigida al sitio, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de mutagénesis fue llevada a cabo usando el sistema QuickChange (Stratagene) para mutagénesis en un volumen final de 50 \mul que contenía:

- 5 \mul de tampón 10x de reacción,

- 100 ng de DNA del plásmido pENTR-INSP035-6HIS,

- 125 ng de cebador INSP035-MF,

- 125 ng de cebador INSP035-MR,

- 1 \mul de mezcla de dNTPs,

- 3 \mul de disolución QuicK, y

- 1 \mul de DNA polimerasa Pfu Turbo.

La termociclación fue llevada a cabo usando un equipo DNA Engine de MJ Research, programado del modo siguiente: 95ºC, 1 minuto; 18 ciclos de 95ºC, 50 segundos, 60ºC, 50 segundos, y 68ºC, 3 minutos; seguidos de un ciclo de elongación adicional de 68ºC durante 7 minutos y un ciclo de mantenimiento de 4ºC.

Se usó una digestión con Dpn I para digerir el molde paterno metilado o hemimetilado de DNA (el plásmido pENTR-INSP035-6HIS en la mezcla de reacción de las muestras). Se añadió 1 \mul de la enzima de restricción Dpn I (10 U/\mul, Stratagene) a la mezcla de reacción y se incubó la mezcla a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción fue luego usada para transformar células supercompetentes XL10-Gold (Stratagene) del modo siguiente. Se descongeló una parte alícuota de 50 \mul de células XL10-Gold sobre hielo y se añadió 1 \mul del DNA tratado con Dpn I. La mezcla fue incubada durante 30 minutos sobre hielo y fue luego térmicamente estimulada por incubación a 42ºC durante exactamente 45 segundos. Se devolvieron las muestras al hielo durante 2 minutos y se añadieron 250 \mul de medio NZY precalentado (42ºC). Las muestras fueron incubadas con sacudimiento (220 rpm) durante 1 hora a 37ºC. La mezcla de transformación fue luego sembrada en placas de caldo L (LB) que contenían kanamicina (40 \mug/ml). Las placas fueron incubadas durante la noche a 37ºC.

3.3 Preparación y secuenciación del DNA plasmídico

Ocho colonias de la placa de transformación de las muestras fueron inoculadas a 5 ml de caldo L (LB) que contenía kanamicina (40 \mug/ml) y fueron cultivadas durante la noche a 37ºC con sacudimiento a 220 rpm. Se preparó DNA plasmídico purificado con el sistema "mini-prep" usando un sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). El DNA plasmídico (150-200 ng) fue sometido a secuenciación de DNA con los cebadores 21M13 y M13Rev usando el sistema BigDye Terminator (Applied Biosystems; Ref. 4390246 del catálogo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 4. Las mezclas de las reacciones de secuenciación fueron purificadas usando columnas Dye-Ex (Qiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore; Ref. LSKS09624 del catálogo) y fueron luego analizadas en un secuenciador Applied Biosystems 3700.

El análisis de las secuencias permitió identificar un clon que contenía la secuencia de INSP035-6HIS con una secuencia de Shine-Dalgarno cadena arriba.

3.4 Transferencia de la secuencia de codificación de INSP035-6HIS, del vector mutado dador Gateway (16318) al vector de expresión pDEST14 de E. coli

El DNA plasmídico "mini-prep", preparado a partir del plásmido que contenía la secuencia de INSP035-6HIS con una secuencia de Shine-Dalgarno cadena arriba (1,5 \mul), fue luego usado en una mezcla de reacción de recombinación que contenía 1,5 \mul del vector pDEST14 (0,1 \mug/\mul), 2 \mul de tampón LR y 1,5 \mul de LR Clonase (Invitrogen) en un volumen final de 10 \mul. Se incubó la mezcla a temperatura ambiental durante 1 hora, se detuvo la reacción mediante la adición de proteinasa K (2 \mug) y se incubó la mezcla a 37ºC durante 10 minutos más. Una parte alícuota de esta mezcla de reacción (1 \mul) fue usada para transformar células DH10B de E. coli por electroporación del modo siguiente: Se descongeló sobre hielo una parte alícuota de 25 \mul de células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) y se añadió 1 \mul de la mezcla de reacción LR. La mezcla fue transferida a una cubeta enfriada de electroporación de 0,1 cm, y las células fueron sometidas a electroporación utilizando un aparato Gene-Pulser^{TM} de BioRad de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió medio SOC (0,5 ml) que había sido precalentado a la temperatura ambiental. La mezcla fue transferida a un tubo de 15 ml de capacidad con cierre por presión y fue incubada con sacudimiento (220 rpm) durante 1 hora a 37ºC. Luego se sembraron partes alícuotas de la mezcla de transformación (10 \mul y 50 \mul) en placas de caldo L (LB) que contenían ampicilina (100 \mug/ml) y se incubaron durante la noche a 37ºC.

Se preparó DNA plasmídico "mini-prep" a partir de cultivos de 5 ml procedentes de 6 de las colonias resultantes, usando un sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). El DNA plasmídico (200-500 ng) fue sometido a secuenciación de DNA usando los cebadores de T7 y pDEST14R (Tabla 4). El DNA plasmídico "mini-prep" de 1 de los clones resultantes (pDEST14-SD-INSP035-6HIS) es luego usado para transformar, por ejemplo, células BL21 DE3 de E. coli para la producción de proteínas.

TABLA 4 Cebadores de secuenciación y mutagénesis

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Ejemplo 4 Análisis de los niveles de expresión del gen INSP035 por análisis TaqMan

Se transcribió inversamente el RNA total de cada muestra utilizando el sistema Superscript III (Invitrogen; Ref. 18080-051 del catálogo) de síntesis de primera cadena para transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR; del inglés, reverse transcription-polymerase chain reaction), en un volumen de reacción final de 20 \mul. Se combinaron 2 \mug de RNA total con 50 ng de cebadores hexámeros aleatorios, dATP, dGTP, dCTP y dTTP, cada uno 10 mM, y agua tratada con DEPC en un volumen de 10 \mul. La mezcla fue incubada a 65ºC durante 5 minutos y fue luego enfriada sobre hielo durante 1 minuto. En un tubo separado se preparó la siguiente mezcla para síntesis de cDNA, de 10 \mul: 2 \mul de tampón RT 10x, 4 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de RNaseOUT^{TM} (40 unidades/\mul) y 1 \mul de enzima Superscript^{TM} III RT (200 unidades/\mul). Se añadió la mezcla para síntesis de cDNA a la mezcla de RNA/cebador, y el conjunto fue mezclado suavemente y fue incubado a 25ºC durante 10 minutos y luego a 50ºC durante 50 minutos. La enzima transcriptasa inversa (RT) fue luego inactivada por incubación a 85ºC durante 5 minutos. Se enfrió la mezcla sobre hielo y luego se añadió 1 \mul de RNasa H de E. coli (2 unidades/\mul) y se incubó la mezcla a 37ºC durante 20 minutos. La mezcla fue enfriada sobre hielo y fue luego diluida 1/250 con agua estéril. Las diluciones de la mezcla de reacción de la transcriptasa inversa fueron luego sometidas a un análisis por PCR en tiempo real con un instrumento TaqMan (PE Biosystems 7700).

Utilizando el software Primer Express (PE Biosystems), se diseñaron cebadores de PCR para INSP035 humana y el gen testigo doméstico gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Los cebadores seleccionados fueron h-INSP035-169F1 (AGGGCCCAAGCCAAACC) y h-INSP035-281R1 (TCCTGCGCCTGCATCT-CC). La especificidad y la concentración óptima de cebador para uso en el análisis TaqMan se determinaron probando los cebadores específicos del gen INSP035 en una serie de diluciones del plásmido pCR-XL-TOPO-INSP035. Se excluyó la posible contaminación del cDNA por DNA genómico al llevarse a cabo las reacciones PCR usando cebadores específicos para la secuencia intrónica de GAPDH. Se controló la ausencia de multiplicación inespecífica analizando los productos de PCR en geles de agarosa al 4% para asegurar que se producía una sola banda del peso molecular esperado.

Se llevaron a cabo reacciones PCR en tiempo real con colorante SYBR Green en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía 25 \mul de mezcla maestra para PCR-SYBR Green (PE Biosystems) [a la que se habían añadido previamente 0,5 unidades de uracil N-glicosilasa (UNG) AmpErase (PE Biosystems)], cada cebador de multiplicación en una concentración de 300 nM, y 5 \mul del producto de RT-PCR.

La ciclación fue llevada a cabo utilizando el sistema de detección ABI PRISM 7700 (TaqMan), programado del modo siguiente: 1 ciclo de 50ºC durante 2 minutos; 1 ciclo de 95ºC durante 10 minutos; 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 1 minuto. Se llevó a cabo cada reacción por duplicado y se promediaron los resultados.

De esta manera, se multiplicaron las regiones específicas de cebador de las muestras de cDNA inversamente transcrito y se determinaron sus valores del ciclo umbral (Ct; del inglés, cycle threshold). El valor de Ct de cada muestra de cDNA fue normalizado con respecto al del gen doméstico GAPDH, del modo siguiente. Se expresó la diferencia en el nivel de expresión entre el gen GAPDH y el gen INSP035, en cada muestra de cDNA, como una diferencia en el valor de Ct; es decir, Delta (\delta) Ct = Ct (GAPDH) - Ct (INSP035). Luego se expresaron los resultados de cada muestra como una diferencia por cociente entre el número de ciclos requerido para una expresión detectable del gen INSP035 y el requerido para GAPDH, de acuerdo con la fórmula: Diferencia por Cociente = 2^{(-\delta Ct)}. Finalmente, se mostró el nivel de expresión del gen INSP035 en cada muestra de cDNA con respecto al nivel de expresión del gen GAPDH, siendo el nivel de expresión de GAPDH = 100%, dividiendo 100 por la Diferencia por Cociente para INSP035. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

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TABLA 5 Expresión de INSP035 en diversos tejidos humanos, según se mide por RT-PCR (TaqMan)

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Al ser definido un umbral del nivel de expresión de INSP035 con respecto a la expresión de GAPDH de 0,5, los resultados de la expresión TaqMan muestran que INSP035 está muy expresado en hígado fetal, cuello uterino, páncreas, glándula adrenal, bazo de lupus humano, intestino delgado mezclado con colitis ulcerosa y, particularmente, pulmón. La elevada expresión en el pulmón y el hígado sostiene la implicación de INSP035 en las fibrosis de pulmón e hígado.

Ejemplo 5 La administración in vivo de INSP035 protege a los ratones de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina

La administración de una sola inyección intratraqueal de bleomicina a ratones C57BL/6 da lugar a la rápida inducción, en 14 días, de una fibrosis pulmonar que se caracteriza por un depósito aumentado de colágeno dentro del intersticio pulmonar (Hattori et al., 2000; Zuo et al., 2002; Phillips et al., 2004). Con objeto de determinar si la administración de INSP035 podía ejercer efecto protector alguno frente al desarrollo de fibrosis o reducir realmente la gravedad de la enfermedad, se puede analizar el efecto de una inyección diaria de INSP035 en ratones tratados con bleomicina.

Con objeto de completar el experimento, se dividen los ratones en cuatro grupos. Se administra bleomicina a 3 grupos de 10 ratones mediante una sola instilación intratraqueal. Para comparación, se incluye en el estudio un 4º grupo de ratones que comprende individuos completamente no tratados y de edad y sexo equivalentes (ratones naíf). Se administra INSP035 por inyección subcutánea, comenzando el día después del tratamiento con bleomicina. Un grupo recibe una dosis elevada de bleomicina (5 mg/kg), el segundo grupo recibe una dosis menor de bleomicina (0,5 mg/kg) y los ratones testigo reciben disolución salina subcutánea y diariamente.

Los animales tratados con bleomicina deben caer enfermos con una rápida pérdida de masa corporal que les conduce a la muerte.

12 días después del tratamiento con bleomicina, todo lo ratones supervivientes son sacrificados. El análisis histológico de los pulmones revela el efecto de INSP035 en los animales tratados con INSP035. En los ratones tratados con INSP035 se debe observar un contenido reducido de hidroxiprolina (el contenido de hidroxiprolina es una medida del depósito de colágeno). Se puede concluir que el tratamiento con INSP035 conduce eficazmente a un depósito reducido de colágeno en los pulmones.

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<110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

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<120> NUEVO TRATAMIENTO Y/O NUEVA PREVENCIÓN DE LA ENFERMEDAD FIBRÓTICA

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<130> WO895

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<160> 11

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<170> PatentIn, versión 3.1

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<210> 1

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<211> 492

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

10

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<210> 2

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<211> 163

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

11

12

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<210> 3

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<211> 169

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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13

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<210> 4

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<211> 267

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

14

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<210> 5

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<211> 88

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 94

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

16

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<210> 7

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<211> 88

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 94

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

19

20

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<210> 9

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<211> 225

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 74

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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<210> 11

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<211> 80

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

23

24

Claims (21)

1. Uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, en que dicho polipéptido es seleccionado del grupo que consiste
en:

a)

un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 10;

b)

la forma de etiqueta histidínica de los polipéptidos cuyas secuencias se exponen en la ID. SEC. nº 2 (ID. SEC. nº 3) o ID. SEC. nº 5 (ID. SEC. nº 6) o ID. SEC. nº 7 (ID. SEC. nº 8) o ID. SEC. nº 10 (ID. SEC. nº 11);

c)

un polipéptido que comprende cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11;

d)

una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 40% o 50% o 60% o 70% u 80% o 90% de identidad con respecto a al menos una de las secuencias de (a) a (c);

e)

una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de (a) a (c); y

f)

una sal o una isoforma, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o derivado circularmente permutado de cualquiera de (a) a (e).

2. Uso de una molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, en que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11, y que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a)

una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 4 e ID. SEC. nº 9;

b)

una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con el complemento de la secuencia de ácido nucleico de (a) bajo condiciones moderadamente rigurosas o bajo condiciones muy rigurosas; y

c)

una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) y (b), en que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tiene sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11.

3. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el polipéptido está glicosilado en uno o más sitios.

4. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la proteína de fusión comprende una fusión de inmunoglobulina (Ig).

5. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en que la fusión de Ig es una fusión de Fc.

6. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el derivado funcional comprende al menos un resto fijado a uno o más grupos funcionales que se encuentran como una o más cadenas laterales en los residuos de aminoácido.

7. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 6, en que el resto es un resto de polietileno.

8. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en que la molécula de ácido nucleico está comprendida en un vector de expresión.

9. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 8, en que el vector es un vector para terapia génica.

10. Uso de un vector para inducir y/o potenciar la producción endógena de un polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 1 en una célula, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia.

11. Uso de una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 2, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia.

12. Uso de una célula que expresa un polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia.

13. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que el medicamento comprende además osteoprotegerina para uso simultáneo, secuencial o independiente.

14. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que el medicamento comprende además un interferón para uso simultáneo, secuencial o independiente.

15. El uso de acuerdo con la Reivindicación 14, en que el interferón es interferón \beta.

16. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que el medicamento comprende además un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNF) para uso simultáneo, secuencial o independiente.

17. El uso de acuerdo con la Reivindicación 16, en que el antagonista del TNF es TBP I y/o TBP II.

18. Un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la enfermedad es esclerodermia.

19. El uso de acuerdo con la Reivindicación 18, en que el medicamento comprende además un agente antiesclerodérmico para uso simultáneo, secuencial o independiente.

20. El uso de acuerdo con la Reivindicación 19, en que el agente antiesclerodérmico es seleccionado del grupo que consiste en halofuginona, inhibidores de ACE, bloqueadores del canal del calcio, inhibidores de la bomba de protones, NSAIDs, tal como ibuprofeno, inhibidores de COX, corticosteroides, tal como prednisona, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de la geranil-geranil transferasa, roterlina, inhibidores de la prolil-4-hidroxilasa, inhibidores de la proteinasa c, inhibidores de la lisil-oxidasa, relaxina, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina 1, óxido nítrico, inhibidores de la angiotensina II, interleucina 10, interleucina 8, leucotrieno B4, ácido ursodesoxicólico, antioxidantes y SARP-1.

21. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una sustancia de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia.